JP2020523992A - Gタンパク質共役受容体媒介症状を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年6月16日に出願された米国仮特許出願第62/520,812号明細書の優先権の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、国立衛生研究所により授与されたR01NS054791およびMH18501の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
アンタゴニストまたはアゴニストは、対象に化合物を投与する前、それと同時またはその後に投与される。
定義
Mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX4は、ヒトではMRGPRX4遺伝子によってコードされるタンパク質である。MAS1発癌遺伝子は、アンジオテンシンII代謝産物であるアンジオテンシン−(1−7)に結合するGタンパク質共役受容体である。MAS1受容体は、アンジオテンシン−(1−7)に結合することによって活性化されると、アンジオテンシンII活性化アンジオテンシン受容体の多くの作用に拮抗する。MAS1受容体アゴニストは、血圧の低下など、アンジオテンシンII受容体アンタゴニストと同様の治療効果を有する。
スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)は、重度の皮膚反応の一種である。中毒性表皮壊死症(TEN)とともに一連の疾患を形成し、SJSは比較的軽度である。初期症状には、発熱およびインフルエンザ様症状が挙げられる。数日後、皮膚に水疱ができ、皮がむけ始め、痛みを伴う皮膚のむけた領域が形成される。口腔などの粘膜も典型的に侵される。合併症には、脱水症状、敗血症、肺炎および多臓器不全が挙げられる。
自己免疫疾患は、正常な身体部分に対する異常な免疫応答から生じる症状である。少なくとも80種類の自己免疫疾患が存在する。ほぼすべての身体部分が関与する可能性がある。一般的な症状には、微熱および疲労感が挙げられる。症状は多くの場合現れたり消えたりする。
多発性硬化症(MS)は、脳および脊髄の神経細胞の絶縁被覆が損傷している脱髄疾患である。この損傷は、神経系の一部の伝達能力を混乱させ、身体的、精神的、時に精神医学的な問題を含む様々な徴候および症状をもたらす。特定の症状には、複視、片目失明、筋力低下、感覚障害または協調障害が挙げられ得る。MSにはいくつかの形態があり、新たな症状は、単独の発作で生じるか(再発型)、経時的に蓄積する(進行型)。発作の合間に、症状が完全に消えることがある。しかし、特に疾患が進行するにつれて、永続的な神経学的問題が残ることが多い。
かゆみ(掻痒症とも呼ばれる)は、掻きたいという欲求また反射を引き起こす感覚である。感覚体験の1つにかゆみを分類しようとする多くの試みはうまくいっていない。現代の科学では、かゆみには疼痛と多くの類似点があることが示されており、いずれも不快な感覚体験であるが、行動反応パターンは異なる。疼痛は引っ込め反射を起こし、かゆみは掻破反射を起こす。かゆみおよび疼痛に対する後根神経節の一次感覚ニューロンの無髄神経線維はいずれも皮膚に由来する。しかし、それらの情報は、同じ神経束と脊髄視床路とを使用する2つの異なる系で中央に伝達される。
胆汁うっ滞は、多くの場合、黄疸、皮膚および眼の黄変をもたらす。黄疸は、皮膚に沈着するビリルビン値の上昇のために発生する。ビリルビンはヘムの下流代謝産物である。細胞では、ヘムはヘムオキシゲナーゼ1(HMOX1)によってビリベルジンに分解され、次いでこれがビリベルジンリダクターゼ(BVR)によってビリルビンに還元される。ビリルビンは極めて親油性であり、細胞膜を通過することができると考えられている。血中では、ビリルビンはアルブミンに結合している。肝臓では、UGT1A*28がビリルビンをグルクロン酸に抱合させて水溶性化合物を形成する。抱合型ビリルビンおよび非抱合型ビリルビンの両方が胆汁中に排泄される。ヒトの健康に関しては、ビリルビンは心血管保護効果のある生理的抗酸化物質であると考えられている(Bulmer AC,et al.Prog Lipid Res 52:193−205(2013);Vitek L.,et al.Atherosclerosis 160:449−56(2002))。
Mas関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)は、起痒性リガンドの受容体として、およびかゆみをプログラムするニューロンの分子マーカーとして、非ヒスタミン作動性かゆみに関与している(Liu Q,et al.J Neurosci 32:14532−7(2012);Liu Q,et al.Cell 139:1353−65(2009))。マウスでは、27を超えるMrgprが発現するが、既知の生理学的リガンドを有するのはそのうちのごくわずかである(McNeil B,Dong X.Neurosci Bull 28:100−10(2012))。ヒトでは、4つのMrgpr(MrgprX1〜X4)が発現する。MrgprX1、X3およびX4は、ヒトDRGおよび三叉神経節(TG)に特異的に発現していることが特定されているが、MrgprX2はヒト肥満細胞に認められている(Flegel C,et al.PLoS One 10:e0128951(2015);Goswami SC,et al.Mol Pain 10:44(2014);Lembo PM,et al.Nat Neurosci 5:201−9(2002);McNeil BD,et al.Nature 519:237−41(2015))。
mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX3は、ヒトではMRGPRX3遺伝子によってコードされるタンパク質である。MAS1発癌遺伝子は、アンジオテンシンII代謝産物であるアンジオテンシン−(1−7)に結合するGタンパク質共役受容体である。MAS1受容体は、アンジオテンシン−(1−7)に結合することによって活性化されると、アンジオテンシンII活性化アンジオテンシン受容体の多くの作用に拮抗する。MAS1受容体アゴニストは、血圧の低下など、アンジオテンシンII受容体アンタゴニストと同様の治療効果を有する。
損傷のない皮膚では、表皮(表面層)と真皮(深層)とが外部環境に対する保護バリアを形成する。バリアが破られると、生化学的事象の組織化されたカスケードが開始されて損傷を修復する。このプロセスは、予測可能な段階、すなわち、血液凝固(止血)、炎症、組織増殖(増殖)および組織再構築(成熟)に分けられる。血液凝固は、別の段階ではなく、炎症段階の一部であると考えられる場合がある。
樹状細胞(DC)は、哺乳動物の免疫系の抗原提示細胞(アクセサリー細胞としても知られる)である。樹状細胞の主な機能は、抗原物質を処理し、それを細胞表面で免疫系のT細胞に提示することである。樹状細胞は、自然免疫系と適応免疫系との間のメッセンジャーとして機能する。樹状細胞は、皮膚(ランゲルハンス細胞と呼ばれる特殊な樹状細胞型がある)ならびに鼻、肺、胃および腸の内層など、外部環境と接触している組織に存在する。樹状細胞はまた、血液中に未成熟な状態で見出され得る。樹状細胞は活性化されると、リンパ節に遊走し、そこでT細胞およびB細胞と相互作用して適応免疫応答を開始および形成する。未成熟樹状細胞は、樹状突起ではなく大きな細胞質の「ベール」を有するため、ベール細胞とも呼ばれる。
後根神経節(または脊髄神経節)(後根神経節(posterior root ganglion)としても知られる)は、脊髄神経の後根にある神経細胞体(神経節)の集団である。後根神経節には感覚ニューロン(求心性)の細胞体が含まれる。感覚ニューロンは、求心性ニューロンとしても知られ、それらの受容体を介して特定の種類の刺激を活動電位または段階的電位に変換するニューロンである。このプロセスは感覚伝達と呼ばれる。感覚ニューロンの細胞体は、脊髄の背側神経節(dorsal ganglia)に位置している。一次感覚ニューロンは、受容器で始まり、多くの場合中枢神経系の核内にある二次感覚ニューロンとのシナプスで終わる求心路の最初のものである。
ヒト胎児由来腎臓293細胞は、多くの場合、HEK293、HEK−293、293細胞、またはあまり正確ではないがHEK細胞とも呼ばれ、組織培養で増殖させた(流産したヒト胚由来の)ヒト胎児由来腎臓細胞に元来由来するか死産動物に元来由来する特定の細胞株である。HEK293細胞は、非常に容易に増殖し、非常にトランスフェクトしやすく、細胞生物学研究では長年にわたって広く使用されてきた。HEK293細胞は、バイオテクノロジー産業により、遺伝子療法のための治療用タンパク質およびウイルスを産生するためにも使用される。本明細書には、MrgprX3またはMrgprX4のいずれかを安定に発現するHEK293細胞が記載される。
特定の実施形態では、本発明は、本発明で使用される薬剤を含む医薬組成物を提供する。薬剤は、好適に製剤化され、そのような送達のために認識されている任意の手段によって対象、または細胞の環境に導入され得る。
以下の材料および方法を使用した。
野生型129S1/SvlmJ、野生型BALB/cJ、およびBALB/c遺伝的バックグラウンドにおけるRag1−/−(C.129S7(B6)−Rag1tm1Mom/J)をジャクソン研究所から購入し、ジョンズ・ホプキンス大学医学部において特定病原体不在条件下で交配および飼育した。12時間の昼夜サイクルで動物を維持し、オートクレーブ処理された飼料と濾過水とを自由に摂取させた。他の実験にはいずれも8〜10週齢の動物を使用した。ジョンズ・ホプキンス大学医学部の動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下で全動物を管理した。WTおよび変異体試料ならびに動物に対する同等の処理を含む全実験が、条件を知らない実験者によって行われた。
ラモトリギン(LTG)、アロプリノール、カルバマゼピンおよびオクスカルバゼピン(いずれもSigma製)を実験当日に新たに調製した。まずジメチルスルホキシド(DMSO)にこれらの薬物を溶解し、次いで使用前にカルシウムイメージング緩衝液で少なくとも10000倍に希釈した。対応する図の説明文に、各実験の薬物の最終濃度を示した。
HEK293ヒト胎児由来腎臓細胞(ATCC)を37°Cの増殖培地(10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、100U ml−1ペニシリンおよび100mg ml−1ストレプトマイシンを補充したDMEM)中で培養した。Mrgpr発現細胞を生成するために、Lipofectamine 3000(Invitrogen)を使用して、Mrgpr遺伝子(pLX304ベクターにクローニングおよび挿入したMRGPRX4および変異MRGPRX4を除く)をコードするcDNAを挿入したpcDNA3.1哺乳動物発現プラスミドをHEK293細胞に一時的にトランスフェクトした。Mrgpra1−GFP、Mrgprc11−GFPおよびMRGPRX4−GFPを発現する安定な細胞株は、前述のように生成した(24)。要約すると、プラスミド内のMrgprタンパク質のC末端に融合したGFPをコードするcDNAをHEK293細胞にトランスフェクトした。10%FBSを補充したDMEM中のゼオシンまたはブラストサイジンにより、トランスフェクトした細胞を選択した。クローニングした各細胞を安定な細胞株としてさらに選択し、受容体−GFP融合タンパク質の膜局在を確認した。
最初の実験では、100μg/mlのポリ−D−リジンで被覆したガラスカバースリップ上にHEK293細胞を播種し、Mrgpr遺伝子を含有するベクターを一時的にトランスフェクトし、培養の24〜48時間後、37°Cの暗所で30分間、プルロニックF−127分散剤(0.1%、Molecular Probes)とともにFura2−アセトメトキシエステルカルシウムインジケーター(0.5μM、Molecular Probes)を細胞に添加し、次いで、カルシウムイメージング緩衝液(CIB;NaCl 125mM、KCl 3mM、CaCl2 2.5mM、MgCl2 0.6mM、HEPES 10mM、グルコース20mM、NaHCO3 1.2mM、スクロース20mM、NaOHによりpH7.4にしたもの)で洗浄した。Fura 2添加細胞に薬物を加え、340nmおよび380nmの励起波長を使用して細胞内遊離カルシウムを測定し、顕微鏡ベースのイメージングシステム(Nikon Eclipse TE200)を用いて520nmで発光を測定した。340/380nm励起での発光蛍光比の変化を1秒間隔で継続的にモニターした。その後、Mrgpra1−GFP、Mrgprc11−GFPおよびMRGPRX4−GFP安定細胞株を使用して実験を行って、一過性発現細胞から得られた観察結果を確認した。
Mrgpra1または野生型および変異体MRGPRX4が安定に発現したHEK細胞を、96ウェルプレート上の100μlの培養培地に一晩播種した。翌日、培地をFLIPRカルシウム5アッセイキット(Molecular Devices)製の色素添加溶液に置き換え、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)に20mM HEPESを加えたもの(pH7.4)で希釈した。37°Cで1時間インキュベートした後、細胞を室温で暗所で10分間回復させた後、Flexstation−3(Molecular Devices)で細胞内カルシウム動員アッセイを行った。試験した薬物は、3倍濃度のHBSS/HEPES溶液中で調製した。製造業者の仕様に従って、180秒間の同時データ収集でウェルをイメージングし、イメージング開始後20秒で50μlの薬物を加えた。少なくとも3つの独立したウェルで物質を試験し、シグナルを平均化した。最大シグナル(薬物により刺激した後に得られる)から最小シグナル(薬物を加える前の基礎レベルで)を差し引くことにより応答を決定した。用量反応曲線は、SoftMax(登録商標)Pro(Molecular Devices)によって最高応答(100%)に正規化された相対蛍光シグナル(%)としてプロットした。その試験でその物質に対する正規化されたピーク応答の50%の応答を与える物質の濃度としてEC50(半最大有効濃度)を決定した。
赤色蛍光色素によって薬物を標識するために、1μgのLTGを最初に50μlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、さらに450μlの反応緩衝液(0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH9.0)で希釈して、7.8mMの濃度のLTGを得た。次いで、10mg ml−1のDMFに溶解した50μlのTexas−red−コンジュゲートスルホニルクロリド(Thermo Fisher Scientific、T1905)をLTG溶液にゆっくりと加えた。反応物を連続的に撹拌しながら4℃で1時間インキュベートした。次いで、その後の使用のために混合物を細胞培養培地に希釈した。Texas Red色素によって標識したLTGは、励起/発光極大約595/615nmを有する明るい赤色蛍光を生成することができる。Mrgpra1−GFP、Mrgprc11−GFPまたはMRGPRX4−GFP融合タンパク質を安定に発現するHEK293細胞を、10%FBSを含むDMEM中で増殖させた。血清飢餓の4〜6時間後、細胞を培地、色素のみ、非標識LTGまたはTexas−Red標識LTGのいずれかで37°Cで15または60分間処理した。細胞をPBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドにより固定した。倍率400倍の共焦点蛍光顕微鏡下で(Zeiss LSM 700)、Mrgpr−GFPまたは薬物の細胞内局在を視覚化した。
ポンプ、脱ガス器、オートサンプラー、カラムオーブンおよびダイオードアレイ検出器(Shimadzu、京都、日本)からなるShimadzu LC−2010A装置を用いて、CMC分析を行った。Lab−solutionプログラム(Shimadzu)によってデータを取得した。移動相は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;5mM、pH7.4)からなり、0.2ml/分の流速で送液した。標準薬を別個にメタノールに溶解することにより、ラモトリギンのストック溶液(100μM)を調製した。ストック溶液を移動相で希釈することにより、様々な濃度の標準溶液を調製した。MRGPRX2/CMCおよびMRGPRX4/CMCカラムを以下のように調製した。要約すると、MRGPRX4発現HEK293細胞(1×108)を採取し、遠心分離した(1000g、10分、4°C)。4℃で10分間1000gで遠心分離することにより、細胞を生理食塩水(pH=7.4)で洗浄した。30分間Tris−HCl(50mM、pH=7.4)中で超音波により細胞を溶解し、4℃で10分間1000gで2回遠心分離した。次いで、回収した上清を4℃で20分間12000gで遠心分離し、ペレットを5mlの氷冷生理食塩水に再懸濁した。シリカ(45mg)を105°Cで30分間活性化した。4℃で一晩撹拌しながら、真空下で活性化シリカを用いて、細胞膜懸濁液をホモジナイズ/吸着した。次いで、細胞膜固定相を蒸留水で洗浄し、湿式充填法(10MPa、5分)を用いてカラムに充填し、CMCカラムを得た。
SJS/TENマウスモデル
8〜10週齢の雄マウスに、生理食塩水に懸濁した原因薬物(LTG、アロプリノール、オクスカルバゼピン)、または生理食塩水のいずれかを強制経口投与した。投与量は、示されている動物の体重のmg/kgに基づくものとした(例えば、LTG 50mg kg−1体重)。皮膚、眼および粘膜、生存率、体重、身体的および肉眼的外観(特に眼、粘膜および皮膚に対して)を連日監視した。
ペントバルビタールにより動物を深く麻酔し、20mlの0.1M冷PBS(pH7.4)に続いて25mlの冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)を経心臓的に灌流した。足の皮膚、眼瞼、脾臓、リンパ節を切除し、4%PFA中で2時間超かけて後固定し、20%に続いて30%スクロース溶液中で4°Cで各24時間凍結保護した。組織試料を最適切断温度(OCT)で包埋し、凍結してから20μm切片に連続的に切断し、スライド上に置いた。製造業者の指示(VitroView(商標)H&E染色キット)に従って、標準手順を使用してヘマトキシリン・エオシン(H&E)染色を行った。アポトーシス細胞の量を定量するために、Apo‐BrdU DNA断片化アッセイキット(Biovision)のプロトコルに従って、核酸の末端を標識することによってアポトーシス細胞から生じるDNA断片化を検出する方法である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを行った。組織内の全細胞数を推定するために、ヨウ化プロピジウムにより核を残らず染色した。倍率200倍の共焦点蛍光顕微鏡下で(Zeiss LSM 700)デジタル写真を撮影した。TUNEL陽性核の数を計数し、皮膚の表皮層で観察された総核の数に対する割合として報告した。
連日の薬物投与後9日目に、SJS/TENモデルマウスの足の皮膚を採取した。組織を秤量し、Bio−Gen Pro200ホモジナイザー(Pro Scientific)を使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Cell Signaling Technology)を含有する冷PBS中でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを10,000g、4°Cで10分間遠心分離した。上清を使用して、Duoset(登録商標)ELISA開発システムキット(R&D System)を使用してTNF−αの値とグランザイムBの値とを測定した。各試料を最小3連ウェルでアッセイし、pg ml−1 mg−1組織としてサイトカイン濃度を報告した。
Mrgpra1GFP/GFPマウス由来のGFP+細胞を特性評価するために、それらの脾臓およびリンパ節を小片に切断し、1mg ml−1コラゲナーゼD(Sigma−Aldrich)および30μg ml−1 DNase I(Worthington Biochemical)を含有するRPMI1640培地中で37°Cで30分間消化した。次いで、消化した組織を70μmメッシュのナイロン細胞濾過器(BD Falcon)を通して濾過して、単一細胞懸濁液を生成した。脾細胞懸濁液中の汚染赤血球を、室温で5分間、ACK溶解緩衝液(Quality Biological)中で溶解した。残りの細胞をPBSで2回洗浄し、氷上で30分間、LIVE/DEAD Aqua(ThermoFisher、Molecular Probes)により染色した。次いで、細胞を洗浄し、FACS染色緩衝液(2%加熱不活性化FBSを含む1倍PBS)に再懸濁し、抗マウスCD16/CD32 Fc Block(BD Biosciences)により非特異的結合を10分間ブロックした後、CD4(クローンRM4−5)、CD8a(53−6.7)、CD11b(M1/70)、CD45(30−F11)、CD317(927)、CD370(DNGR1、7H11)、F4/80(BM8)、I−A/I−E(M5/114.15.2)、Ly6C(HK1.4)、Ly6G(1A8)、XCR1(ZET、いずれもBiolegend製)、CD3(145−2C11)およびCD11c(N418;eBioscience)を認識する抗体を含む蛍光色素コンジュゲート表面マーカー染色抗体の可変パネルとともに氷上で30分間インキュベートした。次いで、染色された試料をいずれも染色緩衝液で2回洗浄し、LSR−IIフローサイトメーター(BD Biosciences)上で細胞の取得を行った。あらゆるフローサイトメトリーデータを分析し、図11A〜図11Cに示すようにゲーティングし、FlowJoソフトウェア(FlowJo,LLC)を用いてプロットした。Mrgpra1+/+野生型(GFPなし)マウス由来の脾細胞およびリンパ節細胞を使用して、GFP陰性領域のゲートを設定した。必要に応じて、「蛍光マイナス1」対照を他の表面染色に使用した。
CD11cおよびMHC−II発現に基づいて脾細胞の様々な細胞タイプを選別するために、マウス脾細胞の単一細胞懸濁液を上記のように調製した。次いで、製造業者のプロトコルによって示唆されているように、いくつかの改変を加えて、EasySep(商標)マウスCD11c Positive Selectionキット(StemCell Technologies)を用いてCD11c+細胞を濃縮した。要約すると、マウスFcRブロッカーにより非特異的結合について細胞懸濁液をブロックし、次いでCD11cに対するフィコエリトリン(PE)コンジュゲート抗体により染色し、続いてPEおよび磁気ナノ粒子を認識した四量体抗体複合体とともにインキュベートした。次いで、免疫磁気分離からPE標識細胞を一度回収した。反復磁気分離を行わずに、APC−Cy7コンジュゲート抗マウスI−A/I−E(クローンM5/114.15.2)抗体(Biolegend)により、濃縮されたCD11c+細胞を染色した。FACS Divaソフトウェアを用いるFACSAria IIuソーター(BD Bioscience)上で、図12に示すようなCD11cおよびMHC−IIの発現に基づいて、細胞集団をゲーティングおよび選別した。次いで、Mrgpra1発現を確認するためのRNA単離、またはカルシウムイメージング(HEK細胞について記載されているように)のいずれかのために、選別された細胞を直ちに使用した。
様々な臓器から得られたマウス組織試料をホモジナイズし、製造業者のマニュアルに従って、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)またはRNeasy Fibrous Tissue Mini Kitのいずれかを用いてそれらのRNAを抽出した。RNeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して、単離されたマウス細胞または培養ヒト樹状細胞からRNAを抽出した。ゲノムDNA(gDNA)汚染を最小限に抑えるために、gDNA Eliminatorカラム(Qiagen)を使用してRNAを精製し、カラム上でDNase Iにより15分間処理した。製造業者の指示に従って、iScript cDNA合成キット(Bio−Rad)を使用して、oilgo−dTおよびランダムプライマーにより、組織から得られた500ナノグラムの全RNA、または細胞から得られた30ナノグラムの全RNAを相補DNA(cDNA)に逆転写した。gDNAの汚染を確認するために、逆転写酵素を使用しない陰性対照反応を行った。次いで、0.5LのTaqman特異的プライマー/プローブ(Thermo Fisher;Mrgpra1用のMm01703261;Actb用のMm04394036;MRGPRX4用のhs00607779;ACTB用のHs01060665)、7.5LのTaqman Universal Master Mix(Thermo Fisher)および5LのDEPC処理水を用いて、2LのDNAから定量的PCRアッセイを行った。PCR反応は、以下の熱プロファイル、すなわち、50°Cで2分間、95°Cで10分間、次いで、45サイクルの95°C(15秒)に続いて60°C(1分)により行った。2%アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を視覚化した。
CD4/CD8 Tリンパ球のインビボ枯渇に、マウスCD4(BioXCell、クローンGK1.5)およびCD8(BioXCell、クローン2.43)に対するラットモノクローナル抗体を使用した。−2、0および3日目に、雄の野生型129S1/SvlmJマウスに、200μgのCD4またはCD8抗体を腹腔内注射した。同様のプロトコルにより、ラットIgG2bアイソタイプ対照抗体(BioXCell)を用いて対照群を処置した。全マウスに、0日目から1日1回、LTG(50mg kg−1体重)を強制経口投与した。7日目に、脾臓および末梢血のフローサイトメトリー分析により、枯渇の効果を評価した。この枯渇スキームにより、それぞれ、CD4枯渇マウスの脾臓および末梢血のCD4+細胞が約98.4%および89.9%減少したのに対し、CD8枯渇マウスの脾臓および末梢血のCD8+細胞が99.1%および97.6%減少した(図10)。
ナイーブな129S1 WTマウスまたはMrgpra1−/−マウスから得られた脾臓を無菌的に除去し、製造業者のマニュアルに従って、マウスPan樹状細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いてDCを単離した。要約すると、上記のようにコラゲナーゼD/DNase I消化によって、脾臓由来の単一細胞懸濁液を生成した。次いで、非樹状細胞に対するビオチンコンジュゲート抗体のカクテル、続いて抗ビオチン磁気マイクロビーズを細胞懸濁液に加えた。LSカラムを使用して、ビーズ標識非樹状細胞から樹状細胞を分離した。LTG(50mg/kg−1体重)の連日投与を開始する前日に、ナイーブな雄のMrgpra1ノックアウトマウスに、200μlのハンクス平衡塩類溶液(HBSS)に懸濁した、WTマウスまたはKOマウスから新たに単離した樹状細胞を静脈内(尾静脈)注射した(2x106細胞/マウス)。
Lonza(cc−2701)およびSTEMCELL Technologies(70041)から、4例の異なるドナー由来のヒト末梢血樹状細胞を購入した。未成熟樹状細胞として細胞を維持するために、細胞を解凍し、加湿した37°C 5%CO2インキュベーター内で、10%FBS、50ng ml−1のIL−4および50ng ml−1のGM−CSFを補充したRPMI1640培地中で培養した。これらの樹状細胞に関する実験はいずれも、細胞が死滅する前の7日以内に完了した。
MRGPRX4に対するON−TARGET+SMARTpool siRNA(Dharmacon)を使用して、樹状細胞でのMRGPRX4の発現をダウンレギュレートした。培養開始後3日目に、ヒト樹状細胞を培地で洗浄し、回収し、室温で10分間200gで遠心分離した。次いで、Nucleofector(登録商標)溶液に細胞を再懸濁し、ヒト樹状細胞Nucleofactor(登録商標)キットのプロトコルに従ってNucleofactor(商標)2bデバイス(Lonza)を使用して、MRGPRX4 siRNAまたは非標的化対照siRNAのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション後、500μlの添加培養培地を試料に静かに加え、48時間インキュベートする。次いで、カルシウムイメージングおよび内在化アッセイに細胞を使用した。
カバースリップにヒト樹状細胞を播種し、10%FBSを含むRPMI 1640培地中で5日間培養した。4〜6時間の血清飢餓の後、培地、色素のみ、非コンジュゲートLTGまたはTexas RedコンジュゲートLTG(Texas Redは、上述のようにLTGにコンジュゲートした)を用いて、37°Cの暗所で細胞を15分間処理した。PBS中の4%パラホルムアルデヒドにより細胞を固定し、PBSで洗浄した。次いで、固定した細胞をブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清)中で一時間ブロックしてから、ウサギ抗MRGPRX4(10ug ml−1、Abcam、ab188740)中で4°Cで一晩インキュベートした。続いて、0.3%Triton溶液で細胞を洗浄し、Alexa Flour484コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(1:1000、Thermo Fisher)中で室温で2時間インキュベートした。カバースリップをPBSで洗浄し、DAPI(Vector Laboratories)を含む退色防止封入剤により封入した。
本試験は、国立台湾大学病院(NTUH−REC番号:2015121334RINC)の研究倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。黄斑丘疹性発疹(MPE)、好酸球増加と全身症状を伴う薬物反応(DRESS)、およびスティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)を含む、ラモトリギンに対する重篤な有害皮膚反応(cADR)の症例は、皮膚科専門医によって評価および診断された。ラモトリギン耐性の症例は、2カ月超のラモトリギンの使用歴のある神経科クリニックから募集したが、関連する皮膚有害反応は報告されなかった。末梢血単核球(PBMC)は、前述のように末梢血から分離した(25)。血液試料を同量のFicoll−Paque PLUS溶液(GE Healthcare)と混合し、600gで40分間さらに遠心分離した。−80℃でPBMCを保存した。
Trizol試薬(Invitrogen)を用いて、ヒトPBMC由来の全RNAを抽出した。RevertAid RT Reverse Transcriptionキット(ThermoFisher Scientific、K1691)を使用してRNAの逆転写を行った。MRGPRX4順方向プライマー5’−CAGAGATGATACAGCTGGTG−3’(配列番号1)およびMRGPRX4逆方向プライマー5’−GACTGGGATGAAATCTGACG−3’(配列番号2)を使用してPCRを行った。PCR条件:94°Cで3分、および94°Cで30秒の30サイクル、52°Cで30秒、ならびに72°Cで30秒。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を用いて配列決定を行った。
本明細書に記載されるように、薬物誘発アナフィラキシー様反応(図1A)に不可欠な肥満細胞特異的受容体Mrgprb2/MRGPRX2(MAS関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)サブファミリーのメンバー)が先に同定された(参照により本明細書に組み込まれる(10))。Mrgprがスティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)などの他の種類のADRに関与しているかどうかを決定するために、HEK293細胞に個々に発現したMrgprに対して、SJSを引き起こす薬物であるラモトリギンをスクリーニングした。Ca2+イメージングアッセイを使用して、マウスMrgpra1およびヒトMRGPRX4のみが、ラモトリギン(LTG)およびオクスカルバゼピンなどのいくつかのSJS関連薬物によって特異的に活性化されることを決定した。ヒトMRGPRX4に対するLTGのEC50は約200μMであり、これは臨床で使用される用量範囲内である(11、12)。マウスMrgprA1に対するLTGのEC50は約30μMである。
SJSを引き起こす薬物であるラモトリギンにMrgpra1が結合することができることを知り、そのインビボでの役割を検討した。SJS/TENのマウスモデルを開発するために、野生型(WT)129S1/SvlmJマウスに50mg kg−1体重の用量でLTGを連日強制経口投与した。このLTGの用量は臨床で推奨されている量よりも高かったが、ヒトが発症したSJSではLTGの過剰投与範囲内であった(14)。薬物治療の7〜10日後、ほぼすべてのマウスでは体重が減少し、眼の粘膜分泌物および足の水疱出血を含むSJS/TEN様症状が示され、14日目までの死亡率は60%であった(図2B、図6A、図6B)。この表現型の発現は、抗原曝露後数日から数週間を要するヒト患者の薬物誘発性過敏症に似ている(15)。高用量のオクスカルバゼピンおよびアロプリノールを含む他のSJS原因薬物も、この系統のマウスに対して、比較的低い発生率で、足の異常を伴わず、眼症状を誘発することができる(図5)。特に、高用量LTGの連日の経口投与は129S1およびBALB/c系統(図8)に対してのみSJS様の特徴を誘発することができることが分かったが、C57BL/6マウスは耐性であるようである。これは、この薬物に反応したマウス系統のかなりの変動を示唆する。このため、129S1/SvlmJバックグラウンド上でMrgpra1のオープンリーディングフレームがGFPに置換されたMrgpra1ノックアウトマウス(Mrgpra1GFP/GFP、KOマウス)を作製した(図2A)。同じLTG処置に曝露すると、Mrgpra1ヘテロ接合マウス(Mrgpra1GFP/+、HETマウス)はWTマウスと同様の表現型を発現したが、MrgprA1 KOマウスには死亡も体重減少も見られず、SJS様症状を発現しなかった(図2C、Dおよび図6A、図6B)。結膜および後足切片の組織学的染色により、LTG処置KOマウスまたは生理食塩水処置対照動物ではなく、LTG処置WTおよびHETマウスの組織のみの明らかな表皮壊死および炎症細胞浸潤が明らかにされた(図2C、図2D)。
SJS/TEN患者の組織病理学的検査では、表皮に広範囲なケラチノサイトアポトーシスが示される(16、17)。この病態生理は、いくつかのサイトカイン(TNF−α、IFN−γ、IL−6など)の上昇とともに、細胞傷害性CD8+T細胞から放出される細胞傷害性分子(例えば、グランザイムB、グラニュリシン、Fasリガンド)によって媒介されることが提案されている(17〜21)。次いで、本明細書に記載のマウスモデルに対して、これらの特性を検討した。ヒトSJS患者と一致して、LTGを強制経口投与したMrgpra1 WTおよびHETマウスの皮膚では、上皮アポトーシス細胞およびCD8+T細胞の数が有意に増加するとともに、グランザイムBおよびTNF−αの上昇が認められた(図2C、図2D、図2E、図2F、図6D、図6Eおよび図6F)。ただし、Mrgpra1 KOマウスは、薬物曝露後に細胞毒性の徴候を示さない。CD8+T細胞とそのメディエーターとが、本明細書に記載のマウスモデルのSJS様表現型の発現に必要であるかどうかを確認するために、Rag1−/−マウス(機能性TおよびBリンパ球を含有しない)およびCD8枯渇動物(抗体枯渇を介して枯渇させている)を利用した。LTGに曝露した後、CD8+T細胞の数がゼロであるか少ないこれらのマウスでは、表現型は発現しなかった(図7、図8)。これらのデータはいずれも、1)本明細書に記載の動物モデルでは、CD8+T細胞がSJSの発症に必要であり、2)Mrgpra1がこの免疫応答を開始するために不可欠であり得ることを示唆している。
SJSの発症に果たすMrgpra1の役割を示唆するデータを用いて、この受容体の発現部位を決定した。逆転写PCR(RT−PCR)では、Mrgpra1がリンパ節および脾臓に主に発現したことが示された(図3A)。次いで、Mrgpra1遺伝子をGFP(Mrgpra1GFP/GFP)に置換することによって作製されたMrgpra1 KOマウスをレポーターマウスとして使用して、Mrgpra1発現細胞を同定した。Mrgpra1GFP/GFPマウスから得られた脾細胞およびリンパ節細胞のフローサイトメトリー分析では、小さな顕著なGFP+集団の存在が明らかにされた(図3Bおよび図9A)。その後の特性評価では、GFP+細胞が、従来の樹状細胞マーカー(インテグリンCD11cおよびクラスII主要組織適合抗原(MHC−II)の両方の高発現)を伴うが、他の細胞タイプのマーカーは伴わない造血細胞(CD45+)の特徴を示したことが示された(図3Bおよび図9B)。これらのマウスから得られた脾臓組織切片の免疫染色では、不規則な形状および樹状突起様のGFP+細胞がCD11c+とともに同定されたが、CD3+(T細胞のマーカー)は同定されなかった(図9C)。Mrgpra1が樹状細胞で発現および機能することをさらに検証するために、CD11cおよびMHC−II:CD11c+MHC−IIhigh(主に樹状細胞)、CD11c+MHC−IIint(主にマクロファージ)、CD11c−MHC−II+(主にB細胞)およびCD11c−MHC−II−(主にT細胞)の発現に基づいて、Mrgpra1+/+およびMrgpra1GFP/GFPマウスから得られた脾細胞を4つの集団に分類した(図10に示すゲーティング戦略)。RT−PCR分析により、WT動物のCD11c+MHC−IIhigh集団でのみMrgpra1の発現が決定された(図3C)。Mrgpra1GFP/GFPノックアウトマウスから得られたCD11c+MHC−IIhigh細胞にはMrgpra1は存在しない。機能的には、WT CD11c+MHC−IIhigh細胞のサブセット(約5%)のみがCa2+イメージングアッセイを使用してLTGに応答し、このLTG誘導活性化はKO細胞で有意に減少した(図3D、図3E)。これらデータはいずれも、Mrgpra1が樹状細胞のサブセットで特異的に発現し、他の免疫細胞では発現しないことを示唆している。続いて、これらのMrgpra1発現樹状細胞がインビボでの薬物誘発SJS/TEN症状の発現に必要であるかどうかを検討するために、Mrgpra1+/+マウスから得られた樹状細胞を単離し、Mrgpra1 KO動物に養子移入した。薬物曝露の7〜10日後、WT樹状細胞を受け取ったMrgpra1 KO動物では体重が減少し、その64%がSJS様の眼症状を発現したが、KO樹状細胞を受け取った対照動物では体重減少も表現型も観察されなかった(図3Fおよび図11)。ただし、WT樹状細胞を注射した動物に見られたこれらの表現型は3〜4日しか続かず、12日目以降は消失した。これは、樹状細胞の活性化およびリンパ球との相互作用後の樹状細胞の寿命が短いためと考えられる(22)。これらの観察結果は、樹状細胞でのMrgpra1の同定と、SJS/TENの病因の誘発および維持に果たすその役割とを強く裏付けている。
本明細書に記載のCa2+イメージングデータによれば、ヒトMRGPRX4は、マウスMrgpra1と同様のSJS原因薬物に応答した(図3C)。このため、MRGPRX4がヒトのSJS/TENの発症に関与している可能性を検討した。最初に、ヒトCD11c+樹状細胞では、RT−PCRによるMRGPRX4転写物および免疫染色によるMRGPRX4タンパク質がともに検出された(図4Aおよび図12)。次に、LTGはMRGPRX4依存的にヒト樹状細胞を活性化することができる。Ca2+イメージング試験では、マウス樹状細胞と同様に、約5%のヒト樹状細胞がLTGによって活性化された(図4B、図4C)。短干渉RNA(siRNA)を用いたMRGPRX4ノックダウン樹状細胞では、LTGに応答した活性化細胞数が有意に少ないことが示された(図4C)。また、MRGPRX4発現樹状細胞のみが、それらの細胞質区画にTexas Red標識LTGを内在化することができた(図4D)。cADRの発生率に関連するMRGPRX4遺伝子の変異を同定した。LTGに対するcADRを有する患者6例と耐性症例28例とを試験に登録した。cADRには、SJS、DRESSおよびMPEが含まれる。大部分のLTG耐性症例は、MRGPRX4の495番目のヌクレオチド(受託番号_054032.3、rs2468774、495位)でヘテロ接合G/T対立遺伝子を示した。タンパク質レベルでp.Asn25Lysのミスセンス変異体につながる同じ遺伝子座でホモ接合G/G対立遺伝子の有意に高い有病率があった。28例の耐性患者のうち2例(7.1%)がホモ接合G/G対立遺伝子を有し、6例のcADR患者のうち3例がホモ接合対立遺伝子を有した(50%)(図4E)。まとめると、これらの結果は、MRGPRX4がMrgpra1のヒトホモログであり、ヒトのSJSを媒介することを示唆している。
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マウスMrgpr遺伝子座は、27個のインタクトなMrgprオープンリーディングフレームを含有する。マウスに発現した多くのMrgprは、同様の配列を有する(10;20)。Mrgprメンバー間で起こり得る補償を回避するために、一群のMrgprを遺伝的に欠失させる(クラスターKO)クラスター欠失戦略を追求した。クラスターKOマウスは、12個のインタクトなMrgpr ORFを含有する845kbのDNAを欠失している(22)。
ANIT処置は多くの病理学的変化をもたらす。通常、血清中に微量に存在する胆汁成分がアップレギュレートされる。さらに、ANITは肝細胞損傷を引き起こし、これにより、生物学的恒常性にさらに混乱がもたらされる。これらの変化により、クラスターKO動物に見られる胆汁うっ滞性のかゆみの減少を説明することができる多くの仮説が存在する。これに対処するために、WTおよびクラスターKO同腹仔の両方に、胆汁うっ滞性掻痒症に関与すると仮定された多数の胆汁成分を注射した。注射後、急性のかゆみを評価した。これらの注射から、以前に発表されていない現象である起痒物質としてビリルビンを同定した。WTマウスは、ビリルビンの注射に反応して、頬または背中のいずれかを掻破する(図14A、図14D)。この掻破反応は用量依存的であり、比較的低用量であれば動物は掻破しない(図14A)。注目すべきことに、ビリルビンの注射は、クラスターKO動物のかゆみを誘発することができなかった(図14A)。ビリルビンはヒスタミン放出アッセイおよびカルシウムイメージングの両方で肥満細胞を活性化することができなかったため、ビリルビン媒介掻痒症は本質的にヒスタミン作動性であるとは考えられなかった(図15A、図15B)。さらに、H1受容体遮断薬は行動を阻害しなかった(図15C)。胆汁うっ滞性掻痒症の3つの提案されたメディエーターの代表的なメンバーである他の起痒物質、DAMGO、モルヒネ、LPAおよびDCAの注射はいずれも、WTおよびクラスターKO動物の両方に対して同等のかゆみ反応を誘発した(図14B、図14C、図14E、図14F)。これに基づいて、クラスターKO動物の胆汁うっ滞性掻痒症の減少の機序は、クラスター内のMrgprに対するビリルビンの活性低下に起因するものであった。
ヘム代謝産物は構造的に非常に似ている。これに基づいて、追加のヘム代謝産物がMrgprA1およびX4に対して活性を有することが予測され得る。実際、カルシウムイメージングにより評価されるように、複数のヘム代謝産物はこれらの受容体を活性化し、関連受容体A3およびX1は活性化しなかった(表1、図22)。ヘム代謝産物は構造的に関連している。複数のヘム代謝産物は、マウス受容体であるMrgprA1とヒト受容体であるMrgprX4とを活性化した。物質の用量を上に列挙し、活性化のおおよその割合を表に示す。いくつかの同定されたMrgprA1アゴニストをWTマウスに注射することによって、このカルシウムイメージングを検証した。ヘマチンおよびステルコビリンなど、MrgprA1に対する活性を有する他のヘム代謝産物はいずれも、クラスターKO動物では見られなかったかゆみをWT動物では誘発した。さらに、構造的に異なるアゴニストであるFMRFによるMrgprA1の活性化が、かゆみを引き起こした。これに基づいて、MrgprA1の活性化はかゆみを誘発するのに十分であった。カルシウムイメージングによって確立された機能的相同性に基づいて、ヒトでのMrgprX4の活性化はかゆみを引き起こす。
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図20Aに示すように、MRGPRX3を発現するHEK細胞は、合成ヒトβ−デフェンシン3(hBD3)に対して強いCa2+応答を生じた。RT−PCRを使用して、初代ヒトケラチノサイトでのMRGPRX3の発現を分析し、遺伝子が中間レベルで発現していることを確認した。MRGPRX3に対するsiRNAは、別のファミリーメンバーMRGPRX4に影響を及ぼすことなく、この受容体の発現を効果的に減少させた(図20B)。MRGPRX3をノックダウンすると、hBD3に応答するケラチノサイトの割合が80%超から20%未満に顕著に減少し、MRGPRX3が、細胞がリガンドを感知し応答するために必要であることが示された。
MrgprA6はケラチノサイトに発現する。
ヒトMRGPRX3のマウスホモログの同定を行った。Mrgpr遺伝子クラスターは進化の過程で大きく拡大し、ヒトでは4つのMRGPRXに対して20を超える受容体がコードされていた(図21C)。第1の工程は、マウス上皮からケラチノサイトを単離し、Mrgpr遺伝子のいずれが強く発現しているかを決定することであった。RT−PCRでは、MrgprA6、A12およびB3の3つの遺伝子のみがマウスケラチノサイトに強く発現していることが明らかにされた。MrgprA1、A4およびB6は弱い発現を示した(図21A)。
MrgprX3はオーファン受容体であり、hBD3はその最初に同定されたアゴニストである。hBD3のよく保存されたマウスホモログであるマウスβ−デフェンシン−14(mBD14)を使用して、hMrgprX3のマウスホモログをさらに探索した。マウスケラチノサイトに発現を示した受容体の中で(図21A)、MrgprA6はmBD14によって強く活性化された唯一の受容体であったが、MrgprA1、A4、A12、B3およびB6は反応を示さなかった(図21B)。
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以下の材料および方法を使用した。
実験はいずれも、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。
ジョンズ・ホプキンス大学医学部の治験審査委員会(試験番号:IRB00154650)によって承認されたプロトコルの下で、高ビリルビン血症、特に胆汁うっ滞に罹患した患者から得られた血漿を分離した。全血をPAXgeneチューブ(PreAnalytiX 761115)に収集し、300gで5分間遠心分離した。次いで、血漿を収集し、アリコートし、実験まで−20℃で保存した。正常な対照ヒト血漿は、Sigma(P9523)から購入した。
以下の分子を使用した:ビリルビンIXα(Frontier Scientific)。α−ナフチルイソチオシアネート(ANIT、Sigma)、ビリベルジン(Sigma)、クロロキン(Sigma)、化合物48/80(Sigma)、シクロスポリンA(Sigma)、ヘミン(Sigma)、ヒト血清アルブミン(HSA、Sigma)、BAM8−22(Sigma)、BOC−GLN−D−(ホルミル)TRP−PHE−ベンジルエステル(QWF、Sigma)、ビリルビンジタウレート(Lee Biosciences)。セチリジン(Tocris Biosciences)、ステルコビリン(Santa Cruz Biotechnology)、ウロビリノーゲン(Santa Cruz Biotechnology)、コレラ毒素(Santa Cruz Biotechnology)、U73122(Santa Cruz Biotechnology)、YM−254890(Wako Chemicals)、百日咳毒素(Fisher Scientific)、フィブロネクチン(Sigma)、Fluo 4−AM(Molecular Probes)およびFura 2−AM(Molecular Probes)。
あらゆる適用可能な行動試験を行い、遺伝子型を知らない実験者が分析した。使用したマウスはいずれも、C57BL/6Jバックグラウンドで作製したか、C57BL/6Jマウスに少なくとも10世代戻し交配した8〜12週齢の雄(20〜30g)であった。かゆみ行動実験はいずれも午前8時から午後12時までの間に行った。実験の前日に、試験チャンバーに動物を30分間入れた後、5分間の休憩を挟んで一連の3回の模擬注射を行った。実験当日、注射の10分前に、動物を最初に試験チャンバーに順応させた。首筋または頬に掻痒性化合物を皮下注射し、掻破行動を30分間観察した。注射部位の領域に向けられたいずれかの後足による連続的な掻破運動として掻破発作を定義した。頬注射モデルでは、片方の前足によって注射部位をなでる動きとして拭い行動を定義した。顔または頬に対する両前足の使用は毛づくろい行動と解釈した。30分間の観察期間にわたって5分間隔で掻破発作の回数を数えることにより、掻破行動を定量した。10分間の観察期間にわたって2分間隔で拭い行動を定量した。H1R遮断では、ビリルビン注射の30分前に、30mg/kgの塩酸セチリジン(pH7.4)を腹腔内投与した。舐め行動は、数秒にわたり定量し、身体のいずれかの他の部分の舐め行動に先行も後続もしなかった、注射部位の後足足指または足蹠の舐め行動として識別した。
前述のように、Mrgpr−クラスターΔ−/−マウス、Mrgpra1GFPマウス、およびMrgprdPLAPを作製した4、21、44。前述のように、Tg(Mrgpra3−Cre)マウスを作製した24。ジャクソン研究所からLsl−tdTomatoマウス(Ai9、007909)を購入した。ガイドRNA配列:TTCCCAGCAGCACCTGTGCAGGG(配列番号3)を使用して、C57BL/6バックグラウンドに対してCRISPR−Cas9を使用してMrgpra1−/−マウスを作製した。Blvra−/−マウスは、C57BL/6JバックグラウンドでOzgene(オーストラリア)で作製された。
カルシウムイメージング緩衝液(CIB;10mM HEPES、1.2mM NaHCO3、130mM NaCl、3mM KCl、2.5mM CaCl2、0.6mM MgCl2、20mMグルコースおよび20mMスクロース(pH7.4および290〜300mOsm))中で細胞を画像化した。細胞内の変化[Ca2+]([Ca2+]i)をモニターするために、イメージングの直前にCIB中で37°Cの暗所で30分間、細胞にFura 2‐AM(HEK293細胞)またはFluo 4−AM(DRGニューロンおよびマスト細胞)を添加した。Fura 2−AMでは、340nmおよび380nmの両方の励起から510nmでの発光をモニターした。Fluo 4−AMでは、488nmでの励起から520nmでの発光をモニターした。細胞内[Ca2+]が、ベースラインと比較して50%、または50mM KClの添加中にアッセイした[Ca2+]i変化と比較して50%上昇した場合に、細胞は応答しているものとして識別した(ニューロンのみ)。損傷、剥離、高ベースラインおよび運動活性化細胞は分析から除外した。
最初のスクリーニングでは、多種多様なGPCRをホスホリパーゼC30に非選択的に結合させる独自のGαタンパク質であるマウスGタンパク質αサブユニットGα15を安定に発現するHEK293細胞を、ポリ−D−リジンで被覆したカバースリップ上に播種し、目的のMRGRPRをコードする構築物を一時的にトランスフェクトした。12〜24時間後、細胞にFura 2−AMを添加した。特に明記しない限り、ベースライン期間が確立された後、約30秒間、イメージングチャンバーに化合物を灌流した。次いで、5秒間隔でさらに60秒間応答をモニターした。
解離の24時間後(自然遺伝子型)または解離の48時間後(ウイルス形質導入)に、Fluo−4 AMとともにDRGをインキュベートした。特に明記しない限り、細胞を20秒間画像化して、化合物を加える前にベースラインを確立した。30秒後、2分間洗浄してから別の物質を加えた。各イメージング試験の最後に、陽性対照として50mM KClを加えた。割合を計算するのに含めた細胞はいずれも、KClを加えると、ベースラインと比較して、[Ca2+]iの少なくとも50%の増加を示した。
肥満細胞を記載のように精製し、30mg/mLのフィブロネクチンでコーティングしたガラスカバースリップ上に播種し、37℃で2時間回復させた。次いで、細胞にFluo−4 AMを添加した。
MRGPRA1、MRGPRX4およびMRGPRC11のいずれかを安定に発現するHEK293細胞を、10,000細胞/ウェルでポリ−D−リジン被覆96ウェルプレートに播種した。細胞にFura 2−AMを添加し、2回洗浄し、CIB中で維持した。ヘム代謝産物を薄明かりでDMSOに新たに溶解し、次いで、20mM Trisおよび150mM NaClから構成される緩衝液(pH8.8)に希釈した。各実験の前にpHの潜在的変化を評価した。3連で、2〜4回反復して実施した用量反応からEC50値を決定した。ビリルビンに対するQWFによる潜在的な拮抗作用を決定するために、アゴニストの適用前に、CIB中で1分間、様々な用量のQWFによって細胞を処理した。
CO2吸入により、8〜12週齢の成体雄マウスを殺処分した。使用前に合計25mLの肥満細胞解離培地(MCDM;3%ウシ胎児血清および10mM HEPESを含むHBSS、pH7.2)を氷上で冷却し、2回の連続腹膜洗浄を行った。洗浄液を合わせて、200gで遠心した。2mLのMCDMにペレットを再懸濁し、4mlの等張性70%Percoll懸濁液(2.8mlのPercoll、320mlの10%HBSS、40mlの1M HEPES、830mlのMCDM)上に重層し、4°Cで500gで20分間遠心した。肥満細胞をペレットに回収した。10%ウシ胎児血清(FBS)および25ng/mLの組換えマウス幹細胞因子(Sigma)を含むDMEMに肥満細胞を再懸濁した。
肥満細胞を記載のように精製し、37°Cで2時間回復させた。次いで、300細胞/ウェルで、20mg/mLのフィブロネクチンで被覆した96ウェルプレートに細胞を播種した。アッセイ前に、37℃で45分間プレートをインキュベートした。アッセイのために、試験化合物をいずれもCIBで希釈した。化合物添加の5分後、上清を吸引し、製造業者の指示に従ってHTRFヒスタミンアッセイキット(Cisbio Assays)を用いてヒスタミン値が測定されるまで−80℃で凍結した。
冷DH10培地(90%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F−12、10%FBS、ペニシリン(100U/mL)およびストレプトマイシン(100μg/mL))中に、あらゆる脊髄部位由来のDRGニューロンを収集した。ディスパーゼ(5mg/ml)/コラゲナーゼI型(1mg/ml)酵素混合物を用いて、DRGを37°Cで45分間消化した。粉砕後、300gで細胞を遠心し、DH10に再懸濁してから、ポリ−D−リジン(0.5mg/ml)およびラミニン(10μg/ml、Invitrogen)で被覆したガラスカバースリップに播種した。50ng/mLのNGFを補充したDH10を用いて、37°CでDRGを培養した。
psPAX2およびpMD2.Gを使用して、MRGPRの様々なcDNAをコードするレンチウイルスを生成した。100,000gで4時間遠心分離することによりウイルスをペレット化し、DH10培地で2回穏やかに洗浄し、DH10に懸濁した。DRGの単離および培養の1日後、DRGを24時間一晩レンチウイルスに感染させた。翌朝、50ng/mLのNGFを補充した新鮮なDH10に培地を完全に置き換えた。感染の24時間後、カルシウムイメージングのために細胞を処理した。
3〜5週齢のマウス由来のDRGニューロンを記載のように収集した。1〜3日間培養した後、NaOHによりpH7.4に調整した、144 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、0.5 MgCl2、5 HEPESおよび10グルコース(mM単位)を含有する細胞外溶液とともにDRGニューロンをチャンバーに移した。チップ抵抗3〜5MΩのホウケイ酸毛細管ガラス電極(Sutter Instrument)を用いて、約23°Cでホール・セル・カレント・クランプ・レコーディングを行った。内部溶液には80 K−アセテート、30 KCl、40 HEPESおよび1 CaCl2(mM単位)を含有させ、水酸化カリウム(KOH)によりpH7.4に調整した。パッチクランプのために直径15〜25μmの小径ニューロンを選択した。Axopatch 700B増幅器とpClamp9.2ソフトウェアパッケージ(Axon Instrument)を備えたDigidata 1322Aデジタイザーを使用してデータを取得した。20秒間灌流することにより1mMのクロロキン(CQ)を加え、新たに生成した50μMのビリルビンをピペットにより加えた。各細胞の記録の最後に、50mM KClを含有する溶液を適用した。KClを加えた後に活動電位を発生させることができるニューロンのみが、正常であり、データ分析に含めるのに適切であると考えられた。
NanoTemper monolith NT.115機器を使用したマイクロスケール熱泳動によって、様々なリガンドに対するMRGPRA1、MRGPRX4およびMRGPRC11の結合等温式を決定した27。結合緩衝液(20mM Trisおよび150mM NaCl(pH8.8))中で、室温で5分間、10μMの目的のGFPタグ付き受容体とともにリガンドをプレインキュベートした。受容体を安定に発現する細胞から、膜画分として受容体を粗精製した45。薄明かりで0.1M NaOHにヘム代謝産物を新たに溶解し、次いで、アッセイ緩衝液に希釈した。凍結乾燥したBAM8−22を結合緩衝液に溶解した。受容体とのインキュベーションの前に、各リガンドのpHを評価した。NanoTemper製のNT.115 Hydrophobic−Treated Capillariesに試料を添加した。20%LED電力および15%MST電力を使用して、マイクロスケール熱泳動実験を行った。3つの独立した実験から得られたデータを用いて、質量作用の法則を使用してKDを計算した。ビリルビンと受容体との間の結合は純粋に熱泳動的に評価したのに対して、BAM8−22とMRGPRC11との間の結合はT−Jumpによって評価した。初期蛍光に著しい偏差のある試料は除外した。
前述のように、GTPの放射性標識された非加水分解性形態である[35S]グアノシン−5’−(γ−チオ)トリホスフェート([35S]GTPγS)の結合を測定することによって、MRGPRの活性化を決定した45。要約すると、10μMのGDPを補充した175μLのアッセイ緩衝液(50mM HEPES、5mM MgCl2、100mM NaCl、1mM EDTA、0.1%Triton 80)に10μgの粗膜画分を希釈し、室温で5分間インキュベートした。次いで、50μMビリルビンを補充した最終容量199μLのアッセイ緩衝液中でさらに1分間膜をインキュベートした。次いで、10nM[35S]GTPγSを加えて試料を200μLにした。穏やかに撹拌しながら、試料を4℃で2時間インキュベートした。GF/Bフィルター上への急速濾過により実験を終了し、洗浄緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM MgCl2および50mM NaCl(pH7.4))で3回洗浄した。次いで、フィルターをシンチレーションカクテルに浸漬し、計数した。10μMの非標識GTPγSとの競合によって非特異的結合を決定した。GTPγS結合アッセイは、2回の独立した実験として3連で行った。
成体マウス(5〜6週齢)をペントバルビタールにより麻酔し、20mLの冷0.1M PBS(pH7.4)、続いて25mLの冷固定剤(0.1M PBS中の4%ホルムアルデヒド(v/v)および14%飽和ピクリン酸(v/v))を灌流した。灌流したマウスからDRGを切除し、4℃の4%パラホルムアルデヒド中に1時間かけて後固定した。20%スクロース(w/v)中で組織を24時間超かけて凍結保護してから、最適切断温度化合物(OCT)に包埋し、クライオスタットを用いて切片にした。スライド上で切片を37°Cで1時間乾燥させ、4%パラホルムアルデヒドにより21〜23°Cで10分間固定した。ブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清(v/v)、PBS中0.2%Triton X−100(v/v)、pH7.4)中でスライドを21〜23°Cで1時間プレインキュベートし、次いで、一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。二次抗体のインキュベーションを21〜23℃で2時間行った。一次抗体については、CGRP(T−4239、Peninsula、1:1,000)に対してウサギ抗体、GFP(A−11122、Molecular Probes、1:1,000)に対してウサギ抗体とした。二次抗体については、ウサギに対するヤギ抗体(A11011、Alexa 568コンジュゲート;A11008、Alexa 488コンジュゲート;Molecular Probes)をブロッキング溶液で1:500に希釈して使用した。
先に記載された報告では、GFPタグ付きMRGPRA3、MRGPRC11、MRGPRD、MRGPRX1およびMRGPRX2を発現するHEK293安定細胞株が生成された21、23、46。要約すると、Lipofectamine 3000を使用して、HEK細胞に目的の受容体を含有するプラスミドをトランスフェクトした。3日後、0.5mg/mLのG418を使用して細胞を選択した。3週間後、モノクローナルコロニーを樹立し、各々の最高発現クローンを同定した。この試験では、Mrgpra1およびMRGPRX4をpEGFP−N1に挿入し、HEK293細胞にトランスフェクトした。0.5mg/mLのG418を使用してMRGPR陽性細胞を3週間かけて選択し、その後、FACSによりGFP陽性細胞を選別し、モノクローナル的に拡大した。試験のために、GFP蛍光によって測定された際に、同様のレベルのMRGPRA1およびMRGPRX4を発現する2つの系統を選択した。
分析用LC‐18カラム、25cm×4.6mm(Xterra、Waters Corporation)を用いたHPLCにより、血漿ビリルビンを検出した。移動相(60%メタノール/40%水(v/v)(pH5.2)(溶媒A)および100%メタノール(溶媒B)中の0.1M酢酸アンモニウム)の勾配でビリルビンを溶出した。ビリルビンは以下のように溶出した:0〜14分:100%A〜100%Bの直線勾配;14〜19分:100%A〜100%Bの直線勾配;19〜24分:100%Aでのイソクラティック溶出。ビリルビンは約14〜15分の保持時間を示し、450nmで吸光度を測定することにより検出された。内部標準として試料に10μMビリルビンを加えることにより、血漿ビリルビンに対応するピークを確認した。
1−ナフチルイソチオシアネート(ANIT;Sigma)をオリーブ油(Sigma)に可溶化した。動物に25mg/kgのANITを5日間連日経口投与した。5日目に、かゆみ行動のために動物を順応させた。6日目に、動物を試験チャンバーに入れ、1時間ビデオ録画した。1時間にわたり、後足のいずれかによる連続的な掻破運動として定義される掻破発作の回数を数え、5分間隔でビニングした。かゆみ行動を評価した後、動物にペントバルビタール(50mg/kg、i.p.)を投与した。心臓穿刺により血液を採取し、ヘパリン処理したチューブに入れた(BD Biosciences)。遠心分離後、血漿を収集し、アリコートし、分析まで−20℃で保存した。Cell Biolabs製の蛍光測定キットにより胆汁酸値を評価した。適用可能な場合には、その後、マウスを組織学的検査に進めた。
ANIT誘発胆汁うっ滞の組織学的評価のために、動物に冷PBS、続いて4%PFA(w/v)を経心臓的に灌流した。肝臓を切除し、4%PFA中に一晩かけて後固定し、10〜30%スクロース(w/v)の勾配により凍結保存した。肝臓をOCTに包埋し、クライオスタットを用いて切片にした。切片を室温で1時間乾燥させた後、ヘマトキシリンにより染色し、エオシンにより対比染色し、リンスし、次いで脱水した。
Spartan 16を用いてDFT計算を行い、wxMacMolPltを用いてモデル化した。6−31G(d)基底関数セットを用いたDFT−Hartree FockハイブリッドB3LYP理論を使用して、形状の最適化とシングルポイントエネルギー計算とを行った。気相298 Kの基底状態でエネルギーを計算した。
FeCl3によるビリベルジンIXα/ビリベルジンXIIIαへの選択的酸化によって、または免疫沈降によって血漿ビリルビンを枯渇させた。FeCl3は、20%FeCl3の0.1N HCl/メタノール溶液として調製した。37°Cで10分間、最終濃度1.5%FeCl3で血漿とともにFeCl3をフラックスした。FeCl3は穏やかな酸化剤であるが、ビリルビンがビリベルジンに酸化される酸化還元電位を示す47。また、正常ウサギIgG、またはタンパク質A/Gビーズに結合した抗ビリルビン抗体(前述のように生成された10)5μgとともに血漿を25°Cで1時間インキュベートすることによってビリルビンを免疫沈降させた。ビリルビン枯渇を定量するために、100%メタノールを用いて試料からビリルビンを抽出し、HPLCおよびUV可視分光分析に供した。吸光度を0ODのベースラインに調整し、クロマトグラフィーのピーク下面積を積分することによってビリルビンを定量した。
特に明記しない限り、群のデータは平均±標準誤差として表した。Two−tailed unpaired Student’s t−tests、フィッシャー直接確率法およびカイ二乗検定を使用して統計的比較の有意性を決定し、P<0.05で有意差があると解釈した。統計的検出力分析を使用してサンプルサイズを正当化し、分散はF検定により決定したように全処置群間で類似していると決定した。成功した手順および/または処置を受けたサンプルまたは動物は分析から除外しなかった。行動実験はいずれも、遺伝子型および処置の両方を考慮し、ブロックした方法でデザインした。
かゆみは、臨床的には掻痒症として知られており、皮膚と粘膜表面とを支配する後根神経節の一次感覚ニューロンによって知覚される5〜8。ヒスタミン介在性のかゆみには効果的な治療選択肢が存在するが、黄疸関連掻痒症などの非ヒスタミン作動性疾患の治療は比較的困難である2。黄疸、すなわち皮膚、強膜および粘膜の黄変は、黄色の代謝産物であるビリルビンが異常に蓄積した結果である。
原因となるMrgprを特定するために、クラスター−/−マウスでは欠失させた12のMrgprの各々をヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞に個別に発現させ、ビリルビンの適用時に細胞内カルシウムの変化をモニターした。陽性のリガンド‐受容体相互作用時にカルシウム応答が確実に観察されるようにするために、ホスホリパーゼC(PLC)を介してカルシウムシグナル伝達にGPCRを結合するGαタンパク質であるマウスGタンパク質αサブユニットGα15を安定に発現するHEK293細胞を使用した。
これまでの試験では、MRGPRA1およびMRGPRX4の両方が後根神経節(DRG)内の感覚ニューロンのサブセットに発現することが実証されている4、25、29。6週齢の成体マウスは、わずかな割合の感覚ニューロンにMRGPRA1を発現する。(図25A)。50μMビリルビンの適用により、小径(<30μm)WT DRG感覚ニューロン(50のうち5)に強力な活動電位が誘発された。しかし、ビリルビンは、A1−/−ニューロンでは活動電位を誘発することができなかった(60のうち0)(図25B)。感覚ニューロンでのMRGPRA1の発現は、かゆみ感覚ニューロンの典型であるMRGPRA3発現と重複している(Dong et al.,2001;Han et al.,2012)。電気生理およびCa2+イメージングの両方によって決定されるように、ビリルビン応答性ニューロンは、MRGPRA3のリガンドである1mMクロロキンにも応答するニューロンと部分的に重複した(Qin Liu,Dong,Cell 2009)(図25C、図30A)。ビリルビン感受性ニューロンは、かゆみ感覚ニューロンに特徴的な直径である20.4±1.3μmの平均細胞体直径を有した(図30B)。WT DRGニューロンの約5%が50μMビリルビンの適用に応答したが、クラスター−/−またはA1−/−DRG由来の感覚ニューロンはほとんど応答しなかった(図25D〜図25E)。
ビヒクル処置と比較して、ANIT処置では、全動物の掻痒症が有意に増加した(図A)。しかし、クラスター−/−およびA1−/−マウスはWTマウスよりも著しく掻破が少なく(図26A)、MRGPRA1が胆汁うっ滞性掻痒症の成分を媒介したことが示唆された。ヒトでは、胆汁酸、内因性オピオイドおよびLPAが胆汁うっ滞性血清中で増加することが多く、掻痒症を媒介することが示されている31〜34。ANIT処置動物の血清は胆汁酸の上昇を示したが(図31E)、内因性オピオイドペプチドであるメトエンケファリン35、36もLPA産生酵素オートタキシンも上昇しなかった(図31F〜図31G)。
様々な病態により黄疸、ビリルビンの蓄積による皮膚の黄変が生じる。黄疸を有する患者は、一般に、激しい非ヒスタミン作動性のかゆみを経験すると報告されている1〜3。この関連にもかかわらず、ビリルビン自体の起痒能力は検討されておらず、ビリルビン受容体も同定されていない。本明細書では、ビリルビンの病態生理学的レベルが末梢かゆみ感覚ニューロンを刺激し、一次感覚ニューロンに発現するGタンパク質共役受容体のファミリーであるMrgprを介して掻痒症を誘発することが実証された4。ビリルビンは、これまで特徴付けられていなかった2つのMrgpr、マウスMRGPRA1およびヒトMRGPRX4に結合し活性化する。病理学的高ビリルビン血症の2つのマウスモデルでは、ビリルビン産生酵素であるMrgpra1またはBVRのいずれかの遺伝子欠失がかゆみを減弱することが示された。同様に、高ビリルビン血症患者から分離した血漿は野生型動物に対してかゆみを誘発したが、Mrgpra1−/−動物には誘発しなかった。ビリルビンを除去すると、患者血漿の起痒能力が低下した。これらのデータに基づいて、MRGPRを標的とすることは黄疸に関連するかゆみを軽減するための有望な戦略である
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製造業者のワンステッププロトコルによって説明されているように、384ウェルのホモジニアス時間分解蛍光法(HTRF IP−One(登録商標)、CisBio International、Bagnols/Ceze、フランス、カタログ番号62IPAPEJ)を使用して、細胞内イノシトールリン酸値を決定した。要約すると、組換えヒトMrgprX4を安定に発現するHEK293細胞を採取し、フェノールレッド不含OptiMEM(ThermoFisher)中に懸濁し、15,000細胞/ウェルで10μL/ウェルの容量で、384ウェルアッセイプレート(Perkin Elmer、Proxiplate−Plus(登録商標)カタログ番号6008280)中に播種した。次いで、加湿CO2インキュベーター内でこれらの細胞プレートを37℃で一晩インキュベートした。試験化合物をDMSOに溶解し、アッセイ緩衝液(Tris.HCl 40mM、NaCl 300mM、LiCl 350mM、pH8)でさらに希釈し、細胞に加えた(2μL添加、最終アッセイ濃度は典型的には10μM)。この構成では、アッセイはアゴニストおよびインバースアゴニストを検出することができる。アンタゴニストの検出のために、試験化合物を加えた後、ビリルビンを加えた(2μL添加、最終アッセイ濃度100μM)。次いで、アッセイ形式(アゴニスト/インバースアゴニスト対アンタゴニスト)とは関係なく、プレートを37℃で1時間インキュベートし、続いて室温で30分間インキュベートした。次いで、溶解/検出試薬(6uL/ウェル)を加え、プレートを室温で1時間インキュベートした後、Perkin Elmer EnVision(登録商標)またはBMG Pherastar(登録商標)などのHTRF互換リーダーにより読み取る。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではない。他の態様、利点および修正は、添付の特許請求の範囲内に入る。
Claims (79)
- 1つ以上のMrgprX4またはMrgprX3 Gタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
MrgprX4またはMrgprX3 Gタンパク質共役受容体を発現する1つ以上の細胞を候補薬剤と接触させることと、
前記1つ以上の細胞の応答を検出することによって評価用の前記候補薬剤を選択して、前記Gタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節することとを含む方法。 - 前記細胞の応答が、前記Gタンパク質共役受容体の活性化として検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記候補薬剤が前記Gタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節するかどうかを決定することをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記MrgprX4またはMrgprX3 Gタンパク質共役受容体媒介症状が、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および創傷治癒から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞が、免疫細胞、神経細胞および皮膚細胞から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞が樹状細胞を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞がケラチノサイトを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞が、後根神経節の一次感覚ニューロンを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出された応答が、細胞内カルシウムまたは活性化の増加であり、イノシトールリン酸検出によっても評価することができる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- MrgprX3またはMrgprX4の活性化が、細胞内カルシウムの増加を特定することにより、またはイノシトールリン酸検出により検出される、請求項9に記載の方法。
- 対象のGタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のMrgprX3アンタゴニストおよび/またはMrgprA6アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Gタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。 - 前記Gタンパク質共役受容体媒介症状が、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および/または創傷治癒から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項11または12に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のGタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のMrgprX3アゴニストおよび/またはMrgprA6アゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Gタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。 - 前記Gタンパク質共役受容体媒介症状が、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、および/または皮膚障害および/または創傷治癒から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記アゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項15または16に記載の方法。
- 前記アゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のGタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のMrgprX4アンタゴニストおよび/またはMrgprA1アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Gタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。 - 前記Gタンパク質共役受容体媒介症状が、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症および胆汁うっ滞性掻痒症から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項19または20に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のGタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のMrgprX4アゴニストおよび/またはMrgprA1アゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Gタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。 - 前記Gタンパク質共役受容体媒介症状が、疼痛、掻痒症および胆汁うっ滞性掻痒症から選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項23または24に記載の方法。
- 前記アゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物を投与することにより誘発される、対象の薬物有害反応の重症度を軽減する方法であって、
対象に前記化合物を投与することと、
MrgprA1アンタゴニストおよび/またはMrgprX4アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより前記対象の薬物有害反応の前記重症度を軽減することとを含む方法。 - 対象が化合物に対する薬物有害反応を発現するリスクが高いかどうかを決定する方法であって、
化合物に対する薬物有害反応を有するか、化合物に対する薬物有害反応を発現するリスクのある対象から試験試料を得ることと、
前記試験試料中の少なくとも1つのGタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルを決定することと、
前記試験試料中の前記Gタンパク質共役受容体遺伝子の前記発現レベルと、参照試料中の前記Gタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルとを比較することと、
前記試験試料中の前記Gタンパク質共役受容体遺伝子の前記発現レベルが前記参照試料中の前記Gタンパク質共役受容体遺伝子の前記レベルと比較して差次的に発現している場合、前記対象に対する前記化合物の投与が薬物有害反応を誘発するであろうことを決定することとを含む方法。 - 前記Gタンパク質共役受容体遺伝子がMrgprA1またはMrgprX4である、請求項28に記載の方法。
- 前記MrgprA1またはMrgprX4が変異体である、請求項29に記載の方法。
- 有効量のGタンパク質共役受容体アンタゴニストを含む、Gタンパク質共役受容体媒介症状または障害の治療のための医薬組成物。
- 前記Gタンパク質共役受容体アンタゴニストがMrgprX4またはMrgprX3アンタゴニストである、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項31または32に記載の医薬組成物。
- 有効量のGタンパク質共役受容体アゴニストを含む、Gタンパク質共役受容体媒介症状または障害の治療のための医薬組成物。
- 前記Gタンパク質共役受容体アンタゴニストがMrgprX4またはMrgprX3アゴニストである、請求項34に記載の医薬組成物。
- 前記アゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項34または35に記載の医薬組成物。
- 1)請求項31から36のいずれか一項に記載の医薬組成物と、2)前記Gタンパク質共役受容体症状または障害を治療するための指示書とを含むキット。
- 前記指示書が、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および/または創傷治癒を治療するためのものである、請求項37に記載のキット。
- mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX3(MrgprX3)またはMrgprA6を発現する組換え核酸を含む単離細胞。
- 前記組換え核酸がMrgprX3を発現する、請求項39に記載の単離細胞。
- 前記組換え核酸がMrgprA6を発現する、請求項39に記載の単離細胞。
- MrgprX3を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項40に記載の単離細胞。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprX3タンパク質を産生する、請求項42に記載の単離細胞。
- MrgprA6を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項41に記載の単離細胞。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprA6タンパク質を産生する、請求項44に記載の単離細胞。
- 前記単離細胞が、ヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞、自然免疫細胞、幹細胞または細胞株を含む、請求項41に記載の単離細胞。
- mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX4(MrgprX4)またはMrgprA1を発現する組換え核酸を含む単離細胞。
- 前記組換え核酸がMrgprX4を発現する、請求項47に記載の単離細胞。
- 前記組換え核酸がMrgprA1を発現する、請求項47に記載の単離細胞。
- MrgprX4を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項48に記載の単離細胞。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprX4タンパク質を産生する、請求項50に記載の単離細胞。
- MrgprA1を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項49に記載の単離細胞。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprA1タンパク質を産生する、請求項52に記載の単離細胞。
- 前記単離細胞が、ヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞、自然免疫細胞、幹細胞または細胞株を含む、請求項47に記載の単離細胞。
- MrgprX3またはMrgprA6のアンタゴニストを同定する方法であって、
請求項39に記載の単離細胞を、皮膚反応または上皮反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、
MrgprX3またはMrgprA6の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのMrgprX3またはMrgprA6の前記活性化と比較してMrgprX3またはMrgprA6の活性化が低下していると、前記候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法。 - MrgprX4またはMrgprA1のアンタゴニストを同定する方法であって、
請求項47に記載の単離細胞を、薬物有害反応またはかゆみ反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、
MrgprX4またはMrgprA1の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのMrgprX4またはMrgprA1の前記活性化と比較してMrgprX4またはMrgprA1の活性化が低下していると、前記候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法。 - MrgprX3、MrgprX4または他のMrgprメンバーの二重/多価アンタゴニストを同定する方法であって、
請求項39から54 49のいずれか一項に記載の単離細胞を、皮膚または上皮反応および薬物有害反応またはかゆみ反応を誘発する化合物と接触させることと、前記単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、
MrgprX4およびMrgprX3の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのMrgprX4およびMrgprX3の前記活性化と比較してMrgprX4およびMrgprX3の活性化が低下していると、前記候補化合物が多価アンタゴニストであると決定される方法。 - MrgprX3またはMrgprA6のアゴニストを同定する方法であって、
請求項39から46のいずれか一項に記載の単離細胞を、皮膚反応または上皮反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、
MrgprX3またはMrgprA6の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのMrgprX3またはMrgprA6の前記活性化と比較してMrgprX3またはMrgprA6の活性化が増大していると、前記候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法。 - MrgprX4またはMrgprA1のアゴニストを同定する方法であって、
請求項47から54のいずれか一項に記載の単離細胞を、薬物有害反応またはかゆみ反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、
MrgprX4またはMrgprA1の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのMrgprX4またはMrgprA1の前記活性化と比較してMrgprX4またはMrgprA1の活性化が増大していると、前記候補化合物がアゴニストであると決定される方法。 - mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX3(MrgprX3)またはMrgprA6を発現する組換え核酸。
- 前記組換え核酸がMrgprX3を発現する、請求項60に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸がMrgprA6を発現する、請求項60に記載の組換え核酸。
- MrgprX3を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項61に記載の組換え核酸。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprX3タンパク質を産生する、請求項63に記載の組換え核酸。
- MrgprA6を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項62に記載の組換え核酸。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprA6タンパク質を産生する、請求項65に記載の組換え核酸。
- mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX4(MrgprX4)またはMrgprA1を発現する組換え核酸。
- 前記組換え核酸がMrgprX4を発現する、請求項67に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸がMrgprA1を発現する、請求項67に記載の組換え核酸。
- MrgprX4を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項68に記載の組換え核酸。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprX4タンパク質を産生する、請求項70に記載の組換え核酸。
- MrgprA1を発現する前記組換え核酸が1つ以上の変異を含む、請求項69に記載の組換え核酸。
- 前記1つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないMrgprA1タンパク質を産生する、請求項72に記載の組換え核酸。
- mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX3(MrgprX3)またはMrgprA6をコードする核酸配列を含むベクター。
- 前記核酸配列が、1つ以上の変異を含むMrgprX3核酸配列をコードする、請求項74に記載のベクター。
- 前記核酸配列が、1つ以上の変異を含むMrgprA6核酸配列をコードする、請求項74に記載のベクター。
- mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX4(MrgprX4)またはMrgprA1をコードする核酸配列を含むベクター。
- 前記核酸配列が、1つ以上の変異を含むMrgprX4核酸配列をコードする、請求項77に記載のベクター。
- 前記核酸配列が、1つ以上の変異を含むMrgprA1核酸配列をコードする、請求項77に記載のベクター。
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