JP6990674B2 - 黄色ブドウ球菌ロイコシジンの細胞毒性に関与する細胞因子：新規治療標的 - Google Patents

黄色ブドウ球菌ロイコシジンの細胞毒性に関与する細胞因子：新規治療標的 Download PDF

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Description

本出願は2013年6月18日付で出願された米国仮特許出願第61/836,516号の恩典を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、黄色ブドウ球菌感染を処置および予防する方法、ならびに黄色ブドウ球菌感染の処置および予防のための新規治療法を特定する方法に関する。
発明の背景
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) (S. aureus)は、人口の25%超に片利共生的に定着する細菌である。血流へのアクセスを得ると、黄色ブドウ球菌は伝播し、広範囲の疾患を引き起こす。黄色ブドウ球菌は、院内感染の主な原因であり、感染性心内膜炎ならびに皮膚および軟組織感染の最も一般的な病原体であり、食中毒の4大原因の1つである。総計で、黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間120万人超の患者に感染しているものと推定される。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、黄色ブドウ球菌感染に対する最後の砦と考えられる抗生物質バンコマイシンに耐性である株を含む、抗生物質耐性株(すなわち、MRSA株)の出現によってさらに強調される。これらの事実は、この重要な病原体に対する新規の治療法を開発する重要性を強調する。
黄色ブドウ球菌がヒト病原体として成功していることには、一つには、細胞外環境へ分泌される病毒性因子の備蓄庫を生み出すことによって宿主の免疫系を武装解除させるこの細菌の能力によるものがある(Foster, T.J.「Immune Evasion by Staphylococci」, Nat. Rev. Microbiol. 3:948-58 (2005)（非特許文献1）)。これらのうちで、二成分性孔形成ロイコトキシンは、感染制御に関与する種々の免疫細胞を標的化して死滅させるため、特に興味深い(Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2:12 (2012)（非特許文献2）; Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013)（非特許文献3）)。ロイコトキシンは、これらの免疫細胞のうち、侵入微生物の貪食死滅化により感染に対する初期障壁として働く、「PMN」としても公知の、多形核細胞を死滅させる(Rigby & DeLeo,「Neutrophils in Innate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections」, Semin. Immunopathol. 34:237-59 (2012)（非特許文献4）)。
各ロイコトキシンは2つのサブユニット「S」型および「F」型から構成されており、これらのサブユニットは協調して標的細胞膜の中に八量体の細孔を形成し(Yamashita et al.,「Crystal Structure of the Octameric Pore of Staphylococcal Gamma-Hemolysin Reveals the Beta-Barrel Pore Formation Mechanism by Two Components」, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 108: 17314-9 (2011)（非特許文献5）)、最終的には細胞死を導く。臨床的に関連する黄色ブドウ球菌株は、最大5種の異なる二成分性ロイコトキシン: パントン-バレンタインロイコシジン(PVLまたはLukFS-PV)、ロイコシジンE/D (LukED)、γ溶血素(HlgABおよびHlgCB)、ならびにロイコシジンA/B (LukAB; LukGHとしても公知)を産生することができる(Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012)（非特許文献2）; Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013)（非特許文献3）)。これらの毒素は各々、ヒトPMNを標的化し死滅させうるが、それらはまた、さらなる白血球に対する指向性を示す(Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013)（非特許文献3）; Gravet et al.,「Characterization of a Novel Structural Member, LukE-LukD, of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family」, FEBS Lett. 436:202-8 (1998)（非特許文献6）; Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003)（非特許文献7）; Perret et al.,「Cross-Talk Between Staphylococcus aureus Leukocidins-Intoxicated Macrophages and Lung Epithelial Cells Triggers Chemokine Secretion in an Inflammasome-Dependent Manner」, Cell. Microbiol. 14: 1019-36 (2012)（非特許文献8）)ことから、黄色ブドウ球菌がロイコトキシンを用いて、身体を感染から防御するのに関与する免疫細胞を枯渇させることが示唆される。白血球に加えて、HlgAB、HlgCBおよびLukEDは、赤血球(RBC)を溶解させることも可能であり(Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003)（非特許文献7）)、このことは、鉄源として用いるためにRBCからヘモグロビンを放出させることにより、インビボでの黄色ブドウ球菌の増殖に寄与しうる(Torres et al.,「Staphylococcus aureus Fur Regulates the Expression of Virulence Factors That Contribute to the Pathogenesis of Pneumonia」, Infect. Immun. 78: 1618-28 (2010)（非特許文献9）)。
黄色ブドウ球菌ロイコトキシンの細胞毒性活性に関する100年を超える調査にもかかわらず、免疫細胞およびRBCに対するロイコトキシンの指向性を左右する細胞受容体は、いまだ不完全にしか定義されていない。
本発明は、当技術分野におけるこれらのおよびその他の制限を克服することに向けられる。
Foster, T.J.「Immune Evasion by Staphylococci」, Nat. Rev. Microbiol. 3:948-58 (2005) Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2:12 (2012) Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013) Rigby & DeLeo,「Neutrophils in Innate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections」, Semin. Immunopathol. 34:237-59 (2012) Yamashita et al.,「Crystal Structure of the Octameric Pore of Staphylococcal Gamma-Hemolysin Reveals the Beta-Barrel Pore Formation Mechanism by Two Components」, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 108: 17314-9 (2011) Gravet et al.,「Characterization of a Novel Structural Member, LukE-LukD, of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family」, FEBS Lett. 436:202-8 (1998) Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003) Perret et al.,「Cross-Talk Between Staphylococcus aureus Leukocidins-Intoxicated Macrophages and Lung Epithelial Cells Triggers Chemokine Secretion in an Inflammasome-Dependent Manner」, Cell. Microbiol. 14: 1019-36 (2012) Torres et al.,「Staphylococcus aureus Fur Regulates the Expression of Virulence Factors That Contribute to the Pathogenesis of Pneumonia」, Infect. Immun. 78: 1618-28 (2010)
本発明の第1の局面は、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階と、選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を処置または予防するのに有効な条件の下で、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階とを伴う。
本発明の別の局面は、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階と、選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ダッフィ抗原ケモカイン受容体(Duffy antigen receptor for chemokines, DARC)との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階とを伴う。
本発明の別の局面は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象からサンプルを得る段階と、サンプル中のCXCR1、CXCR2、DARCまたはそれらの組み合わせの発現レベルを定量化する段階とを伴う。本方法は、定量化された発現レベルに基づいて対象に向けた処置を施す段階をさらに伴う。
本発明の別の局面は、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応するエピトープに結合する、単離されたロイコシジンE (LukE)抗体、またはその抗体結合断片に向けられる。
本発明の別の局面は、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応するエピトープを結合する、単離されたHlgA抗体、またはその抗体結合断片に向けられる。
本発明の別の局面は、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する、単離されたロイコシジンE (LukE)タンパク質またはそのポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物に向けられる。
本発明の別の局面は、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する、単離されたHlgAタンパク質またはそのポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物に向けられる。
黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間120万を超える患者に感染し、米国内で年間約40,000人の死亡を伴う。この細菌は、院内感染および市中感染の主な原因であり、感染性心内膜炎、皮膚、および軟組織感染の最も一般的な病原体であり、かつ食中毒の4大原因の1つである。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)を含む、抗生物質耐性株の出現によってさらに度を増している。これらの事実は、新規の治療法の開発のための新たな標的を特定する重要性を強調する。本発明は、CXCR1、CXCR2、およびDARCが黄色ブドウ球菌病毒性因子ロイコトキシンED (LukED)およびγ溶血素AB (HlgAB)に対するヒト細胞受容体であるという発見に関する。この情報は、黄色ブドウ球菌感染の処置に対してとてつもなく大きな治療的意義を有している。CXCR1/CXCR2はPMNの表面に主に見出され、これは黄色ブドウ球菌感染の制御に関与する最初の応答体である。黄色ブドウ球菌感染の回避におけるPMNの重要性は、PMN機能の遺伝的欠損を持っているヒトが黄色ブドウ球菌感染に対して高度に感受性であるという観察によって最もよく証明されている(Rigby & DeLeo,「Neutrophils in Innate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections」, Semin. Immunopathol. 34:237-59 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。本発明のCXCR1/CXCR2とのLukEDおよびHlgABの相互作用を遮断するための方法および組成物は、これらの細胞のLukEDおよびHlgAB媒介性の死滅を防ぎ、これが今度は、黄色ブドウ球菌感染に対抗する宿主の免疫系の能力を高める。さらに、CXCR1、CXCR2、およびDARCはまた、内皮の表面に見出されるので、内皮細胞のLukED媒介性およびHlgAB媒介性の損傷は、敗血性ショック、つまり敗血症を引き起こす黄色ブドウ球菌血流感染の一般的転帰を引き起こす血管内透過性を促進する可能性が高い。それゆえ、本発明の方法および組成物を用いて内皮細胞に及ぼすLukEDおよびHlgAB媒介性の効果を遮断することは同様に、黄色ブドウ球菌感染の処置および予防を促進する。
[本発明1001]
黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階、ならびに
選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階
を含む、対象において黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法。
[本発明1002]
黄色ブドウ球菌感染がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記組成物が、CXCR1およびCXCR2の両方を阻害する薬剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記薬剤がCXCR1およびCXCR2のタンパク質またはペプチド阻害剤である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記タンパク質またはペプチド阻害剤が、CXCケモカインリガンド8 (CXCL8)に由来し、CXCL8(3-74)K11R/G31P (SEQ ID NO:1)、CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G (SEQ ID NO:2)、およびCXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P (SEQ ID NO:3)からなる群より選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記タンパク質またはペプチド阻害剤が、黄色ブドウ球菌CXCR1/CXCR2受容体結合ドメイン配列を含んだ組み換えペプチドである、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記組み換えペプチドが、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応するアミノ酸配列を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記組み換えペプチドが、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応するアミノ酸配列を含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記薬剤がCXCR1およびCXCR2の小分子阻害剤である、本発明1003の方法。
[本発明1010]
前記小分子阻害剤が、2-ヒドロキシ-N,N,-ジメチル-3-[[2-[[1(R)-(5-メチル-2-フラニル)プロピル]アミノ]-3,4-ジオキソ-1-シクロブテン-1-イル]アミノ]ベンズアミド(SCH-527123)、N-(2-ヒドロキシ-3-ジメチルスルホニルアミド-4-クロロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)-N''-シアノグアニジン(SCH468477)、SCH-479833、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記小分子阻害剤が、R(-)-2-[(4-イソブチルフェニル)プロピオニル]-メタンスルホンアミド(レパリキシン)、R(-)-2-[(4'-トリフルオロメタンスルホニルオキシ)フェニル]プロピオニル-メタンスルホンアミド(メラキシン)、4-[(1R)-2-アミノ-1-メチル-2-オキソエチル]フェニルトリフルオロメタンスルホネート(DF 2162)、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記組成物が、SB-656933、N-(2-ヒドロキシ-3-スルファミル-4-クロロフェニル)-N'-(2,3ジクロロフェニル)尿素(SB-332235)、N-(2-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)尿素(SB 225002)、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるCXCR2阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記組成物が、CXCR1遮断抗体もしくはその抗体結合部分、CXCR2遮断抗体もしくはその抗体結合部分、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記組成物が、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応するアミノ酸配列を含んだ黄色ブドウ球菌ロイコシジンE (LukE)のエピトープに結合する抗体またはその抗体結合部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記組成物が、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応するアミノ酸配列を含んだ黄色ブドウ球菌γ溶血素A (HlgA)のエピトープに結合する抗体またはその抗体結合部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤からなる群より選択される薬剤を、前記組成物と組み合わせて投与する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群より選択される、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置または予防される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記投与段階を繰り返すことをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、本発明1001の方法。
[本発明1022]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、本発明1001の方法。
[本発明1023]
LukEとのCXCR1およびCXCR2の相互作用が阻害される、本発明1001の方法。
[本発明1024]
HlgAとのCXCR1およびCXCR2の相互作用が阻害される、本発明1001の方法。
[本発明1025]
黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階、ならびに
選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ダッフィ抗原ケモカイン受容体(Duffy antigen receptor for chemokines, DARC)との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階
を含む、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法。
[本発明1026]
黄色ブドウ球菌感染がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記組成物がDARC阻害剤を含む、本発明1025の方法。
[本発明1028]
DARC阻害剤がDARC遮断抗体である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤からなる群より選択される薬剤を、前記組成物と組み合わせて投与する段階をさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1030]
皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群より選択される、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置または予防される、本発明1025の方法。
[本発明1031]
前記投与段階を繰り返すことをさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1032]
前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、本発明1025の方法。
[本発明1033]
前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、本発明1025の方法。
[本発明1034]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、本発明1025の方法。
[本発明1035]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、本発明1025の方法。
[本発明1036]
LukEとのDARCの相互作用が阻害される、本発明1025の方法。
[本発明1037]
HlgAとのDARCの相互作用が阻害される、本発明1025の方法。
[本発明1038]
黄色ブドウ球菌感染を有する対象からサンプルを得る段階;
該サンプル中のCXCR1、CXCR2、DARC、またはそれらの組み合わせの発現レベルを定量化する段階; および
該定量化段階に基づいて該対象への処置を施す段階
を含む、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を処置する方法。
[本発明1039]
前記定量化段階が、前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARCタンパク質発現を測定することを含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記定量化段階が、前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、DARC mRNA発現を測定することを含む、本発明1038の方法。
[本発明1041]
前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARCの定量化された発現レベルを、CXCR1、CXCR2、および/またはDARCの参照発現レベルと比較する段階をさらに含み、
該比較段階に基づいて適当な処置が判定される、
本発明1038の方法。
[本発明1042]
SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応するエピトープに結合する、単離されたLukE抗体、またはその抗体結合断片。
[本発明1043]
前記抗体結合断片が、単一の可変VHドメイン、単一の可変VLドメイン、Fab断片、または一本鎖抗体断片を含む、本発明1042の単離された抗体。
[本発明1044]
SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応するエピトープに結合する、単離されたHlgA抗体、またはその抗体結合断片。
[本発明1045]
前記抗体結合断片が、単一の可変VHドメイン、単一の可変VLドメイン、Fab断片、または一本鎖抗体断片を含む、本発明1044の単離された抗体。
[本発明1046]
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチド、および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
[本発明1047]
前記単離されたLukEポリペプチドがSEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号20～263を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、本発明1046の組成物。
[本発明1048]
P184、G186、P187、およびG189からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
前記単離されたLukEタンパク質がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、本発明1047の組成物。
[本発明1050]
前記単離されたLukEタンパク質がSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、本発明1047の組成物。
[本発明1051]
前記単離されたLukEポリペプチドがSEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、本発明1057の組成物。
[本発明1052]
単離されたロイコシジンD (LukD)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含む、本発明1046の組成物。
[本発明1053]
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:12と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離されたLukDタンパク質を含む、本発明1052の組成物。
[本発明1054]
SEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号20～281を含む単離されたLukDポリペプチドを含む、本発明1052の組成物。
[本発明1055]
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたHlgAタンパク質またはそのポリペプチド、および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
[本発明1056]
前記単離されたHlgAタンパク質がSEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号20～258を含み、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
P182、G184、およびP185からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、本発明1056の組成物。
[本発明1058]
前記単離されたHlgAタンパク質がSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む、本発明1056の組成物。
[本発明1059]
前記単離されたHlgAタンパク質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、またはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、本発明1056の組成物。
[本発明1060]
単離されたγ溶血素B (HlgB)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含む、本発明1055の組成物。
[本発明1061]
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:16と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離されたHlgBタンパク質を含む、本発明1060の組成物。
[本発明1062]
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染を有する対象またはHIV感染を有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象においてHIVを予防または処置するのに有効な条件の下で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象においてHIV感染を予防または処置する方法。
[本発明1063]
単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチドおよび単離されたLukDタンパク質またはそのポリペプチドを含む組成物と組み合わせて、HIVの処置において有用な1つまたは複数の抗ウイルス剤または他の薬剤を投与する段階
をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
抗ウイルス剤が、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される、本発明1063の方法。
[本発明1065]
抗ウイルス剤が、ジドブジン、ラミブジン、ザルシタビン、ジダノシン、スタブジン、アバカビル、アデホビルジピボキシル、ロブカビル、BC H-10652、エミトリシタビン、ベータ-L-FD4、DAPD、ロデノシン、ネビラピン、デラビリジン、エファビレンツ、PNU-142721、AG-1549、MKC-442、(+)-カラノライドAおよびB、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、ラシナビル、DMP-450、BMS-2322623、ABT-378、アンプレナビル、ヒドロキシウレア、リバビリン、IL-2、IL-12、ペンタフシド、Yissum番号1 1607、ならびにAG-1549からなる群より選択される、本発明1063の方法。
[本発明1066]
滑沢剤、抗菌剤、湿潤剤、乳化剤、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる薬剤をさらに含む、本発明1046、本発明1052、本発明1055、または本発明1060の組成物。
[本発明1067]
セチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたは白ろう、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される滑沢剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1068]
プロピレングリコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される抗菌剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1069]
ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エデト酸二ナトリウム、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される抗酸化物質を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1070]
エチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物からなる群より選択される湿潤剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1071]
カルボマー、ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-ステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ステアリン酸ジグリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラノリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、メチルセルロース、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ソルビタンエステル、ステアリン酸、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される乳化剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1072]
局所投与用に製剤化されている、本発明1066の組成物。
[本発明1073]
膣投与および/または直腸投与用に製剤化されている、本発明1066の組成物。
[本発明1074]
含嗽液として製剤化されている、本発明1066の組成物。
[本発明1075]
HIV感染に曝露される危険性がある対象を選択する段階;
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチドを含む、本発明1046、本発明1052、または本発明1066の組成物を提供する段階; および
組織における細胞のHIV感染性を阻害するのに有効な条件の下で対象の組織を組成物と接触させ、それにより対象においてHIV感染を予防する段階
を含む、対象においてHIV感染を予防する方法。
[本発明1076]
炎症状態を有する対象を選択する段階、および
選択した対象に、炎症状態を処置するのに有効な条件の下で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象において炎症状態を処置する方法。
[本発明1077]
炎症状態が急性炎症状態である、本発明1076の方法。
[本発明1078]
急性炎症状態が限局性である、本発明1077の方法。
[本発明1079]
急性炎症状態が皮膚または軟組織における感染創傷である、本発明1077の方法。
[本発明1080]
炎症状態が、関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、I型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変症、炎症性腸疾患、結核症、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、アレルギー性接触皮膚炎、急性過敏症、ならびに急性神経炎症性傷害からなる群より選択される、本発明1076の方法。
[本発明1081]
移植片対宿主病(GVHD)を有する対象またはGVHDを有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象において移植片対宿主病(GVHD)を予防または処置するのに有効な量で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象においてGVHDを予防または処置する方法。
[本発明1082]
がんを有する対象またはがんを有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象においてがんを予防または処置するのに有効な量で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象においてがんを予防または処置する方法。
[本発明1083]
がんが、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、および肺がんからなる群より選択される、本発明1082の方法。
[本発明1084]
がんが転移がんである、本発明1082の方法。
図1A～1Gは、LukEDがCXCR1およびCXCR2を標的化して、単球およびPMNを死滅させることを実証する。図1Aでは、Δ32Ccr5ドナーから単離された末梢血単核細胞(PBMC)をPBSまたはLukED (75 nM)とともにインキュベートし、CD14およびCD3陽性についてゲーティングした。図1Bは、LukE、LukDまたはLukED (75 nM)の存在下においてCcr5+またはΔ32Ccr5ドナーから単離された初代ヒト好中球(PMN)の生存性を示す。図1Cは、同質遺伝子黄色ブドウ球菌WT (N = 14)、ΔlukED (N = 15)またはΔlukED::lukED (N = 15)株を全身感染させたCcr5+/+マウス、および黄色ブドウ球菌WT (N = 10)またはΔlukED (N = 11)を全身感染させたCcr5-/-マウスの肝臓由来の細菌負荷(CFU)を示す。図1Dは、表示したケモカイン受容体をトランスフェクションし、LukEDまたはLukSF-PV (600 nM)とともにインキュベートしたHEK293T細胞の生存性を示すグラフである。図1E～1Fは、フローサイトメトリーによって判定されたPMN (図1E)または単球(図1F)表面のCXCR1およびCXCR2レベルを示す。図1Gは、LukEDで処理した非標的またはCxcr2 shRNA形質導入THP-1細胞の生存性を示す。一元配置分散分析により＊P < 0.05 (図1C)。平均±標準誤差を示す(n = 3)。 マラビロク(MVC)がLukED媒介性の死から単球を防御しないことを示す。PBS (毒素なし)、LukED (75 nM)またはLukED (75 nM)に加えてMVC (100 ng/mL)で処理したCCR5+ゲーティングPBMCに存在するCD14+およびCD3+細胞。 LukEDがCCR5、CXCR1、CXCR2、およびDARCを標的化して、宿主細胞を死滅させることを実証する。HEK293T細胞に、空のプラスミド(pcDNA)をトランスフェクションし、または表示したケモカイン受容体をコードするcDNAを含んだプラスミドをトランスフェクションした。細胞を次いで、1時間LukEDに曝露し、毒素媒介性の細孔を臭化エチジウム透過性によって測定した。 図4A～4Bは、HlgABがCXCR1、CXCR2、およびDARCを用いて、哺乳類細胞を標的化して死滅させることを示す。HEK293T細胞に、表示したケモカイン受容体をコードするcDNAを含んだプラスミドをトランスフェクションした。細胞を次いで、表示のように20μg/mlのHlgAB (図4A)またはHlgCB (図4B)に曝露し、毒素媒介性の細孔を臭化エチジウム透過性によって測定した。 図5A～5Cは、一過性にトランスフェクションされたHEK293TおよびTHP-1細胞上のいくつかの試験ケモカイン受容体の表面レベルを示す。図5Aは、フローサイトメトリーによって評価した場合の、一過性にトランスフェクションされたHEK293T細胞上のCCR5、CXCR1、CXCR2、およびCXCR4の表面レベルを示す。図5Bは、フローサイトメトリーによって評価した場合の、THP-1細胞上のCXCR1およびCXCR2表面レベルを示す。図5Cは、フローサイトメトリーによって判定した場合の、Cxcr2 shRNA形質導入THP-1細胞上のCXCR2レベルを示す。 図6A～6Eは、LukEDがCXCR1およびCXCR2へのLukEの結合を介してPMNを標的化することを実証する。図6Aは、フローサイトメトリーによって評価したPMNの表面へのGFP-LukEまたはGFP-LukDの結合を示す。図6Bは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、非標識LukEまたはLukS-PVの存在下におけるPMNへのGFP-LukE (300 nM)の結合を示す。図6Cは、CXCL8またはCXCL1の存在下において致死量のLukED (75 nM)で攻撃されたPMNの生存性を示す。図6Dは、CXCL8の存在下におけるPMNの表面へのGFP-LukE (300 nM)の結合を示す。図6Eは、HAタグ付CXCR1またはCXCR2を含んだ細胞溶解物とのHis-LukEまたはHis-LukDの相互作用を示す免疫ブロットである。免疫ブロットは少なくとも3回の独立した実験を代表するものである。平均±標準誤差を示す(n = 3)。 LukEはPMNでのカルシウムシグナル伝達を活性化しないことを示す。グラフは、フローサイトメトリーによって測定された、LukE (300 nM)、CXCL8 (0.3 nM)またはCXCL1 (0.3 nM)添加時のPMNでのカルシウム動員を示す。 LukE（SEQ ID NO: 4）およびLukS-PV（SEQ ID NO: 57）のアミノ酸配列アライメントである。このアライメントから形成された大多数（majority）配列はSEQ ID NO: 58として示されている。保存されたアミノ酸は赤色で描かれている(非保存アミノ酸残基はXで表示されている)。Rimドメイン多様性領域(「DR」)は次のように表示されている: DR1 (黄色の囲み)、DR2 (灰色の囲み)、DR3 (橙色の囲み)、DR4 (青色の囲み)およびDR5 (赤色の囲み)。アライメントは、ClustalW法を用いDNASTAR MegAlignソフトウェアで作出された。 図9A～9Hは、多様性領域4におけるLukEアミノ酸残基番号182～196は、CXCR1およびCXCR2+細胞のLukED標的化に必要とされることを実証する。図9Aは、LukEおよびLukS-PVの構造は、高度に多様性の残基を暗い青色で着色し、同一の残基を赤色で着色し、保存的置換が中間色を有している色の傾斜によって示されるように、rimドメイン表面が主に異なることを示す。図9Bは、DR 1～5アミノ酸が以下: DR1 (黄色, 57～75)、DR2 (灰色, 139～150)、DR3 (橙色, 164～178)、DR4 (青色, 182～196)およびDR5 (赤色, 237～271)のように強調されているLukE (3ROH, 明るい青色)およびLukS (1T5R, 薄緑色)の構造アライメントである。図9Cは、WTおよびLukEDRハイブリッド(DR 1～5, 300 nM)で処理されたPMNの生存性を示す。挿入図は、精製されたLukEDRハイブリッドのクマシーブルー染色ゲルである。図9Dは、表示した毒素(300 nM)で処理されたCCR5+細胞の生存性を示す。図9Eは、フローサイトメトリーによって判定した場合の、非標識LukEまたはLukEDR4の存在下におけるGFP-LukE (300 nM)の結合を示す。図9Fは、スティックとして示されたLukEとLukS-PVとの間で異なる残基を有するLukEDR4 (青色)構造を描く。図9Gおよび9Hのグラフは、表示した黄色ブドウ球菌株による感染多重度10でのPMN (図9G)またはHUT-R5 (図9H)のエクスビボ感染を示す。一元配置分散分析により＊ P < 0.05; ＊＊P ≦ 0.0001 (d, g)。平均±標準誤差を示す(n = 3)。 LukEDおよびLukEDR4Dのエクスビボおよびインビボ効果を示す。毒素なし(PBS)、LukEDまたはLukEDR4Dによる処理に対するPBMC対象の感受性をフローサイトメトリーによって評価した。 図11A～11Bは、異なる黄色ブドウ球菌株のタンパク質分析を示す。図11Aの上部免疫ブロットは、lukEDまたはlukEDR4Dをコードするプラスミドで補完した無毒素黄色ブドウ球菌株の細胞外タンパク質プロファイルを示す。図11A下部の2つの免疫ブロットは、LukD、LukE、LukEDR4のレベル、およびLukE構築体上のHisタグの存在を評価するものである。図11Bは、免疫ブロットによって評価した場合の、黄色ブドウ球菌ΔlukED組み込み株またはlukEDもしくはlukEDR4Dをコードするプラスミドで補完された菌株でのLukE、LukEDR4、およびLukDレベルを示す。陰性対照として、lukEDおよびhlgACBを欠く菌株(ΔlukED ΔhlgACB)を用いた。lukEDR4Dによって産生されたLukEDR4レベルは、lukEDによって産生されたLukEレベルと比べて低減されたように思われる。しかし、同等のレベルのLukEおよびLukEDR4が図11Aの免疫ブロットに対するクマシーブルーゲル染色により観察されることから、見掛け上のタンパク質レベルの低減がLukEと比べてLukEDR4の準最適な抗体認識によるものであることが示唆される。 図12A～12Cは、LukED媒介性のCXCR1+およびCXCR2+細胞死滅化がマウス全身感染モデルにおいて黄色ブドウ球菌の病原性に寄与することを示す。図12Aは、PBS (毒素なし)、LukED、またはLukEDR4D (300 nM)の存在下における腹膜誘発マウスPMN (CXCR2+)またはマクロファージ(CCR5+)の生存性を示す。FACSプロットは処置あたりマウス3匹のうちの1匹(図12A)を代表するものである。 図12A～12Cは、LukED媒介性のCXCR1+およびCXCR2+細胞死滅化がマウス全身感染モデルにおいて黄色ブドウ球菌の病原性に寄与することを示す。図12Bは、同質遺伝子黄色ブドウ球菌ΔlukED、ΔlukED::lukEDまたはΔlukED::lukEDR4D株を全身感染させたマウスの肝臓(上パネル)および腎臓(下パネル)から単離されたマウスPMNにおける細胞死を示す。FACSプロットは株あたり感染マウス10匹のうちの1匹(図12B)を代表するものである。 図12A～12Cは、LukED媒介性のCXCR1+およびCXCR2+細胞死滅化がマウス全身感染モデルにおいて黄色ブドウ球菌の病原性に寄与することを示す。図12Cは、同質遺伝子黄色ブドウ球菌ΔlukED (n = 10)、ΔlukED::lukED (+lukED, n = 16)またはΔlukED::lukEDR4D (+lukEDR4D, n = 16)株を感染させたマウスの「生存」を示す。一元配置分散分析(マンテル・コックス検定)によるΔlukED v+lukED, ＊＊＊＊p < 0.0001; ΔlukED v+lukEDR4D, p = 0.0577; +lukED v +lukEDR4D, ＊＊＊p < 0.0003の統計分析(図12C)。 図13A～13Bは、LukEDおよびLukEDR4Dのエクスビボおよびインビボ効果を示す。図13Aは、PBS (毒素なし)、LukEDまたはLukEDR4Dによる処置時のマウスPECから単離されたPMNまたはマクロファージの生存性を示す。図13Bは、同質遺伝子黄色ブドウ球菌ΔlukED、ΔlukED::lukEDまたはΔlukED::lukEDR4Dを感染させたマウスの肝臓または腎臓から単離されたPMNの生存性を示す。 多様性領域4におけるHlgAアミノ酸残基番号180～192は、ヒト好中球(hPMN)、CXCR1/CXCR2+細胞のHlgAB標的化に必要とされることを実証する。この図は、WTおよびHlgADRハイブリッド毒素で処理されたhPMNの生存性を示す。細胞生存性をCellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)でモニタリングした。結果は、異なるヒトドナー(n = 8)由来の平均および標準誤差を表す。 図15A～15Bは、DR4ドメイン内のLukEのアミノ酸P184、G186、P187、およびG189が、CXCR1およびCXCR2+細胞のLukED標的化に必要とされ、マウスにおいて観察されるLukEDの致死性に必要とされることを実証する。図15Aは、WT LukED (LukE/LukD)またはLukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素で処理されたhPMNの生存性を示す。結果は、異なるヒトドナー(n = 8)由来の平均および標準誤差を表す。図15Bは、LukD 10μgとの組み合わせでの各LukE変種10μgの血流投与時のマウスの「生存」を示す。マウス(n = 5)を、表示した毒素を含有する静脈内注射液で処置し、死亡までの時間を記録し、カプラン・マイヤー生存プロットとして提示した。 図16A～16Dは、LukED媒介性のヒト赤血球(RBC)溶解がDARCの存在に関連していること、ならびにLukED媒介性のRBC溶解が精製DARCおよび抗DARC抗体で遮断されうることを実証する。図16Aは、独立した9人のヒトドナーから単離されたRBCの感受性を示す。図16Bは、ドナーをDARC+およびDARC-に分類した図16Aに提示されたデータを描く。結果は、異なるヒトドナー(DARC+の場合n = 5およびDARC-の場合n = 4)由来の平均および標準誤差を表す。図16Cは、LukED媒介性のRBC溶解が漸増濃度の精製DARCによって阻害されることを示す。結果は、異なるヒトドナー(n = 3)由来の平均および標準誤差を表す。図16Dは、LukED媒介性のRBC溶解がマウスIgG2A抗DARCモノクローナル抗体(クローン番号358307)で阻害されることを示す。結果は、異なるヒトドナー(n = 3)由来の平均および標準誤差を表す。統計的有意性はスチューデントのt検定によって判定された。
発明の詳細な説明
本発明の第1の局面は、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階と、選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する(すなわち、LukEおよび/またはHlgAとのCXCR1/CXCR2の相互作用を阻害することにより)組成物を投与する段階とを伴う。
現在まで、黄色ブドウ球菌感染の大部分はMRSAに起因している(Moran et al.,「Methicillin-Resistant S. aureus Infections Among Patients in the Emergency Department」, The New England Journal of Medicine 355:666-674 (2006)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。以前は、MRSA感染の大部分は、院内起源のもの(HA-MRSA)であると考えられていたが、現在では、感染は医療施設との接触がなかった、その他の点では健常な個体、すなわち、市中関連MRSA (CA-MRSA)で起きている(Klevens et al.,「Invasive Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections in the United States」, Jama 298: 1763-1771 (2007)およびKlevens et al.,「Changes in the Epidemiology of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Intensive Care Units in US Hospitals, 1992-2003」, Clin. Infect. Dis. 42:389-391 (2006)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらのCA-MRSA関連の感染はHA-MRSA感染と比べて、より重篤であり、より高い死亡率を引き起こす(Deleo et al.,「Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus」 Lancet 375: 1557-1568 (2010)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。近年の報告から、CA-MRSA感染と関連付けられる株の病毒性増加が、HA-MRSA感染と関連付けられるものと比べて、好中球(PMN)媒介性の死滅化を回避するCA-MRSA関連株の能力の増強に主に起因することが示唆された(Voyich et al.,「Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils」, J. Immunol. 175:3907-3919 (2005); Wang et al.,「Identification of Novel Cytolytic Peptides as Key Virulence Determinants for Community-Associated MRSA」, Nat. Med. 13: 1510-1514 (2007); Li et al.,「Evolution of Virulence in Epidemic Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus」, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:5883-5888 (2009); Dumont et al.,「Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis」, Mol. Microbiol. 79:814-825 (2011); およびAlonzo III et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。黄色ブドウ球菌は、細胞毒素および細胞溶解ペプチドの一群でPMNを標的化して死滅させることによりPMN媒介性の死滅化を回避する(Wang et al.,「Identification of Novel Cytolytic Peptides as Key Virulence Determinants for Community-Associated MRSA」, Nat. Med. 13: 1510-1514 (2007); Dumont et al.,「Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis」, Mol. Microbiol. 79:814-825 (2011); Alonzo III et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); Loffler et al.,「Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils」, PLoS Pathog. 6:e1000715 (2010); およびVentura et al.,「Identification of a Novel Staphylococcus aureus Two-Component Leukotoxin Using Cell Surface Proteomics」, PLoS One 5:e11634 (2010)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。臨床的に関連する黄色ブドウ球菌株は、最大5種の異なる二成分性ロイコトキシン: パントン-バレンタインロイコシジン(PVLまたはLukFS-PV)、ロイコシジンE/D (LukED)、γ溶血素(HlgABおよびHlgCB)、ならびにロイコシジンA/B (LukAB; LukGHとしても公知)を産生することができる(Vandenesch et al,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012)、およびAlonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:el003143 (2013)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの毒素は各々、ヒトPMNを標的化して死滅させうるが、それらはまた、さらなる白血球に対する指向性を示す(Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013); Gravet et al.,「Characterization of a Novel Structural Member, LukE-LukD, of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family」, FEBS Lett. 436:202-8 (1998); Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003); およびPerret et al.,「Cross-Talk Between Staphylococcus aureus Leukocidins-Intoxicated Macrophages and Lung Epithelial Cells Triggers Chemokine Secretion in an Inflammasome-Dependent Manner」, Cell. Microbiol. 14: 1019-36 (2012)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)ことから、黄色ブドウ球菌がロイコトキシンを用いて、身体を感染から防御するのに関与する免疫細胞を枯渇させることが示唆される。白血球に加えて、HlgAB、HlgCBおよびLukEDも赤血球(RBC)を溶解させることが可能であり(Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、このことは、鉄源として用いるためにRBCからヘモグロビンを放出させることによってインビボでの黄色ブドウ球菌の増殖に寄与しうる(Torres et al.,「Staphylococcus aureus Fur Regulates the Expression of Virulence Factors That Contribute to the Pathogenesis of Pneumonia」, Infect. Immun. 78: 1618-28 (2010)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
毎年MRSAにかかる個体が多数であることを考慮すると、これらの感染のうちの相当な割合のものが、伝統的な抗生物質の処置過程に対して不応性となる可能性が高い。そのような感染を処置するための革新的な手法は、黄色ブドウ球菌感染に対する防御に関与する最も重要な先天性免疫細胞PMNを死滅させ、かつ細菌増殖にとって重要な栄養素を提供する、赤血球(RBC)を溶解させる、LukEDおよびHlgABのような、黄色ブドウ球菌病毒性因子を阻害することである。本明細書において記述されるように、本出願人らは、ヒトPMN上のLukEDおよびHlgABに対する細胞受容体として、それぞれ、インターロイキン8受容体αおよびβ鎖としても知られる、CXCR1およびCXCR2を特定した。さらに、本出願人らは、ヒトRBC上のLukEDおよびHlgABに対する細胞受容体としてダッフィ抗原ケモカイン受容体(DARC)を特定した。これらの細胞受容体へのLukEDおよびHlgABの結合が、ロイコトキシンオリゴマー化および孔形成に至り、細胞死に至る。それゆえ、CXCR1/CXCR2および/またはDARCとの黄色ブドウ球菌LukEDおよびHlgABの相互作用を阻害する薬剤および組成物は、黄色ブドウ球菌の細胞毒性を遮断するのに、さらにはPMNの枯渇を防ぐのにおよび先天性免疫系によって黄色ブドウ球菌の自然排除を促進するのに臨床的に有用である。
本発明のこの局面によれば、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害するのに適した組成物には、CXCR1およびCXCR2の両方を阻害する薬剤(CXCR1/CXCR2阻害剤またはアンタゴニストといわれる)が含まれる。CXCR1およびCXCR2の両方を阻害する適当な薬剤には、当技術分野において周知であり、以下にさらに詳細に記述される阻害剤タンパク質およびペプチド、抗体、ならびに小分子が含まれる。
CXCR1/CXCR2の適当なペプチド阻害剤には、参照により全体が本明細書に組み入れられるLi et al.,「CXCL8(3-74)K11R/G31P Antagonizes Ligand Binding to the Neutrophil CXCR1 and CXCR2 Receptors and Cellular Responses to CXCL8/IL-8」, Biochem. Biophys. Res. Comm. 293(3): 939-944 (2002); Gordonの米国特許第8,039,429号、およびGordonらの米国特許第7,201,895号によって記述されるようにCXCR1およびCXCR2受容体リガンド、CXCケモカインリガンド8 (CXCL8; インターロイキン8としても知られる)に由来するものが含まれる。CXCL8に由来する例示的なペプチド阻害剤としては、非限定的に、以下に示されるようにSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するCXCL8(3～74)K11R/G31Pが挙げられる。
Figure 0006990674000001
SEQ ID NO:2(以下に示される)のアミノ酸配列を有するCXCL8(3～74) K11R/G31P/P32GおよびSEQ ID NO:3(以下に示される)のアミノ酸配列を有するCXCL8(3～74) K11R/T12S/H13F/G31Pのような、CXCL8(3～74) K11R/G31Pの類似体も、本発明の方法で用いるのに適している。
SEQ ID NO:2; CXCL8(3～74) K11R/G31P/P32G
Figure 0006990674000002
SEQ ID NO:3; CXCL8(3～74) K11R/T12S/H13F/G31P
Figure 0006990674000003
参照により全体が本明細書に組み入れられるGordonの米国特許第8,039,429号およびGordonらの米国特許第7,201,895号に記述されているCXCR1/CXCR2の阻害剤と同様に機能する他のCXCL8由来ペプチドも、本発明のこの局面によって用いるのに適している。
CXCR1/CXCR2の他の適当なペプチド阻害剤には、黄色ブドウ球菌CXCR1/CXCR2受容体結合ドメイン配列を含んだ組み換えペプチドが含まれる。本明細書において記述されるように、本出願人らは、CXCR1およびCXCR2に結合する黄色ブドウ球菌LukEおよびHlgA毒素の領域を特定した。その結果として、これらのアミノ酸残基を含むペプチドは、適当なCXCR1/CXCR2阻害ペプチドを構成する。それゆえ、本発明の1つの態様において、CXCR1/CXCR2の適当なペプチド阻害剤は、可溶性LukEタンパク質(黄色ブドウ球菌Newman株; SEQ ID NO:4、下記)のアミノ酸残基番号182～196に対応するアミノ酸配列を含む。
Figure 0006990674000004
QSPNGPTGSAREYFA (SEQ ID NO:5; すなわち、SEQ ID NO:4の残基番号182～196)のアミノ酸配列を少なくとも含んだCXCR1/CXCR2ペプチド阻害剤は、CXCR1またはCXCR2に結合するその能力を変化させないが、しかし阻害ペプチドの安定性または標的送達を増強するように機能するさらなるアミノ酸残基をそのN末端またはC末端に含みうる。
本発明の別の態様において、CXCR1/CXCR2の適当なペプチド阻害剤は、可溶性HlgAタンパク質(黄色ブドウ球菌Newman株; SEQ ID NO:6、下記)のアミノ酸残基番号180～192に対応するアミノ酸配列を含む。
Figure 0006990674000005
QDPTGPAARDYFV (SEQ ID NO:7; すなわち、SEQ ID NO:6の残基番号180～192)のアミノ酸配列を少なくとも含んだCXCR1/CXCR2ペプチド阻害剤は、CXCR1またはCXCR2に結合するその能力を変化させないが、しかし阻害ペプチドの安定性または標的送達を増強するように機能するさらなるアミノ酸残基をそのN末端またはC末端に含みうる。
本発明の方法で用いるのに適した組成物はあるいは、CXCR1およびCXCR2の両方を阻害する小分子を含んでもよい。CXCR1/CXCR2の多数の小分子阻害剤またはアンタゴニストが、当技術分野において公知であり、本発明の方法で用いるのに適している。
本発明の方法で用いるのに適した第1のクラスの例示的な小分子CXCR1/CXCR2阻害剤には、フェニル基の4位に4-スルホニルアミノ置換基を持つ(2R)-2-フェニルプロパンアミドが含まれる(Allegrettiら(Dompe S.P.A.)の米国特許第7,652,169号および同第7,868,046号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。このクラスの化合物は以下の式Iの一般式を有する:
Figure 0006990674000006
式中で
式IのRは、
H、OH、C1～C5アルキル、C3～C6シクロアルキル、C2～C5アルケニル、C1～C5アルコキシおよびフェニル;
置換および非置換ピロール、チオフェン、フラン、インドール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、ピリジンおよびピリミジンより選択されるヘテロアリール基;
R''がHもしくはC1～C5アルキルであり、nが0～2の整数である、式-CH2CH2O-(CH2-CH2O)nR''の残部
より選択され;
または式IのRは、カップリングされるNH基とともに、(2S)-2-アミノプロパンアミド、(2S)-2-アミノ-3-フェニルプロパンアミド、(2S)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミド、(2S)-2-アミノ-3-カルボキシプロパンアミド、(2S)-2,6-ジアミノエキサナミド(diaminoexanamide)のような天然アミノ酸の第1級アミドのラジカル基である。上記のNH基は、天然アミノ酸の第1級アミドのラジカル基の一部として、天然アミノ酸のアミノ基を表す。
式IのR'は、
直鎖もしくは分枝C1～C5アルキル、C3～C6シクロアルキル、C2～C5アルケニルおよびトリフルオロメチル;
置換もしくは非置換フェニル;
置換もしくは非置換ベンジル;
置換および非置換ピリジン、ピリミジン、ピロール、チオフェン、フラン、インドール、チアゾールおよびオキサゾールより選択されるヘテロアリール基
より選択される。
本発明の方法で用いるのに適した例示的な(2R)-2-フェニルプロパンアミド化合物としては、非限定的に、(2R)-2-{4-[(イソプロピルスルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-{4[(イソプロピルスルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミドナトリウム塩; (2R)-2-{4-{[(2-クロロフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-{4-{[(2,6-ジクロロフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-{4-[(メチルスルホニル)アミノ]フェニル}プロパンアミド; (2R)-2-{4-[(フェニルスルホニル)アミノ]フェニル}プロパンアミド; (2R)-2-{4-{[(4-メチルフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-{4-{[(4-メトキシルフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-(4-[(ベンジルスルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-(4-{[(4-クロロフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-(4-{[(4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル}アミノ)フェニル]プロパンアミド; (2R)-2-{4-[(チエン-2イルスルホニル)アミノ]フェニル}プロパンアミド; (2R)-2-{4-[(シクロフェニルスルホニル)アミノ]フェニル}プロパンアミド; (2R)-2-(4-{[(トリフルオロメチル)スルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-{4-[(イソプロピルスルホニル]アミノ}フェニル)-N-メチルプロパンアミド; (2R)-N-[(1S)-2-アミノ-1-メチル-2-オキソエチル]-2-{4-[(イソプロピルスルホニル]アミノ}フェニル)プロパンアミド; (2R)-2-{4-[(イソプロピルスルホニル]アミノ}フェニル)-N-[4-(トリフルオロメチル)-1,3-チアゾール-2-イル]プロパンアミド; (2R)-2-{4-{[(2-クロロフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)-N-[4-(トリフルオロメチル)-1,3-チアゾール-2-イル]プロパンアミド; (2R)-2-{4-{[(2-クロロフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)-N-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチル]プロパンアミド; (2R)-2-{4-{[(2-クロロフェニル)スルホニル]アミノ}フェニル)-N-シクロプロピルプロパンアミドが挙げられる。
本発明の方法で用いるのに適した別のクラスの例示的な小分子CXCR1/CXCR2阻害剤には、以下に示されるように式IIの一般式を有する、参照により全体が本明細書に組み入れられるPiemontiら(Dompe S.P.A)の米国特許出願公開第20120202884号に記述されているものが含まれる:
Figure 0006990674000007
式中で式IIのRが、直鎖または分枝4-(C1～C6)アルキル、4-トリフルオロメタンスルホニルオキシまたは3-ベンゾイルより選択され、かつ式IIのR1が直鎖または分枝(C1～C6)アルキルである。
本発明の方法で用いるのに適した式IIの例示的な化合物には、非限定的に、R(-)-2-[(4-イソブチルフェニル)プロピオニル]-メタンスルホンアミド(レペルタキシンまたはレパリキシンとしても知られる)、R(-)-2-[(4'-トリフルオロメタンスルホニルオキシ)フェニル]プロピオニル-メタンスルホンアミド(メラキシンとしても知られる)が含まれる。
本発明の方法で用いるのに適した別のクラスの例示的な小分子CXCR1/CXCR2阻害剤には、参照により全体が本明細書に組み入れられるBertini et al.「Noncompetitive Allosteric Inhibitors of the Inflammatory Chemokine Receptors CXCR1 and CXCR2: Prevention of Reperfusion Injury」, Proc Natl Acad Sci USA. 101: 11791-11796 (2004); Bizzarri et al.,「ELR+ CXC Chemokines and Their Receptors (CXC Chemokine Receptor 1 and CXC Chemokine Receptor 2) as New Therapeutic Targets」, Pharmacol Ther. 112: 139-149 (2006); およびSouza et al.,「Repertaxin, A Novel Inhibitor of Rat CXCR2 Function, Inhibits Inflammatory Responses that Follow Intestinal Ischaemia and Reperfusion Injury」, Br J Pharmacol. 143: 132-142 (2004)によって記述されているように2-アリールフェニルプロピオン酸の誘導体が含まれる。このクラスのCXCR1/CXCR2阻害剤における例示的な化合物には、以下の式IIIの構造を有する4-[(1R)-2-アミノ-1-メチル-2-オキソエチル]フェニルトリフルオロメタンスルホネート(DF 2162)およびその誘導体が含まれる。
Figure 0006990674000008
別のクラスの例示的な小分子CXCR1/CXCR2阻害剤には、以下に示されるように式IVおよびVの式を有する、参照により全体が本明細書に組み入れられるMaedaら(Syntrix Biosystems)の米国特許出願公開第2010/0210593号に開示されているピリジンおよびピリミジンカルボキサミド化合物が含まれる:
Figure 0006990674000009
式中で式IVおよびVのR1およびR2が、水素、2-もしくは3-もしくは4-ハロ-フェニル、ヘテロアルキル、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキルからなる群より独立して選択され;
式中で式IVおよびVのR3が-B(R4R5)、-R6-B(R4R5)、R6、-C(O)-R6、-O-R6、-S(O)y-R6 (式中でy=0、1、もしくは2)、-P(O)-(R4R5)および-N(R7R8)より選択され;
式中で式IVおよびVのR6がアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルより選択され;
式中で式IVおよびVのR4およびR5が独立して水素、ヒドロキシル、アリールオキシ、もしくはアルコキシであり、または式中でR4およびR5がともに、環状エステル、もしくは酸無水物(混合酸無水物もしくは対称酸無水物のどちらか)を形成し;
式中で式IVおよびVのR7およびR8が、水素、アルキル、ハロアルキル、アリール、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルより独立して選択され; R7およびR8が両方とも酸素であってニトロ基を形成し; またはR7およびR8は、それらが付着される窒素とともに、ヘテロシクリルを形成し; ならびに
式中で式IVおよびVのX1が炭素もしくは窒素であり; 式IVおよびVのX2が-S(O)y- (式中でy=0、1、もしくは2)、窒素、もしくは酸素であり; かつ式IVおよびVのnが0～8の整数である。
他の周知の小分子CXCR1/CXCR2阻害剤には、非限定的に、2-ヒドロキシ-N,N,-ジメチル-3-[[2-[[1(R)-(5-メチル-2-フラニル)プロピル]アミノ]-3,4-ジオキソ-1-シクロブテン-1-イル]アミノ]ベンズアミド(SCH-527123) (Kouらの米国特許第8,183,287号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、N-(2-ヒドロキシ-3-ジメチルスルホニルアミド-4-クロロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)-N''-シアノグアニジン(SCH468477)、SCH-479833、およびそれらの誘導体(Singh et al.,「Small-Molecule Antagonists for CXCR2 and CXCR1 Inhibit Human Melanoma Growth by Decreasing Tumor Cell Proliferation, Survival, and Angiogenesis」, Clin. Cancer Res. 15: 2380 (2009)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)が含まれる。本発明で用いるのに適しているさらなる小分子CXCR1/CXCR2阻害剤には、参照により全体が本明細書に組み入れられる、Chaoらの米国特許第7,326,729号に記述されているものが含まれる。
本発明のこの局面の別の態様において、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害するのに適した組成物には、CXCR1を阻害する薬剤およびCXCR2を阻害する薬剤が含まれる。適当なCXCR2阻害剤には、非限定的に、N-(2-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)尿素(SB 225002) (White et al.,「Identification of a Potent, Selective Non-Peptide CXCR2 Antagonists That Inhibits Interleukin-8-Induced Neutrophil Migration」, J. Biol. Chem. 273: 10095-10098 (1998)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、N-(3-(アミノスルホニル)-4-クロロ-2-ヒドロキシフェニル)-N'-(2,3-ジクロロフェニル)尿素(Podolin et al.,「A Potent and Selective Nonpeptide Antagonist of CXCR2 Inhibits Acute and Chronic Models of Arthritis in the Rabbit」, J. Immunology 169(11):6435-6444 (2002)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、N-(2-ヒドロキシ-3-スルファミル-4-クロロフェニル)-N'-(2,3ジクロロフェニル)尿素(SB-332235)、SB-656933、参照により全体が本明細書に組み入れられるMaedaらのWO2012027289に開示されているアミノピリジンおよびアミノピリミジンカルボキサミド、参照により全体が本明細書に組み入れられるWillisらのWO2001/025242に開示されているチアゾロ(4,5-D)ピリミジン化合物、ならびに参照により全体が本明細書に組み入れられるBaettigらの米国特許出願公開第US 2010029670号およびHuntらの同第US20100152205号に開示されているスクアラミド誘導体が含まれる。本発明で用いるのに適しているさらなる小分子CXCR2阻害剤には、参照により全体が本明細書に組み入れられるBonnertらの米国特許第7,579,342号およびBroughらの米国特許出願公開第20050272750号に記述されているものが含まれる。
本発明のこの局面の別の態様において、組成物は、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する1種または複数種の抗体を含む。適当な抗体には、CXCR1遮断抗体もしくはその抗体結合部分(例えば、Ginestier et al.,「CXCR1 Blockade Selectively Targets Human Breast Cancer Stem Cells In Vitro and In Xenografts」, J. Clin. Invest. 120(2): 485-497 (2010)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、CXCR2遮断抗体もしくはその抗体結合部分(例えば、Nemzek et al.,「Functional Contribution of CXCR2 to Lung Injury After Aspiration of Acid and Gastric Particulates」, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298(3):L382-L391 (2010)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)またはCXCR1およびCXCr2抗体の組み合わせが含まれる。あるいは、適当な抗体には、CXCR1およびCXCR2と相互作用する黄色ブドウ球菌LukEおよびHlgAタンパク質の領域に結合するものが含まれる。この種の例示的な抗体には、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応する、
Figure 0006990674000010
のアミノ酸配列を含む黄色ブドウ球菌LukEのエピトープを認識し、かつそれに結合する、抗体またはその抗体結合部分が含まれる。この種の別の例示的な抗体には、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応する、
Figure 0006990674000011
のアミノ酸配列を含む黄色ブドウ球菌HlgAのエピトープを認識し、かつそれに結合する、抗体またはその抗体結合部分が含まれる。LukEおよびHlgAのCXCR1/CXCR2受容体結合領域に結合する抗体は、以下にさらに詳細に記述されている。
本発明の別の局面は、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階と、選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ダッフィ抗原ケモカイン受容体(DARC)との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する(すなわち、LukEおよび/またはHlgAとのDARCの相互作用を阻害することにより)組成物を投与する段階とを伴う。
DARCとの黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害するのに適した組成物には、DARC阻害剤またはアンタゴニストが含まれる。本発明の方法で用いるための例示的なDARC阻害剤は、DARC遮断抗体である(例えば、Patterson et al.,「Expression of the Duffy Antigen/Receptor for Chemokines (DARC) by the Inflamed Synovial Endothelium」, J. Pathol. 197(1): 108-116 (2002)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
本発明の方法による処置に適した対象には、非限定的に、任意の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトが含まれる。適当な対象には、免疫無防備状態（immunocompromised）および非免疫無防備状態の乳幼児、若年者、および成人が含まれる。本発明の1つの態様において、対象は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染を有するか、または有する危険性がある。本発明の別の態様において、対象は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染を有するか、または有する危険性がある。他の適当な対象には、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態、すなわち黄色ブドウ球菌関連状態、例えば、皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群などを有しうるか、または発症する危険性がある対象が含まれる。
本発明の1つの態様において、本発明の組成物は、黄色ブドウ球菌感染または関連状態にかかる危険性のある対象における黄色ブドウ球菌感染の発症を予防、遅延、または阻害するように予防的に投与される。本発明のいくつかの態様において、本発明の1つまたは複数の組成物の予防的投与は、個体における黄色ブドウ球菌感染を完全に予防するのに有効である。他の態様において、予防的投与は、さもなければそのような投与が無い状態では発症する感染を、完全に予防する、すなわち、個体における黄色ブドウ球菌感染を実質的に予防、阻害、または最小限にするのに有効である。
本発明の別の態様において、本発明の組成物は、黄色ブドウ球菌感染を有する個体に治療的に投与されて、感染の進行およびさらなる進展を阻害し、すなわち、個体における他の細胞への感染の広がりを阻害および/または予防し、感染を減らし、ならびに感染の1つまたは複数の症状を処置または軽減する。
本発明の治療用組成物は、処置される黄色ブドウ球菌感染の性質に依って、併用療法の一部として他の活性剤と併せて投与することができる。そのような追加の活性剤には、抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤が含まれる。
本発明において有用でありうる代表的な抗感染剤には、バンコマイシンおよびリソスタフィンが含まれる。他の抗感染剤には、参照により全体が本明細書に組み入れられるTorresらの米国特許出願公開第2011/0274693号に記述のLukAB阻害剤; 参照により全体が本明細書に組み入れられるTorresらの米国特許出願公開第2013/0017203号に記述のLukED阻害剤または抗体; 参照により全体が本明細書に組み入れられるTorresらの米国特許出願公開第2013/0039885号に記述のCCR5阻害剤、および参照により全体が本明細書に組み入れられるTorresらの国際特許出願第PCT/US2013/032436号に記述のCD11b阻害剤が含まれる。
本発明において有用でありうる代表的な抗生剤および抗菌剤には、バンコマイシン、リソスタフィン、ペニシリンG、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、セファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン、セファマンドール、セフォキシチン、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、テイコプラニン、リンコマイシンおよびクリンダマイシンを含めて、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、セファロスポリンおよびカルバペネムが含まれる。これらの抗生物質の投与量は、当技術分野において周知である(例えば、MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY (Beers & Berkow eds., 2004)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。抗感染症剤、抗生物質および/または抗菌剤は、投与の前に混ぜ合わされてもよく、あるいは本発明の組成物と同時に(同じ組成物の一部としてもしくは異なる組成物によって)または連続的に投与されてもよい。ある種の態様において、投与は繰り返される。
本発明の治療用組成物は単回の用量で、または複数投薬プロトコルにしたがって投与することができる。例えば、本発明の1つの態様において、1用量または2用量のような、比較的少用量の治療用組成物が投与される。本発明の別の態様において、治療用組成物は、より頻繁に、例えば、感染レベルが減少するか、または消滅するまで毎日投与される。数日間または数週間にわたる複数用量を一般的に伴う、従来の抗生物質療法を含む態様において、抗生物質は一定期間、例えば少なくとも5日間、10日間またはさらには14日間もしくはそれ以上の日数の間、毎日1回、2回もしくは3回またはそれ以上の回数、服用されうるが、一方で本発明の組成物は、1回または2回だけ投与される。しかしながら、当業者は、処置される対象および感染に基づいて治療用組成物および抗生物質のさまざまな投与量、投与のタイミングおよび相対量を選択および調節することができ、そうするべきである。
黄色ブドウ球菌感染を予防するためにCXCR1/CXCR2および/またはDARCへのLukEおよび/またはHlgAの結合を阻害する組成物を用いるという文脈において、これらの組成物の濃度は、黄色ブドウ球菌感染の予防または実質的な予防、特に、影響を受け易い集団(すなわち、乳幼児、若年者、成人、または免疫無防備状態の乳幼児、若年者もしくは成人)における黄色ブドウ球菌の予防を達成するのに十分でなければならない。黄色ブドウ球菌感染を処置するために治療用組成物を用いるという文脈において、阻害性組成物の投与量は、LukEおよび/またはHlgA媒介性細胞毒性を阻害するのに十分なものであり、かつ、いくつかの症状の低減、少なくとも1つの症状の重症度の減少、または少なくとも1つの症状のさらなる進行の遅延、またはさらには感染もしくはその症状の全体的な軽減を達成することができるものである。
本発明の薬剤または組成物の治療的有効量は、例えば、組成物中のこれらの活性剤の濃度、投与の方法および頻度、処置または予防される黄色ブドウ球菌感染の重症度、ならびに年齢、体重、健康全般および免疫状態のような、対象の詳細を含む、多数の要因を考慮に入れた、標準的な手順にしたがって判定される。一般的な手引きは、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Company 1990)のなかで見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。臨床医は、望まれるまたは必要とされる予防効果または治療効果を与える投与量に達するまで、LukEおよび/またはHlgAを阻害する組成物を投与することができる。この治療の進行を従来のアッセイ法によって容易にモニタリングすることができる。
本発明の薬剤および組成物は、予防的および/または治療的処置のために非経口、局所的、静脈内、経口、皮下、腹腔内、鼻腔内または筋肉内手段によって投与することができる。
本発明の薬剤および組成物は、非経口投与のために製剤化されてもよい。薬剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合された水中に調製することができる。分散液はまた、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、およびそれらの油中混合物中に調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、または鉱物油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、特に注射液に好ましい液体担体である。通常の保管および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。
注射用に適した薬学的製剤には、無菌水溶液または分散液、および無菌注射液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。いかなる場合でも、形態は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール)、それらの適当な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒体でありうる。
本発明の薬剤および組成物を全身に送達することが望ましい場合、それらは注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化されてよい。注射のための製剤は、単位剤形の状態で、例えば、アンプルまたは複数回投与容器中に、追加の保存剤とともに提示されてよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとることができ、また、懸濁剤、安定剤および/または分散剤のような調合剤を含有してよい。
本発明の薬剤の腹腔内または髄腔内投与は、Medtronic, Northridge, CAにより記述されるものなどの注入ポンプ装置を用いて達成することもできる。そのような装置は、所望の化合物の連続注入を可能にし、反復注射および反復操作を回避する。
前述の製剤に加えて、薬剤はデポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長期作用性製剤は、適当な重合体材料もしくは疎水性材料(例えば、許容される油中の乳濁液として)またはイオン交換樹脂と製剤化されうるか、あるいはわずかに可溶性の誘導体として、例えば、わずかに可溶性の塩として製剤化されうる。
本発明の別の局面は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象からサンプルを得る段階およびサンプル中のCXCR1、CXCR2、DARCまたはそれらの組み合わせの発現レベルを定量化する段階を伴う。本方法は、定量化された発現レベルに基づいて対象に向けた処置を施す段階をさらに伴う。
本発明のこの局面によれば、対象由来のサンプルは血液、組織、細胞、または血清サンプルを含みうる。
本発明のこの局面の1つの態様において、CXCR1、CXCR2、DARCの発現レベルを定量化する段階は、対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARC mRNA発現を測定する段階を伴う。サンプル中のmRNA発現レベルを検出かつ定量化する方法は、当技術分野において周知であり、以下に一般的に記述される。
対象由来のmRNAは、当技術分野において公知の方法を用いて組織または細胞サンプルから単離かつ調製することができる。RNA調製は酵素的に操作可能なmRNAまたは分析可能なRNAをもたらさなければならない。全RNAおよびmRNAは、イソチオシアン酸グアニジニウム-超遠心分離法、グアニジニウムおよびフェノール-クロロホルム抽出、塩化リチウム-SDS尿素抽出を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の方法を用いて、またはオリゴ(dT)セルロース法によって単離されうる。単離された全RNAは、例えば、ランダムプライマー、オリゴ-dTプライマー、またはランダム-オリゴ-dTプライマーを用い、当技術分野において公知の任意の手順を用いて、第1鎖コピーDNA (cDNA)を作出するために用いることができる。cDNAを次いで、標的またはサンプル存在量に依り、第1ラウンド増幅反応用の鋳型または定量的PCR反応用の鋳型として用いる。第1ラウンドPCR増幅は、関心対象の標的遺伝子(すなわち、CXCR1、CXCR2、またはDARC)に特異的であるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、プライマーセットで行う。第1ラウンドの増幅後、反応産物の清浄化部分を定量分析に用いる。定量的リアルタイムPCRプロトコルは、典型的には、反応サイクルの伸長段階後に産物形成の蛍光判定を行うことに依る。定量的PCRのための典型的な蛍光手法は、SYBRグリーン、FAM、フルオレセイン、HEX、TET、TAMRAなどのような蛍光レポーター色素およびDABSYL、Black Holeなどのようなクエンチャ色素に基づく。Molecular Beacons (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)、Taqman(登録商標)Probes (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)、LNAまたはMGB Probes、Scorpion(登録商標)Primers (DxS Ltd., Manchester, UK)、AmpliFluor、Plexor、またはLuxプライマーのようなシステムも、定量的遺伝子分析の分野において周知である。リアルタイムプローブに関連した方法および試薬の例は、参照により全体が本明細書に組み入れられる全てTyagiらの米国特許第5,925,517号、同第6,103,476号、同第6,150,097号、および同第6,037,130号において見出すことができる。
定量的遺伝子発現は、絶対コピー数としてまたは相対遺伝子発現として表現することができる。どちらの方法でも、定量的データが正確に得られる標準曲線を利用する。サンプルにおいて測定されたmRNA発現レベルを、典型的には、参照または対照サンプルにおいて測定されたmRNA発現レベル、例えば、対照集団における平均発現レベル、黄色ブドウ球菌感染に対して既知の感受性を有する臨床患者集団における平均発現レベル、および/または黄色ブドウ球菌感染に対して既知の抵抗性を有する臨床患者集団における平均発現レベルと比較する。
本発明のこの局面の別の態様において、CXCR1、CXCR2、DARCの発現レベルを定量化することには、対象由来のサンプルにおいてCXCR1、CXCR2、および/またはDARCタンパク質発現を測定することを伴う。サンプル中のタンパク質発現レベルを検出かつ定量化する方法は、当技術分野において周知であり、以下に一般的に記述される。
当技術分野において公知の標準的な調製方法を用いて、対象由来のサンプルタンパク質をサンプルから単離かつ調製することができる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のような界面活性剤、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含有する緩衝液中で細胞を溶解させることができる。Bradford Assayまたは当技術分野において公知の方法の変化形を用いて、タンパク質収量を判定することができる。サンプル内の標的タンパク質の発現レベルを評価することは、当技術分野において公知のさまざまな技法によって行うことができる。例えば、発現のレベルを評価することは、二次元電気泳動、質量分析、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、多次元液体クロマトグラフィーとその後のタンデム質量分析、またはプロテインチップ発現分析により1種または複数種のタンパク質を分析することを伴うことができる。他の技法は、タンパク質発現を測定するのに適している1つまたは複数の検出可能な試薬、例えば、CXCR1、CXCR2、もしくはDARCに対する結合特異性を有する標識抗体、または二次抗体と併用される、CXCR1、CXCR2、もしくはDARCに対する結合特異性を有する一次抗体とサンプルを接触させること、およびサンプル中の全タンパク質に対して規準化した後にサンプル中の検出可能な試薬のレベルに基づいてタンパク質発現レベルを測定することを伴う。当技術分野において一般的に利用される、サンプル、例えば、血液または血清サンプル中のタンパク質発現レベルを検出するのに適した方法には、例えばかつ非限定的に、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、または蛍光活性化細胞選別法(FACS)が含まれる。サンプルにおいて測定されたタンパク質発現レベルを、典型的には、参照または対照サンプルにおいて測定されたタンパク質発現レベル、例えば、対照集団における平均発現レベル、黄色ブドウ球菌感染に対して既知の感受性を有する臨床患者集団における平均発現レベル、および/または黄色ブドウ球菌感染に対して既知の抵抗性を有する臨床患者集団における平均発現レベルと比較する。
本発明のこの局面によれば、正常参照集団における発現レベルと比べて増大したまたは高いレベルのCXCR1、CXCR2、もしくはDARC発現または黄色ブドウ球菌感染に対して既知の感受性を有する参照集団における発現レベルと比べて類似したレベルのCXCR1、CXCR2、もしくはDARC発現から、対象は黄色ブドウ球菌感染に対して増大した感受性または高まった感度を有しうることが一般的に示唆されよう。したがって、より積極的な治療的処置計画が採用されるべきであり、それには、CXCR1、CXCR2、またはDARCとの黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する本発明の1つまたは複数の薬剤または組成物が含まれる。正常対照または参照集団と比べて減少したまたは低いレベルのCXCR1、CXCR2、またはDARC発現から、対象は黄色ブドウ球菌の感染に対していっそう高い抵抗性を有するものと示唆されよう。適当な処置はそれでも、感染を予防または最小限にするために本発明の1つまたは複数の薬剤または組成物を含むであろう。しかしながら、投薬計画は、感染に対していっそう高い感受性の対象における投薬計画よりも積極性が低い。
本発明の別の局面は、単離されたロイコシジンE (LukE)抗体、またはその抗体結合断片に向けられ、ここで該抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196に対応するエピトープを結合する。
本発明の別の局面は、単離されたHlgA抗体、またはその抗体結合断片に向けられ、ここで該抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180～192に対応するエピトープを結合する。
本発明の目的で、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、および抗体の遺伝子組み換え型、ならびにそれらの組み合わせを含む。より具体的には、「免疫グロブリン」という用語と互換的に用いられる「抗体」という用語は、全長(すなわち、天然に存在するまたは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組み換え過程により形成された)免疫グロブリン分子(例えば、IgG抗体)、およびかさねて、天然に存在してもよい、または事実上合成による、その免疫学的に活性な断片(すなわち、全長免疫グロブリン分子の特異的な結合部分を含む)を含む。したがって「抗体断片」という用語はF(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、sdAb (ナノボディ)などのような抗体の一部分を含む。構造にかかわらず、抗体断片は、全長抗体によって認識される同一抗原と結合し、本発明との関係においては、LukEおよびHlgAのCXCR1/CXCR2またはDARC受容体結合領域を特異的に結合する。抗体断片を作出およびスクリーニングする方法は、当技術分野において周知である。
本発明において、抗LukE抗体および抗HlgA抗体は、HlgC、LukS-PVL、LukS-I、LukA、およびLukMのような他のブドウ球菌ロイコシジンS-サブユニットとある程度の交差反応性を有しうる。治療的に有効な抗LukE抗体および/または抗HlgA抗体は、CXCR1/CXCR2またはDARC結合へのLukEおよび/またはHlgAの結合を阻害または低減する。いくつかの態様において、抗LukE抗体および/または抗HlgA抗体は、それぞれ、LukEおよびHlgA活性を中和する(例えば、実質的になくす)。
天然に存在する抗体は、典型的には、2本の同一の重鎖および2本の同一の軽鎖を有し、各軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合的に連結されており、複数のジスルフィド結合が2本の重鎖を互いとさらに連結している。個々の鎖は、類似のサイズ(110～125アミノ酸)および構造を有するが、しかし異なる機能を有するドメインへ折り重なりうる。軽鎖は1つの可変ドメイン(VL)および/または1つの定常ドメイン(CL)を含むことができる。重鎖はまた、1つの可変ドメイン(VH)および/または、抗体のクラスもしくはアイソタイプに依り、3つもしくは4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3およびCH4)を含むことができる。ヒトでは、アイソタイプはIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMであり、IgAおよびIgGはサブクラスまたはサブタイプ(IgA1～2およびIgG1～4)へさらに細分類される。
一般に、可変ドメインは、とりわけ抗原結合部位の場所で、抗体ごとにかなりのアミノ酸配列のバラツキを示す。超可変領域または相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3つの領域がVLおよびVHの各々において見出され、これらはフレームワーク可変領域と呼ばれるバラツキの少ない領域により支持されている。本発明の抗体はIgGモノクローナル抗体および抗体断片または遺伝子操作型を含む。これらは、例えば、Fv断片、または例示される抗体のCDRおよび/もしくは可変ドメインが単鎖抗原結合タンパク質として遺伝子操作されているタンパク質である。
VLおよびVHドメインからなる抗体の部分は、Fv (断片可変部)と指定され、抗原結合部位を構成する。単鎖Fv (scFvまたはSCA)は、1本のポリペプチド鎖上のVLドメインおよびVHドメインを含有する抗体断片であり、その一方のドメインのN末端および他方のドメインのC末端がフレキシブルリンカーによって結び付けられている。単鎖抗体を産生するために用いられるペプチドリンカーは、典型的には、VLおよびVHドメインの適正な三次元的折り畳みが行われることを確実とするように選択されたフレキシブルペプチドである。このリンカーは、一般に3～50アミノ酸残基であり、場合によってはさらに短く、例えば、約3～30アミノ酸残基、または3～25アミノ酸残基、あるいは場合により3～15アミノ酸残基である。このようなリンカーペプチドの例には、4つのグリシン残基とそれに続くセリン残基の繰り返しが含まれる。
単鎖抗体は、それらが由来する抗体全体のうちの定常ドメインの一部または全部を欠いている。それゆえ、単鎖抗体は、抗体全体の使用に伴う問題の一部を克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子との間のある種の望ましくない相互作用を免れる傾向がある。これに加えて、単鎖抗体は抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも大きな浸透性を有することができる結果、単鎖抗体を局在化させ、標的抗原結合部位とより効率的に結合させることが可能になる。さらに、単鎖抗体のこの比較的小さなサイズによって、単鎖抗体は抗体全体よりもレシピエントにおいて不必要な免疫応答を引き起こす可能性が低くなる。
単一ドメイン抗体(sdAb; ナノボディ)は、単一の単量体可変抗体ドメイン(およそ12～15 kDa)からなる抗体断片である。sdAbは重鎖の可変ドメイン(VH)または軽鎖の可変ドメイン(VL)に由来する。sdAbは、すなわち、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメの免疫により、天然に産生されうる(Ghahroudi et al.,「Selection and Identification of Single Domain Antibody Fragments from Camel Heavy-Chain Antibodies」, FEBS Letters 414(3): 521-526 (1997)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。あるいは、抗体は微生物において産生され、または従来の全抗体に由来しうる(Harmsen et al.,「Properties, Production, and Applications of Camelid Single-Domain Antibody Fragments」, Appl. Microbiol. Biotechnology 77: 13-22 (2007)、Holt et al.,「Domain Antibodies: Proteins for Therapy」, Trends Biotech. 21(11): 484-490 (2003)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
Fab (断片、抗原結合性)は、VL、CL、VH、およびCH1ドメインからなる抗体の断片をいう。単純にパパイン消化後に作出されるものはFabといわれ、重鎖ヒンジ領域を保持しない。ペプシン消化後、重鎖ヒンジを保持するさまざまなFabが作出される。鎖間ジスルフィド結合が完全な状態のそれらの断片はF(ab')2といわれ、一方、単一のFab'はジスルフィド結合が保持されない場合に生じる。F(ab')2断片は、一価Fab断片よりも抗原に対して高い結合活性を有する。
Fc (断片、結晶化)は、対合した重鎖定常ドメインを含む抗体の部分または断片の呼称である。例えば、IgG抗体では、FcはCH2およびCH3ドメインを含む。IgAまたはIgM抗体のFcはさらに、CH4ドメインを含む。このFcは、Fc受容体の結合、補体媒介性細胞毒性の活性化および抗体依存性細胞毒性(ADCC)と関連がある。多重IgG様タンパク質の複合体であるIgAおよびIgMなどの抗体の場合、複合体形成にはFc定常ドメインが必要になる。
抗体「特異性」は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識をいう。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはT細胞受容体への特異的結合ができるか、または分子と別の方法で相互作用ができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸もしくは糖質、または糖の側鎖のような分子の化学的に活性な表面集団からなり、かつ、一般的に、特異的な三次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。エピトープは「線状」または「立体配座」でありうる。線状エピトープにおいて、タンパク質と、相互作用する分子(抗体のような)との間の相互作用点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に現れる。立体配座のエピトープにおいて、相互作用点は互いに分離したタンパク質上のアミノ酸残基、すなわち、タンパク質の三次折り畳みによって近接して並べられた非連続アミノ酸にわたって現れる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露によっても保持され、一方、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理によって失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも3個、通常は、少なくとも5個または8～10個のアミノ酸を、固有の空間的立体配座に含む。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体が別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を示す単純な免疫アッセイ法において確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体はマウス、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体でありうる。ヒト化抗体は、ある種、例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマ、もしくはニワトリ抗体(または任意の他の適当な動物抗体)由来の抗体のCDRが、ヒト重可変ドメインおよび軽可変ドメインへ移入される、組み換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。ヒト化抗体を作出するための方法は、当技術分野において周知である。キメラ抗体は、好ましくは、ヒト抗体定常領域に実質的にまたは排他的に由来する定常領域、およびヒト以外の哺乳類の可変領域の配列に実質的にまたは排他的に由来する可変領域を有する。キメラ化の過程は、マウス(または他の非ヒト哺乳類)抗体の、超可変領域または相補性決定領域(CDR)以外の、可変領域を、対応するヒト配列と置き換えることによってもさらに効果的に行うことができる。CDR以外の可変領域は可変フレームワーク領域(FR)としても公知である。本発明のさらに他のモノクローナル抗体は、2つの異なるエピトープに対する特異性を有するという点で、二重特異性である。二重特異性抗体は、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。
上記の抗体は標準的な技法にしたがって得ることができる。例えば、LukE、HlgA、または所望の受容体結合エピトープを含んだLukEもしくはHlgAの免疫学的に活性な断片を対象(例えば、ヒトもしくはマウスのような哺乳類、またはナノボディの場合にはヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、またはサメ)に投与することができる。ロイコシジンはそれ自体で免疫原として使われてもよく、またはそれらは担体タンパク質もしくは他の担体材料、例えばセファロースビーズに付着されてもよい。動物が抗体を産生した後に、脾細胞のような、抗体産生細胞の混合物を単離し、それからポリクローナル抗体を得ることができる。個々の抗体産生細胞を混合物から単離し、例えば、それらを骨髄腫細胞のような、腫瘍細胞と融合することで、それらを不死化することにより、モノクローナル抗体が産生されてもよい。得られたハイブリドーマを培地中で保存し、モノクローナル抗体を培地から回収する。
本発明の別の局面は、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する、単離されたロイコシジンE (LukE)タンパク質またはそのポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物に向けられる。
本明細書において記述されるように、本出願人らは、LukEのCXCR1/CXCR2受容体結合領域が可溶性LukEタンパク質(SEQ ID NO:4)のアミノ酸残基番号182～196を含むことを特定した。したがって、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質は、特定されたこの領域(すなわち、SEQ ID NO:4の182～196)のなかに受容体結合を乱す1つまたは複数のアミノ酸残基置換または欠失を含む。本発明の1つの態様において、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質(「LukELukS-DR4」)は、以下に示されるようにSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する。
Figure 0006990674000012
非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを含んだ適当なLukEポリペプチドは、長さが約50～約100アミノ酸、より好ましくは長さが約100～200アミノ酸または長さが約200～250アミノ酸である。例示的な単離LukEポリペプチドは、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号1～273、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号20～263、またはSEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号20～273を含み、CXCR1/CXCR2受容体結合領域(すなわち、アミノ酸残基番号182～196)のなかに1つまたは複数のアミノ酸残基置換または欠失を含む。本発明の1つの態様において、単離されたLukEポリペプチドは、以下に示されるようにSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む。
Figure 0006990674000013
少なくとも1つの態様において、非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを含んだLukEポリペプチドは、例えば、アミノ酸P184、G186、P187、G189の1つもしくは複数の置換もしくは欠失、またはそれらの任意の組み合わせを有する(すなわち、単一変異体、二重変異体、三重変異体、および四重変異体が全て企図される)。適当な例としては非限定的に、LukELukS-DR4(すなわち、SEQ ID NO:8)、LukE20～263 LukS-DR4(すなわち、SEQ ID NO:9)、LukEP184A,G186A,P187A(すなわち、SEQ ID NO;10、以下に示す)、およびLukEP184A,G186A,P187A,G189A(すなわち、SEQ ID NO;11、以下に示す)が挙げられる。
SEQ ID NO:10; LukEP184A,G186A,P187A
Figure 0006990674000014
SEQ ID NO: 11; LukEP184A,G186A,P187A,G189A
Figure 0006990674000015
本発明の組成物は、単離されたロイコシジン(LukD)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含みうる。単離されたLukDタンパク質は、以下に示されるようにSEQ ID NO:12のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:12 (LukDのアミノ酸配列)と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含みうる。
Figure 0006990674000016
適当なLukDポリペプチドは、長さが約50～約100アミノ酸、より好ましくは長さが約100～200アミノ酸または長さが約200～250アミノ酸である。例示的な単離LukDポリペプチドはSEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号1～286、SEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号20～281、またはSEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号20～286を含む。適当なLukDポリペプチドは同様に、SEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号1～286、SEQ ID NO:11のアミノ酸残基番号20～281、またはSEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号20～286と約70～80%の配列類似性、好ましくは80～90%の配列類似性、より好ましくは90～95%の配列類似性、および最も好ましくは95～99%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドを含む。
本発明の別の局面は、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたHlgAタンパク質またはそのポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物に向けられる。
本明細書において記述されるように、本出願人らは、HlgAのCXCR1/CXCR2受容体結合領域が可溶性HlgAタンパク質(SEQ ID NO:6)のアミノ酸残基番号180～192を含むことを特定した。したがって、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたHlgAタンパク質は、特定されたこの領域(すなわち、SEQ ID NO:6の180～192)のなかに受容体結合を乱す1つまたは複数のアミノ酸残基置換または欠失を含む。本発明の1つの態様において、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたHlgAタンパク質(「HlgALukS-DR4」)は、以下に示されるようにSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する。
Figure 0006990674000017
非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを含んだ適当なHlgAポリペプチドは、長さが約50～約100アミノ酸、より好ましくは長さが約100～200アミノ酸または長さが約200～250アミノ酸である。例示的な単離HlgAポリペプチドは、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号1～268、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号20～258、またはSEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号20～268を含み、CXCR1/CXCR2受容体結合領域(すなわち、アミノ酸残基番号180～192)のなかに1つまたは複数のアミノ酸残基置換または欠失を含む。本発明の1つの態様において、単離されたHlgAポリペプチドは、以下に示されるようにSEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む。
Figure 0006990674000018
少なくとも1つの態様において、非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを含んだHlgAポリペプチドは、例えば、アミノ酸P182、G184、P185の1つもしくは複数の置換もしくは欠失、またはそれらの任意の組み合わせを有する(すなわち、単一変異体、二重変異体、および三重変異体が全て企図される)。適当な例としては非限定的に、HlgALukS-DR4(すなわち、SEQ ID NO:13)、HlgA20-258 LukS-DR4(すなわち、SEQ ID NO:14)、およびHlgAP182A,G184A,P185A(すなわち、SEQ ID N0:15、以下に示す)が挙げられる。
Figure 0006990674000019
本発明の組成物は、単離されたHlgBタンパク質またはそのポリペプチドをさらに含みうる。単離されたHlgBタンパク質は、以下に示されるSEQ ID NO:16のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:16 (HlgBのアミノ酸配列)と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含みうる。
Figure 0006990674000020
適当なHlgBポリペプチドは、長さが約50～約100アミノ酸、より好ましくは長さが約100～200アミノ酸または長さが約200～250アミノ酸である。適当なHlgBポリペプチドは同様に、SEQ ID NO:16のアミノ酸残基番号1～286と約70～80%の配列類似性、好ましくは80～90%の配列類似性、より好ましくは90～95%の配列類似性、および最も好ましくは95～99%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドを含む。
本発明の別の局面は、対象においてヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染を予防または処置する方法に向けられる。この方法は、HIV感染を有する危険性がある対象またはHIV感染を有する対象を選択する段階と、選択した対象に、対象においてHIVを予防または処置するのに有効な条件の下で、非機能的なCXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離LukEタンパク質またはそのポリペプチドを含む本発明の組成物を投与する段階とを伴う。本組成物は、上記のように単離LukDタンパク質またはそのポリペプチドをさらに含んでもよい。本組成物は、上記のように、アミノ酸P184、G186、P187、および/またはG189が存在する位置にLukEタンパク質またはポリペプチドに対するいずれか1つまたは複数の置換または欠失を含んでもよい。
本明細書においておよび他でも(Torresらの米国特許出願公開第20130039885号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)記述されているように、CCR5はまた、黄色ブドウ球菌LukE毒素の細胞受容体である。CCR5陽性細胞へのLukEDの結合は孔形成を引き起こし、細胞死をもたらす。CCR5受容体は、HIV細胞侵入および感染を媒介することが知られている; それゆえ、LukEおよびLukDタンパク質またはポリペプチドを含む組成物でHIVを有する対象を処置することにより、全てのHIV陽性細胞の細胞死が引き起こされるであろう。この処置方法は現行のHIV治療戦略よりも優れている。というのは、LukED処置が対象において全てのCCR5陽性細胞、それゆえ、全てのHIV陽性細胞を選択的かつ特異的に枯渇させるからである。「修飾されたLukEタンパク質またはポリペプチド」、すなわち、非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを有するLukEタンパク質またはポリペプチドを含む本発明の組成物は、HIVおよび本明細書において記述される他の適応症の処置に対する特異性を増強させた。というのは、PMNを含む、CXCR1/CXCR2陽性細胞の非特異的な標的化および細胞死が回避されるからであり、すなわち、本発明の修飾されたLukEタンパク質またはポリペプチドを含む組成物が、CCR5+細胞に対して選択性が高いからである。
本発明の治療用組成物は、別の抗HIV剤との併用で併用治療の一部として投与することができる。したがって、非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する、単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチド、および単離されたLukDタンパク質またはそのポリペプチドを含む組成物はさらに、HIVの処置において有用な1つもしくは複数の抗ウイルス剤もしくは他の薬剤を含んでもよく、またはHIVの処置において有用な1つもしくは複数の抗ウイルス剤もしくは他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。適当な抗ウイルス剤は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を含む。より具体的には、適当な抗ウイルス剤は、非限定的に、ジドブジン、ラミブジン、ザルシタビン、ジダノシン、スタブジン、アバカビル、アデホビルジピボキシル、ロブカビル、BCH-10652、エミトリシタビン、ベータ-L-FD4、DAPD、ロデノシン、ネビラピン、デラビリジン、エファビレンツ、PNU-142721、AG-1549、MKC-442、(+)-カラノライドAおよびB、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、ラシナビル、DMP-450、BMS-2322623、ABT-378、アンプレナビル、ヒドロキシウレア、リバビリン、IL-2、IL-12、ペンタフシド、Yissum番号1 1607ならびにAG-1549を含む。
本発明のこの局面の目的上、標的「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを包含する。対象におけるHIV感染を予防する目的で本発明の組成物を投与するという文脈において、標的対象は、HIVに感染される危険性がある任意の対象を包含する。対象におけるHIV感染を処置する目的で本発明の組成物を投与するという文脈において、標的対象は、HIVに感染した任意の対象を包含する。
HIV感染を処置するために本発明の治療用組成物を使用するという文脈において、修飾されたLukEおよびLukDの治療的有効量は、感染に関連した症状の低減、少なくとも1つの症状の重症度の減少、対象のウイルス量の減少、および好ましくは、対象からのウイルスの完全な根絶を達成できる量である。
修飾されたLukEおよびLukDを含有する組成物の治療的有効量は、例えば、組成物中のこれらの活性剤の濃度、投与の方法および頻度、処置(または予防)されるHIV感染の重症度、ならびに年齢、体重、健康全般および免疫状態のような、対象の詳細を含む、多数の要因を考慮に入れた、標準的な手順にしたがって判定することができる。一般的な手引きは、例えば、International Conference on Harmonizationの刊行物のなかで、およびREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Company 1990)のなかで見出すことができ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。臨床医は、望まれるまたは必要とされる予防効果または治療効果を与える投与量に達するまで、修飾されたLukEおよびLukDタンパク質またはポリペプチドを含有する組成物を投与することができる。この治療の進行を従来のアッセイ法(例えば、ウイルス量)によって容易にモニタリングすることができる。
本発明の治療用組成物は、単回用量で、または複数用量プロトコルによって投与されうる。例えば、複数用量プロトコルにおいて、治療用組成物は処置条件の使用および重症度に依って、毎日、毎週または毎月1回または2回投与されうる。当業者は異なる投与量、投与のタイミングおよび治療用組成物の相対量を選択かつ調節することができる。本発明の治療用組成物の投与方法は、以下に記述される。
本発明の別の局面は、対象のHIV感染を予防する方法に関する。この方法は、非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはポリペプチド、および、任意で、単離されたLukDタンパク質またはポリペプチドを含む組成物を提供する段階、ならびに組織中の細胞のHIV感染を遮断するのに有効な条件の下で対象の組織を組成物と接触させ、それによって対象のHIV感染を阻害する段階を伴う。
本発明のこの局面によれば、修飾されたLukEおよびLukDタンパク質またはポリペプチドを含む組成物は、CXCR1/CXCR2+細胞を非特異的に標的化することなく、感染が起こる前にHIV感染に対して感受性であるCCR5+細胞だけを選択的に死滅させる、抗HIV殺菌薬として働く。組成物は、HIVへの曝露の危険性がある任意の女性または男性対象に対して、HIV感染を予防する予防的手段として投与することができる。
本発明のこの局面によれば、修飾されたLukEおよびLukDタンパク質またはポリペプチドを含む組成物は、1つまたは複数のさらなる薬剤をさらに含んでもよい。1つまたは複数のさらなる薬剤は、例えば、かつ非限定的に、滑沢剤、抗菌剤、抗酸化物質、湿潤剤、乳化剤、殺精子剤またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物を含む。
適当な滑沢剤には、非限定的に、セチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムもしくは白ろう、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物が含まれる。適当な抗菌剤には、非限定的に、プロピレングリコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物が含まれる。適当な抗酸化物質には、非限定的に、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、もしくはエデト酸二ナトリウム、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物が含まれる。適当な湿潤剤には、非限定的に、エチレングリコール、グリセリンもしくはソルビトール、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物が含まれる。適当な乳化剤には、非限定的に、カルボマー、ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-ステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ステアリン酸ジグリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラノリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、メチルセルロース、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ソルビタンエステルもしくはステアリン酸、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物が含まれる。
本発明のこの局面の1つの態様において、殺菌薬組成物は、局所適用のために製剤化される。本発明による局所投与用の組成物は、溶液、軟膏、クリーム、泡、懸濁液、ローション、粉末、ペースト、ゲル、スプレイ、エアロゾル、または膣、肛門もしくは口腔投与用の油として製剤化することができる。本発明の別の態様において、組成物は膣投与および/または直腸投与用に製剤化される。本発明の別の態様において、組成物は、膣リング、IUDもしくはスポンジ、または他の避妊具(例えば、コンドーム)のような膣用器具からの持続放出用に製剤化される。本発明の別の態様において、組成物は含嗽液としての用途のために製剤化される。本発明の好ましい態様において、組成物は、HIV感染に曝露される危険性がある対象の皮膚または粘膜に直接適用または接触される。
本発明の別の局面は、対象において炎症状態を処置する方法に関する。この方法は、炎症状態を有する対象を選択する段階、ならびに非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはポリペプチド、および、任意で、単離されたLukDタンパク質またはポリペプチドを含む本発明の組成物を、対象における炎症状態を処置するのに有効な量で投与する段階を伴う。
本出願人らは、LukEDがヒトCCR5陽性白血球を標的化して死滅させることを発見した。非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを有するLukEタンパク質またはポリペプチドを含む組成物は、CCR5+細胞に対してLukED媒介性細胞傷害を選択的かつ特異的に指令するが、しかし他の有核哺乳類細胞ではそうではない。CCR5は、炎症の間、局所的に濃縮される炎症性サイトカインを産生するエフェクタT細胞のサブセットにおいて発現されるので、修飾されたLukEおよびLukDタンパク質およびポリペプチドを含む本発明の組成物は、CCR5陽性細胞集団を選択的に枯渇させることによって炎症状態を処置するのに有用である。任意の対象、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを、炎症の原因、例えばいずれの細菌感染またはウイルス感染にも関係なく、本発明のこの局面によって処置することができる。修飾されたLukEおよびLukDタンパク質および/またはポリペプチドを含有する適当な組成物は、上述されている。
本発明の治療用組成物は、急性炎症状態、関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、I型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変症、炎症性腸疾患、結核症、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、アレルギー性接触皮膚炎、急性過敏症、ならびに急性神経炎症性傷害(例えば、急性感染によって引き起こされる)を含むが、これらに限定されない、いくつかの炎症状態を処置するために用いられうる。
急性炎症状態は、襲ってくる刺激に対する身体の初期応答を包含し、創傷または感染組織の限局領域への血漿および白色血液細胞(白血球)の動員を伴う。急性炎症状態は、急激な発生および重度の症状を有する。患者の正常な状態から炎症の症状が重度に現れる状態までの発生期間は、概して、約72時間まで続く。本発明の治療用組成物による処置に適している急性炎症状態は、結膜炎、虹彩炎、ブドウ膜炎、中心性網膜炎、外耳炎、急性化膿性中耳炎、乳様突起炎、迷路炎、慢性鼻炎、急性鼻炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、接触性皮膚炎、真皮壊死、糖尿病患者多発性神経炎、多発性筋炎、骨化性筋炎、変性性関節炎、関節リウマチ、上腕肩甲関節周囲炎および奇形性骨炎を含む。本発明の1つの態様において、急性炎症状態は、皮膚または軟組織における感染創傷である。
炎症状態の処置という文脈において、修飾されたLukE/LukD組成物の有効量は、処置が炎症の低減、炎症の重症度の減少、またはさらには炎症状態の全体的な緩和を達成できるという意味において治療的に有効な量である。
本発明の抗炎症組成物は、以下に記述されるように任意の投与経路によって投与されうる。限局性である急性炎症状態の処置の場合、どの症例においても治療用組成物の投与が急性炎症の部位でまたはその周囲である非全身投与が好まれうる。これに関連して、局所投与用の組成物が好ましい。上述した局所製剤に加えて、局所製剤は、活性成分を含浸させたパッチまたは包帯の形態であってもよく、それは1つまたは複数の賦形剤または希釈液を任意で含んでもよい。いくつかの態様において、局所製剤は皮膚または他の患部を通じた活性剤の吸収または浸透を増強する材料を含む。
本発明のこの局面または他の局面における修飾されたLukE/LukD組成物の治療的有効量は、有益なまたは所望の結果を得るのに必要な量である。治療的有効量は、1回または複数回の投与、適用または投与量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されるよう意図されない。
また、本発明のこの局面によっても、修飾されたLukE/LukD組成物は、他の抗炎症組成物、TNFα阻害剤またはそれらの組み合わせと併せて(すなわち、その前に、それとともに、またはその後に)投与することができる。例示的な抗炎症薬としては、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、鎮痛薬、糖質コルチコイド、疾患修飾抗リウマチ薬、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤(例えば、メトトレキセート)、生物学的反応修飾物質、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されることはない。
適当なNSAIDは、選択的シクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2)阻害剤である。例示的なCOX-2阻害剤としては、ニメスリド、4-ヒドロキシニメスリド、フロスリド、メロキシカム、セレコキシブおよびロフェコキシブ(Vioxx)が挙げられるが、これらに限定されることはない。あるいは、非選択的NSAID阻害剤は、本発明のLukE/D組成物と組み合わせて投与される。例示的な非選択的NSAIDS阻害剤としては、非限定的に、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダクおよびトルメチンが挙げられる。
好ましい鎮痛薬には、非限定的に、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドールおよび塩酸プロポキシフェンが含まれる。
好ましい糖質コルチコイドには、非限定的に、コルチゾン、デキサメタゾン(dexamethosone)、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンが含まれる。
好ましい生物学的反応修飾物質には、リツキシマブのようなB細胞阻害剤またはレフルノミド、エタネルセプト(Enbrel)もしくはインフリキシマブ(Remicade)のようなT細胞活性化阻害剤が含まれる。
適当なTNFα阻害剤は、TNF-α抗体、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、コルチコステロイド、テトラサイクリンTNFαアンタゴニスト、フルオロキノロンTNFαアンタゴニストおよびキノロンTNFαアンタゴニストを含む。例示的なTNFαアンタゴニスト抗体としては、非限定的に、インフリキシマブ、エタネルセプト、CytoFAb、AGT-1、アフェリモマブ、PassTNFおよびCDP-870が挙げられる。例示的なコルチコステロイドとしては、非限定的に、モメタゾン、フルチカゾン、シクレソニド、ブデソニド、ベクロメタソン、ベコナーゼ、フルニソリド、デフラザコート、ベタメタゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾル、トリアムシノロン、コルチゾン、コルチコステロン、ジヒドロキシコルチゾン、ベクロメタゾンジプロピオネートおよびプレドニゾンが挙げられる。例示的なテトラサイクリンTNF-αアンタゴニストとしては、非限定的に、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、リメサイクリンおよび4-ヒドロキシ-4-ジメチルアミノテトラサイクリンが挙げられる。
本発明の別の局面は、対象において移植片対宿主病(GVHD)を予防する方法に関する。この方法は、GVHDを有する対象またはGVHDを有する危険性がある対象を選択する段階、および対象において移植片対宿主病(GVHD)を予防するのに有効な量で、非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはポリペプチド、および、任意で、単離されたLukDタンパク質またはポリペプチドを含む組成物を投与する段階を伴う。
移植片対宿主病(GVHD)は、臨床骨髄移植(BMT)の初期の合併症であり、この重要な治療法の広範囲にわたる適用に対する主要な妨げあり続けている。GVHDの特質は、皮膚、腸および胆管の宿主上皮区画へのドナーTリンパ球の溶浸である。GVHDは、移植片の骨髄に含まれる成熟T細胞が、免疫抑制された宿主に移植されるときに起こる。移植後、宿主抗原提示細胞(APC)は、宿主組織適合抗原を移植片T細胞に提示することによって移植片のT細胞(ドナーT細胞)を活性化する。ドナー由来のAPCはまた、交差提示している宿主同種異系抗原によってドナーT細胞を活性化しうる。新たに作出された宿主特異的Tエフェクタ(hsTeff)集団はその後、末梢の宿主器官に移動して標的器官の損傷をもたらす。
GVHDは一般的に、急性型および慢性型として起こる。急性GVHDはBMT後の最初の約100日の範囲内で観察されるが、慢性GVHDはこの初期の100日の後に起こる。時系列順に加えて、異なる臨床症状は、急性GVHD対慢性GVHDとしても現れる。急性GVHDは、概して、宿主対象における宿主肝臓、皮膚、粘膜および腸上皮の損傷を特徴としているが、いくつかの形態の特発性肺炎も報告されている。他方では、慢性GVHDは、器官と同様に結合組織に対する損傷、および宿主対象における急性GVHDの間、損傷を受ける組織と関与する。一般に、本発明の方法は、既に宿主対象に存在するGVHDに取り組むか、宿主対象において起こるGVHDを予防するかのいずれかのための療法に関する。1つの態様において、本発明は急性GVHDを処置または予防する方法に関する。特に、本発明の方法は、GVHDが宿主腸上皮に損傷を与えている急性GVHDの処置に適している。本発明の方法はまた、GVHDが宿主肝臓、宿主皮膚、宿主肺および宿主粘膜からなる群より選択される少なくとも1つの組織に損傷を与えている急性GVHDの処置に適している。もちろん、本方法は、GVHDが2つ以上の組織に損傷を与えている急性GVHDを処置するために用いられてもよい。
本発明のこの態様によれば、同種移植の間、レシピエント宿主に移植されたCCR5-陽性ドナーT細胞は、GVHDを媒介する。したがって、本発明の1つの態様において、ドナー骨髄細胞は、全てのCCR5+細胞の細胞死を達成するため移植前に修飾されたLukE/Luke Dを含有する組成物で処置され、それによってGVDHを予防する。
本発明の別の態様において、ドナー骨髄細胞の処置は移植片を処置することによって達成される。「移植片を処置すること」は、組成物を投与することまたは移植片材料に対して手順を実施することを意味するよう意図され、処置は宿主生物に直接影響を及ぼすよう意図されない。もちろん、GVHDの重症度が低減され、またはさらには完全に除去されうるという点で、移植片の処置の成功は宿主生物に間接的に影響を及ぼす。本発明の方法は、移植片が処置される時には移植片の位置に限定されることはない。このように、1つの態様において、移植片はドナー生物からの除去の前に処置される。別の態様において、移植片はドナー生物からの除去の後に処置される。さらに別の態様において、移植片はドナー生物からの除去の後、しかし宿主対象への移植の前に処置される。さらに別の態様において、移植片は宿主生物への移植の後に処置される。
本発明のこの局面によれば、修飾されたLukEおよびLukDを含む組成物は、併用療法の一部として投与されうる。例えば、LukE/LukD組成物は、限定されるものではないが、メトトレキセートおよびサイクロスポリンのような、別の薬学的に活性な物質と同時投与されうる。同時投与されうるさらなる薬剤には、さまざまな標的に対する抗体、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、TNFα(腫瘍壊死因子-α)、結合タンパク質、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH)のミコフェノール酸モフェチルおよび他の阻害剤、糖質コルチコイド、アザチオプリンおよび他の細胞増殖抑制剤、例えば、限定されるものではないが、代謝拮抗物質およびアルキル化剤などが含まれるが、これらに限定されることはない。1つの態様において、移植片またはドナーは、移植の前にサイクロスポリン(単独でまたはステロイドとの組み合わせで)およびメトトレキセートのような免疫抑制薬の投与によって予め処置されうる。予防の場合、免疫抑制療法は典型的には、メトトレキセート(MTX)、サイクロスポリン(CsA)、タクロリムス(FK 506)および/またはコルチコステロイドの組み合わせレジメンからなる。予防的に投与される静脈内ガンマグロブリン調製物はまた、GVHDの予防に有益であることが示された。さらに、TNFα産生を下方制御できるキサンチン誘導体ペントキシフィリンを、サイクロスポリンに加えてメトトレキセートまたはメチルプレドニゾロンのいずれかと投与して、GVHDの発生率をさらに減少させることもできる。慢性GVHDは、プレドニゾン、オゾチオプリンおよびサイクロスポリンのようなステロイドで処置されうる。また、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)および/またはウルソジオールが用いられうる。免疫抑制特性を有するサリドマイドは、慢性GVHDの処置において有望な結果を示した。サリドマイドと同様に、クロファジミンもまた、LukEおよびLukDを含む本発明の組成物と同時投与されうる。同時投与される抗体の抗体標的には、T細胞受容体(TCR)、インターロイキン-2 (IL-2)およびIL-2受容体が含まれるが、これらに限定されることはない。さらに、GVHD予防のためにCD(25)モノクローナル抗体、抗CD8モノクローナル抗体、または抗CD103抗体が同時投与されてもよい。
本発明の別の局面は、対象においてがんを予防または処置する方法に関する。この方法は、がんを有する対象またはがんを有する危険性がある対象を選択する段階と、選択した対象に、対象においてがんを処置または予防するのに有効な量で、非機能的CXCR1/CXCR2受容体結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはポリペプチド、および、任意で、単離されたLukDタンパク質またはポリペプチドを含む組成物を、投与する段階とを伴う。
本発明のこの局面による処置に適したがんには、CCR5ががんの発生または進行の媒介に関与し、かつCCR5拮抗作用が有益な治療的意義を有している、原発型および転移型の、がんが含まれる。例えば、適当ながんには、非限定的に、肝臓がん(Ochoa-Callejero et al.,「Maraviroc, a CCR5 Antagonist, Prevents Development of Hepatocellular Carcinoma in a Mouse Model」, PLOS One 8(1):e53992 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、乳がん(Velasco-Velazquez et al.,「The CCL5/CCR5 Axis Promotes Metastasis in Basal Breast Cancer」, Oncoimmunology 2(4): e23660 (2013)およびVelasco-Velazquez et al.,「CCR5 Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast Cancer Cells」, Cancer Res. 72:3839 (2012)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、肺がん(Lee et al,「Deficiency of C-C Chemokine Receptor 5 Suppresses Tumor Development Via Inactivation of NF-κB and Inhibition of Monocyte Chemoattractant Protein-1 in Urethane-Induced Lung Tumor Model」, Carcinogenesis 33(12): 2520-2528 (2012)、これは参照によりその全体の方法が本明細書に組み入れられる)、ならびに前立腺がん(Zhang et al.,「Structure Activity Relationship Studies of Natural Product Chemokine Receptor CCR5 Antagonist Anibamine Toward the Development of Novel Anti-Prostate Cancer Agents」, Eur. J. Medicinal Chem. 55:395-408 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)が含まれる。
本発明のこの局面によれば、CCR5+がん細胞を標的化するために対象に、修飾されたLukEおよびLukDを含む組成物を投与することは、他の抗がん治療法と同時に行うことができ、すなわち、組成物は併用療法の一部として投与される。したがって、本発明の1つの態様において、薬剤は化学療法薬、放射線(例えば、外照射療法もしくは小線源療法)、または抗血管新生治療薬のような1種または複数種のさらなるがん治療法と組み合わせて投与される。
併用療法に適した化学療法剤には、非限定的に、アルキル化剤(例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド(cyclophophamide)、CCNU、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、BCNU、およびブスルファン)、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、および5-フルオロウラシル)、アントラサイクリン(ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロン)、抗腫瘍抗生物質(例えば、ブレオマイシン、モノクローナル抗体(例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブ(Trastuxmab))、白金(platinium) (例えば、シスプラチンおよびオキサリプラチン)または植物性アルカロイド(例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカ・アルカロイド、タキサン、およびエピポドフィロトキシン)が含まれる。
本発明の組成物との併用治療法で用いるのに適した抗血管新生治療薬には、非限定的に、血管内皮増殖因子(VEGF)阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)阻害剤、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)アンタゴニスト、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)アンタゴニスト、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)アンタゴニスト、アンギオポイエチン受容体(Tie-2)アンタゴニスト、上皮増殖因子受容体(EGFR, ErbB)アンタゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの適当な小分子血管新生阻害剤が、当技術分野において公知であり、または臨床開発中である(例えば、Wu et al.,「Anti-Angiogenic Therapeutic Drugs for the Treatment of Human Cancer」, J Cancer Molecules 4(2):37-45 (2008)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの血管新生阻害剤には、非限定的に、ゲフィチニブ(ErbB阻害剤)、ラパチニブ(二重ErbB1/ErbB2阻害剤)、エルロチニブ、カネルチニブ(パンErbB阻害剤)、バタラニブ(VEGF受容体阻害剤)、イマチニブ(Bcr-Abl、c-kit、およびPDGF-Rの多標的化阻害剤)、スニチニブ(VEGFR、PDGFR Kit、Flt3、TetおよびCSF1Rの多標的化阻害剤)、ソラフェニブ(VEGFRおよびPDGFRの多標的化阻害剤)、パゾパニブ(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF-α、PDGFR-β、およびc-kitの多標的化阻害剤)が含まれる。あるいは、抗脈管形成治療薬はモノクローナル抗体である。適当な抗体治療薬には、非限定的に、ベバシズマブ(VEGF抗体)、IMC-1C11 (VEGFR-2抗体)、mF4-31C1 (VEGFR-3抗体)、およびビタキシン(インテグリンανβ3抗体)が含まれる。
本発明の別の局面は、黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置できる化合物を特定する方法に関する。この方法は典型的には、インビトロで、すなわち、細胞培養で行われる。この方法は、候補化合物のコレクションを提供する段階ならびにヒトCXCR1、CXCR2、および/またはDARCを発現する細胞の集団を提供する段階を伴う。本方法は、LukEDまたはHlgAB媒介性細胞傷害を誘導できる薬剤で細胞の集団を処理する段階、および処理した細胞の集団をコレクションの1種または複数種の候補化合物と接触させる段階をさらに伴う。本方法は、1種または複数種の候補化合物の存在下および非存在下において処理細胞の集団におけるLukEDまたはHlgAB媒介性細胞傷害レベルを測定する段階、ならびに1種または複数種の候補化合物の存在下および非存在下において測定されたLukEDまたはHlgAB媒介性細胞傷害レベルを比較する段階をさらに伴う。1種または複数種の候補化合物の非存在下と比べて1種または複数種の候補化合物の存在下におけるLukEDまたはHlgAB媒介性細胞傷害のレベルの低下から、黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置できる化合物が特定される。
本発明のこの局面によって用いるのに適しているヒトCXCR1/CXCR2を発現する細胞には、ヒトPMN、単球、ナチュラルキラー細胞、CD8+ T細胞サブセット、上皮細胞および内皮細胞が含まれる。本発明のこの局面によって用いるのに適しているヒトDARCを発現する細胞には、ヒト内皮細胞および赤血球が含まれる。他の適当な細胞には、CXCR1/CXCR2またはDARCを発現するように操作された任意の有核細胞、例えば、ヒトCXCR1、CXCR2、および/またはDARCポリヌクレオチド配列を含む発現構築体を安定的にまたは一過性にトランスフェクションされた細胞が含まれる。
本明細書において記述されるように、本発明のこの方法は、LukEDまたはHlgAB媒介性細胞傷害およびヒトCXCR1/CXCR2+細胞またはDARC+細胞の溶解をもたらす事象のカスケードのいくつかの局面を阻害する薬剤を特定するようにデザインされる。カスケードの一部である標的化される事象には、例えば、CXCR1/CXCR2またはDARCへのLukEまたはHlgAの結合、LukEDまたはHlgABオリゴマー化、およびLukEDまたはHlgABオリゴマーによる膜孔形成が含まれる。アッセイ法では、LukEおよびHlgA結合ドメインを含むヒトCXCR1/CXCR2もしくはDARCを発現している任意の哺乳類細胞もしくは非哺乳類細胞、適当な培地、ならびに単離されたもしくは組み換えLukE/LukDおよびHlgA/HlgB、または黄色ブドウ球菌を利用する。アッセイ法には、ヒトCXCR1/CXCR2またはDARCを発現している細胞がLukEDまたはHlgAB細胞傷害を誘導できる薬剤と接触される前に、接触される間に、または接触された後に細胞に曝露される標識された細胞傷害マーカーがさらに含まれる。標識された細胞傷害マーカーは、細胞生存性色素、細胞非透過性色素、および/または細胞溶解の指標を含みうる。本発明のこの局面にしたがって用いるのに適した例示的なスクリーニングプロトコルは、Torresらの国際特許出願第PCT/US2013/032436号に詳細に記述されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供されるが、その範囲を限定することを決して意図するものではない。
実施例1～8の材料および方法
細胞培養条件およびウイルス形質導入
特に明記しない限り、10%ウシ胎仔血清(FBS; Atlanta Biologicals)ならびにペニシリン(100 U ml-1)およびストレプトマイシン(0.1 mg ml-1) (Mediatech)を補充したRPMI中5% CO2とともに37℃で初代ヒト細胞およびTHP-1を培養した。Cxcr2または非標的shRNAの過剰発現およびレンチウイルスに基づくノックダウンは、既述のように行い(Wan et al., "Cytokine Signals Through PI-3 Kinase Pathway Modulate Th17 Cytokine Production by CCR6+ Human Memory T Cells," J. Exp. Med. 208: 1875-1887 (2011)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、1.3μg ml-1のピューロマイシン中で維持した。HEK293T細胞をDMEM (Cellgro)中5% CO2とともに37℃で培養し、上記のように補充を行った。
PBMCの単離
ニューヨーク血液センター(New York Blood Center)より匿名化されたドナーの同意を得て、血液をバフィーコートとして得た。PBMCをFicoll-Paque PLUS勾配(GE Amersham)によって血液から単離し、CCR5+細胞に対してゲーティングした後に、リンパ球および単球集団に対しての抗CD3およびCD14細胞表面染色を行った。細胞をその後、マラビロク(MVC, 100 ng ml-1)の存在下または非存在下においてLukED (75 nM)とともにインキュベートした。
CCR5阻害剤およびリガンド
マラビロクは、AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS (NIAID, NIH)を通じて入手し、100 ng ml-1の終濃度で用いた。CXCL8およびCXCL1は、BioLegendから入手し、テキストに示されている濃度で用いた。
FACS分析
細胞染色は、既述のように行った(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。FACSデータはLSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)にてFACSDivaソフトウェアを用いて得た。FlowJoソフトウェア(Treestar)を用いてデータを分析した。
抗体および色素
初代ヒト細胞の表面染色に用いた抗体には、以下が含まれた: CXCR1-APC (クローン8F1/CXCR1)、CXCR2-PE (クローン5E8/CXCR2)、CD3-PE-Cy7 (クローンUCHT1)、CD8-Pacific Blue (クローンHIT8 a)、CD14-Alexa Fluor 700 (クローンHCD14)、CD16-Alexa Fluor 488 (クローン3G8)、CD56-PerCP-Cy5.5 (クローンHCD56)、CD19- Brilliant Violet 650 (クローンHIB19)、HLA-DR-Brilliant Violet 605 (クローンL243)、CD14-FITC (クローンM5E2)、CD18-PE-Cy5 (クローンTS1/18) (BioLegend)およびCCR5-PE (クローン2D7) (BD Pharmingen)。
初代マウス細胞の表面染色に用いた抗体には、以下が含まれた: CXCR2-AF647 (クローンTG11/CXCR2) (BioLegend)、CCR5-PerCP-Cy5.5 (BD Pharmingen)、ストレプトアビジン-PerCP-Cy5.5 (BioLegend)、CD11b-PE (クローンM1/70) (BD Pharmingen)、B220-Alexa700 (クローンRA3-6B2) (BioLegend)、Ly6G-FITC (クローン1A8) (BD Biosciences)、F480-PECy7 (クローンBM8) (BioLegend)およびCD16/CD32 Fc Block (クローン2.4G2) (BD Biosciences)。固定可能な生存性色素eFluor-450およびeFluor 780は、eBioscienceから入手した。
lukEDR構築体の作出
同質遺伝子DR変異体株を重複PCRによって作出した(詳細なプライマーおよび株情報については以下の表1～3を参照のこと)。lukEDR1を作出するため、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT891; VJT297かつVJT894; またはVJT892かつVJT893で増幅させた。lukEDR2の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT895; VJT898かつVJT297; またはVJT896かつVJT897で増幅させた。lukEDR3の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT899; VJT902かつVJT297; またはVJT900かつVJT901で増幅させた。lukEDR4の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT903; VJT914かつVJT297; またはVJT904かつVJT905で増幅させた。lukEDR5の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを用い、プライマーVJT296およびVJT911; またはVJT906およびVJT297で増幅させた。lukS-PVを含んだVJT8.89由来のプラスミドを用い、プライマーVJT912およびVJT913で増幅させて、lukEDR5遺伝子座を完成させた。最終PCR産物を得るため、隣接プライマーVJT296かつVJT297を含んだPCR反応に各DNA断片を含めた。XhoIおよびBamHI制限部位を用いてpET14b-6xHis (Novagen)へ単位複製配列をクローニングし、N末端6×ヒスチジン(His)タグ付lukEDRキメラ配列を得た。
lukEDR大腸菌(E. coli)発現株の作出
pET14b-6xHis-lukEDRプラスミドを大腸菌(Escherichia coli (E. coli)) DH5αへ形質転換し、形質転換体をアンピシリン(Fisher)耐性によって選択した。陽性クローンを既述のように組み換えタンパク質の精製のために大腸菌T7 LysY/LacQ (New England BioLabs)へ形質転換した((Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); DuMont et al.,「Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis」, Mol. Microbiol. 79:814-825 (2011)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assayキットを用いて、タンパク質濃度を測定した。
ハイブリッド/変異タンパク質の作出
HlgA/DDR4を作出するため(HlgA由来のアミノ酸番号182～196を、LukE由来の対応するアミノ酸と置き換える)、NewmanゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーVJT635かつVJT1267; およびVJT1209かつVJT1266で増幅させた(詳細なプライマーおよび株情報については以下の表1～3を参照のこと)。完全な変異体遺伝子座を作出するため、得られたDNA産物を、隣接プライマーVJT635かつVJT1209を用いた最終の重複伸長PCR (sewing overlap extension PCR)反応の鋳型として用いた。BamHIおよびPstI制限部位を用いてpOS1-PlukAB-lukAS.S.-6xHisベクターへ最終の単位複製配列をクローニングし、これによってN末端6×ヒスチジンタグ付HlgA/EDR4を得た。
HlgA/SDR4を作出するため(HlgA由来のアミノ酸番号182～196を、LukS-PV由来の対応するアミノ酸と置き換える)、NewmanゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーVJT635かつVJT1263; およびVJT1209かつVJT1262で増幅させた(詳細なプライマーおよび株情報については以下の表1～3を参照のこと)。完全な変異体遺伝子座を作出するため、得られたDNA産物を、隣接プライマーVJT635かつVJT1209を用いた最終の重複伸長PCR反応の鋳型として用いた。BamHIおよびPstI制限部位を用いてpOS1-PlukAB-lukAS.S.-6xHisベクターへ最終の単位複製配列をクローニングし、これによってN末端6×ヒスチジンタグ付HlgA/SDR4を得た。
LukEP184A,G186A,P187A,G189Aを作出するため、NewmanゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーVJT629かつVJT1179; およびVJT1114かつVJT1180で増幅させた(詳細なプライマーおよび株情報については以下の表1～3を参照のこと)。完全な変異体遺伝子座を作出するため、得られたDNA産物を、隣接プライマーVJT629かつVJT1114を用いた最終の重複伸長PCR反応の鋳型として用いた。BamHIおよびPstI制限部位を用いてpOS1-PlukAB-lukAS.S.-6xHisベクターへ最終の単位複製配列をクローニングし、これによってN末端6×ヒスチジンタグ付LukEP184A,G186A,P187A,G189Aを得た。
タンパク質産生
全てのプラスミドを大腸菌DH5αへ形質転換し、アンピシリン耐性によって選択した。陽性プラスミドを次に、制限陰性の黄色ブドウ球菌RN4220コンピテント細胞へエレクトロポレーションし、その後にタンパク質産生のために黄色ブドウ球菌Newman無毒素コンピテント細胞(Newman ΔlukED, hlg::tet, lukAB::spec, hla::ermC)へのエレクトロポレーションを行った。黄色ブドウ球菌における変異体の選択は、クロラムフェニコール耐性によって行った。
ロイコトキシン処理
HEK293T細胞、THP-1、初代ヒトPBMCおよび初代マウス腹腔滲出細胞を既述のようにLukE、LukDまたはLukEDで処理した(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。全ての実験において、細胞1～2×105個を96ウェルプレートに播種した。初代ヒト細胞またはマウス細胞を用いた実験の場合、中毒を氷上で30分間実行し、細胞を次に、固定可能な生存性色素で染色し、同様に細胞表面マーカーに対する抗体で染色し、その後にフローサイトメトリー分析を行った。その他全ての細胞毒性アッセイ法の場合、細胞を37℃に加えて5% CO2で1時間毒素の存在下でインキュベートし、その後に代謝色素(Cell Titer, Promega)とともにさらに1～2時間インキュベートした。
（表１）本試験において用いた細菌株
Figure 0006990674000021
3Alonzo et al., Mol. Microbiol.83:423-435 (2012); 4Alonzo et al., Nature 493:51-55 (2013); 19Dumont et al., PNAS (2013)
（表２）これらの試験において用いたプライマー
Figure 0006990674000022
Figure 0006990674000023
Figure 0006990674000024
（表３）これらの試験において用いたプライマー
Figure 0006990674000025
3Alonzo et al., Mol. Microbiol.83:423-435 (2012); 19Dumont et al., PNAS (2013)
結合および競合アッセイ法
結合アッセイ法の場合、漸増濃度のGFP-LukEまたはGFP-LukDを5×104個のヒトPMNに加え、氷上で30分間インキュベートし、その後にFACS緩衝液中で1回洗浄し、室温で15分間固定し、引き続きフローサイトメトリー分析を行った。GFP+細胞の平均蛍光強度(MFI)を測定して、飽和結合を達成するのに必要とされる毒素濃度を確立した。残りの競合アッセイ法の場合、漸増濃度のLukEまたはLukS-PVのどちらかを30分間、一定の飽和濃度のLukE-GFP (300 nM)と共インキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、FACS固定緩衝液中で15分間固定し、FACS緩衝液中で再度洗浄し、フローサイトメトリーにより結合について評価した。平均GFP蛍光強度は、300 nM GFP-LukEとのインキュベーションによって観察された最大蛍光に基づき、%GFP+として表される。CXCL8またはCXCL1を用いた競合アッセイ法の場合、用量反応量のどちらかのケモカインを氷上で30分間、ヒトPMNに加えておき、引き続いて300 nM GFP-LukEの添加を行った。細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、FACS固定緩衝液中で15分間固定し、FACS緩衝液中で再度洗浄し、上記のようにフローサイトメトリーにより結合について評価した。GraphPad PRISMソフトウェア(バージョン5.0f, GraphPad PRISM Software, Inc.)を用いて、これらのアッセイ法の結果をグラフにより描いた。
黄色ブドウ球菌染色体組み込み株の作出
WT LukEDによる補完のため、lukED遺伝子座全体を、以下のプライマー: VJT605およびVJT299を用いて黄色ブドウ球菌NewmanゲノムDNAから増幅させ、染色体組み込みを記述のように(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)行った。lukEDR4D組み込み構築体を作出するため、lukEDプロモーター領域を、プライマーVJT605およびVJT1019を用いて黄色ブドウ球菌NewmanゲノムDNAから増幅させた。lukEDR4コード領域を、鋳型としてlukEDR4を含んだVJT34.58株からの精製プラスミドを用いて増幅させ、プライマーVJT1020およびVJT1021で増幅させた。プライマーVJT1022およびVJT299を用いてlukDおよびlukEとlukDとの間の遺伝子間領域を増幅させるために、黄色ブドウ球菌NewmanゲノムDNAを用いた。最終の重複PCR反応を、得られたDNA断片ならびにプライマーVJT605およびVJT299でセットアップした。lukEDおよびlukEDR4D構築体を大腸菌DH5αへ形質転換し、クローンをアンピシリン耐性によって選択した。精製されたプラスミドを、BamHIおよびPstI制限部位を用いてpJC1112へクローニングし、DH5αへ形質転換した。得られた組み換えプラスミドを、SaPI-1ファージインテグラーゼをコードするプラスミドpRN7023を含んだRN9011株へのエレクトロポレーションにより導入して、SaPI-1部位への単一コピーの染色体組み込みを容易にし、既述のようにクロラムフェニコールおよびエリスロマイシン耐性に基づき選択をした(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。SaPI-1組み込み済の構築体をその後、既述の方法を用いて、VJT8.16, Newman ΔlukED株へ形質導入した(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
空ベクターを含んだΔlukED株を作出するため、pJC1112ベクターを上記のようにRN9011へエレクトロポレーションした。バクテリオファージを介した形質導入を次に用いて、既述の方法により黄色ブドウ球菌株Newman ΔlukEDへ組み込み済の補完ベクターを導入した(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
細菌株および増殖条件
大腸菌株を、アンピシリンを補充したルリアベルターニ(LB)ブロス中、180 RPMで振盪させながら30℃で日常的に増殖させた。大腸菌由来のタンパク質を精製するため、細菌を1:100で、アンピシリンを補充したLBへ継代培養し、220 RPMで振盪させながら37℃でインキュベートし、その後に16℃および220 RPMで0.1 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの終濃度により終夜誘導した。黄色ブドウ球菌株を表示のように抗生物質の存在下または非存在下においてRPMIに加えて10%カザミノ酸またはトリプチックソイブロス中、180 RPMで振盪させながら37℃で日常的に増殖させた。黄色ブドウ球菌Newman無毒素株を作出するため、既述されているNewman ΔlukED親株(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に、hlgACB::tet、引き続きlukAB::spec、その後にhla::ermをコードするファージで形質導入した。
lukEDおよびlukEDR4Dを含んだ黄色ブドウ球菌Newman無毒素株の作出
エクスビボでのLukEDおよびその誘導体LuEDR4Dの効果の研究は、インビトロ増殖の条件下での毒素の低レベル発現(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)およびエクスビボアッセイ法において用いられる類似の細胞種を標的とする他のロイコトキシンのインビトロ存在量の多さによって複雑化される。これらの複雑化させる要因を克服するため、分離してロイコトキシン活性を評価するシステムを、上記の無毒素Newman株ΔΔΔΔ(ΔlukED, Δhlg::tet, ΔlukAB::spec, Δhla::erm)、ならびにプラスミドに基づくLukEDおよびその誘導体LuEDR4Dの発現の使用によって実施した。lukEDおよびlukEDR4D遺伝子座をBamHIおよびPstI制限部位とともに、プライマーVJT629およびVJT630を用いて上記のpJC1112染色体組み込み株から増幅させた。単位複製配列を、既述のように(Dumont et al.,「The Staphylococcus aureus LukAB Cytotoxin Kills Human Neutrophils by Targeting the CD11b Subunit of the Integrin Mac-1」, PNAS (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) lukAプロモーターの制御下で6×Hisタグ付ロイコトキシンを発現するようデザインされた改変pOS1ベクター(pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis)へサブクローニングし、引き続いて無毒素黄色ブドウ球菌株Newman ΔΔΔΔ(ΔlukED, Δhlg::tet, ΔlukAB::spec, Δhla::erm)への形質転換を行った。
エクスビボ感染実験
無毒素(空)、lukEDまたはlukEDR4Dを含んだpOS1-plukA-lukAs.s.-6xHisベクター構築体を含んだ黄色ブドウ球菌株を4.5時間継代培養し、RPMI + 10% FBS中で1 mlあたり1×109 CFUへの規準化を行った。細胞を1:10で希釈し、20μlを、96ウェルプレート中に播種された2×105個のPMNを含有する培地80μlに加えた。180 RPMで振盪させながら37℃で3.5時間感染を行った。2μg ml-1のリソスタフィンを180 RPMで振盪させながら37℃で20分間加えて、全ての細菌を死滅させた。細胞を1,500 RPMおよび4℃で5分間遠心分離し、引き続いてFACS固定緩衝液(PBS + 2% FBS + 2%パラホルムアルデヒド + 0.05%アジ化ナトリウム)中での固定を行った。フローサイトメトリーにより毒素媒介性の死滅化を分析するため、ゲート生細胞からの細胞枯渇を評価した。生ゲートに残存している細胞を、0%死に設定した、空のpOS1-plukA修飾空ベクター(無毒素)を含んだNewman ΔΔΔΔ株のものと比較することによって、%細胞死を計算した。
LukEDおよびCXCR1またはCXCR2との間の相互作用を調べるための生化学的アッセイ法
HEK293T細胞に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてN末端HAタグ付CXCR1またはCXCR2 (Missouri S&T cDNA Resource Center)をコードするcDNAを一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後に、5 mM EDTAを含有するPBSで細胞を引きはがし、溶解緩衝液(PBS + 10 mMイミダゾール(Fisher) + 1% Brij O10 (Sigma) + 1 mM PMSF (Thermo Scientific) + 2×プロテアーゼ阻害剤ペレット(Roche))を用いて1時間、膜タンパク質を可溶化した(およそ細胞1×106個/条件)。Hisタグ付LukEおよびLukDを2時間、平衡化Ni-NTA樹脂(Qiagen)とともにインキュベートし、引き続いて溶解緩衝液中での3回の洗浄を行った。溶解物および樹脂をその後、2時間ともにインキュベートし、引き続いて溶解緩衝液中での3回の洗浄および4×SDSサンプル緩衝液45μl中での樹脂の最終の再懸濁を行った。タンパク質サンプルを80Vにて10% SDS-PAGEゲル上で泳動し、引き続いて1 Ampにて1時間、ニトロセルロース膜(GE)への転写を行った。膜を1時間、PBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳でブロッキングし、毒素の場合にはPBS + 0.01% Tween-20中で1:3,000に希釈した抗His抗体(Cell Sciences)または受容体の場合にはPBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳中で1:1,000に希釈した抗HA抗体(Covance)のどちらかとともに4℃で終夜インキュベートした。翌日、二次ヤギ抗マウスHRP抗体(Bio-Rad)をPBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳中で1時間、膜に加えておき、引き続いてオートラジオグラフィーフィルム(LabScientific, Inc)上での検出のためにSuper Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific)とのインキュベーションを行った。
カルシウム動員の測定
既述のように(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)蛍光カルシウム指示薬Fluo4-AM (Invitrogen)を用いてヒトPMN上でのCXCR1およびCXCR2の活性化を評価した。手短に言えば、細胞をハンク平衡塩溶液(HBSS)中、3μMのFluo4-AMとともに室温で30分間インキュベートし、引き続いてHBSS中での3回の洗浄および30分間37℃での平衡化を行った。ベースラインのカルシウムレベルを60秒間、フローサイトメーターにて経時的に分析した。この時点で、CXCL8、CXCL1またはLukE (300 nM)を細胞に加え、経時的な平均蛍光強度をさらに4分間評価した。5秒超の間隔での平均蛍光強度をグラフ表示のためにプロットした。
マウス・インビトロおよびインビボ実験
インビトロでのLukED媒介性のマウス細胞死滅化を評価するため、C57BL/6 WTマウス(Taconic)に1×107 CFUの、熱死滅化された黄色ブドウ球菌Newman ΔlukEDを腹腔内注射した。注射から24時間後に、別用量の1×107 CFUの、熱死滅化された黄色ブドウ球菌Newman ΔlukEDを先のように注射した。さらに24時間後、マウスを殺処理し、8 mlのPBSを用い腹膜腔洗浄によって免疫細胞を集めた。ACK溶解緩衝液(Gibco) 2 mlを用いて赤血球を溶解させ、その後にRPMI + 10% FBS中での残存腹腔滲出細胞の再懸濁を行った。細胞をPBS、LukEDまたはLukEDR4D (300 nM)とともにインキュベートし、氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、その後に固定可能な生存性色素eFluor-450で染色し、引き続いてCD11b、B220、F480、CD3、Ly6G、CCR5およびCXCR2抗体での細胞表面染色を行った。特異的免疫細胞集団の細胞生存性をその後、LSRIIフローサイトメーター(BD)にて分析した。FACSプロットは、少なくとも3匹の独立的な動物から単離した細胞から得られた結果を代表するものである。細胞死を定量化し、eFluor-450+細胞の割合としてグラフ表示した。
インビボ実験の場合、8週齢雌性C57BL/6マウス(Taconic)をアベルチン(tert-アミル-アルコールに溶解され、滅菌生理食塩水中2.5% v/vの終濃度に希釈された2,2,2-トリブロモエタノール) 250μlで麻酔し、引き続いて1×107 CFUの同質遺伝子Newman ΔlukED、ΔlukED::lukEDおよびΔlukED::lukEDR4Dの眼窩後方注射を行った。感染から96時間後に、マウスを殺処理し、器官を集め、ホモジナイズして、細菌負荷(コロニー形成単位, CFU)を評価した。免疫細胞に及ぼすこれらの菌株の感染の影響を判定するため、40/80 Percoll (GE Healthcare)密度勾配遠心分離を用いて器官免疫細胞懸濁液を精製し、その後、既述のように(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)処理かつ染色した。特異的免疫細胞集団の細胞生存性をLSRII (BD)フローサイトメーターにてフローサイトメトリー分析により判定した。FACSプロットは1群あたり少なくとも9匹の感染動物から得られた結果を代表するものである。細胞死を定量化し、eFluor450+細胞の割合としてグラフ表示した。
生存実験の場合には、同質遺伝子株Newman ΔlukED、ΔlukED::lukEDおよびΔlukED::lukEDR4Dの3時間継代培養物を、PBSを用いて1ミリリットルあたり5×108 CFUに規準化した。5～6週齢の雌性ND4マウス(Harlan)をアベルチン250μlで腹腔内麻酔し、引き続いて5×107 CFUの最終CFUカウントのため、規準化された細菌100μlの眼窩後方注射を行った。猫背の姿勢、立毛、体重減少、食べ物または飲み物の摂取不能、運動失調および後肢まひのような、病的状態の兆候に到達するまで経時的にマウスの生存についてモニタリングし、その到達の時点でマウスをすばやく殺処理し、生存曲線を経時的(時間)にプロットした。
黄色ブドウ球菌タンパク質分泌の細胞外タンパク質プロファイルおよび免疫ブロット分析
黄色ブドウ球菌株Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukED、Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukEDR4D、Newman ΔlukED + pJC1112-、Newman ΔlukED + pJC1112-lukED、Newman ΔlukED + pJC1112-lukE DR4DおよびNewman ΔlukEDΔhlgACBを5時間、180 RPMで振盪させながら37℃で後期対数期まで増殖させた。細菌培養物をその後、15分間4,000 RPMで遠心分離し、引き続いて細菌上清1.3 mlの除去およびトリクロロ酢酸の添加(10%の終濃度)を行った。タンパク質を4℃で終夜沈殿させた。翌日、沈殿したタンパク質を30分間15,000 RPMで遠心分離によりペレットとし、100%エタノールで洗浄し、1×サンプル緩衝液60μlに再懸濁した。サンプルをボルテックスし、SDS-PAGEの前に5分間煮沸した。抗His、抗LukE、および抗LukD免疫ブロットの場合、黄色ブドウ球菌細胞外タンパク質を10% SDS-PAGEゲル上で分離し、引き続いて1時間1 Ampでのニトロセルロースへの転写を行った。膜をPBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳中で1時間ブロッキングし; 以下の希釈: 抗His (1:3,000)、抗LukE (1:5,000)、および抗LukD (1:5,000)にて一次抗体でプローブし; PBSTで3回洗浄し; 二次ヤギ抗マウス(抗His抗体の場合)または抗ウサギ(抗LukE抗体および抗LukD抗体の場合) Alexafluor-680結合抗体で1時間プローブし; 引き続いてOdyssey撮像装置(LI-COR)での撮像を行った。LukEDまたはLukEDR4D (Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukED、Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukAlukAs.s.-6xHis-lukEDR4D)を過剰発現する菌株の場合、LukEDR4変異体に対するLukE抗体の親和性の減少を実証するために、クマシー染色されたゲルを示す。内因性レベルのLukEDおよびLukEDR4D (Newman ΔlukED + pJC1112-、Newman ΔlukED + pJC1112-lukED、Newman ΔlukED + pJC1112-lukEDR4D)を産生する菌株の場合、HlgC3との抗LukE抗体の交差反応性に起因してΔlukEDΔhlgACB二重変異体を含めた。全ての画像は少なくとも3回の独立した実験を代表するものである。α-LukEおよびα-LukD抗体は、既述のように作出された。
LukE/LukS-PV構造多様性の構造モデリング
LukEおよびLukS-PVアミノ酸配列を、ClustalWで整列させ、ESPriptを用い配列多様性の程度にしたがってRislerマトリックスでスコア化した。スコアを色の傾斜(赤色、橙色、黄色、緑色、明るい青色、暗い青色)によってLukE構造表面に表示したが、ここで厳密に保存されていた残基には赤色をつけ、最も相違する残基には暗い青色をつけた。保存的置換は中間色によって表されている。構造図は全てPyMOLを用いて準備した。
実施例1-LukEDはCXCR1およびCXCR2を標的化して単球およびPMNを死滅させる
黄色ブドウ球菌は、世界中で相当な罹患率および死亡率に関与しているグラム陽性細菌である(DeLeo & Chambers,「Reemergence of Antibiotic-Resistant Staphylococcus aureus in the Genomics Era」, J. Clin. Invest. 119:2464-2474 (2009)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。この生物の病原性は、免疫回避およびその後の疾患顕在化に寄与するものと考えられる病毒性因子の備蓄庫の作出に依る(Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012); Nizet, V.,「Understanding How Leading Bacterial Pathogens Subvert Innate Immunity to Reveal Novel Therapeutic Targets」, J. Allergy Clin. Immunol. 120: 13-22 (2007)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。ヒト感染と関連する菌株は、最大5種の異なる二成分性ロイコトキシン(LukSF-PV/PVL、HlgAB、HlgCB、LukED、およびLukAB/HG)を産生することができる(Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins」, PLoS Pathog 9:e1003143 (2013); Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013); Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012); Panton & Valentine,「Staphylococcal Toxin」, The Lancet 506-508 (1932); Loffler et al.,「Staphylococcus aureus Panton- Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils」, PLoS Pathog. 6:e1000715 (2010); Labandeira-Rey et al.,「Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin Causes Necrotizing Pneumonia」, Science 315: 1130-1133 (2007); Yamashita et al.,「Crystal Structure of the Octameric Pore of Staphylococcal Gamma-Hemolysin Reveals the Beta-Barrel Pore Formation Mechanism by Two Components」, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 108: 17314-17319 (2011); Dalla Serra et al.,「Staphylococcus aureus Bicomponent Gamma-Hemolysins, HlgA, HlgB, and HlgC, Can Form Mixed Pores Containing All Components」, J. Chem. Inf. Model. 45: 1539-1545 (2005); Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003); Gravet et al.,「Characterization of a Novel Structural Member, LukE-LukD, of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family」, FEBS Lett. 436:202-208 (1998); DuMont et al.,「Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis」, Mol. Microbiol. 79:814-825 (2011); Dumont et al.,「Staphylococcus aureus Elaborates Leukocidin AB to Mediate Escape From Within Human Neutrophils」, Infect. Immun. 81: 1830-1841 (2013); Ventura et al.,「Identification of a Novel Staphylococcus aureus Two-Component Leukotoxin Using Cell Surface Proteomics」, PLoS One 5:e11634 (2010)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの毒素はヒト好中球(多形核細胞; PMN)、つまり細菌感染に対する防御に重要な先天性免疫細胞を強力に標的化して死滅させる(Loffler et al.,「Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils」, PLoS Pathog. 6:e1000715 (2010)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。何年にもわたって、これらの毒素は余剰であるものと考えられていたが、しかしその独特な向細胞性を促進する細胞因子に関する最近の特定によって、そうではないことが証明された(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013); Spaan et al.,「The Staphylococcal Toxin Panton-Valentine Leukocidin Targets Human C5a Receptors」, Cell Host & Microbe 13:584-594 (2013); Dumont et al.,「The Staphylococcus aureus LukAB Cytotoxin Kills Human Neutrophils by Targeting the CD11b Subunit of the Integrin Mac-1」, PNAS (2013)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。初代ヒト末梢血単核細胞(PBMC)に及ぼすLukEDの効果を調べている間に、細胞表面のCCR5を生来欠いている、Δ32Ccr5個体から単離されたPBMC内の単球(Oswald-Richter et al.,「Identification of a CCR5-Expressing T Cell Subset That is Resistant to R5-Tropic HIV Infection」, PLoS Pathog. 3:e58 (2007)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)がLukEDを介して、CCR5非依存的に標的化されることが観察された(図1A)。同様に、Ccr5+/+個体から単離されたPBMC由来の単球は、LukED媒介性のCCR5+細胞死滅化を遮断することが知られているCCR5アンタゴニストであるマラビロクの存在下でさえもLukEDに対して感受性であった(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) (図2)。さらに、Ccr5+/+およびΔ32Ccr5ドナー由来のPMNはLukEDに等しく感受性であったこと(図1B)から、LukEDがCCR5非依存的にヒト単球およびPMNを標的化することが示唆される。
インビボでの黄色ブドウ球菌病毒性に及ぼすLukEDのCCR5非依存的寄与を評価するため、Ccr5+/+およびCcr5-/-マウスに同質遺伝子黄色ブドウ球菌の野生型(WT)株およびΔlukED株を全身感染させ、感染した肝臓における細菌負荷を感染から96時間後に評価した。ΔlukED感染Ccr5+/+マウスは、WT株または補完株(ΔlukED::lukED)を感染させたものと比べてCFUの2-log低減を示した(図1C)。従前の研究と一致して、WT黄色ブドウ球菌を感染させたCcr5-/-マウスにおける細菌負荷は、WT黄色ブドウ球菌を感染させたCcr5+/+マウスと比べて1-log低減された(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493 :51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。対照的に、ΔlukED株を感染させたCcr5-/-マウスは、WT黄色ブドウ球菌を感染させたCcr5+/+マウスと比べて細菌負荷の3-logの低減を示したことから、黄色ブドウ球菌病原性に対するLukEDの強力なCCR5非依存的寄与が示唆された(図1C)。まとめてこれらのデータから、標的化が全身性黄色ブドウ球菌感染の樹立に寄与する、PMNおよび単球の表面上の代替的LukED細胞受容体の存在が示唆された。
これらの標的を特定するため、食細胞の表面に存在するケモカイン受容体を、ヒト胎児腎臓293T細胞(HEK293T)に異所的に発現させ、その後にLukEDの添加を行った。この手法を用いて、ケモカイン受容体CXCR1、CXCR2、およびDARCは、HEK293T細胞をLukEDに感受性にさせるのに十分であったが、しかしCXCR2を標的にしない相同なロイコトキシンLukSF-PVに対してはそうでなかったこと(図1D、図3、および図5A)が実証された(Spaan et al.,「The Staphylococcal Toxin Panton-Valentine Leukocidin Targets Human C5a Receptors」, Cell Host & Microbe 13:584-594 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
CXCR1およびCXCR2はそれぞれ、インターロイキン8受容体αおよびβ鎖としても知られている(Stillie et al.,「The Functional Significance Behind Expressing Two IL-8 Receptor Types on PMN」, J. Leukoc. Biol. 86:529-43 (2009)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらのサイトカイン受容体は相互作用して、PMNの表面においてヘテロ二量体およびホモ二量体複合体を形成し、感染の部位への免疫細胞の動員を促進する、IL8としても公知の、CXCL8の高親和性結合を容易にする(Stillie et al.,「The Functional Significance Behind Expressing Two IL-8 Receptor Types on PMN」, J. Leukoc. Biol. 86:529-43 (2009)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。CXCR1およびCXCR2は、77%のアミノ酸同一性を示す相同タンパク質であり、骨髄細胞系列、主にPMNおよび単球において(Stillie et al.,「The Functional Significance Behind Expressing Two IL-8 Receptor Types on PMN」, J. Leukoc. Biol. 86:529-43 (2009)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、ならびにナチュラルキラー細胞、CD8+ T細胞サブセット、上皮細胞および内皮細胞において発現される。対照的に、Fy糖タンパク質(FY)またはCD234としても公知の、ダッフィ抗原ケモカイン受容体(DARC)は、赤血球(RBC)および内皮細胞の表面に主として見出される。DARCはCCおよびCXCケモカインの「シンク」であり、これは血流から過剰なケモカインを除去するものと思われる。DARCはまた、ヒトマラリア原虫の三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)およびサルマラリア原虫(Plasmodium knowlesi)の受容体である。まとめて、LukEDがCXCR1/CXCR2およびDARCを結合するという発見は、LukEDがそれぞれ、PMNおよびRBCをいかにして標的化するかということの説明となる。
PMNおよび末梢血単球の大部分がLukEDに対するその感受性と一致して、CXCR1および/またはCXCR2の両方に対して陽性であった(図1Eおよび1F)。さらに、CXCR2しか提示しない、ヒト単球細胞株THP-1におけるCxcr2 shRNAを用いたレンチウイルスに基づくCXCR2ノックダウン(Liu-Bryan et al.,「The CXCR1 Tail Mediates Beta1 Integrin-Dependent Cell Migration Via MAP Kinase Signaling」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 332: 117-125 (2005)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) (図5B～5C)は、非標的shRNA対照と比べて細胞をLukED死滅化に対して抵抗性にした(図1G)。これらのデータから、LukEDを介した宿主細胞の死滅化にはCXCR1またはCXCR2が必要かつ十分であることが実証される。
実施例2- CXCR1、CXCR2、およびDARCはまた、細胞をHlgAに対して感受性にする
黄色ブドウ球菌ロイコトキシンの共通の特徴は、それらが全て、PMNを標的化して死滅しうるということである(Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012)およびAlonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。本明細書において記述される所見から、LukEDがCXCR1/CXCR2を標的化することによりPMNを死滅させることが示唆される。LukEDはLukSF-PV、HlgABおよびHlgCBとの有意なアミノ酸同一性(70%超)を示すので、これらの受容体がまた、宿主細胞をこれらのロイコトキシンに対して感受性にするかどうかについても評価した。CCR5ではなく、CXCR1、CXCR2、およびDARCは、HlgCBまたはLukSF-PVに対してではなく、HlgABに対して細胞を感受性にした(図4A～4B)。HlgCBではなくHlgABがこれらの受容体を標的化するという知見から、HlgAがこの毒素の指向性に関与するサブユニットであることが示唆される。DARCがHlgAB細胞毒性を補助するという所見はまた、この毒素が溶血活性を示すという知見と一致している。
実施例3- LukEDはCXCR1およびCXCR2へのLukEの結合を介してPMNを標的化する
黄色ブドウ球菌に対する防御での主な役割のため(Rigby & DeLeo,「Neutrophils in Innate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections」, Semin. Immunopathol. 34:237-259 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、本明細書において記述される研究の残りは、LukEDを介した初代PMNのCXCR1/CXCR2標的化に焦点を合わせる。結合アッセイ法を利用したが、ここではPMNを緑色蛍光タンパク質融合LukEまたはLukD (GFP-LukEまたはGFP-LukD)とともにインキュベートした(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。GFP-LukEだけが用量依存的かつ飽和可能な形でPMNに結合し、その一方でGFP-LukDは飽和不能な表面結合を示した(図6A)。GFP-LukEの結合はLukEで競合除去されたが、等価なPVLサブユニットLukS-PVではそうでなかったこと(図6B)から、CXCR1/CXCR2との特異的相互作用が示唆された。
CXCR1/CXCR2は、損傷および感染に応答して宿主により産生されるケモカインリガンドCXCL8に主に応答する(Nasser et al.,「Differential Activation and Regulation of CXCR1 and CXCR2 by CXCL8 Monomer and Dimer」, J. Immunol. 183:3425-3432 (2009); Stillie et al.,「The Functional Significance Behind Expressing Two IL-8 Receptor Types on PMN」, J. Leukoc. Biol. 86:529-543 (2009)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。CXCL8に加えて、CXCR2もケモカインCXCL1に応答する(Nasser et al.,「Differential Activation and Regulation of CXCR1 and CXCR2 by CXCL8 Monomer and Dimer」, J. Immunol. 183 :3425-3432 (2009); Allen et al.,「Chemokine: Receptor Structure, Interactions, and Antagonism」, Annu. Rev. Immunol. 25:787-820 (2007)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらのケモカインがLukED媒介性の細胞毒性を阻害できるかどうか試験するため、PMNをCXCL8またはCXCL1のどちらかの存在下においてLukEDで処理した。CXCL8はLukEDを介したPMN死を防いだが、しかしCXCL1ではそうでなかったこと(図6C)から、PMNをLukED媒介性の死滅化から防御するためには両受容体の遮断が必要とされることが示唆される。CXCL8は、細胞毒性の必要条件である細胞表面へのLukEの結合を防ぐことによりPMNをLukEDから防御した(図6D)。LukEおよびCXCL8はともに、CXCR1/CXCR2を標的化するが、それらは同じ能力まで受容体を結合するようには思われない。というのは、PMNとのインキュベーションによってLukEはカルシウム動員を誘発できないからである(図7)。LukEDPMN結合試験と一致して、プルダウン実験から、LukDではなくLukEがCXCR1およびCXCR2の両方と複合体を形成することが明らかにされた(図6E)。
実施例4-多様性領域4におけるLukEアミノ酸残基番号182～196は、CXCR1およびCXCR2+細胞のLukED標的化に必要とされる
LukEおよび高度に相同なロイコトキシンLukS-PVは、71%のアミノ酸同一性を共有するが、しかしLukS-PVはPMNを標的化して死滅させるためにCXCR1/CXCR2受容体を用いない(Spaan et al.,「The Staphylococcal Toxin Panton-Valentine Leukocidin Targets Human C5a Receptors」, Cell Host & Microbe 13:584-594 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) (図1D)。LukEおよびLukS-PVのアミノ酸配列アライメントから、有意な配列多様性を含んだ5つの領域(多様性領域1～5; DR1～5)が明らかにされた(図8)。これらのDRは、受容体の認識に関与するものと仮定されている、LukEおよびLukS-PV構造のrimドメインに主として位置している(図9A～9B) (Menestrina et al.,「Ion Channels and Bacterial Infection: The Case of Beta-Barrel Pore-Forming Protein Toxins of Staphylococcus aureus」, FEBS Lett. 552:54-60 (2003)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの5つのDRのいずれかがヒトPMNに対するLukEの特異性の付与に関与するかどうか試験するため、ハイブリッドLukE/S-PV毒素が作出された。LukE/S-PVハイブリッドタンパク質を精製し、LukDと等モル比で混合し、PMNとともにインキュベートして、その細胞毒性活性を評価した。LukEDR4DおよびLukEDR5D毒素のみ、WT LukEDと比べてPMNに対するその細胞毒性が減弱された(図9C)。
LukEDR4およびLukEDR5ハイブリッドが示す細胞毒性の欠如がCXCR1/CXCR2発現細胞に対して特異的であったかどうか評価するため、CCR5+細胞に対するその活性についても試験した。また、LukEDR5Dは同様にCCR5+細胞の死滅化が損なわれていたことから、受容体標的化ではなく毒素活性にDR5が必要とされることが示唆された(図9C, 9D)。顕著には、LukEDR4DはWT LukEDのものと類似の能力でCCR5+細胞を標的化できたことから、DR4だけがCXCR1およびCXCR2の認識に関与することが示唆された(図9D)。PBMCのさらなる分析から、CXCR1発現を通じて排他的に、LukEDがまた、NK細胞の大部分およびCD8+ T細胞のサブセットに対して細胞毒性であることが明らかにされた(図10)。さらに、LukEDR4D変異体はCCR5のその発現にもかかわらず単球を死滅させる際のその能力が低減されたこと(図10)から、CXCR1/CXCR2はLukEDを介したこれらの骨髄細胞系列細胞の標的化に好ましい受容体でありうることが示唆された。
野生型LukEとは対照的に、LukEDR4はPMNの原形質膜への結合についてGFP-LukEと競合できなかったことは、CXCR1/CXCR2+細胞の認識にはこのドメインが欠かせないことを立証するものであった(図9E)。LukE DR4の15アミノ酸配列(残基番号182～196)は、CXCR1/CXCR2に対するLukEの指向性を決定しうる、LukSPVのものとは異なる極性表面を提示する2つのグリシン残基(G186およびG189)ならびに2つのプロリン残基(P184およびP187)を含んだループを形成する。
エクスビボ感染中の黄色ブドウ球菌を介したPMN死滅化に対してのLukEDによるCXCR1およびCXCR2標的化の寄与についても調べた。黄色ブドウ球菌は、PMNを死滅させうる一連の毒素を産生するので、主要な毒素の全てを欠いている黄色ブドウ球菌株の操作を行い、ここではlukEDまたはlukEDR4Dがプラスミドからトランスに発現された(図11A)。予想通り、無毒素黄色ブドウ球菌株はPMNを死滅させることができなかったのに対し、lukEDをトランスに補完された無毒素株はこれらの細胞を死滅させることができた(図9G)。LukED産生黄色ブドウ球菌株の細胞毒性活性は、CXCL8により阻害され、LukEDR4D産生株はWT LukED産生株と比べて顕著に低減されたPMN死滅化を示した(図9G)。重要なことに、LukEDR4D産生株によって示される細胞死滅化の欠損は、CXCR1/CXCR2+細胞に対して特異的であった。というのは、CCR5+細胞がLukEDおよびLukEDR4D産生株の両方に対して等しく感受性であったからである(図9H)。
実施例5-LukED媒介性のCXCR1およびCXCR2+細胞死滅化はマウス全身感染モデルにおいて黄色ブドウ球菌の病原性に寄与する
LukEDがまた、CXCR1/CXCR2依存的にマウス白血球を死滅させるかどうか評価するため、マウス腹腔滲出細胞(PEC)をLukEDまたはLukEDR4Dで処理した。LukEDはおよそ79%のPMNを死滅させたが、LukEDR4Dは顕著に損傷され、これらの細胞のおよそ8%を死滅させただけであった。PMNに及ぼす影響とは対照的に、PEC集団内由来のCCR5+マクロファージはLukEDおよびLukEDR4Dの両方に対して等しく感受性であって(図12Aおよび13A)、LukEDが厳密にCCR5依存的にこれらの細胞を死滅させるという所見と一致していた(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。さらに、同質遺伝子黄色ブドウ球菌ΔlukED、ΔlukED::lukEDまたはΔlukED::lukEDR4D株を感染させた組織由来のPMNの生存性を評価した(図11B)。黄色ブドウ球菌ΔlukED::lukEDR4D感染マウス由来のPMNは、ΔlukED感染マウスと同様に、ΔlukED::lukED感染マウスのものと比べて毒素媒介性の死から大部分が保護された。顕著には、ΔlukED::lukEDR4D感染マウス由来のPMNは、ΔlukED感染マウス由来のPMNと同じくらい健常であったこと(図12Bおよび13B)から、CXCR1/CXCR2とのDR4ドメインの相互作用がインビボでのPMNの標的化に必要とされることが示唆された。
LukEDは、黄色ブドウ球菌血流感染に苦しむマウスにおいて観察された死亡率の一因となる(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。この表現型の付与におけるLukED媒介性のCXCR1/CXCR2標的化の役割を評価するため、同質遺伝子黄色ブドウ球菌ΔlukED、ΔlukED::lukED、またはΔlukED::lukEDR4D株を全身感染させた動物の生存についてモニタリングした(図11B)。予想通り、ΔlukED株を感染させたマウスは感染を生き延びたが、ΔlukED::lukED補完株を感染させたマウスは感染のために死んだ(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。対照的に、ΔlukED::lukEDR4D感染マウスはΔlukED::lukED補完株と比べて顕著に保護された(図12C)。これらの所見から、LukED媒介性のCXCR1またはCXCR2標的化がインビボで黄色ブドウ球菌の病原性を促進することが示唆される。
LukED細胞受容体としてのCXCR1およびCXCR2の特定は、CCR5を欠く白血球を死滅させるこの毒素の能力の説明となる(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。PMNは感染に対する最初の応答体であり、PMN機能の欠陥は黄色ブドウ球菌感染に対する異常な感受性を引き起こすので(Rigby & DeLeo,「Neutrophils in Innate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections」, Semin. Immunopathol. 34:237-259 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、黄色ブドウ球菌のような病原体がLukEDのような病毒性因子を産生して、これらの細胞を死滅させるということは理にかなっている。しかしながら、PMNの持続的機能はまた、その持続的動員および感染の部位で分泌される炎症性メディエータを通じて増強された効力または寿命に依る。実際に、好中球またはT細胞、とりわけIL-17またはIFNγを分泌するエフェクタサブセットの定量的および定性的破壊は、黄色ブドウ球菌感染に対する感受性を大いに増大させる(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013); Cho et al.,「IL- 17 is Essential for Host Defense Against Cutaneous Staphylococcus aureus Infection in Mice」, J. Clin. Invest. 120: 1762-1773 (2010); Lin. et al.,「Th1-Th17 Cells Mediate Protective Adaptive Immunity Against Staphylococcus aureus and Candida Albicans Infection in Mice」, PLoS Pathog. 5:e1000703 (2009)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。したがって、LukEDは多様な宿主ケモカイン受容体のその認識を通じて免疫防御の両腕を一意的に標的化する。CXCR1/CXCR2の使用を通じて、LukEDは大部分は先天的防御、好中球、単球、およびNK細胞を標的化する。ところがCCR5+細胞を標的化することにより、LukEDはT細胞サブセット(Th1およびTh17細胞)ならびに抗原提示専門細胞を排除する(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)が、そのどれも抗Staph免疫において決定的に重要である。宿主免疫応答の一時的な性質および感染治癒に関与する多様な細胞種のため、CXCR1/CXCR2またはCCR5のどちらかのLukED標的化の遮断(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)は、インビボにおいて増強された生存性をもたらす。かくして、本明細書において記述される所見から、LukEDを遮断する戦略は、生命を脅かすヒト黄色ブドウ球菌感染に対する有効な治療的または予防的手法であることが示唆される。
実施例6-多様性領域4におけるHlgAアミノ酸残基番号180～192は、ヒト好中球(hPMN)、CXCR1/CXCR2+細胞のHlgAB標的化に必要とされる
LukEおよびHlgAは70%超のアミノ酸同一性を共有し、ともにCXCR1およびCXCR2受容体を標的化してhPMNを死滅させる。LukE DR4ドメインに対応するHlgAにおけるアミノ酸(すなわち、HlgAアミノ酸番号180～192)がまた、CXCR1/CXCR2の標的化に関与するかどうか評価するため、いくつかのハイブリッドHlgAタンパク質の操作が行われた。HlgA DR4ドメインをLukE (HlgALukE-DR4)またはLukS-PV (HlgALukS-DR4) DR4ドメインと交換した。HlgALukE-DR4およびHlgALukS-DR4ハイブリッドタンパク質を精製し、HlgBと等モル比で混合し、hPMNとともにインキュベートして、その細胞毒性活性を評価した。多様性領域4におけるHlgAアミノ酸残基番号180～192は、ヒト好中球(hPMN)、CXCR1/CXCR2+細胞のHlgAB標的化に必要とされる(図14)。HlgA/HlgBおよびHlgALukE-DR4/HlgBの組み合わせは、hPMNに対して強力な細胞毒性活性を示したが、しかしHlgALukS-DR4/HlgBの組み合わせではそうでなかった。これらのデータから、LukEDと同様に、HlgAのDR4ドメインがCXCR1およびCXCR2の標的化に関与することが実証される。
実施例7-DR4ドメイン内のLukEのアミノ酸P184、G186、P187、およびG189は、hPMNの標的化かつ死滅化に必要とされ、血流中毒によるLukEDを介した致死性に必要とされる
LukEはDR4ドメインを介してCXCR1/CXCR2+細胞に結合すること、およびこのドメインをLukS-PV DR4とスイッチすることで、ヒト好中球を含むCXCR1/CXCR2+細胞に対してLukEDが不活性にされることが実証された(図9A～9H)。HlgAにおけるDR4ドメインは、HlgABによるヒト好中球の標的化かつ死滅化に必要とされることも分かった(図14)。LukE DR4は、CXCR1およびCXCR2に対するLukEの指向性を決定する可能性が高い、LukS-PVのDR4のものとは十分に異なる極性表面を提示する2つのグリシン残基(G186およびG189)ならびに2つのプロリン残基(P184およびP187)を含んだループを形成する。興味深いことに、これらの4つのアミノ酸のうちの3つが同様に、HlgAにおいて保存されている。LukED媒介性のhPMN死滅化におけるP184、G186、P187、およびG189の関与を直接評価するため、全4つのアミノ酸をアラニンへ変異させて、LukEP184A, G186A, P187A, G189Aタンパク質(LukEP184,G186,P187)を生じさせた。WT LukEおよびLukEP184,G186,P187,G189タンパク質を精製し、LukDと等モル比で混合し、ヒトhPMNとともにインキュベートして、その細胞毒性活性を評価した。WT LukED毒素はhPMNを標的化かつ死滅させたが、LukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素の場合には検出可能な活性は観察されなかった(図15A)。このデータから、LukED媒介性のCXCR1/CXCR2+細胞死滅化に対してP184、G186、P187、およびG189アミノ酸により作出される極性表面の重要性が実証される。LukE P184、G186、およびP187に対応するHlgA残基がCXCR1/CXCR2へのHlgAの結合において同様の役割を果たすものと予測される。
LukEDは、黄色ブドウ球菌を静脈内感染させたマウスにおいて観察された致死性に関与するロイコトキシンである(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth In Vivo」 Mol. Microbiol. 83(2):423-35 (2012); Alonzo et al.,「CCR5 Is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493(7430):51-5 (2013); Reyes-Robles et al.,「Staphylococcus aureus Leukotoxin ED Targets the Chemokine Receptors CXCR1 and CXCR2 to Kill Leukocytes and Promote Infection」, Cell Host Microbe. 14(4):453-9 (2013)、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。インビボでのこの毒素の直接的影響をさらに研究するため、マウスに精製LukEDを静脈内注射した。20 gのマウスへの各サブユニット10μgよりも高い濃度でのWT毒素の投与は、「中毒」動物の急死を引き起こすことが観察された(図15B)。このLukEDを介した致死性に対する CXCR1/CXCR2標的化の寄与について調べるため、LukELukS-DR4/LukDおよびLukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素のインビボでの影響についても試験した。黄色ブドウ球菌血流感染で観察された致死性に対するLukEDによるCXCR1/CXCR2標的化の重要性(Reyes-Robles et al.,「Staphylococcus aureus Leukotoxin ED Targets the Chemokine Receptors CXCR1 and CXCR2 to Kill Leukocytes and Promote Infection」, Cell Host Microbe. 14(4):453-9 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)と一致し、CXCR1/CXCR2+細胞のLukED標的化を損なわせた変異によって、毒素の致死作用が取り除かれた(図15B)。
実施例8-LukED媒介性のヒト赤血球溶解は、DARCに依存し、精製DARCおよび抗DARC抗体で遮断されうる
DARC発現プラスミドでのHEK293T細胞のトランスフェクションは、これらの細胞をLukEDおよびHlgABに対して感受性とさせるのに十分である(図3および4A)。ヒト赤血球(RBC)に対するLukEDの溶血活性を試験したが、ドナーのなかにはLukED溶血に対して感受性であるものもいたが、そうでないものもいたことが観察された(図16Aおよび16B)。蛍光活性化細胞選別(FACS)によるRBC表面上のDARCレベルの評価から、LukEDに対する抵抗性がこれらのRBC表面の検出不能なDARCに関係していることが明らかにされ、LukED媒介性のRBC溶解にはDARCが必要とされることが示唆された。
RBCの溶解は、黄色ブドウ球菌の増殖に極めて重要な金属である鉄の宝庫ヘモグロビンの放出のため、黄色ブドウ球菌の病原性に必要とされるものと仮定された。したがって、RBCを溶解させる黄色ブドウ球菌の能力を遮断することで、ヘモグロビンの放出が阻害され、細菌増殖が減じられよう。LukED媒介性およびHlgAB媒介性の溶解に必要とされる細胞因子としてのDARCの特定から、毒素と受容体との相互作用の遮断は、RBCをこれらの毒素から防御する可能性が高いことが示唆される。この仮説を検証するため、ヒトRBCとのインキュベーションの前にLukEDを緩衝液とともにまたは漸増濃度の精製DARC (OriGene Technologies Inc.)とともにインキュベートした。DARCはLukED媒介性のRBC溶解を完全に中和できることが分かった(図16C)。さらに、抗ヒトDARCモノクローナル抗体(クローン番号358307; R&D Systems(商標))を用いたヒトRBCの処理によっても、ヒトRBCがLukED媒介性の溶解から防御された(図16D)。全体として、これらの所見は、ヒトRBCがLukED、および最も可能性が高いことには、精製された、DARCまたはこの受容体に対して作製された抗体によるHlgAB媒介性のヒトRBC溶解から防御されうることを実証している。
本発明を例示の目的で詳細に記述したが、そのような詳細は単にその目的のためであり、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者はその中で変更を行うことができるものと理解される。

Claims (8)

  1. SEQ ID NO:4の変種ロイコシジンE(LukE)ポリペプチドであって、該変種は非-機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有し、ここで、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196のアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されており、かつ、該変種LukEポリペプチドが細胞毒性を示さない、前記変種LukEポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドがSEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号20～263を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182～196のアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、請求項1記載の変種LukEポリペプチド。
  3. SEQ ID NO:4のP184、G186、P187、およびG189からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、請求項1または2記載の変種LukEポリペプチド。
  4. 前記変種LukEポリペプチドが、50～100アミノ酸の長さである、請求項１記載の変種LukEポリペプチド。
  5. 前記変種LukEポリペプチドが、100～200アミノ酸の長さである、請求項１記載の変種LukEポリペプチド。
  6. 前記変種LukEポリペプチドが、200～250アミノ酸の長さである、請求項１記載の変種LukEポリペプチド。
  7. 前記変種LukEポリペプチドがSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項2記載の変種LukEポリペプチド。
  8. 前記変種がSEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号237～271内の1つまたは複数のアミノ酸残基置換または欠失をさらに含む、請求項1記載の変種LukEポリペプチド。
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