CN116472349A - Line1的抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于医学使用的(长散在元件1)LINE1(L1)表达的阻遏物或抑制剂。

Description

LINE1的抑制剂及其用途
发明领域
本发明涉及用于医学使用的(长散在元件1)LINE1(L1)表达的阻遏物或抑制剂，特别是用于在治疗和/或预防以下中使用：原发性或继发性免疫缺陷，或展示免疫抑制表型的疾病，优选地癌症和/或转移，更优选地肺癌，甚至更优选地非小细胞肺癌(NSCLC)，或结肠直肠癌(CRC)，或病毒性疾病。
发明背景
转座元件(TE)解释了基因组演化和个体间遗传变异。
人类基因组的三分之二由重复元件(66％)组成，重复元件中仅转座元件(TE)就占人类基因组组成的40％-45％1,2。对于基因组生物学家来说，一个令人感兴趣的问题是解开基因组这一“暗面”的功能，它仍然代表着一种“有生命的物质”，演化可以对其起作用而产生新的功能。现在很清楚，TE调节基因组的能力主要在于产生复杂的大量的RNA调节网络，这继而影响细胞的转录输出3-5。TE分为四个不同的类别，并且除DNA转座子外，主要是逆转录转座子，逆转录转座子通过使用RNA作为中间体，经由“复制和粘贴”机制获得了移动的能力。逆转录转座子包括长散在元件(LINE)、短散在元件(SINE)和长末端重复序列(LTR)逆转录转座子。根据它们是否具有编码逆转录转座所需机制的ORF，它们进一步被分类为自主或非自主的6。
LINE是一类非常古老且演化成功的转座子。在人类基因组中发现了三个LINE超家族：LINE1、LINE2和LINE3，其中只有LINE1仍有活性。全长LINE1(L1)元件长大约6kb，并且构成基因组的自主成分。LINE1元件具有内部聚合酶II启动子，并编码两个开放阅读框即ORF1和ORF2(图1)7。在L1 RNA被转录后，它被输出到细胞质进行翻译，并且随后与伴侣RNA结合蛋白ORF1和核酸内切酶和逆转录酶ORF2组装。然后这些核糖核颗粒(ribonucleoparticle)被再输入细胞核中，在那里ORF2产生单链切口，并从L1 RNA的3’末端引发逆转录。逆转录经常导致许多截短的、无功能的插入，并且因此大多数LINE衍生的重复序列都很短，平均大小为约900-1000bp。估计L1在人类基因组中存在超过500,000个拷贝7。
L1机制还负责SINE的逆转录转座(SINE可分为三个超家族：Alu、MIR、MIR3)，SINE是没有任何编码潜力的非自主逆转录元件，长度短(约300bp)，并且从聚合酶III启动子转录(图1)。最具代表性的人类特异性SINE超家族Alu在人类基因组中有1,090,000个拷贝8。
LTR逆转录转座子由转录调节元件嵌入的长末端直接重复序列(long terminaldirect repeats)起始和终止。自主LTR逆转录转座子包含gag和pol基因，它们编码逆转录酶、整合酶、蛋白酶和RNA酶H(图1)。LTR有四个超家族：I类ERV、II类ERV(K)、III类ERV(L)和MalR。MalR是LTR最具代表性的超家族，有240,000个拷贝9。
演化生物学家假设，自我复制性RNA基因组是地球上早期生命的基础，并且逆转录的出现在第一个DNA基因组(更稳定的基于脱氧核糖的聚合物)的演化中起着关键作用6,10。从这个角度来看，多轮逆转录可能有助于扩大人类基因组的大小和复杂性。在哺乳动物和植物两者中特别明显的是，逆转录转座子已经大量积累，驱动基因组演化。据报道，L1和Alu代表了人类基因组演化的最重要的催化剂11，并且TE之间的同源重组可能已经驱动/正在驱动突变、染色体重排、缺失、倒位和易位12。TE是体细胞基因组多样性和个体间变异的主要来源13，并且TE插入已被显示是生理发生的14-16。特别是，发生在从果蝇(fly)到人的神经元中的L1逆转录转座被大量描述17-19，是一种在神经祖细胞发育和分化中被微调和表观遗传学调节的机制，有助于脑中神经元的体细胞多样化13,20。TE活性的失调如今正成为许多不同疾病的重要促成因素，因为它发生在神经疾病、炎症和癌症疾病中21-23。
宿主已经产生了许多控制TE的表达和扩展24(因此，表观遗传修饰和非编码RNA，诸如Piwi相互作用RNA)以限制TE逆转录转座的可能有害效应的系统。这种扩展实现了有害和有益效应之间的平衡，可能成为促进通过演化获得的基因组功能的新的调节机制3。如今公认，在小鼠和人类两者中，TE已经被吸收到用于适应宿主基因组代谢和转录的多种调节功能中，由它们的DNA元件和它们转录的RNA对应物两者介导。
不仅仅是转座：TE RNA是新调节功能的丰富来源。
近80年前，Barbara McClintock首次在玉米中发现了TE。她认为这些元件是能够调节基因活性的“控制元件”25,26。她的理论，尽管被摒弃了很长时间，却是开创性的，并且随着下一代测序(NGS)技术的出现，已经被彻底修改。目前出现的概念是，TE与宿主基因组的转录调节功能相互作用3,4,27,28。
尽管大量的文献集中于逆转录转座和从头插入效应的研究，但值得注意的是TE可以具有与其逆转录转座解耦的RNA调节功能。
ENCODE(Encyclopedia of DNA Elements，DNA元件百科全书)和FANTOM(Functional Annotation of the Mammalian Genome，哺乳动物基因组功能注释)等十年长的国际项目产生了数量巨大的数据集并对其进行了生物信息学分析，为研究TE开辟了道路。这些结果揭示，TE在建立和影响细胞类型特异性转录程序方面具有精确的功能，产生了由TE的基因组元件和衍生的转录物促进的调节网络3,28，揭示了从这些元件转录的RNA可能具有各种各样的功能，这无疑改变了许多基因组学概念在教科书中的书写方式29。
这些研究阐明了，TE可以产生新的或替代的启动子30，促进转录因子31和表观遗传修饰物32的组装，并且有利于它们的传播和基因表达的调控。此外，TE特别是SINE和HERV已被显示在3D基因组折叠中具有功能，作为染色质组织器(chromatin organizers)的结合位点33-35。
在2009年Faulkner等人36首次显示TE在人类和小鼠细胞类型中以组织特异性表达模式广泛表达，提示逆转录转座子的特异性时空激活。Faulkner等人进一步显示多达30％的转录物在重复元件内启动36。值得注意的是，胚胎来源的组织在其转录组中含有最高比例的转座元件衍生序列，在胎盘和卵母细胞中具有LTR的特异性表达37。相应地，最近发现不同种类的重复序列特异性地富集在具有明确时空表达的基因中，进一步决定了它们在发育中表达的时机和数量38。
在这种情况下，TE以不同的方式放大转录组的复杂性：产生反义转录物，通常在基因启动子附近36；通过处理(nurse)选择性剪接位点作用于mRNA的成熟以实现组织特异性外显子化(exonization)39,40，并提供替代的多腺苷酸化信号41,42和RNA介导的诱饵的位点43。此外，TE有助于内含子和非翻译区(UTR)内的RNA调节序列36。重要的是注意到TE是长非编码RNA(lncRNA)的主要贡献者44,45。在这种情况下，提出LTR衍生的转录物的增强子RNA功能，这是小鼠和人类胚胎干(ES)细胞中维持多能性所需的46,47。此外，已经显示LINE和SINE表达为与染色质区室紧密相关的RNA，在那里它们定位于常染色质，这表明这些RNA在3D基因组折叠中的可能功能48。L1也被描述为胚胎发生中的染色质相关RNA，调节开放染色质的可及性49,50，和在小鼠ES细胞中的染色质相关RNA，在那里它们参与细胞身份维持和2-细胞阶段分化所需基因的调节51。
尽管这些影响深远的论文增加了对TE功能的认识和知识，强调了转座子在胚胎发生和发育中的重要表观遗传作用，但TE对成年细胞可塑性和疾病发生和进展的贡献仍然研究得很少。这是研究TE的内在困难的结果，由于TE重复性、高度同源性、序列差异和变性，使得为双等位基因建立的技术的应用几乎不可行，特别是在生物信息学中。
研究肿瘤微环境内T细胞转录可塑性的重要性
如今已充分显示，先天和适应性免疫应答在肿瘤发生中起着重要作用；肿瘤细胞和免疫系统之间的相互作用被定义为癌症免疫编辑。事实上，最复杂的免疫编辑形式表现为肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)和肿瘤细胞之间的交互作用，其在肿瘤微环境内暴露肿瘤细胞表面的新抗原；这可导致肿瘤消除、免疫应答和残留肿瘤细胞生长之间的平衡或肿瘤逃避免疫控制52。
就免疫浸润丰度、组成和应答而言，肿瘤微环境可能是非常异质性的53；特别地，TIL的相对丰度和效应功能可以通过产生能够削弱、排除和逃避免疫系统的肿瘤特异性转录程序被抑制54。肿瘤依赖性免疫抑制机制依赖于在肿瘤微环境内建立的复杂网络，并基于功能仅被部分表征的统称为免疫检查点的调节分子的上调55。然而，这些分子(例如CTLA-4、PD-1、PDL-1)是免疫检查点抑制剂(ICI)疗法(免疫疗法)的靶，其以如此强有力的方式释放自发的抗肿瘤免疫应答，从而创造了在癌症治疗的范式转变56-58。然而，虽然很清楚由于高突变负荷而更具抗原性的肿瘤类型(例如黑素瘤、肺、肾、膀胱)更可能对免疫疗法有响应，但不太清楚为何大多数患有这些高抗原性肿瘤的患者对免疫疗法没有持久响应或根本没有响应；事实上，没有响应的患者的比例仍然很高，而该领域的努力主要集中在寻找针对T细胞亚群中表达(也在单细胞水平上定义)的新表面标志物的特异性ICI54,59-62。几乎没有关于控制TIL的肿瘤内功能障碍状态以旨在重建它们的功能的作用于转录可塑性的可逆机制的基因组和表观遗传机制的报道。
发明简述
本发明人表征了免疫疗法较常用且有效(非小细胞肺癌，NSCLC)或较少使用或不太有效(结肠直肠癌，CRC)的两种最常见的人类癌症类型。它们分别是全世界的第一和第二大死亡原因。就发病率而言，肺癌是最常见的癌症(2018年估计有209万例)63，其中NSCLC占肺部肿瘤病例的84％64，5年总生存率至多19％。结肠直肠癌(CRC)是第三大常见癌症，2018年估计新增病例184万例，五年总生存率为60％63,65。
本发明人发现，这些TE(包括转录物)代表了用其他策略无法预测的新的治疗靶，用于促进TIL转录重塑，导致释放的效应免疫应答。
因此，本发明的目的是用于治疗和/或预防以下的LINE1(长散在元件1)(L1)表达的阻遏物或抑制剂：原发性或继发性免疫缺陷，或展示免疫抑制表型的疾病，优选地癌症和/或转移，更优选地肺癌，甚至更优选地非小细胞肺癌(NSCLC)，或结肠直肠癌(CRC)，或病毒性疾病，诸如由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的免疫缺陷，或淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
其中L1包含与SEQ ID NO:1和/或2和/或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
优选地，L1包含与SEQ ID NO:1或2或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
优选地，L1包含SEQ ID NO:1、2和/或3或由其组成。
优选地，L1包含SEQ ID NO:1、2或3或由其组成。
本发明的另一个目的是用于医学使用的LINE1(L1)表达的阻遏物或抑制剂，其中L1包含与SEQ ID NO:1和/或2和/或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
优选地，L1包含与SEQ ID NO:1或2或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
优选地，L1包含SEQ ID NO:1、2和/或3或由其组成。
优选地，L1包含SEQ ID NO:1或2或3或由其组成。
优选地，所述阻遏物或抑制剂是至少一种选自由以下组成的组的分子：
a)多核苷酸，诸如反义构建体、反义寡核苷酸、RNA干扰构建体或siRNA或编码其的多核苷酸，
b)抗体或其片段；
c)多肽；
d)小分子；
e)编码所述抗体或多肽或其功能性衍生物的多核苷酸；
f)包含或表达a)或e)中定义的多核苷酸的载体；
g)CRISPR/Cas9组分，例如sgRNA；
h)表达所述多肽或抗体或包含a)或e)中定义的多核苷酸或g)的至少一种组分的遗传工程化宿主细胞。
优选地，多核苷酸是分离的靶向LINE1的抑制性核酸。
优选地，抑制性核酸包含与SEQ ID NO:1、2或3的10个至50个连续核苷酸互补的核苷酸序列。
优选地，所述抑制性核酸是至少一种RNA抑制剂，优选地选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、mixmer、shRNA、siRNA、stRNA、snRNA、sgRNA，更优选地所述抑制性核酸是被修饰的，诸如2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核酸(FANA)ASO，和/或包含一个或更多个修饰的键或碱基。
优选地，ASO或FANA ASO包含能够与包含SEQ ID NO:1、2或3或由SEQ ID NO:1、2或3组成的序列杂交或互补的序列。
优选地，阻遏物或抑制剂用于在T细胞，更优选地用于CD4+ T初始细胞或CD8+ T细胞、CD4+肿瘤浸润淋巴细胞和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞两者，B细胞，自然杀伤细胞或肿瘤细胞中使用。
优选地，阻遏物或抑制剂与免疫疗法和/或放射疗法和/或化疗剂和/或促进产生新抗原和免疫应答的靶向疗法和/或免疫系统佐剂组合使用，优选地，所述免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂和/或表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，优选地，免疫检查点抑制剂是以下或包括以下：一种或更多种抗CDl37抗体；抗PD-l(程序性细胞死亡1)抗体；抗PDLl(程序性细胞死亡配体1)抗体；抗PDL2抗体；或抗CTLA-4抗体。
优选地，阻遏物或抑制剂用于过继细胞转移(ACT)、细胞疗法治疗、非匹配骨髓移植、非匹配NK细胞输注或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞输注，或者其中所述阻遏物或抑制剂被注射到肿瘤部位，例如肠肿瘤、黑素瘤中，或者通过纳米颗粒特异性递送到感兴趣的部位。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，包含以上定义的阻遏物或抑制剂和至少一种药学上可接受的载体，并且任选地还包含治疗剂。
本发明的另一个目的是调节初始CD4+ T初始细胞向任何效应谱系的定型(commitment)和调节功能障碍的T细胞的效应应答的方法，包括抑制所述细胞中LINE1表达的步骤，其中抑制所述细胞中LINE1表达的步骤通过至少一种以上定义的阻遏物或抑制剂进行。
本发明的另一个目的是分离的人类T细胞、B细胞、NK细胞或肿瘤细胞，其中所述细胞的LINE1(L1)表达被稳定或瞬时影响，优选地所述细胞是CD4+ T初始细胞或CD8+ T细胞，或功能障碍的T细胞，例如TIL。
优选地，L1包含与SEQ ID NO:1和/或2和/或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
优选地，所述细胞是CD4+ T初始细胞或CD8+ T细胞，或功能障碍的T细胞，例如TIL。
优选地，L1包含SEQ ID NO:1、2或3或由其组成。
另一个目的是包含至少一种以上定义的细胞或其组合的组合物，所述组合物优选地还包含至少一种生理上可接受的载体。
以上定义的细胞或组合物可以用作药物，优选地用于治疗和/或预防原发性或继发性免疫缺陷，或展示免疫抑制表型的疾病，优选地癌症和/或转移，更优选地肺癌，甚至更优选地非小细胞肺癌(NSCLC)，或结肠直肠癌(CRC)，或病毒性疾病，诸如由HIV引起的免疫缺陷，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。
优选地，所述细胞或组合物用于过继细胞转移(ACT)、细胞疗法治疗、非匹配骨髓移植、非匹配NK细胞输注或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞输注，或者其中所述细胞或组合物被注射到肿瘤部位，例如肠肿瘤、黑素瘤中，或者通过纳米颗粒特异性递送到感兴趣的部位。
优选地，ASO包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列靶向以下序列(LINE1 ASO)之一或相应的RNA序列或与以下序列(LINE1 ASO)之一或相应的RNA序列互补：
LINE1-a GCACTAAATGCCTACAAGAGA(SEQ ID NO:4)
LINE1-b GATAGACCGCTAGCAAGACTA(SEQ ID NO:5)
LINE1-c GAAGTTGAATCTCTGAATAGA(SEQ ID NO:6)
LINE1-d GGACCTCTTCAAGGAGAACTA(SEQ ID NO:7)
LINE1-e GGAGAGGATGCGGAGAAATAG(SEQ ID NO:8)。
优选地，sgRNA包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列靶向一种序列或与其互补，所述一种序列是位于被移除的LINE1元件侧翼的独特的、非编码部分。
优选地，sgRNA包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列靶向以下序列之一或相应的RNA序列或与以下序列之一或相应的RNA序列互补或与以下序列之一或相应的RNA序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％相同：
IFNGR2-F ACTGATCGTGAGAGGCTTCGTGG(SEQ ID NO:9)
IFNGR2-R GGTCATTTAGGGTGACAGGCAGG(SEQ ID NO:10)
ARCP2-F GCTGTCATGGGAATCACGAAGGG(SEQ ID NO:11)
ARCP2-R AAGGAAGACCACTTTTAAGGAGG(SEQ ID NO:12)。
SEQ ID No 1-3是逆转录转座功能不全的，并且是本发明人发现在T淋巴细胞(初始的和功能障碍的)中特异性表达的那些。因此，抑制所述表达是新颖和有利的，因为它可以在调节T细胞的免疫应答方面提供更特异性的靶向和有效性。
发明详述
术语“阻遏物或抑制剂”或“(选择性)阻遏或抑制...的分子”是指实现靶的表达变化的分子。该变化是相对于在没有“阻遏物或抑制剂”或分子但其他方面处于相似条件的情况下的正常或基线表达水平，并且该变化代表正常/基线表达的降低。靶表达的阻遏或抑制可以通过本领域技术人员已知的任何方法来评估。对靶的表达水平或存在的评估优选地使用经典分子生物学技术诸如(实时聚合酶链式反应)qPCR、微阵列、珠阵列、RNA酶保护分析或RNA印迹分析或克隆和测序来进行。在本发明的上下文中，靶是基因、mRNA、cDNA或其编码的蛋白质。上述分子还包括其盐、溶剂化物或前药。上述分子可以被H2O溶剂化或不被H2O溶剂化。在本发明的上下文中，术语“靶向”或“互补”可以指与靶序列的全部或靶序列的部分完全或部分地互补，或者能够与特定靶序列的全部或特定靶序列的部分杂交。
如上所述的多核苷酸，例如siRNA，还可以包含dTdT或UU 3′-突出端，和/或如本文别处所述的核苷酸和/或多核苷酸主链修饰。在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA、siRNA、shRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。多核苷酸可以是单链或双链的。以上定义的RNA抑制剂优选地能够与特定靶序列的全部或特定靶序列的部分杂交。因此，RNA抑制剂可以与靶序列的全部或靶序列的部分完全或部分地互补。在中等至高严格条件下RNA抑制剂能够与特定靶序列杂交。RNA抑制剂可以参考与其意图靶向的序列的反向互补序列的特定序列同一性来定义。反义序列通常将与其靶序列的反向互补序列具有至少约75％、优选地至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
术语多核苷酸和多肽还包括其衍生物和功能性片段。多核苷酸可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成。
根据本发明的分子可以是抗体或其衍生物。
本文中的术语基因还包括相应的种间同源基因或同源基因、亚型、变体、等位基因变体、其功能衍生物、功能性片段。词语“蛋白质”意图还包括由相应的种间同源基因或同源基因、其功能突变体、功能衍生物、功能性片段或类似物、亚型编码的相应蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“多肽”或“蛋白质”包括：
i.完整蛋白、其等位基因变体和种间同源物；
ii.任何合成、重组或蛋白水解的功能性片段；
iii.任何功能等同物，诸如例如合成或重组的功能类似物。
在本发明中，蛋白质的“功能突变体”是可以通过突变蛋白质序列中的一个或更多个氨基酸产生并保持蛋白质活性的突变体。事实上，如果需要，本发明的蛋白质可以在体外和/或体内修饰，例如通过糖基化、肉豆蔻酰化、酰胺化、羧化或磷酸化，并且可以例如通过本领域已知的合成或重组技术获得。本文中与蛋白质相关使用的术语“衍生物”是指化学修饰的肽或其类似物(其中至少一个取代基不存在于未修饰的肽或其类似物中)，即已经共价修饰的肽。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基基团、酰基基团、酯等。如本文所用，术语“衍生物”也指与本文公开的基因和序列，或与由其种间同源基因或同源基因编码的相应区域的氨基酸序列具有例如至少41％，优选地至少41.5％、50％、54.9％、60％、61.2％、64.1％、65％、70％或75％，更优选地至少85％，例如至少90％，并且甚至更优选地至少95％的同一性百分比的更长或更短的多肽。本文提及蛋白质所用的术语“类似物”是指修饰的肽，其中肽的一个或更多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代，和/或其中一个或更多个氨基酸残基从肽中缺失，和/或其中一个或更多个氨基酸残基从肽中缺失，和/或其中一个或更多个氨基酸残基被添加到肽中。氨基酸残基的这种添加或缺失可以发生在肽的N-末端和/或肽的C-末端。“衍生物”可以是编码以上定义的多核苷酸的核酸分子，如DNA分子，或包含以上定义的多核苷酸或互补序列的多核苷酸的核酸分子。在本发明的上下文中，术语“衍生物”也指更长或更短的多核苷酸和/或与例如SEQ ID NO:1-12或它们的互补序列或它们的DNA或RNA相应序列具有例如至少41％、50％、60％、65％、70％或75％，更优选地至少85％，例如至少90％，并且甚至更优选地至少95％或100％的同一性百分比的多核苷酸。术语“衍生物”和术语“多核苷酸”也包括修饰的合成寡核苷酸。修饰的合成寡核苷酸优选地为LNA(锁核酸)、硫代磷酸寡核苷酸或甲基化寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸、2’-O-甲基寡核苷酸、2’-O-甲氧基乙基寡核苷酸和胆固醇缀合的2’-O-甲基修饰的寡核苷酸(antagomirs)。术语“衍生物”也可以包括核苷酸类似物，即被非天然存在的核苷酸取代的天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。术语“衍生物”还包括可以通过突变其序列、等同物或前体序列中的一个或更多个核苷酸或氨基酸而产生的核酸或多肽。术语“衍生物”还包括多核苷酸的至少一个功能性片段。在本发明的上下文中，“功能性”意指例如“维持它们的活性”。如本文所用，“片段”是指优选地具有至少200、400、600、800、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸、1300个核苷酸、1400个核苷酸、1500个核苷酸长度的多核苷酸或优选地具有至少50aa、100aa、150aa、200aa、250aa、300aa长度的多肽。术语“多核苷酸”也指修饰的多核苷酸。如本文所用，术语“载体”是指表达载体，并且可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。这样的载体可以包括细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA诸如痘苗病毒DNA、腺病毒DNA、慢病毒病毒DNA、禽痘病毒病毒DNA和伪狂犬病病毒DNA。大量合适的载体是本领域技术人员已知的，并且是商业可得的。多核苷酸序列，优选地载体中的DNA序列可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)以指导mRNA合成。作为这样的启动子的代表性实例，人们可以提及原核或真核启动子，诸如CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。表达载体也可以包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录载体。载体还可以包含用于扩增表达的适当序列。此外，载体优选地含有一个或更多个选择性标志物基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，诸如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或诸如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。如本文所用，术语“遗传工程化的宿主细胞”涉及已经用前述多核苷酸或载体转导、转化或转染的宿主细胞。作为合适的宿主细胞的代表性实例，人们可以提及细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、真菌细胞诸如酵母、昆虫细胞诸如Sf9、动物细胞诸如CHO或COS、植物细胞等。根据本文的教导，合适的宿主的选择被认为在本领域技术人员的能力范围内。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，并且最优选地是人类细胞。将前述多核苷酸或载体引入宿主细胞可以通过本领域技术人员熟知的方法来实现，诸如磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、电穿孔、脂质体转染、显微注射、病毒感染、热休克、膜化学透化后的转化或细胞融合。多核苷酸可以是载体，诸如例如病毒载体。以上定义的多核苷酸可以作为载体内的核酸引入待治疗的受试者体内，该载体复制到宿主细胞中并产生多核苷酸。本发明的药物组合物的合适施用途径包括但不限于口服、直肠、经粘膜、肠道、肠内、表面(topical)、栓剂、通过吸入、鞘内、脑室内、腹膜内、鼻内、眼内、肠胃外(例如静脉内、肌内、髓内和皮下)、化学栓塞。其他合适的施用方法包括注射、病毒转移、使用脂质体(例如阳离子脂质体)、口服摄入和/或皮肤施用。在某些实施方案中，本发明的药物组合物以剂量单位(例如片剂、胶囊、团注(bolus)等)的形式施用。对于药物应用，组合物可以是溶液的形式，例如可注射溶液、乳液、混悬液等。载体(carrier)可以是任何合适的药物载体。优选地，使用能够增加分子进入靶细胞的功效的载体。这样的载体的合适实例是脂质体。在根据本发明的药物组合物中，阻遏物或抑制剂可以与其他治疗剂关联。可以根据治疗要求选择药物组合物。根据本发明的这样的药物组合物可以以片剂、胶囊、口服制剂、粉末、颗粒、丸剂、可注射或可输注的液体溶液、混悬剂、栓剂、吸入用制剂的形式施用。制剂的参考是Remington的书(“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,Lippincott Williams&Wilkins,2000)。本领域专家将通过选择合适的稀释剂、辅料(adjuvants)和/或赋形剂来选择施用形式和有效剂量。本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如，使用各种熟知的混合、溶解、造粒、粉碎、乳化、封装、包封或冻干方法。组合物可以联合包含赋形剂和助剂的一种或更多种生理学上可接受的载体来配制，该生理学上可接受的载体有助于将活性化合物加工成药学上可以使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。在本发明的许多方面，肠胃外途径是优选的。对于注射，包括但不限于静脉内、肌内和皮下注射，本发明的化合物可以在水性溶液中配制，优选地在生理相容的缓冲液诸如生理盐水缓冲液或极性溶剂(包括但不限于吡咯烷酮或二甲基亚砜)中配制。化合物优选地配制成用于肠胃外施用，例如通过团注注射或连续输注。有用的组合物包括但不限于在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以包含助剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的水性溶液，诸如但不限于活性化合物的盐。此外，活性化合物的混悬液可以在亲脂性媒介物中制备。合适的亲脂性媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯和甘油三酯，或材料诸如脂质体。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液黏度的物质，诸如羧乙基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂和/或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的剂。可选地，活性成分可以呈粉末形式，用于在使用之前用合适的媒介物例如无菌无热原水构建。对于口服施用，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来配制化合物。这样的载体使得本发明的化合物能够被配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、糊剂、浆料、溶液、混悬液、浓缩溶液和用于稀释在患者饮用水中的混悬液、用于稀释在患者食物中的预混剂等，用于由患者口服摄入。有用的赋形剂是，特别地，填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品，诸如例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉和马铃薯淀粉，以及其他材料，诸如明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。对于通过吸入施用，本发明的分子可以使用加压包或雾化器和合适的推进剂方便地以气溶胶喷雾的形式递送。分子也可以使用例如常规栓剂基质诸如可可脂或其他甘油酯被配制为直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂。除前述制剂外，还可将化合物配制成贮库(depot)制剂。这样的长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或肌内注射施用。本发明的化合物可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如，在含有药理学上可接受的油的乳液中)、离子交换树脂或作为微溶性衍生物(诸如但不限于微溶性盐)来配制用于该施用途径。此外，化合物可以使用缓释系统(诸如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质)来递送。已经建立了各种缓释材料，并且为本领域技术人员所熟知。治疗有效量是指有效预防、减轻或改善蛋白质构象疾病的化合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文的公开内容，完全在本领域技术人员的能力内。通常，治疗方法中使用的量是在哺乳动物中有效实现期望的治疗结果的量。特别是，分子施用应按照当前的临床指南。合适的日剂量范围将为0.001mg/kg体重至10mg/kg体重，特别是0.1mg/kg至5mg/kg。在多核苷酸的情况下，合适的日剂量可以在0.001pg/kg体重至10mg/kg体重的范围内。典型地，用于本文所述分子的肠胃外施用的患者剂量范围为约1mg/天至约10,000mg/天，更典型地为约10mg/天至约1,000mg/天，并且最典型地为约50mg/天至约500mg/天。上述范围是说明性的，并且本领域技术人员将根据临床经验和治疗适应症确定所选化合物的最佳剂量。
如本文所用，“寡核苷酸”或“多核苷酸”应指能够与互补的单链或双链RNA或DNA靶序列结合的单链或双链RNA或DNA，包括ASO、sgRNA和siRNA。本发明的是ASO或sgRNA或siRNA的治疗性寡核苷酸的序列特异性部分包含长度为约7个碱基至约45个碱基的核苷酸序列。非序列特异性的另外碱基可以被包括在寡核苷酸中，诸如例如接头序列。序列特异性是指寡核苷酸的与靶RNA或DNA互补和/或指导靶RNA或DNA裂解的部分。
如本文所用，“ASO”应指含有与靶DNA或RNA互补的序列的DNA或衍生的DNA(例如硫代磷酸DNA)的短片段(约7个至约45个序列特异性核苷酸)。ASO的互补部分的范围通常将为寡核苷酸的约30％至约100％。
如本文所用，“siRNA”应指RNA双链体，其中双链体的每条链包含长度为约15个和约30个之间的碱基，并且其中至少一条链与DNA或RNA靶共享至少约90％、更优选地高达约100％的同源性。
如本文所用，“基因表达”应指mRNA合成或mRNA翻译。
在本发明的一种实施方案中，本发明的治疗性寡核苷酸是ASO。ASO包含与特定RNA序列的一部分或可选地互补基因序列互补，并减少或抑制基因表达的单链DNA或RNA。ASO的非限制性实例包括与mRNA转录物互补的RNA序列，从而形成导致翻译水平降低的RNA双链体。可选地，ASO可以包含与mRNA转录物互补的DNA序列，该DNA序列与mRNA转录物杂交并用作RNA酶H的底物。
反义寡核苷酸技术在本领域中已被认为是一种有前途的治疗来源。反义寡核苷酸依赖于已知核酸序列与其反向互补序列之间的Watson-Crick碱基配对来抑制基因表达(Jen,K.等人,Stem Cells,18:307-19(2000))。反义寡核苷酸疗法可用于对抗各种各样的紊乱，例如涉及疾病或紊乱的人类基因的表达，或者可选地通过靶向感染原的复制(Tanaka,M.等人,Respir.Res.,2:5-9(2000)；Bunnell,B.A.等人,Clin.Micro.Rev.,11:42-56(1998))。在设计反义寡核苷酸疗法时必须考虑的关键因素包括在体内的反义稳定性、反义寡核苷酸治疗剂的有效递送和反义寡核苷酸的有效细胞内定位(Jen,K.等人,StemCells,18:307-19(2000))。
熟知的是，取决于靶基因，与靶基因的任何部分(诸如编码区、内含子、5’非翻译区(5’UTR)、翻译起始位点或3’UTR)杂交的ASO可能具有治疗效用。因此，本文列出的序列仅仅是可用于本发明的可能的治疗性寡核苷酸(其包括本领域已知的所有ASO)的示例。此外，本领域提出的所有替代核酸化学都可以用于本发明，尽管有效性程度可能不同。适用于本发明的治疗性寡核苷酸的化学在下文提供的题为“缀合化学和载体分子”的部分中进一步详细讨论。简而言之，本文列出的化合物代表了对本发明有用的各种化学的治疗性寡核苷酸的广泛类别。在本发明的一种实施方案中，本发明的ASO和siRNA治疗性寡核苷酸的序列结合部分的长度为约7个至约45个碱基。在本发明的优选实施方案中，本发明的ASO和siRNA治疗性寡核苷酸的序列结合部分的长度为约10个至约30个核苷酸。在本发明的特别优选的实施方案中，本发明的ASO和siRNA治疗性寡核苷酸的序列结合部分的长度为约15个至约25个核苷酸。在本发明中有用的另外的寡核苷酸包括先前在本领域中以游离形式显示出功效的寡核苷酸。
本发明的治疗性寡核苷酸还包括siRNA。siRNA来源于RNA干扰，其是用于使某些基因转录沉默的自然细胞过程(Sharp,P.A.,Genes&Dev.,15:485-490(2001)；Carmichael,G.G.,Nature,418:379-380(2002))。siRNA与细胞蛋白质复合物缔合并指导这些蛋白质复合物对互补靶RNA的裂解。
在本发明中，siRNA包含长度为大约15-30个碱基的双链体RNA，双链体RNA的一条链优选地与RNA靶具有至少约90％的同源性，更优选地与RNA靶具有高达约100％的同源性。可选地，siRNA与RNA靶共享足够的同源性，以指导蛋白质复合物对互补靶RNA的裂解。两个核苷酸序列之间的同源性可以由本领域普通技术人员使用基于检索的计算机程序诸如BLAST或FASTA程序来确定。可选地，本领域普通技术人员可以使用序列比对程序诸如MegAlign(包含在DNASTAR计算机程序套件中)来确定序列同源性。
用下述化学反应基团修饰siRNA，使得能够与移动蛋白(优选地人类血清白蛋白)形成共价键，在本发明的优选实施方案中，通过添加化学反应基团对siRNA双链体进行的修饰发生在末端。用化学反应基团对RNA双链体进行的化学修饰可以发生在RNA双链体的4个末端中的任何一个，即RNA双链体的两条RNA链中的任何一条的5’末端或3’末端。
优选地，抑制性核酸包含一种或更多种肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)分子，或者抑制性核酸是包含在2’-氧和4’-碳之间具有桥的核糖环的核糖核酸类似物。
优选地，核糖核酸类似物包含2’-氧和4’-碳之间的亚甲基桥。
优选地，抑制性核酸的至少一个核苷酸包含选自以下的修饰的糖部分：2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分。
优选地，抑制性核酸包含选自以下的至少一个修饰的核苷间连接：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲酯及其组合。
L1亚家族包括：HAL1、HAL1B、HAL1M8、IN25、L1、L1HS、L1M1_5、L1M1B_5、L1M2A_5、L1M3A_5、L1M3B_5、L1M3C_5、L1M3D_5、L1M3DE_5、L1M4B、L1M6_5end、L1M6B_5end、L1M7_5end、L1MA1、L1MA10、L1MA2、L1MA3、L1MA4、L1MA4A、L1MA5、L1MA5A、L1MA6、L1MA7、L1MA8、L1MA9、L1MB1、L1MB2、L1MB3、L1MB3_5、L1MB4、L1MB5、L1MB6_5、L1MB7、L1MB8、L1MC1、L1MC2、L1MC4、L1MCB_5、L1MD1、L1MD2、L1MDB_5、L1ME_ORF2、L1ME1、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME4A、L1MEA_5、L1MEC_5、L1MED_5、L1MEf_5end、L1PA10、L1PA11、L1PA12、L1PA12_5、L1PA13、L1PA13_5、L1PA14、L1PA15、L1PA16、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA8、L1PB1、L1PB2、L1PB2c、L1PB3、L1PB4、L1PREC1、L1PREC2。
(https://www.girinst.org/repbase/,Kenji K.Kojima,Human transposableelements in Repbase:genomic footprints from fish to humans,Mob DNA.2018；9:2)。
在本发明的上下文中，癌症或肿瘤可以包括任何的癌症或肿瘤，例如肺癌，优选地非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌(CRC)、肠肿瘤或黑素瘤。
现在将参考附图通过非限制性实例的方式来说明本发明。
图1.静止的初始CD4+ T细胞富含LINE1 RNA，LINE1 RNA在体外和体内在TCR被mTORC1激活后被下调。
(a)对静止的初始和记忆CD4+和CD8+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。作为对照，用RNA酶处理初始CD4+ T细胞。原始放大63X。比例尺5μm。(b)来自四个个体的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少246个细胞核。***P<0.0001普通单因素ANOVA。(c)在静止的初始和记忆Th1、Th2、Th17 CD4+ T细胞以及静止的初始和记忆CD8+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平；每个点代表不同的供体。***P<0.0001普通单因素ANOVA。(d)来自三个个体的静止的初始CD4+ T细胞的细胞质、核质和染色质中LINE1RNA、HERV RNA和Alu RNA的丰度。数据表示为平均值。*P＝0.0217普通单因素ANOVA。(e)经放线菌素D处理或未处理的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1和β肌动蛋白表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。β肌动蛋白未处理对比放线菌素D处理的*P＝0.046单尾配对t检验。(f)在初始CD4+ T细胞中和在2小时、4小时和8小时、1天、3天、5天、7天用TCR接合(TCR engagement)和Th1细胞因子混合物激活的细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平(n＝6个个体)。***P<0.0001普通单因素ANOVA。(g)TCR激活下游信号通路的示意图。指出了用于抑制这些途径的药物及其分子靶。(h)在用TCR接合激活并在激活后用不同信号通路抑制剂处理8小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平(n＝4个个体)；每个点代表不同的供体。对照对比雷帕霉素***P＝0.0003双尾配对t检验。(i)对从健康个体、用依维莫司治疗的移植患者和用西罗莫司治疗的LAM患者分离的记忆Th1CD4+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。(j)来自每组两个个体的记忆Th1CD4+ T细胞的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少138个细胞核。***P<0.0001Mann Whitney t检验，**P＝0.0058Mann Whitney t检验。(k)在从4个健康个体、2个用依维莫司治疗的移植患者和4个用西罗莫司治疗的LAM患者分离的记忆CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平。数据表示为平均值和±s.e.m。**P＝0.007，普通单因素ANOVA。
图2.LINE1被剪接到调节相应基因座转录的细胞激活基因的非典型转录变体中。
(a)ARCP2.L1显示为包含LINE1的转录物的实例：包含LINE1元件的新外显子被放大。示出了H3K36me3对比H3K9me3变化倍数对数的轨迹(暗红色)，初始CD4+ T细胞染色质RNAseq的覆盖率轨迹(蓝色)，新外显子的分裂和支持读段。(b-c)DNA FISH探针(绿色)、smRNA FISH探针(粉色)和ASO(蓝色)在LINE1转录物序列中的位置的示意图。(c)对静止和激活的初始CD4+ T细胞和用HIRA.L1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的初始CD4+ T细胞进行的针对HIRA.L1的smRNA FISH的代表性宽视野荧光显微术图像。原始放大100X。比例尺5μm。右图，代表每个细胞核的点数的条形图。(d)对静止的初始CD4+ T细胞进行的针对HIRA.L1的TSA RNA FISH(红色)与针对HIRA基因组基因座的DNA FISH(绿色)的代表性宽视野荧光显微术图像的组合。原始放大100X。比例尺5μm。(e)静止的初始CD4+ T细胞中HIRA.L1敲低的示意图。初始CD4+ T细胞用HIRA.L1或对照(Scr)ASO处理48小时。(f)在用HIRA.L1或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的HIRA.L1和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。*P＝0.04，双尾配对t检验。(g)在静止的初始CD4+ T细胞中用Cas9/RNP进行LINE1转录物缺失的示意图。初始CD4+T细胞用Cas9/RNP进行核转染(nuclofection)，并保持培养96小时。(h-i)IFNGR2的示意图(h)描绘靶向IFNGR2基因座的sgRNA位置的序列。(i)在用针对IFNGR2.L1的Cas9/RNP或对照核转染后96小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的IFNGR2.L1和典型转录物表达水平(n＝4个个体)。LINE1转录物，IFNGR2.L1*P＝0.04双尾配对t检验，典型转录物*P＝0.0275单尾配对t检验。
图3.与核仁蛋白复合的LINE1转录物保持细胞激活基因的暂停表达，阻碍H3K36me3在静止的初始CD4+ T细胞中的沉积。
(a)静止的初始CD4+ T细胞中LINE1 RNA敲低的示意图。初始CD4+ T细胞用LINE1ASO或对照(Scr)ASO处理48小时。(b)左图，对用LINE1ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞进行的LINE1RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。右图，来自两个健康个体的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少500个细胞核。***P<0.001Mann Whitney t检验。(c)在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物***P<0.0001，F＝68.60双因素ANOVA；典型转录物***P<0.0001，F＝39.39。双因素ANOVA。(d)通过定量蛋白质印迹评估的，用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中的H3K36me3、H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3水平(n＝3个个体)。H3用作上样对照。数据表示为平均值和±s.e.m。H3K36me3 Scr对比LINE1*P＝0.0495双尾配对t检验。(e)在初始和激活的CD4+ T细胞以及用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞之间进行比较的绘制在含有LINE1的基因或对照基因体上的H3K36me3 ChIP seq信号的位置分布。绘制了基因之间的H3K36me3信号(ChIP/输入富集倍数)的中位值。(f-g)在静止的初始CD4+T细胞中进行的核仁蛋白RIP实验中，通过qRT-PCR扩增的LINE1转录物和对照基因(GAPDH)(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。(h)静止的初始CD4+ T细胞中核仁蛋白敲低的示意图。初始CD4+ T细胞用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时。(i)在用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。典型转录物，***P<0.0001，F＝42.57.60双因素ANOVA。(j)用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+T细胞的细胞质、核质和染色质中LINE1RNA的丰度(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。*P＝0.0345，F＝8.772双因素ANOVA。(k)激活的CD4+ T细胞中LINE1 RNA敲低的示意图。用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理初始CD4+ T细胞48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活7天。(l)通过细胞内染色测量的，用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理的初始CD4+ T细胞中的T-bet阳性细胞和IFNγ阳性细胞(n＝8个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。Tbet***P＝0.0009双尾配对t检验；IFNγ***P＝0.0002双尾配对t检验。(m)激活的CD4+ T细胞中核仁蛋白敲低的示意图。用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理初始CD4+ T细胞48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活7天。(n)通过细胞内染色测量的，用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活7天的初始CD4+ T细胞中的T-bet阳性细胞和IFNγ阳性细胞(n＝4个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。Tbet*P＝0.0142双尾配对t检验；IFNγ**P＝0.0041双尾配对t检验。
图4.LINE1转录物受转录因子IRF4控制。
(a)胸腺中CD4+和CD8+ T细胞发育的示意图。描述了造血祖细胞、早期T细胞祖细胞、DN2、DN3、双阳性、初始CD4+和初始CD8+的特异性表面标志物。(b-c)在祖细胞、初始和激活的CD4+ T细胞以及初始和激活的CD8+ T细胞的RNA-seq数据集中LINE1转录物和典型转录物两者的表达水平。***P<0.001Wilcoxon秩和检验用于将每种细胞类型与初始CD4+T细胞进行比较(仅在与CD4+激活的T细胞相比时为配对选择)。(d)通过定量蛋白质印迹评估初始CD4+和初始CD8+ T细胞中的IRF4水平。H3用作上样对照。数据表示为平均值和±s.e.m。n＝3个个体**P＝0.0085双尾配对t检验。(e)在静止的初始CD4+ T细胞和初始CD8+ T细胞中进行的IRF4ChIP实验中，通过qRT-PCR扩增含有LINE1的基因和对照基因(HECW1)启动子(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。含有LINE1的基因启动子**P＝0.0034，F＝10.7，双因素ANOVA。(f)静止的初始CD4+T细胞中IRF4敲低的示意图。初始CD4+ T细胞用IRF4ASO或对照(Scr)ASO处理48小时。(g)在用IRF4 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物、典型转录物和对照基因(HECW1)表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物***P＝0.001，F＝924双因素ANOVA；典型转录物*P＝0.04，F＝22.2。双因素ANOVA。
图5.激活后LINE1转录物被抑制性剪接蛋白PTBP1/MATR3下调，而典型转录物表达被转录因子GTF2F1促进。
(a-b)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活16小时的初始CD4+ T细胞中进行的PTBP1 RIP实验中，通过qRT-PCR扩增LINE1转录物和对照基因(GAPDH)(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。***P＝0.0002，F＝26.26，双因素ANOVA。(c-d)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活16小时的初始CD4+ T细胞中进行的GTF2F1 RIP实验中，通过qRT-PCR扩增LINE1转录物和对照基因(GAPDH)(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。**P＝0.0014，F＝16.68，双因素ANOVA。(e)对PTBP1 RIP(图f)和对GTF2F1 RIP(图g)的qRT-PCR测定的示意图，以确定PTBP1或GTF2F1是否与激活的CD4+ T细胞中的典型RAB22A mRNA、RAB22A.L1或前体mRNA结合。引物设计成扩增i)LINE1外显子、ii)前体mRNA中与内含子和附近LINE1外显子重叠的区域、ii)经剪接的LINE1转录物(外显子2上的fw引物和LINE1外显子2.1上的rev引物)和iv)典型转录物。(f)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活16小时的初始CD4+ T细胞中进行的PTBP1 RIP实验中，通过qRT-PCR扩增RAB22ARNA种类(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。(g)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活16小时的初始CD4+ T细胞中进行的PTBP1 RIP实验中，通过qRT-PCR扩增RAB22ARNA种类(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。(h)激活的CD4+ T细胞中PTBP1和GTF2F1敲低的示意图。用PTBP1 ASO和GTF2F1 ASO或对照(Scr)ASO处理初始CD4+ T细胞48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活16小时。(i)在用PTBP1 ASO和GTF2F1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活16小时的激活的CD4+T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。LINE1转录物，***P＝0.0006，F＝14.89，双因素ANOVA；典型转录物，***P<0.0001，F＝44.52，双因素ANOVA。
图6.LINE1转录物在功能障碍的肿瘤浸润效应淋巴细胞中重新积累。
(a)上图，对浸润正常邻近组织或CRC肿瘤的记忆CD4+和CD8+ T细胞进行的LINE1RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。下图，来自两个患者的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少100个细胞核。记忆CD4+ T细胞***P<0.001双尾Mann-Whitney检验；记忆CD8+ T细胞***P<0.001双尾Mann-Whitney检验。(b)对浸润正常邻近组织或NSCLC肿瘤的记忆CD4+和CD8+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。下图，来自三个患者的CD4+ T细胞和来自两个患者的CD8+ T细胞的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少84个细胞核。记忆CD4+ T细胞***P<0.001双尾Mann-Whitney检验。(c)左图，对效应CD4+ T细胞和功能障碍的CD4+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。右图，来自健康个体的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少100个细胞核。***P<0.001Mann Whitney t检验。(d)在效应CD4+T细胞和功能障碍的CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物**P＝0.0089，F＝8.092双因素ANOVA；典型转录物***P<0.0001，F＝38.08。双因素ANOVA。(e)左图，对效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。右图，来自健康个体的LINE1 RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少100个细胞核。***P<0.001Mann Whitney t检验。(f)在效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物**P＝0.0039，F＝17.93双因素ANOVA；典型转录物***P<0.0001，F＝83.66。双因素ANOVA。
图7.LINE1转录物在功能障碍的效应淋巴细胞中的重新积累受IRF4调节，由核仁蛋白和GTF2F1/PTBP1结合的丧失稳定在染色质。
(a)通过定量蛋白质印迹评估效应CD4+ T细胞和功能障碍的CD4+ T细胞以及效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞中的IRF4、核仁蛋白、GTF2F1和PTBP1水平。H3用作上样对照。数据表示为平均值和±s.e.m(n＝2个个体)。(b)在效应CD4+ T细胞和功能障碍的CD4+T细胞以及效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞中进行的核仁蛋白、PTBP1和GTF2F1RIP实验中，通过qRT-PCR扩增RAB22A.L1、ARCP2.L1和IFNGR2.L1(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。(c)功能障碍的CD4+和CD8+ T细胞中IRF4敲低的示意图。功能障碍的T细胞用IRF4ASO或对照(Scr)ASO处理48小时。(d)在用IRF4 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的功能障碍的CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物***P<0.001，F＝47.6双因素ANOVA；典型转录物***P<0.0001，F＝36.1。双因素ANOVA。(e)在用IRF4 ASO或对照(Scr)ASO处理的功能障碍的CD8+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物**P＝0.009，F＝22.6双因素ANOVA；典型转录物**P＝0.001，F＝16.8。双因素ANOVA。
图8.LINE1转录物水平调节浸润CRC或NSCLC的CD4+和CD8+记忆T细胞的功能障碍表型。
(a)对用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理的浸润CRC或NSCLC并从CRC或NSCLC分离的记忆CD4+ T细胞和CD8+记忆T细胞进行的免疫学测定的示意图。ASO处理后，将测试肿瘤浸润记忆CD4+和CD8+(TIL)的抑制性检查点染色(图b和图c)、效应细胞因子分泌(图d和图e)以及杀伤作为单核细胞的带有MHCII和MHCI的异源抗原呈递细胞的能力(图f和图g)。(b)通过表面标志物染色测量的，在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的从CRC(黑色，n＝3个个体)或NSCLC(红色，n＝3个个体)分离的记忆CD4+ T细胞中的PD-1、TIM-3或LAG-3阳性细胞，PD-1Scr ASO对比LINE ASO**P＝0.0044，双尾配对t检验；TIM-3Scr ASO对比LINEASO*P＝0.017，双尾配对t检验；LAG-3Scr ASO对比LINE ASO*P＝0.04，双尾配对t检验。(c)通过表面标志物染色测量的，在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的从CRC(黑色，n＝3个个体)或NSCLC(红色，n＝3个个体)分离的记忆CD8+ T细胞中的PD-1、TIM-3或LAG-3阳性细胞，PD-1Scr ASO对比LINE ASO*P＝0.0268，双尾配对t检验；LAG-3Scr ASO对比LINEASO*P＝0.03，双尾配对t检验。(d)通过细胞内染色测量的，在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时并且然后通过TCR接合激活另外48小时的从CRC(黑色，n＝2个个体)或NSCLC(红色，n＝2个个体)分离的记忆CD4+ T细胞中的IFNγ或GrzB阳性细胞。数据表示为平均值和±s.e.m。IFNγScr ASO对比LINE ASO*P＝0.04，单尾配对t检验；GrzB Scr ASO对比LINE ASO*P＝0.02，单尾配对t检验。(e)通过细胞内染色测量的，在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时并且然后通过TCR接合激活另外48小时的从CRC(黑色，n＝3个个体)或NSCLC(红色，n＝1个个体)分离的记忆CD8+ T细胞中的IFNγ、GrzB或PerfA阳性细胞。数据表示为平均值和±s.e.m。IFNγScr ASO对比LINE ASO**P＝0.0095，双尾配对t检验；GrzB Scr ASO对比LINEASO*P＝0.03，单尾配对t检验；PerfAScr ASO对比LINE ASO*P＝0.035，单尾配对t检验。(f-g)与用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的来自CRC(黑色，n＝1个个体)或NSCLC(红色，n＝2个个体)的记忆CD4+(f)或CD8+(g)T细胞共培养12小时的死亡异源单核细胞的百分比。记忆CD4+ T细胞*P＝0.02，双尾配对t检验；记忆CD8+ T细胞*P＝0.04，双尾配对t检验。
图9.LINE1 RNA在初始CD4+ T细胞的开放染色质区域富集。
(a)对静止的初始和记忆CD4+和CD8+ T细胞进行的Alu RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。作为对照，用RNA酶处理初始CD4+T细胞。原始放大63X。比例尺5μm。(b)来自四个个体的Alu RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少220个细胞核。***P<0.0001，普通单因素ANOVA。(c)在静止的初始和记忆Th1、Th2、Th17 CD4+ T细胞以及静止的初始和记忆CD8+ T细胞中通过qRT-PCR检测的Alu表达水平，每个点代表不同的供体。(d)对静止的初始和记忆CD4+和CD8+ T细胞进行的HERV RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。作为对照，用RNA酶处理初始CD4+ T细胞。原始放大63X。比例尺5μm。(e)来自三个个体的HERV RNA FISH信号的小提琴图表示；每组评估了至少164个细胞核。(f)在静止的初始和记忆Th1、Th2、Th17 CD4+ T细胞以及静止的初始和记忆CD8+ T细胞中通过qRT-PCR检测的HERV表达水平，每个点代表不同的供体。(g)来自三个个体的静止的初始CD4+ T细胞的细胞质、核质和染色质中18S和Xist(细胞质关联的对照转录物和染色质关联的对照转录物)的丰度。数据表示为平均值。(h)对静止的初始CD4+ T细胞的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像以及H3K4me3和H3K9me3的免疫荧光染色(灰色)。原始放大63X。比例尺5μm。(i)在三个个体中测量了RNA FISH和免疫染色之间共定位的Pearson相关性；每组评估了至少103个细胞核。***P<0.0001，普通单因素ANOVA。静止的初始CD4+ T细胞用TCR接合和(j)Th2或(k)Th17细胞因子混合物激活。对于(a)和(b)，在第1天、第3天、第5天、第7天通过qRT-PCR检测的四个个体中的LINE1表达水平。*P＝0.0209普通单因素ANOVA；**P＝0.0100普通单因素ANOVA。(l)在用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活72小时并且然后用不同的信号通路抑制剂处理48小时的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平(n＝4个个体)。对照对比雷帕霉素*P＝0.0286双尾Mann-Whitney检验。(m)在用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活72小时并且然后用雷帕霉素或CsA处理的初始CD4+T细胞中通过定量蛋白质印迹评估的磷酸化的S6蛋白(pS6，mTORC1靶)水平。β微管蛋白用作上样对照。(n)对用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活72小时并且然后用雷帕霉素或CsA处理的静止的初始CD4+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺10μm。
图10.初始CD4+ T细胞表达演化上古老的LINE1元件，相比之下mESC表达演化上年轻的、有逆转录转座能力的LINE1元件。
(a)在初始CD4+ T细胞的各染色质和核质RNA-seq重复中，转座元件在类别、超家族和亚家族水平表达的热图。使用DESeq2对log2转换的归一化读段计数计算Z-评分。(b)初始CD4+ T细胞的核质(x轴)和染色质(y轴)RNA-seq中LINE1亚家族表达的散点图。亚家族根据演化来源进行颜色编码：哺乳动物特异性(L1M，橙色)，灵长类动物特异性(L1P，蓝色)，人类特异性(L1Hs，绿色)，HAL(黄色)。(c)在各mESC RNA-seq重复中转座元件在类别、超家族和亚家族水平表达的热图。使用DESeq2对log2转换的归一化读段计数计算Z-评分。(d和f)，代表Hs LINE1(d)和Mm LINE1(f)的嵌合读段和纯读段的分布的饼图，报告为初始CD4+ T细胞的重复之间的平均百分比(参见方法)。(e和g)初始CD4+ T细胞中蛋白质编码、基因间区域、lncRNA、假基因和ncRNA转录单元之间的Hs LINE1(e)和Mm LINE1(g)转录物基因组分布。
图11.新LINE1转录物的验证。
(a)通过纳米孔测序检测到的LINE1转录物的长读段转录谱(n＝407)。线和面积分别代表平均覆盖率和平均值的标准误差。(b-i)包含LINE1的基因mRNA和重建的新LINE1转录物的方案；LINE1外显子用橙色表示。中图，报告了设计用于验证两种转录亚型的存在的PCR引物的方案。下图，LINE1转录物、含有LINE1的基因mRNA和阴性对照的PCR结果的琼脂糖凝胶。
图12.演化上古老的和内含子LINE1元件(无逆转录转座能力)被剪接为对细胞激活重要的基因的非典型剪接变体的新外显子。
(a)LINE1基因座的长度分布。虚线示出了LINE1基因座的平均长度。(b)相对于全长LINE1序列(6kb)的LINE1基因座位置分布。示出了用于qRT-PCR的引物、用于RNA FISH的探针和用于LINE1敲低实验的反义寡核苷酸(ASO)。右图，全长LINE1序列的ORF1、ORF2、5’UTR和3’UTR内LINE1基因座的百分比。(c)示出LINE1转录物中最富含的LINE1亚家族的百分比的条形图。(d)含有LINE1的蛋白质编码基因的内含子、外显子、启动子、5’UTR和3’UTR间LINE1基因座的分布。(e)LINE1外显子的供体和接受者剪接位点的共有基序。(f)在用媒介物(DMSO)或3TC逆转录酶抑制剂处理的初始CD4+ T细胞中进行的LINE1 RNA FISH。
图13.在静止的初始CD4+ T细胞中LINE1转录物水平保持典型转录物的表达顺式暂停。
(a)左图，对静止和激活的初始CD4+ T细胞和用RAB22A.L1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的初始CD4+ T细胞进行的针对RAB22A.L1的smRNA FISH的代表性宽视野荧光显微术图像。原始放大100X。比例尺5μm。(b)，代表每个细胞核的点数的条形图。(c)对静止的初始CD4+ T细胞进行的针对RAB22A.L1的TSARNA FISH(红色)与针对RAB22A基因组基因座的DNA FISH(绿色)的代表性宽视野荧光显微术图像的组合。原始放大100X。比例尺5μm。(d)在用RAB22A.L1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的RAB22A.L1和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。*P＝0.04，双尾配对t检验。(e)在静止的初始CD4+ T细胞中用Cas9/RNP进行ARCP2 LINE1转录物缺失的示意图。初始CD4+ T细胞用Cas9/RNP进行核转染，并保持培养96小时。(f)在用针对ARPC22.L1的Cas9/RNP或对照核转染后96小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的ARPC2.L1和典型转录物表达水平(n＝4个个体)。LINE1转录物，ARCP2.L1*P＝0.04单尾配对t检验。(g)上图，sgRNA(蓝色)和检测PCR引物(黑色)在IFNGR2基因座中的位置的示意图。中图，对从用靶向IFNGR2.L1的Cas9/RNP或对照核转染后96小时的初始CD4+ T细胞提取的25ng gDNA的PCR验证(n＝4个个体)。使用的引物设计在sgRNA序列外部。下图，预测的缺失基因座(sgRNA为蓝色，PAM为红色)的示意图，以及PCR验证的sanger测序分析。(h)上图，sgRNA(蓝色)和检测PCR引物(黑色)在ARCP2基因座中的位置的示意图。中图，对从用靶向ARCP2.L1的Cas9/RNP或对照核转染后96小时的初始CD4+ T细胞提取的25ng gDNA的PCR验证(n＝3个个体)。使用的引物设计在sgRNA序列外部。下图，预测的缺失基因座(sgRNA为蓝色，PAM为红色)的示意图，以及PCR验证的sanger测序分析。
图14.LINE1转录物阻碍H3K36me3在包含LINE1的基因上沉积。
(a)在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平(n＝8个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。***P<0.0001双尾配对t检验。(b)对用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)和针对H3K36me3和H3K4me3的免疫荧光染色(灰色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。(c)来自用LINE1ASO或对照(Scr)ASO处理的从两个个体分离的初始CD4+ T细胞的H3K36me3和H3K4me3信号的小提琴图表示；每组评估了至少267个细胞核。***P<0.001双尾Mann-Whitney检验。(d)绘制在含有LINE1的基因或对照基因体上的H3K4me3 ChIP seq信号的位置分布，在初始的和激活的CD4+ T细胞之间进行比较。绘制了基因之间的H3K34me3信号(ChIP/输入富集倍数)的中位值。(e-f)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活16小时的初始CD4+ T细胞中，含有LINE1的ERGIC2基因、和FUCA2对照基因的H3K4me3和H3K36me3的代表性ChIP-seq轨迹。呈现了LINE1转录物和LINE1基因组位置。将ChIP-seq覆盖率轨迹针对它们各自的输入归一化。(g)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物激活16小时的初始CD4+ T细胞中进行的H3K36me3 ChIP实验中，通过qRT-PCR扩增典型转录物和对照基因(HECW1)(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。H3K36me3ChIP初始CD4+ T细胞对比激活的CD4+ T细胞***P<0.0001，F＝69.42双因素ANOVA。(h)在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中进行的H3K36me3 ChIP实验中，通过qRT-PCR扩增典型转录物和对照基因(HECW1)(n＝3个个体)。数据表示为输入的％的平均值±s.e.m。H3K36me3 ChIP Scr对比LINE1***P<0.0001，F＝58.86，双因素ANOVA。
图15.LINE1转录物与核仁蛋白组合干扰含有LINE1的基因的转录。
在用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+T细胞中，(a)通过qRT-PCR检测的核仁蛋白基因表达水平，和(b)蛋白质水平，分析了四个个体。数据表示为平均值和±s.e.m。*P＝0.0482双尾配对t检验。(c)对用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞进行的LINE1 RNA FISH(红色)和针对H3K36me3的免疫荧光染色(灰色)的代表性共聚焦荧光显微术图像。原始放大63X。比例尺5μm。(d)来自用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理的从三个个体分离的初始CD4+ T细胞的H3K36me3信号的小提琴图表示；每组评估了至少259个细胞核。***P<0.001，双尾Mann-Whitney检验。(e)用核仁蛋白ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞的细胞质、核质和染色质中的GAPDH和MALAT1(细胞质对照转录物和核对照转录物)的丰度(n＝3个个体)。数据表示为平均值。
图16.LINE1转录物在T细胞激活时下调，而典型转录物上调。
(a)在静止和激活的初始CD4+ T细胞的RNA-seq数据集中，典型转录物、和三组不保留基因组LINE1元件的对照基因(没有LINE1的对照基因)的随机对照组、和三组保留LINE1元件但不产生LINE1转录物的对照基因(带有LINE1的对照基因)的随机对照组的表达水平。***P<0.001Wilcoxon配对符号秩检验。(b)在静止的初始CD4+ T细胞和用TCR接合和Th1细胞因子混合物处理16小时的激活的CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。LINE1转录物**P＝0.0024，F＝13.65双因素ANOVA；典型转录物***P＝0.0003，F＝23.30双因素ANOVA。(c)对含有LINE1的基因的启动子区域进行转录因子(TF)结合基序研究；在RNA-seq和蛋白质组学数据集两者中，相对于初始CD8+ T细胞，在初始CD4+ T细胞中统计学上上调的TF被过滤出来(参见方法)，IRF4是最富集的之一。(d)在静止的初始和激活的CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的IRF4表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。*(e)在用IRF4 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的IRF4表达水平(n＝3个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。**P＝0.0042，双尾配对t检验。(f)在用IRF4 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+T细胞中通过FACS分析的IRF4水平。
图17.MATR3/PTBP1阻遏激活的CD4+ T细胞中LINE1外显子剪接。
(a)静止的初始CD4+ T细胞用PTBP1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活16小时，通过qRT-PCR检测的PTBP1表达水平。数据表示为平均值和±s.e.m。n＝3个个体**P＝0.0014双尾配对t检验。(b)在用PTBP1 ASO或对照(Scr)ASO处理的激活的CD4+ T细胞中通过FACS分析的PTBP1水平。在用GTF2F1 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的静止的初始CD4+ T细胞中，(c)通过qRT-PCR检测的GTF2F1表达水平和蛋白质水平(d)，分析了四个个体。数据表示为平均值和±s.e.m。**P＝0.0031，双尾配对t检验。(e)静止的初始CD4+ T细胞用MATR3 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活16小时，通过qRT-PCR检测的MATR3表达水平。数据表示为平均值和±s.e.m。n＝3个个体***P＝0.0006双尾配对t检验。(f)在用MATR3 ASO或对照(Scr)ASO处理的激活的CD4+ T细胞中通过FACS分析的MATR3水平。(g)在用MATR3 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时，并且然后在存在Th1细胞因子混合物的情况下通过TCR接合激活16小时的激活的CD4+ T细胞中通过qRT-PCR检测的LINE1转录物和典型转录物表达水平(n＝4个个体)。LINE1转录物，***P<0.001，F＝44.8，双因素ANOVA；典型转录物，**P＝0.006，F＝29.3，双因素ANOVA。
图18.在体外，LINE1 RNA在功能障碍的CD4+和CD8+ T淋巴细胞中重新积累。
(a)静止的初始CD4+ T细胞被激活并分化为Th1，并每2天一次暴露于刺激性抗CD3mAb；长期抗CD3刺激诱导生长停滞、PD-1表面标志物表达和IFNγ产生减少。(b)左图，在第2-4-6-8-10天，效应CD4+ T细胞和功能障碍的CD4+ T细胞的细胞计数(n＝5个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m，***P<0.0001，F＝57.22双因素ANOVA。中图，在第2-5-7-9天，效应CD4+T细胞和功能障碍的CD4+ T细胞中的PD-1阳性细胞(n＝4个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m，***P<0.0001，F＝48.77双因素ANOVA。右图，在第9天，效应CD4+ T细胞和功能障碍的CD4+ T细胞中的IFNγ阳性细胞(n＝4个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。*P＝0.032。单尾配对t检验。(c)静止的初始CD8+ T细胞被激活并每2天一次暴露于刺激性抗CD3 mAb；长期抗CD3刺激诱导生长停滞、PD-1表面标志物表达和IFNγ、GrzB和PerfA产生减少。(d)左图，在第2-4-6-8天，效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞的细胞计数。数据为平均值和±s.e.m，N＝4个个体。***P＝0.0003，F＝26.05双因素ANOVA。中图，在第2-5-7天，效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞中的PD-1阳性细胞。数据为平均值和±s.e.m，N＝4个个体。***P<0.0001，F＝58，双因素ANOVA。右图，在第9天，效应CD8+ T细胞和功能障碍的CD8+ T细胞中的IFNγ、GrzB和PerfA阳性细胞。数据为平均值和±s.e.m，N＝4个个体。IFNγ*P＝0.01；GrzB*P＝0.02。双尾配对t检验。(e)在用IRF4 ASO或对照(Scr)ASO处理48小时的功能障碍的CD4+和CD8+ T细胞中通过FACS分析的IRF4水平。
图19.在体外，LINE1转录物调节CD4+和CD8+ T淋巴细胞的衰竭(exhausted)表型。
(a)在体外对被致使衰竭并用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理的效应CD4+和CD8+ T细胞进行的免疫学测定的示意图。在ASO处理后，将测试衰竭的CD4+和CD8+ T细胞的效应细胞因子分泌(图d和图e)、杀伤作为单核细胞的带有MHCII和MHCI的异源抗原呈递细胞的能力(图f和图g)和增殖能力(图h和图i)。(b-c)在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理的衰竭的CD4+ T细胞(b)和CD8+ T细胞(c)中通过qRT-PCR检测的LINE1表达水平(n＝4个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。CD4+ T细胞**P＝0.004；CD8+ T细胞**P＝0.007双尾配对t检验。(d)用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理的衰竭的CD4+ T细胞中IFNγ或GrzB阳性的百分比(n＝4个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。*P＝0.0336，单尾配对t检验。(e)用LINE1ASO或对照(Scr)ASO处理的衰竭的CD8+ T细胞中IFNγ、GrzB或PerfA阳性的百分比(n＝4个个体)。数据表示为平均值和±s.e.m。IFNγ**P＝0.002；GrzB**P＝0.004，PerfA***P<0.001，双尾配对t检验。(f-g)与用LINE1ASO或对照(Scr)ASO处理的衰竭的CD4+ T细胞(f)或CD8+ T细胞(g)共培养12小时的死亡的异源单核细胞的百分比。CD4+ T细胞**P＝0.009，CD8+T细胞**P＝0.008双尾配对t检验；(h-i)在用LINE1 ASO或对照(Scr)ASO处理的衰竭的CD4+ T细胞(h)或CD8+ T细胞(i)中用cell trace进行的增殖测定。
实施例1
材料和方法
人类血液和组织样品
来自匿名健康供体的血液由米兰的Fondazione Istituto di Ricovero e Curaa Carattere Scientifico(IRCCS)CàGranda Ospedale Maggiore Policlinico提供。健康供体的年龄和性别未知(隐私)。来自淋巴管平滑肌瘤病(LAM)患者的外周血从米兰的Ospedale San Giuseppe-MultiMedica IRCCS获得。来自用依维莫司治疗的肾移植患者的外周血从Fondazione IRCCS CàGranda-Ospedale Maggiore Policlinico,Milan获得。结肠直肠癌(CRC)样品和非小细胞肺癌(NSCLC)样品由欧洲肿瘤学研究所(EuropeanInstitute of Oncology，IEO)提供，非肿瘤样品从距病灶远端至少10cm的正常邻近组织获得；没有患者接受姑息性手术或新辅助化疗和/或放疗。这些医院的伦理委员会批准将人类样品用于研究目的并从所有受试者获得了知情同意。
T细胞纯化和分选和单核细胞纯化
用Ficoll-Paque Plus通过密度梯度离心法从人类血液样品纯化人类外周血单个核细胞(PBMC)。使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)或CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，用磁分离仪(AutoMACS Pro Separator；Miltenyi Biotec)从PBMC中对T细胞进行负选择。用针对表面标志物的抗体对T细胞进行染色，并通过流式细胞术对T细胞亚群进行分选：初始CD4+为CD4+CD25-CD127-/高CD45RO-，CD4+ Th1细胞为CD4+CD25-CD127-/高CD45RO+CXCR3+CCR6-，CD4+ Th2细胞为CD4+CD25-CD127-/高CD45RO+CRTH2+并且CD4+ Th17细胞为CD4+CD25-CD127-/高CD45RO+CCR6+CXCR3-；初始CD8+为CD4-CD8+CD45RO-并且记忆CD8+为CD4-CD8+CD45RO+。为了分离组织浸润淋巴细胞，将肿瘤和正常邻近组织洗涤数次，并在补充有400μg/mL庆大霉素、15μg/mL两性霉素、500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640中于4℃维持过夜。然后将组织称重、粉碎并用5mL/gr的EDTA螯合缓冲液(HBSS中5mM EDTA、1mM DTT和67μg/mL DNA酶I)在37℃处理20min。组织在500g和室温(RT)离心，用Hank平衡盐溶液(HBSS)(Gibco)洗涤，并用5mL/gr消化溶液(HBSS中稀释的1mg/mL胶原酶D和67μg/mL DNA酶，补充有抗生素)在37℃搅拌消化3h。将释放的细胞通过70-μM滤网(strainer)，用HBSS在500g和4℃洗涤两次10min，并通过Percoll梯度(100％-60％-40％-30％)在400g分层30min。从60％和40％Percoll层之间的界面回收T细胞，并用针对表面标志物的抗体染色。然后通过流式细胞术分选T细胞亚群：记忆CD4+为CD45+CD3+CD4+CD25-CD127-/高CD45RO+并且记忆CD8+为CD45+CD3+CD8+CD45RO+。以下抗体用于基于流式细胞术的分选：抗CD4-APCCy7(BD Biosciences；克隆：RPA-T4)或抗CD4-VioGreen(Miltenyi Biotec；克隆：VIT4)；抗CD8-VioGreen(Miltenyi Biotec；克隆：REA-734)或抗CD8-VioBlue(Miltenyi Biotec；克隆：REA734)；抗CD25-PECy7(Invitrogen,LifeTechnologies；克隆：BC96)；抗CD127-PECy5(BioLegend；克隆：A019D5)或抗CD127-PE(Miltenyi Biotec；克隆：MB15-18C9)；抗CD45RO-BV605(BioLegend；克隆：UCHL1)或抗CD45RO-APC(Miltenyi Biotec；克隆：UCHL1)；抗CD3-PE(BD Biosciences；克隆：UCHT1)；抗CD45-Pacific Blue(BioLegend；克隆2D1)；抗CD183-PECy5(BD Biosciences；克隆：1C6/CXCR3)；抗CD294(CRTH2)-APC-Vio770(Miltenyi Biotec；克隆：REA598)；抗CCR6-FITC(BioLegend；克隆：G034E3)。细胞分选使用FACSAria III(BD Bioscience)进行。分选的细胞纯度>97.5％。用磁分离仪(AutoMACS Pro；Miltenyi Biotec)使用CD14微珠(MiltenyiBiotec)通过正选择从PBMC中分离单核细胞。
CD4+和CD8+ T细胞在体外分化
将静止的初始CD4+ T细胞以1.5x106/mL铺板，用Dynabeads人类T-激活剂抗CD3/抗CD28珠(Gibco；目录号1131D)刺激并用适当的T辅助分化培养基培养数小时(激活的初始CD4+ T细胞)或数天(效应CD4+ T细胞)。T辅助分化培养基由完全培养基加上T辅助特异性细胞因子组成，完全培养基包含RPMI 1640和GlutaMAX-I(Gibco)，补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(Gibco)、1％(v/v)非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素。Th1细胞因子：20IU/mL重组IL-2(目录号130-097-744)、10ng/mL重组IL-12(目录号130-0976-704)、2μg/mL中和抗IL-4(目录号130-095-753)。Th2细胞因子：100IU/mL重组IL-2、10ng/mL重组IL-4(目录号130-093-919)、2μg/mL中和抗IL-12(目录号130-095-755)和抗IFN-γ(目录号130-095-743)。Th17细胞因子：10ng/mL重组IL-1b(目录号130-095-374)、10ng/mL IL-6(目录号130-095-365)和10ng/mL IL-23(目录号130-095-757)、1ng/mL重组TGF-β1(目录号130-108-971)、2μg/mL中和抗IL-12、抗IL-4抗IFN-γ(Miltenyi Biotec)。将静止的初始CD8+ T细胞以1.5x106/mL铺板，用Dynabeads人类T-激活剂抗CD3/抗CD28珠刺激，并在补充有20IU/mL重组IL-2的完全培养基中培养数天(效应CD8+ T细胞)。将细胞在37℃在5％CO2加湿培养箱中维持，每2-3天计数和分开一次。
体外功能障碍的CD4+和CD8+ T细胞
功能障碍的长期刺激的CD4+和CD8+ T细胞如66中所述产生，稍加修改。简言之，初始CD4+ T细胞被激活并分化为Th1表型，而初始CD8+ T细胞用补充有20IU/mL重组IL-2的完全培养基激活，每2天一次对T细胞计数并将T细胞暴露于刺激性抗CD3/抗CD28珠。测试功能障碍的长期刺激的T细胞的增殖减少、PD-1标志物增加和用谱系特异性细胞因子的细胞内染色评估的T细胞效应特性。免疫抑制的CD4+ T细胞如67中所述产生，简言之，初始CD4+ T细胞被激活以分化为Th1，持续4天，用50ng/mL TGF-β培养24-72小时。免疫抑制的T细胞的效应特性用谱系特异性细胞因子的细胞内染色进行测试。
T细胞处理
静止的初始CD4+ T细胞用放线菌素D 5μg/mL(Merck；目录号A9415)处理16小时，如68中所述。使用以下免疫抑制药物进行TCR信号通路抑制：雷帕霉素(100nM；Merck；目录号R8781)用于mTORC1，环孢素A(0.5μg/mL；Merck；目录号C3662)用于钙调磷酸酶途径，地塞米松(1μM；Merck；目录号D4902)用于NF-κB途径。静止的初始CD4+ T细胞用上述药物预处理2小时，然后在存在不同抑制剂的情况下，在Th1培养基中用Dynabeads人类T激活剂抗CD3/抗CD28珠刺激；激活后2h、4h、8h收集T细胞。另外，被激活并在Th1培养基中培养72h的初始CD4+ T细胞用药物处理48h。检测处理的细胞的存活力，并评估处理功效。
敲低实验
使用FANA(2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核酸，https://www.aumbiotech.com)-反义寡核苷酸(ASO)进行敲低实验。对于GTF2F1、核仁蛋白、MATR3和PTBP1 mRNA，使用四种ASO；对于IRF4mRNA，使用两种FANA-ASO。对于LINE1 RNA，针对LINE1共有序列的ORF2区域设计了五种ASO，而对于HIRA.L1或RAB22A.L1，针对LINE1转录物的独特和特异性序列部分设计了三种ASO。不相关的加扰(scramble，Scr)ASO用作对照。将ASO以等摩尔比例混合，并按照制造商的说明在没有任何转染试剂的情况下(通过gymnosis)以10μM的最终浓度施用。从健康供体分离的静止的初始CD4+ T细胞在补充有200IU/mL重组IL-2和10μM ASO的完全培养基中培养48h；用ASO处理的初始CD4+在Th1培养基中并在存在10μM ASO的情况下用抗CD3/抗CD28珠激活，16h(激活的CD4+)或7天(效应CD4+)后收集T细胞。长期刺激的CD4+ T细胞从第2天开始用10μM ASO处理，并在第9天收集用于随后的LINE1敲低分析，另外从第6天开始对CD4+ T细胞进行48h的IRF4敲低处理。从肿瘤样品分离的记忆CD4+和CD8+ T细胞在补充有200IU/mL重组IL-2和10μM ASO的完全培养基中培养48h。ASO处理48h后，对细胞进行表面标志物染色，并且杀伤其他细胞的T细胞被激活另外48h并进行细胞内细胞因子染色。通过RT-qPCR和/或RNA-FISH以及蛋白质印迹或FACS分析检测敲低效率(如下所述)。
T细胞表面和细胞内染色及增殖测定
表面标志物染色通过在37℃用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μL抗体/5x104个细胞孵育30min来进行。在PBS中洗涤T细胞，并且然后进行分析。使用以下抗体：抗CD279(PD-1)-Alexa Fluor 488(BioLegend；克隆：EH12.2H7)、抗CD366(TIM3-1)-BV650(BioLegend；克隆：F38-2E2)和抗CD223(LAG-3)-BV785(BioLegend；克隆：11C3C65)。对于细胞内细胞因子和转录因子染色，在37℃用50ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和0.5μg/mL离子霉素刺激5x104个T细胞2h，随后在37℃添加100μg/mL布雷菲德菌素A(Merck)，持续另2h。根据制造商的说明，在4℃用Foxp3转录因子固定/透化试剂盒(Invitrogen,LifeTechnologies)洗涤、固定和透化细胞30min。通过在RT用透化缓冲液(Invitrogen,LifeTechnologies)中稀释的1μL抗体/5x104个细胞孵育20min对细胞因子和转录因子进行染色。在PBS中洗涤T细胞，并且然后进行分析。对于细胞内染色，使用以下抗体：抗IFN-γ-V450(克隆：B27)、抗GrzB-FITC(克隆：GB11)、抗PerfA-APC(克隆：deltaG9)、抗PerfA-PE(克隆：deltaG9)、抗T-bet-V450(克隆：O4-46)(BD Biosciences)。对于MATR3、PTPB1和IRF4FACS染色，将T细胞如上所述在4℃固定并透化30min。然后在RT将细胞用透化缓冲液(Invitrogen,Life Technologies)中稀释的1μL一抗/5x104个细胞孵育1小时。在PBS中洗涤T细胞，并在RT用二抗染色30min。在PBS中洗涤T细胞，并且然后进行分析。使用以下一抗：抗MATR3(Abcam目录号Ab151714)、抗PTBP1(Abcam目录号Ab133734)和抗IRF4(BioLegend目录号646412)。使用以下二抗：山羊抗兔-Alexa Fluor 488(Invitrogen LifeTechnologies)和山羊抗大鼠-Alexa Fluor 647(Invitrogen LifeTechnologies)。使用cell trace(C34557)在长期刺激的细胞中进行增殖测定，在37℃将初始CD4+和CD8+ T细胞与磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μL cell trace/1x106个细胞一起孵育20min。然后在37℃用10％FBS洗涤细胞5min，并且如上所述激活，激活后7天评估增殖。对于所有上述分析，用FACSCanto I(BD Biosciences)采集平均104个细胞，并使用FlowJo v.10软件分析数据。
杀伤测定
将用ASO处理的功能障碍的长期刺激的效应CD4+和CD8+ T细胞与异源单核细胞以1:1的比例共培养12小时。将用FANA-ASO处理48小时的浸润NSCLC或CRC的CD4+和CD8+记忆T细胞与异源单核细胞以1:1的比例共培养12小时。共培养后，将细胞在RT用LIVE/DEAD可固定的绿色死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Life Technologies；目录号L34969)染色20min，在PBS中洗涤并用CD14-APC(克隆：M5E2)染色以识别单核细胞。单核细胞被鉴定为CD14阳性，并且它们的存活力被评估为死亡单核细胞的％。用FACSCanto I(BD Biosciences)采集平均104个细胞，并使用FlowJo v.10软件分析数据。
RNA分离和qRT-PCR
根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)加QIAshredder(QIAGEN)分离总RNA。在提取期间，使用无RNA酶的DNA酶组(RNase-free DNase Set，QIAGEN)进行DNA酶消化。按照制造商的说明，使用SuperScript III第一链合成SuperMix试剂盒(Invitrogen,Life Technologies)对总RNA进行逆转录。使用Power SYBR Green PCR Master mix(Applied Biosystem,Life Technologies)在StepOnePlus实时PCR系统(AppliedBiosystem,Life Technologies)上进行实时定量PCR。将所有基因表达数据针对两个独立的看家基因(18S、GAPDH)归一化。归一化Ct值计算为2-dCT或2-ddCt。对于放线菌素D处理，加标(spike-in)黑腹果蝇(D.Malanogaster)RNA用于归一化。
RNA-FISH和RNA FISH加免疫荧光
RNA-FISH和组合RNA-FISH-免疫荧光如69进行。简言之，使用MAXIscript T7转录试剂盒(Invitrogen)和生物素RNA标记混合物(Roche)体外转录用于LINE1、AluY和HERVK的反义生物素化RNA探针(riboprobe)。每次实验使用50-100ng反义生物素化RNA探针。3％多聚甲醛(PFA)固定的T细胞用PBS中0.05％Triton-X-100洗涤，用PBS中0.5％Triton-X-100透化，并在20％甘油/PBS中维持。用干冰冷冻和解冻细胞，并用0.1M HCl脱蛋白。T细胞与RNA探针在52.5℃杂交3.5min，并在水浴中在37℃孵育过夜。用2X SSC中50％甲酰胺、2X SSC、1X SSC和4X SSC/0.2％Tween-20洗涤玻片。将T细胞在BSA中封闭，并且然后与TNT/BSA(DEPC中0.1M TrisHCl pH 8、0.150M NaCl、0.1％NP-40、4％BSA)中稀释的链霉亲和素HRP(1:1000；Perkin Elmer,Akoya Biosciences)一起孵育。用TNT洗涤T细胞4次，并用1x扩增缓冲液中的TSA工作溶液(1:150)(TSAPlus荧光试剂盒Cy3.5(Perkin Elmer))孵育3min来放大信号。用TNT洗涤T细胞4次，细胞核用1μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。将玻片以prolong Diamond抗淬灭封固剂(antifade prolong Diamond mounting)封固。当RNA-FISH与免疫荧光偶联时，在4℃在2％BSA/10％山羊血清/0.1％Tween/PBS中将T细胞与针对H3K4me3 1:250(Millipore 07-473)、H3K36me3 1:250(Abcam，目录号9050)和H3K9me31:500(Abcam，目录号Ab8898)的一抗一起孵育过夜。使用与Alexa Fluor 647缀合的二抗。图像用带有HCX PL APO 63x/1.40-NA-油浸物镜的Leica TCS SP5共聚焦显微镜获得，并在随机选择的视野中用0.3μm Z堆叠(stacks)进行采集。
RNA FISH信号定量
为了对3D重建细胞核中RNA信号的平均荧光强度定量，用NIS-Elements软件(Nikon)分析图像。在“总体分析”中，生成DAPI信号的掩模以识别单个细胞核，并且然后对每个细胞核中的RNA信号进行“3D测量”。为了测量RNA和组蛋白标记信号的共定位，使用ImageJ软件通过命令“共定位阈值”来检测每个细胞核的Pearson相关性。
对LINE1转录物的单分子RNA FISH(smRNA FISH)及相对定量
使用HuluFISH技术进行单分子RNA FISH(smRNA-FISH)。反义RNA探针由Pixelbio针对HIRA.L1或RAB22A.L1 LINE1转录物的特定和独特区域进行设计，它们被合成为在针对RAB22A.L1的ATTO-568和针对HIRA.L1的ATTO-647中进行直接标记。将静止的初始CD4+ T细胞、8h激活的CD4+ T细胞或HIRA.L1或者RAB22A.L1转录物被敲低的初始CD4+T细胞接种在聚赖氨酸玻片上，并在4％PFA中固定，用135mM甘氨酸洗涤，并在70％EtOH中保持过夜。然后将T细胞在20％甘油中冲洗1h，并且然后用0.01N HCl中0.025％胃蛋白酶处理3.5min。然后将T细胞与20％甲酰胺/2X SSC/10％硫酸右旋糖酐中1:40稀释的针对RAB22A.L1的探针和10％甲酰胺/2X SSC/10％硫酸右旋糖酐中1:40稀释的针对HIRA.L1的探针杂交，并与RNA探针在水浴中在37℃孵育过夜。对于HIRA.L1探针，在10％甲酰胺/2X SSC中洗涤玻片5min 3次，对于RAB22A.L1探针，在20％甲酰胺/2X SSC中洗涤玻片5min 3次并用2X SSC洗涤5min，细胞核用1μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。将玻片以prolong抗淬灭玻片封固介质(antifade prolong glass mounting media)封固。我们在Eclipse Ti-E(NikonInstruments)Plan Apoλ物镜显微镜100x油(Nikon)上检查了smRNA FISH。我们在随机选择的视野收集了0.3Z堆叠，每个个体分析了至少90个细胞，并由对实验取样不知情的人计数每个细胞的点数。
TSA RNA FISH联合DNA FISH
TSA RNA FISH联合DNA FISH方案改编自70和69,71。针对HIRA.L1或RAB22A.L1的反义TEG-生物素化寡核苷酸由Eurofins Genomics合成，使用相同序列的smRNA FISH探针。将静止的初始CD4+ T细胞在4％ PFA中固定，用PBS中0.05％ Triton-X-100洗涤，用PBS中0.5％ Triton-X-100透化，并在20％甘油/PBS中维持过夜。用干冰冷冻和解冻细胞，用0.1MHCl和0.01N HCl中0.025％胃蛋白酶脱蛋白。悬浮在20％甲酰胺/2X SSC/10％硫酸右旋糖酐中的T细胞与针对RAB22A.L1的1-6ng生物素探针杂交，并且悬浮在10％甲酰胺/2X SSC/10％硫酸右旋糖酐中的T细胞与针对HIRA.L1的1-6ng生物素探针杂交，并在水浴中在37℃孵育过夜。用2X SSC中50％甲酰胺洗涤玻片，用TBN/BSA(DEPC中0.1M TrisHCl pH 8、150mMNaCl，4％ BSA)在BSA中封闭，并且然后与TNT/BSA(DEPC中100mM TrisHCl pH 8、150mMNaCl，0.2％ Tween-20、4％ BSA)中稀释的链霉亲和素HRP(1:10000；Perkin Elmer,AkoyaBiosciences)一起孵育。用TNT洗涤T细胞3次，并用1x扩增缓冲液中的TSA工作溶液(1:300)(TSAPlus荧光试剂盒Cy3.5(Perkin Elmer))孵育5min来放大信号。T细胞用TNT洗涤3次，用4％ PFA后固定2min，并且然后在50％甲酰胺/2X SSC中维持至少10小时。针对HIRA或RAB22A的DNA探针通过BAC(HIRA：RP11-1057H19；RAB22A:RP11-452017，BACPAC Chori)的切口平移(nick translation)来制备并用地高辛-11-dUTP标记，如69中报道的。T细胞在75℃杂交5min，并在水浴中在37℃孵育过夜。用2X SSC、0.1X SSC洗涤玻片，并在4X SSC/0.2％Tween-20中冲洗。将T细胞在BSA中封闭，并且然后与4X SSC/0.2％ Tween-20/4％ BSA中稀释的抗地高辛-488(1:150；Vector Laboratories DI-7488)一起孵育。在4X SSC/0.2％Tween-20中洗涤T细胞3次，并且然后细胞核用1μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。将玻片以prolong抗淬灭玻片封固剂(antifade prolong glass mounting)封固。我们在Eclipse Ti-E(Nikon Instruments)Plan Apoλ物镜显微镜100x油(Nikon)上检查了TSARNA FISH联合DNA FISH，在随机选择视野以0.3μm Z堆叠进行。
CRISPR-Cas9介导的对静止的初始CD4+ T细胞中LINE1元件的缺失
对于LINE1元件基因组缺失，我们使用了两种不同的靶向重复元件的侧翼位点的sgRNA，因此我们为每个靶序列(即ARCP2.L1和IFNGR2.L1中包含的LINE1)设计了两种sgRNA。我们在静止的初始CD4+ T细胞中核转染了Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物。对于每种sgRNA，我们以1:3的比例通过轻轻混合40μM Alt-R S.p.HiFi Cas9核酸酶V3(IDT,目录号1081061)和120μM sgRNA(Merck)来制备Cas9-sgRNA复合物，允许复合物在37℃形成15分钟。将两种Cas9-sgRNA复合物添加到已重悬于20μL原代细胞核转染溶液(P3原代细胞4DNucleofector X试剂盒S，Lonza)中的1x106个初始CD4+ T细胞；先前已经分选了静止的初始CD4+ T细胞，并在补充有200IU/mL重组IL-2的完全培养基中维持培养24h。将Cas9-sgRNA复合物和初始CD4+ T细胞转移到核转染杯条(Nucleofection cuvette strips)(P3原代细胞4D Nucleofector X试剂盒S，Lonza，目录号LOV4XP3032)中，并使用4D Nucleofector(4DNucleofector，Lonza)和EH115脉冲程序进行电穿孔。核转染后，将细胞重悬于补充有200IU/mL重组IL-2的完全培养基中，并在37℃在5％ CO2加湿培养箱中保持培养4天。通过用GoTaq G2 Flexi DNA聚合酶对从核转染的初始CD4+ T细胞纯化的基因组DNA进行PCR来评估缺失。将引物设计成在IFNGR2.L1和ARCP2.L1上sgRNA位置之前和之后。对PCR产物进行TA克隆和Sanger测序，类似于72。
蛋白质提取和蛋白质印迹分析
组蛋白提取方案和随后的蛋白质印迹分析如73中的进行。简言之，将1.5x106个T细胞在胞质溶胶提取缓冲液(10mM HEPES KOH pH 8、10mM KCl、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、0.1mM DTT、1×蛋白酶抑制剂)中裂解并在1500g和4℃收集细胞核，用等体积的胞质溶胶提取缓冲液洗涤三次，并在4℃在转轮(wheel)上重悬于0.2N HCl中过夜。组蛋白提取物通过在4℃在16300g离心10min来收集。核蛋白提取如73中的进行。简言之，将1x106个T细胞在胞质溶胶提取缓冲液(10mM HEPES KOH pH 8、1.5mM MgCl2、10mM NaCl、1mM DTT、10％甘油、1×蛋白酶抑制剂)中裂解，在1200g和4℃收集细胞核，用等体积的胞质溶胶提取缓冲液洗涤三次，并重悬于补充有2mM CaCl2和20U MN酶的核缓冲液(10mM HEPES KOH pH 8、1.5mMMgCl2、300mM NaCl、1mM DTT、0.2％ NP-40、10％甘油、1×蛋白酶抑制剂)中，并在37℃保持30min。总蛋白提取如68中的进行。用Qubit(Invitrogen)荧光计对蛋白质提取物定量，并用于随后的蛋白质印迹分析。1-5μg组蛋白提取物用于蛋白质印迹，同时20-40μg核提取物或总提取物用于蛋白质印迹。在4％-12％ Bolt Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分离蛋白质，并通过湿转移转移到硝酸纤维素膜中。封闭膜并在4℃与以下一抗一起孵育过夜：H3K4me3(Millipore，目录号07-473)、H3K9me3(Abcam，目录号Ab8898)、H3K36me3(Abcam，目录号Ab9050)、H3K27me3(Millipore，目录号07-449)、H3(Abcam，目录号Ab1791)、抗rpS6(CellSignaling，目录号D68F8)、抗核仁蛋白(Abcam目录号Ab22758)、抗PTBP1(Abcam目录号Ab133734)、抗KAP1(Abcam目录号Ab22353)、抗IRF4(Abcam目录号)、抗β微管蛋白(Abcam目录号Ab6046)。用适当的与HRP偶联的二抗处理膜，并使用West Dura试剂盒(PierceRockford，USA)通过化学发光进行显影。用对发射光具有线性响应的光敏CCD(电荷耦合器件)相机(Las 3000)检测膜。用ImageJ软件使用命令“分析-凝胶-选择泳道-绘图泳道”测量蛋白质条带的密度。将结果针对内部上样对照(H3)归一化，并以相对于对照的富集倍数表示。
免疫共沉淀(Co-IP)
对核提取物进行Co-IP测定，如73中所述，稍作修改。将CD4+ T细胞的沉淀物重悬于胞质溶胶提取缓冲液(10mM HEPES、5mM MgCl2、0.25mM蔗糖、0.1％ Np-40、1x蛋白酶抑制剂)并在冰上孵育5min，以300g收集细胞核10min，并重悬于核提取裂解缓冲液(10mMHEPES、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、300mM NaCl、0.5％ Triton X-100、25％甘油、1x蛋白酶抑制剂)。然后声处理(具有3.2mm锥形微尖端的BRANSON A250；以20％振幅、30％占空比的1min的一个循环)细胞核悬浮液，并通过在4℃以16300g离心10min来收集细胞核提取物。用Dynabeads蛋白A/G预清洁蛋白质，用Qubit(Invitrogen)荧光计定量，并用于随后的Co-IP分析。通过将600μg蛋白质与4μg抗核仁蛋白抗体(Abcam目录号Ab22758)和8μg抗KAP1抗体(Abcam目录号22353)在4℃在转轮上孵育过夜，对核提取物进行免疫沉淀。在4℃在转轮上用磁性Dynabeads蛋白A/G(Invitrogen)回收免疫复合物2h。珠用600μL低盐缓冲液(10mMHEPES、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、150mM NaCl、0.1％ Triton X-100、5％甘油)洗涤一次，用高盐缓冲液(10mM HEPES、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、300mM NaCl、0.1％ Triton X-100、5％甘油)洗涤一次，并用低盐缓冲液再洗涤一次。样品在洗脱缓冲液(5％ SDS、1X上样缓冲液、10mM DTT)中洗脱，并用于蛋白质印迹分析。
RNA免疫沉淀(RIP)
静止的和16小时激活的初始CD4+ T细胞在1％甲醛中交联。将交联的细胞在核分离缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、5mM MgCl2、320mM蔗糖，1％ Triton X-100)中裂解，用dounce匀浆并在冰上保持10min。在2500g离心细胞核15min，并重悬在RIP缓冲液(25mMTris-HCl pH 7.4、150mM KCl、5mM EDTA、0.5mM DTT、0.5％ NP-40、0.5％ SDS、100U/mLRNA酶抑制剂)中，并剪切(具有3.2mm锥形微尖端的BRANSON A250；以20％振幅、30％占空比的1min的一个循环)。通过在4℃在16300g离心10min来收集核提取物。将对应于1-3x106个细胞的量的核提取物与4μg抗核仁蛋白(Abcam目录号Ab22758)和8μg抗PTBP1(Abcam目录号Ab133734)以及抗GTF2F1(Abcam目录号Ab28179)在4℃在转轮上孵育过夜。在4℃在转轮上用磁性Dynabeads蛋白A/G(Invitrogen)回收免疫复合物2h。将珠用600μL RIP缓冲液洗涤三次并用PBS洗涤1次。交联逆转通过在55℃在NT2缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4、150mMNaCl、1mM MgCl2、0.05％NP-40、1％ SDS、1.2mg/mL蛋白酶K)中孵育免疫复合物2h来进行。通过TRI-试剂纯化RNA，并在提取期间用Turbo无DNA试剂盒(Invitrogen)进行DNA酶消化。
染色质和核质RNA提取
细胞分级如74中的进行，稍作修改。简言之，将5-10x106个静止的初始CD4+ T细胞重悬于60μL缓冲液A(10mM HEPES pH 7.5、10mM KCl、10％(v/v)甘油、340mM蔗糖、4mMMgCl2、1mM DTT、1X蛋白酶抑制剂混合物(PIC))，添加等体积的缓冲液A0.2％(v/v)TritonX-100，并在冰上裂解T细胞12min。将T细胞在4℃以1200g离心5min，收集代表胞质RNA级分的上清液。将细胞核沉淀物在120μL NRB缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、50％(v/v)甘油、75mMNaCl、1mM DTT、1X PIC)中在4℃以900g洗涤5min，并重悬在60μL NRB缓冲液中，添加等体积的NUN缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、300mM NaCl、1M尿素、1％(v/v)NP-40、1mM MgCl2、1mMDTT)，并在冰上裂解T细胞5min。将裂解物在4℃以1200g离心5min，收集代表核质RNA级分的上清液。将染色质沉淀物在500μL缓冲液A中在4℃以1200g洗涤5min，并且然后将沉淀物重悬于50μL缓冲液A，代表染色质RNA级分。使用Maxwell RSC miRNA组织试剂盒(Promega，目录号AS1460)按照制造商的说明提取总RNA、核质和染色质相关RNA，稍作修改。
RNA文库制备与测序
用TapeStation(高灵敏度RNAScreentape测定)检查RNA完整性，并使用15-75ng总RNA来制备文库。RNA用RiboGone-Mammalian(TaKaRa，目录号634846)按照制造商的说明进行RNA消耗(ribodeplete)，并用SMARTer Stranded RNA-Seq试剂盒(TaKaRa，目录号634836)按照制造商的说明制备文库。文库在Illumina NextSeq 500上按100bp或150bp配对测序。制备以下的RNA-seq文库：i)来自静止的CD4+初始T细胞的染色质和核质RNA(4个个体)；ii)来自静止的初始CD4+ T细胞和在Th1培养基中用抗CD3/抗CD28珠激活16小时的初始CD4+ T细胞的总RNA(3个个体)。
RNA-seq数据集的处理和比对
对测序和公开可用的RNA-seq样品进行统一处理和比对。CD8+初始(GSM3591829、GSM3591834)和激活的(GSM3591826、GSM3591831)T细胞从Bediaga等人检索，小鼠胚胎干细胞从ENCODE Project Consortium检索(GSM2400249、GSM2400250)，并且胸腺细胞样品从Buratin等人检索(GSM4222226、GSM4222227、GSM4222228、GSM4222229、GSM4222230)。值得注意的是，这些数据集被准确地选择，以便与当前研究中产生的数据集(即总RNA提取和文库制备，分析的文库的读段长度)具有可比性。使用FastQC v0.11.3检查Fastq文件的读段质量。来自BBMap v38.51的BBDuk算法用于从读段对中去除衔接子(ktrim＝r k＝23mink＝11hdist＝1tpe tbo)，丢弃与保存的人类核糖体RNA序列(NCBI登录：U13369.1)匹配的rRNA来源的读段(k＝31hdist＝1)并从读段对修剪(trim)掉低质量碱基。使用质量合格的读段对用于使用STAR v2.5.4a(--outFilterScoreMinOverLread 0.3--outFilterMatchNminOverLread 0.3--outFilterMatchNmin 0--outFilterMismatchNmax10--winAnchorMultimapNmax 200--outFilterMultimapNmax 200)针对人类参考基因组的hg38组装或小鼠参考基因组的mm10组装进行比对，使用来自GENCODE版本25人类或GENCODE版本M21小鼠GTF文件的注释用作剪接连接点(splice junctions)数据库。
主成分分析(PCA)
对一组综合转录单元进行PCA分析，这些转录单元包括关于人类基因组(hg38)的来自GENCODE版本25的50,596个基因和来自UCSC Repeat Masker的1180个重复序列亚家族。使用HTSeq v0.12.4(htseq-count-s yes--nonunique all)在比对的读段上生成每个基因计数数据，并如下所述生成每个重复序列亚家族计数(参见“RNA-seq数据集中TE亚家族表达定量”小标题)。使用DESeq2对方差稳定转化(vst)归一化RNA-Seq数据进行PCA。使用R软件包ggbiplot版本0.55生成PCA图。
RNA-seq数据集中TE亚家族表达定量
转座元件的定量在类别(n＝8)、超家族(n＝112)和亚家族(n＝1180)水平上进行，如UCSC RepeatMasker对类基因组(hg38)所注释的。使用来自BedTools 2.29.2的intersectBed(用“-split”参数)将读段与UCSC Repeat Masker注释相交，并将以链特异性方式与重复序列重叠至少10bp的读段用于计数。为了减轻多重映射读段对计数的影响，对与同一亚家族的多于一个重复基因座重叠的读段计数一次，并在超家族和类别水平上进行同样的计数。此外，读段对被计为单个单元。这允许对长重复区域和短重复区域进行无偏计数。使用DESeq2计算所有类别、超家族和亚家族的归一化读段计数。
从头重建含有LINE1的新转录物
静止的初始CD4+ T细胞染色质区室中包含LINE1的转录物的综合目录通过组合用于从头转录物组装的两种不同的方法来产生。简言之，将来自4个生物重复的以正确对(samflags 99、147、83和163)映射的染色质RNA-seq读段汇集在一起，总计共1.13亿个正确读段对。为了以更高的置信度重建包含TE的转录物，使用了两种独立的算法：Trinity 2.8.4 75，以基因组引导模式(--SS_lib_type FR--genome_guided_bam--genome_guided_max_intron 10000--genome_guided_min_reads_per_partition 3)串联PASA2.3.3 76(-C-R--ALT_SPLICE--ALIGNERS blat,gmap--CPU 1--transcribed_is_aligned_orient)和StringTie 2.0 77(--rf-a 3)。单外显子转录物从进一步分析中移除，如在78,79中已经进行的，以过滤掉由于转录噪声或低聚合酶保真度产生的可能的伪转录物，此外，它们难以进行生物信息学评估，并且需要大量的人工处理。选择与TE(UCSC Repeatmasker)相交的多外显子转录物。为了获得新的且一致的非冗余转录物目录，只选择了那些共享由两个装配器鉴定的含TE的外显子(intersectBed-f 0.8-r-s)的转录物。通过使用StringTie(merge-i-f0)合并所选择的转录物，获得一组统一的TE转录物。使用gffcompare 0.11.2对照来自GENCODE版本25GTF文件的转录物对TE转录物进行注释。最后，在外显子和LINE1基因座之间具有至少20bp重叠的从头重建的TE转录物被注释为包含LINE1的转录物，检索到3072个转录物。在其基因组位置内含有LINE1转录物的基因在下文被称为“含有LINE1的基因”。
新的LINE1转录物的表达定量
我们使用Salmon 1.1.0(用默认参数以选择性比对模式)估计LINE1转录物的表达，以使相似和部分重叠的典型转录亚型的混杂效应最小化，并包括多映射读段。使用参考转录组构建salmon索引，所述参考转录组包括来自GENCODE版本25的转录物和重建的TE转录组(参见“从头重建含有LINE1的新转录物”小标题)两者。
新的LINE1转录物的过滤
首先，我们过滤了在4个重复中的至少3个中在初始CD4+ T细胞中与核质级分相比在染色质级分中表达更多(TPM值更高)，并且在3个重复中的至少2个中与初始CD4+ T细胞相比在激活的T细胞中表达较少(TPM值较低)的LINE1转录物，检索到1884个特异性富集于初始CD4+ T细胞染色质的含有LINE1的转录物。通过使用来自bedtools 2.29.2的intersectBed将1884个包含LINE1的转录物与来自GENCODE版本32的已知转录物相交，将这1884个包含LINE1的转录物分配到基因间区域或转录单元(基因)。如果独特的基因或基因间区域的分配是不可能的，该基因被归类为“不明确的(ambiguous)”。我们发现1884个转录物中有1647个注释到已知的转录单元，81个是基因间的，并且156个是不明确的(另参见“LINE1转录物表征”小标题)。在与转录单元相交的1647个转录物中，112个被分配到非编码基因，并且1535个被分配到蛋白质编码基因，其中1469个处于相同的方向(对于与编码和非编码GENCODE转录单元两者相交的LINE1转录物，蛋白质编码转录物用于分配)。1469个转录物中的1013个转录物在新的LINE1转录物的开始部分(前两个外显子之一)或结束部分(后两个外显子之一)具有含有LINE1的外显子。此外，在1013个含有LINE1的转录物中，我们选择了那些具有平均H3K36me3信号是平均H3K9me3信号两倍的含有LINE1的外显子的转录物，作为该染色质区域转录的证据80, 81。H3K36me3和H3K9me3信号通过处理RoadmapEpigenomics pre-aligned ChIP-seq数据获得(参见ChIP-seq数据分析)。最后，我们丢弃了其LINE1外显子延伸并与宿主基因的UTR重叠的LINE1转录物，作为已经注释的转录物的可能伪象(artefacts)。这种策略导致鉴定出461种新的LINE1转录物。
LINE1转录物表征
使用Fisher精确检验对照人类基因组(hg38)中存在的所有132个LINE1亚家族的基因组分布(如UCSC RepeatMasker中所注释的)对新鉴定出的461个LINE1转录物进行LINE1亚家族富集分析(参见扩展数据图4c、图4d)。基于LINE1基因座在L1.4(GenBank登录号L19092.1)上的比对，对LINE1基因座的LINE1特征(5’UTR、ORF1、基因间、ORF2和3’UTR)进行了注释。L1.4序列是使用L1Xplorer注释的，使用blastn将LINE1基因座与L1.4进行比对。为了捕获所有可能与L1.4序列演化相似或趋异的LINE1基因座，blastn用两组不同的参数进行：一组用于密切相关的序列(-word_size 4-gapopen 5-gapextend 2-reward 2-penalty-3-dust no-soft_masking false)，并且另一组用于趋异的序列(-word_size 4-gapopen 8-gapextend 6-reward 5-penalty-4-dust no-soft_masking false)。LINE1基因座覆盖率最高的Blast命中被选为最佳命中，并根据它们在L1.4序列上的比对位置对LINE1特征进行注释(参见扩展数据图4f)。在五个重复中的至少三个中检测到带有PAS的LINE1转录物被认为是多腺苷酸化的(参见扩展数据图4g)。在461个LINE1转录物中检索剪接基序共有序列。使用WebLogo 3.7.4生成LINE1转录物开始或结束处包含LINE1的外显子的边界处的共有序列的序列标志表示(参见扩展数据图4h)。
LINE1转录物的PCR验证
用GoTaq G2 Flexi DNA聚合酶(Promega，目录号M7806)通过PCR验证LINE1转录物。对初始CD4+ T细胞cDNA进行PCR反应(使用RT minus来验证新转录变体的剪接)。针对IFNGR2.L1、MED23.L1、HIRA.L1、EED.L1、ASH2L.L1、ARCP2.L1、DDX6.L1、RAB22a.L1转录物和相应的典型mRNA设计引物。PCR扩增子通过在1.6％琼脂糖凝胶上电泳来检测。所有的转录物在至少3个不同的个体中验证。
RNA-seq数据集中基因表达的定量和检测
使用HTSeq v0.12.4(htseq-count-s yes--nonunique all)对照GENCODE版本25使用比对的读段生成每个基因的读段计数，并使用映射在基因模型坐标内的读段总数作为文库大小将该读段计数归一化为每千碱基每百万片段(fragments per kilobase permillion，FPKM)。在所有定量的基因中选择含有LINE1的基因的表达值。
Ingenuity Pathway分析
将407个含有LINE1的基因包括在使用Ingenuity Pathway分析(Systems,www.ingenuity.com)进行的网络分析中。包含LINE1的基因标识符的列表被上传到该应用程序中。每个基因标识符被映射到其在Ingenuity Pathways Knowledge Base中相应的基因对象，并称为焦点基因。对于网络的生成，考虑每个网络70个基因和显著性评分>40。网络表示关于基因的亚细胞定位，并且连接性基于直接(连续线)和间接关系(虚线)。在图形表示中，基因表示为节点，并且两个节点之间的生物学关系表示为边。
纳米孔cDNA文库制备与测序
使用PCR-cDNA条形码化试剂盒(Oxford Nanopore Technologies，UK)并按照制造商的指南，从75ng染色质RNA开始制备文库。来自三个独立样品的RNA被单独处理和条形码化，并且最终的文库被汇集在一起用于测序运行。文库质量和平均大小由TapeStation(Agilent,CA,USA)检查。使用MinION平台和R9.4.1流通池(Oxford NanoporeTechnologies)进行测序。
纳米孔测序数据分析
使用Guppy碱基判定(basecalling)软件版本5.0.7将纳米孔cDNA信号处理成多路分解的(demultiplexed)读段，参数为“guppy_basecaller--flowcell FLO-MIN106--kitSQK-PCB109--barcode_kits SQK-PCB109–trim_barcodes”。使用minimap2版本2.17-r941和参数“-ax map-ont”，将来自三个生物重复的读段与含有Gencode v25和重建的含TE的转录物(参见“从头重建含有LINE1的新转录物”小标题)的参考转录组进行比对。通过选择独特对齐的(uniquely aligned)转录物来测试纳米孔数据中LINE1转录物的存在。通过使用bedtools genomecov和参数“-ignoreD–bg”计算覆盖率，将LINE1转录物分成100个箱(bin)，并使用R 3.6.2计算每个箱的平均值和平均值的标准误差，获得使用长读段的LINE1转录物的转录谱。
染色质免疫沉淀(ChIP)
ChIP测定如82中所述进行，稍作修改。静止的和16小时激活的初始CD4+ T细胞在1％甲醛中交联。将交联的细胞在声处理缓冲液(10mM TrisHCl pH 8、2mM EDTA、0.25％SDS，补充有1x完全无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche)和1mM PMSF(Merck))中裂解。剪切(具有3.2mm锥形微尖端的BRANSON A250；以25％振幅、50％占空比的1min的五个循环)染色质，在70V运行的0.9％琼脂糖凝胶上检查。免疫沉淀通过将1.5x平衡缓冲液(10mM TrisHCl pH8、233mM NaCl、0.166％ Na-脱氧胆酸盐、1.66％Triton X-100、1mM EDTA、1X完全无EDTA蛋白酶抑制剂和1mM PMSF)中稀释的25μg染色质与1-2μg抗体(H3K4me3(Millipore，目录号07-473)和H3K36me3(Abcam，目录号Ab9050))在4℃在转轮上孵育过夜来进行。在4℃在转轮上用磁性Dynabeads(蛋白G；Invitrogen)回收免疫复合物2h。将珠用600μL RIPA低盐(10mMTrisHCl pH 8、100mM NaCl、1mM EDTA、0.1％ SDS、0.1％ Na-脱氧胆酸盐、1％ Triton X-100)洗涤两次，用600μL RIPA高盐(10mM TrisHCl pH 8、500mM NaCl、1mM EDTA、0.1％SDS、0.1％ Na-脱氧胆酸盐、1％ Triton X-100)洗涤两次，用600μL RIPA-LiCl(10mMTrisHCl pH 8、250mM LiCl、1mM EDTA、0.5％ Na-脱氧胆酸盐、0.5％NP-40)洗涤两次，并最后用600μL的10mM TrisHCl pH 8洗涤。所有RIPA缓冲液均补充有1X完全无EDTA蛋白酶抑制剂和1mM PMSF。通过将珠在洗脱缓冲液(10mM TrisHCl pH 8、2％ SDS)中于65℃孵育过夜来进行交联逆转。按照制造商的说明，用AMPure XP PCR纯化珠(Beckman Coulter)纯化免疫沉淀的DNA。使用用于Illumina的NEBNext Ultra I DNA文库制备试剂盒(NEB)，用25ng纯化的DNA制备DNA文库，不进行尺寸选择并进行8个PCR扩增循环。使用AMPure XP珠纯化文库，在无核酸酶H2O中洗脱并在NextSeq 500平台(Illumina)上以150bp配对测序。
ChIP-seq数据分析
对于LINE1转录物选择，使用ENCODE发表的CD4+初始T细胞的针对H3K36me3(ENCFF152WXT、ENCFF324OZH、ENCFF416GLM、ENCFF783JQO)和H3K9me3(ENCFF197EDP、ENCFF287UWA、ENCFF338SVK、ENCFF753UAT)及其相关输入样品(ENCFF044KMD、ENCFF343ILJ、ENCFF421BMD、ENCFF737YRO)的数据集。使用macs 2.2.6相对于ChIP的对照输入对ChIP进行倍数富集，其中非默认参数“-f BAM-g3049315783-p 1e-2--nomodel--extsize[averagefragment size provided by ENCODE]--keep-dup all-B--SPMR--broad”用于峰判定(callpeak)模块，并且“-m FE”用于bdgcmp模块。使用deeptools 3.4.1bigWigCompare将H3K36me3与H3K9me3相比的富集信号计算为log2比率，以10bp作为箱尺寸。
此外，产生H3K36me3和H3K4me3 ChIP-seq以检查T细胞激活或LINE1敲低中染色质中包含LINE1的基因(参见上文)。将来自技术重复的读段汇集在一起，并使用FastQC0.11.9评估修剪之前和之后的读段质量。使用Trimmomatic 0.39用参数“ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:50”以配对末端模式(paired-end mode)，或用衔接子参考文件“TruSeq3-SE.fa”和与上述相同的参数以单末端模式对低质量碱基判定的读段进行修剪。使用Bowtie1.2.3和参数“-m 1--best--strata-v 3”和仅用于配对末端的“-X 2000--fr”将经修剪的读段与人类基因组组装hg38进行比对。在比对后，使用Samtools1.9去除未正确配对映射的配对末端读段以及重复读段83。使用macs 2.2.6峰判定模块判定ChIP峰，将ChIP靶的比对文件及其相关对照输入提供为输入，其中参数“--keep-dup all-g 3049315783-B-p 0.01”用于H3K4me3和H3K36me3样品，并且“--broad”仅用于H3K36me3，配对末端特异性参数为“-f BAMPE”，并且单末端特异性参数为“-f BAM--nomodel--extsize 200”。使用参数为“-m FE”的macs2 bdgcmp模块，通过从片段堆积中减去背景信号来计算覆盖率轨迹(coverage track)。作为含有LINE1的基因的对照，使用GNU coreutils内置的“shuf”命令从具有至少一个H3K36me3峰的蛋白质编码基因集合中随机取样一组相同数量的基因。通过将基因模型分成40个箱，获得在含有LINE1的基因和对照基因上H3K36me3和H3K4me3的位置分布，同时使用deeptools3.4.1computeMatrix和参数“-m 6000-b 3000-a 3000-bs 150”用150bp长的箱平滑-1.5kb和+3kb侧翼区域，计算重复之间的平均值和基因之间的中位值，并使用R 3.6.2内置的“smooth.spline”函数将三次平滑样条(cubic smoothing spline)拟合到数据中。
基序富集分析
使用来自MEME套件版本5.3.3的AME算法进行基序富集的分析，其中参数“--scoring avg--method fisher--hit-lo-fraction 0.25--evalue-report-threshold10.0--control--shuffle----kmer 2”用于DNA和RNA结合基序两者。在LINE1转录物宿主基因的推定启动子序列上检索由HOCOMOCO Human(v11 CORE)数据库提供的转录因子结合基序。通过使用bedtools版本2.29.2将来自两个生物重复的在宿主基因转录起始位点上游5kb和下游1kb之内发现的H3K4me3峰和H3K27Ac峰交叉获得启动子区域。在蛋白质组学分析中具有log2变化倍数CD8+/CD4+<-2和在RNA-seq数据集中<0的TF被认为是“排名靠前的CD4+特异性TF”。在包含在新转录物的LINE1外显子中的LINE1 RNA序列上检索由Ray等人2013提供的RNA结合蛋白基序(PMID23846655)。
结果
本发明人在此提供了关于在来自外周血的人类T淋巴细胞中、在体外功能障碍/无变应性T细胞中和TIL中LINE1表达的动态变化的观察结果以及它们在CD4+初始T细胞中的鉴定。
LINE1 RNA在CD4+初始T细胞的染色质上表达，并在激活和分化时受mTORC1途径调节。
为了研究TE在人类T淋巴细胞中的表达，我们用RNA FISH和qRT-PCR检测了从健康个体分离的静止的初始和记忆CD4+和CD8+ T细胞中的LINE1、Alu和HERV超家族。我们观察到，LINE1 RNA在静止的初始CD4+ T细胞的细胞核中特异性表达(图1a-图1c)。而Alu RNA在所有T细胞亚群中表现出广泛的核周分布(图9a-图9c)，而HERV RNA表达较少(图9d-图9f)。LINE1 RNA几乎只存在于初始CD4+ T细胞的染色质级分中(图1d和图9g)，并与开放染色质区域关联，如通过与H3K4me3组蛋白标记共定位所确定的(图9h、图9i)。延长的放线菌素D处理中度地影响LINE1 RNA水平，表明这些RNA在初始CD4+ T细胞中没有高速转录(图1e)。然后，我们分析了T细胞激活和分化中的LINE1 RNA动态变化，发现在朝向效应细胞(即Th1、Th2、Th17，图1f和图9j、图9k)分化期间LINE1RNA快速下调并保持在低水平。
我们假设，LINE1 RNA水平受T细胞特异性信号通路的精细调节。因此，我们用靶向mTORC1、钙调磷酸酶或NF-κB途径的不同免疫抑制药物处理激活或分化的CD4+ T细胞(图1g)，发现mTORC1抑制剂雷帕霉素使激活和分化的T细胞中的LINE1 RNA水平恢复(图1h和图9l-图9n)。为了加强这些体外数据，我们探询了在体内LINE1 RNA水平是否受mTORC1抑制的影响。因此，我们研究了从用mTORC1抑制剂依维莫司治疗的肾移植患者和用雷帕霉素类似物西罗莫司21终身治疗的淋巴管平滑肌瘤病(LAM)[MIM:606690]患者20的血液分离的记忆CD4+ T细胞中LINE1的表达。与mTORC1在体外对LINE1 RNA表达的抑制作用一致，我们发现，与健康个体不同，这些患者的记忆CD4+ T细胞重新表达LINE1RNA(图1i-图1k)。因此我们展示，LINE1 RNA在CD4+ T细胞的染色质上被包裹(enfold)，在那里LINE1 RNA在T细胞激活后以mTORC1依赖的方式快速下调。
在初始CD4+ T细胞中表达的LINE1被剪接到细胞激活基因的非典型转录变体中。
为了确定哪些LINE1元件被表达以及LINE1转录物是如何构成的，我们对来自静止的初始CD4+ T细胞的染色质和核质RNA进行了测序。作为初步分析，我们对TE类别、超家族和家族的读段进行计数，并且然后比较了染色质和核质级分中的读段计数。我们证实，在TE类别中，LINE，并且特别是L1M家族(演化上古老，存在于灵长类动物中，并且广泛存在于其他哺乳动物中)表达最多且染色质富集，而L1P和L1H家族表达水平较低且在核质中富集(图10a、图10b)。这一结果与在mESC中发现的结果不同，在mESC中，演化上年轻的、有逆转录转座能力的L1md_T和L1md_A亚家族相对于演化上古老的L1_Mus1和L1_Mus3表达更多(11和图10a、图10b)。在T细胞中，几乎一半的LINE1读段是嵌合的(即映射至LINE1和非重复区域)，并且79％的读段来源于位于蛋白质编码基因中的LINE1(图10d、图10e)，因此最有可能被包含在新的转录变体中。在mESC中，大多数LINE1读段完全来源于具有更宽基因组分布的LINE1元件(图10f、图10g)，从而支持了：相对于人类T细胞，在小鼠发育中表达不同的LINE1。为了鉴定含有LINE1的转录变体，我们应用了使用两种算法Trinity22和StringTie23的从头链基因组引导转录组组装(参见方法)。我们鉴定出3072个包含至少一个含有LINE1的外显子的多外显子转录物。为了获得可靠的LINE1转录物列表，基于它们在不同个体中存在的一致性和LINE1外显子在染色质水平转录的证据(H3K36me3/H3K9me3比率24,25)，我们应用了若干种过滤标准。我们检索到461个LINE1转录物，它们是非典型剪接变体，来源于407个蛋白质编码基因。这些LINE1转录物中的88％的存在可以用对初始CD4+ T细胞的染色质级分进行的长纳米孔读段来验证和准确重建(图11a)，并且通过rt-PCR在从3个不同个体分离的初始CD4+ T细胞中确认了若干个(图11b-图11i)。经剪接的LINE1长度短(平均371bp)，主要是ORF2截短元件，并富含不同的L1M亚家族(即L1ME4a、L1MC4、L1ME4b)(图12a-图12c)；特别是，这些LINE1中的80％位于内含子内(图12d)，并剪接为包含LINE1和内含子片段的新外显子(图12e)。值得注意的是，这些是演化上古老的LINE1元件，代表全长LINE1元件的截短形式，这些元件在演化期间被重塑，结果成为不能逆转录转座并且不编码逆转录转座所需的任何蛋白质的退化元件。事实上，为了展示该观察到的机制独立于逆转录转座机制，我们用3TC抑制剂处理初始CD4+ T细胞，并且我们进行了RNA-FISH，发现LINE1 RNA的染色完全没有改变(图12f)。
图2a示出了代表性LINE1转录物(例如ARPC2)如何被重建。HIRA.L1在初始CD4+ T细胞中的存在和它们在激活时的下调，用单分子RNA-FISH(smRNA-FISH)检测LINE1外显子的独特部分进一步证实(图2b、图2c和图13a)。
为了估算LINE1转录物来源的407个蛋白质编码基因的功能相关性，我们使用IPA(Ingenuity Pathway分析)网络分析，并发现与细胞激活所需的基因(例如，基因表达、细胞信号传导和细胞间相互作用、细胞周期)有直接和一致的关系。总之，上述实验鉴定出一大组细胞激活所需基因的以前未知的非典型转录变体，因此表明这些转录物参与维持CD4+ T细胞静止。
由于LINE1转录物来源于细胞激活基因并位于染色质，我们探询了它们是否可以调节相应蛋白质编码基因(以下称为典型转录物)的表达。首先，我们观察到，LINE1转录物顺式定位在它们的基因组基因座上，如在HIRA和RABB22A的组合DNA-RNA FISH实验中示例的(图2d和图13c)。然后，我们用针对LINE1外显子非重复区域设计的反义寡核苷酸(ASO)消耗初始CD4+ T细胞的HIRA.L1或RABB22A.L1转录物，并发现只有相应的典型转录物被上调(图2e、图2f和图13d)。最后，我们使用含有针对重复序列侧翼的独特区域的sgRNA的Cas9RNP复合物从IFNGR2和ARPC2基因的内含子将LINE1缺失(delete)，并证明在初始CD4+ T细胞中，i)LINE1元件是产生LINE1转录物所必需的，和ii)LINE1转录物的调控作用是严格地顺式的(图2g-图2i和图13e-图13h)。因此，我们的结果表明，LINE1转录物使相应的典型转录物的染色质表达保持暂停。
LINE1转录物与核仁蛋白复合而发挥作用，顺式减少初始CD4+ T细胞中含有LINE1的基因的表达。
我们探询了LINE1转录物如何表观遗传地控制它们所来自的基因的表达。我们通过用LINE1 ASO处理静止的初始CD4+ T细胞48h来敲低LINE1转录物(图3a、图3b)。令人感兴趣的是，我们观察到，含有LINE1的基因的上调发生在LINE1 RNA被敲低的静止的初始CD4+T细胞中(图3c)。
由于LINE1 RNA可以调节染色质浓缩和基因沉默38,49,51，我们探询了LINE1转录物的敲低是否影响静止T细胞的染色质组织(organization)。因此，我们通过对用LINE1 ASO处理48小时的初始T细胞的组蛋白提取物的定量蛋白质印迹73和对该细胞的免疫染色来评估若干种组蛋白标记(即，H3K36me3、H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3)的水平，并且发现LINE1RNA消耗导致H3K36me3显著增加，因此表明染色质朝向活性转录重塑，这发生在没有细胞激活的情况下(图3d和图14a-图14c)。令人感兴趣的是，我们对消耗了LINE1 RNA的初始T细胞进行了H3K36me3 ChIP-seq，并且发现H3K36me3的增加对含有LINE1的基因是特异性的，在T细胞激活时观察到了同样的情况(图3e和图14d-图14h)，因此展示了含有LINE1的基因可以在没有激活的情况下被LINE1转录物阻遏活性释放。
因为已经报道在mESC中核仁蛋白(一种LINE1 RNA结合蛋白86)与LINE1 RNA和Kap1复合以调节细胞身份和2C期分化基因51，我们探询了T细胞中核仁蛋白和LINE1 RNA之间的关系。我们对核仁蛋白进行了RNA免疫沉淀，发现核仁蛋白与LINE1转录物复合(图3h)。令人感兴趣的是，核仁蛋白ASO处理表型模拟(phenocopy)了LINE1 ASO在促进含LINE1基因的转录和H3K36me3增加中的作用(图15a、图15d)。当我们通过用特异性ASO处理静止的初始CD4+T细胞48小时来消耗其核仁蛋白时，LINE1 RNA水平保持不变，但在亚细胞分级后，我们观察到LINE1RNA与染色质的结合减少，表明核仁蛋白参与LINE1 RNA染色质区室化(compartmentalization)。(图3i、图3j和图15e)。最后，我们探询了LINE1RNA调节是否会影响T细胞效应功能。首先，消耗了LINE1 RNA的初始CD4+ T细胞被激活并分化7天成为Th1效应细胞，观察到这些细胞的转录因子Tbet的产生和效应细胞因子IFNγ的分泌加倍(图3k、图3l)；重要的是，在相同的条件下观察到核仁蛋白敲低的相同表型(图3m、图3n)。总之，这些结果表明，LINE1 RNA调节初始CD4+ T淋巴细胞从静止状态到激活状态的转录转换，与核仁蛋白复合地通过H3K36me3染色质重塑作用于染色质。
在CD4+ T细胞中，LINE1转录物受IRF4转录因子调节。
由于LINE1转录物来源于参与细胞激活的基因，我们探询了为何CD8+ T细胞不像发育上接近的CD4+ T细胞那样表达LINE1转录物。因此，我们使用T细胞祖细胞、初始和激活的CD4+和CD8+ T细胞的RNAseq数据分析了461个LINE1转录物和典型转录物的表达(图4a，参见方法)。在所有T细胞前体中，LINE1转录物由初始CD4+独特表达，证实了先前的结果(图4b和图1a-图1c)。令人感兴趣的是，典型转录物也是CD4+ T细胞特异性的：特别是，在激活的CD4+ T细胞中，LINE1转录物被下调，而典型转录物被上调(图4b、图4c和扩展数据图16a、图16b)。然后，我们在RNA-seq和蛋白质组学数据集26中检索在CD4+ T细胞中比CD8+ T细胞中表达更多的转录因子(TF)(参见方法)并且其基序在含有LINE1的基因启动子中富集，这可以解释这些基因座的差异调节。通过这一分析，我们将IRF4排在第一位，我们发现它很令人感兴趣，因为它是CD4+ T细胞激活中报告的关键因子27,28(图16c)。首先，我们证实了IRF4在CD8+ T细胞中几乎不存在(图4d)，并在CD4+ T细胞激活中上调(图16d)，并且其次，我们通过ChIP展示了IRF4在初始CD4+ T细胞而不是CD8+ T细胞中与含有LINE1的基因启动子结合(图4e)；然后，我们使用IRF4 ASO消耗初始CD4+ T细胞中的IRF4(图4f和图16e、图16f)，并观察到LINE1转录物和典型转录物两者都强烈下调(图4g)，表明这种TF控制它们的CD4+特异性表达。总的来说，这些数据表明，在T细胞发育期间，LINE1和相应的典型转录物是CD4+ T细胞特异性的，处于IRF4转录因子的控制下。
T细胞激活时，LINE1转录物被剪接阻遏物PTBP1/MATR3和延长因子GTF2F1下调，有利于典型转录物的表达。
由于IRF4是T细胞激活的关键因子，并直接参与含有LINE1的基因座调控，那么LINE1转录物在激活的CD4+ T细胞中以何种方式下调？Attig等人已经报道了若干种异聚RNA结合蛋白结合内含子LINE1，影响其谱系特异性剪接；特别是PTBP1和MATR3阻遏LINE内和LINE周围的RNA剪接29。此外，由于我们报道了LINE1 RNA下调受mTORC1的控制(图1)，我们将该数据集与Hsu等人30的详尽描述受mTORC1调节的蛋白质的数据集进行了交叉。我们只鉴定出一种结合内含子LINE1并且也受mTORC1调节的蛋白质GTF2F1。GTF2F1是T细胞激活时被磷酸化的转录延伸因子31。因此，我们研究了PTBP1、MATR3和GTF2F1在激活的CD4+ T细胞中调节LINE1转录物中的作用。我们对PTBP1和GTF2F1进行了RNA免疫沉淀实验，展示了这两种因子在激活的CD4+ T细胞中特异性结合LINE1外显子(图5a-图5d)。具体地，如对RABB22A示例的，PTBP1仅结合前体mRNA，符合其剪接阻遏作用，而GTF2F1结合前体mRNA和经剪接的典型转录物两者，如对转录延伸因子预期的(图5e-图5g)。事实上，当我们用ASO消耗初始CD4+T细胞的PTBP1、MATR3和GTF2F1，并且然后激活该细胞时，我们发现LINE1转录物表达增加，而典型转录物表达减少(图5h和图17)，因此表明LINE1和典型转录物之间存在因果逆相关。我们推断，LINE1转录物是非典型剪接变体，被PTBP1/MATR3/GTF2F1抑制，有利于细胞激活中典型转录物的表达。
LINE1转录物通过IRF4和核仁蛋白以及PTPB1/GTF2F1介导的机制的损失在TIL中重新积累。
我们分析了从肿瘤微环境分离的T细胞中的LINE1 RNA动态变化，在肿瘤微环境中，效应T细胞经常出现功能障碍。尽管最近的报道已经描述了转录因子和表观遗传修饰对功能障碍状态的贡献，但潜在的机制还没有很好地确定91-93。因此，我们评价了从若干种结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和相应的非肿瘤邻近组织分离的CD4+和CD8+ T细胞中的LINE1 RNA含量。值得注意的是，我们在所有肿瘤样品的肿瘤内记忆CD4+T细胞中观察到LINE1 RNA信号，并且令人惊讶的是，也在肿瘤内记忆CD8+ T细胞中观察到LINE1 RNA信号，而在非肿瘤邻近组织中，类似于在外周血中观察到的，在记忆T细胞中没有检测到信号(图6a、图6b)。
然后，我们通过每2天一次将CD4+和CD8+ T细胞暴露于刺激性抗CD3 mAb，探索了在体外在衰竭的功能障碍的CD4+和CD8+ T细胞中的LINE1 RNA表达66 67。重复的抗CD3刺激在CD4+和CD8+ T细胞两者中诱导预期的生长停滞、PD-1上调和效应细胞因子分泌减少(图18)。令人感兴趣的是，我们观察到LINE1 RNA在这些功能障碍的CD4+和CD8+ T细胞的细胞核中一致的重新积累：更具体地，我们观察到LINE1转录物的特异性增加，同时伴随着含有LINE1的基因表达的减少(图6c-图6f)。我们发现，衰竭的CD4+和CD8+ T细胞，与LINE1转录物积累一致，具有更高量的转录因子IRF4蛋白水平和核仁蛋白，同时衰竭的CD4+和CD8+ T细胞中GTF2F1的丰度降低(图7a)。特别是，通过RIP测定，我们发现，LINE1转录物更多地与核仁蛋白结合，同时它们损失了PTBP1和GTF2F1结合(图7b)。IRF4敲低确定，该转录因子也在衰竭的背景中负责LINE1转录(图7c、图7d和图18e)。总的来说，这些组数据表明，在衰竭的T细胞和TIL中，LINE1转录物重新积累，并且这是由于IRF4-核仁蛋白介导的LINE1转录物的产生和在染色质的稳定同时通过PTBP1/GTF2F1介导的阻遏机制损失引起的。
LINE1转录物水平控制TIL的效应物响应。
为了评估在肿瘤内T细胞中观察到的功能障碍行为是否至少部分地可归因于LINE1 RNA的积累，并因此受到LINE1靶向的调节，我们分离了肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞，并用LINE1 ASO敲低它们的LINE1转录物。然后测量LINE1被消耗的细胞的抑制剂检查点(Inhibitor Checkpoint)表达、效应细胞因子产生和靶细胞杀伤能力(图8a)。我们发现，在LINE1靶向后，PD-1、LAG3和TIM3阳性细胞的百分比降低(图8b、图8c)，并且与这些结果一致，我们还观察到LINE1被消耗的记忆TIL中效应细胞因子(CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的IFNγ和颗粒酶B，CD8+ T细胞的穿孔素A)分泌的增加(图8d、图8e)。这些数据表明TIL的功能增强，并且为了证实这一点，我们还测量了用LINE1 ASO处理的记忆CD4+和CD8+ TIL对比用不相关ASO处理的肿瘤内T细胞的靶细胞杀伤能力，证实TIL的杀伤能力在LINE1敲低后几乎加倍(图8f、图8g)。
作为这一结果的推论，先前在体外被致使衰竭的T细胞中的LINE1RNA敲低导致效应细胞因子(CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的IFNγ和颗粒酶B，CD8+ T细胞的穿孔素A)分泌恢复(图19a-图19e)和杀伤能力恢复(图19f、图19g)，而增殖不被LINE1 ASO处理改变(图19h、图19i)。总之，我们的发现表明，LINE1 RNA水平调节T细胞效应物响应，并且LINE1 RNA在肿瘤内T细胞中的积累与功能障碍行为相关，该功能障碍行为可以用LINE1 RNAASO部分地逆转。
序列
在T细胞中重建的LINE1转录物中主要代表的LINE1序列的共有序列。
>L1ME4A L1智人(Homo sapiens)
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>L1M4B L1智人
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IDNO:2)
>L1MC4 L1智人
ctaatatacctaatatacaaaaaactcttaaaattgaaggataaaaagncaaaaaccnaatannaaaatgggnaaaagacatgaacagacaattcacnaaaaatnataaaatggcccttaagcatataaaaagatgttcancctcacntataattagagaaacgcaaattaaaactacaccgagataccatttctcacccancagatcggcaaaaattaaaaagtatggcaatatannctgttggcgaggctgtggggnaacnggnactctcatacactgctggtgggagtgcaaattggtacaactnctttggaaganaatttggcagtntctaataaaactacacntgcntttacactttgacccattagtcccacttctagaaatttaccctanagaaatacttctaacagntcaaaaatacacatgtacagggatgttcatagcagtnttattnntaatngtaaaanattggaaacaatcnaaatgtccatcagcaggagaatggntgaataaactatggtncatccacacaatggaatactatncagctgtaaaaaagaatgaggaagatctctgtaataatgtggagngatttcggaacatnntnttnagttgaaaaagcnangcgcaaaagagtatatatantatgctacccttcatataagaaagaaggggatatgagaaaatatacatatatctgctcatttgtgcaaaaagaaacacagaaaagataaancaganactaatgagattggttacccacagggaannggtgggaatggggaggaaaggacggaaggaatggggggcagtgacacttttctgagtatacctttttgtatagttctaacttttgnaaccatgttaatgtttcacatactcaagaaatgaataantaaaatcaacaaggatggggganaactcaaaatgaaatacaaacagaaacaaatgaaccwaactgtatttcaaatgaataacataaccacactgaagggggtnaggaagaaaagaactaacccaagtaacttttgaacacagtattttgactatatgccctcaggctaaagacaaaaagaactntaaacaaatattgaactctagttagtaggcttattttccgcagnggcatgggttagcaattctgaaactactttctgtatattctaggactgagcaaataagtaaatatattgnggataatgggagccaggtttctcactgtcggagaagggagttacaaatatggaaagggggaagactagaatgaaccctgtggtgttggattggaattggaggtatcagtgtgaactcatggtttttaatatanatagatatacagacagacagatatagaaatagatatagatatatatgtgtntgtgtatatgtgtatgtatatacgtacatatatttcctagctctgtccactgagagggcctagaagcaatgacaccccagtagcaatgagcacacctagcgcccagatcttggtttctaaataccattctccactaaaaggaaccagggctccttggagaaatggctgattccagggctggggcagggaaagtacaagatgagcctggaacatcttgttgtgccagaaagtaaggaagtgctcaaagaatgatggggacatgtcaaaaggacacaggagccagcttgaaggggctcccactggccaaatctgggacaatttgagcatcaaaataaataatgatagtaatggattataacccattgaataaaataagaatccatgagtccatactgatataaataaataaataaataaatgggggagaagggaaagctcttccttacagtagaatgccaactaataaatgtagaaggaatgatggaattagaaaatcaccatttggcaaccatcatagtaataattgattcaggcaagaatcatcaatggatgctaaaactagtgggtgaaagtttgatgagnaacaggatatttacatagtctcaaagtatctccccacaaaatacttattaattacaaaggggaaaatagtaactttacagtggagaaacctggcagacaccaccttaaccaagtgatcaaagttaacatcaccagtaatgggacaaatcgacatcatgtgcctcctgatatgatgcactgagaaggacacaacatcacttctgtggtattcctgccaaaaatgcataacctgaatctaatcatgaggaaacatcagacaaacccaaattgagggacattctacaaaataactggcctgtactcttcaaaaatgtcaaggtcatgaaagacaaagaaagactgaggaactgttccagattaaaggagactaaagagacatgacaactaaatgcaacgcgtgatcctggattggatcctggaccaganttttttttgctataaaggacattattgggacaactggcgaaatttgaataaggtctgtagattagataatagtattgtatcaatgttaatttcctgattttgatnattgtactgtggttatgtaagagaatgtccttgtttttaggaaatacacactgaagtatttaggggtaanggggcatcatgtctgcaacttactctcaaatggttcagaaaaaaaaatatgtatatgnanacagagaatgataaagcaaatgtggcaaaatgttaacatttggggaatctgggtgaagggtatacgggaattctttgtactattcttgcaacttttctgtaagtctgaaattatttcaaaataaaaagttaaaaaa(SEQ ID NO:3)
LINE1 ASO能够靶向这些LINE1元件，即那些在初始CD4+ T细胞中特异性表达的元件(参见结果)。
用于以上序列的命名如下(以下为IUPAC核苷酸代码和相应的碱基)：
A：腺嘌呤
C：胞嘧啶
G：鸟嘌呤
T(或U)：胸腺嘧啶(或尿嘧啶)
R：A或G
Y：C或T
S：G或C
W：A或T
K：G或T
M：A或C
B：C或G或T
D：A或G或T
H：A或C或T
V：A或C或G
N：任何碱基
.或-：缺口(gap)。
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agtccagcca agtcactaaa caaataaaca agcaaaaaca ancacnanga gccgggggng 1320
gggaatcagt atccagagtt gctacaatat attacctaaa atgtccagtt ttcaacaaaa 1380
aattatgaga catgcaaaga aacaggaaag tgtgacccat acacaggaaa aaaagcaggc 1440
aacagaaact gcctgtgaga gggcccagat gtcggattta gcagacaaag acttcaaagc 1500
agccattata aatatgttca aagaactaaa ggaaaccatg cttaaagaag taaaggaagg 1560
tatgatgaca atgtctcatc aaatagagan tatcaataaa gagatagaaa ttataanaaa 1620
aaaccaaatg gaaattctgg agttgaaaag tacaataact gaaatgaaaa attcactaga 1680
ggggctcaac agtagatttg anctggcaga agaaaagaat cagtraactt gaagatagat 1740
caatagagat tatgcaatct gaagaacaga aagaaaaaaa agaatgaaga aaaatgaaca 1800
gagcctcaga gaaatgtggg acaccatyaa gcataccaac atatacatac atggacagac 1860
aaacaacata tacataatgg gagtaccaga aggagaggag aagagagaga aaggagcaga 1920
aaaaatattt gaagaaataa tggctaaaaa cttcccaaat ttgatgaaaa acattaatat 1980
taatctacac atccaagaag ctcaataaac tccaagtagg ataaactcaa agagatccac 2040
acctagacac atcatagtca aaatgttgaa agacaaagac aaagagaaaa tcttgaaagc 2100
agcaagagaa aaatgactca tcacatacaa gggaannnac ctcaataaga ttaacagctg 2160
acttctcatc agaaacaatg gaggccagaa ggcagtggga tgacatattc aaagtgctga 2220
aagaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa aahacanaaa caaatacaac nytacctgtc 2280
aaccaagaat tctatatcca gcaaaactat ctttcaaaaa tgaaggtgaa ataaagacat 2340
tcccagataa acaaaaactg agagaatttg ttgctagcag acctacctta caagaaatac 2400
taaaggaaga gttcttcagg ctgaaaggca agtgacacca gatagtaatt caaatccaca 2460
taaaaaaata aagagacaca cactaagtaa agnncactag taaaggtaat tatgtagnaa 2520
gacagtaant taattatnaa agrcatgtak gtaattataa aagacagtat aaatgcatat 2580
ttcttctttc ttctcttaac tgatttaaaa agcaattgta taaaacaata tgtatataat 2640
tgtattgttg ggcctataac atatagaaat gtaatatatt tgacaataac agcacaaagg 2700
aggtgggtgg gagcaaagct gtattggagt aaggaaatga caccagatgg taacttgaat 2760
ccacaggaac aaatgaagag aaccagaaat ggtaaataag aaggttaata taacaaactc 2820
tataaatata tacttgttct cctttcttct cttctttaaa agacataaaa ttatataaag 2880
taataattat aacaaatgta tttntnnnat aataatgttg ggtttgtaac atatatagat 2940
gtatatatat tnntattgta atatgtataa caataatagc acaaaaaagg agaaaaagga 3000
atagagctat ataggagtaa catttctata tctcactgga attaagttag tataaatctg 3060
aagtagattc tgataangtt aagatgtata tggtaagccc tagagcaacc actaagaaaa 3120
taacttaaaa aaatatagta aaaaaaatca ttaaagaaat taaaatgtta cactagaaaa 3180
tattcactta atgcaaaaga aagcagtaaa ggaggaatag aggaacaaaa aagacatgag 3240
acatatnaca tatagaaaac aaaaagtaaa atggcagata taaatccaac tatatcaata 3300
taacattaaa tgtgattatg gattaaryaa aatggcaraa gctgtcagnc tngagattta 3360
ntntatataa atccaantnn ntngttnana tgntnagacn gntaatncaa atatcaataa 3420
taacattaaa tgtgaatgga ttaaacaatc caatcaaaag gcagagattg tcagactgga 3480
taaaaaaaaa aaaacaagat ccaactatat gctgtctaca ggagacacac tttagattca 3540
aagatacaaa tagrttgaaa gtaaaaggat ggaaaaagat atatcatgca aacagcaacc 3600
ataagaaagc tggagtggct atactaatat cagacaaaat agactttaaa acaaaaaatg 3660
ttactagaga taaagaggga cattttatta tataatgata aaagggtcaa aagggtcaat 3720
ccatcaggaa gatataacaa ttataaacat atatgcatat anatatatgc acctaacaac 3780
agagccccca aaatacatga agcaaaaact gacagaaatg aagggagaaa tagacaattc 3840
aacaataata gttggagact tcaatayccc actttcaata atggatagaa caactaggca 3900
gaagnnaata ngatcaacaa ggaaatagaa gacttgaaca acactataaa ccaactagac 3960
ctaacagaca tctatagaac atttatagaa cactcyatcc aacaacagca gaatatacat 4020
tcttctcaag tgcacatgga acattctcca ggatagacca tatgctaggc cataaaacaa 4080
gyctcaataa atttatttaa aggattgaaa taatacaaag tatgttctct gaccacaatg 4140
gaatgaaatt agaaatcaat aacaaaaaat ttgggaaatt tacaaatatg tggaaattaa 4200
acaacacact cctaaataac caatgggtca aagaagaaat cacaagagaa attagaaaat 4260
actttgagat gaatgaaaat gaagacacaa cataccaaaa tttatgggat gcagctaaag 4320
cagtgyttag aggaaaattt atagctgtaa atgcctatat taaaaaagaa gaaagatctc 4380
aaatcaataa cctaaccttc taccttaaga cactaaaaaa agaagagcaa actaaaccta 4440
aagcaagcag aaggaaggaa ataataaaga ttagagcaga aattaatgaa atagaagaaa 4500
aacaatagag aaaatcaatg aaaccaaaag ctggttcttt gaaaagatca acaaaattga 4560
caaaccttta gctagactga ccaagaaaaa gagaagactc aaattactaa aatcagaaat 4620
gaaagaggga acattactac taaccttaca gaaataaaaa ggattataaa ggaatactat 4680
gaacaattgt atgccaataa attnagataa cttagatgaa atggacaaat tcctagaaan 4740
yaagacacac aaactacyaa aactgactca agaagaaata ganaatctga atagacctat 4800
aaaantnaag agattgaatt agtaatntaa aaactnccya caaaaaaagc ccagncccag 4860
atggcttcac tggtgaattc tccaaanatt taaaanagaa ttaataccaa ttattcacct 4920
nttccaaaaa atagaagagg aggnaayact nccnaactna ttctatgagg ccagtattat 4980
cctgatacca aaaccagnca aagacatnac aaaagaaaag aaaa 5024
<210> 3
<211> 2761
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
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<223> n是a、c、g或t
<400> 3
ctaatatacc taatatacaa aaaactctta aaattgaagg ataaaaagnc aaaaaccnaa 60
tannaaaatg ggnaaaagac atgaacagac aattcacnaa aaatnataaa atggccctta 120
agcatataaa aagatgttca ncctcacnta taattagaga aacgcaaatt aaaactacac 180
cgagatacca tttctcaccc ancagatcgg caaaaattaa aaagtatggc aatatannct 240
gttggcgagg ctgtggggna acnggnactc tcatacactg ctggtgggag tgcaaattgg 300
tacaactnct ttggaagana atttggcagt ntctaataaa actacacntg cntttacact 360
ttgacccatt agtcccactt ctagaaattt accctanaga aatacttcta acagntcaaa 420
aatacacatg tacagggatg ttcatagcag tnttattnnt aatngtaaaa nattggaaac 480
aatcnaaatg tccatcagca ggagaatggn tgaataaact atggtncatc cacacaatgg 540
aatactatnc agctgtaaaa aagaatgagg aagatctctg taataatgtg gagngatttc 600
ggaacatnnt nttnagttga aaaagcnang cgcaaaagag tatatatant atgctaccct 660
tcatataaga aagaagggga tatgagaaaa tatacatata tctgctcatt tgtgcaaaaa 720
gaaacacaga aaagataaan caganactaa tgagattggt tacccacagg gaannggtgg 780
gaatggggag gaaaggacgg aaggaatggg gggcagtgac acttttctga gtataccttt 840
ttgtatagtt ctaacttttg naaccatgtt aatgtttcac atactcaaga aatgaataan 900
taaaatcaac aaggatgggg ganaactcaa aatgaaatac aaacagaaac aaatgaaccw 960
aactgtattt caaatgaata acataaccac actgaagggg gtnaggaaga aaagaactaa 1020
cccaagtaac ttttgaacac agtattttga ctatatgccc tcaggctaaa gacaaaaaga 1080
actntaaaca aatattgaac tctagttagt aggcttattt tccgcagngg catgggttag 1140
caattctgaa actactttct gtatattcta ggactgagca aataagtaaa tatattgngg 1200
ataatgggag ccaggtttct cactgtcgga gaagggagtt acaaatatgg aaagggggaa 1260
gactagaatg aaccctgtgg tgttggattg gaattggagg tatcagtgtg aactcatggt 1320
ttttaatata natagatata cagacagaca gatatagaaa tagatataga tatatatgtg 1380
tntgtgtata tgtgtatgta tatacgtaca tatatttcct agctctgtcc actgagaggg 1440
cctagaagca atgacacccc agtagcaatg agcacaccta gcgcccagat cttggtttct 1500
aaataccatt ctccactaaa aggaaccagg gctccttgga gaaatggctg attccagggc 1560
tggggcaggg aaagtacaag atgagcctgg aacatcttgt tgtgccagaa agtaaggaag 1620
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aatgggacaa atcgacatca tgtgcctcct gatatgatgc actgagaagg acacaacatc 2160
acttctgtgg tattcctgcc aaaaatgcat aacctgaatc taatcatgag gaaacatcag 2220
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catgacaact aaatgcaacg cgtgatcctg gattggatcc tggaccagan ttttttttgc 2400
tataaaggac attattggga caactggcga aatttgaata aggtctgtag attagataat 2460
agtattgtat caatgttaat ttcctgattt tgatnattgt actgtggtta tgtaagagaa 2520
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gcaaatgtgg caaaatgtta acatttgggg aatctgggtg aagggtatac gggaattctt 2700
tgtactattc ttgcaacttt tctgtaagtc tgaaattatt tcaaaataaa aagttaaaaa 2760
a 2761
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
gcactaaatg cctacaagag a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
gatagaccgc tagcaagact a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
gaagttgaat ctctgaatag a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
ggacctcttc aaggagaact a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
ggagaggatg cggagaaata g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
actgatcgtg agaggcttcg tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
ggtcatttag ggtgacaggc agg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
gctgtcatgg gaatcacgaa ggg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
aaggaagacc acttttaagg agg 23

Claims (16)

1.(长散在元件1)LINE1(L1)表达的阻遏物或抑制剂，用于在治疗和/或预防以下中使用：原发性或继发性免疫缺陷，或展示免疫抑制表型的疾病，优选地癌症和/或转移，更优选地肺癌，甚至更优选地非小细胞肺癌(NSCLC)，或结肠直肠癌(CRC)，或病毒性疾病，诸如由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的免疫缺陷，或淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
其中L1包含与SEQ ID NO:1、2或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
2.LINE1(L1)表达的阻遏物或抑制剂，用于医学使用，其中L1包含与SEQ ID NO:1、2或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成。
3.根据权利要求1或2所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，其中L1包含SEQ ID NO:1、2或3或由其组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，其中所述阻遏物或抑制剂是至少一种选自由以下组成的组的分子：
a)多核苷酸，诸如反义构建体、反义寡核苷酸、RNA干扰构建体或siRNA或编码其的多核苷酸，
b)抗体或其片段；
c)多肽；
d)小分子；
e)编码所述抗体或所述多肽或其功能性衍生物的多核苷酸；
f)包含或表达a)或e)中定义的所述多核苷酸的载体；
g)CRISPR/Cas9组分，例如sgRNA；
h)表达所述多肽或所述抗体或包含a)或e)中定义的所述多核苷酸或g)的至少一种组分的遗传工程化宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，其中所述多核苷酸是分离的靶向LINE1的抑制性核酸。
6.根据权利要求5所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，其中所述抑制性核酸包含与SEQID NO:1、2或3的10个至50个连续核苷酸互补的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，其中所述抑制性核酸是至少一种RNA抑制剂，优选地选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、mixmer、shRNA、siRNA、stRNA、snRNA，更优选地所述抑制性核酸是被修饰的，诸如2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核酸(FANA)ASO，和/或包含一个或更多个修饰的键或碱基。
8.根据权利要求7所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，其中所述ASO包含能够与包含SEQ ID NO:1、2或3或由SEQ ID NO:1、2或3组成的序列杂交或互补的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，用于在T细胞，优选地CD4+T初始细胞或CD8+T细胞、CD4+肿瘤浸润淋巴细胞和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞两者，B细胞，自然杀伤细胞或肿瘤细胞中使用。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，与免疫疗法和/或放射疗法和/或化疗剂和/或促进产生新抗原和免疫应答的靶向疗法和/或免疫系统佐剂组合，优选地，所述免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂和/或表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，优选地，免疫检查点抑制剂是以下或包括以下：一种或更多种抗CDl37抗体；抗PD-l(程序性细胞死亡1)抗体；抗PDLl(程序性细胞死亡配体1)抗体；抗PDL2抗体；或抗CTLA-4抗体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的用于使用的阻遏物或抑制剂，用于过继细胞转移(ACT)、细胞疗法治疗、非匹配骨髓移植、非匹配NK细胞输注或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞输注，或者其中所述阻遏物或抑制剂被注射到肿瘤部位，例如肠肿瘤、黑素瘤中，或者通过纳米颗粒特异性递送到感兴趣的部位。
12.一种药物组合物，包含权利要求1-11的任一项中定义的阻遏物或抑制剂和至少一种药学上可接受的载体，并且任选地还包含治疗剂。
13.一种调节初始CD4+T初始细胞向任何效应谱系的定型和调节功能障碍的T细胞的效应应答的方法，包括抑制所述细胞中LINE1表达的步骤，其中抑制所述细胞中LINE1表达的步骤通过至少一种在权利要求1-11的任一项中定义的阻遏物或抑制剂进行。
14.分离的人类T细胞、B细胞、NK细胞或肿瘤细胞，其中所述细胞的LINE1(L1)表达被稳定或瞬时影响，
其中L1包含与SEQ ID NO:1或2或3具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％同一性的序列或由其组成
优选地，所述细胞是CD4+T初始细胞或CD8+T细胞，或功能障碍的T细胞，例如TIL。
15.一种组合物，包含至少一种根据权利要求14中定义的细胞或其组合，所述组合物优选地还包含至少一种生理上可接受的载体。
16.根据权利要求14所述的细胞或根据权利要求15所述的组合物，用于用作药物，优选地用于在治疗和/或预防以下中使用：原发性或继发性免疫缺陷，或展示免疫抑制表型的疾病，优选地癌症和/或转移，更优选地肺癌，甚至更优选地非小细胞肺癌(NSCLC)，或结肠直肠癌(CRC)，或病毒性疾病，诸如由HIV引起的免疫缺陷，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，
优选地，所述细胞或组合物用于过继细胞转移(ACT)、细胞疗法治疗、非匹配骨髓移植、非匹配NK细胞输注或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞输注，或者其中所述细胞或组合物被注射到肿瘤部位，例如肠肿瘤、黑素瘤中，或者通过纳米颗粒特异性递送到感兴趣的部位。
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