JP5785873B2 - T細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびt細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
[1]RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化阻害剤。
[2]RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である前記[1]に記載のT細胞活性化阻害剤。
[3]RGM阻害物質がRGM siRNAである前記[1]に記載のT細胞活性化阻害剤。
[4]前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とするT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
[5]T細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である前記[4]に記載の医薬組成物。
[6]自己免疫疾患が多発性硬化症である前記[5]に記載の医薬組成物。
[7]被験物質をRGMに接触させる工程と、前記RGMの活性レベルを測定する工程と、前記活性レベルを、被験物質に接触していないRGMの活性レベルと比較する工程と、RGMの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを特徴とするT細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。
[8]RGM阻害物質をRGM発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするT細胞活性化阻害方法。
[9]RGM阻害物質が抗RGM中和抗体である前記[8]に記載のT細胞活性化阻害方法。
[10]RGM阻害物質がRGM siRNAである前記[8]に記載のT細胞活性化阻害方法。
[11]哺乳動物に対して、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする自己免疫疾患の予防または治療方法。
[12]自己免疫疾患の予防または治療用医薬組成物を製造するための、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤の使用。
[13]自己免疫疾患の予防または治療に使用するための、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のT細胞活性化阻害剤。
本発明は、RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化阻害剤を提供する。本発明のT細胞活性化阻害剤の有効成分であるRGM阻害物質は、RGMの活性(RGM活性)を阻害する物質およびRGMの発現を阻害する物質のいずれでもよい。
本発明は、上記本発明のT細胞活性化阻害剤を含有するT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、換言すれば、RGM阻害物質を有効成分とするT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物である。
本発明のスクリーニング方法は、被験物質をRGMに接触させる工程、被験物質に接触したRGMの活性レベルを測定する工程、測定した活性レベルを被験物質に接触していないRGMの活性レベルと比較する工程、RGMの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程を包含するものであればよい。本発明のスクリーニング方法により、T細胞活性化阻害物質を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。
(1−1)骨髄由来樹状細胞(BMDCs)におけるRGMaの発現
Lutzらの方法(Lutz, M.B., et al. J. Immunol. Methods 223, 77-92 (1999).)に従って、C57BL/6マウス(8〜10週齢)から骨髄細胞を採取し、GM−CSF(20ng/mL、シグマ・アルドリッチ)を含む培地で培養することによりBMDCsを取得した。実験には、培養開始後6日のBMDCsを使用した。
C57BL/6マウス(8〜10週齢)から脾臓を摘出し、速やかにRPMI1640培地(Invitrogen)中に入れて緩やかに押し付け、ACK溶解バッファー(Lonza Walkersville)で赤血球除去処理をして細胞懸濁液を得た。RPMI1640で3回洗浄後、細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーに通して脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。この懸濁液に各種濃度のヒトRGMaのC末端フラグメント(以下「RGMa−Fc」という。)を添加して30分間インキュベートした。洗浄後、PE標識抗CD11b抗体またはAPC標識抗CD4抗体と、FITC標識抗ヒトRGMa−Fc抗体(BD Biosciences)とを組み合わせた免疫染色を施し、フローサイトメトリー解析により細胞とヒトRGMa−Fcとの結合を測定した。フローサイトメトリー解析には、FACSCalibur(BD Biosciences)およびCellQuestソフトウエア(BD Biosciences)を用いた。
次に、CD4+T細胞およびCD11b+マクロファージに結合するRGMaによって仲介される可能性のあるシグナル伝達について検討した。Tリンパ球において、TCRライゲーションはRap1の一時的活性化、および、T細胞の抗原提示細胞接触面におけるRap1−GTPの蓄積を引き起こし、これはLFA−1(インテグリン):ICAM−1(インテグリンリガンド)が仲介するシグナルを制御することが知られている(Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000)、Katagiri, K., Hattori, M., Minato, N. & Kinashi, T. Mol. Cell Biol 22, 1001-1015 (2002))。そこで、CD4+T細胞およびCD11b+マクロファージのRap1活性化におけるRGMaの関与について評価した。
インテグリンが媒介する接着は、T細胞のトラフィッキングおよび活性化において中心的役割を果たす。さらに、TCRが誘導する接着はRap1の活性化を必要とする(Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000)、Reedquist, K.A. et al. J. Cell Biol. 148, 1151-1158 (2000)、Suga, K. et al. FEBS Lett. 489, 249-253 (2001))。そこで、RGMaによって誘導された活性型Rap1が接着活性に関与するか否かを確認するために、リンパ球結合アッセイを行った。
(2−1)多発性硬化症モデルマウスの作製
多発性硬化症の臨床および病理学的特徴の研究モデルとして広く受け入れられているモデル動物として、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(myelin oligodendrocyte glycoprotein、以下「MOG」という。)で誘導した実験的自己免疫性脳脊髄炎(experimental autoimmune encephalomyelitis、以下「EAE」という。)マウスを用いた。具体的には、EAEは、(MOG)35-55ペプチド(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(配列番号5)、Greiner Bio-one)100μgを含むPBS100μLと、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント100μLとのエマルジョン200μLを、C57BL/6マウス(8〜10週齢)の脇腹皮下に投与することで誘導した。さらに、MOG投与後およびその48時間後に、200ngの百日咳毒素(List Biological Laboratories)を静脈内投与した。
MOG投与後7日目および10日目に本発明者らが作製した抗RGMa中和抗体(非特許文献3参照)またはコントロール抗体(ウサギIgG、シグマ・アルドリッチ)を各400μg腹腔内投与した。抗RGMa中和抗体投与群は9匹、コントロール抗体投与群は11匹のEAEマウスで構成した。MOG投与(0日)から21日まで観察し、EAEの臨床症状を以下の基準に基づいて評価した。
0 :異状なし
0.5:尾の緊張喪失
1 :尾の反射性喪失
2 :尾の反射性喪失、正向反射の低下、一肢の知覚異常
3 :一肢の知覚異常および麻痺
3.5:両後肢の麻痺
4 :前肢および後肢の麻痺
5 :瀕死、死亡
0:炎症なし
1:血管周囲および髄膜のみの細胞浸潤
2:骨髄実質の軽度の細胞浸潤
3:骨髄実質の中等度の細胞浸潤
4:骨髄実質の重度の細胞浸潤
実施例2の臨床症状観察を終了した多発性硬化症モデルマウス(EAEマウス)からMOG投与後21日目に脾臓を摘出して脾細胞を単離し、96ウェルプレートに5×105個/ウェルで播種し、3日間培養して細胞増殖を解析した。培地には、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、2−ME、および10%熱不活化FBSを含むRPMI1640培地を用いた。CD4+T細胞を再刺激するために、20μg/mLのMOGペプチドまたは5μg/mLの抗CD3モノクローナル抗体(2C11、BD Biosciences)を培養開始時に添加した。Kuboらの方法(Kubo, T., et al. J. Immunol. 173, 7249-7258 (2004).)に従って、培養終了前18時間の[3H]チミジン取り込みを評価した。
(4−1)再発性多発性硬化症モデルマウスの作製
MOGに代えてミエリンプロテオリピドタンパク質(myelin proteolipid protein、以下「PLP」という。)をSJL/Jマウスに投与することで、再発性EAEモデルマウスを作製した。具体的には、再発性EAEは、(PLP)139-151ペプチド(HSLGKWLGHPDKF(配列番号6)、Greiner Bio-one)100μgを含むPBS100μLと、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント100μLとのエマルジョン200μLを、SJL/Jマウス(8〜10週齢)の脇腹皮下に投与することで誘導した。さらに、PLP投与後およびその48時間後に、200ngの百日咳毒素(List Biological Laboratories)を静脈内投与した。
PLP投与後25日目および28日目に本発明者らが作製した抗RGMa中和抗体(非特許文献3参照)またはコントロール抗体(ウサギIgG、シグマ・アルドリッチ)を各400μg腹腔内投与した。抗RGMa中和抗体投与群は9匹、コントロール抗体投与群は11匹のEAEマウスで構成した。PLP投与(0日)から45日まで観察し、EAEの臨床症状を上記実施例2に記載の基準に基づいて評価した。
(5−1)RGMa遺伝子ノックダウンBMDCsの作製
以下に示す塩基配列のマウスRGMa siRNA(Stealth RNAi(商品名)、Invitrogen)を購入して使用した。また、ノンターゲティングdsRNA(Invitrogen)をコントロールsiRNAとして使用した。
センス鎖:5’-AAAGAGGCCGCAGUGAGUGUAGUUG-3’(配列番号7)
アンチセンス鎖:5’-CAACUACACUCACUGCGGCCUCUUU-3’(配列番号8)
マウスRGMa siRNAまたはコントロールsiRNAを導入したBMDCsに、100μg/mLの(MOG)35-55ペプチドを添加し、4〜6時間培養して抗原刺激を与えた。刺激後の生細胞6×105個をレシピエントマウス(C57BL/6)の静脈内に投与した。続いて、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント200μLを皮下投与した。さらに、その48時間後に200ngの百日咳毒素(List Biological Laboratories)を静脈内投与した。
RGMa siRNA群(5匹)およびコントロールsiRNA群(5匹)について、細胞移植(0日)から21日まで観察し、EAEの臨床症状を上記実施例2に記載の基準に基づいて評価した。
観察期間中のEAEスコアの変化を図12に示した。EAEスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「*」および「**」はStudentのt検定においてそれぞれP<0.05およびP<0.01であることを表す。図12から明らかなように、RGMa siRNA群のEAEスコアは、コントロールsiRNA群のEAEスコアより顕著に低値であった。この結果から、RGMa siRNAが多発性硬化症の予防または治療に有効であることが明らかとなった。
(6−1)ドナーマウスのCD4+T細胞の調製
ドナーマウス(C57BL/6)に本発明者らが作製した抗RGMa中和抗体(非特許文献3参照)またはコントロール抗体(ウサギIgG、シグマ・アルドリッチ)を各400μg腹腔内投与した(−2日)。その2日後(0日)に、抗RGMa中和抗体またはコントロール抗体の2度目の投与を行うと共に、(MOG)35-55ペプチド100μgを含むPBS100μLと、結核死菌(H37Ra、Difco)500μgを含むフロイント完全アジュバント100μLとのエマルジョン200μLを皮下投与した。さらに、その5日後(5日)に、抗RGMa中和抗体またはコントロール抗体の3度目の投与を行った。MOG投与から10日目にマウスを安楽死させ、脾臓および流入領域リンパ節を摘出し、細胞を単離して細胞懸濁液を調製した。CD4+T細胞を再刺激するために、40μg/mLの(MOG)35-55ペプチドを含む培地で細胞(1×106個/mL)を3日間培養した。培養終了後、細胞を集め、CD4+T細胞分離キット(Miltenyi Biotec)を用いてCD4+T細胞を分離した。
レシピエントマウス(C57BL/6)には、予め亜致死量(500Gy)の放射線を照射した。CD4+T細胞(生細胞)6×105個をレシピエントマウスに静脈内投与した。抗RGMa中和抗体を投与したドナーマウス由来のCD4+T細胞を移植したマウス(抗RGMa中和抗体群、7匹)およびコントロール抗体を投与したドナーマウス由来のCD4+T細胞を移植したマウス(コントロール抗体群、7匹)について、細胞移植(0日)から21日まで観察し、EAEの臨床症状を上記実施例2に記載の基準に基づいて評価した。
Claims (15)
- RGMa阻害物質を有効成分として含有するT細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
(1)抗RGMa中和抗体、
(2)RGMa siRNA、
(3)RGMa shRNA、及び
(4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - RGMa阻害物質が抗RGMa中和抗体である請求項1に記載の医薬組成物。
- RGMa阻害物質がRGMa siRNAである請求項1に記載の医薬組成物。
- T細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項4に記載の医薬組成物。
- RGMa阻害物質を有効成分として含有する多発性硬化症の再発予防用医薬組成物であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
(1)抗RGMa中和抗体、
(2)RGMa siRNA、
(3)RGMa shRNA、及び
(4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - RGMa阻害物質が抗RGMa中和抗体である請求項6に記載の医薬組成物。
- RGMa阻害物質がRGMa siRNAである誇求項6に記載の医薬組成物。
- RGMa阻害物質を有効成分として含有するT細胞活性化阻害剤であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
(1)抗RGMa中和抗体、
(2)RGMa siRNA、
(3)RGMa shRNA、及び
(4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - RGMa阻害物質が抗RGMa中和抗体である請求項9に記載のT細胞活性化阻害剤。
- RGMa阻害物質がRGMa siRNAである請求項9に記載のT細胞活性化阻害剤。
- 被験物質をRGMaに接触させる工程と、
前記RGMaの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質に接触していないRGMaの活性レベルと比較する工程と、
RGMaの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを
特徴とするT細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。 - RGMa阻害物質をRGMa発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするin vitro T細胞活性化阻害方法であって、RGMa阻害物質が以下の群から選択される医薬組成物:
(1)抗RGMa中和抗体、
(2)RGMa siRNA、
(3)RGMa shRNA、及び
(4)RGMa アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - RGMa阻害物質が抗RGMa中和抗体である請求項13に記載のT細胞活性化阻害方法。
- RGMa阻害物質がRGMa siRNAである請求項13に記載のT細胞活性化阻害方法。
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