KR102284780B1

KR102284780B1 - Ｔ 세포 활성화 저해제, 이것을 함유하는 의약 조성물 및 ｔ 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102284780B1
Application number: KR1020217005837A
Authority: KR
Inventors: 도시히데 야마시타; 다케카즈 구보
Original assignee: 미쓰비시 타나베 파마 코퍼레이션
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2021-08-02
Also published as: KR20210025700A; KR20190110633A; JPWO2011071059A1; US20160244517A1; EP2510948A1; EP2510948B1; CN102811739A; WO2011071059A1; US9751938B2; EP2510948A4; KR102223464B1; JP5785873B2; KR20210097217A; ES2555060T3; KR20170102378A; US9334323B2; US20120328633A1; KR20120120193A; CN106237331A; KR102425676B1

Abstract

항RGM 중화 항체 등의 RGM 저해 물질을 유효 성분으로 하는 T 세포 활성화 저해제를 제공한다. 이 T 세포 활성화 저해제는, 다발성 경화증 등의 자기 면역 질환이나, 그 밖의 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물로서 유용하다. 또한, 피험 물질을 RGM에 접촉시켜, RGM의 활성 레벨을 저감시키는 피험 물질을 선택함으로써, T 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝을 할 수 있다.

Description

Ｔ 세포 활성화 저해제, 이것을 함유하는 의약 조성물 및 Ｔ 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법{T CELL ACTIVATION INHIBITOR, PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME, AND SCREENING METHOD FOR T CELL ACTIVATION INHIBITING SUBSTANCE}

본 발명은, T 세포 활성화 저해제, 이것을 함유하는 의약 조성물 및 T 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상세하게는, RGM 저해 물질을 유효 성분으로 하는 T 세포 활성화 저해제, 이 T 세포 활성화 저해제를 함유하는 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 피험 물질을 RGM에 접촉시키는 공정을 포함하는 T 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

RGM(repulsive guidance molecule)은 당초 시각계의 축색 유도 분자로서 동정된 막 단백질이다(비특허문헌 1 참조). RGM 패밀리에는 RGMa, RGMb 및 RGMc라고 불리는 3 종류의 멤버가 포함되며, 적어도 RGMa와 RGMb는 동일한 시그널 전달 기구에서 기능하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2 참조). 그 후의 연구에 의해, RGM은, 제노푸스(Xenopus) 및 닭 배(胚)에 있어서의 축색 유도와 라미나(lamina) 형성, 및 마우스 배에 있어서의 두부 신경관의 폐쇄 제어 등의 기능을 갖는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 3 참조). 발생 단계의 기능에 더하여, 성인 인간 및 래트의 중추신경계 손상 후에 재발현하는 것, 래트에게 있어서 RGM 저해가 척수 손상 후의 축색 성장을 항진하여 기능 회복을 촉진하는 것으로부터(비특허문헌 4 참조), RGM은 중추신경계 손상 후의 축색 재생 저해 물질이라고 생각되고 있다. 또한, 특허문헌 1에는 항RGM 중화 항체를 유효 성분으로서 함유하는 축색 재생 촉진제가 개시되어 있다.

다발성 경화증(Multiple Sclerosis)은 뇌와 척수의 신경섬유를 덮는 미엘린(수초)이 염증을 일으켜 탈수가 일어나, 신경의 정보가 잘 전해지지 않게 되기 때문에 시각 장해, 운동 장해, 감각 저하, 평형 장해 등의 여러 가지 증상이 나오는 질환이며, 아직 원인이 명확하지 않아, 현대 의학으로는 완전히 고칠 수 없는 만성병이다. 자기 면역 질환의 하나라고 인식되어 있지만, 그 발증 메카니즘의 상세한 것은 해명되지 않았다. 예컨대, 비특허문헌 5에는, CD4⁺ T 세포가 뇌 및 척수의 백질에 있어서의 미엘린 및 올리고덴드로사이트를 면역적으로 공격하는 것이 보고되어 있다.

특허문헌 1 : 일본 특허 제3981148호 공보

비특허문헌 1 : Stahl, B., Muller, B., von Boxberg, Y., Cox, E.C. & Bonhoeffer, F. Biochemical characterization of a putative axonal guidance molecule of the chick visual system. Neuron 5, 735-743(1990) 비특허문헌 2 : Liu, X., Hashimoto, M., Horii, H., Yamaguchi, A., Naito, K. and Yamashita, T. Repulsive guidance molecule b inhibits neurite growth and is increased after spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 795-800(2009) 비특허문헌 3 : Yamashita, T., Mueller, B.K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 17, 29-34(2007) 비특허문헌 4 : Hata, K. et al. RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury. J. Cell Biol. 173, 47-58(2006) 비특허문헌 5 : Trapp, B.D., Ransohoff, R.M., Fisher, E. & Rudick, R. Neurodegeneration in multiple sclerosis: relationship to neurological disability. Neuroscientist 5, 48-57(1999)

본 발명은, RGM의 신규의 기능을 알아내어, 신규의 T 세포 활성화 저해제, T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물, T 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서 이하의 각 발명을 포함한다.

[1] RGM 저해 물질을 유효 성분으로 하는 T 세포 활성화 저해제.

[2] RGM 저해 물질이 항RGM 중화 항체인 상기 [1]에 기재한 T 세포 활성화 저해제.

[3] RGM 저해 물질이 RGM siRNA인 상기 [1]에 기재한 T 세포 활성화 저해제.

[4] 상기 [1]∼[3] 중 어느 것에 기재한 T 세포 활성화 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

[5] T 세포 활성화에 기인하는 질환이 자기 면역 질환인 상기 [4]에 기재한 의약 조성물.

[6] 자기 면역 질환이 다발성 경화증인 상기 [5]에 기재한 의약 조성물.

[7] 피험 물질을 RGM에 접촉시키는 공정과, 상기 RGM의 활성 레벨을 측정하는 공정과, 상기 활성 레벨을, 피험 물질에 접촉하지 않은 RGM의 활성 레벨과 비교하는 공정과, RGM의 활성 레벨을 저감시키는 피험 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법.

[8] RGM 저해 물질을 RGM 발현 세포와 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 활성화 저해 방법.

[9] RGM 저해 물질이 항RGM 중화 항체인 상기 [8]에 기재한 T 세포 활성화 저해 방법.

[10] RGM 저해 물질이 RGM siRNA인 상기 [8]에 기재한 T 세포 활성화 저해 방법.

[11] 포유동물에 대하여, 상기 [1]∼[3] 중 어느 것에 기재한 T 세포 활성화 저해제의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 면역 질환의 예방 또는 치료 방법.

[12] 자기 면역 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제조하기 위한, 상기 [1]∼[3] 중 어느 것에 기재한 T 세포 활성화 저해제의 사용.

[13] 자기 면역 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 상기 [1]∼[3] 중 어느 것에 기재한 T 세포 활성화 저해제.

본 발명에 의해 신규의 T 세포 활성화 저해제를 제공할 수 있다. 이 T 세포 활성화 저해제는 T 세포 활성화에 기인하는 질환, 예컨대 자기 면역 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 T 세포 활성화 저해 물질은 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방약 또는 치료약의 유효 성분의 후보가 된다.

도 1은 LPS에 의해 자극받은 골수 유래 수상 세포(BMDCs)에 있어서의 RGMa의 mRNA 발현을 리얼타임 정량 PCR로 측정한 결과를 도시하는 도면이다.
도 2는 LPS에 의해 자극받은 BMDCs에 있어서의 RGMa의 발현을 웨스턴 블로팅으로 검출한 결과를 도시하는 도면이다.
도 3은 CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지와, 각종 농도의 인간 RGMa-Fc와의 결합을 플로우 사이토메트리에 의해 해석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 4(a)는 CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지에 있어서의 전체 Rap1 및 활성형 Rap1을 웨스턴 블로팅에 의해 검출한 결과를 도시하는 도면이다.
도 4(b)는 도 4(a)의 웨스턴 블로팅의 밴드를 Scion image를 이용하여 정량하여 상대적인 Rap1 활성화 레벨을 산출한 결과를 도시하는 도면이다.
도 5(a)는 RGMa 자극의 유무에 있어서의 비장 세포의 피브로넥틴에의 접착율을 측정한 결과를 도시하는 도면이다.
도 5(b)는 RGMa 자극의 유무에 있어서의 CD4⁺ T 세포의 ICAM1에의 접착율을 측정한 결과를 도시하는 도면이다.
도 6은 항RGMa 중화 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스와 컨트롤 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스에 있어서의 실험적 자기 면역성 뇌척수염(EAE)의 임상 증상을 스코어에 의해 수치화하여, 경시적 변화를 관찰한 결과를 도시하는 도면이다.
도 7의 (A)는 각 그룹에 있어서의 EAE의 임상 증상 발현율을 도시하는 도면이고, (B)는 각 그룹에 있어서의 EAE 발병일의 평균치를 도시하는 도면이고, (C)는 각 그룹의 각 마우스의 EAE 스코어 최대치의 평균치를 도시하는 도면이고, (D)는 각 그룹의 각 마우스의 EAE 스코어 누적치의 평균치를 도시하는 도면이다.
도 8의 (a) 및 (b)는 컨트롤 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스의 경수(頸髓)의 HE 염색 조직상이며, (c) 및 (d)는 항RGMa 중화 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스의 경수의 HE 염색 조직상이다.
도 9는 컨트롤 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스의 골수 조직 표본 및 항RGMa 중화 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스의 골수 조직 표본에 있어서, 염증 인덱스에 기초하여 염증의 정도를 수치화한 결과를 도시하는 도면이다.
도 10은 컨트롤 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스 및 항RGMa 중화 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스로부터 조제한 비장 세포의 항원 특이적 T 세포 활성화 및 비특이적 T 세포 활성화를 검토한 결과를 도시한 도면으로, (a)는 세포 증식, (b)는 IL-2의 분비량, (c)는 IFN-γ의 분비량, (d)는 IL-17의 분비량 결과를 도시하는 도면이다.
도 11은 항RGMa 중화 항체를 투여한 재발성 다발성 경화증 모델 마우스와 컨트롤 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스에 있어서의 EAE의 임상 증상을 스코어에 의해 수치화하여, 경시적 변화를 관찰한 결과를 도시하는 도면이다.
도 12는 RGMa 유전자 넉다운한 BMDCs 또는 RGMa 유전자 넉다운하지 않은 BMDCs에 대하여 MOG 자극을 행한 후, 이들의 BMDCs를 리시피언트 마우스에게 이식하여, 리시피언트 마우스에 있어서의 EAE의 임상 증상을 스코어에 의해 수치화하여, 경시적 변화를 관찰한 결과를 도시하는 도면이다.
도 13은 항RGMa 중화 항체 또는 컨트롤 항체, 및 MOG을 투여한 도너 마우스로부터 조제한 CD4⁺ T 세포에 대하여 MOG 자극을 행한 후, 이들 CD4⁺ T 세포를 리시피언트 마우스에게 이식하여, 리시피언트 마우스에게 있어서의 EAE의 임상 증상을 스코어에 의해 수치화하여, 경시적 변화를 관찰한 결과를 도시하는 도면이다.

본 발명자들은, 골수 유래 수상 세포(BMDCs)에 RGM이 발현하고 있는 것, CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지에 RGM 수용체가 발현하고 있는 것을 처음으로 알아내어, RGM이 CD4⁺ T 세포나 CD11b⁺ 마크로파지의 RGMa 수용체에 결합함으로써 Rap1이 활성화되고, 그 결과 CD4⁺ T 세포나 CD11b⁺ 마크로파지의 세포 접착 활성이 증강하는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은, 다발성 경화증 모델 마우스를 이용한 실험에 있어서, 항RGM 중화 항체의 투여는, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG)로 유도한 다발성 경화증 모델 마우스(실험적 자기 면역성 뇌척수염(EAE) 마우스)의 임상 증상 및 조직 병변 양쪽을 경감하는 것, 항RGM 중화 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스로부터 채취한 비장 세포에서는, 항원 특이적 및 비특이적인 T 세포 활성화가 현저히 감약(減弱)하고 있는 것을 밝혀냈다. 또한, 항RGM 중화 항체의 투여는, 미엘린 프로테오리피드 단백질(PLP)로 유도한 재발성 다발성 경화증 모델 마우스에 있어서의 EAE 임상 증상의 발현을 억제하는 것, RGMa를 넉다운한 BMDCs에 MOG 자극을 주어 마우스에게 이식한 경우, 이식을 받은 마우스에게 있어서의 EAE 임상 증상의 발현이 억제되는 것, 항RGM 중화 항체 및 MOG를 투여한 마우스로부터 조제한 CD4⁺ T 세포에 MOG 자극을 주어 마우스에게 이식한 경우, 이식을 받은 마우스에게 있어서의 EAE 임상 증상의 발현이 억제되는 것을 알아냈다(실시예 참조).

〔T 세포 활성화 저해제〕

본 발명은 RGM 저해 물질을 유효 성분으로 하는 T 세포 활성화 저해제를 제공한다. 본 발명의 T 세포 활성화 저해제의 유효 성분인 RGM 저해 물질은, RGM의 활성(RGM 활성)을 저해하는 물질 및 RGM의 발현을 저해하는 물질의 어느 것이라도 좋다.

RGM 활성을 저해하는 물질로서는, 예컨대, RGM 활성을 저해하는 저분자 화합물, 항RGM 중화 항체 등을 들 수 있다. RGM 활성의 지표로서는, 예컨대, RGM의 RGM 수용체에의 결합 활성(실시예 1의 (1-2) 참조), Rap1 활성화의 유도 활성(실시예 1의 (1-3) 참조), T 세포의 ICAM에의 접착 증강 활성(실시예 1의 (1-4) 참조) 등을 들 수 있고, 이들 지표를 이용하여 평가했을 때에, RGM 활성을 저해(감약)하는 물질을 RGM 저해 물질이라고 부른다. RGM 활성을 저해하는 저분자 화합물로서는, 예컨대 Rho 키나아제 저해제로서 알려져 있는 Y27632(M. Uehata, et al. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature 389, 990(1997))를 들 수 있다.

항RGM 중화 항체는, RGM에 결합하여 그 활성을 저해하는 항체면 좋고, 예컨대, RGM에 결합하여 RGM이 RGM 수용체에 결합할 수 없게 하는 항RGM 항체 등을 들 수 있다. 항RGM 중화 항체는, RGM 또는 그 프래그먼트를 면역원으로서 이용하여, 공지된 방법으로 제작할 수 있다. 얻어진 항체가 중화 항체인 것은, 상기 RGM 활성의 지표를 이용하여 확인할 수 있다. RGM으로서는, 예컨대 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 인간 RGMa, 서열 번호 4에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 래트 RGMa 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 생물에서 유래하는 RGM을 면역원으로서 적합하게 이용할 수 있다. 이들 아미노산 서열은 공지된 데이터베이스(Protein Data Bank 등)로부터 용이하게 취득할 수 있다.

항RGM 중화 항체는 폴리클로날 항체라도 모노클로날항체라도 좋다. 또한, 완전한 항체 분자라도 좋고, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 프래그먼트(예컨대, Fab, F(ab')₂, Fab', Fv, scFv 등)라도 좋다. 폴리클로날 항체는, 예컨대 다음과 같이 제작하여 취득할 수 있다. 즉, 항원(RGM 또는 이들의 프래그먼트)을 PBS에 용해하여, 원하는 바에 따라 통상의 아쥬반트(예컨대 프로인트 완전 아쥬반트)를 적량 혼합한 것을 면역원으로 하여 포유동물(마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 등)을 면역한다. 면역 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 1회 또는 적당한 간격으로 복수 회, 피하 주사 또는 복강내 주사하는 방법이 바람직하다. 이어서, 통상의 방법에 따라서, 면역한 동물로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여, 폴리클로날 항체 획분을 정제함으로써 취득할 수 있다. 모노클로날 항체는, 상기 면역된 포유동물로부터 얻은 면역 세포(예컨대 비장 세포)와 미엘로마 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻고, 이 하이브리도마의 배양물로부터 항체를 채취함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 집어넣어, 이것을 숙주 세포에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 재조합형의 모노클로날 항체를 생성시킬 수도 있다. 또한, 파지 디스플레이법을 이용하여 제작할 수도 있다.

항RGM 중화 항체는 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체가 바람직하다. 인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물에서 유래하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 인간 항체의 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역으로 이루어지는 항체를 말한다. 인간화 항체는, 인간 이외의 동물에서 유래하는 항체의 CDR(상보성 결정 영역 : complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR에 이식한 것을 말하며, CDR 이식 항체, 재구성 항체 등이라고도 불린다. 인간화 항체의 FR(프레임워크 영역 : framework region)은, CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 인간화 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록, 항체의 가변 영역에 있어서의 FR의 아미노산 서열을 치환하더라도 좋다. 인간 항체의 정상 영역의 아미노산 서열은 공지된 데이터베이스(Protein Data Bank 등)로부터 취득할 수 있다.

RGM의 발현을 저해하는 물질로서는, 예컨대, RGM 유전자의 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. RGM 유전자로서는, 예컨대 서열 번호 1에 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 인간 RGMa 유전자, 서열 번호 3에 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 래트 RGMa 유전자 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 생물에서 유래하는 RGM 유전자의 염기 서열은 공지된 데이터베이스(GenBank 등)로부터 용이하게 취득할 수 있다. siRNA는 표적이 되는 유전자(본 발명에 있어서는 RGM 유전자)의 발현을 억제할 수 있는 짧은 이중쇄 RNA이다. siRNA로서 기능하는 한, 염기 서열이나 길이(염기 길이)는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 30 염기 미만, 보다 바람직하게는 약 19∼27 염기, 더욱 바람직하게는 약 21∼25 염기이다. shRNA는 단일쇄 RNA로 부분적으로 회문(palindrome)형의 염기 서열을 포함함으로써, 분자 내에서 이중쇄 구조를 취하여, 3' 말단에 돌출부를 갖는 짧은 헤어핀 구조로 이루어지는 약 20 염기쌍 이상의 분자를 말한다. 그와 같은 shRNA는, 세포 내에 도입된 후, 세포 내에서 약 20 염기(대표적으로는 예컨대, 21 염기, 22 염기, 23 염기) 길이로 분해되어, siRNA와 마찬가지로 표적이 되는 유전자(본 발명에 있어서는 RGM 유전자)의 발현을 억제할 수 있다. siRNA 및 shRNA는 RGM 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것이라면 어떠한 형태라도 좋다. siRNA 또는 shRNA는 인공적으로 화학 합성할 수 있다. 또한, 예컨대 T7 RNA 폴리메라아제 및 T7 프로모터를 이용하여, 주형 DNA로부터 안티센스 및 센스의 RNA를 인비트로로 합성할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, RGM 유전자의 DNA 서열 중의 연속되는 5에서부터 100의 염기 서열에 대하여 상보적이거나, 또는 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드면 되며, DNA 또는 RNA의 어느 것이라도 좋다. 또한, 기능에 지장이 없는 한 수식된 것이라도 좋다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법에 의해서 합성할 수 있으며, 예컨대, 시판되는 DNA 합성 장치에 의해서 용이하게 합성할 수 있다.

이와 같이, RGM 저해 물질은, RGM 발현 세포(RGM을 발현하고 있는 세포 또는 RGM 발현능을 갖는 세포)와 접촉함으로써, T 세포 활성화를 저해할 수 있다. 따라서, RGM 저해 물질을 RGM 발현 세포와 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 활성화 저해 방법도 본 발명에 포함된다.

〔의약 조성물〕

본 발명은, 상기 본 발명의 T 세포 활성화 저해제를 함유하는 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은, 바꿔 말하면, RGM 저해 물질을 유효 성분으로 하는 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다.

T 세포 활성화에 기인하는 질환으로서는, 자기 면역 질환, 뇌혈관 장해 등을 들 수 있다. 자기 면역 질환으로서는, 예컨대, 세포성 자기 면역 질환, 류마티스, 다발성 경화증, 신경 자기 면역 질환(길랑 바레 증후군, 신경 베체트병 등), 악성 빈혈, I형(인슐린 의존형) 당뇨병, 전신 에리테마토데스(SLE), 염증성 장질환(IBD), 쉐그렌 증후군, 아토피성 피부염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 자기 면역성 용혈성 빈혈, 자기 면역성 혈소판 감소성 자반병, 사구체신염, 중증근무력증, 하시모토병 등을 들 수 있다. 뇌혈관 장해로서는, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 본 발명의 의약 조성물은 자기 면역 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 것이 바람직하며, 다발성 경화증의 예방 또는 치료에 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은, RGM 저해 물질을 유효 성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 적절하게 배합하여 제제화할 수 있다. 구체적으로는 정제, 피복정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제 등의 경구제; 주사제, 수액, 좌제, 연고, 패치제 등의 비경구제로 할 수 있다. 담체 또는 첨가제의 배합 비율은, 의약품 분야에서 통상 채용되고 있는 범위에 기초하여 적절하게 설정하면 된다. 배합할 수 있는 담체 또는 첨가제는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 물, 생리식염수, 그 밖의 수성 용매, 수성 또는 유성 기제 등의 각종 담체; 부형제, 결합제, pH 조정제, 붕괴제, 흡수 촉진제, 활택제, 착색제, 교미제, 향료 등의 각종 첨가제를 들 수 있다.

RGM 저해 물질이 항RGM 중화 항체인 경우, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된 주사제 또는 수액으로서, 비경구 투여 경로, 예컨대, 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하 또는 국소에 투여하는 것이 바람직하다. 항RGM 중화 항체를 포함하는 주사제 또는 수액은 용액, 현탁액 또는 유탁액으로서 이용할 수 있다. 그 용제로서, 예컨대, 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 용액 및 등장액(예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 붕산, 붕사, 프로필렌글리콜 등의 용액) 등을 이용할 수 있다. 또한, 이 주사제 또는 수액은, 안정제, 용해보조제, 현탁화제, 유화제, 무통화제, 완충제, 보존제, 방부제, pH 조정제 등을 포함하고 있더라도 좋다. 안정제로서는, 예컨대, 알부민, 글로불린, 젤라틴, 만니톨, 글루코오스, 덱스트란, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 티오황산나트륨, EDTA나트륨, 시트르산나트륨, 디부틸히드록시톨루엔 등을 이용할 수 있다. 용해 보조제로서는, 예컨대, 알코올(예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올(예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(예컨대, 폴리솔베이트 80(등록상표), HCO-50 등) 등을 이용할 수 있다. 현탁화제로서는, 예컨대, 모노스테아린산글리세린, 모노스테아린신알루미늄, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 라우릴황산나트륨 등을 이용할 수 있다. 유화제로서는, 예컨대, 아라비아 고무, 알긴산나트륨, 트래거캔스 등을 이용할 수 있다. 무통화제로서는, 예컨대, 벤질알코올, 클로로부탄올, 소르비톨 등을 이용할 수 있다. 완충제로서는, 예컨대, 인산 완충액, 초산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 시트르산 완충액, 트리스 완충액 등을 이용할 수 있다. 보존제로서는, 예컨대, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산에틸, 파라옥시안식향산프로필, 파라옥시안식향산부틸, 클로로부탄올, 벤질알코올, 염화벤잘코늄, 디하이드로초산나트륨, 에데트산나트륨, 붕산, 붕사 등을 이용할 수 있다. 방부제로서는, 예컨대, 염화벤잘코늄, 파라옥시안식향산, 클로로부탄올 등을 이용할 수 있다. pH 조정제로서는, 예컨대, 염산, 수산화나트륨, 인산, 초산 등을 이용할 수 있다.

RGM 저해 물질이 핵산(siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등)인 경우, 비바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터의 형태로 투여할 수 있다. 비바이러스 벡터 형태의 경우, 리포좀을 이용하여 핵산 분자를 도입하는 방법(리포좀법, HVJ-리포좀법, 양이온성 리포좀법, 리포펙션법, 리포펙트아민법 등), 마이크로인젝션법, 유전자총(Gene Gun)으로 캐리어(금속 입자)와 함께 핵산 분자를 세포에 이입하는 방법 등을 이용할 수 있다. siRNA 또는 shRNA를 바이러스 벡터를 이용하여 생체에 투여하는 경우는, 재조합 아데노바이러스, 레트로바이러스 등의 바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 무독화한 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스, 센다이바이러스, SV40 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에, siRNA 또는 shRNA를 발현하는 DNA를 도입하여, 세포 또는 조직에 이 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 세포 또는 조직 내에 유전자를 도입할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 제제는, 예컨대 인간이나 다른 포유동물(예컨대, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에 대하여, 그 유효량을 투여함으로써, T 세포 활성화에 기인하는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 투여량은, 목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기존 병력, 유효 성분의 종류 등을 고려하여 적절하게 설정된다. 예컨대, 유효 성분이 항RGM 중화 항체인 경우, 약 65∼70 kg의 체중을 갖는 평균적인 인간을 대상으로 한 경우, 1일당 0.02 mg∼4000 mg 정도가 바람직하고, 0.1 mg∼200 mg 정도가 보다 바람직하다. 1일당 총투여량은 단일 투여량이라도 분할 투여량이라도 좋다.

〔스크리닝 방법〕

본 발명의 스크리닝 방법은, 피험 물질을 RGM에 접촉시키는 공정, 피험 물질에 접촉한 RGM의 활성 레벨을 측정하는 공정, 측정한 활성 레벨을 피험 물질에 접촉하지 않은 RGM의 활성 레벨과 비교하는 공정, RGM의 활성 레벨을 저감시키는 피험 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것이면 된다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해, T 세포 활성화 저해 물질을 간편하고 또 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

피험 물질과 RGM과의 접촉은, 예컨대, RGM 용액에 피험 물질을 첨가하여, 용해 또는 현탁함으로써 행할 수 있다. RGM은, 시판되는 리콤비난트 RGM이나 정해진 방법에 의해 자체 제조한 리콤비난트 RGM을 사용할 수 있다. 접촉 시간, 접촉 온도는 특별히 한정되지 않고, 적절하게 선택하면 된다. 또한, 피험 물질을 접촉시키지 않는 대조군을 두는 것이 바람직하다. RGM의 활성 레벨은, RGM의 RGM 수용체에의 결합 활성(실시예 1의 (1-2) 참조), Rap1 활성화의 유도 활성(실시예 1의 (1-3) 참조), T 세포의 ICAM에의 접착 증강 활성(실시예 1의 (1-4) 참조) 등을 지표로 하여 측정할 수 있다.

측정한 활성 레벨을 피험 물질에 접촉하지 않은 RGM의 활성 레벨과 비교함으로써, 피험 물질이 T 세포 활성화 저해 물질인지 여부를 판정할 수 있다. 피험 물질을 접촉시키지 않은 RGM의 활성 레벨과 비교하여, 피험 물질을 접촉시킨 RGM의 활성 레벨이 낮으면, 피험 물질이 T 세포 활성화 저해 물질이라고 판정하여, 이것을 선택하면 된다. 바람직하게는 피험 물질을 접촉시킨 RGM의 활성 레벨이 50% 이하, 보다 바람직하게는 25% 이하일 때 T 세포 활성화 저해 물질이라고 판정한다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 T 세포 활성화 저해 물질은, 자기 면역 질환 등의 T 세포 활성화에 기인하는 질환의 예방약 또는 치료약의 유효 성분 후보 물질로서 유용하다. 특히, 다발성 경화증의 예방약 또는 치료약의 유효 성분 후보 물질로서 매우 유용하다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1 : 면역 세포에 있어서의 RGMa 및 RGMa 수용체의 발현〕

(1-1) 골수 유래 수상 세포(BMDCs)에 있어서의 RGMa의 발현

Lutz 등의 방법(Lutz, M.B., et al. J. Immunol. Methods 223, 77-92(1999))에 따라서, C57BL/6 마우스(8∼10주령)로부터 골수 세포를 채취하여, GM-CSF(20 ng/mL, 시그마·알드리치)를 포함하는 배지로 배양함으로써 BMDCs를 취득했다. 실험에는, 배양 개시 후 6일의 BMDCs를 사용했다.

BMDCs에 있어서의 RGMa mRNA의 발현을 리얼타임 정량 PCR로 측정했다. 즉, 배양 개시 후 6일의 BMDCs에 LPS(시그마·알드리치)를 0, 0.01, 0.1 또는 1 ㎍/mL 첨가하여 24시간 배양하여, 활성화시킨 BMDCs를 모았다. RNeasy Kit(키아겐)를 이용하여 BMDCs로부터 토탈 RNA를 추출하고, 역전사 효소(GE헬스케어)를 이용하여 cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 TaqMan 리얼타임 PCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)을 제조업자의 프로토콜에 따라서 행하여, RGMa의 mRNA 발현을 정량 분석했다. 특이적 프라이머와 프로브는 Applied Biosystems로부터 구입했다.

또한, BMDCs에 있어서의 RGMa의 발현을 웨스턴 블로팅으로 검출했다. 즉, LPS 첨가 24 시간 후의 BMDCs(2×10⁶개)를 2×샘플 버퍼(250 mM Tris-HCl, 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루 및 10% β-머캅토에탄올)로 용해하여, 5분간 증비한 후, 각 샘플의 등량을, 환원 조건 하에서 15% SDS-PAGE에 제공했다. 영동 후, 단백질을 PVDF막(Immobilon-P, 밀리포어)에 전사했다. 5% 스킴 밀크 및 0.05% Tween20을 포함하는 PBS로 블로킹한 후, 항RGMa 항체(본 발명자들이 제작한 항체, 비특허문헌 3 참조)와 반응시켜, HRP 표지 이차 항체(Cell Signaling Technology) 및 ECL 화학 발광 시스템(GE헬스케어)을 이용하여 검출했다. 단백질 밴드의 정량은 Scion image를 이용하여 행했다.

리얼타임 PCR의 결과를 도 1에 도시하고, 웨스턴 블로팅의 결과를 도 2에 도시했다. 도 1로부터 분명한 바와 같이, BMDCs에 있어서의 RGMa mRNA의 발현은 LPS의 자극에 의해서 증강되는 것이 드러났다. 또한, 도 2로부터 분명한 바와 같이, 항RGMa 항체가 결합하는 35 kDa 및 50 kDa의 밴드가 존재하여, LPS 자극에 의해서 세포 내의 양이 늘어나는 것이 드러났다. 50 kDa의 밴드는 RGMa의 전체 길이에 상당하고, 35 kDa는 RGMa의 C 말단 프래그먼트이며 RGMa의 성숙체로 추정된다(Mueller, B.K., Yamashita, T., Schaffar, G. & Mueller, R. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361, 1513-1529(2006)). 이들 결과로부터, 활성화된 BMDCs에 있어서 RGMa의 발현이 유도되는 것이 분명하게 되었다.

(1-2) CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지에 있어서의 RGMa 수용체의 발현

C57BL/6 마우스(8∼10주령)로부터 비장을 적출하여, 신속하게 RPMI1640 배지(Invitrogen) 중에 넣어 완만하게 압박하여, ACK 용해 버퍼(Lonza Walkersville)로 적혈구 제거 처리를 하여 세포 현탁액을 얻었다. RPMI1640로 3회 세정 후, 세포 현탁액을 70 ㎛의 셀 스트레이너에 통과하게 하여 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 조제했다. 이 현탁액에 각종 농도의 인간 RGMa의 C 말단 프래그먼트(이하 「RGMa-Fc」라고 함)를 첨가하여 30분간 인큐베이트했다. 세정 후, PE 표지 항CD11b 항체 또는 APC 표지 항CD4 항체와, FITC 표지 항인간 RGMa-Fc 항체(BD Biosciences)를 조합한 면역 염색을 실시하여, 플로우 사이토메트리 해석에 의해 세포와 인간 RGMa-Fc와의 결합을 측정했다. 플로우 사이토메트리 해석에는, FACSCalibur(BD Biosciences) 및 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용했다.

결과를 도 3에 도시했다. 도 3으로부터 분명한 바와 같이, 비장 유래의 CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지는 모두 농도 의존적으로 인간 RGMa-Fc와 결합하는 것이 드러났다. 이 결과로부터, 이들 세포가 RGMa 수용체를 발현하고 있음이 분명하게 되었다.

(1-3) CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지에 있어서의 Rap1 활성화의 검토

이어서, CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지에 결합하는 RGMa에 의해서 중개될 가능성이 있는 시그널 전달에 관해서 검토했다. T 림프구에 있어서, TCR 라이게이션은 Rap1의 일시적 활성화, 및 T 세포의 항원 제시 세포 접촉면에 있어서의 Rap1-GTP의 축적을 야기하고, 이것은 LFA-1(인테그린):ICAM-1(인테그린 리간드)이 중개하는 시그널을 제어하는 것이 알려져 있다(Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000), Katagiri, K., Hattori, M., Minato, N. & Kinashi, T. Mol. Cell Biol 22, 1001-1015(2002)). 그래서, CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지의 Rap1 활성화에 있어서의 RGMa의 관여에 관해서 평가했다.

상기 (1-2)에서 조제한 비장 세포의 단일 세포 현탁액으로부터, 항CD4 자기 비드 및 항CD11b 자기 비드(Miltenyi Biotec)를 각각 이용한 포지티브 소팅에 의해 CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지를 단리하여, 활성형 Rap1을 측정했다. 활성형 Rap1의 측정에는, Rap1 활성화 분석 키트(Upstate Biotech)를 사용하고, 대조로서 CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지를 단리하기 전의 비장 세포를 사용했다. 즉, 각 세포 현탁액에 2 ㎍/mL의 리콤비난트 마우스 RGMa(R&D Systems)를 첨가하여 5분간 처리한 후, Mg²⁺ 용해 버퍼(25 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 2% 글리세롤, 2 mM 오르토바나듐산나트륨, 1 mM 에틸설포닐 플루오라이드 및 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktails)(Roche Diagnostics)를 포함함)로 용해했다. 세포 용해액은 전체 Rap1의 측정에 이용했다. RalGDS 결합 아가로스와 세포 용해액을 4℃에서 30분간 반응시켜, Ral 결합 도메인에 결합한 활성형 Rap1을 침전시켰다. 비드를 Mg²⁺ 용해 버퍼로 세정하고, 2×샘플 버퍼에 재현탁하여 웨스턴 블로팅에 제공했다. 웨스턴 블로팅에는 키트에 첨부된 항Rap1 항체를 이용하여, 상기 (1-1)과 같은 순서로 행했다. Scion image를 이용하여 밴드의 정량을 행하여, 상대적인 Rap1 활성화 레벨을 산출했다.

웨스턴 블로팅의 결과를 도 4(a)에 도시하고, 상대적인 Rap1 활성을 나타내는 그래프를 도 4(b)에 도시했다. 도 4(b)에 있어서, 상대 활성치의 그래프는 3∼4회의 독립된 실험의 평균치 및 표준오차로 나타내고, 「*」는 Student의 t 검정에 있어서 P<0.05임을 나타낸다. 도 4(a)로부터 분명한 바와 같이, 어느 세포나 마우스 RGMa의 처리에 의해 활성형 Rap1(도면에서, Pull down Rap1)이 증가했다. 그리고, 도 4(b)에 도시하는 바와 같이, RGMa의 5분간의 자극에 의해, 비장 세포, CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지의 Rap1은 모두 유의적으로 활성화되는 것이 분명하게 되었다. 이 결과로부터, 수상 세포에 발현한 RGMa가 CD4⁺ T 세포 및 CD11b⁺ 마크로파지 표면의 RGMa 수용체를 통하여 세포 내의 Rap1을 활성화할 가능성이 시사되었다.

(1-4) 림프구 결합 분석

인테그린이 매개하는 접착은, T 세포의 트래피킹 및 활성화에 있어서 중심적 역할을 한다. 또한, TCR이 유도하는 접착은 Rap1의 활성화를 필요로 한다(Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969(2000), Reedquist, K.A. et al. J. Cell Biol. 148, 1151-1158(2000), Suga, K. et al. FEBS Lett. 489, 249-253(2001)). 그래서, RGMa에 의해서 유도된 활성형 Rap1이 접착 활성에 관여하는지 여부를 확인하기 위해서, 림프구 결합 분석을 했다.

세포 접착의 평가는, 선행문헌(Sebzda, E., Bracke, M., Tugal, T., Hogg, N. & Cantrell, D.A. Nat. Immunol. 3, 251-258(2002), Duchniewicz, M. et al. Mol. Cell Biol. 26, 643-653(2006))에 기재된 방법에 준하여 행했다. 즉, 96웰 평저 플레이트(NUNC, MaxiSorp)에, 2 ㎍/mL의 리콤비난트 마우스 ICAM-1/Fc(R&D Systems) 또는 4 ㎍/mL의 피브로넥틴(시그마·알드리치)을 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 정치하여 프리코팅을 했다. PBS로 플레이트를 세정하고, 비특이적인 결합을 막기 위해서 2% BSA를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen)로 37℃, 1시간 블로킹을 행했다. ICAM-1/Fc를 코트한 플레이트는 CD4⁺ T 세포의 평가에 이용하고, 피브로넥틴을 코트한 플레이트는 비장 세포의 평가에 이용했다.

새롭게 조제한 비장 세포 또는 CD4⁺ T 세포를 2.5 μM의 BCECF-AM(2'7'-비스-(2-카르복시에틸)-5-(및-6)-카르복시플루오레세인, 아세톡시메틸 에스테르, Calbiochem)로, 37℃ 30분간 표지하고, 이어서 0.5% BSA를 포함하는 RPMI1640로 세정했다. 5×10⁵개의 세포를 프리코트한 플레이트에 가하고, 2 ㎍/mL의 리콤비난트 RGMa를 포함하는, 또는 포함하지 않는 0.5% BSA 함유 RPMI1640 속에서 37℃ 1시간 인큐베이트했다. 접착하지 않은 세포를 따뜻한 0.5% BSA 함유 RPMI1640로 3회 세정함으로써 제거했다. 접착은 Spectra MAX(Molecular Devices)를 이용하여, 여기 파장 485 nm 형광 파장 538 nm에서 정량했다. 접착율은 1웰에 파종한 전체 세포수에 대한 퍼센테이지로 나타냈다.

비장 세포의 결과를 도 5(a)에, CD4⁺ T 세포의 결과를 도 5(b)에 도시했다. 접착율의 그래프는 3회의 독립된 실험의 평균치 및 표준오차로 나타내고, 「*」 및 「**」은 Student의 t 검정에 있어서 각각 P<0.05 및 P<0.01임을 나타낸다. 도 5(a)로부터 분명한 바와 같이, RGMa 자극을 받은 비장 세포는, RGMa 자극을 받지 않은 비장 세포와 비교하여, 피브로넥틴에 대한 접착율이 유의적으로 높아지는 것이 드러났다. 마찬가지로, 도 5(b)로부터 분명한 바와 같이, RGMa 자극을 받은 CD4⁺ T 세포는, RGMa 자극을 받지 않은 CD4⁺ T 세포와 비교하여, ICAM-1에 대한 접착율이 유의적으로 높아지는 것이 드러났다. 이들 결과로부터, RGMa가 Rap1을 활성화함으로써, 비장 세포 및 CD4⁺ T 세포의 접착 활성이 증강되는 것이 분명하게 되었다.

〔실시예 2 : 다발성 경화증 모델 마우스에 있어서의 항RGMa 중화 항체의 효과 검토〕

(2-1) 다발성 경화증 모델 마우스의 제작

다발성 경화증의 임상 및 병리학적 특징의 연구 모델로서 널리 받아들여지고 있는 모델 동물로서, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein, 이하 「MOG」라고 함)로 유도한 실험적 자기 면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, 이하 「EAE」라고 함) 마우스를 이용했다. 구체적으로는, EAE는 (MOG)_35-55 펩티드(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(서열 번호 5), Greiner Bio-one) 100 ㎍을 포함하는 PBS 100 μL와, 결핵사균(H37Ra, Difco) 500 ㎍을 포함하는 프로인트 완전 아쥬반트 100 μL과의 에멀젼 200 μL을, C57BL/6 마우스(8∼10주령)의 옆구리 피하에 투여함으로써 유도했다. 또한, MOG 투여 후 및 그 48시간 후에, 200 ng의 백일해 독소(List Biological Laboratories)를 정맥내 투여했다.

(2-2) 다발성 경화증 모델 마우스에의 항RGMa 중화 항체 투여에 의한 임상 증상의 관찰

MOG 투여 후 7일째 및 10일째에 본 발명자들이 제작한 항RGMa 중화 항체(비특허문헌 3 참조) 또는 컨트롤 항체(토끼 IgG, 시그마·알드리치)를 각 400 ㎍ 복강내 투여했다. 항RGMa 중화 항체 투여군은 9마리, 컨트롤 항체 투여군은 11마리의 EAE 마우스로 구성했다. MOG 투여(0일)부터 21일까지 관찰하여, EAE의 임상 증상을 이하의 기준에 기초하여 평가했다.

0 : 이상 없음

0.5 : 꼬리의 긴장 상실

1 : 꼬리의 반사성 상실

2 : 꼬리의 반사성 상실, 정향 반사의 저하, 다리 하나 지각 이상

3 : 다리 하나의 지각 이상 및 마비

3.5 : 양 뒷다리의 마비

4 : 앞다리 및 뒷다리의 마비

5 : 빈사, 사망

관찰 종료 후의 마우스를 안락사시키고, 척수를 적출하여, 파라포름알데히드 고정, 파라핀 포매 절편을 제작하여, 조직학적 평가에 제공했다. 절편을 헤마톡실린-에오신(HE) 염색하여, 염증을 평가했다. 경수에서부터 흉수까지, 마우스당 20-30 절편을 관찰하여, 이하의 기준에 기초하여 반정량적인 염증의 조직학적 평가(염증 인덱스)를 블라인드로 행했다. 항RGMa 중화 항체 투여군은 5마리, 컨트롤 항체 투여군은 6마리에 대해 평가했다.

0 : 염증 없음

1 : 혈관 주위 및 수막만의 세포 침윤

2 : 골수 실질의 경도의 세포 침윤

3 : 골수 실질의 중간 정도의 세포 침윤

4 : 골수 실질의 중도의 세포 침윤

관찰 기간 중의 EAE 스코어의 변화를 도 6에 도시했다. EAE 스코어는 평균치 및 표준오차로 나타냈다. 도 6으로부터 분명한 바와 같이, 14일 이후 항RGMa 중화 항체 투여군의 EAE 스코어는 컨트롤 항체 투여군보다 현저히 낮은 값이었다. 도면에는 나타내지 않았지만, Student의 t 검정 결과, 14일째는 P<0.05, 15일째 이후는 P<0.01로 양 그룹 사이에 통계적 유의차가 인정되었다.

도 7(A)에 각 그룹에 있어서의 EAE의 임상 증상 발현율을 도시하고, 도 7(B)에 각 그룹에 있어서의 EAE 발병일의 평균치를 도시하고, 도 7(C)에 각 그룹의 각 마우스의 스코어 최대치의 평균치를 도시하고, 도 7(D)에 각 그룹의 각 마우스의 스코어 누적치의 평균치를 도시했다. 도면에서 「n.s.」는 Student의 t 검정에 있어서 유의차가 없음을, 「*」 및 「**」은 Student의 t 검정에 있어서 각각 P<0.05 및 P<0.01임을 나타낸다. 도 7(A)로부터 분명한 바와 같이, 컨트롤 항체 투여군은 전체 예(100%)가 EAE의 임상 증상을 발현했지만, 항RGMa 중화 항체 투여군에서는, 44%의 마우스가 EAE의 임상 증상을 발현하지 않았다. 또한, 도 7(B)로부터 분명한 바와 같이, 양 그룹 사이의 발병일에 차이는 없고, 항RGMa 중화 항체 투여에 의해서 EAE의 발병이 지연되는 것은 아님이 드러났다. 한편, 도 7의 (C) 및 (D)로부터 분명한 바와 같이, 스코어 최대치의 평균치 및 스코어 누적치의 평균치는, 모두 항RGMa 중화 항체 투여군이 컨트롤 항체 투여군보다 유의적으로 낮은 값을 보였다. 이들 결과는, 항RGMa 중화 항체의 투여가 EAE의 증상 발현의 억제 및 진행의 억제에 유효하다는 것을 나타내는 것이다.

경수의 HE 염색 조직상을 도 8에 도시했다. (a) 및 (b)는 컨트롤 항체 투여군의 HE 염색 조직상, (c) 및 (d)는 항RGMa 중화 항체 투여군의 HE 염색 조직상이며, 스케일바는 250 ㎛를 나타낸다. 도 8의 (a) 및 (b)로부터 분명한 바와 같이, 컨트롤 항체 투여군의 골수에는 넓게 염증성 단핵 세포가 존재하여, 광범위한 염증성 병변이 보였다. 한편, (c) 및 (d)로부터 분명한 바와 같이, 항RGMa 중화 항체 투여군의 골수에는 염증성 단핵 세포가 현저히 적어, 염증 병변이 경감되고 있음이 드러났다.

염증 지수(index)의 평가 결과를 도 9에 도시했다. 도면에서 「*」은 Student의 t 검정에 있어서 P<0.05임을 나타낸다. 도 9로부터 분명한 바와 같이, 항RGMa 중화 항체 투여군의 염증 지수는, 컨트롤 항체 투여군과 비교하여 유의적으로 낮은 수치를 보였다. 이상과 같이, 다발성 경화증 모델 마우스를 이용한 실험 결과로부터, 항RGMa 중화 항체의 투여는, EAE에 있어서의 임상 증상 및 조직학적 병변 양쪽을 경감하는 것이 분명하게 되었다.

〔실시예 3 : 항RGMa 중화 항체를 투여한 다발성 경화증 모델 마우스의 비장 세포에 있어서의 T 세포 활성화의 검토〕

실시예 2의 임상 증상 관찰을 종료한 다발성 경화증 모델 마우스(EAE 마우스)로부터 MOG 투여 후 21일째에 비장을 적출하여 비장 세포를 단리하여, 96웰 플레이트에 5×10⁵개/웰로 파종하고, 3일간 배양하여 세포 증식을 해석했다. 배지에는, 글루타민, 피루브산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신, 2-ME 및 10% 열 불활화 FBS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용했다. CD4⁺ T 세포를 재자극하기 위해서, 20 ㎍/mL의 MOG 펩티드 또는 5 ㎍/mL의 항CD3 모노클로날 항체(2C11, BD Biosciences)를 배양 개시시에 첨가했다. Kubo 등의 방법(Kubo, T., et al. J. Immunol. 173, 7249-7258(2004))에 따라서, 배양 종료전 18시간의 [³H]티미딘 취입을 평가했다.

IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-17의 생성량 측정을 위해, 상기 비장 세포를 24웰 플레이트에 2×10⁶개/웰로 파종하여, 20 ㎍/mL의 MOG 펩티드 또는 5㎍/mL의 항CD3 모노클로날 항체의 존재 하 또는 비존재 하에서 배양했다. 배양 개시 후 24시간의 배양 상청을 IL-2의 측정에 사용하고, 배양 개시 후 72시간의 배양 상청을 다른 시토킨의 측정에 사용했다. 시토킨의 측정에는 ELISA 키트(Invitrogen)를 이용하여, 설명서 기재에 따라서 행했다.

결과를 도 10에 도시했다. (a)는 세포 증식의 측정 결과, (b)는 IL-2의 측정 결과, (c)는 IFN-γ의 측정 결과, (d)는 IL-17의 측정 결과이다. 각 그래프는 평균치 및 표준오차(컨트롤 항체 투여군 n=6, 항RGMa 중화 항체 투여군 n=5)로 나타내고, 「*」 및 「**」은 Student의 t 검정에 있어서 각각 P<0.05 및 P<0.01임을 나타낸다. 도 10(a)로부터 분명한 바와 같이, 항RGMa 중화 항체 투여군의 마우스로부터 얻은 비장 세포의 세포 증식은, MOG 펩티드에 의한 항원 특이적 자극 및 항CD3 모노클로날 항체에 의한 비특이적 자극 중 어느 것에 의한 경우도, 컨트롤 항체 투여군의 마우스로부터 얻은 비장 세포의 세포 증식보다 유의적으로 낮음이 드러났다. 또한, 도 10의 (b), (c), (d)로부터 분명한 바와 같이, 항RGMa 중화 항체 투여군의 마우스로부터 얻은 비장 세포의 IL-2, IFN-γ 및 IL-17의 분비량은, MOG 펩티드에 의한 항원 특이적 자극 및 항CD3 모노클로날 항체에 의한 비특이적 자극 중 어느 것에 의한 경우도, 컨트롤 항체 투여군의 마우스로부터 얻은 비장 세포의 각 시토킨 분비량보다 유의적으로 낮음이 드러났다. 한편, 데이터를 나타내지 않지만, IL-4의 분비량에 대해서는, 항RGMa 중화 항체의 투여가 영향을 미치지 않았다. 이들 결과로부터, EAE 마우스에의 항RGMa 중화 항체의 투여는, EAE 마우스에 있어서의 항원 특이적 및 비특이적인 T 세포 활성화를 현저히 감약시키는 것이 분명하게 되었다.

〔실시예 4 : 재발성 다발성 경화증 모델 마우스에 있어서의 항RGMa 중화 항체의 효과 검토〕

(4-1) 재발성 다발성 경화증 모델 마우스의 제작

MOG 대신에 미엘린 프로테오리피드 단백질(myelin proteolipid protein, 이하 「PLP」라고 함)을 SJL/J 마우스에게 투여함으로써, 재발성 EAE 모델 마우스를 제작했다. 구체적으로는, 재발성 EAE는 (PLP)_139-151 펩티드(HSLGKWLGHPDKF(서열 번호 6), Greiner Bio-one) 100 ㎍을 포함하는 PBS 100 μL와, 결핵사균(H37Ra, Difco) 500 ㎍을 포함하는 프로인트 완전 아쥬반트 100 μL와의 에멀젼 200 μL을, SJL/J 마우스(8∼10주령)의 옆구리 피하에 투여함으로써 유도했다. 또한, PLP 투여 후 및 그 48시간 후에, 200 ng의 백일해 독소(List Biological Laboratories)를 정맥내 투여했다.

(4-2) 재발성 다발성 경화증 모델 마우스에의 항RGMa 중화 항체 투여에 의한 임상 증상의 관찰

PLP 투여 후 25일째 및 28일째에 본 발명자들이 제작한 항RGMa 중화 항체(비특허문헌 3 참조) 또는 컨트롤 항체(토끼 IgG, 시그마·알드리치)를 각 400 ㎍ 복강내 투여했다. 항RGMa 중화 항체 투여군은 9마리, 컨트롤 항체 투여군은 11마리의 EAE 마우스로 구성했다. PLP 투여(0일)에서부터 45일까지 관찰하여, EAE의 임상 증상을 상기 실시예 2에 기재한 기준에 기초하여 평가했다.

관찰 기간 중의 EAE 스코어의 변화를 도 11에 도시했다. EAE 스코어는 평균치 및 표준오차로 나타냈다. 도면에서 「*」은 Student의 t 검정에 있어서 P<0.05임을 나타낸다. 도 11로부터 분명한 바와 같이, 항체 투여 후에 있어서의 항RGMa 중화 항체 투여군의 EAE 스코어는, 컨트롤 항체 투여군의 EAE 스코어보다 현저하게 낮은 값이었다. 이 결과로부터, 최초의 마비 발현기의 후기에 항RGMa 중화 항체를 투여함으로써, EAE의 재발을 예방할 수 있음이 드러났다.

〔실시예 5 : MOG로 자극한 BMDCs 이식 마우스의 EAE 임상 증상에 있어서의 RGMa 유전자 넉다운 효과의 검토〕

(5-1) RGMa 유전자 넉다운 BMDCs의 제작

이하에 나타내는 염기 서열의 마우스 RGMa siRNA(Stealth RNAi(상품명), Invitrogen)를 구입하여 사용했다. 또한, 논타켓팅 dsRNA(Invitrogen)를 컨트롤 siRNA로서 사용했다.

센스쇄 : 5'-AAAGAGGCCGCAGUGAGUGUAGUUG-3'(서열 번호 7)

안티센스쇄 : 5'-CAACUACACUCACUGCGGCCUCUUU-3'(서열 번호 8)

배양 개시 후 7일의 BMDCs를 사용했다(실시예 1 참조). 500 pmol의 마우스 RGMa siRNA 또는 컨트롤 siRNA를 포함하는 핵산 도입용 용액 100 μL에 1×10⁶개의 BMDCs를 현탁했다. 샘플을 큐벳트로 옮겨, 뉴클레오펙터(등록상표) 장치(Lonza사)를 이용하여, 제조업자의 취급설명서에 따라 siRNA를 세포에 도입했다. siRNA 도입 후, 세포는 글루타민, 피루브산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신, 2-ME, 10% 열 불활화 FBS를 첨가한 RPMI1640 배지를 이용하여 배양했다. 마우스 RGMa siRNA를 도입한 BMDCs에 있어서의 RGMa의 발현은 현저히 저하되고 있었다.

(5-2) MOG 자극 및 마우스에의 이식

마우스 RGMa siRNA 또는 컨트롤 siRNA를 도입한 BMDCs에, 100 ㎍/mL의 (MOG)_35-55 펩티드를 첨가하여, 4∼6시간 배양하여 항원 자극을 주었다. 자극 후의 생세포 6×10⁵개를 리시피언트 마우스(C57BL/6)의 정맥 내에 투여했다. 이어서, 결핵사균(H37Ra, Difco) 500 ㎍을 포함하는 프로인트 완전 아쥬반트 200 μL를 피하 투여했다. 또한, 그 48시간 후에 200 ng의 백일해 독소(List Biological Laboratories)를 정맥내 투여했다.

(5-3) EAE 임상 증상의 관찰

RGMa siRNA 그룹(5마리) 및 컨트롤 siRNA 그룹(5마리)에 대해서, 세포 이식(0일)에서부터 21일까지 관찰하여, EAE의 임상 증상을 상기 실시예 2에 기재한 기준에 기초하여 평가했다.

관찰 기간 중의 EAE 스코어의 변화를 도 12에 도시했다. EAE 스코어는 평균치 및 표준오차로 나타냈다. 도면에서 「*」 및 「**」은 Student의 t 검정에 있어서 각각 P<0.05 및 P<0.01임을 나타낸다. 도 12로부터 분명한 바와 같이, RGMa siRNA 그룹의 EAE 스코어는, 컨트롤 siRNA 그룹의 EAE 스코어보다 현저히 낮은 값이었다. 이 결과로부터, RGMa siRNA가 다발성 경화증의 예방 또는 치료에 유효하다는 것이 분명하게 되었다.

〔실시예 6 : MOG 자극을 받은 CD4⁺ T 세포 이식 마우스의 EAE 임상 증상에 있어서의 항RGMa 중화 항체의 효과 검토〕

(6-1) 도너 마우스의 CD4⁺ T 세포의 조제

도너 마우스(C57BL/6)에 본 발명자들이 제작한 항RGMa 중화 항체(비특허문헌 3 참조) 또는 컨트롤 항체(토끼 IgG, 시그마·알드리치)를 각 400 ㎍ 복강내 투여했다(-2일). 그 2일 후(0일)에, 항RGMa 중화 항체 또는 컨트롤 항체의 2번째 투여를 하는 동시에, (MOG)_35-55 펩티드 100 ㎍을 포함하는 PBS 100 μL와, 결핵사균(H37Ra, Difco) 500 ㎍을 포함하는 프로인트 완전 아쥬반트 100 μL와의 에멀젼 200 μL를 피하 투여했다. 또한, 그 5일 후(5일)에, 항RGMa 중화 항체 또는 컨트롤 항체의 3번째 투여를 했다. MOG 투여에서부터 10일째에 마우스를 안락사시켜, 비장 및 유입 영역 림프절을 적출하고, 세포를 단리하여 세포 현탁액을 조제했다. CD4⁺ T 세포를 재자극하기 위해서, 40 ㎍/mL의 (MOG)_35-55 펩티드를 포함하는 배지로 세포(1×10⁶개/mL)를 3일간 배양했다. 배양 종료 후, 세포를 모아, CD4⁺ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD4⁺ T 세포를 분리했다.

(6-2) 리시피언트 마우스에의 이식 및 EAE 임상 증상의 관찰

리시피언트 마우스(C57BL/6)에는, 미리 아치사량(500 Gy)의 방사선을 조사했다. CD4⁺ T 세포(생세포) 6×10⁵개를 리시피언트 마우스에게 정맥내 투여했다. 항RGMa 중화 항체를 투여한 도너 마우스 유래의 CD4⁺ T 세포를 이식한 마우스(항RGMa 중화 항체군, 7마리) 및 컨트롤 항체를 투여한 도너 마우스 유래의 CD4⁺ T 세포를 이식한 마우스(컨트롤 항체군, 7마리)에 대해서, 세포 이식(0일)에서부터 21일까지 관찰하여, EAE의 임상 증상을 상기 실시예 2에 기재한 기준에 기초하여 평가했다.

관찰 기간 중의 EAE 스코어의 변화를 도 13에 도시했다. EAE 스코어는 평균치 및 표준오차로 나타냈다. 도면에서 「*」 및 「**」은 Student의 t 검정에 있어서 각각 P<0.05 및 P<0.01임을 나타낸다. 도 13으로부터 분명한 바와 같이, 항RGMa 중화 항체군의 EAE 스코어는, 컨트롤 항체군의 EAE 스코어보다 현저히 낮은 값이었다. 이 결과로부터, 항RGMa 중화 항체에 의한 다발성 경화증의 예방 또는 치료 효과는 항RGMa 중화 항체가 항원 특이적인 T 세포 활성화나 자기 반응성 T 세포의 분화를 억제하는 데에 기초한 것이 분명하게 되었다.

이상의 결과는, 단핵 세포의 척수에의 침윤, 및 T 세포의 증식이나 EAE 관련 시토킨인 IL-2, IL-17 및 IFN-γ의 생성과 같은 T 세포의 활성화 등의 면역 응답의 증대에 의한 EAE의 발병에 RGMa가 관여하는 것을 밝힌 것이다. 또한, 항RGMa 중화 항체나 RGMa siRNA가 T 세포의 활성화를 저해하여, 다발성 경화증의 예방 또는 치료에 유효하다는 것을 나타내는 것이다.

한편 본 발명은 상술한 각 실시형태 및 실시예에 한정되는 것이 아니라, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지 변경이 가능하고, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합하여 얻어지는 실시형태도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 학술문헌 및 특허문헌 모두가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.

본 발명은 의약품 산업에 있어서 매우 높은 이용 가치를 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> Osaka University National University Corporation Chiba University <120> Inhibitory agent for T-cell activation, Pharmaceutical composition containing the same, and Screening method for T-cell activation substance <130> O11F3660 <150> JP 2009-279189 <151> 2009-12-09 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1299 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggggagag gggcaggacg ttcagccctg ggattctggc cgaccctcgc cttccttctc 60 tgcagcttcc ccgcagccac ctccccgtgc aagatcctca agtgcaactc tgagttctgg 120 agcgccacgt cgggcagcca cgccccagcc tcagacgaca cccccgagtt ctgtgcagcc 180 ttgcgcagct acgccctgtg cacgcggcgg acggcccgca cctgccgggg tgacctggcc 240 taccactcgg ccgtccatgg catagaggac ctcatgagcc agcacaactg ctccaaggat 300 ggccccacct cgcagccacg cctgcgcacg ctcccaccgg ccggagacag ccaggagcgc 360 tcggacagcc ccgagatctg ccattacgag aagagctttc acaagcactc ggccaccccc 420 aactacacgc actgtggcct cttcggggac ccacacctca ggactttcac cgaccgcttc 480 cagacctgca aggtgcaggg cgcctggccg ctcatcgaca ataattacct gaacgtgcag 540 gtcaccaaca cgcctgtgct gcccggctca gcggccactg ccaccagcaa gctcaccatc 600 atcttcaaga acttccagga gtgtgtggac cagaaggtgt accaggctga gatggacgag 660 ctcccggccg ccttcgtgga tggctctaag aacggtgggg acaagcacgg ggccaacagc 720 ctgaagatca ctgagaaggt gtcaggccag cacgtggaga tccaggccaa gtacatcggc 780 accaccatcg tggtgcgcca ggtgggccgc tacctgacct ttgccgtccg catgccagag 840 gaagtggtca atgctgtgga ggactgggac agccagggtc tctacctctg cctgcggggc 900 tgccccctca accagcagat cgacttccag gccttccaca ccaatgctga gggcaccggt 960 gcccgcaggc tggcagccgc cagccctgca cccacagccc ccgagacctt cccatacgag 1020 acagccgtgg ccaagtgcaa ggagaagctg ccggtggagg acctgtacta ccaggcctgc 1080 gtcttcgacc tcctcaccac gggcgacgtg aacttcacac tggccgccta ctacgcgttg 1140 gaggatgtca agatgctcca ctccaacaaa gacaaactgc acctgtatga gaggactcgg 1200 gacctgccag gcagggcggc tgcggggctg cccctggccc cccggcccct cctgggcgcc 1260 ctcgtcccgc tcctggccct gctccctgtg ttctgctag 1299 <210> 2 <211> 432 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro Thr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys Lys Ile 20 25 30 Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser His Ala 35 40 45 Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Ser Tyr 50 55 60 Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu Ala 65 70 75 80 Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His Asn 85 90 95 Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr Leu Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys His 115 120 125 Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr Thr His 130 135 140 Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp Arg Phe 145 150 155 160 Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn Tyr 165 170 175 Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala Ala 180 185 190 Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu Cys 195 200 205 Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ala Ala 210 215 220 Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn Ser 225 230 235 240 Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln Ala 245 250 255 Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr Leu 260 265 270 Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu Asp 275 280 285 Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu Asn 290 295 300 Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly Thr Gly 305 310 315 320 Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro Glu Thr 325 330 335 Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val 340 345 350 Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly 355 360 365 Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Val Lys 370 375 380 Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg Thr Arg 385 390 395 400 Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro Arg Pro 405 410 415 Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val Phe Cys 420 425 430 <210> 3 <211> 1296 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 3 atggggagag gggcaggacg ttcagccctg ggattgtggc cgaccctcgc cttccttctc 60 tgcagctttc ccgcagctat ctctccctgc aagatcctca agtgcaactc tgagttctgg 120 agcgccacgt cgtcaggcag ccacgcccct gcctctgacg acgtgcccga gttctgtgct 180 gccctgcgca cctacgccct gtgcacgcga cggacagccc gcacctgccg gggcgacctg 240 gcttaccact cggctgtcca tggcatagag gacctcatga gccagcacaa ctgctccaag 300 gatggcccca cctcacagcc tcgagtgcgc acgctcccgc cagctgggga cagccaggag 360 cgctcagata gccccgagat ctgccactat gagaagagtt tccacaagca ctcagctgcc 420 cccaactaca ctcactgcgg cctctttggg gacccacacc tcaggacttt cacagaccac 480 ttccagacat gtaaggtgca aggcgcttgg cctctcatcg acaataatta cctgaacgtg 540 caggtcacca atacacctgt gctgcccggc tctgccgcca ctgccaccag caagctcacc 600 atcatcttca agaacttcca agagtgtgtg gaccagaaag tataccaagc cgagatggac 660 gagcttccgt ccgcctttgc cgatggctcc aaaaacggtg gagataaaca cggagccaac 720 agcctgaaga tcacagagaa ggtgtcaggc cagcacgtgg agatccaggc caagtacatc 780 ggcaccacca tcgtggtgag acaggtgggc cgctacctga ccttcgccgt ccggatgccc 840 gaggaggtag tcaacgccgt ggaggaccgt gacagccaag gcctctacct ctgcctgcgg 900 ggctgcccgc tcaaccagca gatcgacttc caggctttcc gtgccaacgc cgagagccct 960 cgcaggccag cagctgccag cccctctcct gtggtccccg agacatttcc gtacgagaca 1020 gctgtggcca agtgcaaaga gaagctgcct gtagaagact tgtactacca ggcctgtgtc 1080 ttcgacctcc tcacgactgg cgacgtgaac ttcacgctgg ccgcctacta tgctttggag 1140 gatggcaaga tgctccactc caacaaggac aagctacacc tgtttgaaag gactcgggag 1200 ctgcctggcg ctgtggccgc tgcagcattt cccttggccc ccgagatgct cccgggcacc 1260 gtcacacttc tggtcctgct gcctctgttc tggtag 1296 <210> 4 <211> 431 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro Thr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys Lys Ile 20 25 30 Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His 35 40 45 Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr 50 55 60 Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu 65 70 75 80 Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His 85 90 95 Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu 100 105 110 Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys 115 120 125 His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr 130 135 140 His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His 145 150 155 160 Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn 165 170 175 Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 180 185 190 Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu 195 200 205 Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 210 215 220 Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln 245 250 255 Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr 260 265 270 Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 275 280 285 Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 290 295 300 Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 305 310 315 320 Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 325 330 335 Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 340 345 350 Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 355 360 365 Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 370 375 380 Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 385 390 395 400 Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Glu Met 405 410 415 Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Phe Trp 420 425 430 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of MOG <400> 5 Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Asn Gly Lys 20 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of PLP <400> 6 His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strands of mouse RGMa siRNA <400> 7 aaagaggccg cagugagugu aguug 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strands of mouse RGMa siRNA <400> 8 caacuacacu cacugcggcc ucuuu 25

Claims

RGM 저해 물질을 포함하는, 다발성 경화증에 있어서의 마비 또는 지각 이상을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물로서, 상기 RGM 저해 물질이 항RGMa 중화 항체 또는 RGMa siRNA인, 다발성 경화증에 있어서의 마비 또는 지각 이상을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 다발성 경화증이 재발하는 다발성 경화증인 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 마비 또는 지각 이상은 사지 중 어느 하나 이상의 마비 또는 지각 이상인 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다발성 경화증이 T 세포 활성화에 기인하는 다발성 경화증인 의약 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 RGM 저해 물질이 항RGMa 중화 항체인 의약 조성물.
피검 물질을 RGMa에 접촉시키는 공정과, 상기 RGMa의 활성 레벨을 측정하는 공정과, 상기 활성 레벨을, 피검 물질에 접촉하고 있지 않은 RGMa의 활성 레벨과 비교하는 공정과, RGMa의 활성 레벨을 저감시키는 피검 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다발성 경화증에 있어서의 마비 또는 지각 이상을 억제하는 물질의 스크리닝 방법.