CN111556761A - Srsf3药剂用于治疗和/或预防神经病症、癌症、细菌感染或病毒感染的用途 - Google Patents

Srsf3药剂用于治疗和/或预防神经病症、癌症、细菌感染或病毒感染的用途 Download PDF

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Abstract

本说明书涉及SRSF3药剂用于调节髓系细胞诸如小神经胶质细胞和/或单核细胞的功能以治疗神经病症、癌症、细菌感染和病毒感染的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3的表达或功能。

Description

SRSF3药剂用于治疗和/或预防神经病症、癌症、细菌感染或病 毒感染的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月15日提交的美国临时申请62/586,567的优先权。
技术领域
本发明涉及用于神经病症、癌症或病毒感染的治疗、预后和诊断的方法，与此类方法有关的试剂盒，以及鉴定用于预防和治疗神经病症、癌症或病毒感染的候选化合物的方法。
背景技术
小神经胶质细胞是脑的主要免疫细胞。在生理条件下，小神经胶质细胞对于维持脑组织稳态是必需的(Tremblay等人,2011)，然而，在疾病和/或损伤的情况下，越来越清楚的是，小神经胶质细胞在脑中炎症应答的起始和调节中具有关键作用(Hanisch和Kettenmann,2007)。现在的共识是，一旦被激活，小神经胶质细胞即可获得从经典的促炎性表型到替代的抗炎极化表型范围的广泛免疫谱库(David和Kroner,2011；Kierdorf和Prinz,2013；Ranshoff和Brown,2012)。在过去的十年里，显示小神经胶质细胞的最佳和及时激活有助于控制炎症诱导的中枢神经系统(CNS)损伤(Chen和Trapp,2016；Graft等人,2016；Lancette-Hebert等人,2007；Lancette-Hebert等人,2009；Schwartz和Shechter,2010)。然而，目前，参与小神经胶质细胞极化分布的控制的分子机制仍属未知。
发明内容
本说明书涉及SRSF3药剂用于调节髓系细胞的先天免疫功能的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3或其片段的表达或功能。
本说明书涉及SRSF3药剂在有需要的患者中用于以下的用途：
-治疗和/或预防神经病症(例如血管性痴呆、额颞叶变性(FTD)、阿尔茨海默病(Alzheimer)、运动神经元病(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)(包括散发性ALS或家族性ALS)、进行性延髓麻痹(PBP)、原发性侧索硬化(PLS)或肯尼迪病(Kennedy’s Disease))或帕金森病(Parkinson’s disease))；
-抑制中枢神经系统癌症(例如神经胶质瘤)的增殖；或
-治疗和/或预防病毒感染或细菌感染(例如HIV)；
其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3或其片段的表达或功能。
本说明书涉及一种方法，其用于：
-治疗和/或预防神经病症(例如血管性痴呆、额颞叶变性(FTD)、阿尔茨海默病(Alzheimer)、运动神经元病(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)(包括散发性ALS或家族性ALS)、进行性延髓麻痹(PBP)、原发性侧索硬化(PLS)或肯尼迪病(Kennedy’s Disease))或帕金森病(Parkinson’s disease))；
-抑制中枢神经系统癌症(例如神经胶质瘤)的增殖；或
-治疗和/或预防病毒感染或细菌感染(例如HIV)；
所述方法包括在有需要的患者中给予有效量(例如治疗有效量)的至少一种SRSF3药剂，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3或其片段的表达或功能。
本说明书涉及用于诊断和治疗易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
确定所述受试者的生物样品中SRSF3或其片段的水平；
并且
向所述受试者给予有效量(例如治疗有效量)的至少一种SRSF3药剂；
其中观察到所述生物样品中SRSF3或其片段的水平相对于SRSF3或其片段的参考水平升高指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
本说明书涉及用于诊断易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
确定所述受试者的生物样品中SRSF3或其片段的水平
其中观察到所述生物样品中SRSF3或其片段的水平相对于SRSF3或其片段的参考水平升高指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
本说明书涉及用于诊断易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
鉴定所述受试者的生物样品中上调的和非翻译的mRNA谱，
其中观察到编码小神经胶质细胞的先天免疫应答中所涉及的多肽的上调的和非翻译的mRNA谱指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
本说明书涉及用于诊断和治疗易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
鉴定所述受试者的生物样品中上调的和非翻译的mRNA谱，
向所述受试者给予有效量(例如治疗有效量)的至少一种SRSF3药剂；
其中观察到编码小神经胶质细胞的先天免疫应答中所涉及的多肽的上调的和非翻译的mRNA谱指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
本说明书涉及用于鉴定可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染中的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述候选化合物与包含SRSF3或其片段的生物系统接触，
b)测量所述候选化合物抑制SRSF3功能表达的能力，
c)基于步骤b)的结果确定所述候选化合物是否可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
本说明书涉及用于鉴定可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染中的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述候选化合物与生物系统接触，所述生物系统包含SRSF3或其片段和mRNA的至少一个3'UTR，所述mRNA编码小神经胶质细胞的先天免疫应答中所涉及的多肽，所述至少一个3'UTR至少包含SRSF3结合位点，
b)测量所述候选化合物抑制SRSF3或其片段与所述mRNA的至少一个3'UTR SRSF3结合位点之间的结合的能力，
c)基于步骤b)的结果确定所述候选化合物是否可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
本说明书涉及用于监测受试者的神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的进展或消退的方法，所述方法包括以下步骤：
确定所述受试者的生物样品中SRSF3或其片段的水平，
其中观察到SRSF3或其片段的水平增加指示所述神经病症的进展，并且其中观察到SRSF3的水平降低指示所述神经病症、所述中枢神经系统癌症、所述细菌感染或所述病毒感染的消退。
本说明书涉及生物样品中SRSF3或其片段的水平作为生化标记物用于监测受试者的神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的进展或消退的用途。
附图说明
图1CD11brGFP转基因小鼠的表征。(A)Flag/EGFP标记的鼠Rpl10a在CD11b启动子控制下的构建的示意性表示，I：间插序列(IVS)；II：SV40聚A(SEQ ID NO:1)。(B)通过PCR使用寡核苷酸对转基因的可视化，所述PCR扩增仅来自转基因小鼠(Tg)而不来自WT的329bp的EGFP基因。(C)冠状脑切片的示意性表示。红色矩形定位在(D)和(E)中已经完成图片的区域。(D和E)对照(D)或LPS注射后24小时小鼠(E)的脑切片中的EGFP表达。与CD11b(蓝色)和IbaI(红色)共定位的GFP免疫染色。(F)小神经胶质细胞原代培养物裂解物免疫沉淀后的蛋白质印迹(Western blot)证实Flag珠粒对Flag/EGFP-Rpl10a转基因的免疫结合。比例尺，25μm和50μm。
图2高度上调的免疫基因未翻译。(A)来自转基因小鼠脑的核糖体亲和纯化方法的示意性表示。(B)用Affymetrix 2.0ST芯片分析的小神经胶质细胞的热图和分层聚类。以三个生物学重复进行实验(n＝5只小鼠/条件)。(C)转录组学数据分析和蛋白质组学数据分析之间的差异。在测序的肽列表(所述表仅显示聚类1)中未观察到聚类1(缩放1)和聚类2(缩放2)中呈现的所有上调的免疫基因。将Cap2和Ywhaz用作对照。(D)多核糖体免疫沉淀后通过免疫印迹对蛋白质组学结果的验证。将CAP2和肌动蛋白用作内部对照。将全脑提取物用作输入物。(E)来自用LPS治疗或未用LPS治疗的小鼠的全脑提取物的定量蛋白质印迹分析。(数据为平均值±SEM；n＝3；SAA3：p＝0.3224；LCN2：*p＝0.0297；CCL5：p＝0.3709；CAP2：p＝0.8280)。
图3激活的小神经胶质细胞中趋异的mRNA和蛋白网络。用ClueGo可视化的(A)上调或下调转录物或(B)肽的生物学作用。与相同项(term)相关的转录物/肽由节点表示。大部分上调转录物/肽的项以红色显示。大部分下调转录物/肽的项以绿色显示。灰色节点含有等比例的上调和下调的转录物/肽。节点的大小反映了基因/项相比于聚类的数目。颜色梯度显示了项的富集显著性。边缘显示转录物/肽与项的相关性。边缘的厚度反映了关联显著性。(C)上调转录物的前10种生物学功能。(D)上调肽的前10种生物学功能。
图4Saa3-3'UTR对萤光素酶报告基因活性的抑制。(A)用于萤光素酶测定的pGL3-启动子(pGL3)(GenBank登录号U47298)、pGL3-启动子-Saa3-3'UTR-wt(SEQ ID NO:2)(pGL3-Saa3-3'UTR)和pGL3-启动子-乱序(乱序)(SEQ ID NO:3)(pGL3-乱序)的示意性表示。显示了萤火虫萤光素酶报告基因(棕色框)、Saa3-3'UTR序列(橙色圆圈)和SV40聚A区(浅灰色框)。(B)用每个构建体转染HEK293细胞并在48小时后测定萤光素酶活性。数据表示以一式三份进行的三个独立实验的平均值±SEM(n.s.：p>0.05；***p<0.001)。(C)通过RT-qPCR测量的稳定表达用pGL3载体或pGL3-Saa3-3'UTR-wt载体转染的F/EGFP-Rpl10a质粒的BV2细胞的相对萤火虫萤光素酶mRNA水平。在转染后48小时，使用TRAP方案提取核糖体相关mRNA。数据代表三个单独实验，每个实验以两个技术重复进行(n＝6；平均值±SEM；n.s.：p＝0.5676)。(D)推定的RNA结合蛋白(RBP)根据具有高严格水平的RBP图谱沿着Saa3-3’UTR片段定位。每个圆圈表示一个RBP结合位点。将LPS注射后通过质谱仪分析鉴定的RBP以蓝色加框。(E)Saa3-3'UTR缺失(SEQ ID NO:4到7)的示意性表示。将Saa3-3'UTR分成三个区段：A、B和C。(F)用每个构建体转染HEK293，并在转染后48小时针对萤光素酶测定进行测定。数据代表以一式三份进行的两个单独实验(平均值±SEM，n＝6；与pGL3相比：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与pGL3-Saa3-3'UTR-wt相比：n.s.:p>0.05，##p<0.01，###p<0.001；pGL3-Saa3-3’UTR-DelB+C相比于pGL3-Saa3-3’UTR DelB：&p<0.05)。
图5SRSF3通过3'UTR调节炎性基因表达。(A)LPS处理后24小时BV2细胞中磷酸化SRSF3(pSRSF3)表达的蛋白质印迹。(B)用于pSRSF3的定量蛋白质印迹分析。(数据为平均值±SEM，n＝4；***p<0.001)。(C)LPS后24小时通过蛋白质印迹分析的总SRSF3(tSRSF3)表达。(D)蛋白质印迹的定量分析显示tSRSF3的表达水平。(数据为平均值±SEM，n＝3；p>0.05)。(E)用对照siRNA(CTL siRNA)或抗SRSF3的siRNA(100nM或300nM)(SEQ ID NO:8到11)转染的经LPS处理的BV2细胞的蛋白质印迹分析。(F)蛋白质印迹的定量分析显示在siRNA转染后48小时内源SRSF3的表达水平。(数据为平均值±SEM，n＝3；n.s.：p>0.05；*p<0.05)。(G)使萤光素酶报告物(pGL3和pGL3-Saa3-3'UTR-wt)与CTL siRNA或SRSF3siRNA(300nM)(SEQ IDNO:8到11)在经LPS处理的BV2细胞中共转染。在转染后48小时测量了萤光素酶活性。数据表示两个独立实验的平均值±SEM(n＝6；n.s.：p>0.05；*p<0.05；***p<0.001)。(H)LPS暴露后24小时BV2细胞中SAA3表达的蛋白质印迹。(I)蛋白质印迹分析显示SRSF3敲低后内源SAA3的表达水平。(数据为平均值±SEM，n＝3；n.s.：p>0.05；**p<0.01)。(J)SRSF3分别沿Lcn2、Ccl5和Ccl3的3'UTR的推定位置的示意性表示。(K)用针对SRSF3的siRNA转染并用LPS处理24小时的BV2细胞中LCN2、CCL5和CCL3表达的蛋白质印迹分析。(L)蛋白质印迹的定量分析显示SRSF3敲低和用LPS处理后的内源LCN2、CCL5和CCL3水平(n＝3；n.s.：p>0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图6SRSF3是体内炎性基因的翻译调节物。(A)LPS注射后TLR2诱导的体内成像；LPS注射后24小时的代表性照片。右边的颜色校准是光子计数。(B)头部的3D视图，显示了由CCD相机探测到的光子。(C)腹膜内LPS注射后24小时生物发光信号的3D重建。(D)通过测量光子发射所获得的数据图。黑线显示LPS后24-72小时的TLR2信号诱导(数据为平均值±SEM，基线：n＝5，LPS 24小时：n＝5；LPS 48小时：n＝4；LPS 72小时：n＝4；基线相比于LPS 24小时：**p<0.01；基线相比于LPS 48小时，和基线相比于LPS 72小时：p>0.05；LPS 24小时相比于LPS 48小时和LPS 24小时相比于LPS 72小时：**p<0.01)。(E)在TLR2-luc-GFP小鼠中LPS后24小时在脑切片中由TLR2驱动的GFP转基因表达(Lancette-Hebert等人,2009)。与CD11b(红色)共定位的GFP免疫染色(绿色)。比例尺，50μm。(F)鼻内给予乱序-siRNA或SRSF3-siRNA(SEQ ID NO:8到11)后全脑提取物的蛋白质印迹分析。(G)蛋白质印迹的定量分析显示在给予siRNA后48小时内源SRSF3的表达水平。(数据为平均值±SEM，n＝3；p***<0.001)。(H)实验性时间线的示意性表示。(I)在LPS条件(5mg/kg)下鼻内递送乱序-siRNA(J)或SRSF3-siRNA(K)之前(基线)和之后，TLR2信号的生物发光成像。(L)接受SRSF3-siRNA或乱序-siRNA的TLR2-luc-GFP小鼠中由相对于基线的倍数变化表示的来自脑的总光子发射的纵向定量分析。向所有小鼠腹膜内注射LPS(5mg/kg)并持续24小时(数据为平均值±SEM，乱序-siRNA+LPS-24小时：n＝5；SRSF3-siRNA+LPS-24小时：n＝7；LPS-24小时：n＝5；n.s.：p>0.05；p**<0.01；p***<0.001。在LPS激发后来自乱序-siRNA(M)或SRSF3-siRNA(N)条件的Iba1染色脑切片的代表性显微照片。比例尺，50μm。(O)Iba-1染色的光密度定量(n＝3；p***<0.001)。(P)纯化的小神经胶质细胞中在LPS后SAA3、LCN2、CCL5和CCL3蛋白表达的蛋白质印迹分析。(Q)给予乱序/SRSF3-siRNA后小神经胶质细胞SAA3、LCN2、CCL5和CCL3蛋白的表达的蛋白质印迹的定量分析。数据表示平均值±SEM(n＝3；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图7LPS激发后小神经胶质细胞NF-kB网络中高度上调的mRNA和未调节的蛋白。在LPS注射后，通过ClueGo可视化的与炎症和免疫应答有关的项。(A)在mRNA分析中，所有与炎症和免疫应答有关的项都是上调项并以红色显示。前50种上调转录物中的大部分与那些项相关。使炎症和免疫应答网络变亮以便更好地可视化；未显示未调节的转录物。将前3种上调的mRNA(用红色矩形突出显示)用于进一步验证。(B)在蛋白质组学分析中，所有与炎症和免疫应答有关的项都以灰色呈现，因为与这些项相关的大部分肽不受调节。仅四种与炎症和免疫应答项有关的蛋白受到调节：Ppm1b和Elmo2受到上调，而Hsp90ab1和Fbxw11受到下调。通过蛋白质组学分析检测不到所有与炎症和免疫应答相关的上调转录物。在两个图中，节点的大小反映了基因/项相比于聚类的数目。
图8siGLO在脑的不同区域中的分布。(A)用于可视化siGLO在脑中的分布的三个所选区域的示意性表示，1：皮质；2：胼胝体附近的纹状体；3：皮质。(B、C和D)鼻内递送后在三个所选区域中的siGLO分布(红点)。将siGLO与乱序-siRNA或SRSF3-siRNA共转染，以目视评估siRNA在脑中的摄取。比例尺：10μm和50μm。(E-P)siGLO红点(F、J和N)完美定位于Iba1(绿色)阳性细胞(E、I和M)的细胞核(蓝色)(G、K和O)。信号的核定位是成功转染的明确信号。合并图像(H、L和P)显示荧光寡核苷酸定位于几乎所有Iba1阳性小神经胶质细胞的细胞核。
图9由于pSRSF3的水平在SOD1突变小鼠的脊髓中随时间而增加，因此SRSF3在ALS中有涉及。高度上调的mRNA未翻译，并且关键mRNA在3'UTR处具有多个推定的SRSF3结合位点。SRSF3水平的蛋白质印迹分析在症状前的ALS(SOD1突变小鼠)中显著增加(A)，而磷酸化水平随着疾病进展显著增加(B)(n＝3；未配对t检验；*p<0.05，**p<0.001)。(C)腰椎脊髓小神经胶质细胞(158天SOD1G93A)中10种最上调的mRNA的列表。据报道，以黄色标记的转录物在AD/ALS和朊病毒病中具有生物标记物潜力。所列出的高度上调的mRNA在蛋白水平上不受调节。生物信息学分析揭示Clec7a、Cst7的3'UTR高度富集SRSF3结合位点。
图10正常衰老和额颞叶痴呆小鼠模型(TDP-43G348C)中总SRSF3和pSRSF3的增加水平。全脑提取物的蛋白质印迹分析。
图11pSRSF3水平在散发性ALS患者11的脑脊液(CSF)中升高。在人脊髓、脑脊液(CSF)和血浆中检测到pSRSF3。对来自ALS患者(B、C)和对照受试者(A)的石蜡包埋死后人脊髓切片进行pSR免疫组织化学分析。(D)来自ALS患者和对照受试者的血浆的蛋白质印迹分析。(E)蛋白质印迹的定量分析显示，当与对照受试者相比时，ALS患者中的pSRSF3水平增加。数据为平均值±SEM(n＝4；*p<0.01)。(F)来自ALS患者和对照受试者的CSF的蛋白质印迹分析。*在较高暴露下观察到的模糊条带。(G)蛋白质印迹的定量分析显示，当与对照受试者相比时，ALS患者中的pSRSF3水平增加。数据为平均值±SEM(n＝5；**p<0.01)。
图12胞质溶胶中抗SRSF3吗啉代化合物机制的示意图。抗SRSF3吗啉代化合物是靶向SRSF3mRNA的5'UTR的25个核酸碱基的短链。它们结合互补RNA并通过RNAse H非依赖性机制起作用以阻断胞质溶胶中SRSF3的翻译起始。抗小家鼠(mus musculus)SRSF3吗啉代化合物的序列为：
5'-CCAAGGGACAGGAATCACGATGCAT-3'(SEQ ID NO:15)已经在mRNA靶标周围插入括号以说明其在SRSF3的小家鼠序列中的位置[如下所示]。注意，括号置于有义链上
5’ggtgggcctgtcggagcgttaggatttgagcttgggccttttgaacccaggatctcgaa[(atg)catcgtgattcctgtcccttgg]-3’(SEQ ID NO:16)。
抗人SRSF3吗啉代化合物的序列为：
5’-CCAATGGACAGGAATCACGATGCAT-3(SEQ ID NO:17)。已经在mRNA靶标周围插入括号以说明其在SRSF3的人序列中的位置[如下所示]。注意，括号置于有义链上。
5’-gccgccgcattttttaaccctagatctcgaa[(atg)catcgtgattcctgtccattgg]-3’(SEQ ID NO:18)。
图13敲低SRSF3后蛋白的从头合成。(A)来自鞘内递送50μg抗SRSF3吗啉代化合物或盐水后的SOD1G93A转基因小鼠的完整腰椎脊髓均质物的蛋白质印迹分析。(B)蛋白质印迹的定量分析显示在给予抗SRSF3吗啉代化合物之后，内源总SRSF3(tSRSF3)和磷酸化SRSF3(pSRSF3)的表达水平。数据为平均值±SEM(n＝3；tSRSF3：盐水相比于抗SRSF3吗啉代化合物，**p<0.01；pSRSF3：盐水相比于抗SRSF3吗啉代化合物，*p<0.05)。(C)SOD1G93A小鼠中在鞘内递送50μg抗SRSF3吗啉代化合物或盐水后的整个腰部脊髓提取物的蛋白质印迹分析。(D)蛋白质印迹的定量分析显示在敲低SRSF3后，内源CST7、GPNMB和TLR2蛋白的表达水平增加。数据表示平均值±SEM(n＝3；**p<0.01)。将肌动蛋白用作上样对照。
图14在瘫痪发作后起始的抗SRSF3吗啉代化合物治疗增加SOD1G93A转基因小鼠的存活并改善它们的运动功能。(A)实验时间线的示意性表示。(B)腹膜内注射抗SRSF3吗啉代化合物或盐水后，对用Ficoll纯化的小鼠血细胞的蛋白质印迹分析。(C)蛋白质印迹的定量分析显示给予吗啉代化合物后六天内源SRSF3表达水平的降低。(数据为平均值±SEM，n＝3；*p<0.05)将肌动蛋白用作上样对照。(D)来自经抗SRSF3吗啉代化合物或对照治疗的SOD1G93A转基因小鼠的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。用抗SRSF3吗啉代化合物(25mg/kg，每周一次，n＝8，红线)或用对照吗啉代化合物(乱序，n＝9，蓝线)腹膜内治疗SOD1G93A转基因小鼠。根据卡普兰-迈耶分析的对数秩检验，吗啉代化合物治疗组与对照治疗组相比，在存活概率方面存在统计学显著差异(对于吗啉代化合物，p<0.0386)。(E)在腹膜内注射吗啉代化合物(25mg/kg，每周一次；数据表示平均值±SEM，n＝8，红线)或对照吗啉代化合物(乱序，25mg/kg，每周一次；数据表示平均值±SEM，n＝9，蓝线)的转基因SOD1G93A小鼠中的整个治疗中进行运动功能的转棒仪(rotarod)评估。野生型小鼠(WT)未经治疗并用作对照(数据表示平均值±SEM，n＝4，黑线)。
图15用抗SRSF3吗啉代化合物治疗逆转SOD1G93A小鼠的脾和肌肉的萎缩。(A)来自SOD1G93A Tg小鼠和WT同窝小鼠的脾的形态和大小。当与对照(乱序，25mg/kg，每周一次)相比时，在症状性SOD1G93A转基因小鼠中起始的用抗SRSF3吗啉代化合物(25mg/kg，每周一次)的腹膜内治疗逆转脾萎缩。(B)来自SOD1G93A Tg小鼠和WT同窝小鼠的肌肉的形态和大小。当与对照(乱序，25mg/kg，每周一次)相比时，在症状性SOD1G93A小鼠中起始的用抗SRSF3吗啉代化合物(25mg/kg，每周一次)治疗的腹膜内治疗逆转肌肉萎缩。(C)在用抗SRSF3吗啉代化合物或乱序吗啉代化合物治疗的SOD1G93A之间比较平均胫骨前(TA)肌肉重量。将野生型小鼠(WT)用作对照。(数据表示平均值±SEM，n＝3只小鼠/组，***p<0.001)(D)经NFH染色的TA肌肉的代表性显微照片(绿色)。比例尺1mm。
图16用抗SRSF3吗啉代化合物治疗保护SOD1G93A小鼠脊髓中的运动神经元并增加小神经胶质细胞的激活。(A)来自注射了抗SRSF3吗啉代化合物或乱序的晚期症状性SOD1G93A转基因小鼠的经ChAT和NeuN染色的腰椎脊髓切片的代表性显微照片。将野生型(WT)小鼠用作对照(每组n＝3)。(B)来自注射了抗SRSF3吗啉代化合物或盐水的晚期症状性SOD1G93A转基因小鼠的经Iba1染色的腰椎脊髓切片的代表性显微照片。将野生型(WT)小鼠用作对照(每组n＝3)。
图17靶向SRSF3的RNA结合结构域(RRM结构域)的MAB121的产生和验证。(A)SRSF3蛋白质的序列。将RRM结构域的序列(SEQ ID NO 13)以绿色显示并且将RS结构域的序列(SEQ ID NO 14)以橙色显示。将独特的免疫原性序列(GNNGNKTELERAFGYYGPLRSV)SEQ IDNO.20)以粗体显示。(B)MAB121抗体参与阻断SRSF3作用的示意图。通过(C)ELISA和(D)萤光素酶测定对免疫动物的血清的测试和分析。I萤光素酶测定分析的示意图，所述分析用于检查抗体MAB121破坏SRSF3与其靶mRNA的相互作用并增强萤光素酶活性的效率。将图4中所示的萤光素酶报告系统用于此实验。
图18通过(A)ELISA，使用合成肽作为免疫原或BSA对不同大鼠血清的亲和力的分析。将BSA或合成肽与含有MAB121抗体的血清或免疫前血清(p)一起孵育。数据表示平均值±SEM(n＝3；****p<0.0001)，或通过(B)萤光素酶测定进行分析。用pGL3-启动子(pGL3)(GenBank登录号U47298)、pGL3-启动子-Saa3-3'UTR-wt(SEQ ID NO:2)(pGL3-Saa3-3'UTR)和pGL3-启动子-乱序(pGL3-乱序)构建体转染HEK 293细胞。用来自不同免疫动物的血清处理用pGL3-Saa3-3'UTR转染的HEK293细胞(将来自各动物的免疫前血清用作对照)，并在48小时后测定萤光素酶活性。数据表示平均值±SEM(n＝3；pGL3-启动子相比于pGL3-Saa3-3’UTR：***p<0.001；pGL3-Saa3-3’UTR相比于pGL3-乱序：***p<0.001；pGL3-Saa3-3’UTR相比于pGL3-Saa3-3’UTR+大鼠155号(155)：*p<0.05；pGL3-Saa3-3’UTR+大鼠155号的免疫前血清(155p)相比于pGL3-Saa3-3’UTR+大鼠155号：*p<0.05pGL3-Saa3-3’UTR相比于pGL3-Saa3-3’UTR+大鼠158号(158)：*p<0.05)。
图19SRSF3在中风后小神经胶质细胞激活的调节中有涉及(A)pSRSF3的蛋白质印迹分析揭示，当与非中风对照(CTL)相比时，80分钟大脑中动脉闭塞(MCAO)后24小时表达水平显著增加，而tSRSF3降低。(B)蛋白质印迹的定量分析。数据表示平均值±SEM(n＝4；pSRSF3-MCAO相比于pSRSF3-CTL：***p<0.001；tSRSF3-MCAO相比于tSRSF3-CTL：*p<0.05)。将肌动蛋白用作上样对照。(C)CTL和MCAO中Iba1(红色)和pSRSF3(绿色)的代表性双免疫荧光图像。
图20MCAO中由siRNA介导的SRSF3敲低后小神经胶质细胞激活的增加(A)实验时间线的示意性表示。(B)在MCAO病症中鼻内给予乱序-siRNA或SRSF3-siRNA后全脑提取物的蛋白质印迹分析。(C)蛋白质印迹的定量分析显示在siRNA给予后SRSF3水平降低。数据表示平均值±SEM(n＝4；乱序相比于SRSF3siRNA***p<0.001)。将肌动蛋白用作上样对照。(D)MCAO诱导前(基线)以及诱导后2天、3天、5天和7天的生物发光信号的2D重建。I MCAO诱导后24小时接受SRSF3-siRNA或乱序-siRNA的TLR2-luc-GFP小鼠中由光子发射表示的来自脑的总光子发射的纵向定量分析(数据是平均值±SEM，MCAO组：n＝5；乱序-siRNA+MCAO：n＝6；SRSF3-siRNA+MCAO：n＝7；乱序-siRNA+MCAO相比于SRSF3-siRNA+MCAO：*p<0.05)。
图21中风后24小时鼻内递送siRNA显著降低中风后缺血灶的大小。(A)脑切片的甲酚紫染色显示经乱序-siRNA或SRSF3-siRNA治疗的小鼠中在MCAO后7天的梗塞体积。(B)梗塞体积的定量显示当与乱序-siRNA相比时，给予SRSF3-siRNA后中风体积的显著减小。(数据为平均值±SEM，***P<0.001)。(C)MCAO后3天中风区域的细胞因子阵列分析显示，当与乱序siRNA相比时，SRSF3-siRNA给予后CCL3、CCL5、TIMP1和GM-CSF的表达显著增加。(数据为平均值±SEM，CCl3：***p<0.001；CCL5：*p<0.05；TIMP1：**p<0.01；GM-CSF：**p<0.01)。
图22由于pSRSF3的水平在淀粉样前体蛋白(APP)转基因小鼠的脑中随时间而增加，因此SRSF3在AD发病中有涉及。(A)3-5个月(mo)APP小鼠、APP7-9mo和APP17-20mo的全脑提取物中SRSF3蛋白的磷酸化形式(pSRSF3)的蛋白质印迹分析。(B)定量分析显示SRSF3的磷酸化在APP小鼠中疾病发作/认知缺陷发作时开始显著增加。数据表示平均值±SEM；(n＝3*p<0.05)。将GAPDH用作上样对照。(C)APP转基因脑切片的代表性显微照片显示SRSF3的磷酸化在整个疾病中增加，并且从7-9个月开始。在激活的小神经胶质细胞中与CD11b标记物共定位的抗pSRSF3蛋白染色。将WT小鼠用作阴性对照。照片是从海马体区拍摄的。将刚果红用于对17-20mo的APP小鼠中的淀粉样蛋白斑染色，并与WT小鼠进行比较。
图23高度上调的mRNA在APP小鼠模型中未翻译。(A)17-20mo的WT或APP小鼠的全脑提取物中GFAP蛋白表达的蛋白质印迹分析。将GFAP用作APP转基因小鼠模型中疾病进展的阳性对照(B)蛋白质印迹的定量分析显示当与年龄匹配的WT小鼠相比时，17-20mo的APP小鼠中GFAP同种型表达显著增加。数据表示平均值±SEM；*p<0.05。将肌动蛋白用作上样对照。(C)APP转基因小鼠(3-5mo和17-20mo)的全脑提取物中CLEC7a、TLR2、CST7、CD68和GPNMB表达的蛋白质印迹分析。(D)定量分析显示，除了CLEC7a(我们观察到其在APP-17-20mo中的表达水平增加)之外，TLR2、CST7、CD68和GPNMB的表达水平在整个疾病中没有显著差异。数据表示平均值±SEM；(n＝3*p<0.05)。将GAPDH用作上样对照。
图24鼻内递送抗SRSF3 mRNA的吗啉代化合物(50μg)后总SRSF3的敲低。(A)鼻内递送靶向Srsf3 mRNA的吗啉代化合物后三天和1周，总SRSF3敲低的蛋白质印迹分析。(B)从全脑提取物获得的蛋白质印迹的密度计量分析。数据表示平均值±SEM；(n＝3 CTL相比于72小时：*p<0.05，CTL相比于1周；**p<0.01，72小时相比于1周：#p<0.05)。将肌动蛋白用作上样对照。
图25用10μM抗SRSF3吗啉代化合物处理来源于症状性SOD1G93A小鼠脊髓的原代成年小神经胶质细胞降低Gal3(与异常ALS小神经胶质细胞相关的标记物之一)的表达。
具体实施方式
本说明书涉及以下出人意料的发现：通过阻断高度调节的LPS基因的翻译，SRSF3(富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3(SRSF3/SRp20/SFRS3))充当固有小神经胶质细胞中先天免疫应答的主要调节物。
为了破译体内小神经胶质细胞激活的分子机制，诸位发明人建立了一种转基因模型，其中Flag/EGFP与大亚基核糖体蛋白L10a的N-末端融合，并在髓系特异性基因启动子(SEQ ID NO:1)的转录控制下表达。通过分离核糖体附着的mRNA和肽这两者，诸位发明人获得了小神经胶质细胞核糖体的动态翻译状态(将mRNA作为输入物且将新合成的肽作为输出物)的快照。使用此策略，鉴定出与小神经胶质细胞激活相关的mRNA和蛋白标记。核糖体结合肽的平行分析揭示了最高度上调的mRNA不被翻译。与高度上调的促炎性mRNA相反，大多数测序的肽，包括形成关键免疫NF-κB相互作用组的肽，被下调和/或不被调节。基于核糖体的检查点/对照：鉴定出高度表达的、与核糖体结合的且“主动翻译的”mRNA的选择性由3'UTR介导的翻译阻遏。发现高度调节的基因的翻译阻遏由RBP富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3(SRSF3/SRp20/SFRS3)协调，所述剪接因子在Saa3和其他高度调节的LPS基因的3'UTR的所有结构域中具有多个推定的结合位点。
通过研究响应先天免疫激发的小神经胶质细胞激活的分子模式，发现小神经胶质细胞mRNA和蛋白分子标记的显著解离。在关键的免疫NF-κB网络中观察到最引人注目的趋异性，其中发现高度上调的经LPS诱导的且与核糖体相关的mRNA聚类未被翻译。高度调节的经LPS诱导的mRNA的这种相当有选择性的翻译阻遏导致形成两种不同的小神经胶质细胞分子标记：i)高度特化的免疫和促炎性mRNA标记以及ii)更具免疫调节性的稳态蛋白标记。值得注意的是，观察到的翻译阻遏局限于高度上调的经LPS诱导的基因聚类，而未调节的转录物通常被翻译并通过质谱和蛋白质印迹分析以预期水平被检测到。接着，发现3'UTR区在高度上调的和核糖体附着的免疫转录物的翻译控制中起关键作用。此外，将RNA结合蛋白SRSF3鉴定为小神经胶质细胞中先天免疫基因翻译的主要调节物。还发现SRSF3在若干上调的先天免疫基因上具有推定的结合位点。另外，在LPS激发的情况下，siRNA对内源SRSF3的选择性敲低减轻了几种高度调节的先天免疫基因的翻译阻遏，由此导致免疫介质(包括SAA3、CCL5和CCL3)的蛋白合成的稳健增加。鉴于SRSF3介导的蛋白产生阻遏靶向核糖体结合的mRNA的事实，这强烈表明蛋白合成起始后操作并控制小神经胶质细胞的免疫基因翻译激活调节机制/检查点的存在。
在生理条件下，小神经胶质细胞有助于维持脑稳态，然而，小神经胶质细胞的不受控制和长期激活对神经元是有害的(Prinz和Ratter,2014)。因此，对理解小神经胶质细胞激活中涉及的分子机制的兴趣日益增加。尽管公开的研究集中于鉴定/描述背景依赖性小神经胶质细胞免疫转录物(Beutner等人,2013；Butovsky等人,2014；Hickman等人,2013；Zhang等人,2014)，但体内小神经胶质细胞蛋白质组学和相关的调节机制未被很好地定义。首个全面的成年小鼠脑蛋白质组由Sharma和同事呈现(Sharma等人,2015)。然而，他们的分析局限于粘附分子Lsamp和其在脑和不同细胞类型中的表达模式。在更好地理解小胶质激活的分子机制中的限制因素之一是缺乏适当的体内模型。通过研究小神经胶质细胞核糖体的翻译动力学，发现LPS激发后mRNA和蛋白分子标记的明显趋异性。在先天免疫应答中mRNA翻译成蛋白是高度调节的过程，并且迄今为止已经描述了几种靶向转录物稳定性的转录后机制(Anderson,2010；Carpenter等人,2014；Mino等人,2015)。然而，本文所述的结果揭示mRNA的调节发生在翻译起始之后。所述方法对高度调节的先天免疫mRNA具有选择性，而未调节的转录物通常被翻译并通过定量质谱以预期水平被检测到。重要的是，靶向mRNA的3'UTR区域在RBP SRSF3的推定结合位点中高度富集。因此，LPS激发后观察到的mRNA和蛋白应答的趋异性可以部分地通过由SRSF3施加的经3'UTR介导的抑制作用来解释。
另外，还发现SRSF3在ALS诱导的SOD1模型突变小鼠的脊髓(图9)和散发性ALS患者的脑脊液(CSF)(图11)中上调。如本文所公开的，还发现SRSF3在正常衰老和额颞叶痴呆(FTD)小鼠模型(TDP-43G348C)中上调。不受任何具体理论的约束，诸位发明人相信，在神经病症、中枢神经系统癌症、抗病毒感染和细菌感染(尤其是靶向免疫细胞的感染)中存在与在LPS激发的小神经胶质细胞中观察到的机制类似的机制。诸位发明人相信由SRSF3或磷酸化SRSF3操作的翻译阻遏将使髓系细胞中的免疫功能沉默，否则所述免疫功能将与神经病症、中枢神经系统癌症和感染的控制和治疗相关。
神经炎症和小神经胶质细胞的激活是许多脑病变的标志。在ALS以及其他神经变性障碍中，在疾病过程中，小神经胶质细胞将其表型从最初的有益细胞改变为对任何治疗干预(包括常规抗炎方法)有抗性的高度神经毒性和异常细胞。此外，越来越多的证据表明ALS和/或AD中的慢性脑炎症可能与外周先天免疫的显著失调相关(Zang等人2005,2009,2013)。我们最近的一系列实验揭示SRSF3活性的变化(例如其表达水平和/磷酸化的变化)可以调节脑中和外周的先天免疫应答。实际上，诸位发明人已经揭示SRSF3在对内毒素LPS全身注射的小神经胶质细胞应答(对感染的急性先天免疫应答的模型)中的作用。证明siRNA方法对内源SRSF3的靶向敲低可减轻SRSF3调节的先天免疫基因的翻译停滞，并且与蛋白的从头合成相关。
在一个方面，SRSF3可以用作用于调节/归一化髓系细胞(例如小神经胶质细胞或单核细胞)表型以在不同病理状况中恢复免疫功能的靶标。
在一个方面，SRSF3药剂用于治疗脑血管意外(CVA)，诸如由阻塞引起的缺血性中风或由血管破裂引起的出血性中风。对缺血后炎症的分析揭示SRSF3参与中风后小神经胶质细胞激活的调节。如图19A中所示，pSRSF3水平在中风后显著增加。双免疫荧光分析揭示，中风后pSRSF3的表达局限于Iba1阳性激活的小神经胶质细胞。中风后24小时鼻内递送靶向SRSF3的siRNA诱导内源蛋白的显著敲低(图20A-C)。本文描述了作为治疗方法的siRNA鼻内递送。所述疗法被设计为单剂量，其将对中风后免疫应答的延迟期/促再生期短暂地重新编程。siRNa介导的内源SRSF3的敲低诱导中风后3-5天先天免疫应答的显著增加，这是使用TLR2报告小鼠在体内可视化的。重要的是，先天免疫应答/小神经胶质细胞激活的延迟诱导与缺血灶大小的显著减小以及已知受SRSF3调节的某些免疫分子(诸如CCL3、CCL5和相关基因)的表达水平(蛋白)的延迟增加相关。因此，中风后24小时起始的SRSF3的靶向敲低增加中风后延迟的炎症应答并减少缺血灶(图21)。
总之，诸位发明人发现了参与髓系细胞的分子控制(例如小神经胶质细胞激活)的基于核糖体的机制/检查点。诸位发明人还证明RNA结合蛋白SRSF3作为高度上调的先天免疫基因翻译的主要调节物起作用，并因此在控制先天免疫应答中起关键作用。这为髓系细胞的靶向治疗性调节(例如小神经胶质细胞激活)和先天免疫应答开辟了途径。
序列表
表1：
Figure BDA0002571424680000161
Figure BDA0002571424680000171
定义
术语“受试者”是指任何易患或患有神经病症、中枢神经系统癌症、病毒感染或细菌感染的受试者。具体地，此类受试者可以是但不限于人、动物(例如猫、狗、牛、马等)。更具体地，受试者由人组成。
术语“易患”和“疑似”是指尚未经历或展示神经病症、中枢神经系统癌症、病毒感染或细菌感染的病理或症状，但可能具有发生神经病症、中枢神经系统癌症、病毒感染或细菌感染的增加概率或增加风险的受试者。
术语“mRNA”或“基因转录物”是指一种或多种前mRNA转录物、转录物加工中间体和准备用于翻译的一种或多种成熟mRNA。转录物加工可包括剪接、编辑和降解。
术语“上调的mRNA”是指与来自健康受试者的样品中编码特定多肽的mRNA的参考水平相比，来自易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、病毒感染或细菌感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、病毒感染或细菌感染的受试者的样品中编码相同特定多肽的mRNA的水平可检测地增加。
如在此使用的“编码先天免疫应答中所涉及的多肽的mRNA”包括来自编码免疫功能中所涉及的多肽的基因的mRNA，所述多肽在例如LPS激发后上调但未翻译，诸如SAA3、LCN2、CCL5、IRF7、CCL3、IFI44、IRGM1、GBP2、PLIN4、CP、GPR84、OASL2、IFIT1、USP18、GBP7、GM7676、CLEC7A、OLFR110、CH25H、LILRB4、GPNMB、CST7、OLFR111、CTLA2B、CD68、EIF4A2、TREM2或APOE。
先天免疫应答中所涉及的多肽包括在例如LPS激发后上调但未翻译的多肽，诸如SAA3、LCN2、CCL5、IRF7、CCL3、IFI44、IRGM1、GBP2、PLIN4、CP、GPR84、OASL2、IFIT1、USP18、GBP7、GM7676、CLEC7A、OLFR110、CH25H、LILRB4、GPNMB、CST7、OLFR111、CTLA2B、CD68、EIF4A2、TREM2或APOE。
编码先天免疫应答中所涉及多肽的mRNA还包括如本文所述的LPS注射后(例如在如实施例2中所述的小鼠模型中)上调的mRNA，诸如下表1中所述的那些。
表2：LPS注射后在上调mRNA的3'UTR上的相对SRSF3结合位点
Figure BDA0002571424680000181
Figure BDA0002571424680000191
编码先天免疫应答中所涉及的多肽的mRNA还包括下表2中所示的mRNA。
表3：在小神经胶质细胞免疫功能中有涉及并且在蛋白质组学分析中未检测到的在疾病(ALS小鼠模型中)晚期过表达的mRNA
Figure BDA0002571424680000192
表述“核酸”或“核酸序列”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列。所述术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的经修饰或取代的序列。本公开文本的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。所述序列还可以含有经修饰的碱基。
表述“3'UTR”是指对应于成熟mRNA的序列的3'非翻译区，其定位于蛋白编码区终止密码子的3'，优选紧邻蛋白编码区终止密码子的3'，并且延伸到聚(A)序列的5'侧，优选延伸到紧邻聚(A)序列5'侧的核苷酸。
表述“3'UTR结合位点”是指包含在mRNA的3'UTR序列中的核酸序列，其能够与能够结合所述序列的多肽特异性缔合。核酸序列的长度可以变化。单一3'UTR序列可以包含多个3'UTR结合位点。
表述“神经病症”是指涉及神经元的结构或功能的进行性丧失的病症。神经病症包括血管性痴呆、额颞叶变性(FTD)、阿尔茨海默病、运动神经元病(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、进行性延髓麻痹(PBP)、原发性侧索硬化(PLS)或肯尼迪病)和帕金森病。
表述中枢神经系统癌症包括星形细胞瘤、胶质母细胞瘤或少突神经胶质瘤。
表述“病毒感染”是指由病毒引起的感染。感染可以是或可以不是临床上明显的。所有形式的病毒感染都包括在此定义内，包括HIV、登革病毒(dengue virus)、流感病毒、EB病毒等的感染。
表述“细菌感染”是指由细菌引起的感染。感染可以是或可以不是临床上明显的。所有形式的细菌都包括在此定义内，包括球菌、杆菌、螺旋体、原生质球、原生质体等。此术语内还包括革兰氏阴性或革兰氏阳性的原核生物体。
表述“多肽或其片段”是指肽、寡肽和蛋白。此术语也不排除多肽的表达后修饰。例如，术语多肽涵盖包含糖基、乙酰基、脂质基团等的共价连接的多肽。如在此使用的，术语“其片段”是指可以包含例如全长参考多肽的多肽序列的50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的多肽。在一个方面，片段是功能性(例如保留完整多肽或多核苷酸的活性)的片段。
SRSF3(也称为SFRS3或SRp20)是称为富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子3(SEQ IDNO:12)的蛋白。SRSF3是本领域熟知的。例如，参见GenBank NM_003017.4或UniProtP84103。在一个方面，如本文使用的SRSF3是指全长的SRSS3或其片段。在一个方面，SRSF3包含至少一个RRM(RNA识别基序)结合结构域(SEQ ID NO:13)。在进一步的方面，SRSF3包含RS(丝氨酸-精氨酸二肽重复)结构域(SEQ ID NO:14)。在一个方面，SRSF3包含至少一个RRM(RNA识别基序)结合结构域(SEQ ID NO:13)、至少一个RS(丝氨酸-精氨酸二肽重复)结构域(SEQ ID NO:14)。在一个方面，SRSF3经磷酸化。
在进一步的方面，SRSF3包含GenBank NM_003017.4或UniProt P84103的SRSF3蛋白的天然序列或其功能片段。在一个实施方案中，SRSF3多肽包含与SEQ ID NO:12、GenBankNM_003017.4或UniProt P84103中所示序列的部分或全部至少65％到95％相同、至少65％、70％、75％、80％、85％、90％相同或至少95％相同的序列。
在一个实施方案中，SRSF3多核苷酸包含编码如本文所定义的SRSF3多肽的序列。在一个实施方案中，SRSF3多核苷酸包含与GenBank NM_003017.4或UniProt P84103中所示序列或其片段的部分或全部至少65％到95％相同、至少65％、70％、75％、80％、85％、90％相同或至少95％相同的多核苷酸。
如在此使用的表述“磷酸化SRSF3”是指已经通过磷酸化进行翻译后修饰的所有形式的SFSR3。特别地，它是指苏氨酸、丝氨酸、氢脯氨酸、羟赖氨酸、酪氨酸和/或任何其他非天然羟基氨基酸的侧链的羟基经磷酸酯基团酯化的SRSF3。SRSF3包含至少一个磷酸化位点。术语“磷酸化位点”是指分别出于磷酸化或去磷酸化的目的而被激酶或磷酸酶识别的氨基酸或氨基酸序列。
表述“SRSF3药剂”是指能够修饰SRSF3功能或表达的药剂。在一个方面，SRSF3药剂可抑制SRSF3翻译阻遏活性。在进一步的方面，所述药剂可抑制SRSF3结合至少一种mRNA的3'UTR的能力，所述mRNA编码先天免疫应答中所涉及的多肽。通过修饰SRSF3翻译阻遏活性，SRSF3药剂可以完全或部分恢复mRNA翻译，并且又可以使编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA的翻译增加。
“SRSF3药剂”包括可以抑制SRSF3的表达或功能的SRSF3药剂。在一个方面，SRSF3药剂抑制被磷酸化的SRSF3的活性或功能。在进一步的方面，SRSF3药剂是SRSF3特异性抗体(例如，单克隆抗体、单链抗体(单链变体片段)、人源化抗体和/或磷酸化SRSF3特异性抗体)、核酸(例如反义物、干扰RNA分子、siRNA或miRNA)、多肽、低分子量化合物或基因编辑系统。
在进一步的方面，基因编辑系统包括CRISPR系统、锌指核酸酶系统(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶系统(TALEN)。在一个方面，SRSF3药剂增加编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA的翻译。在进一步的方面，SRSF3药剂抑制SRSF3(例如至少一个RRM位点)与编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA(例如至少一个3'UTRSRSF3结合位点)之间的结合。
表述“CRISPR系统”是指与RNA指导链组合的内切核酸酶。内切核酸酶可以是但不限于I型CRISPR内切核酸酶、II型CRISPR内切核酸酶、III型CRISPR内切核酸酶、IV型CRISPR内切核酸酶、V型CRISPR内切核酸酶、VI型CRISPR内切核酸酶、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、Cpf1、CasX或CasY。
表述“指导RNA”(本文也称为“靶向DNA的RNA”)是指可以结合核酸酶(诸如Cas9或其核酸酶变体)并将核酸酶靶向靶DNA内的特定位置的RNA分子或一组RNA分子。指导RNA包含两个区段，“DNA靶向区段”和“蛋白结合区段”。这两个区段可以在同一RNA分子上，或者在两个或更多个单独的RNA分子上。DNA靶向区段包含与靶DNA链(即靶DNA的互补链)内的特异性序列互补的核苷酸序列。蛋白结合区段与核酸酶(诸如Cas9或Cas9相关多肽)相互作用。如上文所述，在Cas9的情况下，靶DNA的位点特异性切割发生在由以下两者确定的位置：(i)DNA-靶向区段与靶DNA之间的碱基配对互补性；和(ii)靶DNA中称为PAM序列的短基序。指导RNA可以包含修饰的碱基或骨架。
表述“抑制结合”是指药剂阻止或破坏SRSF3与特定核酸序列特异性物理接触的能力。抑制可以通过以下方式来发生：诱导SRSF3的二级结构或三级结构的构象变化，阻塞SRSF3的结合结构域和/或核酸序列上的结合位点，阻止SRSF3磷酸化，SRSF3的去磷酸化，SRSF3的蛋白水解，竞争性结合，SRSF3前mRNA的选择性剪接，阻止SRSF3mRNA翻译，SRSF3基因的突变，使SRSF3基因从细胞基因组中缺失，或抑制SRSF3与特定核酸序列特异性缔合的能力的任何其他机制。
表述“增加的多肽水平”是指相对于对照从样品中的mRNA翻译的多肽(例如上调但未翻译的多肽)的可检测地增加的水平。样品可以来自用SRSF3药剂治疗的受试者。对照可以是由未治疗受试者中同一mRNA翻译的多肽的参考水平。
表述“SRSF3特异性抗体”和“磷酸化SRSF3特异性抗体”是指如下抗体，所述抗体分别结合SRSF3或SRSF3的磷酸化形式的一个或多个表位，但基本上不识别且不结合含有抗原分子混合群体的样品中的其他分子。在一个实施方案中，SRSF3特异性抗体识别SRSF3的包含SRSF3的RRM结构域(SEQ ID NO:13)的至少一部分的区域，而磷酸化SRSF3特异性抗体识别SRSF3的至少包含SRSF3磷酸化位点和SRSF3的RS结构域(SEQ ID NO:14)的至少一部分的区域。
术语“siRNA”是指小的抑制性RNA双链体，其在细胞内的存在导致RNA干扰并导致siRNA所靶向的转录物的表达降低。这些分子在长度上可以变化(通常为18-30个碱基对)，并且含有与它们在反义链中的靶mRNA不同程度的互补性。一些但不是全部siRNA在有义链和/或反义链的5′或3′端上具有未配对的突出碱基。术语“siRNA”包括两个单独链的双链体，以及可以形成包含双链体区域的发夹结构的单链。
表述“反义物”描述寡核苷酸，其为寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、修饰的寡核糖核苷酸或修饰的寡脱氧核糖核苷酸，其在生理条件下与包含特定基因的DNA或所述基因的mRNA转录物杂交，从而抑制所述基因的转录和/或所述mRNA的翻译。这种表达包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)连接构成的寡核苷酸以及具有以类似方式发挥功能的非天然存在部分的寡核苷酸。由于期望的特性，诸如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性，此类修饰或取代的寡核苷酸可能优于天然形式。
根据本说明书的反义物与编码哺乳动物SRSF3的靶核酸的靶序列互补。如本文使用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸序列，其包括与根据本说明书的反义物互补的核酸序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与根据本说明书的反义物的连续核苷酸序列互补的区域组成。在一些实施方案中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列长，并且可以例如表示靶核酸的优选区域，所述优选区域可以被根据本说明书的若干反义物靶向。
根据第一方面，反义物抑制编码SRSF3的mRNA的翻译。根据另一方面，反义物靶向SRSF3的5'UTR(“非翻译转录区”)，即位于起始密码子(ATG)上游或与所述起始密码子重叠的mRNA部分。通过结合此区域，反义物将干扰转录和/或翻译，并因此使SRSF3基因至少部分失活。在进一步的方面，反义物靶向位于ATG上游的包含100个核苷酸的区域。在进一步的方面，反义物靶向关于ATG位于+1位和+25位之间的区域。
表述“低分子量化合物”包括除多肽和核酸之外的可以起作用以影响SRSF3的生物活性的任何化学部分或其他部分。小分子可以包括目前已知和使用的任何数目的治疗剂，或者可以是在用于筛选一种或多种生物学功能的目的的此类分子的文库中合成的小分子。
表述“髓系细胞”是指髓系谱系细胞，包括但不限于单核细胞、巨噬细胞和小神经胶质细胞。
表述“单核细胞”是指参与一线防御机制的一类白细胞，并且被认为能够分化成树突细胞或巨噬细胞前体。单核细胞通常在血液系统中运动。响应于外部刺激信号，单核细胞分泌许多免疫调节细胞因子，运动到组织中的感染部位并分化成巨噬细胞。
表述“小神经胶质细胞”(“microglial cell”或“microglia”)是指参与中枢神经系统内的免疫应答的介导的一类胶质细胞。小神经胶质细胞能够产生外泌体，并且进一步包括不同形式的小神经胶质细胞，包括变形虫样小神经胶质细胞、分支小神经胶质细胞和反应性或“激活的”小神经胶质细胞。小神经胶质细胞包括反应性小神经胶质细胞，其被定义为静止的分支小神经胶质细胞，所述小神经胶质细胞转化为反应性的、“激活的”、巨噬细胞样状态，并在脑损伤和炎症部位积累以参与免疫功能并且有助于组织修复和神经再生(Kreutzberg,1996)。小神经胶质细胞免疫活性受到抑制了不需要的炎症应答和组织破坏的专用免疫抑制途径限制，所述不需要的炎症应答和组织破坏经常与免疫激活相关。小神经胶质细胞经常获得对于脑保护和稳态所必需的稳定表型。
术语“表型”通常是指细胞或生物体的任何可观察到的特征。
表述“先天免疫应答”是指细胞或个体识别病原体和/或损伤的存在并对其作出应答的多种先天抵抗机制。如在此使用的，“先天免疫应答”包括当细胞识别损伤和/或病原体相关的分子模式或信号时发生的细胞内和细胞间事件以及反应。小神经胶质细胞一旦激活即可展现出先天免疫应答。
表述“髓系调节”是指通过SRSF3药剂的作用对髓系细胞的表型的修饰，或预防所述修饰。例如，在神经病症、癌症、细菌感染或病毒感染的情况下，SRSF3药剂可以增加从髓系细胞的免疫应答中所涉及的上调mRNA翻译的多肽的水平，由此将其表型从第一表型(例如异常)修改为第二表型(例如免疫)。
表述“小神经胶质细胞调节”是指通过SRSF3药剂的作用对小神经胶质细胞的表型的修饰，或预防所述修饰。例如，在神经病症、癌症、细菌感染或病毒感染的情况下，SRSF3药剂可以增加从小神经胶质细胞的免疫应答中所涉及的上调mRNA翻译的多肽的水平，由此将其表型从第一表型(例如异常)修改为第二表型(例如免疫)。此外，例如，小神经胶质细胞调节可以预防在神经病症发生开始时发生异常表型。在一个实施方案中，展现异常表型的小神经胶质细胞是指在神经病症、癌症、细菌感染或病毒感染的情况下不能生成有效的先天免疫应答的小神经胶质细胞。在一个实施方案中，展现免疫表型的小神经胶质细胞是指能够生成先天免疫应答功能(诸如但不限于吞噬)的小神经胶质细胞。
术语“样品”是指从受试者获得的并且可以用于诊断测定中的多种样品类型。所述定义涵盖血液、尿液、脑脊液和生物来源的其他液体样品。所述定义还涵盖固体组织样品，诸如样本或组织培养物的活检物或由其衍生的细胞，诸如皮层神经元、小神经胶质细胞、髓系细胞或脊髓提取物。
表述“候选化合物”包括能够与生物靶分子、特别是与蛋白相互作用以修饰其生物活性的化合物，诸如小分子、核酸、抗体或多肽。在一个实施方案中，候选化合物是SRSF3药剂。
表述“生物系统”是指合适的生物测定或生物模型。在一个方面，生物学测定可以是体外测定，其中测量SRSF3(或RRM结合位点)和mRNA(或其3'UTR)之间的相互作用，或测量SRSF3的活性或表达。生物学模型可以是允许评价SRSF3(或RRM结合位点)和mRNA(或其3'UTR)之间的相互作用、或评价SRSF3的活性或表达的任何合适的模型。所述模型可以是为了过表达SRSF3而修饰的生物体。
注意本说明书旨在涵盖化合物的所有药学上可接受的离子化形式(例如，盐)和溶剂化物(例如，水合物)，而不管是否指定了此类离子化形式和溶剂化物，因为本领域众所周知以离子化或溶剂化形式给予药剂。还应注意，除非指定特定立体化学，否则化合物的叙述旨在涵盖所有可能的立体异构体(例如，取决于手性中心的数目的对映异构体或非对映异构体)，而与化合物是以单个异构体还是异构体的混合物存在无关。
表述“药学上可以接受的盐”是指衍生自药学上可以接受的无机和有机的酸和碱的那些。合适的酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸(toleunep sulphonic acid)、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘2磺酸和苯磺酸。还包括衍生自氨基酸(例如L-精氨酸、L-赖氨酸)的盐。衍生自适当碱的盐包括碱金属(例如钠、锂、钾)和碱土金属(例如钙、镁)。
关于药学上可接受的盐，还参见列于Berge等人,Pharmaceutical Salts,J.ofPhar.Sci.,第66卷,第1期,1977年1月,第1-19页的表I中的经FDA批准的市售盐的列表。
本领域技术人员应当理解，化合物可以按不同的多晶型形式存在。如本领域已知的，多晶型现象是化合物结晶为超过一种不同的结晶或“多晶型”物质的能力。多晶型物是化合物的固体结晶相，所述化合物在固态下具有所述化合物分子的至少两种不同排列或多晶型形式。任何给定化合物的多晶型形式由相同的化学式或组成定义，并且在化学结构上与两种不同化合物的晶体结构不同。
应当理解，治疗中使用所需的化合物的量不仅随所选择的具体化合物而变化，而且还随给予途径、需要治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由主治医师决定。
期望剂量可以方便地以单剂量或以适当间隔给予的分次剂量(例如以每日两个剂量、三个剂量或更多个剂量)呈现。尽管可能的是，对于在疗法中的用途来说，可以按原料化合物形式给予化合物，但优选以药物组合物形式呈现活性成分。因此，本说明书进一步提供如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐连同一种或多种药学上可接受的载体以及因此任选地其他治疗和/或预防成分的药物组合或组合物。一种或多种载体必须是在与配制品的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上“可接受的”。
药物组合物包括适合用于口服、直肠、鼻、鼻内、粘膜、局部(包括颊和舌下)、透皮、阴道或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)给予的那些，或适合用于通过吸入或吹入给予的形式的那些。组合物可以在适当情况下方便地以离散的剂量单位呈现，并且可以通过药学领域中熟知的任何方法制备。所有方法都包括如下步骤：使活性物与液体载体或精细分散的固体载体或两者缔合，并且然后，如果需要，将产物成形为期望的组合物。
适合用于口服给予的药物组合物可以方便地作为各自含有预定量的活性成分的离散单位，诸如胶囊、扁囊剂或片剂；作为粉末或颗粒；作为溶液、悬浮液或作为乳液呈现。活性成分也可以作为推注剂、药糖剂或糊剂呈现。用于口服给予的片剂和胶囊可以含有常规赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。可以根据本领域熟知的方法将片剂包衣。口服液体制剂可以呈例如水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者可以作为用于在使用前用水或其他合适的媒介物形成的干燥产品呈现。此类液体制剂可以含有常规添加剂，诸如助悬剂、乳化剂、非水性媒介物(可以包括食用油)或防腐剂。
化合物还可以被配制成用于肠胃外给予(例如，通过注射，例如推注注射或连续输注)，并且可以单位剂型在安瓿、预填充注射器、小体积输注或具有添加的防腐剂的多剂量容器中呈现。这些组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，活性成分可以呈粉末形式(通过无菌分离无菌固体或通过从溶液中冷冻干燥获得)，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)形成。
对于向表皮的局部给予，可将化合物配制为软膏、乳膏或洗剂，或者配制为透皮贴剂。此类透皮贴剂可以含有渗透增强剂，诸如芳樟醇、香芹酚、百里酚、柠檬醛、薄荷醇和反式茴香脑。软膏和乳膏可例如用水性或油性基质并添加合适的稠化剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以用水性或油性基质配制，并且通常还将含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、稠化剂或着色剂。
适合用于在口腔中局部给予的组合物包括含片，其包含在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性成分；软锭剂，其包含在惰性基质(诸如明胶和甘油、或者蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；和漱口剂，其包含在合适的液体载体中的活性成分。
其中载体是固体的适合用于直肠给予的药物组合物例如作为单位剂量栓剂呈现。合适的载体包括可可脂和本领域中常用的其他材料，并且这些栓剂可以方便地通过以下方式形成：将活性化合物与一种或多种软化或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和成型。
适合用于阴道给予的组合物可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂呈现，其除了活性成分之外还含有如本领域已知为适当的此类载体。
对于鼻内给予，化合物或组合可以作为液体喷雾剂或可分散粉末或以滴剂的形式使用。滴剂可以用水性或非水性基质配制，所述水性或非水性基质还包含一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂。方便地从加压包装递送液体喷雾剂。
对于通过吸入给予，从吹入器、喷雾器或加压包装或递送气溶胶喷雾的其他方便手段方便地递送化合物或组合。加压包装可以包含合适的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量量的阀来确定。
替代性地，对于通过吸入或吹入给予，化合物或组合可以采取干粉组合物的形式，例如化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以在例如胶囊或药筒或例如明胶或泡罩包装(可以借助于吸入器或吹入器从其中给予粉末)中的单位剂型呈现。
如本文使用的，表述“可接受的载体”意指可以给予于受试者而没有不良作用的用于本文所述的组合和化合物的媒介物。本领域已知的合适载体包括但不限于金颗粒、无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可以包括助剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、增粘添加剂、有色剂等。
应当理解，治疗中使用所需的化合物的量不仅随所选择的具体化合物而变化，而且还随给予途径、需要治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由主治医师决定。然而，通常合适的剂量将在每天约0.001mg/kg体重到每天约100mg/kg体重范围内，例如，在每天0.01mg/kg到每天50mg/kg范围内，或者例如，在每天0.1mg/kg到每天40mg/kg范围内。所述化合物可以方便地以单位剂型给予；例如每单位剂型中含有1mg到2000mg、10mg到1500mg、方便地20mg到1000mg、最方便地50mg到700mg活性成分。
在本说明书的另一实施方案中，可以基于实验模型的结果，任选地与本说明书的测定结果组合，来估计剂量。通常，活性化合物的每天口服剂量将为约每天0.01mg/kg到每天2000mg/kg。每天一次或几次给予的10mg/kg到500mg/kg范围内的口服剂量可以产生合适的结果。在特定受试者在此类剂量下应答不足的情况下，甚至可以在患者耐受性允许的程度上采用更高剂量(或通过不同的、更局部的递送途径的有效更高剂量)。在一些情况下，还设想到每天多次剂量以实现组合物的适当全身水平。
通过参考以下实施例将更容易理解本发明。这些实施例是本发明的宽范围适用性的说明，而不旨在限制其范围。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中做出修改和变化。虽然在用于测试本发明的实践中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但描述了优选的方法和材料。本文引用的已授权专利、已公布的专利申请和参考文献特此通过引用并入，其程度如同具体地和单独地指出每篇通过引用并入本文一样。在不一致的情况下，将以本公开文本为准。
实施例
实施例1
CD11brGFP转基因小鼠的生成和表征
为了在体内从小神经胶质细胞鉴定细胞类型特异性mRNA和蛋白谱，构建了表达在人CD11b启动子(SEQ ID NO:1)转录控制下与大亚基核糖体蛋白L10a的N-末端融合的Flag-EGFP(Flag-EGFP-RPL10a)的转基因小鼠模型(图1A和图1B)。在先前的工作中，已经表明人CD11b启动子有效地驱动小神经胶质细胞转基因表达(Gowing等人,2006；Lancette-Hebert等人,2007)。转基因小鼠是能活的，并且不产生显性表型。在本实验中，选择了展现适当的小神经胶质细胞特异性转基因表达的称为CD11brGFP的小鼠系。为了确认Flag/EGFP-RPL10a(F/EGFP-L10a)转基因的表达确实局限于小神经胶质细胞，进行了用于EGFP和CD11b/Iba1(两种常用的小神经胶质细胞标记物)的双免疫荧光分析。如图1C到图1E中所示，双免疫荧光分析揭示，在脑组织中，在基线条件下和LPS刺激后，CD11b驱动的转基因(GFP染色)与内源CD11b和Iba1免疫染色共定位。如先前所报道的(Gravel等人,2016；Lancette-Hebert等人,2009)，全身性LPS注射诱导小神经胶质细胞形态的显著变化并增加GFP荧光的表达(图1E)。作为另外的概念验证(proof-of-concept)对照，使来自使用Flag表位的CD11brGFP原代小神经胶质细胞培养物的小神经胶质细胞核糖体选择性地免疫沉淀(IP)。如图1F中所示，蛋白质印迹分析确认Flag珠粒对F/EGFP-L10a转基因的免疫结合，因此进一步验证了转基因模型系统。
实施例2
激活的小神经胶质细胞的翻译谱型分析(profiling)揭示了高度调节的先天免疫基因聚类
迄今为止，已经提出了参与免疫基因的紧密转录和转录后控制的多种调节机制(关于综述(Anderson,2010；Carpenter和Fitzgerald,2015；Carpenter等人,2014))。然而，体内机制仍属未知。为了体内评估小神经胶质细胞激活的分子标记，通过在基线条件下和急性先天免疫激发后进行平行转录组和蛋白质组分析而利用CD11brGFP小鼠模型和修饰的翻译亲和纯化(TRAP)方法。作为实验范例，使用标准LPS激发(Laflamme等人,2001；Laplancette-Hebert等人,2009)。重要的是，全身性LPS不会导致外周细胞的浸润，因此先天免疫应答由CD11b阳性固有小神经胶质细胞介导(Chen等人,2012)。先前已经证实，全身(静脉内)注射LPS诱导在注射后24小时达到峰值的固有小神经胶质细胞激活波(Lancette-Hebert等人,2009)，因此在LPS后24小时，使用抗Flag琼脂糖亲和树脂使脑组织均质物免疫沉淀，并且将多核糖体复合物用于i)mRNA提取，之后进行Affymetrix Mouse Genome 430分析，或ii)肽提取，之后进行高分辨率无标记蛋白质组学分析。实验策略示意性地呈现在图2A中。统计分析揭示LPS与对照相比显著改变661种转录物的表达。其中，394种基因被上调，而267种基因被下调(1.2倍差异或更大)。对于数据可视化，用统计学显著(p<0.05)的基因构建分层聚类(图2B)。基于聚类，观察到两个聚类(图2B：缩放1和缩放2)，其中LPS条件包括与对照显著解离的最上调的转录物。此外，将这些转录物的大部分分类为参与免疫应答。与先前的工作(Madeddu等人,2015)一致，最高度上调的转录物是：血清淀粉样蛋白A3基因(Saa3)(29.52倍变化)和脂质运载蛋白2(Lcn2)(23.71倍变化)。这两种基因都与对感染的急性期免疫应答有关联(Flo等人,2004；O'Brien和Chait,2006)。第三最上调的转录物是趋化因子(C-C基序)配体5(Ccl5/Rantes，15.93倍增加)。RANTES是许多慢性炎症和自身免疫过程中涉及的C-C亚家族趋化因子成员(Danoff等人,1994)。表4总结了前50种上调的转录物。
表4：前50种上调的转录物
Figure BDA0002571424680000301
Figure BDA0002571424680000311
Figure BDA0002571424680000321
实施例3
高度上调的LPS转录物未翻译
为了比较小神经胶质细胞转录组与实际的细胞类型特异性蛋白质组，采用TRAP方案并在LPS激发后24小时收集核糖体相关肽(Cao和Gebale,1996)，并且进行无标记的定量质谱分析。与高度调节的mRNA/转录物相反，LPS注射改变了一百种蛋白的表达水平。进一步，68％的检测蛋白被下调至少1.2倍，而32％被显著上调至少1.2倍。在所测序的肽中未检测到聚类1和聚类2(图2B和图2C)中呈现的高度上调的免疫转录物。这进一步通过蛋白质印迹分析来确认。首先，以细胞类型特异性方式验证3种最上调mRNA(Saa3、Lcn2和CCl5)的蛋白表达水平，并使用识别所选蛋白的N末端的抗体对核糖体附着的小神经胶质细胞肽进行蛋白质印迹分析。如图2D中所示，在蛋白水平上没有检测到前3个在mRNA水平上高度上调的基因。相比之下，使所选的未调节的与核糖体结合的mRNA(诸如CAP2和肌动蛋白)被翻译并通过定量质谱和蛋白质印迹分析检测到。这通过对TRAP洗脱均质物进行的蛋白质印迹分析来验证(图2D)。如图2D和图2E中进一步所证实的，来自全脑组织均质物的蛋白质印迹分析揭示LPS激发后SAA3和CCL5蛋白水平没有显著增加。未调节的对照(CAP2和肌动蛋白)被翻译并以预期水平检测到。例外是LCN2的表达模式。这与先前的证据一致，证实lcn2可能以mRNA水平存在于小神经胶质细胞中，然而，脑中LCN2蛋白的主要来源是星形胶质细胞和内皮细胞(Flo等人,2004；Jin等人,2014；Lee等人,2015)。值得注意的是，未调节的转录物通常被翻译并通过质谱以预期水平检测到(表5和表6)。总之，本发明的结果表明，所观察到的翻译阻遏局限于与小神经胶质细胞NF-κB网络直接相关的高度上调的免疫转录物聚类(图7)。
表5：上调肽的列表
Figure BDA0002571424680000331
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表6：炎症和免疫应答网络：未调节mRNA和肽的列表
Figure BDA0002571424680000342
Figure BDA0002571424680000351
Figure BDA0002571424680000361
实施例4
LPS激活的小神经胶质细胞展现mRNA和蛋白的不同分子标记
接着，进行研究以理解高度调节的免疫基因的观察到的翻译阻遏如何影响激活的小神经胶质细胞的生物学功能。为了获得对LPS激发的小神经胶质细胞应答的全视图，使用Cytoscape(Shannon等人,2003)和ClueGo聚类分析(Bindea等人,2013；Bindea等人,2009)，并对所有受调节的mRNA/蛋白功能(图3A和图3B)的图谱作图。如图3A和图3B所示，功能注释聚类揭示了小神经胶质细胞mRNA和蛋白对先天免疫激发的应答的显著差异。LPS调节的转录物网络高度富集上调的项/功能(红色节点)，而LPS调节的肽网络高度富集下调的项/功能(绿色节点)。显著的趋异性还反映在最高的生物学功能上。如图3C中所示，鉴定出与上调转录物相关的前10种生物学功能。这些功能中的大多数与炎症和免疫应答有关，因此完美概括了由LPS激发触发的导致NF-κB信号传导激活的炎症级联(Medzhitov和Horng,2009)。与高度特化的免疫mRNA应答相对比，上调蛋白的前10种生物学功能局限于细胞骨架、RNA代谢和管家功能(图3D)。因此，结果揭示，与核糖体结合且高度调节的先天免疫基因的选择性翻译阻遏有助于在激活的小神经胶质细胞中形成独特/趋异的mRNA和蛋白分子标记。
实施例5
先天免疫应答中基因表达的翻译调节
尽管在真核生物中，起始被认为是经常为调节目标的翻译的限速步骤(Gao和Roux,2015；Sonenberg和Hinnebusch,2009)，但结果揭示mRNA的调节也在核糖体处翻译起始后发生。这表明通过基于核糖体的机制高度调节的先天免疫基因的控制/检查点的附加层。考虑到大多数转录后控制机制靶向mRNA的3'非翻译区(3'UTR)以阻遏和/或激活靶标转录物的表达(Anderson,2010)，假设高度上调的基因(诸如Saa3)的3'UTR可以含有造成所观察到的翻译阻遏的调节序列。为了解决这个问题，将Saa3转录物的野生型3'UTR克隆于在SV40启动子/调节元件控制下的由萤光素酶组成的pGL3-报告质粒中(图4A)。分别用pGL3载体(pGL3)、pGL3-启动子-Saa3-3'UTR-wt载体(pGL3-Saa3-3'UTR-wt)(SEQ ID NO:2)或pGL3-启动子-乱序载体(pGL3-乱序)(SEQ ID NO:3)转染HEK293细胞系。重要的是，pGL3-Saa3-3'UTR-wt载体的转染显著降低报告载体活性(几乎80％)，而pGL3-乱序载体的转染恢复萤光素酶活性接近对照水平(pGL3载体)(图4B)，因此清楚地证实Saa3-3'UTR中调节元件的存在。为了确认pGL3-Saa3-3'UTR-wt转染后萤光素酶活性的损失是由翻译阻遏(而不是由mRNA稳定性和/或降解的改变)引起的，使用稳定表达F/EGFP-L10a质粒的BV2细胞。用pGL3和pGL3-Saa3-3'UTR-wt载体转染后四十八小时，使用TRAP方案纯化mRNA，然后在两种条件下通过实时q-PCR定量编码萤光素酶的核糖体相关mRNA。如图4C中所示，分析揭示，向pGL3载体添加Saa3-3'UTR不引起核糖体相关萤光素酶mRNA的显著变化(184 x 103±27 x103，pGL3相比于240 x 103±35 x 103 pGL3-Sa a3-3'UTR-wt，n＝6)，因此表明Saa3 3'UTR介导的机制通过直接抑制核糖体结合mRNA的翻译而起作用。
已经证实Saa3-3'UTR在蛋白表达调节中的重要作用，寻求鉴定参与观察到的翻译阻遏的特定3'UTR区域。已知RNA结合蛋白(RBP)和微小RNA(miRNA)于mRNA表达的调节中起重要作用(Glisovic等人,2008；Nilson和Asmann,2007)。通过使用RBP作图网站(Paz等人,2014)，对Saa3-3'UTR中的相对RBP位置(图4D)作图。生物信息学工具(RBPpmap)预测了以不同分布结合Saa3 3'UTR的若干RBP。所有这些点都被指导到将Saa3 3'UTR分成3个区段(A、B和C)(图4D)。为了研究每个区段的功能相关性，创建了含有Saa3-3'UTR的不同区段的报告质粒(图4E)(SEQ ID NO:4到7)。用所示质粒转染HEK293细胞且48小时后进行萤光素酶活性测定。如图4F中所示，含结构域A、C、B缺失或结构域B+C缺失的Saa3-3'UTR构建体部分地减轻了翻译抑制并逐渐增加了萤光素酶活性。虽然完整的3'UTR序列显著降低了萤光素酶活性，但所测试的缺失突变体逐渐恢复萤光素酶活性，表明3个结构域中的每一个都含有在Saa3转录物翻译抑制中起类似程度作用的调节元件(Ciafre和Galardi,2013；Jiang和Coller,2012)。
实施例6
富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3用作先天免疫基因翻译的主要调节物
考虑到Saa3的完整3'UTR(A、B和C结构域)在SAA3蛋白表达的转录后调节中的重要性，假设所观察到的翻译阻遏由结合3'UTR的所有三个结构域的RBP协调。有趣的是，满足此准则的RBP之一是富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3(SRSF3/SRp20)(图4D)(SEQ ID NO:12)。实际上，发现SRSF3结合Saa3的完整3'UTR，并且沿着128bp-3'UTR具有多于二十个推定的结合位点。重要的是，将SRSF3mRNA和蛋白在转录组/蛋白质组分析中鉴定为LPS激发后未调节的核糖体结合mRNA/肽(mRNA倍数变化，LPS相比于CTL：1.11；ANOVA p值＝0.953；LFQ倍数变化，LPS相比于CTL：1.01，LFQ t-学生检验＝0.894)。SRSF3属于富丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白家族，其含有在RNA代谢中具有功能意义的12种哺乳动物RNA结合蛋白。SR蛋白携有N末端处的一个或两个RNA识别基序(RRM)结构域(SEQ ID NO:13)以及C末端处的丝氨酸-精氨酸二肽重复(RS)结构域(SEQ ID NO:14)(Manley和Krainer,2010)。与其他SR蛋白一样，SRSF3也参与选择性剪接事件，然而，最近的报道强调了其在参与转录后调节的机制中的作用，诸如mRNA输出、监视、稳定性和翻译(Kim等人,2014)。证据表明SR蛋白的活性受磷酸化/去磷酸化循环的调节(Misteli和Spector,1997)，因此首先分析LPS激发是否改变SRSF3的磷酸化水平。实际上，LPS将BV2细胞中磷酸化的SRSF3水平增加了2.5倍(图5A和图5B)，而总SRSF3的水平没有显著变化，如通过蛋白质组学所报告的以及通过蛋白质印迹分析所确认的(图5C和图5D)。为了直接评估SRSF3是否是参与SAA3翻译阻遏的RBP，使用针对内源SRSF3的小干扰RNA(siRNA)(SRSF3-siRNA)(SEQ ID NO:8到11)进行SRSF3敲低。如上文所述(图4)，在存在针对内源SRSF3(SRSF3-siRNA)或对照(CTL-siRNA)的小干扰RNA(siRNA)的情况下，用pGL3载体或pGL3-Saa3-3'UTR-wt转染BV2细胞。如图5E和图5F所示，300nM siRNA有效地敲低SRSF3，导致内源SRSF3蛋白表达水平显著降低40％(图5F)。接着，研究SRSF3是否直接负责SAA3的翻译阻遏。如图5G中所示，pGL3-Saa3-3'UTR与抗SRSF3的siRNA的共转染恢复了萤光素酶活性，揭示SRSF3参与3'UTR介导的Saa3的翻译阻遏。如通过蛋白质印迹分析所进一步确认的，SRSF3-siRNA(300nM)诱导的敲低导致LPS激发的BV2细胞中SAA3内源蛋白水平的3.01倍显著增加(图5H和图5I)。接着，研究SRSF3介导的翻译阻遏是否可以表示参与高度调节的免疫基因/mRNA的翻译调节的更一般的机制。为了解决这个问题，选择来自聚类1的高度调节的转录物(图2B；缩放1)：Lcn2、Ccl5和Ccl3。即，所有列出的基因都属于在测序的肽中未检测到的高度上调的转录物聚类。接着，使用生物信息学工具来搜索在所选基因的3'UTR处的潜在SRSF3结合位点。如图5J中所示意性呈现的，对于SRSF3，分别沿Lcn2、Ccl5和Ccl3的3'UTR观察到潜在结合位点的大量分布。为了研究SRSF3是否参与Lcn2mRNA、Ccl5mRNA和Ccl3mRNA的翻译阻遏，进行了一系列SRSF3敲低实验。如先前所述，在siRNA-SRSF3或CTL siRNA(SEQ ID NO:8到11)的存在下，对LPS激发的BV2细胞进行实验。如图5K和图5L中所示，在CTL siRNA的存在下，LPS引起CCL3水平的初始增加，然而，SRSF3的敲低进一步消除了所观察到的翻译阻遏。如通过蛋白质印迹分析所揭示的，SRSF3敲低与LCN2(4.89倍增加)、CCL5(2.5倍增加)和CCL3(2.19倍增加)蛋白水平的显著上调(当与对应的对照相比时)相关，因此清楚地表明SRSFR3在来自聚类1的高度调节转录物的翻译阻遏中的作用。如前面呈现的表1中进一步揭示的，基于筛选数据，几种其他高度调节的转录物的3'UTR区富集用于SRSF3的推定结合位点，因此提高了SRSF3可以充当先天免疫基因翻译的主要调节物的可能性。
实施例7
SRSF3在体内控制先天免疫级联
为了评估SRSF3在体内的作用，使用先前生成的TLR2-luc-GFP报告小鼠(Lancette-Hebert等人,2009)。在此转基因模型中，萤光素酶和GFP在鼠TLR2基因启动子的转录控制下共表达，因此可以使用高分辨率/高灵敏度CCD相机从活小鼠的脑实时可视化先天免疫应答/小神经胶质细胞激活(Lancette-Hebert等人,2009；Lancette-Hebert等人,2012)。与先前的报道一致，全身性LPS引起刺激后24小时达到峰值的在激活的小神经胶质细胞中TLR2信号的稳健诱导(Gravel等人,2016；Lancette-Hebert等人,2009)(图6A-6D)。如进一步证实的，TLR2驱动的转基因GFP的双免疫荧光分析揭示GFP免疫染色与小神经胶质细胞标记物CD11b的完美共定位(图6E)。基于体外实验中获得的结果，假设siRNA介导的内源SRSF3靶向敲低将在体内减轻炎性基因的翻译阻遏，因此导致放大的先天免疫应答和增加的脑TLR2信号。初始鼻内递送后48小时，20μg siRNA(SEQ ID NO:8到11)诱导有效的敲低，导致内源SRSF3蛋白表达水平的60％降低(图6F和图6G)。所述方案的示意性表示呈现在图6H中。考虑到在鼻内递送后48小时获得最佳SRSF3敲低，并且脑中的峰TLR2应答在全身注射后24小时出现，为了可视化SRFF3敲低的体内效应，在siRNA递送后24小时向TLR2-luc-GFP小鼠注射LPS(腹膜内)并且此后24小时使其成像。在LPS注射前(基线)(图6I)和LPS注射后24小时(图6J和图6K)评价TLR2应答。如图6J和图6K中所示，当与对照(乱序siRNA)相比时，siRNA介导的SRSF3敲低在体内诱导了TLR2应答的显著增加。图6L中生物光子信号的定量分析显示SRSF3-siRNA+LPS-24小时实验组中TLR2信号强度与单独的乱序+LPS-24小时或LPS-24小时相比2.18倍和3.41倍的显著增加。如图6M和图6N中进一步揭示的，SRSF3-siRNA+LPS-24小时治疗动物的脑切片的免疫荧光分析揭示，当与乱序+LPS-24小时相比时，小神经胶质细胞的更激活的“变形虫样”形态。定量分析揭示，当与对应的对照相比时，SRSF3-siRNA+LPS-24小时治疗的动物的脑切片中Iba1信号显著增加(图6O)。重要的是，通过siGLO确认siRNA递送到小神经胶质细胞的效率(图8A到图8P)。此转染指示剂作为成功转染的清晰信号定位于细胞核。最后，对通过磁性CD11b微珠从新鲜脑均质物分离的纯化小神经胶质细胞进行的蛋白质印迹分析显示LPS激发后SRSF3的敲低减轻了炎性基因的翻译阻遏。实际上，观察到SAA3(3.91倍增加)、LCN2(3.15倍增加)、CCL5(5.12倍增加)和CCL3(2.78倍增加)的内源小神经胶质细胞蛋白水平的显著上调(图6P和图6Q)。总之，结果证实SRSF3在体内激活的小神经胶质细胞中高度上调的先天免疫基因的翻译控制中起关键作用。
实施例8
由于pSRSF3的水平在SOD1突变小鼠的脊髓中随时间而增加，因此SRSF3在ALS中有涉及。
使用完整的脊髓提取物确定处于症状前(50天)、症状性(135天)和晚期(158天)的疾病中磷酸化SRSF3的水平。将每种条件与用作对照的野生型小鼠(135天)进行比较。以1:1000的浓度使用单克隆抗体(抗磷酸化表位SR)。使用多克隆抗SRSF3(1:5000)确定总SRSF3。图9显示对于总SRSF3(A)和磷酸化SRSF3(B)的定量蛋白质印迹分析。SRSF3水平在症状前ALS(SOD1突变小鼠50d、135d、158d)中显著增加，而磷酸化水平随着疾病进展(SOD1突变小鼠50d、135d、158d)而显著增加。此外，图9C显示158天SOD1G93A小鼠的转录组谱与在LPS激发的小鼠中所观察到的相似，如本文所述。此外，生物信息学揭示了上调的mRNA中的一些(Clec7a、Cst7)可能高度富集SRSF3结合位点。这些结果的组合指向：通过对高度上调的mRNA的翻译阻抑而在ALS中涉及SRSF3。
实施例9
正常衰老和额颞叶痴呆小鼠模型(TDP-43G348C)中总SRSF3和pSRSF3的增加水平
使用全脑提取物(皮层)分析额颞叶痴呆小鼠模型(TDP-43G348C)和正常衰老小鼠模型以确定症状前TDP-43G348C(2-3个月)和症状性TDP-43G348C(1年)以及它们在野生型中的对应对照中磷酸化SRSF3的水平。以1:1000的浓度使用单克隆抗体(抗磷酸化表位SR)。使用多克隆抗SRSF3(1:1000)确定总SRSF3。图10显示蛋白质印迹分析，其中TDP-43G348C小鼠中总SRSF3和磷酸化SRSF3的水平与它们的对应对照相比增加。
实施例10
来自散发性ALS患者的脑脊液
将来自散发性ALS患者和对照患者的人脑脊液(CSF)用丙酮浓缩，并用于分别使用抗磷酸化表位SR抗体(1:250)和多克隆抗SRSF3抗体(1:500)评估磷酸化SRSF3和总SRSF3的水平。结果示于图11A-G中。
实施例11
靶向SRSF3/pSRSF3的反义吗啉代寡核苷酸的开发和验证
为了验证SRSF3在ALS中作为免疫调节性治疗靶标，生成靶向内源SRSF3的抗SRSF3吗啉代化合物(抗SRSF3ASOM)并测试。如图12中所描述和示意性呈现的，ASOM是25个核酸碱基的短链，其靶向SRSF3的5'UTR并结合互补mRNA。作为一种机制，它阻断SRSF3翻译的起始并最终引起内源蛋白的敲低。ASOM序列呈现于图12的图例中。使用ALS小鼠模型(SOD1G93A小鼠)于体内环境中测试治疗的功效。如图13中所证实的，抗SRSF3ASOM的鞘内递送在ALS小鼠的脊髓中诱导内源SRSF3的有效敲低。SRSF3敲低与从靶向mRNA从头合成蛋白相关(SRSF3调节的mRNA，参见图9)。结果清楚地显示靶向内源SRSF3的ASOM可以用于诱导蛋白的从头合成，并因此对疾病影响的小神经胶质细胞中的先天免疫应答有效地重新编程。还测试了ASOM靶向SRSF3和外周免疫细胞处的免疫应答的功效。即，pSRSF3水平在ALS患者和ALS小鼠的血浆中增加。使用腹膜内(i.p.)递送测试ASOM的功效。如图14A-C中所示，ASOM的腹膜内递送诱导血浆(小鼠单核细胞/巨噬细胞)中内源SRSF3的有效敲低。重要的是，在症状性疾病处起始的ASOM的腹膜内递送在ALS的SOD1G93A模型中具有显著的治疗效果。如图14A、图14D、图14E中进一步描述的，在疾病晚期(瘫痪发作后)起始的ASOM(25mg/kg 1x周)治疗显著增加ALS小鼠的存活(21天)。所观察到的存活增加与转棒仪测试中评价的感觉运动缺陷的显著改善相关。此外，ASOM治疗效果的详细分析揭示，用抗SRSF3ASOM的治疗逆转了肌肉和脾的萎缩(图15A-D)并保持SOD1G93A小鼠脊髓中的运动神经元。重要的是，腹膜内递送的ASOM的治疗效果与脊髓中小神经胶质细胞激活的增加相关。总之，结果清楚地证实SFSF3在ALS影响的小神经胶质细胞/巨噬细胞/单核细胞中作为免疫应答的调节物起作用。鉴于上述情况，在疾病晚期用ASOM靶向内源SRSF3在ALS中是治疗性的。
实施例12
靶向SRSF3的RRM结构域的抗体
治疗性调节SRSF3的另一种策略是阻断和/或破坏其与靶免疫mRNA的相互作用。为了破坏SRSF3与其靶mRNA的相互作用，生成了靶向SRSF3的RRM结构域的独特治疗性单克隆抗体(Mab121)。所鉴定的对SRSF3RRM结构域特异的序列(图17A中加下划线)和测试单克隆抗体(MAb)功效的验证策略显示于图17中。在免疫程序后，获得MAB的10个克隆，并且如图18A中进一步所示，选择以高亲和力识别SRSF3肽序列的4个克隆。对用表达Saa33'UTR的PGL3载体稳定转染的稳定HEK细胞进行的验证萤光素酶测定(本文详细描述的测定)显示用含有Mab抗体(克隆155号)的血清处理恢复了萤光素酶活性，因此减轻了由SRSF3结合Saa33'UTR所引起的翻译停滞(图18B)。独特的免疫原性序列是GNNGNKTELERAFGYYGPLRSV
实施例13
SRSF3介导的脑缺血和阿尔茨海默病(AD)的机制的证据。靶向SRSF3在中风后是保护性的
对缺血后炎症的分析揭示SRSF3参与中风后小神经胶质细胞激活的调节。如图19A中所示，中风后pSRSF3的水平显著增加，而总SRSF3蛋白的表达降低。双免疫荧光分析揭示，中风后pSRSF3的表达局限于Iba1阳性激活的小神经胶质细胞。中风后24小时鼻内递送siRNA诱导内源蛋白的显著敲低(图20A-C)。本文描述了作为治疗方法的siRNA鼻内递送。所述疗法被设计为单剂量，其将对中风后免疫应答的延迟期/促再生期短暂地重新编程。siRNa介导的内源SRSF3的敲低诱导中风后3-5天先天免疫应答的显著增加，这是使用TLR2报告小鼠在体内可视化的。重要的是，先天免疫应答/小神经胶质细胞激活的延迟诱导与缺血灶大小的显著减小以及已知由SRSF3调节的某些免疫分子(诸如CCL3、CCL5)的表达水平(蛋白)的延迟增加相关。因此，中风后24小时起始的SRSF3的靶向敲低增加了中风后延迟的炎症应答并减小了缺血灶(图21)。
实施例14
阿尔茨海默病(AD)的淀粉样前体蛋白(APP)小鼠模型中的SRSF3表达模式
AD的APP小鼠模型的脑中SRFS3表达模式的分析揭示pSRSF3水平在7-9月龄开始的显著增加(Borchelt等人,1997)。在此小鼠模型中，此时间点(7-9月龄)与认知缺陷的发作一致(图22A、图22B)。APP小鼠脑切片的免疫荧光分析揭示pSRSF3的表达局限于β淀粉样蛋白斑周围的激活的Iba1阳性小神经胶质细胞。在对照中未检测到pSRSF3免疫反应性。如图23A中进一步所示，为了验证神经炎症，分析了作为阳性对照的GFAP的表达水平，因为已知此蛋白水平的增加和相关星形胶质细胞增生参与APP小鼠模型中的炎症应答。分析了已知在AD影响的小神经胶质细胞(Kang等人2018，Keren-Shaul等人,2017)中诱导的高度调节的且与疾病相关的mRNA(也发现于ALS小神经胶质细胞(Keren-Shaul等人,2017)中)的蛋白表达水平，并且已知其由SRSF3调节。如图23C中所示，来自CLE7A表达水平适度增加的一部分，其他高度上调的mRNA在蛋白水平上不受调节(图23C、图23D)。在APP小鼠中测试了抗SRSF3ASOM的鼻内递送。如图24中所示，单剂量诱导APP小鼠脑中内源SRSF3的有效敲低(1周时间段的持续时间)。越来越多的证据表明AD中先天免疫应答失调，因此用SRSF3拮抗剂-抗SRSF3ASOM治疗可在AD中具有治疗潜力。
材料和方法
DNA构建体、转基因小鼠的生成和基因分型
将CD11b启动子亚克隆到pBluescript KS+中(pBSKS-CD11b)。使用pEGFP-N3质粒作为模板(CLONTECH)通过PCR获得Flag-EGFP片段。将所获得的片段引入pBSKS-CD11b质粒中。将对应于60s核糖体蛋白L10a(RPL10a)的基因组DNA的2.5Kb BamHI/NotI片段引入pBSKS重组载体中。通过测序(SEQ ID NO:1)验证最终构建体的完整性。在琼脂糖凝胶上分离5.2Kb的XhoI-XhoI DNA片段用于显微注射。通过对尾部样品进行的针对EGFP基因的PCR扩增，对转基因小鼠进行基因分型。从F/EGFP-Rpl10a转基因小鼠扩增329bp的EGFP片段。对成年的2-3月龄的雄性和雌性小鼠进行了实验。所有实验程序都得到了拉伐尔大学动物护理伦理委员会(Laval University animal care ethics committee)的批准(方案17-063-1号和14-096-4号)，并且依照加拿大动物护理委员会实验动物护理和使用指南(The Guideto the Care and Use of Experimental Animals of the Canadian Council on AnimalCare)。
TRAP方案
使用Heiman和其同事所述的稍作修改的TRAP方案(Heiman等人,2008)。简单地说，将脑皮层样品置于冰冷的解剖缓冲液中，之后在组织裂解缓冲液中均质化(10％wt/vol)。然后将样品在4℃下以2000g离心10分钟。将1/9样品体积的10％NP-40和1/9样品体积的300mM DHPC添加到上清液中。然后将样品在定轨摇床上在4℃下孵育30分钟。通过在4℃下以20000g离心10分钟来回收不溶性材料。将每个上清液分成两个等分试样。(一个等分试样将用于mRNA提取，而另一个将用于肽洗脱)。将各样品直接添加到抗Flag琼脂糖亲和树脂，并在定轨摇床上于4℃下孵育过夜。第二天，通过离心回收珠粒，并用高盐缓冲液(20mMHepes-KOH pH 7.3、200mM KCl、12mM MgCl2、1％NP-40、0.5mM DTT、100μg/ml放线菌酮)洗涤3次。将珠粒沉淀用于mRNA纯化或肽纯化。
在TRAP方案后从F/EGFP-RPL10a小鼠纯化mRNA
在最后一次洗涤后，将珠粒沉淀再悬浮于100μl含β-巯基乙醇的Nanoprep裂解缓冲液中，并在室温下孵育10分钟。根据试剂盒制造商说明书(Absolutely RNA Nanoprep试剂盒)进行RNA提纯。对每个实验进行三个生物学重复。对于每个重复，n＝5。对收集的RNA进行Affymetrix小鼠基因芯片分析。
在TRAP方案后从F/EGFP-RPL10a小鼠纯化肽
在最后一次洗涤后，去除所有剩余的洗涤缓冲液并将珠粒沉淀再悬浮于EDTA洗脱缓冲液(10mM Hepes-KOH pH 7.3、150mM KCl、5mM MgCl2、20mM EDTA、蛋白酶抑制剂)中，并在定轨摇床上在室温下孵育30分钟。将EDTA洗脱缓冲液用于解离核糖体并释放新生链肽。通过以7000rpm离心15分钟来回收洗脱物。通过使用Orbitrap fusion质谱仪进行质谱分析对收集的核糖体相关肽进行测序。对此实验进行三个技术重复(对于每种条件，n＝5)。
体内生物发光成像
如先前所述(Gravel等人,2011；Lancette-Hebert等人,2007；Lancette-Hebert等人,2009)，使用IVIS 200成像系统(CaliperLSXenogen)采集图像。数据显示为指示光强度的伪彩色图像。以光子每秒每平方厘米每球面度表示目标区域。
统计分析
将数据表示为至少两个独立实验的平均值±SEM。通过应用学生t检验分析测试值与对照值之间的统计学差异。对于多重比较，通过应用普通单因素ANOVA(图基多重比较检验(Tukey's Multiple Contrast Test))分析统计学差异。如果p<0.05，则认为数据是显著的并且由“*”指示，如果p<0.01，则由“**”指示，如果p<0.001，则由“***”指示。使用GraphPad Prism 6.07版(GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥(San DiegoCalifornia USA))进行统计分析。
组织收集和免疫组织化学
如先前所述(Graft等人,2016；Lancette-Hebert等人,2007；Lancette-Hebert等人,2009)将动物处死并灌注，并且进行处理。用低温恒冷冰冻切片机(cryostat)(25μm厚)将脑切割成冠状切片并储存在-20℃。然后将脑切片在一级抗体1:500兔多克隆抗Iba1(Wako)、1:500小鼠单克隆抗绿色荧光蛋白(GFP)(Invitrogen)、1:500大鼠单克隆抗CD11b(Serotec)中孵育。然后将切片在对应的荧光山羊二级抗血清(Invitrogen)中孵育。使用具有20X物镜的Zeiss LSM 700共焦显微镜，利用1X与2X之间的扫描变焦获取荧光图像，并用Zen软件进行分析。
小神经胶质细胞原代培养物
如先前所述(Lancette-Hebert等人,2012)，从CD11brGFP转基因幼鼠的大脑皮层制备原代培养物。将胶质细胞培养物在补充有F12的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle’s medium)中维持20-25天，用于小神经胶质细胞和星形胶质细胞的分离。将胶质细胞培养物用胰蛋白酶消化并接种在10cm2板中。用LPS(1μg/ml)或媒介物处理细胞。在24小时后，收集原代培养物并进行免疫沉淀。
Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST
使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，美国特拉华州威尔明顿市(Wilmington,DE,USA))测量总RNA浓度。在AgilentBioAnalyzer(AgilentTechnologies)上测定RNA质量。根据Affymetrix标准方案，利用Affymetrix Mouse Gene2.0ST进行DNA微阵列分析，每个样品使用100ng总RNA。通过使用Affymetrix ExpressionConsole软件分析图像数据，以进行质量控制、背景扣除以及用稳健多阵列分析(RobustMultiarray Analysis)(RMA)方法将探针组强度归一化。如果两个比较样品之间的倍数变化高于1.2并且相关ANOVA p值低于0.05，则将mRNA视为变体。微阵列分析由魁北克大学医院中心研究中心(CHUL)基因表达平台(CHU de Québec Research Center(CHUL)GeneExpression Platform)(加拿大魁北克)进行。
质谱分析：样品制备
将样品在脱盐柱Amicon 3kDa(Millipore)上浓缩，并用50mM碳酸氢铵洗涤3次。通过比色Bradford测定来确定蛋白浓度。将等量的蛋白溶解于变性缓冲液中。然后将样品在DTT和碘乙酰胺的溶液中加热到95℃并保持5分钟。最后，添加1μg胰蛋白酶，并将混合物在37℃下孵育过夜。通过10分钟RT孵育和16000g的5分钟RT离心去除沉淀的脱氧胆酸钠。将上清液在C18Empore过滤器上脱盐。将肽在80％ACN-0.1％TFA中洗脱，并在speed vac中干燥。
质谱分析：质谱
通过nanoLC/MSMS以一式三份分析样品的统计学信息。对于每次注射，注射750ng的肽样品，并通过在线反相(RP)纳米级毛细管液相色谱(nanoLC)分离，并且通过电喷雾质谱(ESI MS/MS)加以分析。用Dionex UltiMate 3000 nanoRSLC色谱系统(Thermo FisherScientific/Dionex Softron GmbH，德国格梅尔林(Germering))进行实验，所述色谱系统连接到装配有纳升电喷雾离子源的Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo FisherScientific)。使用Thermo XCalibur软件3.0.63版以数据依赖性获取模式获取质谱。使用4e5的AGC靶标、50ms的最大注射时间和120 000的分辨率在轨道阱中获取全扫描质谱(350m/z到1800m/z)。每次MS扫描之后是获取最强离子的碎裂MSMS光谱，总循环时间为3秒(最高速度模式)。将先前破碎的肽的动态排除设置20秒的时间段和10ppm的公差。由加拿大魁北克大学医院的东魁北克基因组中心的蛋白质组学平台(Proteomics platform of theEastern Quebec Genomic Center,CHU de Quebec,Canada)进行质谱分析。使用MaxQuant软件1.5.0.25版(Cox和Mann,2008)的Andromeda模块，针对小鼠蛋白数据库(UniprotKB-分类学小家鼠-84675序列)进行数据库搜索和搜索无标记定量光谱。仅将独特剃刀肽(uniqueand razor peptide)用于定量。只有当待比较的两个样品中的一个样品中存在至少两个重复值时，才认为蛋白是可定量的。如果两个比较样品之间的倍数变化高于1.2并且相关p值低于0.05，则将蛋白视为变体。
Cluego分析
使用Cytoscape environment(3.2.1)，用ClueGo应用程序(2.1.6版)分析来自基因芯片Affymetrix或质谱的数据。使用不同的本体来源，如Gene Ontology(GO)、KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)、Reactome和WikiPathways，使用差异表达的基因(具有对应的倍数变化和p值)生成生物网络。GO间隔在4(最小水平)与11(最大水平)之间。κ得分为0.7。对于生物项和组的富集，我们使用基于超几何分布的双侧(富集/耗尽)测试。我们将转录组学结果的统计学显著性设定为0.05，并且我们使用邦弗朗尼(Bonferroni)调整来校正由ClueGO创建的项和组的p值。主要组项基于基因/项相比于聚类的％。
萤光素酶报告物测定
将指数生长的HEK293或BV2细胞接种在24孔培养皿中。根据制造商说明书(jetPRIME,Polyplus)进行细胞转染。每个转染实验包含0.125μg报告物(pGL3-启动子和经修饰的pGL3-启动子，Promega)和62.5ng PRL-TK-海肾载体(Promega)作为内部转染对照。用LPS(1μg/ml)将转染的BV2细胞处理过夜。根据制造商说明书用双萤光素酶系统(Promega)测量萤光素酶活性。以一式三份进行转染。使用发光计(Bertol，德国)来定量光信号。将萤光素酶活性作为萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶活性的比率来评价。
siRNA转染
将BV2细胞维持在补充有10％FBS和Pen/Strep的DMEM中。在转染前1天，将3.5×104个细胞/孔接种在24孔板中。然后根据制造商说明书(SEQ ID NO:8到11)，用SRSF3siRNA(100nM和300nM；ON-TARGET+小鼠Srsf3 siRNA-SMART库：Dharmacon)或CTL siRNA，使用INTERFERin siRNA转染试剂(Polyplus)转染BV2细胞。对于蛋白质印迹分析，在转染后两天用1μg/ml LPS或媒介物刺激细胞，并收集细胞用于蛋白测量。对于萤光素酶报告物测定，在DNA转染前一天用siRNA转染BV2细胞。
定量逆转录酶PCR分析(RT-qPCR)
用pGL3或pGL3-Saa3-3'UTR-wt转染稳定表达F/EGFP-RPL10a的BV2细胞系。在转染后四十八小时，根据TRAP方案对核糖体进行免疫纯化，并且根据试剂盒制造商说明书(Stratagene Absolutely RNA Nanoprep试剂盒)进行mRNA提纯。
使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，美国特拉华州威尔明顿市)测量核糖体结合的mRNA的量，并且在Agilent BioAnalyzer 2100(AgilentTechnologies，美国加州圣克拉市(Santa Clara，CA，USA))上测定总RNA质量。使用LightCycler 480(Roche Diagnostics，德国曼海姆市(Mannheim,DE))，使用对应于20ng总RNA的cDNA进行基于荧光的实时PCR定量。如制造商所述，使用试剂LightCycler 480SYBRGreen I Master(Roche Diagnostics，美国印第安纳州的印第安纳波利斯市(Indianapolis,IN,USA))与2％DMSO。进行解链曲线以评估非特异性信号。根据Luu-The等人，使用二次导数法和Cp相比于量的对数的标准曲线(Luu-The等人,2005)进行各mRNA拷贝数的计算。使用显示为具有稳定表达水平的基因的参考基因进行归一化：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Warrington等人,2000)。定量实时PCR测量由魁北克大学医院中心研究中心(CHUL)基因表达平台(加拿大魁北克)进行并且符合MIQE指南(Bustin等人,2010；Bustin等人,2009)。
SRSF3-siRNA的鼻内递送
根据制造商的方案，使用体内jetPEI试剂(Polyplus)在麻醉小鼠中鼻内给予乱序-siRNA(20μg)或SRSF3-siRNA(20μg)(Dharmacon)。简单地说，将jetPEI和siRNA在10％葡萄糖溶液(氮和磷(N/P)比等于8)中单独地稀释。然后，将siRNA和PEI溶液混合，并在室温下孵育15分钟，总共50μl。小鼠在每个鼻孔中接受25μL溶液。
SRSF3 AMOS的腹膜内递送
以症状性疾病(130/得分2)开始在SOD1G93A小鼠中腹膜内(i.p.)注射抗SRSF3的反义体内吗啉代化合物(antisense vivo-morpholino)1x周(25mg/kg)直到疾病末期。
siGLO转染
为了可视化siRNA在CNS细胞中的摄取，我们使用体内JetPEI试剂(N/P＝8)将乱序-siRNA或SRSF3-siRNA与siGLO Red(20μg)寡核苷酸双链体(Dharmacon)共转染。将siGLO用于确认siRNA的递送效率。此转染指示剂经改性以在细胞受到成功转染时定位到细胞核中。
体内生物发光成像
如先前所述(Lancette-Hebert等人,2009)，使用IVIS 200成像系统(CaliperLSXenogen)采集图像。在成像阶段前二十分钟，小鼠接受萤光素酶底物D-荧光素(在0.9％盐水中150mg/kg)(CaliperLS-Xenogen)的腹膜内(i.p.)注射。通过使用扩散发光成像断层摄影术(DLIT)算法(活图像3D分析软件，CaliperLS-Xenogen)实现脑中生物发光源的3D重建。数据显示为指示光强度的伪彩色图像。以光子每秒每平方厘米每球面度表示目标区域。
用磁性CD11b珠粒分离脑小神经胶质细胞
在用冰冷的PBS灌注后，将来自用乱序-siRNA或SRSF3-siRNA治疗且用LPS注射(24小时；5mg/kg；腹膜内)的小鼠的脑解剖并用Dispase II(Invitrogen)在37℃酶促消化30分钟，每15分钟进行温和研磨。通过使细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器来去除组织碎片。在细胞洗涤后，将细胞沉淀再悬浮于30％Percoll(GE Healthcare)中并以700g离心10分钟。去除含有髓磷脂的上清液并用HBSS洗涤沉淀的细胞，并且根据试剂盒制造商说明书(人和小鼠的CD11b(Microglia)微珠；Miltenyi Biotec)进行磁性CD11b珠粒分离。对收集的细胞进行蛋白质印迹分析。
用于蛋白质印迹的样品制备(输入物)
用尿素裂解缓冲液(6M尿素、1％SDS、50mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCL)裂解来自注射盐水/LPS的小鼠的脑或用CD11b磁珠纯化的小神经胶质细胞，进行声波处理，并使用Bradford蛋白测定(Bio-Rad)以牛血清白蛋白作为标准品加以定量。将样品在SDS-PAGE凝胶上解析，并转移到PVDF膜(Millipore)。
抗体(蛋白质印迹)
兔多克隆抗小鼠SAA3；1:1000(Santa Cruz)；抗SAA3抗体的免疫原覆盖氨基酸38到122(总aa：128)的大部分蛋白。兔多克隆抗小鼠LCN2；1:1000(Abcam)；对于抗LCN2抗体，所用的免疫原接近氨基酸40(总aa：224)，兔多克隆抗小鼠CCL5；1:1000(LS-Bio)；针对氨基酸24-91(总aa：198)制备兔多克隆抗体抗CCl5。兔多克隆抗小鼠CAP2；1:1000(Origene)。兔多克隆抗小鼠CCL3；1:1000(Abcam)。兔多克隆抗小鼠SRSF3；1:1000(Abcam)。小鼠单克隆抗磷酸化表位SR蛋白克隆1H4；1:1000(Millipore)。将小鼠单克隆抗β肌动蛋白抗体用作上样对照；1:30000(Millipore)。
参考文献
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序列表
<110> 拉瓦尔大学
<120> SRSF3药剂用于治疗和/或预防神经病症、癌症、细菌感染或病毒感染的用途
<130> 000819-0383
<150> 62/586,567
<151> 2017-11-15
<160> 20
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5306
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Flag/EGFP标记的鼠Rpl10a在CD11b启动子控制下的构建, I：间插序列（IVS）；II：SV40聚A
<400> 1
gggccctcca gggttcaagt gattctgctg cctcagcctc ccaggtggga ttacaggtgc 60
ctgccaccac gcctggctaa tttttttgtc tttttagtaa agatgaggtt tcaccatgtt 120
gggcaggctg gtttcaattg ctgacctcaa gtgagccacc ccgcctcagc ctcccaaaat 180
gctaggatta caggcatgag ccaccgcacc cagccaagtt tgtacatata tttttgacta 240
cacttcttaa ctattcttag gataaattac tagaagtgaa aattcttggg tgaagagctt 300
gaggccttta cacacacaca cacacacaca cacaaaaata ggctggatgc agtggctcac 360
acctgtaatc tcagcagttt gggaggctga ggaaggagga tcacttgagt ccaggaggtt 420
gagaatagcc tgaacaacat agcaagatct tgtctctaca aaaaatttaa aaaaaattag 480
ctggccatgg cagcatgtgc ctgtagtacc agctactcgg aaggctgagg taggaggatc 540
gcttgagccc aggaggttga ttgaagctgc agtgagctgt gattacacca ctgcactcca 600
gcctgggcaa cagagctaga ctctgtctct aaaaaaagca caaaataata tttaaaaagc 660
accaggtatg cctgtacttg agttgtcttt gttgatggct acaaatgagg acagctctgg 720
ctgaagggcg cttccatttc catgggctga aggagggaca ttttgcaaag tgtgttttca 780
ggaagacaca gagttttacc tcctacactt gtttgatctg tattaatgtt tgcttattta 840
tttatttaat tttttttttg agacagagtc tcactctgtc acctgggctg gagtgcagtg 900
gcattattga ggctcattgc agtctcagac tcctgagctc aaacaatcct cctgcctcag 960
cctctggagt agctaggact acaggcatgt gccaccatgc ctggctaatt ttttaaatgt 1020
atttttttgt agagtcgggg tctccctatg ttgcccaggc tggagtgcag tggtgtgatc 1080
ctagctcact gcagcctgga cctcgggctc aagtaattct cacacctcag cctgtccagt 1140
agcaggggct acaggcgcgc accaccatgc ccagctaatt aaaaatattt ttttgtagag 1200
acagggtctc tctatgttgc ccaggctggt ttcaaactcc caggctcaag caatcctcct 1260
gccttggcct cccaaagtgc tggcattaca ggcgtgagcc actgcgcctg gcccgtatta 1320
atgtttagaa cacgaattcc aggaggcagg ctaagtctgt tcagcttgtt catatgcttg 1380
ggccaaccca agaaacaagt gggtgacaaa tggcaccttt tggatagtgg tattgacttt 1440
gaaagtttgg gtcaggaagc tggggaggaa gggtgggcag gctgtgggca gtcctgggcg 1500
gaagaccagg cagggctatg tgctcactga gcctccgccc tcttcctttg aatctctgat 1560
agacttctgc ctcctacttc tccttttctg cccttctttg ctttggtggc ttccttgtgg 1620
ttcctcagtg gtgcctgcaa cccctggttc acctccttcc aggttctggc tccttccagc 1680
cgtcgacggt atcgataagc ttgatatcta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 1740
gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 1800
attggtctta ctgacatcca ctttctttct ctccacagga attccctgca ggaggcagca 1860
tggactacaa agacgacgac gacaaggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 1920
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 1980
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 2040
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 2100
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2160
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2220
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2280
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2340
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2400
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 2460
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 2520
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 2580
gcatggacga gctgtacaag taaggatccc ggccgcaaac tgcagcgcct ctccggcttg 2640
gctgagcgcg gaacgtgccc gtaacgggca actctcgcga gaacgcgggc tctatttgag 2700
cgcatgcgca aagcgctctg ccttctttcc ggtttccgcg gcagccgcag ccatgaggta 2760
agttgttatc gtggcgctat ccgccgccat ccgtgcaccc acacgcccgc ggacgccccg 2820
cggcccgtct cggaggctct cccggcgact gccccgcgtc gcgagccttt ccccagcgtg 2880
ccgtgggcct gtcatcgggc ccggggtgca gcatggccgg ccccgaacgc cttcgcttct 2940
ccccaacagc agcaaagtct cacgcgacac cctgtacgag gcggtgcggg aagtcctgca 3000
cgggaaccag cgcaagcgcc gcaagtgagc gcgggcctcc ctcccggggc agggcgagca 3060
tccccggcca tggcgaccct ggctcacagc tcccctctcg ctcaggtttc tggagacggt 3120
ggagctgcag atcagcctga agaactacga ccctcagaag gacaaacgtt tctcgggcac 3180
cgtcaggttg gcaccgctct aaccccaccc agccctcagt gttcccgtgt ggcctggccg 3240
cgccctaggc gggcacgggg acactgacgt gccagggtag ttcaggagcc ctgctgcagg 3300
caggcaggct ggacggaccc ccaccctggg tcttaaaaca agaggggagg cgtggggagg 3360
cctcggccga gcccgccgcc tagcctgaga agccaggcta gtgttgccca gagctccggg 3420
taaggcttgc cgctccctgc catgcgttca gatctagcgg gatggccagc gccgaccatg 3480
acctgttctg ttttctcccc tcccaaacgc aggctcaagt ccaccccacg ccccaagttc 3540
tcggtgtgcg ttctggggga ccagcagcac tgtgatgaag ccaaggccgt ggatatcccc 3600
cacatggaca tcgaggcgct caagaagctt aacaaaaaca agaagttggt caagaagctg 3660
ggtaggtggg gctcactagg gctgaacaca acccatgacc ccctgcccag gagtggcagc 3720
acacattggg cttcacaacc agttagaaaa tgccccacag gctggtctga tactcccctc 3780
tcgccagtgt gtgcagttga ctcatagcca gctattggtt tgggtttcaa gtcttttcag 3840
ttaacaacct atcgagggag gggtcacaag tgtctcccac gtgttagcct ccatggtagc 3900
ccctgtctcc gcatacattt tgggaatagt tatccactgt gagctaggca gttgtcatgc 3960
ctgcttttat agatagaagg tttctccatc tgtcttaaga tttggagtaa tactgagtct 4020
tactgatgtt gccagcctgg ggtctaaggt tatcctctag aagtgctcag gactgtgccc 4080
tgtcactgag ctgtgttctc aggtgacatt atggttccca ggcctgcttg aggcttctca 4140
gatagctggc cttggtccac ctttgacaga taatgagaca gcttttttct taagatttta 4200
ttttatgtat atgagcaggc tgatgagagc ctcagatccc attacaggtg gctgtgagcc 4260
accatgtggc tgctggaaat tgaactcagg acctctggaa ggcagcactc ttaactgctg 4320
agccatctct ccagtccata gtttgaggca atttaaatgc aggcttacag tgaatccaag 4380
gggtgggggc catcacagcc cctcagttct atgcagcaca ccagggattg tgggacatcc 4440
tggtctaaga cctctgtgag gacttgaggg tggagctact cagcagtcat gggtctgagg 4500
aggcaacttg gccttctcgt tgtaaaggat gggttggttg tttaaaatgt tttgttttgt 4560
tttttttttt ttttggtggt ttttgtttgt ttggttggtt tttttggttt ttttggtttt 4620
tttttttttt tttggctcaa tcctgagtgt ctgtgtcttc tagctaagaa gtacgatgcc 4680
tttttggcct ctgagtctct gattaagcag atcccacgta tcctgggccc aggcctaaac 4740
aaggctggca agttcccctc cctgctgaca cacaatgaaa acatggtggc caaagtggat 4800
gaggtgaaat cgacaatcaa gttccagatg aagaaggtca gtctgggcgg tgtgtggtgg 4860
ggaaaccaga aagagctagg tctgggtgcc ttagccctgg gttaagcctt ttcactgggg 4920
gaaagggtac atgctagctt agcctggtga ccttttctgt ccatgcaggt gctgtgtttg 4980
gccgtcgctg ttggccacgt gaagatgacc gatgatgagc tagtctacaa cattcatctg 5040
gctgtcaatt tcttggtgtc cttgcttaag aaaaactggc aaaacgtgcg ggctctgtac 5100
atcaagagca ccatgggcaa gccccagcgt ctgtattagg atgctccaat aaacctcact 5160
gctgccactc aggcggccgc accgcggttg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 5220
agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 5280
taagctgcaa taaacaagtt ccgcgg 5306
<210> 2
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL3-启动子- Saa3-3'UTR-wt
<400> 2
gttttctctt cctgttgttc ccagtcatgc tgccccccga gaagaggagc aactactggg 60
ttgagatatt ttctaaaatc tggatc 86
<210> 3
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL3-启动子-乱序
<400> 3
ggatatcttt tacccatacg atgttcctga ctatgcgggc tatccctatg acgtcccgga 60
ctatgcagga tcctatccat atgacgttcc agattacgct gctcagatcg ataagcttac 120
catgttccag gcggccgagc gcccccagga gtgggccatg gagggccc 168
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 区段C的Saa3-3'UTR缺失
<400> 4
gttttctctt cctgttgttc ccagtcatgc tgccccccga gaagaggagc aactactggg 60
ttgagatatt ttctaaaatc tggatcc 87
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 区段B+C的Saa3-3'UTR缺失
<400> 5
gttttctctt cctgttgttc ccagtcatgc tgccccccgt ctaga 45
<210> 6
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 区段A的Saa3-3'UTR缺失
<400> 6
agaagaggag caactactgg gttgagatat tttctaaaat ctggatccct aaacatccca 60
atgtgctgaa taaatacttg tgaaatgca 89
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 区段B的Saa3-3'UTR缺失
<400> 7
gttttctctt cctgttgttc ccagtcatgc tgccccccga atgtgctgaa taaatacttg 60
tgaaatgca 69
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向SRSF3的siRNA - ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-059214-09, Srsf3
<400> 8
gaaaggcacc ugagaauau 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向SRSF3的siRNA - ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-059214-10, Srsf3
<400> 9
ccagaugaga uuuagguau 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向SRSF3的siRNA - ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-059214-11, Srsf3
<400> 10
cuagcauaau uguguagua 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向SRSF3的siRNA - ON-TARGETplus SMARTpool siRNA
J-059214-12, Srsf3
<400> 11
cuagaagguu ccaacauga 19
<210> 12
<211> 164
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Met His Arg Asp Ser Cys Pro Leu Asp Cys Lys Val Tyr Val Gly Asn
1 5 10 15
Leu Gly Asn Asn Gly Asn Lys Thr Glu Leu Glu Arg Ala Phe Gly Tyr
20 25 30
Tyr Gly Pro Leu Arg Ser Val Trp Val Ala Arg Asn Pro Pro Gly Phe
35 40 45
Ala Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Ala Ala Asp Ala Val Arg
50 55 60
Glu Leu Asp Gly Arg Thr Leu Cys Gly Cys Arg Val Arg Val Glu Leu
65 70 75 80
Ser Asn Gly Glu Lys Arg Ser Arg Asn Arg Gly Pro Pro Pro Ser Trp
85 90 95
Gly Arg Arg Pro Arg Asp Asp Tyr Arg Arg Arg Ser Pro Pro Pro Arg
100 105 110
Arg Arg Ser Pro Arg Arg Arg Ser Phe Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser
115 120 125
Leu Ser Arg Asp Arg Arg Arg Glu Arg Ser Leu Ser Arg Glu Arg Asn
130 135 140
His Lys Pro Ser Arg Ser Phe Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser
145 150 155 160
Asn Glu Arg Lys
<210> 13
<211> 73
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Lys Val Tyr Val Gly Asn Leu Gly Asn Asn Gly Asn Lys Thr Glu Leu
1 5 10 15
Glu Arg Ala Phe Gly Tyr Tyr Gly Pro Leu Arg Ser Val Trp Val Ala
20 25 30
Arg Asn Pro Pro Gly Phe Ala Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp
35 40 45
Ala Ala Asp Ala Val Arg Glu Leu Asp Gly Arg Thr Leu Cys Gly Cys
50 55 60
Arg Val Arg Val Glu Leu Ser Asn Gly
65 70
<210> 14
<211> 79
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Arg Ser Arg Asn Arg Gly Pro Pro Pro Ser Trp Gly Arg Arg Pro Arg
1 5 10 15
Asp Asp Tyr Arg Arg Arg Ser Pro Pro Pro Arg Arg Arg Ser Pro Arg
20 25 30
Arg Arg Ser Phe Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Leu Ser Arg Asp Arg
35 40 45
Arg Arg Glu Arg Ser Leu Ser Arg Glu Arg Asn His Lys Pro Ser Arg
50 55 60
Ser Phe Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Asn Glu Arg Lys
65 70 75
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义物
<400> 15
ccaagggaca ggaatcacga tgcat 25
<210> 16
<211> 84
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 16
ggtgggcctg tcggagcgtt aggatttgag cttgggcctt ttgaacccag gatctcgaaa 60
tgcatcgtga ttcctgtccc ttgg 84
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义物
<400> 17
ccaatggaca ggaatcacga tgcat 25
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
gccgccgcat tttttaaccc tagatctcga aatgcatcgt gattcctgtc cattgg 56
<210> 19
<211> 720
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
tttccaggtc acctgaccgg tctcctttgc tgtcggcgcc aagtcctgca agtttgcttg 60
agagacgaga aaccagcaag agttgggcaa actttccaaa ccaggctttt ccttcagtgt 120
ggaatctagg cggccacagt ctggtgccag ctgggtcaca aacagctccg tgacctgttt 180
gtaaacgcga tgctcttagt tccagactaa ccgctcacaa gggtgaagca cttaattaat 240
tcatctctta atcttgttag gggccaacgg ctcctattag tgtttgagcg tgacggcgac 300
ggtgctgttt atgaagccct agcctatttg gaggtgagga agaggagtct gtgggtaacc 360
tggaggtcga cagaccggga ggaacgctcg agggagcacc aggcctgtta caacgagcgc 420
gcgccgacgc acgtctccac ccacccggcg caaccgccag agcgcgctcc cagcaaccgc 480
ggctctcgct gcgtttgtag ccatacgtca cggcctcttc tgcttctcat tgggggagcc 540
cgtccaatca tgtgattcca gtatggcgta taaataaagg cgaggagaag gcggtggtcc 600
gccatttcgt ggacgccggg tgagtgagag agttggttgg tgttgggccg gaggaaagcg 660
ggaagactca tcggagcgtg tggatttgag ccgccgcatt ttttaaccct agatctcgaa 720
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 20
Gly Asn Asn Gly Asn Lys Thr Glu Leu Glu Arg Ala Phe Gly Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Pro Leu Arg Ser Val
20

Claims (44)

1.SRSF3药剂用于调节髓系细胞的先天免疫功能的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3的表达或功能。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞是小神经胶质细胞。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞是单核细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制被磷酸化的SRSF3的活性或功能。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂是抗体、核酸、多肽、低分子量化合物或基因编辑系统。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂是抗体、反义物、干扰RNA分子、CRISPR系统(CRISPR/Cas9)、锌指核酸酶系统(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶系统(TALEN)。
7.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂增加编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA的翻译。
8.根据权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3与编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA之间的结合。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3与所述至少一种mRNA的至少一个3'UTR SRSF3结合位点之间的结合。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3的至少一个RRM位点和所述至少一种mRNA的至少一个3'UTR SRSF3结合位点之间的结合。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的用途，其中先天免疫应答中所涉及的所述多肽是SAA3、LCN2、LILRB4、CCL5、IRF7、CCL3、GM7676、CLEC7A、CH25H、GPNMB、CST7、CTLA2B、CD68、EIF4A2、TREM2或APOE。
12.SRSF3药剂在有需要的患者中用于以下的用途：
a.治疗和/或预防神经病症(例如血管性痴呆、额颞叶变性(FTD)、阿尔茨海默病、运动神经元病(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、进行性延髓麻痹(PBP)、原发性侧索硬化(PLS)或肯尼迪病)或帕金森病)；
b.抑制中枢神经系统癌症(例如神经胶质瘤)的增殖；或
c.治疗和/或预防病毒感染或细菌感染(例如HIV)；
其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3的表达或功能。
13.SRSF3药剂在有需要的患者中用于以下的用途：
a.治疗和/或预防神经病症(例如血管性痴呆、额颞叶变性(FTD)、阿尔茨海默病、运动神经元病(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、进行性延髓麻痹(PBP)、原发性侧索硬化(PLS)或肯尼迪病)或帕金森病)；
b.抑制中枢神经系统癌症(例如神经胶质瘤)的增殖；
c.治疗和/或预防病毒感染或细菌感染(例如HIV)；
d.治疗脑损伤(例如脑缺血、缺氧、中风、缺血后炎症)
其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3的表达或功能。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制被磷酸化的SRSF3的活性或功能。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂是抗体、核酸、多肽、低分子量化合物或基因编辑系统。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂是抗体、反义物、干扰RNA分子、CRISPR系统(CRISPR/Cas9)、锌指核酸酶系统(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶系统(TALEN)。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂增加编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA的翻译。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3与编码先天免疫应答中所涉及的多肽的至少一种mRNA之间的结合。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3与所述至少一种mRNA的至少一个3'UTR SRSF3结合位点之间的结合。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述SRSF3药剂抑制SRSF3的RRM位点与所述至少一种mRNA的至少一个3'UTR SRSF3结合位点之间的结合。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的用途，其中先天免疫应答中所涉及的所述多肽是SAA3、LCN2、CCL5、IRF7、CCL3、GM7676、CLEC7A、CH25H、GPNMB、CST7、CTLA2B、CD68、EIF4A2、TREM2或APOE。
22.根据权利要求12至21中任一项所述的用途，其用于治疗和/或预防FTD或ALS。
23.根据权利要求22所述的用途，其用于抑制中枢神经系统癌症的增殖，所述中枢神经系统癌症是星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂是靶向SRSF3的长度为10到30个连续核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续序列与人SRSF3前mRNA序列5'UTR的区域(SEQ ID NO:19)至少90％互补。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO:19至少90％互补。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO:19至少100％互补。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其中所述反义寡核苷酸与所述SRSF3mRNA的5'UTR杂交并抑制或降低SRSF3的翻译。
28.根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其中所述反义寡核苷酸包含序列：5'-CCAATGGACAGGAATCACGATGCAT-3'(SEQ ID NO:17)。
29.根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其中所述反义寡核苷酸由以下序列组成：5'-CCAATGGACAGGAATCACGATGCAT-3'(SEQ ID NO:17)。
30.一种根据权利要求24至29中任一项所述的反义物。
31.根据权利要求1至23中任一项所述的用途，其中所述SRSF3药剂是抗体。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体、单链变体片段(scFv)、单链变体-Fc片段(scFv-Fc)、微型抗体、双抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述抗体是人源化抗体。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的用途，其中所述抗体特异性结合SRSF3的区域，所述SRSF3的区域包含RRM结构域(SEQ ID NO:13)的至少一部分。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的用途，其中所述抗体特异性结合SRSF3的区域，所述SRSF3的区域至少包含SRSF3磷酸化位点和SRSF3的RS结构域(SEQ ID NO:14)的至少一部分。
36.根据权利要求30至34中任一项所述的用途，其中所述抗体特异性结合SRSF3的包含SEQ ID NO:20的区域。
37.一种根据权利要求31至36中任一项所述的抗体。
38.一种用于诊断易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
确定所述受试者的生物样品中SRSF3和pSRSF3或其片段的水平
其中观察到所述生物样品中SRSF3或其片段的水平相对于SRSF3或其片段的参考水平升高指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
39.一种用于诊断易于或疑似发生神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染、或者患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
鉴定所述受试者的生物样品中上调的和非翻译的mRNA谱，
其中观察到编码小神经胶质细胞的先天免疫应答中所涉及的多肽的上调的和非翻译的mRNA谱指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括确定所述受试者的生物样品中SRSF3/pSRSF3或其片段的水平，其中观察到所述生物样品中SRSF3、pSRSF3或其片段的水平相对于SRSF3或其片段的参考水平升高指示所述受试者易于或疑似患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染，或正患有神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
41.一种用于鉴定可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染中的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述候选化合物与包含SRSF3或其片段的生物系统接触，
b)测量所述候选化合物抑制SRSF3功能表达的能力，
c)基于步骤b)的结果确定所述候选化合物是否可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
42.一种用于鉴定可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染中的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述候选化合物与生物系统接触，所述生物系统包含SRSF3或其片段和mRNA的至少一个3'UTR，所述mRNA编码小神经胶质细胞的先天免疫应答中所涉及的多肽，所述至少一个3'UTR至少包含SRSF3结合位点，
b)测量所述候选化合物抑制SRSF3或其片段与所述mRNA的至少一个3'UTR SRSF3结合位点之间的结合的能力，
c)基于步骤b)的结果确定所述候选化合物是否可用于治疗和/或预防神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染。
43.一种用于监测受试者的神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的进展或消退的方法，所述方法包括以下步骤：
确定所述受试者的生物样品中SRSF3/pSRSF3或其片段的水平，其中观察到SRSF3或其片段的水平增加指示所述神经病症的进展，并且其中观察到SRSF3的水平降低指示所述神经病症、所述中枢神经系统癌症、所述细菌感染或所述病毒感染的消退。
44.生物样品中SRSF3或其片段的水平作为生化标记物用于监测受试者的神经病症、中枢神经系统癌症、细菌感染或病毒感染的进展或消退的用途。
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