ES2862175T3

ES2862175T3 - Receptor de tipo IGFR novedoso y usos del mismo

Info

Publication number: ES2862175T3
Application number: ES16777913T
Authority: ES
Inventors: Heiko Lickert
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2036-09-07
Also published as: WO2017042242A1; PL3347376T3; JP7175760B2; JP2023015235A; CN108026160A; JP2018528213A; US20190248905A1; EP3347376B1; DK3347376T3; EP3896080A1; EP3347376A1

Abstract

Un antagonista de receptor de tipo IGFR, comprendiendo dicho receptor de tipo IGFR una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1, para su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de diabetes, en el que el antagonista es un anticuerpo o un ARNip.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor de tipo IGFR novedoso y usos del mismo

Antecedentes

Los factores de crecimiento de insulina/de tipo insulina (IGF) constituyen una red de ligandos, receptores de superficie celular y proteínas de unión implicados en la regulación de múltiples procesos fisiológicos y patológicos. La insulina/IGF desempeñan funciones clave en el desarrollo y el metabolismo en todas las etapas de la vida. La señalización de insulina/IGF también contribuye a la regulación de la longevidad, mientras que la desregulación de la señalización se ha implicado en la neoplasia. Aunque el receptor de insulina (InsR) y el receptor de IGF-1 (IGF1R) comparten la mayoría de sus mediadores citoplasmáticos en el sentido de 3', la mayoría de las pruebas experimentales y clínicas son consecuentes con la noción de que la activación del InsR (principalmente por insulina) conduce principalmente a actividades metabólicas, mientras que la activación de IGF1R (principalmente por IGF-1 o IGF-2) conduce a acontecimientos proliferativos y de diferenciación (Sarfstein R y Werner H Endocrinology. Mayo de 2013;154(5):1672-9; Siddle K J Mol Endocrinol. 17 de Junio de 2011;47(1):R1-10, Shrivastava, Trends in Pharmacological Sciences, junio de 1998; 19(6):205-209).

InsR e IGF1R pertenecen a una familia de receptores que contienen tirosina cinasa transmembrana. En su forma madura, se presentan como heterotetrámeros compuestos por 2 subunidades a extracelulares y 2 subunidades p transmembranas que albergan la actividad tirosina cinasa. Tanto los receptores de IGF como de insulina muestran un alto grado de homología (84 % en el dominio de tirosina cinasa, el 45 %-65 % en el dominio de unión a ligando, y por encima del 50 % en la secuencia de aminoácidos global). Además, los receptores muestran una notable similitud en la organización genómica (Sarfstein R y Werner H, loc. cit.; Arnalez F y Helman L. Hematol Oncol Clin North Am. Junio de 2012;26(3):527-42).

También hay receptores “híbridos” compuestos por la mitad de un receptor de insulina y la mitad un receptor de IGF (IRap ligado a IGF1RaP). Los híbridos se unen a IGF con afinidad similar a IGFR, pero se unen a insulina con afinidad sustancialmente menor que InsR. No está claro si los receptores híbridos tienen un papel fisiológico distinto (Sarfstein R y Werner H, loc. cit.; Arnalez F y Helman L., loc. cit).

El receptor de insulina existe en dos isoformas de variante de corte y empalme como resultado del corte y empalme alternativo de la secuencia codificada por el exón 11; la isoforma “B” reconoce únicamente la insulina, pero la isoforma “A”, que es la isoforma que se expresa más comúnmente por tumores, reconoce tanto insulina como IGF1 y 2. Ambas isoformas se expresan diferencialmente durante el desarrollo, con InsR-A expresado predominantemente en tejidos fetales e InsR-B expresado predominantemente en tejidos adultos, particularmente hígado, músculo y adipocitos. El IGF1R presenta un patrón opuesto de expresión, estando ausente en el hígado y presente en niveles bajos en tejido adiposo y en niveles altos en el cerebro. Además, y consecuente con su potente papel antiapoptótico y prosupervivencia, el IGF1R está sobreexpresado en la mayoría de tumores y células malignas (Pollak M Nat Rev Cancer. 16 de febrero de 2012;12(3):159-69, Sarfstein R y Werner H, loc. cit.; Siddle K, loc cit).

IGF1 e IGF2 pueden expresarse de manera endocrina, paracrina o autocrina, siendo esta última común en células transformadas. El hígado es su principal sitio de producción. Por el contrario, la producción de insulina se limita a células p pancreáticas. La insulina y los IGF se unen con alta afinidad a su receptor específico y con menor afinidad al receptor no análogo, con la excepción de IGF2, que también se une a InsR-A con alta afinidad (Pollak M, loc cit.; Siddle K, loc. cit.).

La unión a ligando induce cambios conformacionales en las estructuras del InsR e IGF1R y activa su actividad tirosina cinasa intrínseca. Aunque la insulina y los IGF desempeñan papeles fisiológicos distintos, utilizan las mismas rutas de señalización. La señalización posterior del InsR e IGF1R se canaliza principalmente a través de la ruta de MAPK/Ras-Raf-Erk, la ruta de fosfatidilinositol-3-cinasa/AKT/mTOR(PI3K/AKT) y la ruta de activador de la transcripción y transductor de señales/cinasa Janus (JAK/STAT). En última instancia, la activación de IGF1R da como resultado un aumento de proliferación celular y una disminución de la apoptosis, mientras que la activación del InsR mediante unión a insulina favorece el almacenamiento y la síntesis de lípidos, proteínas e hidratos de carbono e inhibe su descomposición y liberación en la circulación. El primer paso por el cual la insulina aumenta el almacenamiento o la utilización de energía implica el transporte regulado de glucosa a la célula, mediado por el transportador facilitador de glucosa Glut4 (Chang et al. Mol Med. Jul-dic de 2004; 10(7-12): 65-71.). La expresión de insulina se limita a células p pancreáticas especializadas, y en circunstancias normales está estrechamente regulada por el nivel de glucosa circulante. La captación de glucosa estimulada por la insulina por órganos clásicos sensibles a insulina (hígado, músculo y tejido adiposo) reduce los niveles de glucosa circulante. Por tanto, las células p son “termostatos” de glucosa, detectando glucosa y liberando insulina para mantener los niveles fisiológicos de glucosa dentro de un intervalo relativamente estrecho. La ruptura de las rutas de señalización de InsR delicadamente equilibradas da como resultado una secreción de insulina incontrolada o alterada, niveles de glucosa en sangre desregulados y finalmente la destrucción de células p pancreáticas o pérdida de función, una afección comúnmente conocida como diabetes (Pollak M, loc cit. ; Siddle K, loc. cit.; Sarfstein R y Werner H, loc. cit; Arnalez F y Helman L., loc. cit)

La diabetes mellitus, que afecta al 8,3 % de la población adulta del mundo y aumenta a un ritmo alarmante, es una de las enfermedades más comunes de la era actual. Se prevé que el número de pacientes con diabetes mellitus aumente de 382 millones en 2013 a 592 millones en 2035, lo que indica un aumento neto del 55 %. La forma predominante es la diabetes tipo 2 (DT2), que representa casi el 90 % de todos los casos de diabetes (Hameed et al. World J Diabetes.

15 de mayo de 2015; 6(4): 598-612).

La diabetes tipo 1 (DT1) es un trastorno autoinmunitario que afecta a millones de personas en todo el mundo y se produce como consecuencia de la destrucción inmunitaria específica de órgano de las células p productoras de insulina en los islotes de Langerhans dentro del páncreas. Una vez que se destruyen esas células, los pacientes con diabetes tipo 1 pierden el control de la glucosa en sangre, lo que puede dar como resultado tanto afecciones agudas (por ejemplo, cetoacidosis e hipoglucemia grave) como complicaciones secundarias (incluyendo enfermedades cardíacas, ceguera y fallo renal). Se cree que la diabetes tipo 1 se desarrolla como consecuencia de una combinación de predisposición genética, factores ambientales en gran medida desconocidos y acontecimiento estocásticos, sin embargo, siguen por dilucidarse los acontecimientos inmunológicos, genéticos y fisiológicos precisos que controlan la iniciación y progresión de la enfermedad.

La diabetes tipo 2 temprana (DT2) está provocada por resistencia a la insulina de los órganos diana de la insulina clásicos (es decir, reducción de captación de glucosa por células normales diana de insulina, a menudo inducida por una ingesta calórica excesiva) que conduce a hiperinsulinemia. Inicialmente, estos niveles aumentados de insulina son suficientes para superar la resistencia a la insulina y evitar la hiperglucemia. Sin embargo, la hiperglucemia finalmente se produce no solo debido al aumento de resistencia a la insulina, sino también debido a la disminución de la producción de insulina por células p pancreáticas.

Controlar los niveles de glucosa en sangre es el objetivo principal del tratamiento de la diabetes. La DT1 se controla comúnmente con la administración de insulina, así como cambios en la dieta y ejercicio. Sin embargo, la necesidad de por vida de inyecciones de insulina después de la ingesta nutricional puede reducir gravemente la calidad de vida del paciente. Además, la dosificación y programación apropiadas de la inyección de insulina pueden resultar difíciles. La curación o prevención de la DT1 se ve gravemente afectada por la ausencia de biomarcadores que se correlacionen de manera fiable con el proceso patogénico, dando como resultado una reducción notable del número de células p en el momento del diagnóstico. El objetivo de la mayoría de los ensayos clínicos en diabetes tipo 1 hoy en día es mejorar la masa de células p residual funcional, óptimamente mediante la inducción de tolerancia inmunológica, preservando al mismo tiempo las respuestas inmunitarias protectoras. Por definición, esto rara vez “curará” la enfermedad debido a la destrucción significativa de células p que precedió al tratamiento. Por tanto, serían altamente deseables biomarcadores fiables preferiblemente expresados al inicio de la enfermedad. Otros métodos se centran en el trasplante o bien del páncreas o bien de células p pancreáticas para reconstituir la función de secreción de insulina. Sin embargo, esta técnica se ve obstaculizada por la escasez de órganos donados. Para DT2, además de la insulina, están disponibles otros productos terapéuticos sin insulina, incluyendo agentes hipoglucemiantes sintéticos, que, sin embargo, a menudo son limitados en términos de su efecto práctico, conveniencia de administración y pueden provocar reacciones adversas.

Las preocupaciones de seguridad y los efectos adversos de los productos terapéuticos disponibles para la diabetes, así como la falta de remisión permanente de la enfermedad con cualquier agente sometido a prueba hasta la fecha, han aumentado el interés en intervenciones específicas que podrían modular la enfermedad.

El objeto de la invención es cumplir con las necesidades de la técnica anterior.

Sumario

Los presentes inventores observaron que la proteína codificada por el gen KIAA1324 humano, también conocida como proteína 121 de gen inducido por estrógeno (Q6UXG2), se ubica de manera conjunta con IGF-1R, IGF-2R e InsR, en particular en el páncreas. A la proteína 121 de gen inducido por estrógeno se le asignó una función en regulación de la autofagia y en el favorecimiento de la supervivencia celular bajo estrés. Una proteína variante codificada por el gen inducido por estrógeno 121 también se conoce en la técnica y se designó mA bA-1 (documento WO 2007/005987, también citada en los documentos JP 2015/518704, US 2003/017563). MABA-1 difiere de la proteína codificada por el gen inducido por estrógeno 121 en una posición. Se consideró que MABA-1 desempeña un papel en el cáncer, dado que el bloqueo de la proteína dio como resultado la inhibición del crecimiento de células cancerosas. Sin embargo, no se sabía nada, y mucho menos se especuló sobre un papel de dicha proteína en el metabolismo. Este papel fue atribuido por primera vez a dicha proteína por los presentes inventores.

Debido a su estructura de dominios que se asemeja a la de los IGFR, los presentes inventores asignaron a la proteína una función de un receptor y por tanto denominaron a la proteína receptor de tipo IGFR. Los presentes inventores también observaron la expresión más alta de su receptor de tipo IGFR en la hipófisis, el hipotálamo y células de islotes que constituyen el eje endocrino que controla la ingesta de alimentos y el metabolismo.

Además, los presentes inventores aclararon que o bien la atenuación o bien la inactivación del receptor de tipo IGFR da como resultado un aumento de la fosforilación de InsR e IGFR1, así como un aumento de la fosforilación de AMPK, un componente de señalización posterior que se activa cuando o bien IGFR o bien InsR o bien ambos transmiten una señal, por ejemplo, unión de insulina. Por tanto, el tipo IGFR parece regular negativamente la señalización mediada por InsR y/o IGFR. Además, con su conocimiento de la invención, es decir, que la proteína codificada por el gen KIAA1324 actúa de hecho como un receptor de tipo IGFR, los presentes inventores, inspeccionando los estudios de asociación de genoma completo (GWAS), encontraron una fuerte asociación de SNP en el gen KIAA1324 con diabetes tipo 2, colesterol de LDL y/o arteriopatía coronaria.

En resumen, la proteína codificada por el gen KIAA1324 humano a la que los presentes inventores asignaron una función de un modulador de IGFR2 y/o InsR, desempeña un papel en el metabolismo, en particular en la señalización de insulina y también probablemente en el metabolismo del colesterol de LDL, así como en la asistencia a enfermedades tales como cardiopatía coronaria. Este hallazgo es de gran importancia, dado que no se creía que aparte de los IGFR e InsR, pudiera haber un participante adicional en la señalización de insulina. Debido a su supuesta función reguladora negativa en los IGFR y/o InsR, el receptor de tipo IGFR de la presente invención parece ser una diana atractiva para los moduladores y por tanto puede abrir nuevas vías para el desarrollo de medicamentos, por ejemplo, para el tratamiento de la diabetes, el trastorno asociado al colesterol de LDL así como la arteriopatía coronaria, especialmente la diabetes mellitus tipo II.

Por tanto, los antagonistas de dicho receptor abren posibilidades nuevas y urgentemente necesarias para revertir, por ejemplo, la resistencia a la insulina tal como se observa comúnmente en la patogénesis de diabetes mellitus tipo II, mientras que los agonistas podrían usarse para bloquear la señalización de insulina. Sorprendentemente, los presentes inventores también pudieron mostrar que el receptor de tipo IGFR está asociado con la desdiferenciación de células p en el páncreas, un acontecimiento temprano en el inicio de la enfermedad que finalmente conduce a la destrucción de células p o pérdida de función. Por tanto, el receptor de tipo IGFR también es una prometedora herramienta de diagnóstico que permite el diagnóstico precoz y tratamiento de la diabetes antes de la pérdida irrevocable de células p, allanando el camino así posiblemente al tratamiento de la diabetes mellitus tipo I.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para un receptor de IGF, receptor de tipo (IGFR) que es capaz de reaccionar con anticuerpos generados contra un receptor de tipo IGFR de SEQ ID No: 1, en el que dichos anticuerpos se unen específicamente a al menos un epítopo de la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

En particular, dicha secuencia de ADN aislada puede codificar para un receptor de tipo IGFR que comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1.

La secuencia de ADN aislada puede, en particular, comprender una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 7 (NM_0200775.4).

Además, en el presente documento se proporciona un vector que comprende la secuencia de ADN tal como se describe en el presente documento. Dicho vector puede comprender además un elemento de regulación génica operativamente unido a la secuencia de ADN que codifica para dicho receptor de tipo IGFR. También se prevé una célula huésped que comprende dicho vector.

Además, en el presente documento se proporcionan agentes de unión capaces de unirse específicamente a un receptor de tipo IGFR, comprendiendo dicho receptor de tipo IGFR una secuencia correspondiente a la secuencia SEQ ID No.1 para su uso como marcador de diagnóstico de diabetes o del riesgo de desarrollar diabetes.

En el presente documento también se proporcionan antagonistas y agonistas del receptor de tipo IGFR de la invención, comprendiendo dicho receptor de tipo IGFR, por ejemplo, una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1. Dichos antagonistas y agonistas se prevén en general para su uso como medicamento. Específicamente, los antagonistas y agonistas proporcionados en el presente documento están destinados para su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la diabetes. Sin embargo, se prefieren antagonistas.

Se prevé que los antagonistas y agonistas se unan específicamente a dicho receptor de tipo IGFR y pueden seleccionarse, entre otros, de un anticuerpo, un ARNip, un ácido nucleico, un aptámero, un péptido, una proteína o un compuesto orgánico de molécula pequeña, etc. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal.

En particular, dicho anticuerpo, que es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, puede ser un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) que se une específicamente a un epítopo de dicho receptor de tipo IGFr , comprendiendo el epítopo o consistiendo en la secuencia:

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

En los usos terapéuticos y/o de diagnósticos proporcionados en el presente documento, se prevé que la diabetes comprenda diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes gestacional, prediabetes, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y tolerancia a la glucosa alterada.

El tratamiento con el antagonista o agonista del receptor de tipo IGFR, prefiriéndose antagonistas, puede prevenir o revertir la resistencia a la insulina y/o desdiferenciación inversa y/o pérdida de función de células p pancreáticas. Además, en el presente documento se proporciona un medicamento o una composición farmacéutica que comprende un antagonista o agonista del receptor de tipo IGFR (prefiriéndose antagonistas). En una realización preferida dicho receptor de tipo IGFR comprende o consiste en una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1. Dicho antagonista o agonista en una realización preferida es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho receptor de tipo IGFR.

Se prevé en particular que dicho anticuerpo monoclonal se una a un epítopo de dicho receptor de tipo IGFR, comprendiendo el epítopo o consistiendo en la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Además, en el presente documento se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo de receptor de tipo IGFR de la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Además, en el presente documento se proporciona un ensayo de cribado in vitro para antagonistas o agonistas de un receptor de tipo IGFR, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una línea celular estable que expresa dicho receptor de tipo IGFR;

(b) poner en contacto dicha línea celular de (i) con un antagonista o agonista candidato; y

(c) medir o detectar un acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR, en el que se identifica un antagonista por la supresión de dicho acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR, y se identifica un agonista por la promoción de dicho acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR.

Dicho receptor de tipo IGFR comprende en una realización preferida una secuencia correspondiente a la secuencia SEQ ID No. 1.

También en el presente documento se proporciona un antagonista o agonista de receptor de tipo IGFR que puede obtenerse por el ensayo de cribado in vitro, seleccionándose dicho antagonista o agonista de receptor de tipo IGFR de un anticuerpo, un ARNip, un ácido nucleico, un aptámero, un péptido, una proteína o un compuesto orgánico de molécula pequeña.

Además, la invención proporciona un ensayo de diagnóstico in vitro para la detección de la degeneración de células de islotes pancreáticos en un sujeto, que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una muestra, por ejemplo, una muestra de plasma, de dicho sujeto con un agente de unión de diagnóstico, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que se une específicamente al receptor de tipo IGFR;

ii) detectar la unión del agente de unión;

en el que la unión detectable de dicho agente de unión es indicativa de desdiferenciación de células de islotes pancreáticos en el sujeto; y en el que el receptor de tipo IGFR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1.

Se prevé que el agente de unión de diagnóstico, que puede ser, en particular, un anticuerpo de la invención, tal como un anticuerpo monoclonal, se una específicamente a, por ejemplo, un epítopo de receptor de tipo IGFR de la secuencia (i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Se prevé que la desdiferenciación de células de islotes pancreáticos sea indicativa de diabetes o del riesgo de desarrollar diabetes.

El agente de unión de diagnóstico puede estar preferiblemente en forma de una composición, tal como una composición de diagnóstico. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una composición de diagnóstico que comprende un agente de unión de diagnóstico tal como se describe en el presente documento, que comprende opcionalmente además medios para detectar la unión de dicho agente de unión de diagnóstico a su diana, es decir, un receptor de tipo IGFR tal como se describe en el presente documento.

La presente invención se refiere también al uso de los agentes de unión de la invención y, en particular, de los anticuerpos de la invención para la detección in vitro de degeneración de células de islotes pancreáticos. También se contempla el uso de estos anticuerpos para la preparación de una composición terapéutica o de diagnóstico.

Además, en el presente documento se proporciona un método de tratamiento de diabetes, que comprende administrar un antagonista o agonista de receptor de tipo IGFR a un sujeto, comprendiendo dicho receptor de tipo IGFR una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1.

Descripción de las figuras

La invención se entenderá mejor con referencia a la descripción detallada cuando se considere junto con los ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos. Las figuras ilustran realizaciones de métodos de la invención.

Figura 1: Representación de las secuencias enumeradas a lo largo de la memoria descriptiva. La ID de secuencia n.° 1 representa el transcrito largo del receptor de tipo IGFR y están subrayados en rojo los dominios de factor de crecimiento predichos, está subrayado en verde el dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato, está subrayada en negro la región transmembrana y en azul la región citoplasmática. Los caracteres subrayados en negrita resaltados son los 5 epítopos correspondientes a la ID de secuencia n.°: 2-6 para los cuales se generaron anticuerpos.

Figura 2: Expresión de receptor de tipo IGFR adyacente a ligandos de IGF-1, IGF-2 e insulina en el páncreas. La hibridación in situ de los embriones de ratón E14.5 de Genepaint.org muestra una expresión específica del ARNm del receptor tipo IGFR en el páncreas (B). El ARNm de IGF1 e IGF2 se expresa en tejidos adyacentes al epitelio pancreático (A, C), mientras que el ARNm de insulina está presente en el compartimiento endocrino del páncreas (D). Figura 3: Los ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR mueren temprano después del nacimiento con un peso corporal normal. Representación esquemática del alelo EUCOMM (A) El alelo EUCOMM es una primera inserción de inactivación etiquetada con indicador con potencial condicional (casete dirigido por promotor) (Skarnes WC et al.

2011; Nature). El casete L1L2_Bact_P se insertó en la posición 108489484 del cromosoma 3 en el sentido de 5' del/de los exón/exones crítico(s) (Build GRCm38). El casete está compuesto por un sitio de FRT seguido de una secuencia de lacZ y un sitio loxP. Este primer sitio loxP va seguido por neomicina bajo el control del promotor de beta-actina humano, poliA de SV40, un segundo sitio de FRT y un segundo sitio loxP. Se inserta un tercer sitio loxP en el sentido de 3' del exón seleccionado como diana en la posición 108488602. El exón crítico está flanqueado por sitios loxP. Puede crearse un alelo “preparado condicional” (floxed) mediante la expresión de recombinasa flp en ratones portadores de este alelo. La expresión de cre posterior da como resultado un ratón con inactivación. Si la expresión de cre se produce sin expresión de flp, se creará un ratón con inactivación indicador. (http://www.informatics.jax.org/allele/MGI:4436415) Los ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR muestran un aspecto normal al nacer pero no se alimentan tal como se muestra por la falta de leche en su estómago (B, estrellas), son letárgicos y muestran dificultad respiratoria, signos de disfunción metabólica. Las proporciones mendelianas en diferentes fases muestran una distribución normal de los tres genotipos hasta el nacimiento, sin embargo, el porcentaje de ratones con inactivación supervivientes se reduce significativamente después del nacimiento y hasta la edad de destete. Solo unos pocos supervivientes se encuentran en la edad de destete probablemente debido a mecanismos compensatorios y/o corte y empalme alrededor del casete insertado conduciendo a inactivación incompleta (C). Histograma que representa el peso corporal normal de ratones con inactivación en comparación con el tipo silvestre (wt) y el control de compañeros de camada heterocigotos en P0 (D).

Figura 4: Crecimiento, proliferación y diferenciación endocrina en el páncreas de ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR. Imágenes confocales de secciones de páncreas muestran diferenciación endocrina normal a E16.5 tal como se muestra por células p etiquetadas por inmunofluorescencia usando anticuerpos frente a insulina (verde) (se obtuvieron resultados similares en E14.5 y E18.5, no mostrado). Proliferación normal de epitelio pancreático tal como se muestra mediante la incorporación de EdU (rojo). Cuantificación de células positivas para EdU con respecto al número de células total (teñidas por DAPI) en E14.5, E16.5 y E18.5 no muestra diferencias significativas en la proliferación entre páncreas de tipo silvestre e inactivado (se contaron al menos tres secciones de diferentes regiones de un páncreas/fase, las barras de error representan el error estándar de la media (EEM)).

Figura 5: Expresión génica pancreática en ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR antes del nacimiento. La qPCR en tiempo real muestra cambios moderados en la expresión relativa de ARNm de genes seleccionados importantes para la diferenciación de células p endocrina, maduración, proliferación y función en el páncreas inactivado, en comparación con el control de tipo silvestre en E18.5. En esta fase, los embriones todavía dependen de la nutrición materna. (N=4, las barras de error representan EEM). Se usó actina como gen de mantenimiento para la normalización.

Figura 6: Cambios en la expresión génica pancreática en ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR después del nacimiento cuando se interrumpe el suministro de nutrientes placentarios e InsR-A cambia a InsR-B. La expresión relativa de ARNm de genes seleccionados importantes para la diferenciación de células p endocrina (Foxa2, Pdx1, Pax6, Neurod1, Nkx2-2, Nkx6-1), maduración (MafA, MafB, Ucn3), proliferación (Ccnd1, Ccnd2, Cdk4, Cdkn1a, Cdkn1b) y función (Slc2a2, Slc30a8, Gjd3, Kcnj11, Smarca1, Abcc8) cambia significativamente en el páncreas inactivado en comparación con el control de tipo silvestre inmediatamente después del nacimiento tal como se muestra por qPCR en tiempo real. (N=2 las barras de error representan EEM)

Figura 7: Señalización de Akt y AMPK mediada por receptor de tipo IGFR en el páncreas y células de insulinoma de ratón Min6. La inmunotransferencia de tipo Western de lisados de tejido de páncreas completo muestra fosforilación de Akt y AMPK usando anticuerpos específicos de fósforo (A). Un número significativo de embriones mutantes muestra aumento en Akt (mt2, 3, 5, 6) y en la fosforilación de AMPK (mt 1,2, 3) (A). De manera similar, en (B) la atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 conduce a un aumento de la fosforilación de Akt tal como se muestra por inmunotransferencia de tipo Western. Las células Min6 se transfectaron con ARNip que seleccionada como diana ARNm de receptor de tipo IGFR o ARNip revuelto como control.

Figura 8: Influencia de la atenuación del receptor de tipo IGFR sobre la señalización de insulina/IGF en células Min6. La atenuación del receptor de tipo IGFR en células de insulinoma Min6 da como resultado un aumento de fosforilación de IR/IGF1R en condiciones normales de crecimiento y parece ser independiente de las condiciones de inanición, tal como se muestra mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos de fósforo contra IR/IGF1R. Los niveles totales de IR e IGF1R, así como de IRS-2 (una molécula adaptadora aguas abajo de la señalización de IR) no se modifican mientras que el receptor de tipo IGFR se reduce fuertemente en las muestras de atenuación, confirmando la eficiencia de la atenuación de ARNip (A). Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de moléculas de señalización aguas abajo tales como AKT y mTOR, que son moléculas importantes comúnmente fosforiladas como consecuencia de la activación de IR. La atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 conduce a un aumento de fosforilación de Akt y mTOR, pero no de ERK y S6RP. Las condiciones de inanición, tal como se muestra por la reducción dependiente del tiempo de fosfo-S6RP, parece no tener un impacto sobre la fosforilación de ERK, mTOR y Akt en muestras de atenuación de receptor de tipo IGFR en comparación con sus controles coincidentes en el tiempo (B).

Figura 9: Localización del receptor de tipo IGFR en células endocrinas, ductales y exocrinas en el páncreas. Las imágenes confocales de secciones de páncreas E18.5 teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (verde), anticuerpos frente a insulina (rojo) y E-cadherina (cian) muestran la inmunolocalización del receptor de tipo IGFR en ambos compartimentos exocrino y endocrino donde se localiza de manera conjunta parcialmente con la insulina. Los núcleos se tiñeron con DAPI.

Figura 10: Localización subcelular del receptor de tipo IGFR en células Min6. Las imágenes de inmunofluorescencia de células Min6 teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR y GM130, un marcador de Golgi, muestran una localización parcial del receptor de tipo IGFR en el complejo de Golgi de manera similar a IGF2R.

Figura 11: Localización del receptor de tipo IGFR tras la inanición. Las imágenes confocales de inmunofluorescencia de células Min6 marcadas con receptor de tipo IGFR (rojo) y GM130 (verde) muestran una redistribución del receptor de tipo IGFR concentrado en el área de cis-Golgi después de 2 h de inanición en comparación con condiciones de crecimiento normales.

Figura 12: Localización de la señal de unión y clasificación de AP-2 en receptor de tipo IGFR. La figura muestra la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO: 12 y una parte de SEQ ID NO: 1.

Figura 13: Interacción del receptor de tipo IGFR con AP-2 en condiciones de inanición. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western muestra inmunoprecipitación conjunta de la subunidad de adaptina p (parte del complejo de AP2) junto con receptor de tipo IGFR en células Min6 tras la inanición, tal como se demuestra mediante inmunoprecipitación usando un anticuerpo contra receptor de tipo IGFR y adaptina p. Prácticamente ninguna adaptina p precipitó de manera conjunta en condiciones de inanición normales.

Figura 14: El receptor de tipo IGFR pero no InsR se transporta a la célula tras la privación de nutrientes. La biotinilación superficial seguida de la reducción de neutravidina e inmunotransferencia de tipo Western demuestran una reducción dependiente del tiempo en la expresión superficial de la reducción del receptor de tipo IGFR pero ninguna reducción de IR en células Min6 en condiciones de inanición.

Figura 15: La atenuación del receptor de tipo IGFR lo más probable es que no cambie la expresión proteica de proteínas relacionadas con la autofagia en condición basal. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de moléculas relacionadas con autofagia no muestra cambios aparentes en la expresión tras la atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 en condiciones de crecimiento normales.

Figura 16: Expresión de receptor de tipo IGFR en tejido exocrino e islotes diabéticos de ratón. Las imágenes de LSM de páncreas adulto de tipo silvestre (<120 mg/dl de glucosa) y diabético (>500 mg/dl de glucosa), teñido con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo), insulina (cian) y E-cadherina (verde) (A) y receptor de tipo IGFR (rojo), glucagón (cian) y urocortina 3 (verde) (B), muestran inmunorreactividad aumentada de anticuerpos frente a receptor de tipo IGFR en páncreas diabético en ambos compartimentos endocrino y exocrino. El estado diabético se demostró mediante la reducción de insulina y tinción de urocortina 3 en páncreas diabético. Las imágenes de la derecha representan un aumento mayor de regiones marcadas con los cuadrados blancos.

Figura 17: Detección de receptor de tipo IGFR en células de islotes usando anticuerpo contra el dominio intracelular y extracelular del receptor de tipo IGFr . Los experimentos de inmunotransferencia de tipo Western muestran el reconocimiento específico de una banda proteica de —130 kDa en lisados de células de islotes que está ausente en lisados de células de HEK mediante un anticuerpo contra el dominio extracelular SEQ ID NO4 y NO 6. En comparación, la misma banda se reconoce específicamente por el anticuerpo contra el dominio intracelular de SEQ ID NO 2 en los lisados de páncreas totales de tipo silvestre y heterocigotos pero no en embriones mutantes, así como en células de islotes pero no en células HEK.

Figura 18: Expresión de IGF3R en islotes humanos de Langerhans. Las imágenes confocales de islotes de Langerhans de donante humano etiquetado de manera inmunofluorescente con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo), IGF2R (M6PR) (verde) e insulina (cian) muestran una distribución del receptor de tipo IGFR típica en el compartimiento de Golgi y localización conjunta parcial con IGF2R e insulina.

Figura 19: SNP que codifican para KIAA1324/tipo IGFR en dominio extracelular, CRD y CTD.

Figura 20: Asociación de SNP que etiqueta a KIAA1324 con sensibilidad a insulina (A), adipocinas e inflamación (B) y conversión de proinsulina (C).

Figura 21: Modelo hipotético de la función del receptor de tipo IGFR en la ruta de insulina. Dibujo esquemático de los mecanismos propuestos a través de los cuales el receptor de tipo IGFR puede ejecutar sus funciones. En una hipótesis, el receptor de tipo IGFR podría actuar como modulador de la señalización y el reciclaje de IR. Tras la unión de la insulina al IR, la asociación del complejo desencadena el reclutamiento del receptor de tipo IGFR, de una manera dependiente del tiempo y de la dosis que, a su vez, dirigirá este complejo a un compartimento de endosoma/lisosoma temprano donde el ligando se degradará y el IR junto con el receptor de tipo IGFR se encaminará de nuevo a la membrana plasmática. Otra hipótesis es que la unión directa del ligando de insulina al receptor de tipo IGFR podría desencadenar la intemalización del complejo y la degradación de la insulina en el lisosoma, actuando por tanto el receptor de tipo IGFR como una molécula eliminadora que agota cantidades excesivas pericelulares de insulina liberada en determinadas circunstancias. Finalmente, el receptor de tipo IGFR podría estar implicado en la biogénesis y maduración de gránulos de insulina a través del correcto guiado y tráfico de vesículas secretoras.

Figura 22: El receptor de tipo IGFR es indicativo de la disfunción de células p pancreáticas en humanos. Imágenes de LSM de secciones de páncreas humano teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo) e insulina (verde). Los núcleos se tiñen mediante DAPI (azul) y muestran una insulina reducida y aumento de la expresión de receptor de tipo IGFR en un paciente diabético (valor de HbA1c del 6,9 %) en comparación con un paciente no diabético (valor de HbA1c del 4,6 %). (HbA1C usado como indicación del estado diabético definido como el porcentaje de hemoglobina HbA1c glicada en el plasma; intervalo normal: <5,9 %).

Figura 23: Estrategia de inactivación y activación de receptor de tipo IGFR para estudiar la función del receptor en cultivos celulares y ratones. (1) Representación esquemática de la estrategia de inactivación mediada por CRISPR/Cas9 que selecciona como diana el promotor central y el lado de inicio de la transcripción. (2) Representación esquemática de la fusión de activación mediada por CRISPR/Cas9 del indicador fluorescente de Venus mediante la eliminación de la secuencia de terminación de la traducción y la fusión de Venus en marco con respecto al marco de lectura abierto de IGFR-I. El gen IGFR-I se encuentra en el cromosoma 3 de ratón 108455694-108536536.

Figura 24: Localización subcelular del receptor de tipo IGFR en células Min6 de tipo silvestre e inactivadas. Imágenes de inmunofluorescencia de células Min6 teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo) e insulina (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul).

Figura 25: Confirmación de la inactivación del receptor de tipo IGFR en células Min6. (A) Una PCR genómica alrededor del lado de inicio de la transcripción del IGFR-I muestra deleción interna homocigota de un fragmento grande. (B) La inmunotransferencia de tipo Western confirma la mutación nula de IGFRI y muestra que la proteína de IGFR-I está completamente ausente en clones de Min6 inactivados, confirmando los resultados de inmunocitoquímica.

Figura 26: Inactivación del receptor de tipo IGFR en células Min6. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western del receptor de insulina (IR) fosforilado y moléculas de señalización posteriores tales como AMPK, AKT y mTOR, que son moléculas importantes comúnmente fosforiladas como consecuencia de la activación de IR. La inactivación del receptor de tipo IGFR en células de Min6 conduce a una fosforilación aumentada de IR y, como consecuencia, a un aumento de AMPK, pero no de fosforilación de Akt o mTOR. Los clones de inactivación y control de Min6 se cultivaron en condiciones de crecimiento (FCS al 10 % y alto nivel de glucosa).

Figura 27: Línea celular Min6 de activación de la fusión de tipo IGFR-Venus. Se fusionó IGFR-I de manera N-terminal en marco con el indicador fluorescente Venus y la localización conjunta del IGFR-I endógeno (anti-IGFR-I, rojo) e IGFR-I-Venus (anti-GFP detecta Venus, verde) se muestra en el área de Golgi y trans-Golgi. Pueden identificarse compuestos y productos biológicos de molécula pequeña que inhiben la homo y heterodimerización a través del dominio transmembrana (TM) o dominio rico en cisteína de receptor de factor de crecimiento (CRD) (IPR009030) o el cambio de la localización intracelular en trans-Golgi, Golgi, lisosoma y compartimento de la membrana plasmática usando enfoques de cribado de alto contenido usando esta línea celular Min6 activada.

Figura 28: El IGFR-I está fuertemente regulado por incremento en progenitores endocrinos PDX1+/NKX6.1 diferenciados de células madre pluripotentes inducidas humanas (IPSC).

Figura 29: Detección de receptor de tipo IGFR en células de insulinoma Min6 de ratón y células de cáncer de mama MCF7 humanas usando anticuerpos contra el dominio extracelular del receptor de tipo IGFR. Los experimentos de inmunotransferencia de tipo Western muestran el reconocimiento específico de una banda proteica de —130 kDa en lisados de células de MCF7 (fuerte) y Min6 (débil) mediante un anticuerpo contra el dominio extracelular de SEQ ID NO: 4 (EIG-B 18B2 y 10D9) y SEQ iD NO: 6 (EIG-D 26D7). Los clones EIG-B son anticuerpos monoclonales generados contra el péptido de SEQ iD NO: 4 en ratas, mientras que el clon de EIG-D es un anticuerpo monoclonal generado contra la SeQ ID NO: 6 en ratón.

Figura 30: Receptor de tipo IGFR asociado a diabetes tipo 2 en metaestudios de asociación de genoma completo. Gen KIAA1324 humano que codifica para un receptor de tipo IGFR localizado en el cromosoma 1 asociado a diabetes tipo 2; la figura se representa a partir de la referencia www.type2diabetesgenetics.com.

Figura 31: Los SNP en receptor de tipo IGFR están altamente asociados con arteriopatía coronaria, colesterol de LDL y diabetes tipo 2 en metaestudios de asociación de genoma completo. Ampliación del cromosoma humano 1, de 109.55-109.85 Mb. Las barras azules marcadas con un punto se refieren a asociaciones positivas con enfermedad; en cambio, las barras rojas sin punto se refieren a asociaciones negativas. Los tamaños (ninguno, pequeño, mediano y grande) de las barras se refieren a significancias; la figura se representa a partir de la referencia www.type2diabetesgenetics.com.

Descripción detallada

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente un receptor de tipo IGFR novedoso expresado adyacente a ligandos de IGF-1, IGF-2 e insulina en el páncreas y han demostrado que el receptor de tipo IGFR regula negativamente la señalización mediada por InsR e/o IGF1R. Por tanto, antagonistas y agonistas de dicho receptor abren posibilidades nuevas y urgentemente necesarias para revertir la resistencia a la insulina tal como se observa comúnmente en la patogénesis de diabetes, mientras que los agonistas podrían usarse para bloquear la señalización de la insulina. Sorprendentemente, los presentes inventores también pudieron mostrar que el receptor de tipo IGFR está asociado con la desdiferenciación de células p en el páncreas, un acontecimiento temprano en el inicio de la enfermedad que finalmente conduce a la destrucción de células p o a la pérdida de función. Por tanto, el receptor de tipo IGFR es también una prometedora herramienta de diagnóstico que permite el diagnóstico precoz y el tratamiento de la diabetes antes de la pérdida irrevocable de células p.

Los presentes inventores fueron pioneros en dilucidar la función del gen KIAA1324 humano en la codificación de un receptor de tipo IGFR tal como se describe en el presente documento. El producto proteico de KIAA1324 denominado anteriormente proteína UPF0577 KIAA1324 o proteína de gen 121 inducido por estrógeno (EIG121) se ha conocido comúnmente como marcador de cáncer, mientras que los presentes inventores le atribuyeron por primera vez un papel fundamental en el metabolismo a la proteína. Los términos “receptor de tipo IGFR”, “receptor de tipo IGF”; “receptor de IGF3” e “ IGF3R” se usan en el presente documento indistintamente en el presente documento.

En un primer aspecto, la invención proporciona por tanto una secuencia de ADN aislada que codifica para un receptor de tipo receptor de IGF (IGFR) que es capaz de reaccionar con anticuerpos generados contra un receptor de tipo IGFR de SEQ ID No: 1, en la que dichos anticuerpos se unen específicamente a al menos un epítopo que comprende la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

En particular, se prevé que dicha secuencia de ADN aislada codifica para la proteína UPF0577 KIAA1324 con n.° de reg. de Uniprot Q6UXG2, versión de entrada 95 del 22 de julio de 2015 (SEQ ID No. : 1) o una variante funcional de la misma, dichas proteínas también denominadas “receptor de tipo IGFR” en el presente documento.

Es importante destacar que la expresión del gen “EIG121” se conocía en la técnica anterior exclusivamente por su papel en proliferaciones neoplásicas asociadas con el exceso de estrógenos. No estaba previsto, ni era previsible, que el producto proteico del gen, es decir, el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento, regulara la señalización de IGFR/IR y fuera específicamente reconocido por los anticuerpos que se unen a los epítopos que comprenden la secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 o 6, o pudiera seleccionarse como diana con antagonistas o agonistas para el tratamiento de la diabetes.

Las variantes funcionales del receptor de tipo IGFR dadas a conocer en el presente documento, que tienen una identidad de secuencia u homología de secuencia umbral con el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento, también se abarcan por el término “receptor de tipo IGFR”. Dichas variantes funcionales está previsto que tengan al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de identidad de secuencia con la proteína UPF0577 KIAA1324 con n.° de reg. de Uniprot Q6UXG2, versión de entrada 95 del 22 de julio de 2015 (SEQ ID No.: 1) y son capaces de reaccionar con anticuerpos generados contra un receptor de tipo IGFR de SEQ ID No: 1, en la que dichos anticuerpos se unen específicamente a al menos un epítopo que comprende la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Se prevé además que dichas variantes funcionales presenten preferiblemente las mismas propiedades que la proteína UPF0577 KIAA1324, es decir, inhiben o reducen la señalización mediada por IGF1R InsR, en particular (i) la fosforilación de Akt y/o (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR tal como puede abordarse por métodos de rutina establecidos en los ejemplos adjuntos. El término “% de identidad” o “% de identidad de secuencia” tal como se usa en el presente documento se refiere al porcentaje de residuos idénticos por parejas, siguiendo la alineación (homóloga) de una secuencia de un polipéptido de la invención con una secuencia en cuestión, con respecto al número de residuos en la más larga de estas dos secuencias. La identidad en porcentaje se determina dividiendo el número de residuos idénticos entre el número total de residuos y multiplicando el producto por 100. El término “homología” se usa en el documento presente en su significado habitual e incluye aminoácidos idénticos, así como aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras (por ejemplo, intercambio de un residuo de glutamato por un residuo de aspartato) en posiciones equivalentes en la secuencia de aminoácidos lineal de dos proteínas. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 se prefiere como “secuencia de referencia”. SEQ ID NO:1 muestra la proteína UPF0577 humana KIAA1324, también denominada receptor de tipo IGFR en el presente documento. El término “secuencia de referencia” y “secuencia de tipo silvestre” (del receptor de tipo IGFR) se usan indistintamente en el presente documento. Alternativamente, puede usarse como secuencia de referencia la secuencia de aminoácidos con el número de registro Q6UXG2 de Swiss-prot/UniProt Data Bank (versión de entrada 95 de 22 de julio de 2015).

El porcentaje de homología de secuencia o identidad de secuencia puede, por ejemplo, determinarse en el presente documento usando BLASTP, versión blastp 2.2.5 (16 de noviembre de 2002; véase Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402). En esta realización, el porcentaje de homología se basa en la alineación de todas las secuencias de polipéptidos (matriz: BLOSUM 62; costes de huecos: 11,1) incluyendo las secuencias de propéptidos, preferiblemente usando el armazón proteico de tipo silvestre como referencia en una comparación por parejas. Se calcula como el porcentaje de números de “positivos” (aminoácidos homólogos) indicado como resultado en la salida del programa BLASTP dividido entre el número total de aminoácidos seleccionados por el programa para la alineación.

En el contexto de la invención, la expresión “posición correspondiente a otra posición” (por ejemplo, regiones, fragmentos, posiciones de nucleótidos o aminoácidos, o similares) se basa en la convención de numerar según el número de posición de nucleótido o aminoácido y luego alinear las secuencias de manera que maximice el porcentaje de identidad de secuencia. Dado que no es necesario que todas las posiciones dentro de una “región correspondiente” dada sean idénticas, las posiciones no coincidentes dentro de una región correspondiente pueden considerarse “posiciones correspondientes”. Por consiguiente, tal como se usa en el presente documento, la referencia a una “posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido [X]” de una secuencia de proteína especificada representa, además de la referencia a las posiciones de aminoácidos de la secuencia de proteína especificada, la referencia a una colección de posiciones equivalentes en otras familias y homólogos estructurales y proteicos reconocidos. Lo mismo puede aplicarse a la expresión “secuencia correspondiente a una secuencia”, cambiando lo que se tenga que cambiar. Es decir, la referencia a una secuencia “correspondiente a” una secuencia de proteína especificada [X], además de la referencia para secuenciar la secuencia de proteína especificada, la referencia a una colección de secuencias equivalentes en otras familias y homólogos estructurales y proteicos reconocidos.

El término “InsR” o “ IR” se refiere al receptor de insulina y generalmente comprende tanto las isoformas IR-A (también conocida como “isoforma corta”) como IR-B (también conocida como “isoforma larga”). El InsR se produce como un tetrámero de 2 cadenas a que portan las regiones de unión a la insulina y 2 cadenas p que portan el dominio cinasa, unidas por enlaces disulfuro. El InsR es una tirosina cinasa receptora que se activa por la unión de insulina, IGF-1 e IGF-2, conduciendo en última instancia a la señalización a través de la ruta MAPK/Ras-Raf-Erk, la ruta de fosfatidilinositol-3-cinasa/AKT/mTOR (PI3K/AKT) y/o la ruta de activador de la transcripción y transductor de señales/cinasa Janus (JAK/STAT). Más precisamente, la unión del ligando a las cadenas a del ectodominio de InsR induce cambios estructurales dentro del receptor conduciendo a la autofosforilación de diversos residuos de tirosina dentro del dominio tirosina cinasa intracelular de la cadena p, conduciendo al reclutamiento y la fosforilación de varios sustratos intracelulares, incluyendo los sustratos de receptor de insulina (IRS1, 2, 3, 4), SHC, GAB1, CBL y otros productos intermedios de señalización. Cada una de estas proteínas fosforiladas sirve como proteínas de acoplamiento para otras proteínas de señalización que contienen dominios de SRC-homología-2 (dominio SH2), incluyendo la subunidad reguladora p85 de PI3K y SHP2. La fosforilación de las proteínas IRS conduce a la activación de dos rutas de señalización principales: la ruta de PI3K-AKT/PKB, que es responsable de la mayoría de las acciones metabólicas de la insulina, y la ruta de Ras-MAPK, que regula la expresión de algunos genes y coopera con la ruta de PI3K para controlar el crecimiento y la diferenciación celulares. La unión de PI3K a las fosfotirosinas en IRS1 y la subsiguiente activación de PI3K conduce a la fosforilación y activación de AKT, AMPK y mTOR, una ruta de señalización que regula el metabolismo e integra las señales de la insulina. La activación de InsR tras la unión del ligando también desencadena la ruta de Ras/RAF/MAP2K/Mapk mediante fosforilación de IRS1 y el reclutamiento de GRB2/SOS, que está implicado principalmente en la mediación del crecimiento celular, la supervivencia y la diferenciación celular de la insulina.

Un ejemplo ilustrativo del InsR es el InsR humano con n.° de reg. de Uniprot P06213 (versión de entrada 216 del 22 de julio de 2015) y variantes del mismo. Los receptores de insulina en el contexto de la presente invención son preferiblemente capaces de inducir (i) fosforilación de Akt, y/o (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR tras la unión de su ligando, en particular insulina.

El término “receptor e IGF 1” o “ IGF1R” o “IGFRI” se usa en el presente documento para referirse a la tirosina cinasa receptora 1 de factor de crecimiento de tipo insulina. IGF1R se une a IGF1 con alta afinidad e IGF2 e insulina (INS) con menor afinidad. La unión del ligando activa la cinasa receptora, lo que conduce a autofosforilación del receptor, y la fosforilación de múltiples sustratos, incluyendo los sustratos de receptor de insulina (IRS1/2), Shc y proteínas 14-3 3, lo que finalmente conduce a la activación de tres rutas de señalización principales: la ruta de PI3K-AKT/PKB, la ruta de Ras-MAPK y la ruta de JAK/STAT. El IGF1R activado está implicado en el control de la supervivencia y el crecimiento celular. Por tanto, aunque InsR e IGF1R se alimentan en rutas de señalización similares, la señalización mediada por InsR regula predominantemente el metabolismo, mientras que la señalización de IGF1R está implicada en la supervivencia y el crecimiento celular.

Un ejemplo ilustrativo del IGF1R es el IGF1R humano con n.° de reg. de Uniprot P08069 (versión de entrada 185 del 22 de julio de 2015) y variantes del mismo. IGF1R en el contexto de la presente invención es preferiblemente capaz de inducir (i) fosforilación de Akt, y/o (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR tras la unión de su ligando, en particular IGF1.

El término “IGF1” o “ IGFI” se refiere al factor de crecimiento de tipo insulina I, una proteína estructural y funcionalmente relacionada con la insulina, pero que tiene una mayor actividad promotora del crecimiento. Un ejemplo ilustrativo es el IGF1 humano con n.° de reg. de Uniprot P05019 (versión de entrada 186 del 22 de julio de 2015). “ IGF1” en el contexto de la presente invención es preferiblemente capaz de unirse al receptor de IGF1 y provocar la señalización de IGF1R tal como se describe en otra parte en el presente documento.

El término “IGF2R” o “IGF2R” o “ IGFRII” se usa en el presente documento para referirse al receptor del factor de crecimiento de tipo insulina 2/manosa-6-fosfato (IGF-2/M6P). El IGF2R es una única proteína transmembrana compuesta por un dominio extracitoplasmático grande (es decir extracelular), una sola región transmembrana y una cola citoplasmática corta que carece de actividad catalítica intrínseca. El receptor se une a IGF-2 con mayor afinidad que IGF-1 y no se une a la insulina. Se ha notificado que el IGF2R interacciona, a través de sitios distintos, con enzimas lisosomales y una variedad de otros ligandos que contienen M6P, y regula las concentraciones extracelulares de IGF-2, modulando de ese modo la señalización a través de la ruta del receptor de IGF-1 estimulador del crecimiento.

Un ejemplo ilustrativo del IGF2R es el IGF2R humano con n.° de reg. de Uniprot P11717 (versión de entrada 174 del 22 de julio de 2015) y variantes del mismo.

El término “IGF2” o “IGFII” se refiere al factor de crecimiento de tipo insulina II. Un ejemplo ilustrativo es el IGF2 humano con n.° de reg. de Uniprot P01344 (versión de entrada 199 del 22 de julio de 2015) y variantes del mismo. “ IGF2” en el contexto de la presente invención es preferiblemente capaz de unirse al receptor de IG2.

La secuencia de ADN aislada proporcionada en el presente documento puede comprender una secuencia correspondiente a la secuencia del gen KIAA1324 humano (ID de gen de NCBI 57535, actualizado el 15 de julio de 2015) tal como se muestra en SEQ ID No. : 7, o variantes de la misma. Las variantes del gen KIAA1324 humano pueden incluir ortólogos. Un ortólogo, o gen ortólogo, es un gen con una secuencia que tiene una parte con similitud con una parte de la secuencia de un gen conocido, pero que se encuentra en una especie diferente al gen conocido. Un ortólogo y el gen conocido se originaron por descenso vertical de un solo gen de un ancestro común.

Tal como se usa en el presente documento, se prevé que una variante u ortólogo del gen KIAA1324 humano codifique para un receptor de tipo IGFR o una variante funcional del mismo, es decir, que sea capaz preferiblemente de inhibir o reducir la señalización mediada por InsR y/o IGF1R, en particular (i) fosforilación de Akt y/o (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR y que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de identidad de secuencia con el gen KIAA1324 humano (ID de gen de NCBI 57535, actualizado el 15 de julio de 2015), es decir, identidad de secuencia con la secuencia codificante del gen KIAA1324 humano que se muestra en SEQ ID NO: 7. La secuencia codificante se obtiene por la unión de los nucleótidos 222..374, 47932..48052, 50537..50729, 57904..58051, 58526..58606, 59512..59617, 59726..59875, 71083.. 71171, 74215..74392, 75104..75232, 75630..75720, 77404..77509, 77764..77901, 78649..78912, 80459.. 80632, 83512..83692, 84017..84113, 84611..84712, 85892..86018, 86097..86275, 86773..86938, 88982..

89050 de dicho gen KIAA1324 humano (NG_032763.1).

Tal como se usa en el presente documento, el término “secuencia de ADN aislada” se refiere a una molécula de ADN purificada, o sustancialmente purificada, a partir de material endógeno, que incluye otras secuencias de ácido nucleico, proteínas, péptidos, lípidos y así sucesivamente que se produce de manera natural en la célula y/u organismo a partir del cual se deriva la secuencia de ADN e incluye ADN purificado por técnicas de purificación estándar, así como ADN preparado por tecnología recombinante y los sintetizados químicamente.

Vector

El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, puede estar presente en y/o puede ser parte de un vector.

El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico usada como vehículo para transferir material genético (externo) a una célula huésped y abarca, sin limitación, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). En general, los vectores diseñados por ingeniería genética comprenden un origen de replicación, un sitio de multiclonación y un marcador seleccionable. El vector en sí es generalmente una secuencia de nucleótidos, comúnmente una secuencia de ADN que comprende un inserto (transgénico) y una secuencia más grande que sirve como la “estructura principal” del vector. Los vectores pueden abarcar elementos adicionales además del inserto transgénico y una estructura principal que incluye elementos de regulación génica, marcadores genéticos, resistencias a antibióticos, genes indicadores, secuencias de direccionamiento o etiquetas de purificación de proteínas. En particular, se prevén dentro del contexto de la invención vectores de expresión (constructos de expresión) para la expresión del transgén en la célula huésped, que generalmente comprenden, además del transgén, secuencias de regulación génica.

Un vector de expresión es, en general, un vector que puede proporcionar la expresión del receptor de tipo IGFR in vitro y/o in vivo (es decir, en una célula huésped, organismo huésped y/o sistema de expresión adecuado). El experto en la técnica comprenderá fácilmente que la elección de un vector particular incluye, dependiendo, por ejemplo, de la célula huésped, el número previsto de copias del vector, ya se prevea una expresión transitoria o estable del receptor de tipo IGFR, y así sucesivamente.

La “expresión transitoria” resulta de la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, una molécula lineal o no lineal de ADN o ARN) o vector que es incapaz de replicarse de forma autónoma en una célula huésped receptora. La expresión del transgén se produce a través de la expresión transitoria de la secuencia introducida.

Sin embargo, la “expresión estable” de la secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento se preferirá a menudo y puede lograrse o bien integrando de manera estable la secuencia de ácido nucleico en el genoma de la célula huésped o bien introduciendo un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención y que es capaz de replicarse de manera autónoma en la célula huésped.

Se prevé en particular que el vector proporcionado en el presente documento comprenda un elemento de regulación génica operativamente unido a la secuencia de ADN que codifica para dicho receptor de tipo IGFR.

El término “elemento de regulación génica” se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. El término “elemento de regulación génica” incluye promotores transcripcionales controlables, operadores, potenciadores, silenciadores, terminadores transcripcionales, regiones no traducidas en 5' y 3' que interaccionan con proteínas celulares huésped para llevar a cabo la transcripción y traducción y otros elementos que pueden controlar la expresión génica incluyendo codones de iniciación y terminación. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar de un organismo a otro. Los elementos de regulación génica procariótica, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma (RBS), mientras que los elementos de regulación génica para células eucariotas comprenden promotores, señales de poliadenilación (poli-A) y potenciadores.

Se prevé que el elemento de regulación génica esté “operativamente unido” al gen que va a expresarse, es decir, colocado en relación funcional con el mismo. Por ejemplo, un promotor o potenciador está “operativamente unido” a una secuencia de ácido nucleico codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. Las secuencias de ADN que están “operativamente unidas” pueden ser contiguas o no. La unión se realiza normalmente mediante ligación en sitios de restricción convenientes o adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos.

Célula huésped

Además, en el presente documento se proporciona una célula huésped que comprende el vector tal como se describe en el presente documento.

Puede emplearse una variedad de células huésped para expresar la secuencia de ácido nucleico que codifica para el receptor de tipo IGFR tal como se describe en el presente documento. Las células huésped pueden prepararse usando métodos de ingeniería genética conocidos en la técnica. El proceso de introducción del vector en una célula huésped receptora también se denomina “transformación” o “transfección” más adelante en el presente documento. Los términos se usan indistintamente en el presente documento.

La transformación de la célula huésped normalmente implica la apertura de poros u “orificios” transitorios en la pared celular y/o la membrana celular para permitir la captación de material. Ejemplos ilustrativos de protocolos de transformación implican el uso de fosfato de calcio, electroporación, compresión celular, dendrímeros, liposomas, polímeros catiónicos tales como DEAE-dextrano o polietilenimina, sonoporación, transfección óptica, impalefección, nanopartículas (pistola génica), magnetofección, bombardeo de partículas, cationes alcalinos (cesio, litio), digestión enzimática, agitación con perlas de vidrio, vectores virales, u otros. La elección del método depende generalmente del tipo de célula que está transformándose, del vector que va a introducirse en la célula y de las condiciones en las que está llevándose a cabo la transformación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier célula o cultivo celular que actúe como receptor del vector o de la secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para el receptor de tipo IGFR tal como se describe en el presente documento. Las células huésped adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas, y también incluyen, pero no se limitan a, bacterias, células de levadura, células fúngicas, células vegetales y células animales tales como células de insectos y células de mamíferos, por ejemplo, murinas, de rata, macaco o humano.

Por ejemplo, el receptor de tipo IGFR puede producirse en bacterias. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados de clonación o expresión para el receptor de tipo IGFR de la invención. Los ejemplos ilustrativos incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, huéspedes de Kluyveromyces tales como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (documento EP 402226); Pichia pastoris (documento EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del constructo de anticuerpos glicosilados de la invención también pueden derivarse de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y sus correspondientes células huésped de insecto permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 de NPV de Bombyx mori.

También pueden usarse cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco como huéspedes. Los expertos en la técnica conocen vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivo de células vegetales.

Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea renal embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión); células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO), células de Sertoli de ratón (TM4); células renales de mono (c V i ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (h ElA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2,1413 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI; células MRC 5; células f S4; y células de hepatoma humano (Hep G2).

Ligandos

Los presentes inventores han identificado varios dominios en el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento que pueden albergar sitios de unión para posibles ligandos, que pueden servir, entre otras cosas, como molde para proporcionar los agentes de unión de diagnóstico y antagonistas o agonistas de la presente invención. Dichos dominios incluyen dos dominios de unión a factores de crecimiento de tipo insulina (dominio 1: aminoácidos 273-413 de SEQ ID NO. 1; dominio 2: aminoácidos 579-659 de SEQ ID No. 1), un dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato (dominio M6P, aminoácidos 655-857 de SEQ ID No. 1), un dominio transmembrana (aminoácidos 908-930 de SEQ ID NO: 1) y un dominio citoplasmático (aminoácidos 932-1013 de SEQ ID No: 1). Dichos dominios también se derivan de la figura 1. La presente invención, por tanto, se refiere también a agentes de unión, tales como, por ejemplo, anticuerpos (prefiriéndose anticuerpos monoclonales), que se unen específicamente a al menos uno de los dominios mencionados anteriormente.

Las proteínas que comprenden un dominio de unión a factores de crecimiento de tipo insulina (n.° de reg. de InterPro IPR009030) incluyen, sin limitación, las proteínas de unión a factores de crecimiento de tipo insulina (IGFBP1-6), el receptor de factor de crecimiento de tipo insulina de tipo 1 (IGF-1R), la proteína-tirosina cinasa receptora Erbb-2, Erbb-3 y Erbb-4 (ErbB2, 3, 4), receptor de efrina tipo A/B, receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteínas de unión de tipo EGFR, CYR61, matrilina-2, -3 y -4, proteína de tipo delta 1, cubilina, proteína 1 y 3 de homólogo de Slit, proteína 6 de dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico múltiple, proteína 4 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad, proteína 2 de la ruta de señalización inducible por WNT1, proteína 1 de la ruta de señalización inducible por WNT1, proteína 3 de la ruta de señalización inducible por WNT1, proteína 2 de matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF, receptor de lipoproteínas de baja densidad, factor de crecimiento proepidérmico, componente del complemento C9, trombomodulina, proteína S dependiente de vitamina K, cadena alfa de componente del complemento C8, uromodulina, furina, proteína 1 morfogenética ósea, nidógeno 1, proteína relacionada con receptor de insulina, fibulina-1 y -2, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 6, factor de crecimiento de tejido conjuntivo, fibrilina-1, -2 y -3, proteína 1 homóloga de notch de locus neurogénico, homólogo de proteína NOV, antígeno CD97, proteína de matriz oligomérica de cartílago, queratina, Hb3 cuticular de tipo II, proteína jagged-1, homólogo de proteína revuelta 1, serina proteasa HTRA4, serina proteasa HTRA3, proteína 2 relacionada con receptor de lipoproteínas de baja densidad, proteína 2 homóloga de notch de locus neurogénico, miembro de la superfamilia de receptor de factor de necrosis tumoral 9, proteína 1 relacionada con receptor de lipoproteínas de probaja densidad, proteína 1 de matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF, nidógeno-2, miembro 1 de clase F de receptor eliminador, receptor E1 acoplado a proteína G de adhesión, proteína 6 específica de detención del crecimiento, queratina, Ha2 cuticular de tipo I, proteína 1 de unión a factor de crecimiento transformante beta latente, proteína 2 de unión a factor de crecimiento transformante beta latente, R-espondina-1, -2 y -4, Sushi, factor de von Willebrand tipo A, proteína 1 que contiene dominio de pentraxina y EGF, 1 de tipo uromodulina, meckelina, homólogo de proteína de ojos cerrados, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 4, proteína 1 que contiene dominio de sushi, rica en cisteína con proteína 2 de dominio de tipo EGF, nefronectina, protocadherina Fat 4, proteína 3 específica neuronal inducible por ácido retinoico/BMP, proteína de matriz extracelular FRAS1, proteína 6 de tipo factor de crecimiento epidérmico, péptido señal, proteína 1 que contiene dominio de tipo EGF y CUB, péptido señal, proteína 3 que contiene dominio de tipo EGF y CUB, proteína 4 de unión a factor de crecimiento transformante beta latente, hemicentina-2, receptor relacionado con factor de crecimiento epidérmico de tipo Notch y Delta, 1 de tipo proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina, serina proteasa HTRA1, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5, proteína de unión a proteína cinasa C NELL1, proteína que contiene dominio EGF y factor C de von Willebrand, miembro 2 de clase F de receptor de eliminación, rica en cisteína con proteína 1 de dominio de tipo EGF, proteína 1 que contiene dominio de inhibidor de serina proteasa de tipo Kazal, hemicentina-1, proteína de unión a proteína cinasa CNELL2, proteína 4 de homólogo de notch de locus neurogénico, R-espondina-3, receptor acoplado a proteína G de adhesión E3, mucina-13, endosialina, receptor 2 de tipo G de siete pasos de cadherina EGF LAG, receptor C1q de componente del complemento, molécula 1 específica de células endoteliales, péptido señal, proteína 2 que contiene dominio de tipo EGF y CUB, proteína 4 de tipo delta, proteína 3 de unión a factor de crecimiento transformante beta latente, proteína 3 de tipo delta, receptor 1 tipo G de siete pasos de cadherina EGF LAG, proteína 1B relacionada con receptor de lipoproteínas de baja densidad, proteína 1 de neuronas motoras rica en cisteína, fibulina-5, proteína 7 de tipo factor de crecimiento epidérmico, receptor E2 acoplado a proteína G de adhesión, proteína 3 de homólogo de notch de locus neurogénico, proteína jagged-2 y otros.

Los posibles ligandos del receptor de tipo IGFR descritos en el presente documento incluyen por tanto ligandos de las proteínas mencionadas anteriormente, tales como IR, IGF1R, insulina, IGF1, IGF2, efrina-B1, efrina-B2, EGF, EGFR, TGFA/TGF-alfa, amfiregulina, epigen/EPGN, BTC/betacelulina, epiregulina/EREG, HBEGF/EGF de unión a heparina, GP30, ALB, MB, cadenas ligeras kappa y lambda, TF, hemoglobina, GC, SCGB1A1, APOA1, lipoproteína de alta densidad, el complejo de GIF-cobalamina, LRP2, LGALS3, AGRIN, IL-1, IL-2, TNF, colágeno I y IV, perlecán, laminina, heparina, integrina, fibronectina, proteina C, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3, Jagged1, Jagged2 y Delta1, neuregulinas, NTAK, CSPG5, TNFSF9/4-1BBL, Ac-LDL, AXL, TYRO3 MER, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, BTC, EREG, HBEGF, GR4, LGR5, LGR6, C1q, lectina de unión a manosa (MBL2), proteína A tensioactiva pulmonar (SPA), TGFBR2, y fragmentos y variantes de los mismos.

Las proteínas que comprenden dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato (n.° de reg. de InterPro IPR009011) incluyen, sin limitación, receptor de manosa-6-fosfato independiente de catión, subunidad p de glucosidasa 2, receptor manosa-6-fosfato dependiente de catión, proteína OS-9, lectina 1 de retículo endoplásmico y subunidad gamma de N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa.

Los posibles ligandos del receptor de tipo IGFR proporcionados en el presente documento, por tanto, incluyen ligandos de las proteínas mencionadas anteriormente, tales como IGF2, DPP4, fosfomanosilo, TRPV4, IGF2, enzimas lisosomales, TGF p, factor inhibitorio de leucemia (LIF), proliferina, tiroglobulina, prorenina, granzima B y ácido retónico.

Los presentes inventores encontraron que la atenuación del receptor de tipo IGFR daba como resultado un aumento de la fosforilación de IGF1R e IR, y de las proteínas de señalización posteriores Akt, mTOR y AMPK. Se supone, por tanto, que el receptor de tipo IGFR puede inhibir o amortiguar activación de IGF1R y/o IR y/o la señalización posterior. Sin querer restringirse a una teoría específica, se cree que el receptor de tipo IGFR puede, por ejemplo, funcionar como un receptor “eliminador de insulina” que agota la insulina de la sangre y que transfiere la misma a los compartimentos endo- y lisosomales, donde puede degradarse. También se especula que el receptor de tipo IGFR puede asociarse con el receptor de insulina (InsR), dando como resultado la eliminación del InsR de la superficie celular. De cualquier manera, ambos escenarios pueden explicar la disminución de la activación de InsR y la señalización mediada por InsR y/o IGF1, incluyendo fosforilación de InsR, Akt, mTOR y/o AMPK en presencia de receptores de tipo IGFR funcionales. Por tanto, insulina, InsR y/o el complejo de insulina-IR están particularmente contemplados como ligandos para el receptor de tipo IGFR proporcionado en el presente documento.

Antagonistas y agonistas

Además, se proporcionan agonistas y antagonistas del receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento y se demuestra en los ejemplos adjuntos, se ha encontrado que el receptor de tipo IGFR regula negativamente, es decir, inhibe o reduce la señalización mediada por InsR y/o IGF1R, y en particular (i) fosforilación de Akt, (ii) fosforilación de AMPK y (iii) fosforilación de mTOR.

El término “antagonista” se refiere al ligando de receptor que inhibe o reduce las respuestas biológicas mediadas por agonistas en lugar de provocar una respuesta biológica por sí mismo al unirse al receptor. Los antagonistas tienen afinidad, pero esencialmente no tienen eficacia para sus receptores. El término también comprende antagonistas que se unen a los sitios activos (ortostéricos) o alostéricos de sus receptores, y/o a otros sitios de unión no implicados normalmente en la función del receptor. El término “antagonista” en general comprende antagonistas completos y parciales, antagonistas reversibles e irreversibles. Según la invención, el antagonista preferiblemente se une específicamente al receptor de tipo IGFR. Ahora que se ha dilucidado la función novedosa de la proteína UPF0577 KIAA1324, el experto en la técnica podrá identificar fácilmente antagonistas del receptor de tipo IGFR, por ejemplo, aplicando el ensayo de cribado tal como se describe en el presente documento. Según lo mencionado anteriormente, se prevé que los antagonistas del receptor de tipo IGFR supriman la capacidad de los receptores de interferir con, es decir, inhibir o reducir la señalización de IGFR y/o InsR, y pueden, por ejemplo, ser particularmente útiles para revertir la resistencia a la insulina. Específicamente, se prevé que los antagonistas del receptor de tipo IGFR sean capaces de aumentar la señalización mediada por IGF1R y/o InsR, y en particular la fosforilación de IGF1R, InsR, Akt, mTOR y/o AMPK, tal como puede determinarse usando métodos de rutina conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos adjuntos.

El término “agonista” tal como se usa en el presente documento generalmente se refiere a un ligando de receptor que activa el receptor al unirse para producir una respuesta biológica. A diferencia de los antagonistas, los agonistas tienen tanto afinidad como eficacia para sus receptores. El término “agonista”, en general, comprende agonistas completos y parciales, agonistas reversibles e irreversibles. Según la invención, el agonista preferiblemente se une específicamente al receptor de tipo IGFR. Según lo mencionado anteriormente, se prevé que los agonistas del receptor de tipo IGFR provoquen o aumenten las respuestas biológicas del receptor de tipo IGFR, es decir, reducir y/o inhibir la activación de InsR y la señalización posterior. Se prevé por tanto que los agonistas de tipo IGFR sean capaces de disminuir la señalización mediada por IGF1R y/o InsR, y en particular la fosforilación de InsR, IGF1R, Akt, mTOR y/o AMPK tal como puede determinarse usando métodos de rutina conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos adjuntos.

El “antagonista” o “agonista” de la presente invención puede ser en general cualquier molécula, tal como un anticuerpo, un ARNip, un ácido nucleico, un aptámero, un péptido, una proteína o un compuesto orgánico de molécula pequeña, que se une o se une específicamente a un receptor de tipo IGFR tal como se especifica en el presente documento, o una variante o un fragmento del mismo, y bloquea o reduce las respuestas biológicas mediadas por el receptor de tipo IGFR (es decir, actúa como antagonista) o induce o aumenta las respuestas biológicas mediadas por el receptor de tipo IGFR (es decir, actúa como agonista).

Los agonistas y antagonistas del receptor de tipo IGFR pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, usando el ensayo de cribado tal como se proporciona en el presente documento. El experto en la técnica reconocerá fácilmente que ligandos de proteínas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a factor de crecimiento de tipo insulina y/o un dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato (se han descrito proteínas y ligandos a modo de ejemplo en la sección anterior “Ligandos”) pueden usarse como molde para preparar agentes capaces de unirse al receptor de tipo IGFR y presentar un efecto agonista o antagonista. Por ejemplo, en el caso de ligandos peptídicos o proteicos, pueden prepararse fácilmente variantes y fragmentos de los mismos usando métodos rutinarios de ingeniería genética. Se prevé que los agonistas y antagonistas de la invención se unan específicamente al receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento (es decir, preferiblemente no presentan reactividad cruzada hacia dianas distintas del receptor de tipo IGFR), tal como puede someterse a prueba fácilmente, por ejemplo, evaluando la unión de anticuerpos en células huésped con atenuación del receptor de tipo IGFR (véanse los ejemplos adjuntos).

Anticuerpo

El antagonista o agonista proporcionado en el presente documento puede ser un anticuerpo. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento presentan preferiblemente la actividad biológica deseada, es decir, se unen específicamente al receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento. Específicamente, se prevé que los anticuerpos antagonistas de la invención sean capaces de aumentar la señalización mediada por IGFiR y/o InsR, y en particular la fosforilación de IGF1R, InsR, Akt, mTOR y/o AMPK, tal como puede determinarse usando métodos de rutina conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos adjuntos. También se prevé que los anticuerpos antagonistas de la invención se unan a los epítopos (SEQ ID No 2-6). La presente invención, por tanto, también se refiere a un anticuerpo que (a) se une específicamente a al menos uno de los epítopos representados en SEQ ID No 2-6 y (b) aumenta la fosforilación de IGF1R, InsR, Akt, mTOR y/o AMPK. Por lo tanto, “aumentar” indica un aumento en la señal respectiva en presencia del anticuerpo en comparación con la ausencia del anticuerpo en el método de detección respectivo que se usa para la detección y/o cuantificación de dicho aumento. La presente invención se refiere además a un anticuerpo que se une a (a) uno de los dominios de unión a factor de crecimiento mencionados anteriormente y/o dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato (representado en la figura 1) y (b) aumenta la fosforilación de IGF1R, InsR, Akt, mTOR y/o AMPK. Por lo tanto, “aumentar” indica un aumento en la señal respectiva en presencia del anticuerpo en comparación con la ausencia del anticuerpo en el método de detección respectivo que se usa para la detección y/o cuantificación de dicho aumento. Sorprendentemente, IGFR-I contiene un dominio extracelular que muestra una gran similitud con la región de dimerización de HER2, que se selecciona como diana por el anticuerpo trastuzumab (Herceptin®). HER2 es constitutivamente activo, siendo capaz de dimerizarse con otros miembros de la familia HER actuando de manera independiente del ligando y la selección como diana de HER2 por trastuzumab bloquea su actividad e inhibe el crecimiento del cáncer. Además, IGFR-I contiene un motivo de dimerización GxxxG en su dominio transmembrana que se encuentra en miembros de la familia EGFR. Esto sugiere que IGFR-I homo- y hetera se dimeriza con los miembros de la familia EGFR e IR para regular el resultado de la señalización celular, metabólico frente a mitogénico. Se prevé también por tanto que los anticuerpos de la invención que seleccionan como diana el receptor de tipo IGFR interfieran con la homo- y heterodimerización del receptor y/o unión al ligando.

El experto en la técnica conoce bien métodos para proporcionar tales anticuerpos (por ejemplo, documento WO/2014/124020) y se ejemplifican más adelante en el presente documento. Puede purificarse el ectodominio de IGFR-I, así como el receptor de longitud completa a una alta pureza usando un sistema de expresión de mamífero para generar un receptor completamente N-glicosilado y correctamente plegado con una conformación nativa. La reconstitución del receptor en membranas sintéticas no solo permite la dimerización del receptor dentro de una bicapa lipídica, sino que también presenta el receptor como un antígeno en el contexto de la membrana y, por tanto, es altamente adecuado para la generación de los anticuerpos de la presente invención y en particular para los anticuerpos terapéuticos de la invención. Por tanto, los proteoliposomas de IGFR-I son un mimético sintético de las membranas celulares y, por tanto, ideales para producir por ejemplo anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos están dirigidos únicamente contra el dominio extracelular del receptor y pueden interferir con la homo- y heterodimerización del receptor y/o la unión al ligando. Por tanto, se prevé también que los anticuerpos de la invención sean capaces de unirse al receptor de tipo IGFR glicosilado, preferiblemente a su ectodominio glicosilado.

Tal como se conoce bien en la técnica, un anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana (epítopo) a través de al menos un sitio de reconocimiento de epítopo, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. El término “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento comprende anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos (naturales o sintéticos) o variantes de los mismos, incluyendo proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo con un fragmento de unión a antígeno de la especificidad requerida y cualquier otra configuración modificada del anticuerpo que comprende un sitio o fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida. Los ejemplos ilustrativos incluyen dAb, nanoanticuerpo, aficuerpo, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpos y minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. Se entenderá que otros marcos o armazones de anticuerpos que comprenden “sitios de unión a antígenos” pueden emplearse en línea con la presente invención. El término “anticuerpo”, por tanto, también comprende estos armazones. Los armazones mencionados incluyen, por ejemplo, anticuerpos no basados en inmunoglobulina y armazones en los que pueden injertarse CDR de los anticuerpos. Tales armazones incluyen, por ejemplo, anticalinas, avímeros, afilinas, etc.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico (o variante de unión a antígeno o fragmento del mismo). El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena ligera y/o pesada es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie determinada o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado (o variante de unión a antígeno o fragmento del mismo). El término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que contiene una secuencia mínima derivada de un anticuerpo no humano. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas que comprenden residuos de una región hipervariable de una inmunoglobulina derivada de especies no humanas tales como ratón, rata, conejo o primate no humano (“anticuerpo donador”) injertados en la inmunoglobulina humana (“anticuerpo receptor”). En algunos casos, los residuos de la inmunoglobulina humana en la región marco (FR) se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos las FR son los de un secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. Un “anticuerpo humano” es aquel que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos. Los anticuerpos de humano pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol Biol, 222:581 (1991)). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos métodos descritos en Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol, 147(l):86-95 (1991). Véase también el documento van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-374 (2001). Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir tales anticuerpos en respuesta a una exposición antigénica, pero cuyos loci endógenos se han deshabilitado, por ejemplo, Xenomice inmunizado (véanse, por ejemplo, los documentos US 6.075.181 y 6.150.584 en relación con la tecnología XENOMOUSE(TM)). Véase también, por ejemplo, Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) en relación con anticuerpos humanos generados a través de una tecnología de hibridomas de células B humanas.

Modificaciones químicas

Los anticuerpos o variantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos usados según la invención pueden modificarse. Las modificaciones típicas concebibles en el contexto de la invención incluyen, por ejemplo, las modificaciones químicas descritas a continuación.

Generalmente, todo tipo de modificaciones son concebibles siempre que no supriman la capacidad de los anticuerpos o variantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para unirse específicamente al receptor de tipo IGFR y actuar como antagonistas o agonistas del receptor de tipo IGFR tal como se describe en otra parte en el presente documento.

Las posibles modificaciones químicas del anticuerpo o variantes o fragmento de unión a antígeno de los mismos incluyen la acilación o acetilación del extremo amino-terminal o la amidación o esterificación del extremo carboxiterminal o, alternativamente, en ambos. Las modificaciones también pueden afectar al grupo amino en la cadena lateral de lisina o al grupo hidroxilo de treonina. Otras modificaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, la extensión de un grupo amino con cadenas polipeptídicas de longitud variable (por ejemplo, tecnología XTEN o PASylation®), N-glicosilación, O-glicosilación y conjugación química de hidratos de carbono, tales como hidroxietilalmidón (por ejemplo, HESylation®) o poli(ácido siálico) (por ejemplo, tecnología PolyXen®). Modificaciones químicas tales como alquilación (por ejemplo, metilación, propilación, butilación), arilación y eterificación pueden ser posibles y también están previstas.

Tal como se describe en otra parte en el presente documento, se han identificado varios dominios en el receptor de tipo IGFR de la invención. Los anticuerpos que actúan como antagonistas o agonistas del receptor de tipo IGFR está previsto en principio que se unan en cualquier lugar en, o entremedias, los dominios extracelulares preferiblemente del receptor de tipo IGFR (por ejemplo, el dominio de unión a factor de crecimiento de tipo insulina, el dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato). Como tales, los anticuerpos conocidos que se unen a proteínas que comprenden uno o más de dichos dominios (se han enumerado proteínas a modo de ejemplo en la sección de “ ligandos” anterior), y en particular que se unen a un epítopo en el dominio de unión a factor de crecimiento de tipo insulina o al dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato de dichas proteínas, también se prevén generalmente como antagonistas o agonistas y pueden monitorizarse fácilmente para determinar su comportamiento antagonista o agonista en el ensayo de cribado proporcionado en el presente documento.

Además, pueden prepararse anticuerpos contra el receptor de tipo IGFR tal como se describe en los ejemplos adjuntos y someterse a prueba para determinar su actividad agonista o antagonista en el ensayo de cribado proporcionado en el presente documento.

Los anticuerpos proporcionados como antagonistas o agonistas según la presente invención se prevé en particular que sean capaces de unirse a un epítopo de receptor de tipo IGFR que comprende la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Los anticuerpos se unen preferiblemente al receptor de tipo IGFR descrito específicamente en el presente documento, es decir, para no presentar reactividad cruzada hacia moléculas no diana tales como InsR, el IGF1R y el IGF2R. La unión específica de los anticuerpos que reconocen los epítopos que comprenden SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 y 6 se ha demostrado en los ejemplos adjuntos. Por ejemplo, pudo demostrarse que la unión de los anticuerpos se suprime al atenuar el receptor de tipo IGFR, lo que indica que no se ha producido ninguna unión inespecífica.

El término “epítopo” en general se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina o derivado o fragmento de un anticuerpo o de una inmunoglobulina. Un “epítopo” es antigénico y por tanto el término epítopo también se denomina a veces en el presente documento “estructura antigénica” o “determinante antigénico”. Por tanto, el dominio de unión es un “sitio de interacción con antígeno”. Dicha unión/interacción también se entiende que define un “reconocimiento específico”. El término “epítopo” abarca epítopos lineales y epítopos conformacionales. Los epítopos lineales son epítopos contiguos comprendidos en la secuencia primaria de aminoácidos y normalmente incluyen al menos 3 o al menos 4, y más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única. Los epítopos conformacionales están formados por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento de la proteína. Los métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-RMN) y marcaje por centrifugación dirigido por el sitio y espectroscopia por resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Otras moléculas también se consideran en el presente documento como antagonistas o agonistas del receptor de tipo IGFR.

Los ARNip y los ácidos nucleicos son particularmente útiles como antagonistas del receptor de tipo IGFR que reducen o inhiben la expresión del gen KIAA1324 humano (o variantes u ortólogos del mismo). El término “ARNip” se usa indistintamente con “ARN interferente pequeño” o “ARN silenciador”. Los ARNip son moléculas de ARN “antisentido” bicatenarias, que incluyen normalmente una secuencia de al menos 20 nucleótidos consecutivos que tienen al menos el 95 % de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia del ácido nucleico diana, tal como la secuencia codificante del gen KIAA1324 humano, pero también pueden dirigirse a secuencias reguladoras de dicho gen, incluyendo las secuencias promotoras y las señales de terminación de la transcripción y poliadenilación.

Otros ácidos nucleicos capaces de reducir y/o inhibir la expresión del receptor de tipo IGFR incluyen aptámeros, Spiegelmers®, ARNnc (que incluye ARN antisensentido, L-ARN Spiegelmer, ARN silenciador, micro-ARN (miARN), ARN en horquilla corto (ARNhc), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de interferencia pequeño asociado a repeticiones (ARNip-ar) y moléculas o ARN que interaccionan con las proteínas Piwi (Piwi-ARNip). Tales moléculas de ácido nucleico no codificantes pueden, por ejemplo, emplearse para dirigir la degradación del ARNm de receptor de tipo IGFR o interrumpir la traducción del ARNm del receptor de tipo IGFR. Un reactante respectivo, en particular la molécula de ARNip, puede, en principio, sintetizarse directamente dentro de la célula huésped, o puede introducirse en la célula huésped.

En general, los péptidos y las proteínas pueden emplearse como antagonistas o agonistas del receptor de IGFR, dependiendo de si suprimen (antagonistas) o provocan (agonistas) las respuestas biológicas mediadas por la señalización del receptor de tipo IGFR. Los términos “polipéptido” y “proteína” se usando indistintamente en el presente documento. Se prevé que las proteínas y los péptidos se unan específicamente al receptor de tipo IGFR. Tal como se expuso anteriormente en el presente documento, el experto podrá encontrar fácilmente antagonistas o agonistas de péptidos y proteínas capaces de unirse específicamente al receptor de tipo IGFR, por ejemplo, usando ligandos conocidos de proteínas que comprenden un dominio de unión a factor de crecimiento de tipo insulina y/o un dominio de unión a receptor de manosa-6-fosfato (se han enumerado proteínas a modo de ejemplo en la sección anterior “ ligandos”). Dichos ligandos pueden usarse como molde para la preparación de variantes o fragmentos de los mismos usando métodos conocidos de ingeniería genética. Dichas proteínas y péptidos pueden someterse a prueba posteriormente para determinar su actividad agonista o antagonista usando, por ejemplo, el ensayo de cribado proporcionado en el presente documento. Las moléculas orgánicas pequeñas también son capaces de actuar como o bien antagonistas o bien agonistas del receptor de tipo IGFR. Se prevé que las moléculas orgánicas pequeñas se unan específicamente al receptor de tipo IGFR. Están disponibles ensayos de cribado de alto rendimiento para moléculas orgánicas pequeñas fácilmente en la técnica y pueden emplearse para encontrar ligandos del receptor de tipo IGFR proporcionados en el presente documento que puedan presentar actividad agonista o antagonista.

Unión específica

Tal como se expone en el presente documento, se prefiere la unión específica de los agentes de unión, en particular antagonistas y agonistas proporcionados en el presente documento, por ejemplo, anticuerpos, al receptor de tipo IGFR. Los términos “unión a” y “reconocimiento” en todas sus formas gramaticales se usan indistintamente en el presente documento.

El término “se une específicamente” generalmente indica que un agente de unión, en particular un antagonista o agonista, tal como un anticuerpo, se une con mayor afinidad a su diana prevista (es decir, el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento) que a su molécula no diana. Las moléculas no diana incluyen los receptores de IGF, en particular el IGF1R humano con n.° de reg. de Uniprot P08069 (versión de entrada 185 del 22 de julio de 2015), el IGF2R humano con n.° de reg. de Uniprot P11717 (versión de entrada 174 del 22 de julio de 2015) y el InsR humano con n.° de reg. de Uniprot P06213 (versión de entrada 216 de 22 de julio de 2015); y variantes funcionales de los mismos. Preferiblemente la afinidad del agonista o antagonista será de al menos aproximadamente 5 veces, preferiblemente 10 veces, más preferiblemente 25 veces, incluso más preferiblemente 50 veces, y lo más preferiblemente 100 veces o más, mayor por una molécula diana que su afinidad por una molécula no diana. Los anticuerpos preferidos se unen con afinidades de al menos aproximadamente 107 M-1, y preferiblemente entre aproximadamente 108 M-1 y aproximadamente 109 M-1, aproximadamente 109 M-1 y aproximadamente 1010 M-1, o de aproximadamente 1010 M-1 a aproximadamente 1012 M-1.

Preferiblemente, el término “se une específicamente” indica por tanto que un antagonista o agonista, tal como un anticuerpo, se une exclusivamente a su diana prevista (es decir, el receptor de tipo IGFR).

Tratamiento

Se prevé que los antagonistas y agonistas del receptor de tipo IGFR sean particularmente útiles en el tratamiento y diagnóstico de la diabetes. Tal como se usa en el presente documento, “diabetes” se refiere a la amplia clase de trastornos caracterizados por alteración de la producción de insulina y tolerancia a la glucosa y, en general, incluye diabetes tipo 1 y tipo 2 (también llamada juvenil y de inicio en adultos, respectivamente), diabetes gestacional, prediabetes, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y tolerancia a la glucosa alterada. La diabetes es el resultado de una deficiencia o deterioro funcional de las células p productoras de insulina, sola o en combinación con resistencia a la insulina.

El término “síndrome metabólico” comprende obesidad abdominal (central), tensión arterial elevada, glucosa plasmática elevada en ayunas, triglicéridos séricos altos, niveles bajos de lipoproteínas de baja densidad (HDL) y/o altos de lipoproteínas de alta densidad (LDL). Además, se asocia con el riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 y/o enfermedad cardiovascular incluyendo cardiopatías coronarias.

El término “célula(s) p”, “célula(s) beta” y “célula(s) de islote” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a las células p pancreáticas ubicadas en el islote de Langerhans. Su función principal es almacenar y liberar insulina.

La secreción defectuosa de insulina es la base de todas las formas de diabetes mellitus. Mientras que la destrucción de las células p es responsable de la diabetes tipo 1 (DT1), tanto la disminución de la masa de células p como la pérdida de la función secretora están implicadas en la diabetes tipo 2 (DT2). Los resultados emergentes sugieren que una deficiencia funcional, que implica la desdiferenciación de la célula p madura hacia un estado más parecido al de las progenitoras, puede ser un factor importante para la alteración de la secreción en DT2.

Se contempla que los antagonistas y agonistas de la presente invención pueden emplearse ventajosamente para prevenir la desdiferenciación de las células p y/o revertir la pérdida de función de las células p. Por lo tanto, el antagonista y agonistas descritos en el presente documento están previstos para su uso como medicamento. Particularmente, dichos antagonistas y agonistas están destinados a su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la diabetes.

La diabetes tipo 1 también se conoce como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), y diabetes juvenil. Los términos se usan indistintamente en el presente documento. Esta forma representa el 5-10 % de la diabetes y se cree que se debe a la destrucción autoinmunitaria de mediación celular de las células p pancreáticas, lo que da como resultado poca o ninguna secreción de insulina. Los antagonistas y agonistas del receptor de tipo IGFR proporcionados en el presente documento pueden ser capaces de prevenir o incluso revertir la pérdida de función y/o la desdiferenciación de las células p. Por tanto, se prevé que la presente invención abra nuevas posibilidades para una terapia preventiva o regenerativa de la DT1.

La diabetes tipo 2 también se denomina diabetes de inicio en adultos y representa -90-95 % de toda la diabetes. La resistencia a la insulina en los tejidos diana y una deficiencia relativa de secreción de insulina de las células p pancreáticas son las principales características de la diabetes tipo 2 (DT2). La resistencia a la insulina se usa en el presente documento para indicar un estado caracterizado por el fallo de las células diana para responder a la insulina, lo que conduce a hiperglucemia. Las células p pancreáticas en el páncreas aumentan posteriormente su producción de insulina, lo que conduce a hiperinsulinemia. Sin querer restringirse a una teoría específica, se contempla que el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento actúe como eliminador tanto para la insulina como para el receptor de insulina. Por ejemplo, el receptor de tipo IGFR puede unirse al receptor de insulina, conduciendo a la internalización del mismo (eliminador del receptor de insulina). El receptor de tipo IGFR también puede unirse a la insulina, conduciendo a su internalización y posiblemente degradación lisosomal (eliminador de insulina). Al inhibir estas funciones del receptor de tipo IGFR con la ayuda de antagonistas tal como se describe en el presente documento, la señalización mediada por InsR y/o IGF1R puede aumentar, restaurando así la sensibilidad a la insulina.

Tal como se muestra además en los ejemplos adjuntos, los presentes inventores demostraron que el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento regula negativamente la señalización posterior de insulina. Por lo tanto, se prevé que los antagonistas del receptor de tipo IGFR promuevan o restauren la señalización posterior de InsR, mientras que se cree que los agonistas del receptor de tipo IGFR inhiben o amortiguan la señalización de InsR.

Los antagonistas del receptor de tipo IGFR son, por lo tanto, preferiblemente capaces de (i) aumentar la fosforilación de Akt mediada por InsR y/o IGF1R, (ii) aumentar la fosforilación de AMPK mediada por InsR y/o IGF1R y/o (iii) fosforilación de mTOR, aumentando de ese modo ventajosamente la sensibilidad a la insulina en células resistentes a la insulina.

Diagnóstico

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la expresión del receptor de tipo IGFR especificado en el presente documento se asocia con la desdiferenciación de células p pancreáticas. La desdiferenciación de células p es un término usado para describir un cambio en el fenotipo de las células p que revierte de nuevo hacia la célula progenitora multipotente de la que se originó un estado desdiferenciado reversible independiente. Se cree que la desdiferenciación de células p pancreáticas conduce a la pérdida de funciones clave, incluyendo la secreción de insulina. La secreción de insulina desregulada como resultado de la pérdida de funciones críticas de células p se considera una parte fundamental de la patogénesis de la diabetes (incluyendo DT1 y DT2). Se cree que la hiperglucemia es una de las principales causas de desdiferenciación de células p pancreáticas que conduce a una secreción disfuncional de insulina; un proceso también llamado toxicidad por glucosa.

Al presentar esta solicitud, no estaban disponibles biomarcadores fiables para el inicio y la progresión de la enfermedad. Los presentes inventores han descubierto que el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento no solo es una diana potencial y potente útil para el tratamiento de la diabetes, sino que también acompaña a la patogénesis en etapas muy tempranas. Por tanto, la monitorización de la expresión del receptor de tipo IGFR proporcionado en el presente documento permite el diagnóstico temprano de la diabetes e incluso puede permitir el tratamiento (profiláctico) antes de que las células p se pierdan o se alteren gravemente en su función.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento para su uso como marcador de diagnóstico para diabetes o el riesgo de desarrollar diabetes. Preferiblemente, dicho receptor de tipo IGFR comprende una secuencia correspondiente a la secuencia SEQ ID No 1, sin embargo, también se prevén variantes de dicho receptor de tipo IGFR.

En vista de lo anterior, también se proporciona en el presente documento un ensayo de diagnóstico in vitro (es decir, método de diagnóstico) para la detección de desdiferenciación de células de islotes pancreáticas en un sujeto, comprendiendo dicho ensayo las etapas de:

i) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un agente de unión de diagnóstico que se une específicamente al receptor de tipo IGFR soluble;

ii) detectar la unión del agente de unión de diagnóstico;

en el que la unión detectable de dicho agente de unión de diagnóstico es indicativa de desdiferenciación de células de islotes pancreáticas en el sujeto; y en el que el receptor de tipo IGFR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1.

Tal como se indica en el presente documento, la desdiferenciación de células p pancreáticas se cree que es indicativa de diabetes o el riesgo de desarrollar diabetes. En general, la muestra puede ser cualquier muestra, en particular una muestra de plasma.

En general, con el fin de proporcionar un agente de unión de diagnóstico, el experto en la técnica puede seguir los mismos principios establecidos en el contexto de proporcionar antagonistas y agonistas del receptor de tipo IGFR. Del mismo modo, se prevé que los agentes de unión de diagnóstico proporcionados en el presente documento se unan específicamente al receptor de tipo IGFR proporcionado en el presente documento. Los agentes de unión de diagnóstico pueden presentar actividades antagonista o agonista (permitiendo de ese modo, por ejemplo, el diagnóstico y tratamiento (preventivo) simultáneos, o puede no tener un efecto sobre la señalización del receptor de tipo IGFR en absoluto. Al preparar los agentes de unión de diagnóstico, el experto en la técnica puede, tal como se describe en otra parte en el presente documento, por ejemplo, usar ligandos y proteínas que comprenden dominios de unión a factor de crecimiento de tipo insulina y/o dominios de unión a receptor de manosa-6-fosfato y usar sus ligandos como “moldes” para generar agentes de unión de diagnóstico capaces de unirse específicamente al receptor de tipo IGFR. Se han descrito proteínas y ligandos a modo de ejemplo en la sección de “ ligandos” en el presente documento. El enfoque se ha descrito en el contexto de la preparación de antagonistas y agonistas del receptor de tipo IGFR y es completamente aplicable también a los agentes de unión de diagnóstico, con la excepción de que tales agentes de unión no necesariamente tienen que presentar propiedades antagonistas y/o agonistas.

Agentes de unión particularmente útiles para su uso en el ensayo de unión de diagnóstico in vitro comprenden anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos que reconocen específicamente un epítopo del receptor de tipo IGFR que comprende la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Los agentes de unión de diagnóstico empleados en los métodos de la invención pueden comprender además un marcador detectable unido al agente de unión de diagnóstico. El marcador detectable puede unirse (preferiblemente de manera covalente) a los agentes de unión de diagnóstico, o bien directamente o bien a través de espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. En la técnica se conocen diversos métodos de marcaje de proteínas y pueden usarse en la realización de la presente invención. El término “marcador” o “grupo de marcaje” se refiere a cualquier marcador detectable. Los marcadores adecuados para su uso con el agente de unión de diagnóstico incluyen, sin limitación, (i) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), (ii) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas), (iii) restos activos redox, (iv) colorantes ópticos (incluyendo, pero sin limitarse a, cromóforos, fósforos y fluoróforos) tales como marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores quimioluminiscentes y fluoróforos que pueden ser o bien fluoróforos de “molécula pequeña” o bien fluoróforos proteicos, (v) grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, p galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), (vi) grupos biotinilados, (vii) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de parejas de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo, etc.).

Por “marcador fluorescente” quiere decirse cualquier molécula que puede detectarse a través de sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarina, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarillo lucifer, azul cascada J, rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Rojo 705, verde Oregón, los colorantes de Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), azul cascada, amarillo cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina y rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Colorantes ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland. Los marcadores fluorescentes proteínicos a modo de ejemplo también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP, EGFP, proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP), luciferasa y p galactosidasa.

Está dentro del conocimiento del experto en la técnica elegir un marcador adecuado dependiendo del tipo de agente de unión de diagnóstico, sus propiedades químicas y el método de detección previsto. Agentes de unión de diagnóstico particularmente adecuados para su uso en los métodos de la invención son anticuerpos monoclonales, preferiblemente que reconocen específicamente el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento.

Ventajosamente, la desdiferenciación de células p pancreáticas puede visualizarse empleando agentes de unión de diagnóstico capaces de reconocer específicamente el receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento. Se contempla que la desdiferenciación de dichas células p es indicativa de diabetes, o el riesgo de desarrollar diabetes, y precede a la disfunción de células p. La presente invención, por lo tanto, por primera vez, proporciona un ensayo de diagnóstico que permite el diagnóstico de diabetes (incluyendo diabetes gestacional tipo 1, tipo 2, síndrome metabólico y prediabetes) en una fase muy temprana del inicio de la enfermedad, abriendo por tanto nuevas posibilidades para la interferencia temprana con mecanismos destructivos que conducen a la disfunción de células p y a la pérdida o alteración de la producción de insulina.

Habiendo encontrado que el producto génico del gen KIAA1324 humano desempeña un papel en la diabetes, la presente invención permite asignar a cualquiera de los SNP conocidos en el gen KIAA1324 si uno o más SNP pueden estar asociados con una predisposición para desarrollar o estar en riesgo de desarrollar diabetes, en particular, diabetes mellitus tipo II.

La presente invención también permite hacer uso de SNP conocidos en el gen KIAA1324 humano (incluyendo exones, intrones, regiones no traducidas en 5' y 3') para determinar si un sujeto puede tener una predisposición a desarrollar o estar en riesgo de desarrollar diabetes, en particular, diabetes mellitus tipo II. Se enumeran s Np preferidos para tal determinación en la siguiente tabla.

Si un sujeto puede tener en una posición, tal como se enumera en la tabla anterior, otro nucleótido en comparación con el gen KIAA1324 humano de tipo silvestre, dicho sujeto puede tener una predisposición a desarrollar o estar en riesgo de desarrollar diabetes, en particular, diabetes mellitus tipo II, es decir, un SNP en una posición, tal como se enumera en la tabla anterior, puede ser indicativo de una predisposición a desarrollar o estar en riesgo de desarrollar diabetes, en particular, diabetes mellitus tipo II. El gen KIAA1324 humano de tipo silvestre es la ID de gen de NCBI 57535, actualizado el 15 de julio de 2015, mostrado como una secuencia de nucleótidos bajo el número de registro de GenBank NG_032763.1.

Las posiciones a las que se hace referencia en la tabla anterior se toman de la ID de gen 57535 para KIAA1324 (actualizado el 27 de agosto de 2016), versión de anotación 108, ensamblaje GRCh37.p13 (GCF_000001405.25), cromosoma 1, localización NC_000001.10 (109656585..109749403).

Pacientes

El término “paciente” o “sujeto” tal como se usa en el presente documento se refiere a un humano o animal no humano, generalmente un mamífero. Se prevé particularmente un mamífero, tal como un conejo, un ratón, una rata, un conejillo de Indias, un hámster, un perro, un gato, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un caballo, un mono, un simio o preferiblemente un humano. Por tanto, los métodos, usos y compuestos descritos en este documento son en general aplicables tanto a la enfermedad humana como a la veterinaria.

Tratamiento

El término “tratamiento” en todas sus formas gramaticales incluye tratamiento terapéutico o profiláctico. Un “tratamiento terapéutico o profiláctico” comprende tratamientos profilácticos destinados a la prevención completa de manifestaciones patológicas y/o clínicas o tratamiento terapéutico dirigido a la mejora o remisión de manifestaciones patológicas y/o clínicas de las enfermedades. El término “tratamiento” por tanto también incluye la mejora o prevención de la diabetes.

En el contexto de la presente invención, el término “efecto terapéutico” en general se refiere al impacto deseable o beneficioso de un tratamiento, por ejemplo, la mejora o remisión de las manifestaciones de la enfermedad. El término “manifestación” de una enfermedad se usa en el presente documento para describir su expresión perceptible, e incluye tanto manifestaciones clínicas, definidas más adelante en el presente documento como indicaciones de la enfermedad que pueden detectarse durante un examen físico y/o que son perceptibles por el paciente (es decir, síntomas), como manifestaciones patológicas, lo que significa expresiones de la enfermedad a nivel celular y molecular. El efecto terapéutico del tratamiento con los antagonistas y agonistas de tipo IGFR puede evaluarse usando métodos rutinarios en la técnica, por ejemplo, la medición de los niveles de insulina y/o de glucosa en muestras de sangre del paciente. Adicional o alternativamente, también es posible evaluar el aspecto general del paciente respectivo (por ejemplo, forma física, bienestar), lo que también ayudará al facultativo cualificado a evaluar si se ha producido un efecto terapéutico.

El experto en la técnica es consciente de muchas otras formas que son adecuadas para observar un efecto terapéutico de los compuestos de la presente invención.

Dosis

Preferiblemente, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto tal como se describe en el presente documento. Por “cantidad terapéuticamente eficaz” quiere decirse una cantidad del compuesto tal como se describe en el presente documento que produce un efecto terapéutico. La dosis exacta de antagonistas o agonistas del receptor de tipo IGFR dependerá del propósito del tratamiento (por ejemplo, mantenimiento de la remisión frente a tratamiento del empeoramiento agudo de la enfermedad), y podrá determinarla un experto en la técnica usando técnicas conocidas. Pueden ser necesarios ajustes para la vía de administración, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, interacción con fármacos y la gravedad de la afección, y podrán determinarse con experimentación rutinaria por parte de los expertos en la técnica.

Administración

Una variedad de vías son aplicables para la administración del compuesto según la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, por vía oral, tópica, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o intraocular. Sin embargo, cualquier otra vía puede elegirse fácilmente por el experto en la técnica si así lo desea.

Composición

Se prevé administrar los antagonistas o agonistas de tipo IGFR en forma de una composición farmacéutica. Preferiblemente, dichos antagonistas o agonistas están presentes en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Los antagonistas o agonistas particularmente preferidos para su uso en la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento son anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al receptor de tipo IGFR descrito en el presente documento. Dichos anticuerpos se prevé que se unan específicamente a un epítopo de receptor de tipo IGFR que comprende la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID NO.: 5) y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

El término “composición farmacéutica” se refiere en particular a una composición adecuada para administración a un humano, es decir, una composición que es preferiblemente estéril y/o contiene componentes que son farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, también se prevén composiciones adecuadas para administración a animales no humanos en el presente documento. Preferiblemente, una composición farmacéutica comprende un antagonista o agonista de tipo IGFR junto con uno o más excipientes farmacéuticos. El término “excipiente” incluye cargas, aglutinantes, disgregantes, recubrimientos, sorbentes, antiadherentes, deslizantes, conservantes, antioxidantes, aromatizantes, colorantes, agentes edulcorantes, disolventes, codisolventes, agentes tamponantes, agentes quelantes, agentes que confieren viscosidad, agentes tensioactivos, diluyentes, humectantes, portadores, diluyentes, conservantes, emulsionantes, estabilizantes o modificadores de la tonicidad. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse de diversas formas, por ejemplo, en forma sólida, líquida, gaseosa o liofilizada y pueden estar, entre otras, en forma de un ungüento, una crema, parches transdérmicos, un gel, polvo, un comprimido, disolución, un aerosol, gránulos, píldoras, suspensiones, emulsiones, cápsulas, jarabes, líquidos, elixires, extractos, tintura o extractos fluidos o en una forma especialmente adecuada para el método deseado de administración.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además uno o más agentes adicionales. Preferiblemente, dichos agentes son terapéuticamente eficaces para el tratamiento de las enfermedades descritas en el presente documento y están presentes en la composición en una cantidad terapéuticamente eficaz. Los ejemplos incluyen, sin limitación, metformina, sulfonilureas, meglitinidas, tiazolidindionas, inhibidores de DPP-4, agonistas del receptor de GLP-1, inhibidores de SGLT2, insulina y derivados de insulina (insulina glulisina, insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, insulina detemir, insulina isófana), y combinaciones de los mismos.

En vista de lo anterior, la presente invención por lo tanto también proporciona una composición farmacéutica que comprende un antagonista o agonista de tipo IGFR. Dicha composición farmacéutica está especialmente destinada a su uso en un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de la diabetes.

Kit

También se proporciona un kit en el presente documento. El kit puede ser un kit de dos o más partes, y comprende el antagonista o agonista de receptor de tipo IGFR, preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz y en una forma farmacéuticamente aceptable. Los componentes del kit pueden estar contenidos en un recipiente o viales. El kit está previsto que comprenda agentes adicionales útiles en el tratamiento de la diabetes, tal como se describe en otra parte en el presente documento. Los agentes adicionales a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, metformina, sulfonilureas, meglitinidas, tiazolidindionas, inhibidores de DPP-4, agonistas del receptor de GLP-1, inhibidores de SGLT2, insulina y derivados de insulina (insulina glulisina, insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, insulina detemir, insulina isófana), y combinaciones de los mismos.

El antagonista o agonista de tipo IGFR y los agentes adicionales pueden administrarse simultánea o secuencialmente al paciente.

Ensayo de cribado

Cuando se usa en el presente documento, el término “ensayo de cribado” se usa equivalentemente con el término “método de cribado”. Tal ensayo o método se realiza preferiblemente “in vitro". Sin embargo, también puede realizarse “in vivo".

Los antagonistas y agonistas del receptor de tipo IGFR pueden identificarse usando un ensayo de cribado in vitro tal como se proporciona en el presente documento, dicho ensayo comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una línea celular estable que expresa dicho receptor de tipo IGFR; (b) poner en contacto dicha línea celular de (a) con un antagonista o agonista candidato; y (c) medir un acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR, en el que se identifica un antagonista por el aumento de dicho acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR, y se identifica un agonista por la disminución de dicho acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR; en el que dicho receptor de tipo IGFR comprende una secuencia correspondiente a la secuencia SEQ ID No. 1.

Un acontecimiento de señalización posterior preferido es la fosforilación de InsR, fosforilación de AMPK, fosforilación de mTOR, fosforilación de AKT, fosforilación de ERK y/o fosforilación de S6K.

Opcionalmente, en los métodos de cribado descritos en el presente documento, una línea celular, preferiblemente la misma línea celular que se aplica en los métodos de cribado de la presente invención, que expresa dicho receptor de tipo IGFR no se pone en contacto con un antagonista o agonista candidato, respectivamente. Tal línea celular sirve como control. En una línea celular de control de este tipo también se mide un acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR y se compara con el acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR medido en una línea celular que se pone (o se puso) en contacto con un antagonista o agonista candidato.

Ejemplos preferidos de líneas celulares que expresan dicho receptor de tipo IGFR son Min6 o PDX1+/NKX6.1+ iPSC.

Tal como se describe en el presente documento, se cree que acontecimientos de señalización posteriores del receptor de tipo IGFR dan como resultado una regulación negativa de la señalización mediada por InsR y/o IGF1R, y en particular (i) fosforilación de Akt, (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR inhibida o reducida. Como tal, un agente de unión que promueve o aumenta (i) la fosforilación de Akt, (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR en el ensayo de cribado proporcionado en el presente documento es probablemente un antagonista del receptor de tipo IGFr . Un agente de unión que no tiene ningún efecto sobre o incluso reduce (i) la fosforilación de Akt, (ii) la fosforilación de AMPK y/o (iii) la fosforilación de mTOR en el ensayo de cribado proporcionado en el presente documento es probablemente un agonista del receptor de tipo IGFR.

La línea celular estable puede ser cualquier línea celular adecuada para expresar un receptor de tipo IGFR funcional, en la que un “receptor de tipo IGFR funcional” se prevé particularmente para regular negativamente la señalización mediada por InsR y/o IGFlR, tal como puede determinarse mediante una (i) fosforilación de Akt, (ii) fosforilación de AMPK y/o (iii) fosforilación de mTOR reducida o inhibida.

La invención también se refiere a un antagonista o agonista que puede obtenerse por el método de cribado.

La presente invención contempla también un método para detectar si el receptor de tipo IGFR experimenta homo- o heterodimerización con IGFR-1, IGFR-2 y/o InsR. Dicho método comprende detectar si un receptor de tipo IGFR etiquetado se homodimeriza o heterodimeriza. Los heterodimeros pueden incluir el receptor de tipo IGFR e InsR, IGFR-1 y/o IGF-R2.

Etiquetas preferidas son proteínas fluorescentes, tales como GFP o Venus, un mutante genético de proteína fluorescente verde (GFP) con un pico de emisión de 527 nm.

El etiquetado del receptor de tipo IGFR se logra preferiblemente fusionando una etiqueta en marco con dicho receptor de tipo IGFR. Esto puede lograrse mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, activando la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho receptor de tipo IGFR en una secuencia de nucleótidos que codifica para una etiqueta, por ejemplo, mediante la edición del genoma, tal como usando el sistema de CRIPSR/Cas.

Debe indicarse que, tal como se usa en el presente documento, la forma singular “un”, “una” y “el/la”, incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de tales diferentes reactivos y la referencia “al método” incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos habituales en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en el presente documento.

A menos que se indique de otro modo, el término “al menos” que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a todos los elementos en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más de la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento. Tales equivalentes están destinados a abarcarse por la presente invención.

El término “y/o” siempre que se use en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.

El término “alrededor de” o “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento significa dentro del 20 %, preferiblemente dentro del 10 %, y más preferiblemente dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. Esto incluye, sin embargo, también el número concreto, por ejemplo, “alrededor de 20” incluye 20.

El término “menor que” o “mayor que” incluye el número concreto. Por ejemplo, menor que 20 significa menor que o igual a. De manera similar, más que o mayor que significa más que o igual a, o mayor que o igual a, respectivamente.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que la siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender” y variaciones como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento, el término “que comprende” puede sustituirse por el término “que contiene” o “que incluye” o, a veces, cuando se usa en el presente documento por el término “que tiene”.

Cuando se usa en el presente documento, “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en el elemento de reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

A partir de los siguientes ejemplos se obtendrá una mejor comprensión de la presente invención y de sus ventajas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Material y métodos

Generación de los ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR

Todos los ratones fueron alojados en las instalaciones centrales en HMGU de acuerdo con la legislación alemana sobre bienestar animal y las directrices reconocidas de la Sociedad de Animales de Laboratorio (GV-SOLAS) y de la Federación de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA). El sacrificio de ratones en fases embrionarias no estaba sujeto a autorización reglamentaria.

Los clones de células ES seleccionados como diana derivados de la línea celular parental C57BL/6N JM8.N4 se obtuvieron del repositorio celular EUCOMM (EuMMCR) (Helmholtz Zentrum Muenchen GmbH, alelos producidos para los proyectos e Uc OMM y EUCOMMTools por el Helmholtz Zentrum Muenchen GmbH (Hmgu). Mg I Direct Data Submission. 2010-2015) y se inyectaron en blastocistos CD1 para la generación de quimeras. Las quimeras resultantes se acoplaron a ratones CD1 o C57BL/6J, y la progenie se cribó por PCR para confirmar la transmisión de la línea germinal. Los ratones heterocigotos portadores de la mutación objetivo se cruzaron entre sí para generar ratones mutantes homocigotos o bien en el antecedente CD1 o bien C57BL/6J.

El genotipado se confirmó por PCR usando ADN genómico extraído de las colas de ratones con inactivación y de control. Los cebadores usados para la PCR fueron los siguientes: cebador directo: 5'TGGGTAGCCTTTCTGTATGG -3' (SEQ ID NO: 8) y cebador inverso: 5' GACATAGGGCAGATTTGTGG-3' (SEQ ID NO: 9).

Ensayo de proliferación

Para someter a ensayo la proliferación celular en embriones mutantes, se inyectaron en hembras preñadas por vía subcutánea 0,1 mg de EdU/gramo de peso corporal. Después de dos horas, los animales se sacrificaron y los páncreas de los embriones E14.5, E16.5 y E18.5 se diseccionaron y se fijaron en PFA al 4 % en PBS pH 7,4 durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, los órganos se sometieron a un gradiente de sacarosa del 7,5 %, el 15 % y el 30 % incrustados en el medio de congelación de tejidos (Leica, Alemania) y se almacenaron a -80 °C. Se tiñeron criosecciones de 20 micrometros usando un kit de obtención de imágenes de EdU Click-it® (Life Technology) según las instrucciones del fabricante que incluía anticuerpos contra insulina (conejillo de Indias 1:250 de Thermo Schientific; PA1-26938). Se adquirieron imágenes usando un microscopio confocal Leica SP5 con un objetivo 20x y el análisis de datos se realizó usando el software IMARIS (Bitplane, Suiza).

RT-qPCR

Para el análisis de expresión génica, por PCR cuantitativa en tiempo real, se aisló ARNm a partir de páncreas de embriones de control y con inactivación usando el mini kit miRNeasy (Qiagen, Alemania). El ADNc se sintetizó usando el sistema de transcripción inversa GoScriptTM (Promega) y se usó posteriormente para qPCR usando matrices de baja densidad TaqMan® y se ejecutó en un sistema ViiA 7 (Applied Biosystems). Las sondas usadas se enumeran en la tabla 1:

Tabla 1

Generación de anticuerpo monoclonal contra la proteína del gen 121 inducido por estrógeno (EIG).

Se sintetizaron péptidos de la proteína EIG humana y se acoplaron a OVA (Peps4LS, Heidelberg, Alemania). Se inmunizaron ratas Lou/c o ratones C57BL/ por vía subcutánea e intraperitoneal con una mezcla de 50 |ig de péptido-OVA, 5 nmol de oligonucleótido CPG (Tib Molbiol, Berlín), 500 |il (ratón 100 |il) de PBS y 500 |il (ratón 100 |il) de adyuvante incompleto de Freund. Se administró un refuerzo sin adyuvante seis semanas después de la inyección primaria. Se realizó la fusión usando procedimientos estándar. Los sobrenadantes se sometieron a prueba en un ELISA diferencial con los péptidos de EIG biotinilados y un péptido biotinilado irrelevante en placas de ELISA recubiertas con avidina. Los AcM que reaccionaron específicamente con el péptido de EIG se analizaron además en inmunotransferencia de tipo Western.

Los anticuerpos policlonales de conejo se adquirieron de Pineda Antikorper Service, Berlín, Alemania.

Cultivo celular

Min6 es una línea de células p pancreáticas que está bien caracterizada por su capacidad de secretar insulina tras la estimulación con glucosa. Esta línea celular era del laboratorio de Susumu Seino.

Las células Min6 se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco de alto contenido en glucosa de Gibco (41966-052), suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, penicilina/estreptomicina 1 % y 2-mercaptoetanol. Se adquirieron células HEK293 del Global Biosource Center ATCC.

Atenuación de receptor de tipo IGFR

Se sembraron células Min6 a una densidad celular de 5 x 104 células/cm2 y se cultivaron en medio DMEM de alto contenido en glucosa. Después de una transfección de ARNip de receptor de tipo IGFR el día dos y el día tres, las células se lisaron en tampón RIPA sobre hielo el día 4 a una densidad celular del 50-60 %. Se realizó transfección basada en lipofectamina (Lipofectamine 2000, Life Technologies, n.° 11668019) según el protocolo de Life Technologies y se usaron 200 pmol de los siguientes ARNip de Dharmacon GE Healthcare: ARNip-SMARTpool de ratón 5330417C22Rik (229722) On-Target plus L-048745-01-0020 y ARNip sin selección como diana On-target plus de control n.° 1 D-001810-01-20.

Inactivación de receptor de tipo IGFR

Estrategia de inactivación de IGFR-I mediada por CRISPR/CAS9 en células Min6 que selecciona como diana el promotor de núcleo y al lado de inicio de la transcripción (figura 23).

Fusión de Venus de activación de receptor de tipo IGFR

Fusión de activación mediada por CRISPR/Cas9 del indicador fluorescente Venus eliminando la secuencia de terminación de la traducción y fusionando en marco de Venus con el marco de lectura abierta de IGFR-I (figura 23): Un Cas9 fusionado en el marco con el indicador fluorescente Venus se transfectó de manera conjunta en células Min6 con ARN de guía (ARNg) que flanquea el lado de inicio de la transcripción del IGFR-I. Después de 2 días, las células fluorescentes se clasifican por flujo y se sembraron en placa diluciones limitadas en placas de 10 cm. Después de 10 14 días, se recogieron clones individuales en placas de 96 pocillos y se analizaron para determinar la expresión de IGFR-I (tinción y WB) y deleción interna por PCR genómica.

Ensayo de inanición de Min6

Se sembraron células Min6 a una densidad celular de 5 x 104 células/cm2 y se cultivaron en medio DMEM de alto contenido en glucosa. Después de realizar una atenuación del receptor de tipo IGFR, se lavaron células Min6 seis veces con PBS 1x y se añadió tampón HBSS que contenía BSA al 0,2 % durante 15 min, 30 min, 60 min y 120 min para someter a inanición a las células. Posteriormente, las células se lisaron en tampón RIPA sobre hielo.

Inmunotransferencia de tipo Western (inmunotransferencia semiseca)

Se lisaron células y tejidos en tampón RIPA (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, IGEPAL al 1 %, SDS al 0,1 %, desoxicolato de Na al 0,1 %) que contenían un cóctel de inhibidor de proteinasa (1:100, Sigma, P8340) e inhibidores de fosfatasas (1:100, Sigma Aldrich, n.° 2 P0044 y n.° 3 P5726) y los lisados de células o tejidos se aclararon por centrifugación a 13000 r.p.m. durante 10-30 min. Las proteínas (10-20 |ig) se redisolvieron en SDS PAGE al 6,5-15 % según el tamaño de proteína que va a detectarse y se transfirieron a una membrana de PVDF. Se añadieron anticuerpos primarios a la membrana en leche al 5 % y se incubaron a 4 °C durante la noche. Se visualizaron bandas proteicas sobre Hyperfilms (GE healthcare, 28906837) o Blaufilme CEA-RP (Ernst Christiansen GmbH, EC84A) mediante detección quimioluminiscente (ECL, Millipore, WBKLS0500).

Se usaron los siguientes anticuerpos con diluciones correspondientes:

Receptor de tipo IGFR de SEQ ID No. 2 (1:5000 conejo Pineda, Berlín, Alemania), receptor de tipo IGFR de SEQ ID No. 2 (1:100 rata y ratón), receptor de tipo IGFR de SEQ ID No. 4 y 6 (1:10 rata y ratón), Akt (1:5000 Cell Signaling, 4691), P-Akt (1:5000 Cell Signaling, 4060), Erk (1:5000 Cell Signaling, 4695), P-Erk (1:5000 Cell Signaling, 4370), m-TOR (1:1000 Cell Signaling, 2972), P-mTor (1:1000 Cell Signaling, 5536), Ampk (1:1000 Cell Signaling, 2532), P-Ampk (1:2500 Cell Signaling, 2535), IRS-2 (1:1000 Cell Signaling, 4502), R (1:1000 Cell Signaling, 3025), S6rp (1:5000 Cell Signaling, 2217S), P-S6RP (1:5000 Cell Signaling, 2211S), P-IR/IGFR (1:1000, Millipore, 07-841), a-tubulina (1:5000, Sigma, T7451), clon de adaptina beta de ratón 74 (1:5000, BD Bioscience 610382). Para la detección de proteínas relacionadas con autofagia, se usó el kit Autophagy Antibody Sampler (#4445, 1:1000) de Cell Signaling.

Inmunofluorescencia y obtención de imágenes

Para la inmunocitoquímica, se sembraron en placa células Min6 en placas de cámara de 8 pocillos de Ibidi (Múnich, Alemania) a una densidad celular de 5 x 104 células/pocillo. Tres días después de la siembra, se fijaron las células directamente con PFA al 4 % durante 10 min seguido de una incubación de 10 min en disolución de permeabilización (glicina 0,1 M, Triton-X100 al 0,2 % en PBS 1x). Después del bloqueo (suero de asno al 10 %, BSA al 1 % y FCS al 5 %, Tween-20 al 0,5 % en PBS 1x) durante 1 h, se incubaron células en disolución de bloqueo que contenía anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C: receptor de tipo IGFR SEQ ID No. 2 (rata y ratón 1:10), GM130 (1:300, BD, 610822), IGF2R (1:100 TermoScientific, PA3-850). Se aplicaron los siguientes anticuerpos secundarios durante 2 h a temperatura ambiente en disolución de bloqueo: anti-conejo de asno IgG-555 (1:800, Invitrogen, A31572), anti-ratón de asno IgG 488 (1:800, Invitrogen, A21202) y anti-rata de asno IgG 647 (1:400, Dianova, 712-605-150). Después de la tinción con DAPI (50 ng/ml), se montaron las muestras con elvanol y se adquirieron imágenes sobre un microscopio confocal SP5 de exploración por láser Leica con objetivo 63x.

Para inmunohistoquímica en tejido de ratón, se diseccionaron los páncreas y se fijaron en PFA al 4 % en PBS durante 2 h a 4 °C, se crioprotegieron en una serie de gradiente de disoluciones de sacarosa (sacarosa al 7,5, el 15 y el 30 % en PBS) durante al menos 2 h en cada disolución y finalmente se incrustaron los órganos en medio de congelación de tejidos (Leica 14020108926) y se almacenaron a -80 °C. Se usaron secciones de 20 |im para la inmunotinción. Brevemente, las secciones se lavaron en PBS, se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,1 %, glicina 0,1 M en PBS durante 15 minutos y luego se bloquearon en disolución de bloqueo (FCS al 10 %, suero de asno al 3 %, BSA al 0,1 % y Tween-20 al 0,1 % en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron en disolución de bloqueo y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se lavaron las secciones tres veces durante 5 minutos cada una en PBST (Tween-20 al 0,1 % en PBS) incubadas en anticuerpos secundarios diluidos en disolución de bloqueo durante 3-5 h a temperatura ambiente, se tiñeron con DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindol) y se montaron en medio de incrustación (medio de incrustación antidesvanecimiento ProLong Gold, Life Technologies).

Para la tinción de montaje completo de los islotes humanos, los islotes se fijaron en PFA al 4 % en PBS durante 15 min a TA y se incubaron directamente durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en disolución de bloqueo seguido de tres lavados en PBST y luego se incubaron con anticuerpos secundarios durante 3-5 horas a TA tal como se indicó anteriormente.

Para la tinción de secciones de tejido humano, se incrustaron trozos de páncreas congelados inmediatamente de donantes humanos en medio de congelación de tejidos (Leica 14020108926) y se almacenaron a -80 °C. Se fijaron secciones de sección de 10 |im de grosor en PFA al 4 % en PBS durante 20 min a TA, se lavaron 2 veces con PBS y se permeabilizaron durante 5 min sobre hielo. El procedimiento de tinción con anticuerpos se realizó tal como se describió anteriormente.

Los anticuerpos primarios usados fueron anti-receptor de tipo IGFR de conejo de SEQ ID No 21:100, anti-receptor de tipo IGFR de SEQ ID No:2 y SEQ ID No. 4 de rata 1:10, receptor de tipo IGFR de SEQ ID No:2 y SEQ ID No. 6 de ratón 1:10, anti-insulina (conejo 1:250; Cell Signaling; 3014), anti-insulina (conejillo de Indias 1:250; Thermo Scientific; PA1-26938), anti-E-cadherina (rata 1:500; DECMA Kremmer); anti-receptor de manosa 6P (conejo 1:200; Thermo Scientific; PA3-850) y anti-urocortina 3 (conejo 1:300; Phoenix Pharmaceuticals; H-019-29). Los anticuerpos secundarios usados fueron anti-conejo Alexa-555 (1:800; Invitrogen; A31572), anti-Conejo Alexa-488 (1:800; Invitrogen; A21206), anti-rata Alexa-488 (1:800; life technologies, A-21208), anti-rata Alexa-647 (1:800; Dianova, 712 605-150) y anti-conejillo de Indias Alexa647 (1:800; Dianova; 706-495-148) anti-ratón Alexa-555 (1:800; Invitrogen; A31570). Se tomaron fotografías en un microscopio Leica DMI 6000.

Ensayo de inmunoprecipitación

Para el ensayo de inmunoprecipitación, las células Min6 se sometieron a inanición durante 15, 30, 60 y 120 minutos en HBSS con BSA al 0,2 % libre de ácidos grasos y se lisaron en tampón de inmunoprecipitación (CHAPS al 2 %, HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 200 mM, EDTA 2 mM) que contenía un cóctel de inhibidor de proteinasa (1:100, Sigma, P8340) durante 20 minutos sobre hielo. Los lisados se aclararon por centrifugación durante 30 min a 14000 rpm y 4 °C. Aproximadamente, se incubaron 500 ug de lisados de células completas con un anticuerpo de SEQ ID o 2 frente a receptor de tipo IGFR generado en rata y diluido 1:10 durante 1 h a 4 °C seguido de una incubación con proteína G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) durante 16 h a 4 °C. Los precipitados se lavaron 5 veces con tampón de inmunoprecipitación, se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 min en tampón de muestra SDS 2x (Tris-HCl 100 mM, SDS al 4 %, glicerol al 20 %, azul de bromofenol al 0,2 %) que contenía Dt T 100 mM y 2-mercaptoetanol al 5 % y se sometieron a análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Ensayo de biotinilación de superficie

Se incubaron células Min6 con sulfo-NHS-LC-biotina 2 mM EZ-Link® (Thermo Scientific) en PBS pH 8,0 durante 10 min a temperatura ambiente, después de lo cual se detuvo la reacción de biotinilación con glicina 100 mM en PBS. Las células se lavaron entonces en PBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón RIPA que contenía un cóctel de inhibidor de proteinasa. Después de aclarar por centrifugación a 14000 rpm y 4 °C durante 30 minutos, los sobrenadantes se incubaron durante la noche a 4 °C con perlas de NeutrAvidin (Thermo Scientific/Pierce). Al día siguiente, después de lavarse 5 veces en tampón RIPA, se eluyeron las proteínas marcadas con biotina a partir de las perlas mediante ebullición en tampón de muestra SDS 2x que contenía DTT 100 mM y 2-mercaptoetanol al 5 % y se sometieron a análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Ejemplo 2: Expresión de receptor de tipo IGFR adyacente a ligandos de IGF-1, IGF-2 e insulina en el páncreas.

Brevemente, se obtuvieron embriones de ratón E14.5 y se sometieron a hibridación in situ (ISH) usando GenePaint™ (Tecan).

La hibridación in situ de GenePaint de los embriones de ratón E14.5 muestra una expresión específica del ARNm de receptor de tipo IGFR en el páncreas (figura 2B). El ARNm de IGF1 e IGF2 se expresa en tejidos adyacentes al epitelio pancreático (figura 2A, C) mientras que el ARNm de insulina está presente en el compartimiento endocrino del páncreas (figura 2 D).

Ejemplo 3: Ratón con inactivación de receptor de tipo IGFR

Se generaron ratones con inactivación de receptor de tipo IGFR tal como se describió en el ejemplo 1.

Los ratones con inactivación de receptor de tipo IGFR muestran un aspecto normal al nacer pero no se alimentan tal como se demuestra por la falta de leche en su estómago (figura 3 B, estrellas), son letárgicos y presentan dificultad respiratoria. Las proporciones mendelianas en diferentes fases muestran una distribución normal de los tres genotipos hasta el nacimiento, sin embargo, el porcentaje de ratones con inactivación supervivientes se reduce significativamente después del nacimiento y hasta la edad de destete. Solo unos pocos supervivientes se encuentran en la edad de destete probablemente debido a mecanismos compensatorios y/o corte y empalme alrededor del casete insertado conduciendo a la inactivación incompleta (figura 3 C). Histograma que representa el peso corporal normal de ratones con inactivación en comparación con el tipo silvestre y el control de compañeros de camada heterocigóticos en P0 (figura 3 D).

Ejemplo 4: Crecimiento, proliferación y diferenciación endocrina en el páncreas de ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR.

Brevemente, se generaron ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR y se diseccionaron los páncreas y se sometieron a inmunohistoquímica usando anticuerpos contra insulina. Se determinó la proliferación celular usando EdU. En el ejemplo 1, se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Las imágenes confocales de secciones del páncreas muestran diferenciación endocrina normal en E16.5 tal como se muestra en células p marcadas mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos frente a insulina (verde)

(Se obtuvieron resultados similares en E14.5 y E18.5 no mostrados). Proliferación normal del epitelio pancreático tal como se muestra mediante la incorporación de EdU (rojo). La cuantificación de células positivas para EdU con respecto al número de células total (teñidas por DAPI) en E14.5, E16.5 y E18.5 no muestra diferencias significativas en la proliferación entre páncreas de tipo silvestre y con inactivación. (Se contaron al menos tres secciones de diferentes regiones de un páncreas/fase, las barras de error representan el error estándar de la media) (figura 4).

Ejemplo 5: Expresión génica pancreática en ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR antes del nacimiento.

Brevemente, se generaron ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR tal como se describió anteriormente. Se diseccionaron páncreas de ratones con inactivación y controles de tipo silvestre antes y después del nacimiento, se aisló ARNm y se realizó PCR cuantitativa en tiempo real. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

La qPCR en tiempo real muestra cambios moderados en la expresión de ARNm relativa de genes seleccionados importantes para la diferenciación de células p endocrina, la maduración, proliferación y función en el páncreas con inactivación, en comparación con el control de tipo silvestre en E18.5. En esta fase los embriones todavía dependen de la nutrición materna (figura 5). Se usó actina como gen de mantenimiento para la normalización. La expresión de ARNm relativa de genes seleccionados importantes para la diferenciación de células p endocrina (Foxa2, Pdx1, Pax6, Neurod1, Nkx2-2, Nkx6-1), maduración (MafA, MafB, Ucn3), proliferación (Ccnd1, Ccnd2, Cdk4, Cdkn1a, Cdkn1b) y función (Slc2a2, Slc30a8, Gjd3, Kcnj11, Smarca1, Abcc8) está significativamente cambiada en el páncreas con inactivación en comparación con el control de tipo silvestre inmediatamente después del nacimiento tal como se muestra por qPCR en tiempo real (figura 6).

Ejemplo 7: Señalización de Akt y AMPK mediada por receptor de tipo IGFR en el páncreas y Min6.

Brevemente, se generaron ratones con inactivación del receptor de tipo IGFR y se diseccionaron los páncreas. Se cultivaron células Min6 y se recogieron tal como se describió anteriormente. La atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 se realizó mediante transfección con ARNip que selecciona como diana ARNm de receptor de tipo IGFR o ARNip revuelto como control. Se sometieron células y tejidos a inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos de fósforo contra Akt y AMPK. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

La inmunotransferencia de tipo Western de lisados de tejido de páncreas completo muestra fosforilación de Akt y AMPK usando anticuerpos específicos de fósforo (figura 7 A). Un número significativo de embriones mutantes muestran aumento en la fosforilación de Akt (mt2, 3, 5, 6) y AMPK (mt1, 2, 3) (figura 7 A). De manera similar en (figura 7 B) la atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 conduce a un aumento de la fosforilación de Akt.

Ejemplo 8: Influencia de la atenuación del receptor de tipo IGFR sobre la señalización de insulina/IGF en Min6.

Brevemente, se cultivaron células Min6 y transfectaron con ARNip que selecciona como diana ARNip de receptor de tipo IGFR y se investigaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos de fósforo contra IR/IGF1R, así como anticuerpos específicos de fósforo contra moléculas de señalización posterior de AKT, mTOR, ERK y S6RP. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

La atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min 6 da como resultado un aumento de la fosforilación de IR/IGF1R en condiciones de crecimiento normales y parece ser independiente de condiciones de inanición. Los niveles totales de IR e IGF1R, así como de IRS-2 (una molécula adaptadora posterior de la señalización de IR) no cambian mientras que el receptor de tipo IGFR se reduce fuertemente en las muestras atenuadas confirmando la eficiencia de la atenuación de ARNip (figura 8A). El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de moléculas de señalización posterior tales como AKT y mTOR, que son moléculas importantes comúnmente fosforiladas como consecuencia de la activación de IR, indicó que la atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 conduce a un aumento de la fosforilación de Akt y mTOR pero no de ERK y S6RP. Las condiciones de inanición, tal como se muestra mediante la reducción dependiente del tiempo de fosfo-S6RP, parecen no tener un impacto sobre la fosforilación de Akt, mTOR y ERK en muestras con atenuación del receptor de tipo IGFR en comparación con sus controles de tiempo coincidente (figura 8B).

Ejemplo 9: Localización de receptor de tipo IGFR en células endocrinas, ductales y exocrinas en el páncreas.

Brevemente, se diseccionaron páncreas E18.5 y se sometieron a inmunohistoquímica usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR, insulina y E-cadherina. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Las imágenes confocales de secciones de páncreas E18.5 teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (verde), anticuerpos frente a insulina (rojo) y E-cadherina (cian) muestran la inmunolocalización del receptor de tipo IGFR en tanto el compartimento exocrino como endocrino donde se localiza de manera conjunta parcialmente con insulina (figura 9). Los núcleos se tiñeron con DAPI.

Ejemplo 10: Localización subcelular del receptor de tipo IGFR.

Brevemente, se cultivaron células Min6 tal como se describió anteriormente y se sometieron a inmunocitoquímica usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR y GM130. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Ejemplo 11: Localización subcelular del receptor de tipo IGFR

Brevemente, se realizó la tinción de inmunofluorescencia y la obtención de imágenes tal como se describió en el ejemplo 1.

Imágenes de inmunofluorescencia de células Min6 teñidas con anticuerpos etiquetados inmunofluorescentemente contra receptor de tipo IGFR y GM130, un marcador de Golgi, muestran una localización parcial del receptor de tipo IGFR en el complejo de Golgi de manera similar a IGF2R (figura 10, figura 11).

Después de 2 h de inanición, puede observarse una redistribución del receptor de tipo IGFR concentrado en el área de cis-Golgi en comparación con condiciones de crecimiento normales (figura 11).

Ejemplo 11: Interacción del receptor de tipo IGFR con AP-2 en condiciones de inanición.

Brevemente, se cultivaron células Min6 tal como se describió anteriormente y se sometieron a inmunoprecipitación e inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR y adaptina p (una subunidad del complejo AP2). En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

El análisis de inmunotransferencia de tipo Western muestra la inmunoprecipitación conjunta de la subunidad de adaptina p (parte del complejo AP2) junto con el receptor de tipo IGFR en células Min6 tras la inanición, tal como se demuestra mediante inmunoprecipitación usando un anticuerpo contra receptor de tipo IGFR y adaptina p. Prácticamente ninguna adaptina p precipitó de manera conjunta en condiciones de inanición normales (figura 13).

Ejemplo 12: IGF3R pero no InsR se transporta al interior de la célula tras la privación de nutrientes.

Brevemente, se cultivaron células Min6 tal como se describió anteriormente y se sometieron a biotinilación superficial e inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR y adaptina p (una subunidad del complejo AP2). En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

La biotinilación superficial seguida de la reducción de neutravidina e inmunotransferencia de tipo Western demuestra una reducción dependiente del tiempo en la expresión superficial de la reducción del receptor de tipo IGFR pero no la reducción de IR en células Min6 en condiciones de inanición (figura 14).

Ejemplo 14: Efecto de la atenuación del receptor de tipo IGFR sobre la expresión de proteínas relacionadas con autofagia

Brevemente, se cultivaron y transfectaron células Min6 tal como se describió anteriormente y se sometieron a inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra ATG16L1, ATG7, ATG3, beclina-1, LC3A/B y ATG5 (es decir, proteínas relacionadas con autofagia). En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

La atenuación del receptor de tipo IGFR lo más probablemente no cambia la expresión proteica de proteínas relacionadas con autofagia en condición basal. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de moléculas relacionadas con autofagia no muestra cambios aparentes en la expresión tras la atenuación del receptor de tipo IGFR en células Min6 en condiciones de crecimiento normales (figura 15).

Ejemplo 15: Expresión de receptor de tipo IGFR en islotes diabéticos y tejido exocrino de ratón.

Brevemente, se diseccionaron los páncreas de ratones de tipo silvestre y diabéticos y se sometieron a inmunocitoquímica usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR, insulina y E-cadherina. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Las imágenes de LSM de páncreas adultos de tipo silvestre (<120 mg/dl de glucosa) y diabéticos (>500 mg/dl de glucosa), teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo), insulina (cian) y E-cadherina (verde) (A) y receptor de tipo IGFR (rojo), glucagón (cian) y urocortina (verde) (B), muestran una inmunorreactividad aumentada de anticuerpos frente a receptor de tipo IGFR en páncreas diabético en los compartimentos tanto endocrino como exocrino. El estado diabético se demostró mediante la tinción de urocortina 3 e insulina reducida en páncreas diabético (figura 16).

Ejemplo 16: Detección de receptor de tipo IGFR en células de islotes usando anticuerpo contra el dominio extracelular del receptor de tipo IGFR.

Brevemente, se cultivaron células HEK293 y se obtuvieron células de islotes humanos tal como se describió anteriormente. Se diseccionaron páncreas de ratones de tipo silvestre, heterocigotos y mutantes (inactivación del receptor de tipo IGFR). Se sometieron células y tejidos a inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos anti-receptor de tipo IGFR que reconocen SEQ ID NO: 2, 4 y 6.

Los experimentos de inmunotransferencia de tipo Western muestran el reconocimiento específico de una banda proteica de —130 kDa en lisados de células de islotes que está ausente en los lisados de células HEK293 mediante un anticuerpo contra SEQ ID NO: 4 y NO: 6. En comparación, se reconoce específicamente la misma banda mediante el anticuerpo contra SEQ ID NO 2 en lisados de páncreas totales de tipo silvestre y heterocigotos pero no en embriones mutantes, así como en células de islotes pero no en células HEK (figura 17).

Ejemplo 17: Distribución de receptor de tipo IGFR en islotes humanos de Langerhans

Brevemente, se obtuvieron islotes humanos y se sometieron a inmunocitoquímica usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR, IGF2R e insulina. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Expresión de receptor de tipo IGFR en islotes humanos de Langerhans. Las imágenes confocales de islotes de Langerhans de donante humano marcadas inmunofluorescentemente con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo), IGF2R (verde) e insulina (cian) muestran una distribución típica de receptor de tipo IGFR en el compartimiento de Golgi y localización conjunta parcial con IGF2R e insulina (figura 18).

Ejemplo 18: El receptor de tipo IGFR es indicativo de disfunción de células B pancreáticas en humanos.

Brevemente, se obtuvieron islotes humanos de donantes sanos y diabéticos y se sometieron a inmunocitoquímica usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR e insulina. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Imágenes de LSM de secciones de páncreas humano teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo) e insulina (verde). Los núcleos se tiñen mediante DAPI (azul) y muestran una de insulina reducida y aumento de la expresión de receptor de tipo IGFR en un paciente diabético (valor de HbA1c del 6,9 %) en comparación con un paciente no diabético (valor de HbA1c del 4,6 %). (HbA1C usado como indicador del estado diabético definido como el porcentaje de hemoglobina glicada HbA1c en el plasma; intervalo normal: < 5,9 %) (figura 22).

Ejemplo 19: Localización subcelular de receptor de tipo IGFR en células Min6 de tipo silvestre y con inactivación. Imágenes de inmunofluorescencia de células Min6 teñidas con anticuerpos contra receptor de tipo IGFR e insulina.

Brevemente, se obtuvieron clones de Min6 de tipo silvestre y clones Min6 con inactivación y se sometieron a prueba por PCR genómica e inmunotransferencia de tipo Western, donde se demuestra que la proteína IGFR-I está completamente ausente en clones de Min6 con inactivación (figura 25 A y B). Luego se sometieron WT y KO a inmunocitoquímica usando anticuerpos contra receptor de tipo IGFR (rojo) e insulina (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul) (figura 24). La inmunocitoquímica confirma los resultados de la PCR genómica e inmunotransferencia de tipo Western. En el ejemplo 1 se proporciona una descripción detallada de los materiales y métodos usados.

Ejemplo 20: Influencia de la inactivación de receptor de tipo IGFR sobre la señalización de insulina/IGF en Min6 (C22RIK).

Brevemente, se generaron células con inactivación Min6 mediante la estrategia de inactivación mediada por CRISPR/Cas9 tal como se describió en el ejemplo 1 y se investigaron mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos de fósforo contra IR/IGF1R, así como anticuerpos específicos de fósforo contra moléculas de señalización posterior Ampk, AKT y mTOR.

La inactivación del receptor de tipo IGFR en células Min6 conduce a un aumento de la fosforilación de IR y como consecuencia a un aumento de la fosforilación de AMPK, pero no de Akt o mTor (figura 26). Se cultivaron clones con inactivación y de control de Min6 en condiciones de crecimiento (FCS al 10 % y alto nivel de glucosa).

Ejemplo 21: Línea celular Min6 con activación de fusión de Venus de tipo IGFR.

Brevemente, se generó la línea celular Min6 con activación de fusión de Venus IGFR-I tal como se describió en el ejemplo 1 y se sometió a inmunohistoquímica usando anticuerpos contra el receptor de tipo IGFR y el indicador fluorescente Venus.

La fusión de IGFR-I Venus (anti-GFP detecta Venus, verde) se localiza de manera conjunta con el IGFR-I endógeno (anti-IGFR-I, rojo) en el área de Golgi y trans-Golgi. Pueden identificarse compuestos de molécula pequeñas y productos biológicos que inhiben la homo-y heterodimerización a través del dominio transmembrana (TM) o el dominio rico en cisteína del receptor de factor de crecimiento (CRD) (IPR009030) o el cambio de localización intracelular en el compartimento de membrana plasmática, trans-Golgi, Golgi y lisosoma usando enfoques de cribado de alto contenido usando esta línea celular Min6 con activación (figura 27).

Ejemplo 22: Localización de receptor de tipo IGFR en progenitores endocrinos diferenciados a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC).

Brevemente, se obtuvieron progenitores endocrinos PDX1+/NKX6.1 y se sometieron a inmunohistoquímica usando

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un antagonista de receptor de tipo IGFR, comprendiendo dicho receptor de tipo IGFR una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1, para su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de diabetes, en el que el antagonista es un anticuerpo o un ARNip.
2. El antagonista para su uso según la reivindicación 1, en el que el antagonista se une específicamente a dicho receptor de tipo IGFR.
3. El antagonista para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende anticuerpos, variantes de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo.
4. El antagonista para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal.
5. El antagonista para su uso según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo de dicho receptor de tipo IGFR, comprendiendo el epítopo la secuencia:

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID No.: 5); y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).
6. El antagonista para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la diabetes comprende diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes gestacional, prediabetes, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y tolerancia a glucosa alterada.
7. El antagonista para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tratamiento previene o revierte la resistencia a la insulina.
8. El antagonista para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tratamiento previene o revierte la desdiferenciación de células de islotes pancreáticas.
9. Una composición farmacéutica que comprende un antagonista de un receptor de tipo IGFR que comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1, en la que dicho antagonista es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho receptor de tipo IGFR, en la que dicho anticuerpo se une específicamente a un epítopo de dicho receptor de tipo IGFR, comprendiendo el epítopo la secuencia:

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID No.: 5); y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).
10. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo de receptor de tipo IGFR que comprende la secuencia

(i) TSKRTPDGFDSVPLKT (SEQ ID NO.: 2); y/o

(ii) CHQCDPDKYSE (SEQ ID NO.:3); y/o

(iii) MYKWAKPKICSEDLEG (SEQ ID NO.: 4); y/o

(iv) FQRTTFHEASRKYTN (SEQ ID No.: 5); y/o

(v) CTFSRNTPTRTFNY (SEQ ID NO.: 6).

Un agente de unión de diagnóstico capaz de unirse específicamente a un receptor de tipo IGFR, comprendiendo dicho receptor de tipo IGFR una secuencia correspondiente a la secuencia SEQ ID No. 1, para su uso en un método in vivo de diagnóstico de diabetes o el riesgo de desarrollar diabetes, en el que dicho agente de unión de diagnóstico es un anticuerpo monoclonal.

Un método de cribado in vitro para antagonistas de un receptor de tipo IGFR, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una línea celular estable que expresa dicho receptor de tipo IGFR;

(b) poner en contacto dicha línea celular de (a) con un antagonista candidato; y

(c) medir un acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR, en el que se identifica un antagonista por el aumento de dicho acontecimiento de señalización posterior del receptor de tipo IGFR; en el que dicho receptor de tipo IGFR comprende una secuencia correspondiente a la secuencia SEQ ID No.

1, y

en el que dicho acontecimiento de señalización posterior es fosforilación de InsR, fosforilación de AMPK, fosforilación de mTOR, fosforilación de AKT, fosforilación de ERK y/o fosforilación de S6K.

Un método de diagnóstico in vitro para la detección de la degeneración de células de islotes pancreáticas en un sujeto, que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un agente de unión de diagnóstico que se une específicamente al receptor de tipo IGFR;

ii) detectar la unión del agente de unión;

en el que la unión detectable de dicho agente de unión de diagnóstico es indicativa de la desdiferenciación de células de islotes pancreáticas en el sujeto;

en el que el receptor de tipo IGFR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID No. 1, y en el que el agente de unión de diagnóstico es un anticuerpo monoclonal.