ES2555060T3

ES2555060T3 - Inhibidor de la activación de linfocitos T, composición farmacéutica que lo contiene y método de cribado de sustancias inhibidoras de la activación de linfocitos T

Info

Publication number: ES2555060T3
Application number: ES10835979.5T
Authority: ES
Inventors: Toshihide Yamashita; Takekazu Kubo
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2015-12-28
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: KR102425676B1; KR20210097217A; KR20210025700A; KR20190110633A; CN102811739A; US9334323B2; US9751938B2; KR20170102378A; WO2011071059A1; JP5785873B2; EP2510948A1; US20160244517A1; EP2510948A4; KR102284780B1; CN106237331A; US20120328633A1; KR20120120193A; EP2510948B1; JPWO2011071059A1; KR102223464B1

Abstract

Una sustancia inhibidora de una molécula de orientación repulsiva a (RGMa) como ingrediente activo para uso en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, tales como enfermedad autoinmunitaria celular, reumatismo, esclerosis múltiple, enfermedades autoinmunitarias del sistema nervioso, tales como síndrome de Gui- llain-Barré, enfermedad de neuro-Behçet, anemia maligna, diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedades inflamatorias intestinales (IBD), síndrome de Sjogren, dermatitis atópica, síndrome de Goodpasture, enfermedades de Grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, glomerulonefritis, miastenia grave, enfermedades de Hashimoto.

Description

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tampón, conservante, antiséptico, agente de ajuste del pH y similares. Como agente estabilizante, se pueden usar albúmina, globulina, gelatina, manitol, glucosa, dextrano, etilenglicol, propilenglicol, ácido ascórbico, bisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, EDTA sódico, citrato de sodio, dibutilhidroxitolueno y similares. Como agente solubilizante, se puede usar alcohol (por ejemplo, etanol, etc.), polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, etc.), tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80 (marca registrada), HCO-50, etc.) y similares. Como agente de puesta en suspensión, se pueden usar monoestearato de glicerol, monoestearato de aluminio, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, laurilsulfato de sodio y similares. Como agente emulsionante, se pueden usar goma arábiga, alginato de sodio, goma de tragacanto y similares. Como agente relajante, se pueden usar alcohol bencílico, clorobutanol, sorbitol y similares. Como agente tampón, se pueden usar tampón de fosfato, tampón de acetato, tampón de borato, tampón de carbonato, tampón de citrato, tampón Tris y similares. Como agente conservante, se pueden usar p-hidroxibenzoato de metilo, parahidroxibenzoato de etilo, p-hidroxibenzoato de propilo, p-hidroxibenzoato de butilo, clorobutanol, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, deshidroacetato de sodio, edetato de sodio, ácido bórico, bórax y similares. Como agente antiséptico, se pueden usar cloruro de benzalconio, ácido p-oxibenzoico, clorobutanol y similares. Como agente de ajuste del pH, se pueden usar ácido clorhídrico, hidróxido sódico, ácido fosfórico, ácido acético y similares.

Cuando la sustancia inhibidora de la RGM es un ácido nucleico (siRNA, shRNA, oligonucleótido antisentido y similares), se puede administrar en forma de un vector no viral o un vector viral. Cuando tiene una forma de vector no viral, se puede utilizar un método que usa un liposoma para introducir una molécula de ácido nucleico (método de liposomas, método de HVJ-liposomas, método de liposomas catiónico, método de lipofección, método de lipofectamina y similares), un método de microinyección, un método de transferir una molécula de ácido nucleico a una célula junto con un vehículo (partículas de metal) por una pistola génica y similares. Cuando siRNA o shRNA se administra al cuerpo utilizando un vector viral, se puede usar un vector viral tal como adenovirus recombinante, retrovirus y similares. Un gen puede ser introducido en una célula o tejido por introducción de un siRNA o shRNA que expresa DNA en un virus de DNA o virus de RNA, tales como retrovirus destoxificado, adenovirus, virus adeno-asociado, virus herpes, virus de la viruela vacuna, poxvirus, virus de la poliomielitis, virus Sindbis, virus hemaglutinante de Japón, SV40 y similares, para permitir la infección de la célula o tejido con el virus recombinante.

Administrando una cantidad eficaz de la preparación así obtenida a, por ejemplo, seres humanos y otros mamíferos (por ejemplo, rata, ratón, conejo, oveja, cerdos, ganado bovino, gato, perro, mono y similares), se puede prevenir o tratar una enfermedad causada por activación de linfocitos T. La dosis se determina apropiadamente teniendo en cuenta el objeto, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso, el sexo y el historial médico del paciente, la clase de ingredientes activos y similares. Por ejemplo, cuando el ingrediente activo es un anticuerpo neutralizante anti-RGM, se prefiere alrededor de 0,02 mg -4000 mg al día y es más preferible aproximadamente 0,1 mg -200 mg al día, para un ser humano normal, con un peso de aproximadamente 65 -70 kg como diana. La dosis diaria total puede ser una dosis única o dosis divididas.

[Método de cribado]

El método de cribado de la presente invención puede ser cualquiera siempre que comprenda una etapa de puesta en contacto de una sustancia de ensayo con la RGM, una etapa de medición del nivel de actividad de la RGM en contacto con la sustancia de ensayo, una etapa de comparación del nivel de actividad medida con el de la RGM en contacto con la sustancia de ensayo y una etapa de selección de una sustancia de ensayo que reduce el nivel de actividad de la RGM. Una sustancia inhibidora de la activación de linfocitos T se puede cribar conveniente y eficazmente por el método de cribado de la presente invención.

Una sustancia de ensayo se puede poner en contacto con la RGM, por ejemplo, añadiendo la sustancia de ensayo a una solución de RGM para permitir su disolución o puesta en suspensión. Como RGM, se puede usar una RGM recombinante comercialmente disponible o una RGM recombinante propia preparada de acuerdo con un método convencional. El tiempo de contacto y la temperatura de contacto no están particularmente limitados y se pueden determinar apropiadamente. Además, se ajusta preferiblemente un grupo de control sin contacto con la sustancia de ensayo. El nivel de actividad de la RGM se puede medir como un índice basándose la actividad de unión de la RGM al receptor de RGM (véase el Ejemplo 1 (1-2)), la actividad inductora de la activación de Rap1 (véase el Ejemplo 1 (13)), la mejor actividad en la adhesión de linfocitos T a ICAM (véase el Ejemplo 1 (1-4)) y similares.

Por comparación del nivel de actividad medida con el de RGM que no ha estado en contacto con la sustancia de ensayo, se puede juzgar si la sustancia de ensayo es una sustancia inhibidora de la activación de linfocitos T. Cuando el nivel de actividad de la RGM en contacto con una sustancia de ensayo es menor que el de la RGM que no ha estado en contacto con la sustancia de ensayo, se interpreta que la sustancia de ensayo es una sustancia inhibidora de la activación de linfocitos T y se selecciona. Preferiblemente, cuando el nivel de actividad de la RGM en contacto con una sustancia de ensayo no es mayor del 50%, más preferiblemente no mayor del 25%, se interpreta que la sustancia de ensayo es una sustancia inhibidora de la activación de linfocitos T. Una sustancia inhibidora de la activación de linfocitos T obtenible por el método de cribado de la presente invención es útil como sustancia candidata de un ingrediente activo de un fármaco profiláctico o terapéutico para una enfermedad causada por la activación de linfocitos T, tal como una enfermedad autoinmunitaria y similar. En particular, es extremadamente útil como sustancia candidata de un ingrediente activo de un fármaco profiláctico o terapéutico para la esclerosis múltiple.

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Los linfocitos T CD4+ y los macrófagos CD11b+ se aislaron por clasificación positiva, utilizando respectivamente perlas magnéticas con anti-CD4 y perlas magnéticas con anti-CD11b (Miltenyi Biotec) de la suspensión celular de un solo esplenocito preparada en el ejemplo (1-2) antes mencionado y se midió la forma activa de Rap1. Para la medición de la forma activa de Rap1, se utilizó un kit de ensayo de activación de Rap1 (Upstate Biotech) y se utilizaron como control esplenocitos antes del aislamiento de los linfocitos T CD4+ y los macrófagos CD11b+. Para ser específicos, se añadió a cada suspensión celular 2 µg/mL de RGMa de ratón recombinante (R&D Systems), la mezcla se trató durante 5 minutos y se lisaron en tampón de lisis de Mg2+ (que contenía HEPES 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de Igepal CA-630, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, 2% de glicerol, ortovanadato de sodio 2 mM, fluoruro de etilsulfonilo 1 mM y cócteles de inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics)). El lisado celular se utilizó para la medición de la Rap1 total. Agarosa unida a RalGDS y el lisado celular se hicieron reaccionar a 4ºC durante 30 minutos para precipitar la forma activa de Rap1 unida a un dominio de unión a Ra1. Las perlas se lavaron con tampón de lisis de Mg2+, se volvieron a poner en suspensión en 2 x tampón de muestra y se sometieron a transferencia de Western. Para la transferencia de Western, se utilizó anticuerpo anti-Rap1 unido al kit y se siguieron procedimientos similares a los del ejemplo (1-1) antes mencionado. La banda se cuantificó utilizando el programa Scion Image y se calculó el nivel relativo de activación de Rap1.

En la Fig. 4 (A) se muestran los resultados de la transferencia de Western y en la Fig. 4 (B) se muestra un gráfico que muestra la actividad relativa de Rap1. En la Fig. 4 (B) se muestra el gráfico de los valores medios de la actividad relativa y el error típico de 3 o 4 experimentos independientes, y "*" significa p <0,05 en la prueba t de Student. Como se deduce de la Fig. 4 (A), la forma activa de Rap1 (Rap1 desplegada en la figura) aumentó en todas las células por el tratamiento con la RGMa de ratón. Como se muestra en la Fig. 4 (B), se ha aclarado que la estimulación por RGMa durante 5 minutos activa significativamente Rap1 en esplenocitos, linfocitos T CD4+ y macrófagos CD11b+. Estos resultados sugieren la posibilidad de que RGMa se exprese en células dendríticas activando la Rap1 intracelular vía el receptor de RGMa en la superficie de linfocitos T CD4+ y macrófagos CD11b+.

(1-4) Ensayo de unión a linfocitos

La adhesión mediada por integrina desempeña un papel central en el tráfico y la activación de los linfocitos T. Además, la adhesión inducida por TCR requiere la activación de Rap1 (Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-69 (2000), Reedquist, K.A. et al. J. Cell Biol. 148, 1151-1158 (2000), Suga, K. et al. FEBS Lett. 489, 249-253 (2001)). Para confirmar si Rap1 en forma activa o no activa inducida por RGMa está implicada en la actividad de adhesión, se realizó un ensayo de unión a linfocitos.

La adhesión celular se evaluó de acuerdo con el método descrito en las referencias de la técnica anterior (Sebzda, E., Bracke, M., Tugal, T., Hogg, N. & Cantrell, D.A. Nat. Immunol. 3, 251-258 (2002), Duchniewicz, M. et al. Mol. Cell Biol. 26, 643-653 (2006)). Concretamente, se añadieron 2 µg/mL de ICAM-1/Fc recombinante de ratón (R&D Systems) o 4 µg/mL de fibronectina (Sigma-Aldrich) a una placa plana de 96 pocillos (NUNC, MaxiSorp) y se dejaron en reposo a 4ºC durante una noche para pre-revestimiento. La placa se lavó con PBS y se bloqueó con RPMI1640 (Invitrogen) que contenía 2% de BSA a 37ºC durante 1 hora para evitar la unión no específica. La placa revestida con ICAM-1/Fc se utilizó para la evaluación de linfocitos T CD4+, y la placa revestida con fibronectina se utilizó para la evaluación de los esplenocitos.

Se marcaron esplenocitos o linfocitos T CD4+ recién preparados con 2,5 µM de BCECF-AM éster acetoximetílico de (2’7’-bis-(2-carboxietil)-5-(y -6)-carboxifluoresceína, Calbiochem) a 37ºC durante 30 minutos y después se lavaron con RPMI1640 que contenía 0,5% de BSA. A la placa pre-revestida se añadieron 5 x 105 células, y se incubaron en RPMI1640 que contenía 0, 5% de BSA que a su vez contenía o no contenía 2 µg/mL de RGMa recombinante a 37ºC durante 1 hora. Las células que no se adhirieron se retiraron lavando tres veces con RPMI1640 caliente que contenía 0,5% de BSA. La adhesión se cuantificó usando Spectra MAX (Molecular Devices) a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 538 nm. La relación de adhesión se muestra en porcentaje del número total de células sembradas en un pocillo.

Los resultados para los esplenocitos se muestran en la Fig. 5 (A) y los resultados para los linfocitos T CD4+ se muestran en la Fig. 5 (B). El gráfico de la relación de adhesión muestra el valor medio y el error típico de tres experimentos independientes, y “*” y “**” muestran p <0, 05 y p <0,01, respectivamente, en la prueba t de Student. Como se deduce de la Fig. 5 (A), los esplenocitos estimulados con RGMa muestran significativamente mayor relación de adhesión a la fibronectina en comparación con los esplenocitos libres de estimulación por RGMa. Similarmente, como se deduce de la Fig. 5 (B), los linfocitos T CD4+ estimulados con RGMa muestran significativamente mayor relación de adhesión a ICAM-1 en comparación con los linfocitos T CD4+ libres de estimulación por RGMa. Estos resultados han aclarado que la activación de Rap1 por RGMa aumenta la actividad de adhesión de esplenocitos y linfocitos T CD4+.

[Ejemplo 2: Estudio del efecto del anticuerpo neutralizante anti-RGMa en ratón modelo con esclerosis múltiple]

(2-1) Producción del ratón modelo con esclerosis múltiple

Como modelo animal ampliamente aceptado como modelo experimental de características clínicas y patológicas de esclerosis múltiple, se usó un ratón con encefalomielitis autoinmunitaria experimental (en lo sucesivo denominada

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administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa a las del grupo al que se había administrado el anticuerpo de control. Estos resultados muestran que la administración de anticuerpo neutralizante anti-RGMa es eficaz para la supresión de la expresión de los síntomas de la EAE y la supresión de su progreso.

Las muestras histológicas teñidas con HE de la médula espinal cervical se muestran en la Fig. 8, en la que (a) y (b) son muestras histológicas teñidas con HE del grupo al que se había administrado el anticuerpo de control, (c) y (d) son muestras histológicas teñidas con HE del grupo al que se había administrado anticuerpo neutralizante anti-RGMa y la barra de la escala representa 250 µm. Como se deduce de las Figs. 8 (a) y (b), están ampliamente presentes células mononucleares inflamatorias y las lesiones inflamatorias están muy extendidas en la médula ósea del grupo al que se había administrado el anticuerpo de control. Por otro lado, como es evidente de (c) y (d), el número de células mononucleares inflamatorias es notablemente pequeño en la médula ósea del grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa, lo que indica que se ha reducido la lesión inflamación.

En la Fig. 9 se muestran los resultados de la evaluación del índice de inflamación, en donde “*” muestra p<0,05 en la prueba t de Student. Como se deduce de la Fig. 9, el índice de inflamación del grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa mostró un valor significativamente bajo en comparación con el grupo al que se había administrado el anticuerpo de control. Como se ha mostrado antes, los resultados del experimento utilizando ratones modelo con esclerosis múltiple han aclarado que la administración del anticuerpo neutralizante anti-RGMa reduce tanto los síntomas clínicos como la lesión histológica en la EAE.

[Ejemplo 3: Estudio de la activación de linfocitos T en esplenocitos de ratón modelo con esclerosis múltiple al que se ha administrado anticuerpo neutralizante anti-RGMa]

El día 21 después de la administración de MOG, se aisló el bazo del ratón modelo con esclerosis múltiple (ratón con EAE) del Ejemplo 2 después de finalizar la observación de los síntomas clínicos. Se aislaron esplenocitos, se sembraron en una placa de 96 pocillos a 5 x 105 células/pocillo y se cultivaron durante 3 días para analizar la proliferación celular. Como medio, se utilizó medio RPMI1640 que contenía glutamina, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina, 2-ME y 10% de FBS inactivado por calor. Para la re-estimulación de linfocitos T CD4+ se añadieron cuando comenzó el cultivo 20 µg/mL de péptido MOG o 5 µg/mL de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (2C11, BD Biosciences). De acuerdo con el método de Kubo et al., (Kubo, T., et al. J. Immunol. 173, 7249-7258 (2. 004)), se evaluó la absorción de [3H]timidina durante 18 horas antes de la finalización del cultivo.

Para la medición de las cantidades de producción de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-17, los esplenocitos antes mencionados se sembraron en una placa de 24 pocillos a 2 x 106 células/pocillo, y se cultivaron en presencia o ausencia de 20 µg/mL de péptido MOG o 5 µg/mL de anticuerpo monoclonal anti-CD3. Se utilizó el líquido sobrenadante del cultivo a las 24 horas del comienzo del cultivo para la medición de IL-2 y se utilizó el líquido sobrenadante de cultivo a las 72 horas desde el comienzo del cultivo para la medición de las otras citoquinas. La medición de las citoquinas se realizó utilizando un kit ELISA (Invitrogen) y de acuerdo con sus instrucciones.

Los resultados se muestran en la Fig. 10, en la que (a) muestra los resultados de la medición de la proliferación celular, (b) muestra los resultados de la medición de IL-2, (c) muestra los resultados de la medición de IFN-γ y (d) muestra los resultados de la medición de IL-17. Cada gráfico muestra el valor medio y el error típico (n = 6 en el grupo al que se le había administrado el anticuerpo de control, n = 5 en el grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa), y “*” y “**” muestran p<0,05 y p<0,01, respectivamente, en la prueba t de Student. Como se deduce de la Fig. 10 (a), la proliferación celular de los esplenocitos obtenidos del ratón del grupo al que se había administrado anticuerpo neutralizante anti-RGMa era significativamente menor que la de los esplenocitos obtenidos a partir del ratón del grupo al que se había administrado el anticuerpo de control, tanto en los casos de estimulación específica del antígeno por péptido MOG como de estimulación no específica por anticuerpo monoclonal anti-CD3. Además, como se deduce de las Figs. 10 (b), (c) y (d), las cantidades de IL-2, IFN-γ e IL-17 secretadas por los esplenocitos obtenidos del ratón del grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa era significativamente menor que las de los esplenocitos obtenidos del ratón del grupo al que se había administrado anticuerpo de control, tanto en los casos de la estimulación específica de antígeno por el péptido MOG como en los de la estimulación no específica por anticuerpo monoclonal anti-CD3. Aunque los datos no se muestran, la cantidad de secreción de IL-4 no se vio influenciada por la administración de anticuerpos neutralizantes anti-RGMa. Estos resultados han aclarado que la administración de anticuerpo neutralizante anti-RGMa a ratón con EAE atenúa notablemente las activaciones de linfocitos T específicas de antígeno y no específicas en ratón con EAE.

[Ejemplo 4: Estudio del efecto del anticuerpo neutralizante anti-RGMa en ratón modelo con esclerosis múltiple recurrente]

(4-1) Preparación del ratón modelo con esclerosis múltiple recurrente

En lugar de MOG, se administró proteína proteolipídica mielínica (en lo sucesivo denominada “PLP”) a ratón SJL/J para preparar un ratón modelo con EAE recurrente. Específicamente, la EAE recurrente se indujo administrando por vía subcutánea una emulsión (200 µL) de 100 µL de PBS que contenía péptido (PLP)139-151 (HSLGKWLGHPDKF (SEQ ID NO: 6), Greiner Bio-one, 100 µg) y 100 µL de adyuvante completo de Freund que contenía bacilos de la tuberculosis muertos (H37Ra, Difco, 500 µg) al costado de un ratón SJL/J (8 a 10 semanas de edad). Además, se

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administraron por vía intravenosa 200 ng de toxina de la tosferina (List Biological Laboratories) después de la administración de PLP y 48 horas después.

(4-2) Observación de síntomas clínicos por administración de anticuerpo neutralizante anti-RGMa a ratón modelo con esclerosis múltiple recurrente

Un anticuerpo neutralizante anti-RGMa producido por los autores de la presente invención (véase el documento no patente 3) o un anticuerpo de control (IgG de conejo, Sigma-Aldrich) se administró intraperitonealmente 400 µg de cada uno los días 25 y 28 después de la administración de PLP. El grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa consistía en 9 ratones con EAE, y el grupo al que se había administrado el anticuerpo de control consistía en 11 ratones con EAE. Los síntomas clínicos de EAE fueron observados desde la administración de PLP (día 0) hasta el día 45, y se evaluaron basándose en los criterios descritos en el Ejemplo 2 antes mencionado.

Los cambios en la puntuación de EAE durante el periodo de observación se muestran en la Fig. 11. La puntuación de EAE se muestra como valor medio y error típico, en donde “*” muestra p<0,05 en la prueba t de Student. Como se deduce de la Fig. 11, la puntuación de EAE del grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizante anti-RGMa después de la administración del anticuerpo fue notablemente menor que la del grupo al que se había administrado el anticuerpo de control. Estos resultados han revelado que la administración del anticuerpo neutralizante anti-RGMa en la última etapa de la primera etapa de expresión de parálisis puede prevenir la recurrencia de EAE.

[Ejemplo 5: Estudio del efecto de la expresión reducida del gen RGMa sobre los síntomas clínicos de la EAE en ratones a los que se ha trasplantado BMDC estimuladas por MOG]

(5-1) Preparación de las BMDC con expresión reducida del gen RGMa

Se adquirió y usó un siRNA (Stealth RNAi (nombre comercial), Invitrogen) de la RGMa de ratón que tenía las secuencias de bases mostradas a continuación. Además, se utilizó como siRNA de control, dsRNA no dirigido (Invitrogen).

Cadena con sentido: 5'-AAAGAGGCCGCAGUGAGUGUAGUUG-3' (SEQ ID NO: 7) Cadena antisentido: 5'-CAACUACACUCACUGCGGCCUCUUU-3' (SEQ ID NO: 8).

Se utilizaron las BMDC el día 7 después del comienzo del cultivo (véase el Ejemplo 1). Se pusieron en suspensión 1 x 106 BMDC en 100 µL de una solución para la introducción de ácidos nucleicos que contenían 500 pmol de siRNA de RGMa de ratón o siRNA de control. La muestra se transfirió a una cubeta y se introdujo siRNA en las células usando Nucleofector (marca registrada) (Lonza) de acuerdo a la explicación de manipulación del fabricante. Después de la introducción de siRNA, las células se cultivaron en medio RPMI1640 al que se había añadido glutamina, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina, 2-ME y 10% de FBS inactivado por calor. La expresión de RGMa en las BMDC introducidas con el siRNA de la RGMa de ratón disminuyó notablemente.

(5-2) Estimulación por MOG y trasplante a un ratón

Las BMDC introducidas con el siRNA de la RGMa de ratón o el siRNA de control se añadieron a 100 µg/mL de péptido (MOG)35-55 y se cultivaron durante 4 -6 horas para permitir la estimulación de antígenos. Las células viables (6 x 105) después de la estimulación se administraron por vía intravenosa a un ratón receptor (C57BL/6). A continuación, se administró por vía subcutánea el adyuvante completo de Freund (200 µL) que contenía bacilos de la tuberculosis muertos (H37Ra, Difco, 500 µg). 48 horas después, se administraron por vía intravenosa 200 ng de toxina de la tosferina (List Biological Laboratories).

(5-3) Observación de los síntomas clínicos de EAE

Se observaron el grupo con siRNA de RGMa (5 ratones) y el grupo con siRNA de control (5 ratones) desde el trasplante de células (día 0) hasta el día 21 y se evaluaron los síntomas clínicos de la EAE basándose en los criterios descritos en el Ejemplo 2 anterior.

Los cambios en las puntuaciones de EAE durante el periodo de observación se muestran en la Fig. 12. Las puntuaciones de EAE se expresan en valores medios y los errores típicos, en donde “*” y “**” muestran p<0,05 y Pp<0,01, respectivamente, en la prueba t de Student. Como se deduce de la Fig. 12, la puntuación de la EAE del grupo con siRNA de la RGMa fue notablemente menor que la del grupo con siRNA de control. Los resultados han aclarado la eficacia de siRNA de RGMa para la profilaxis o el tratamiento de esclerosis múltiple.

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Claims

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