JP5785873B2 - T細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびt細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents

T細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびt細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法 Download PDF

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Description

本発明は、T細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびT細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法に関するものであり、詳細には、RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化阻害剤、当該T細胞活性化阻害剤を含有するT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物および被験物質をRGMに接触させる工程を含むT細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法に関するものである。
RGM(repulsive guidance molecule)は、当初、視覚系の軸索誘導分子として同定された膜タンパク質である(非特許文献1参照)。RGMファミリーには、RGMa、RGMbおよびRGMcと呼ばれる3種類のメンバーが含まれ、少なくともRGMaとRGMbは同じシグナル伝達機構で働くことが知られている(非特許文献2参照)。その後の研究により、RGMは、ゼノパスおよびニワトリ胚における軸索誘導およびラミナ形成、並びに、マウス胚における頭部神経管の閉鎖の制御等の機能を有することが明らかとなっている(非特許文献3参照)。発生段階の機能に加えて、成人ヒトおよびラットの中枢神経系損傷後に再発現すること、ラットにおいてRGM阻害が脊髄損傷後の軸索成長を亢進し、機能回復を促進することから(非特許文献4参照)、RGMは中枢神経系損傷後の軸索再生阻害物質であると考えられている。また、特許文献1には抗RGM中和抗体を有効成分として含有する軸索再生促進剤が開示されている。
多発性硬化症(Multiple Sclerosis)は、脳と脊髄の神経線維を覆うミエリン(髄鞘)が炎症を起こして脱髄が生じ、神経の情報がうまく伝わらなくなるために視覚障害、運動障害、感覚低下、平衡障害等のさまざまな症状が出る疾患であり、未だ原因がはっきりせず、現代の医学では完全に治すことができない慢性病である。自己免疫疾患の1つと認識されているが、その発症メカニズムの詳細は解明されていない。例えば、非特許文献5には、CD4T細胞が脳および脊髄の白質におけるミエリンおよびオリゴデンドロサイトを免疫的に攻撃することが報告されている。
特許第3981148号公報
Stahl, B., Muller, B., von Boxberg, Y., Cox, E.C. & Bonhoeffer, F. Biochemical characterization of a putative axonal guidance molecule of the chick visual system. Neuron 5, 735-743 (1990) Liu, X., Hashimoto, M., Horii, H., Yamaguchi, A., Naito, K. and Yamashita, T. Repulsive guidance molecule b inhibits neurite growth and is increased after spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 795-800 (2009) Yamashita, T., Mueller, B.K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 17, 29-34 (2007) Hata, K. et al. RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury. J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006) Trapp, B.D., Ransohoff, R.M., Fisher, E. & Rudick, R. Neurodegeneration in multiple sclerosis: relationship to neurological disability. Neuroscientist 5, 48-57 (1999)
本発明は、RGMの新規な機能を見出し、新規なT細胞活性化阻害剤、T細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物、T細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
[1]RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化阻害剤。
[2]RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である前記[1]に記載のT細胞活性化阻害剤。
[3]RGM阻害物質がRGM siRNAである前記[1]に記載のT細胞活性化阻害剤。
[4]前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とするT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
[5]T細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である前記[4]に記載の医薬組成物。
[6]自己免疫疾患が多発性硬化症である前記[5]に記載の医薬組成物。
[7]被験物質をRGMに接触させる工程と、前記RGMの活性レベルを測定する工程と、前記活性レベルを、被験物質に接触していないRGMの活性レベルと比較する工程と、RGMの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを特徴とするT細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。
[8]RGM阻害物質をRGM発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするT細胞活性化阻害方法。
[9]RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である前記[8]に記載のT細胞活性化阻害方法。
[10]RGM阻害物質がRGM siRNAである前記[8]に記載のT細胞活性化阻害方法。
[11]哺乳動物に対して、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする自己免疫疾患の予防または治療方法。
[12]自己免疫疾患の予防または治療用医薬組成物を製造するための、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤の使用。
[13]自己免疫疾患の予防または治療に使用するための、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤。
本発明により、新規なT細胞活性化阻害剤を提供することができる。当該T細胞活性化阻害剤は、T細胞活性化に起因する疾患、例えば自己免疫疾患の予防または治療に有用である。また、本発明のスクリーニング方法により得られるT細胞活性化阻害物質は、T細胞活性化に起因する疾患の予防薬または治療薬の有効成分の候補となる。
LPSで刺激された骨髄由来樹状細胞(BMDCs)におけるRGMaのmRNAの発現をリアルタイム定量PCRで測定した結果を示す図である。 LPSで刺激されたBMDCsにおけるRGMaの発現をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。 CD4T細胞およびCD11bマクロファージと、各種濃度のヒトRGMa−Fcとの結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。 CD4T細胞およびCD11bマクロファージにおける全Rap1および活性型Rap1をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。 図4(A)のウエスタンブロッティングのバンドをScion imageを用いて定量し相対的なRap1活性化レベルを算出した結果を示す図である。 RGMa刺激の有無における脾細胞のフィブロネクチンへの接着率を測定した結果を示す図である。 RGMa刺激の有無におけるCD4T細胞のICAM1への接着率を測定した結果を示す図である。 抗RGMa中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスとコントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。 (A)は各群におけるEAEの臨床症状発現率を示す図であり、(B)は各群におけるEAE発病日の平均値を示す図であり、(C)は各群の各マウスのEAEスコア最大値の平均値を示す図であり、(D)は各群の各マウスのEAEスコア累積値の平均値を示す図である。 (a)および(b)はコントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの頸髄のHE染色組織像であり、(c)および(d)は抗RGMa中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの頸髄のHE染色組織像である。 コントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの骨髄組織標本および抗RGMa中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの骨髄組織標本において、炎症インデックスに基づいて炎症の程度を数値化した結果を示す図である。 コントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスおよび抗RGMa中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスから調製した脾細胞の抗原特異的T細胞活性化および非特異的T細胞活性化を検討した結果を示す図であり、(a)は細胞増殖、(b)はIL−2の分泌量、(c)はIFN−γの分泌量、(d)はIL−17の分泌量の結果を示す図である。 抗RGMa中和抗体を投与した再発性多発性硬化症モデルマウスとコントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスにおけるEAEの臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。 RGMa遺伝子ノックダウンしたBMDCsまたはRGMa遺伝子ノックダウンしていないBMDCsに対してMOG刺激を行った後、これらのBMDCsをレシピエントマウスに移植し、レシピエントマウスにおけるEAEの臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。 抗RGMa中和抗体またはコントロール抗体、およびMOGを投与されたドナーマウスから調製したCD4T細胞に対してMOG刺激を行った後、これらのCD4T細胞をレシピエントマウスに移植し、レシピエントマウスにおけるEAEの臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。
本発明者らは、骨髄由来樹状細胞(BMDCs)にRGMが発現していること、CD4T細胞およびCD11bマクロファージにRGM受容体が発現していることを初めて見出し、RGMがCD4T細胞やCD11bマクロファージのRGMa受容体に結合することによってRap1が活性化され、その結果CD4T細胞やCD11bマクロファージの細胞接着活性が増強することを見出した。また、本発明者らは、多発性硬化症モデルマウスを用いた実験において、抗RGM中和抗体の投与は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)で誘導した多発性硬化症モデルマウス(実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウス)の臨床症状および組織病変の両方を軽減すること、抗RGM中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスから採取した脾細胞では、抗原特異的および非特異的なT細胞活性化が顕著に減弱していることを明らかにした。さらに、抗RGM中和抗体の投与は、ミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP)で誘導した再発性多発性硬化症モデルマウスにおけるEAE臨床症状の発現を抑制すること、RGMaをノックダウンしたBMDCsにMOG刺激を与えてマウスに移植した場合、移植を受けたマウスにおけるEAE臨床症状の発現が抑制されること、抗RGM中和抗体およびMOGを投与されたマウスから調製したCD4T細胞にMOG刺激を与えてマウスに移植した場合、移植を受けたマウスにおけるEAE臨床症状の発現が抑制されることを見出した(実施例参照)。
〔T細胞活性化阻害剤〕
本発明は、RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化阻害剤を提供する。本発明のT細胞活性化阻害剤の有効成分であるRGM阻害物質は、RGMの活性(RGM活性)を阻害する物質およびRGMの発現を阻害する物質のいずれでもよい。
RGM活性を阻害する物質としては、例えば、RGM活性を阻害する低分子化合物、抗RGM中和抗体などが挙げられる。RGM活性の指標としては、例えば、RGMのRGM受容体への結合活性(実施例1の(1−2)参照)、Rap1活性化の誘導活性(実施例1の(1−3)参照)、T細胞のICAMへの接着増強活性(実施例1の(1−4)参照)等が挙げられ、これらの指標を用いて評価したときに、RGM活性を阻害(減弱)する物質をRGM阻害物質と称する。RGM活性を阻害する低分子化合物としては、例えばRhoキナーゼ阻害剤として知られているY27632(M. Uehata, et al. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature 389, 990 (1997))が挙げられる。
抗RGM中和抗体は、RGMに結合してその活性を阻害する抗体であればよく、例えば、RGMに結合してRGMがRGM受容体に結合できなくする抗RGM抗体等が挙げられる。抗RGM中和抗体は、RGMまたはそのフラグメントを免疫原として用い、公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、上記RGM活性の指標を用いて確認することができる。RGMとしては、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるヒトRGMa、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるラットRGMa等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のRGMを免疫原として好適に用いることができる。これらのアミノ酸配列は公知のデータベース(Protein Data Bank等)から容易に取得することができる。
抗RGM中和抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント(例えば、Fab、F(ab’)、Fab’、Fv、scFv等)でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原(RGMまたはこれらのフラグメント)をPBSに溶解し、所望により通常のアジュバント(例えばフロイント完全アジュバント)を適量混合したものを免疫原として哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等)を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、1回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞(例えば脾細胞)とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。
抗RGM中和抗体は、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域からなる抗体をいう。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のCDR(相補性決定領域:complementarity determining region)をヒト抗体のCDRへ移植したものをいい、CDR移植抗体、再構成抗体などとも称される。ヒト化抗体のFR(フレームワーク領域:framework region)は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるFRのアミノ酸配列を置換してもよい。ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列は、公知のデータベース(Protein Data Bank等)から取得することができる。
RGMの発現を阻害する物質としては、例えば、RGM遺伝子のsiRNA(short interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。RGM遺伝子としては、例えば配列番号1に示される塩基配列からなるヒトRGMa遺伝子、配列番号3に示される塩基配列からなるラットRGMa遺伝子等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のRGM遺伝子の塩基配列は公知のデータベース(GenBank等)から容易に取得することができる。siRNAは、標的となる遺伝子(本発明においてはRGM遺伝子)の発現を抑制することができる短い二本鎖RNAである。siRNAとして機能する限りにおいて、塩基配列や長さ(塩基長)は特に限定されないが、好ましくは約30塩基未満、より好ましくは約19〜27塩基、さらに好ましくは約21〜25塩基である。shRNAは、一本鎖RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、3'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約20塩基対以上の分子のことをいう。そのようなshRNAは、細胞内に導入された後、細胞内で約20塩基(代表的には例えば、21塩基、22塩基、23塩基)の長さに分解され、siRNAと同様に標的となる遺伝子(本発明においてはRGM遺伝子)の発現を抑制することができる。siRNAおよびshRNAは、RGM遺伝子の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。siRNA又はshRNAは、人工的に化学合成することができる。また、例えばT7RNAポリメラーゼおよびT7プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンスおよびセンスのRNAをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RGM遺伝子のDNA配列中の連続する5から100の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、DNAまたはRNAのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のDNA合成装置によって容易に合成することができる。
このように、RGM阻害物質は、RGM発現細胞(RGMを発現している細胞またはRGM発現能を有する細胞)と接触することにより、T細胞活性化を阻害することができる。したがって、RGM阻害物質をRGM発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするT細胞活性化阻害方法も本発明に含まれる。
〔医薬組成物〕
本発明は、上記本発明のT細胞活性化阻害剤を含有するT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、換言すれば、RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物である。
T細胞活性化に起因する疾患としては、自己免疫疾患、脳血管障害などが挙げられる。自己免疫疾患としては、例えば、細胞性自己免疫疾患、リウマチ、多発性硬化症、神経自己免疫疾患(ギランバレー症候群、神経ベーチェット病等)、悪性貧血、I型(インスリン依存型)糖尿病、全身エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患(IBD)、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、グッドバスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病などが挙げられる。脳血管障害としては、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血などが挙げられる。中でも、本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患の予防または治療に使用することが好ましく、多発性硬化症の予防または治療に使用することが特に好ましい。
本発明の医薬組成物は、RGM阻害物質を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤;注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体;賦形剤、結合剤、pH調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。抗RGM中和抗体を含む注射剤または輸液は、溶液、懸濁液または乳濁液として用いることができる。その溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液(例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液)等を用いることができる。さらに、この注射剤または輸液は、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、pH調整剤等を含んでいてもよい。安定剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、EDTAナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール(例えば、エタノール等)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート80(登録商標)、HCO−50等)等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。pH調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。
RGM阻害物質が核酸(siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど)である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法(リポソーム法、HVJ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など)、マイクロインジェクション法、遺伝子銃(Gene Gun)でキャリア(金属粒子)とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。siRNAまたはshRNAをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、SV40などのDNAウイルスまたはRNAウイルスに、siRNAまたはshRNAを発現するDNAを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
このようにして得られる製剤は、例えばヒトや他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して、その有効量を投与することにより、T細胞活性化に起因する疾患を予防または治療することができる。投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。例えば、有効成分が抗RGM中和抗体である場合、約65〜70kgの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、1日当たり0.02mg〜4000mg程度が好ましく、0.1mg〜200mg程度がより好ましい。1日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
〔スクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法は、被験物質をRGMに接触させる工程、被験物質に接触したRGMの活性レベルを測定する工程、測定した活性レベルを被験物質に接触していないRGMの活性レベルと比較する工程、RGMの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程を包含するものであればよい。本発明のスクリーニング方法により、T細胞活性化阻害物質を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。
被験物質とRGMとの接触は、例えば、RGM溶液に被験物質を添加し、溶解または懸濁することにより行うことができる。RGMは、市販のリコンビナントRGMや定法により自製したリコンビナントRGMを使用することができる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。RGMの活性レベルは、RGMのRGM受容体への結合活性(実施例1の(1−2)参照)、Rap1活性化の誘導活性(実施例1の(1−3)参照)、T細胞のICAMへの接着増強活性(実施例1の(1−4)参照)等を指標にして測定することができる。
測定した活性レベルを、被験物質に接触していないRGMの活性レベルと比較することで、被験物質がT細胞活性化阻害物質であるか否かを判定することができる。被験物質を接触させていないRGMの活性レベルと比較して、被験物質を接触させたRGMの活性レベルが低ければ、被験物質がT細胞活性化阻害物質であると判定して、これを選択すればよい。好ましくは被験物質を接触させたRGMの活性レベルが50%以下、より好ましくは25%以下であるときにT細胞活性化阻害物質であると判定する。本発明のスクリーニング方法により得られるT細胞活性化阻害物質は、自己免疫疾患等のT細胞活性化に起因する疾患の予防薬または治療薬の有効成分候補物質として有用である。特に、多発性硬化症の予防薬または治療薬の有効成分候補物質として極めて有用である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例1:免疫細胞におけるRGMaおよびRGMa受容体の発現〕
(1−1)骨髄由来樹状細胞(BMDCs)におけるRGMaの発現
Lutzらの方法(Lutz, M.B., et al. J. Immunol. Methods 223, 77-92 (1999).)に従って、C57BL/6マウス(8〜10週齢)から骨髄細胞を採取し、GM−CSF(20ng/mL、シグマ・アルドリッチ)を含む培地で培養することによりBMDCsを取得した。実験には、培養開始後6日のBMDCsを使用した。
BMDCsにおけるRGMa mRNAの発現をリアルタイム定量PCRで測定した。すなわち、培養開始後6日のBMDCsにLPS(シグマ・アルドリッチ)を0、0.01、0.1または1μg/mL添加して24時間培養し、活性化させたBMDCsを集めた。RNeasy Kit(キアゲン)を用いてBMDCsからトータルRNAを抽出し、逆転写酵素(GEヘルスケア)を用いてcDNAを得た。得られたcDNAを鋳型としてTaqManリアルタイムPCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)を製造業者のプロトコールに従って行い、RGMaのmRNA発現を定量分析した。特異的プライマーとプローブはApplied Biosystemsより購入した。
また、BMDCsにおけるRGMaの発現をウエスタンブロッティングで検出した。すなわち、LPS添加24時間後のBMDCs(2×10個)を2×サンプルバッファー(250mM Tris−HCl、4%SDS、20%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー、および10%β−メルカプトエタノール)で溶解し、5分間の煮沸後、各サンプルの等量を、還元条件下で15%SDS−PAGEに供した。泳動後、タンパク質をPVDF膜(Immobilon-P、ミリポア)に転写した。5%スキムミルクおよび0.05%Tween20を含むPBSでブロッキングした後、抗RGMa抗体(本発明者らが作製した抗体、非特許文献3参照)と反応させ、HRP標識二次抗体(Cell Signaling Technology)およびECL化学発光システム(GEヘルスケア)を用いて検出した。タンパク質バンドの定量はScion imageを用いて行った。
リアルタイムPCRの結果を図1に示し、ウエスタンブロッティングの結果を図2に示した。図1から明らかなように、BMDCsにおけるRGMa mRNAの発現はLPSの刺激によって増強されることが示された。また、図2から明らかなように、抗RGMa抗体が結合する35kDaおよび50kDaのバンドが存在し、LPS刺激によって細胞内の量が増えることが示された。50kDaのバンドはRGMaの全長に相当し、35kDaはRGMaのC末端フラグメントでありRGMaの成熟体と推定される(Mueller, B.K., Yamashita, T., Schaffar, G. & Mueller, R. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361, 1513-1529 (2006))。これらの結果から、活性化されたBMDCsにおいてRGMaの発現が誘導されることが明らかとなった。
(1−2)CD4T細胞およびCD11bマクロファージにおけるRGMa受容体の発現
C57BL/6マウス(8〜10週齢)から脾臓を摘出し、速やかにRPMI1640培地(Invitrogen)中に入れて緩やかに押し付け、ACK溶解バッファー(Lonza Walkersville)で赤血球除去処理をして細胞懸濁液を得た。RPMI1640で3回洗浄後、細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーに通して脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。この懸濁液に各種濃度のヒトRGMaのC末端フラグメント(以下「RGMa−Fc」という。)を添加して30分間インキュベートした。洗浄後、PE標識抗CD11b抗体またはAPC標識抗CD4抗体と、FITC標識抗ヒトRGMa−Fc抗体(BD Biosciences)とを組み合わせた免疫染色を施し、フローサイトメトリー解析により細胞とヒトRGMa−Fcとの結合を測定した。フローサイトメトリー解析には、FACSCalibur(BD Biosciences)およびCellQuestソフトウエア(BD Biosciences)を用いた。
結果を図3に示した。図3から明らかなように、脾臓由来のCD4T細胞およびCD11bマクロファージは、いずれも濃度依存的にヒトRGMa−Fcと結合することが示された。この結果から、これらの細胞がRGMa受容体を発現していることが明らかとなった。
(1−3)CD4T細胞およびCD11bマクロファージにおけるRap1活性化の検討
次に、CD4T細胞およびCD11bマクロファージに結合するRGMaによって仲介される可能性のあるシグナル伝達について検討した。Tリンパ球において、TCRライゲーションはRap1の一時的活性化、および、T細胞の抗原提示細胞接触面におけるRap1−GTPの蓄積を引き起こし、これはLFA−1(インテグリン):ICAM−1(インテグリンリガンド)が仲介するシグナルを制御することが知られている(Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000)、Katagiri, K., Hattori, M., Minato, N. & Kinashi, T. Mol. Cell Biol 22, 1001-1015 (2002))。そこで、CD4T細胞およびCD11bマクロファージのRap1活性化におけるRGMaの関与について評価した。
上記(1−2)で調製した脾細胞の単一細胞懸濁液から、抗CD4磁気ビーズおよび抗CD11b磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)をそれぞれ用いたポジティブソーティングによりCD4T細胞およびCD11bマクロファージを単離し、活性型Rap1を測定した。活性型Rap1の測定には、Rap1活性化アッセイキット(Upstate Biotech)を使用し、対照としてCD4T細胞およびCD11bマクロファージを単離する前の脾細胞を使用した。すなわち、各細胞懸濁液に2μg/mLのリコンビナントマウスRGMa(R&D Systems)を添加し5分間処理した後、Mg2+溶解バッファー(25mM HEPES(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 2% glycerol, 2mM sodium orthovanadate, 1mM ethylsulfonyl fluoride, およびprotease inhibitor cocktails (Roche Diagnostics)を含む)で溶解した。細胞溶解液は全Rap1の測定に用いた。RalGDS結合アガロースと細胞溶解液とを4℃で30分間反応させ、Ral結合ドメインに結合した活性型Rap1を沈殿させた。ビーズをMg2+溶解バッファーで洗浄し、2×サンプルバッファーに再懸濁してウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングにはキットに添付の抗Rap1抗体を用い、上記(1−1)と同様の手順で行った。Scion imageを用いてバンドの定量を行い、相対的なRap1活性化レベルを算出した。
ウエスタンブロッティングの結果を図4(A)に示し、相対体的なRap1活性を示すグラフを図4(B)に示した。図4(B)において、相対活性値のグラフは3〜4回の独立した実験の平均値および標準誤差で表わし、「*」はStudentのt検定においてP<0.05であることを表す。図4(A)から明らかなように、いずれの細胞もマウスRGMaの処理により活性型Rap1(図中、Pull down Rap1)が増加した。そして、図4(B)に示したように、RGMaの5分間の刺激により、脾細胞、CD4T細胞およびCD11bマクロファージのRap1は、いずれも有意に活性化されることが明らかとなった。この結果から、樹状細胞に発現したRGMaがCD4T細胞およびCD11bマクロファージ表面のRGMa受容体を通して細胞内のRap1を活性化する可能性が示唆された。
(1−4)リンパ球結合アッセイ
インテグリンが媒介する接着は、T細胞のトラフィッキングおよび活性化において中心的役割を果たす。さらに、TCRが誘導する接着はRap1の活性化を必要とする(Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000)、Reedquist, K.A. et al. J. Cell Biol. 148, 1151-1158 (2000)、Suga, K. et al. FEBS Lett. 489, 249-253 (2001))。そこで、RGMaによって誘導された活性型Rap1が接着活性に関与するか否かを確認するために、リンパ球結合アッセイを行った。
細胞接着の評価は、先行文献(Sebzda, E., Bracke, M., Tugal, T., Hogg, N. & Cantrell, D.A. Nat. Immunol. 3, 251-258 (2002)、Duchniewicz, M. et al. Mol. Cell Biol. 26, 643-653 (2006))に記載の方法に準じて行った。すなわち、96ウェル平底プレート(NUNC, MaxiSorp)に、2μg/mLのリコンビナントマウスICAM−1/Fc(R&D Systems)または4μg/mLのフィブロネクチン(シグマ・アルドリッチ)を添加し、4℃で一夜静置してプレコーティングを行った。PBSでプレートを洗浄し、非特異的な結合を防ぐために2%BSAを含むRPMI1640(Invitrogen)で37℃、1時間ブロッキングを行った。ICAM−1/FcをコートしたプレートはCD4T細胞の評価に用い、フィブロネクチンをコートしたプレートは脾細胞の評価に用いた。
新たに調製した脾細胞またはCD4T細胞を2.5μMのBCECF−AM(2’7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester、Calbiochem)で、37℃30分間標識し、続いて0.5%BSAを含むRPMI1640で洗浄した。5×10個の細胞をプレコートしたプレートに加え、2μg/mLのリコンビナントRGMaを含む、または含まない0.5%BSA含有RPMI1640中で37℃1時間インキュベートした。接着していない細胞を、温かい0.5%BSA含有RPMI1640で3回洗浄することにより除去した。接着は、Spectra MAX(Molecular Devices)を用いて、励起波長485nm蛍光波長538nmで定量した。接着率は1ウェルに播種した全細胞数に対するパーセンテージで表した。
脾細胞の結果を図5(A)に、CD4T細胞の結果を図5(B)に示した。接着率のグラフは、3回の独立した実験の平均値および標準誤差で表し、「*」および「**」はStudentのt検定においてそれぞれP<0.05およびP<0.01であることを表す。図5(A)から明らかなように、RGMa刺激を受けた脾細胞は、RGMa刺激を受けていない脾細胞と比較して、フィブロネクチンに対する接着率が有意に高くなることが示された。同様に、図5(B)から明らかなように、RGMa刺激を受けたCD4T細胞は、RGMa刺激を受けていないCD4T細胞と比較して、ICAM−1に対する接着率が有意に高くなることが示された。これらの結果から、RGMaがRap1を活性化することで、脾細胞およびCD4T細胞の接着活性が増強されることが明らかとなった。
〔実施例2:多発性硬化症モデルマウスにおける抗RGMa中和抗体の効果の検討〕
(2−1)多発性硬化症モデルマウスの作製
多発性硬化症の臨床および病理学的特徴の研究モデルとして広く受け入れられているモデル動物として、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(myelin oligodendrocyte glycoprotein、以下「MOG」という。)で誘導した実験的自己免疫性脳脊髄炎(experimental autoimmune encephalomyelitis、以下「EAE」という。)マウスを用いた。具体的には、EAEは、(MOG)35-55ペプチド(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(配列番号5)、Greiner Bio-one)100μgを含むPBS100μLと、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント100μLとのエマルジョン200μLを、C57BL/6マウス(8〜10週齢)の脇腹皮下に投与することで誘導した。さらに、MOG投与後およびその48時間後に、200ngの百日咳毒素(List Biological Laboratories)を静脈内投与した。
(2−2)多発性硬化症モデルマウスへの抗RGMa中和抗体投与による臨床症状の観察
MOG投与後7日目および10日目に本発明者らが作製した抗RGMa中和抗体(非特許文献3参照)またはコントロール抗体(ウサギIgG、シグマ・アルドリッチ)を各400μg腹腔内投与した。抗RGMa中和抗体投与群は9匹、コントロール抗体投与群は11匹のEAEマウスで構成した。MOG投与(0日)から21日まで観察し、EAEの臨床症状を以下の基準に基づいて評価した。
0 :異状なし
0.5:尾の緊張喪失
1 :尾の反射性喪失
2 :尾の反射性喪失、正向反射の低下、一肢の知覚異常
3 :一肢の知覚異常および麻痺
3.5:両後肢の麻痺
4 :前肢および後肢の麻痺
5 :瀕死、死亡
観察終了後のマウスを安楽死させ、脊髄を摘出し、パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋切片を作製して、組織学的評価に供した。切片をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色し、炎症を評価した。頸髄から胸髄まで、マウス当たり20−30切片を観察し、以下の基準に基づいて半定量的な炎症の組織学的評価(炎症インデックス)をブラインドで行った。抗RGMa中和抗体投与群は5匹、コントロール抗体投与群は6匹について評価した。
0:炎症なし
1:血管周囲および髄膜のみの細胞浸潤
2:骨髄実質の軽度の細胞浸潤
3:骨髄実質の中等度の細胞浸潤
4:骨髄実質の重度の細胞浸潤
観察期間中のEAEスコアの変化を図6に示した。EAEスコアは平均値および標準誤差で示した。図6から明らかなように、14日以後抗RGMa中和抗体投与群のEAEスコアはコントロール抗体投与群より顕著に低値であった。図には示していないが、Studentのt検定の結果、14日目はP<0.05、15日目以後はP<0.01で両群間に統計的有意差が認められた。
図7(A)に各群におけるEAEの臨床症状発現率を示し、図7(B)に各群におけるEAE発病日の平均値を示し、図7(C)に各群の各マウスのスコア最大値の平均値を示し、図7(D)に各群の各マウスのスコア累積値の平均値を示した。図中「n.s.」はStudentのt検定において有意差がないこと、「*」および「**」はStudentのt検定においてそれぞれP<0.05およびP<0.01であることを表す。図7(A)から明らかなように、コントロール抗体投与群は全例(100%)がEAEの臨床症状を発現したが、抗RGMa中和抗体投与群では、44%のマウスがEAEの臨床症状を発現しなかった。また、図7(B)から明らかなように、両群間の発病日に差異はなく、抗RGMa中和抗体投与によってEAEの発病が遅延するものではないことが示された。一方、図7(C)および(D)から明らかなように、スコア最大値の平均値およびスコア累積値の平均値は、いずれも抗RGMa中和抗体投与群がコントロール抗体投与群より有意に低い値を示した。これらの結果は、抗RGMa中和抗体の投与が、EAEの症状発現の抑制および進行の抑制に有効であることを示すものである。
頸髄のHE染色組織像を図8に示した。(a)および(b)はコントロール抗体投与群のHE染色組織像、(c)および(d)は抗RGMa中和抗体投与群のHE染色組織像であり、スケールバーは250μmを示す。図8(a)および(b)から明らかなように、コントロール抗体投与群の骨髄には広く炎症性単核細胞が存在し、広範囲の炎症性病変が示された。一方、(c)および(d)から明らかなように、抗RGMa中和抗体投与群の骨髄には炎症性単核細胞が顕著に少なく、炎症病変が軽減されていることが示された。
炎症インデックスの評価結果を図9に示した。図中「*」はStudentのt検定においてP<0.05であることを表す。図9から明らかなように、抗RGMa中和抗体投与群の炎症インデックスは、コントロール抗体投与群と比較して有意に低い数値を示した。以上のように、多発性硬化症モデルマウスを用いた実験結果から、抗RGMa中和抗体の投与は、EAEにおける臨床症状および組織学的病変の両方を軽減することが明らかとなった。
〔実施例3:抗RGMa中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの脾細胞におけるT細胞活性化の検討〕
実施例2の臨床症状観察を終了した多発性硬化症モデルマウス(EAEマウス)からMOG投与後21日目に脾臓を摘出して脾細胞を単離し、96ウェルプレートに5×10個/ウェルで播種し、3日間培養して細胞増殖を解析した。培地には、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、2−ME、および10%熱不活化FBSを含むRPMI1640培地を用いた。CD4T細胞を再刺激するために、20μg/mLのMOGペプチドまたは5μg/mLの抗CD3モノクローナル抗体(2C11、BD Biosciences)を培養開始時に添加した。Kuboらの方法(Kubo, T., et al. J. Immunol. 173, 7249-7258 (2004).)に従って、培養終了前18時間の[H]チミジン取り込みを評価した。
IFN−γ、IL−2、IL−4およびIL−17の生成量測定のために、上記脾細胞を24ウェルプレートに2×10個/ウェルで播種し、20μg/mLのMOGペプチドまたは5μg/mLの抗CD3モノクローナル抗体の存在下または非存在下で培養した。培養開始後24時間の培養上清をIL−2の測定に使用し、培養開始後72時間の培養上清を他のサイトカインの測定に使用した。サイトカインの測定にはELISAキット(Invitrogen)を用い、説明書の記載に従って行った。
結果を図10に示した。(a)は細胞増殖の測定結果、(b)はIL−2の測定結果、(c)はIFN−γの測定結果、(d)はIL−17の測定結果である。各グラフは平均値および標準誤差(コントロール抗体投与群n=6、抗RGMa中和抗体投与群n=5)で表し、「*」および「**」はStudentのt検定においてそれぞれP<0.05およびP<0.01であることを表す。図10(a)から明らかなように、抗RGMa中和抗体投与群のマウスから得た脾細胞の細胞増殖は、MOGペプチドによる抗原特異的刺激および抗CD3モノクローナル抗体による非特異的刺激のいずれによる場合も、コントロール抗体投与群のマウスから得た脾細胞の細胞増殖より有意に低いことが示された。また、図10(b)、(c)、(d)から明らかなように、抗RGMa中和抗体投与群のマウスから得た脾細胞のIL−2、IFN−γおよびIL−17の分泌量は、MOGペプチドによる抗原特異的刺激および抗CD3モノクローナル抗体による非特異的刺激のいずれによる場合も、コントロール抗体投与群のマウスから得た脾細胞の各サイトカイン分泌量より有意に低いことが示された。一方、データを示していないが、IL−4の分泌量に関しては、抗RGMa中和抗体の投与が影響を及ぼさなかった。これら結果から、EAEマウスへの抗RGMa中和抗体の投与は、EAEマウスにおける抗原特異的および非特異的なT細胞活性化を顕著に減弱させることが明らかとなった。
〔実施例4:再発性多発性硬化症モデルマウスにおける抗RGMa中和抗体の効果の検討〕
(4−1)再発性多発性硬化症モデルマウスの作製
MOGに代えてミエリンプロテオリピドタンパク質(myelin proteolipid protein、以下「PLP」という。)をSJL/Jマウスに投与することで、再発性EAEモデルマウスを作製した。具体的には、再発性EAEは、(PLP)139-151ペプチド(HSLGKWLGHPDKF(配列番号6)、Greiner Bio-one)100μgを含むPBS100μLと、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント100μLとのエマルジョン200μLを、SJL/Jマウス(8〜10週齢)の脇腹皮下に投与することで誘導した。さらに、PLP投与後およびその48時間後に、200ngの百日咳毒素(List Biological Laboratories)を静脈内投与した。
(4−2)再発性多発性硬化症モデルマウスへの抗RGMa中和抗体投与による臨床症状の観察
PLP投与後25日目および28日目に本発明者らが作製した抗RGMa中和抗体(非特許文献3参照)またはコントロール抗体(ウサギIgG、シグマ・アルドリッチ)を各400μg腹腔内投与した。抗RGMa中和抗体投与群は9匹、コントロール抗体投与群は11匹のEAEマウスで構成した。PLP投与(0日)から45日まで観察し、EAEの臨床症状を上記実施例2に記載の基準に基づいて評価した。
観察期間中のEAEスコアの変化を図11に示した。EAEスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「*」はStudentのt検定においてP<0.05であることを表す。図11から明らかなように、抗体投与後における抗RGMa中和抗体投与群のEAEスコアは、コントロール抗体投与群のEAEスコアより顕著に低値であった。この結果から、最初の麻痺発現期の後期に抗RGMa中和抗体を投与することにより、EAEの再発が予防できることが示された。
〔実施例5:MOGで刺激したBMDCs移植マウスのEAE臨床症状におけるRGMa遺伝子ノックダウンの効果の検討〕
(5−1)RGMa遺伝子ノックダウンBMDCsの作製
以下に示す塩基配列のマウスRGMa siRNA(Stealth RNAi(商品名)、Invitrogen)を購入して使用した。また、ノンターゲティングdsRNA(Invitrogen)をコントロールsiRNAとして使用した。
センス鎖:5’-AAAGAGGCCGCAGUGAGUGUAGUUG-3’(配列番号7)
アンチセンス鎖:5’-CAACUACACUCACUGCGGCCUCUUU-3’(配列番号8)
培養開始後7日のBMDCsを使用した(実施例1参照)。500pmolのマウスRGMa siRNAまたはコントロールsiRNAを含む核酸導入用溶液100μLに1×10個のBMDCsを懸濁した。サンプルをキュベットに移し、ヌクレオフェクター(登録商標)装置(Lonza社)を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従ってsiRNAを細胞に導入した。siRNA導入後、細胞は、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、2−ME、10%熱不活化FBSを添加したRPMI1640培地を用いて培養した。マウスRGMa siRNAを導入したBMDCsにおけるRGMaの発現は、顕著に低下していた。
(5−2)MOG刺激およびマウスへの移植
マウスRGMa siRNAまたはコントロールsiRNAを導入したBMDCsに、100μg/mLの(MOG)35-55ペプチドを添加し、4〜6時間培養して抗原刺激を与えた。刺激後の生細胞6×10個をレシピエントマウス(C57BL/6)の静脈内に投与した。続いて、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント200μLを皮下投与した。さらに、その48時間後に200ngの百日咳毒素(List Biological Laboratories)を静脈内投与した。
(5−3)EAE臨床症状の観察
RGMa siRNA群(5匹)およびコントロールsiRNA群(5匹)について、細胞移植(0日)から21日まで観察し、EAEの臨床症状を上記実施例2に記載の基準に基づいて評価した。
観察期間中のEAEスコアの変化を図12に示した。EAEスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「*」および「**」はStudentのt検定においてそれぞれP<0.05およびP<0.01であることを表す。図12から明らかなように、RGMa siRNA群のEAEスコアは、コントロールsiRNA群のEAEスコアより顕著に低値であった。この結果から、RGMa siRNAが多発性硬化症の予防または治療に有効であることが明らかとなった。
〔実施例6:MOG刺激を受けたCD4T細胞移植マウスのEAE臨床症状における抗RGMa中和抗体の効果の検討〕
(6−1)ドナーマウスのCD4T細胞の調製
ドナーマウス(C57BL/6)に本発明者らが作製した抗RGMa中和抗体(非特許文献3参照)またはコントロール抗体(ウサギIgG、シグマ・アルドリッチ)を各400μg腹腔内投与した(−2日)。その2日後(0日)に、抗RGMa中和抗体またはコントロール抗体の2度目の投与を行うと共に、(MOG)35-55ペプチド100μgを含むPBS100μLと、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント100μLとのエマルジョン200μLを皮下投与した。さらに、その5日後(5日)に、抗RGMa中和抗体またはコントロール抗体の3度目の投与を行った。MOG投与から10日目にマウスを安楽死させ、脾臓および流入領域リンパ節を摘出し、細胞を単離して細胞懸濁液を調製した。CD4T細胞を再刺激するために、40μg/mLの(MOG)35-55ペプチドを含む培地で細胞(1×10個/mL)を3日間培養した。培養終了後、細胞を集め、CD4T細胞分離キット(Miltenyi Biotec)を用いてCD4T細胞を分離した。
(6−2)レシピエントマウスへの移植およびEAE臨床症状の観察
レシピエントマウス(C57BL/6)には、予め亜致死量(500Gy)の放射線を照射した。CD4T細胞(生細胞)6×10個をレシピエントマウスに静脈内投与した。抗RGMa中和抗体を投与したドナーマウス由来のCD4T細胞を移植したマウス(抗RGMa中和抗体群、7匹)およびコントロール抗体を投与したドナーマウス由来のCD4T細胞を移植したマウス(コントロール抗体群、7匹)について、細胞移植(0日)から21日まで観察し、EAEの臨床症状を上記実施例2に記載の基準に基づいて評価した。
観察期間中のEAEスコアの変化を図13に示した。EAEスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「*」および「**」はStudentのt検定においてそれぞれP<0.05およびP<0.01であることを表す。図13から明らかなように、抗RGMa中和抗体群のEAEスコアは、コントロール抗体群のEAEスコアより顕著に低値であった。この結果から、抗RGMa中和抗体による多発性硬化症の予防または治療効果は、抗RGMa中和抗体が抗原特異的なT細胞活性化や自己反応性T細胞の分化を抑制することに基づくことが明らかとなった。
以上の結果は、単核細胞の脊髄への浸潤、およびT細胞の増殖やEAE関連サイトカインであるIL−2、IL−17およびIFN−γの産生といったT細胞の活性化などの免疫応答の増大によるEAEの発病に、RGMaが関与することを明らかにしたものである。さらに、抗RGMa中和抗体やRGMa siRNAがT細胞の活性化を阻害し、多発性硬化症の予防または治療に有効であることを示したものである。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
本発明は、医薬品産業において極めて高い利用価値を有する。

Claims (15)

  1. RGM阻害物質を有効成分として含有するT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
    (1)抗RGMa中和抗体、
    (2)RGMa siRNA、
    (3)RGMa shRNA、及び
    (4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド
  2. RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である請求項1に記載の医薬組成物。
  3. RGM阻害物質がRGM siRNAである請求項1に記載の医薬組成物。
  4. T細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
  5. 自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項4に記載の医薬組成物。
  6. RGM阻害物質を有効成分として含有する多発性硬化症の再発予防用医薬組成物であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
    (1)抗RGMa中和抗体、
    (2)RGMa siRNA、
    (3)RGMa shRNA、及び
    (4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド
  7. RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である請求項6に記載の医薬組成物。
  8. RGM阻害物質がRGM siRNAである誇求項6に記載の医薬組成物。
  9. RGM阻害物質を有効成分として含有するT細胞活性化阻害剤であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
    (1)抗RGMa中和抗体、
    (2)RGMa siRNA、
    (3)RGMa shRNA、及び
    (4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド
  10. RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である請求項9に記載のT細胞活性化阻害剤。
  11. RGM阻害物質がRGM siRNAである請求項9に記載のT細胞活性化阻害剤。
  12. 被験物質をRGMに接触させる工程と、
    前記RGMの活性レベルを測定する工程と、
    前記活性レベルを、被験物質に接触していないRGMの活性レベルと比較する工程と、
    RGMの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを
    特徴とするT細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。
  13. RGM阻害物質をRGM発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするin vitro T細胞活性化阻害方法であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
    (1)抗RGMa中和抗体、
    (2)RGMa siRNA、
    (3)RGMa shRNA、及び
    (4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド
  14. RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である請求項13に記載のT細胞活性化阻害方法。
  15. RGM阻害物質がRGM siRNAである請求項13に記載のT細胞活性化阻害方法。
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