DE60214676T2

DE60214676T2 - Hochaffine antagonisten der elr-cxc chemokine

Info

Publication number: DE60214676T2
Application number: DE60214676T
Authority: DE
Inventors: R. John Saskatoon GORDON; Fang Dalian Liaoning Province LI
Original assignee: University of Saskatchewan; Saskatchewan University of Technologies Inc
Current assignee: University of Saskatchewan; Saskatchewan University of Technologies Inc
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2022-03-02
Also published as: CA2439452A1; US20070021593A1; WO2002070565A2; CA2439452C; EP1363944B1; US20030077705A1; US20090118469A1; US7741434B2; WO2002070565A3; DE60214676D1; US7201895B2; WO2002070565A9; ES2274957T3; AU2002237136B2; JP2004534521A; DK1363944T3; HK1062689A1; EP1363944A2; ATE339447T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von CXC-Chemokin-Rezeptor-Antagonisten.
Hintergrund der Erfindung
Die CXC-Chemokine, die das Rezeptor-signalisierende Glutamat-Leucin-Arginin(ELR)-Motiv besitzen (z.B., CXCL1/GROα, CXCL8/IL-8; Ref. 1), sind für den Einstrom von Entzündungszellen wichtig, der einen großen Teil der Pathologie (Erkrankung) in verschiedenen Situationen vermittelt, einschließlich des Ischämie-Reperfusionsschadens (Ref. 2, 3), des Endotoxämieinduzierten akuten Atemnotsyndroms (ARDS; Ref. 4), der Arthritis und der Immunkomplexartigen Glomerulonephritis (Ref. 5). Zum Beispiel initiieren und/oder erhalten aus aktivierten Neutrophilen in ungeeigneter Weise freigesetzte hydrolytische Enzyme und reaktive Sauerstoff-Spezies die pathologischen Vorgänge aufrecht. Auf der anderen Seite stellt diese Chemokin-Reaktion einen kritischen ersten Verteidigungsweg während der meisten bakteriellen Infektionen dar, aber sogar hier können ELR⁺-CXC-Chemokin-Reaktionen über ihre Fähigkeiten, Entzündungszellen zu aktivieren, die die CXCR1- und CXCR2-Rezeptoren aufweisen, die Pathologie verschlimmern. Zum Beispiel reduziert die Neutralisation von MIP-2 während der experimentellen „Zökum-Punktion und Ligation"-Sepsis („cecal puncture and ligation" sepsis) die Sterblichkeit von Mäusen von 85 auf 38% (Ref. 6). Und experimentelle Behandlungen, die zirkulierenden Neutrophile eliminieren, verbessern die Pathologie von pneumonischer Mannheimiose (Ref. 7), wobei die CXCL8-Expression in den Luftwegen die Neutrophil-Chemoanziehung („chemoattraction") unterschiedlich beeinflusst (Ref. 8, 9). Trotz der kritischen Bedeutung dieser Chemokin-Reaktionen in vielen Situationen sind unberechenbare Entzündungszellreaktionen ausreichend schädlich, sodass die Entwicklung therapeutischer Mittel, mit welchen wir ELR⁺α-Chemokine blockieren können, zu einem Hauptforschungsziel wurde (Ref.10).
Die „ELR"-Chemokine ziehen Entzündungszellen über ihre CXCR1- und CXCR2-Rezeptoren chemisch an („chemoattract") und aktivieren diese (Ref. 1, 11). Der CXCR1 ist für CXCL8 und CXCL6/Granulozyten-chemotaktisches Protein-2 (GCP-2) spezifisch, während der CXCR2 mit hoher Affinität an CXCL8 bindet, jedoch auch an Makrophagen-Entzündungsprotein-2 („macrophage inflammatory protein-2", MIP-2), CXCL1, CXCL5/ENA-78 und CXCL6 mit etwas geringeren Affinitäten (siehe zum Beispiel Ref. 10). Das Signalisieren („signaling") durch CXCL8 in Zelllinien, die mit dem humanen CXCR1 oder CXCR2 transfiziert sind, induziert äquipotente chemotaktische Reaktionen (Ref. 13, 14), und die Freisetzung cytotoxischer Substanzen in den Atemwegen („respiratory burst") und die Aktivierung von Phospholipase D hängt nachweislich nur vom CXCR1 ab, während Änderungen des Neutrophil-zytosolischen freien Ca⁺⁺ und die zelluläre Degranulierung als Reaktion auf CXCL8 ebenfalls durch beide Rezeptoren vermittelt werden (Ref. 16). Auf der anderen Seite wurde berichtet, dass ein Nicht-Peptid-Antagonist des CXCR2, jedoch nicht des CXCR1, die CXCL8-vermittelte Neutrophil-Chemotaxis, jedoch nicht die zelluläre Aktivierung, antagonisiert (Ref. 17). Außerdem berichteten Clark-Lewis et al. (Band 269, Ausgabe vom 10. Juni, Seiten 16075-16081, 1994) über strukturelle Erfordernisse für die Interleukin-8-Funktion, die durch Konstruktion von Analoga und CXC-Chemokin-Hybriden identifiziert wurden. Clark-Lewis et al. (1994) offenbarten ebenfalls Mutationen in IL-8 an den Stellen Lysin11 und Glycin31, die jedoch keine signifikanten EC₃₀-Werte, bezogen auf den Wildtyp, zeigten. Hayashi et al. (Journal of Immunology, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, US, Band 154, 1995, Seiten 814-824) offenbarten synthetische Hexa- und Heptapeptide, die IL-8 an der Bindung an und Aktivierung humaner Blut-Neutrophile inhibierten. Zusätzlich offenbarte US 5,665,346 humane Interleukin-8-Analoga (IL-8), die an verschiedenen Aminosäure-Positionen Modifikationen zeigen, z.B. an den Positionen Glu4, Leu5 oder Arg6.
Schließlich gibt es viele Belege dafür, dass Chemokine meistens während der Entzündungsreaktionen überzählig exprimiert werden (siehe zum Beispiel Ref. 8). Jedoch sind trotz aktiver Forschung auf dem Gebiet keine CXC-Chemokin-Antagonisten aus dem Stand der Technik bekannt, die eine Unterdrückung der nachteiligen Entzündungszellaktivität bewirken, welche durch beide ELR-CXC-Chemokin-Rezeptoren induziert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen beinhalten neue ELR-CXC-Chemokin-Antagonist-Proteine, die in der Lage sind, an CXCR1- oder CXCR2-Rezeptoren in Säugetier-Entzündungszellen zu binden. Diese beinhalten Antagonisten, die in der Lage sind, mit hoher Affinität zu binden, wobei „hohe Affinität" sich auf die Affinität des Antagonisten zum Rezeptor bezieht, die um mindestens etwa eine Größenordnung größer als die des Wildtyp-Chemokin-Antagonisten ist. Die neuen Antagonist-Proteine beinhalten ebenfalls solche Proteine, die im Wesentlichen zu einem Wildtyp-Rinder-CXCL8-Protein (hier als Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 veranschaulicht) äquivalent sind (d.h., solche Proteine, die Aminosäure-Substitutionen, -Additionen und -Deletionen (Entfernungen) enthalten, die die CXCR1- und CXCR2-Bindungsfunktionen nicht beseitigen) und ebenfalls eine Verkürzung um die ersten zwei Aminosäurereste zusammen mit Substitutionen von Lys11 durch Arg und Gly31 durch Pro tragen. Analoga dieser CXCL_(3-74)K11R/G31P sind ebenfalls beinhaltet, nämlich CXCL_(3-74)K11R/G31P/P32G und CXCL_(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P. Zusätzlich führen Verbin dungen, die eine dreidimensionale Struktur aufweisen, zu einer Bindung mit hoher Affinität an CXCR1- oder CXCR2-Rezeptoren in Säugetier-Entzündungszellen.
Andere Zusammensetzungen der Erfindung sind neue Polynukleotide und Polypeptide, die sich auf diese Proteine beziehen. Ein solches neues Polynukleotid ist die Nukleotidsequenz, die hier als SEQ ID NO:4 dargestellt ist, während ein solches neues Polypeptid die Aminosäuresequenz ist, die hier als SEQ ID NO:1 dargestellt ist. Weiterhin beinhaltet die Erfindung Vektoren, die die neuen Polynukleotide umfassen, und Expressionsvektoren, die die neuen Polynukleotide umfassen, welche mit regulatorischen Sequenzen operabel assoziiert sind, die die Expression der Polynukleotide kontrollieren. Entsprechend sind Genfusionen, die Affinitätstags und die neuen Polynukleotide umfassen, in der Erfindung beinhaltet, genauso wie die resultierenden Vektoren und Expressionsvektoren, die solche Genfusionen enthalten.
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls Wirte, die die neuen Polynukleotide enthalten, genauso wie Wirte, die die neuen Polynukleotide (in genetischer Form) enthalten, die mit regulatorischen Sequenzen operativ assoziiert sind, d.h. mit den regulatorischen Sequenzen auf so eine Weise assoziiert, dass die regulatorischen Sequenzen die Expression der neuen Polynukleotide kontrollieren. Ebenfalls beinhaltet sind Wirte, die Genfusionen enthalten, die entweder mit den regulatorischen Sequenzen auf so eine Weise assoziiert sind, dass die regulatorischen Sequenzen die Expression der Genfusionen kontrollieren, oder denen solche regulatorischen Sequenzen fehlen. Die Wirte können Viren oder Zellen sein, wobei die letzten, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakterien, Hefe, Protozoen, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen und höhere Organismen, die aus ihnen abstammen, beinhalten.
Die Erfindung umfasst zusätzlich die Verwendung der neuen Polypeptide in der Behandlung von CXC-Chemokin-vermittelten Pathologien in Säugetieren, die die CXCR1- oder CXCR2-Rezeptoren einbeziehen. Gleichermaßen beinhaltet die Erfindung Verfahren zur Behandlung von ELR-CXC-Chemokin-vermittelten Pathologien, die die CXCR1- oder CXCR2-Rezeptoren einbeziehen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines der neuen Polypeptide an das betroffene Säugetier. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine biologisch aktive Menge eines der neuen Polypeptide umfassen, sind ebenfalls in der Erfindung beinhaltet.
Schließlich sind ebenfalls Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung der neuen Polypeptide in der Erfindung beinhaltet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Das G31P-Analogon von CXCL8_(3-74)K11R ist ein potenter Inhibitor der CXCL8-Bindung an die peripheren Blut-Neutrophile. Periphere Blut-Neutrophile von Rindern (87-93% Reinheit) wurden (oberes Feld) bei 4°C für 2 h den CXCL8_(3-74)K11R-Analoga (10 ng/ml) oder nur dem Medium (med.) ausgesetzt, nachfolgend gewaschen und entsprechend mit biotinyliertem CXCL8 (^biotCXCL8; 1000 ng/ml oder 129 nM) inkubiert. Die Niveaus von CXCL8 entsprachen ungefähr denen, die in den Lungengeweben von Lebewesen mit pneumonischer Pasteurellose (Ref. 8, 9) gefunden wurden. Die Niveaus der ^biotCXCL8-Bindung an die Zellen wurden unter Verwendung der ELISA-Technologie bestimmt. Die gezeigten Aminosäure-Substitutionen innerhalb von CXCL8_(3-74)K11R beinhalteten: G31P; P32G; T12S/H13P/G31P und T12S/H13P/G31P/P32G. Das G31P-, jedoch nicht das P32G-Analogon war ein hochwirksamer Antagonist der CXCL8-Bindung an die Zellen. Bei sowohl den G31P- als auch P32G-Analoga reduzierten zusätzliche Substitutionen von T12S und H13F deren CXCL8-Antagonist-Aktivitäten (unteres Feld). Neutrophile wurden gleichzeitig für 45 Min. bei 4°C variierenden Konzentrationen von CXCL8_(3-74)K11R/G31P oder unmarkiertem CXCL8 und ≈ 20 pM ¹²⁵I-CXCL8 ausgesetzt. Das Niveau von ¹²⁵I-CXCL8 wurde so ausgewählt, dass es für die CXCL8-Rezeptoren der Zelle mit hoher Affinität nahezu gesättigt war (Daten nicht gezeigt). Die Niveaus vom Zellassoziierten ¹²⁵1-CXCL8 wurde unter Verwendung eines γ-Zählers untersucht. Die Daten deuten deutlich darauf hin, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P eine im Wesentlichen höhere Affinität zu den Neutrophilen aufwies als CXCL8.
2. CXCL8_(3-74)K11R/G31P ist kein Agonist für die Chemoanziehungs-Reaktionen von Neutrophilen oder die β-Glucuronidase-Freisetzung. CXCL8 und die G31P-, P32G- oder die kombinierten G31P/P32G-Analoga von CXCL8_(3-74)K11R wurden auf deren Neutrophil-Agonist-Aktivitäten unter Verwendung frisch aufgereinigter peripherer Blut-Neutrophile von Rindern getestet. (oberes Feld) Die chemotaktischen Reaktionen auf jedes Protein wurden in 30-minütigen Mikrochemotaxis-Assays getestet und die Ergebnisse wurden als Mittelwerte (+/- SEM) der Anzahl von Zellen/40x Objektiv-Mikroskopfeld, wie in dem Verfahrensabschnitt behandelt, dargestellt. Sowohl die G31P- als auch die G31P/P32G-Analoga zeigten geringe erkennbare chemotaktische Aktivität, während das P32G-Analogon die wesentlichen Reaktionen bei 100 ng/ml stimulierte. (unteres Feld) Die Neutrophile wurden variierenden Dosen jedes Analogons für 30 Min. ausgesetzt, nachfolgend wurden die zellulären Sekretionsprodukte unter Verwendung des chromogenen Substrats p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronid, wie in dem Verfahrensabschnitt dargestellt, auf β-Glucuronidase untersucht. Die gesamten zellulären Vorräte von β-Glucuronidase wurden aus den Zell-Aliquots, die mit Triton-X-100 lysiert wurden, bestimmt.
Die Enzymfreisetzung bei jeder Behandlung ist als der Prozentsatz der gesamten zellulären Vorräte dargestellt. Keines der Analoga wies wesentliche Agonist-Aktivität auf, obwohl CXCL8 allein signifikante Enzymfreisetzung induzierte. Die Behandlung der positiven Kontrolle mit Phorbol-12,13-Myristatacetat und Calcium-lonophor A23187 induzierte eine Enzymfreisetzung von 42 +/- 6%.
3. CXCL8_(3-74)K11R/G31P ist ein hochwirksamer Antagonist der ELR-CXC-Chemokinvermittelten Neutrophil-Chemoanziehung. Die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P, die chemotaktischen Reaktionen der Rinder-Neutrophile auf verschiedene ELR-CXC-Chemokine zu blockieren, wurde unter Verwendung von 20-minütigen Mikrochemotaxis-Assays gemessen. (linkes Feld) Die Zellen wurden gleichzeitig dem CXCL8 (1 μg/ml unter variierenden Konzentrationen des Analogons ausgesetzt. Die Anzahl von Zellen, die auf den CXCL8 reagierte, wurde durch direkte Auszählung aus den Chemotaxis-Assay-Membranen wie in 2 untersucht. CXCL8_(3-74)K11R/G31P war ein hochwirksamer kompetitiver Inhibitor der Zellreaktionen auf CXCL8. (mittleres Feld) Dosis-Reaktions-Kurven für die Chemoanziehung von Rinder-Neutrophilen durch humanen CXCL1, CXCL5 oder CXCL8. Jedes Chemokin zeigte ein biphasisches Aktivitätsmuster mit Maxima bei 1-10 ng/ml und bei 1 μg/ml. (rechtes Feld) Die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P, die Zellreaktionen auf 1 ng/ml des humanen CXCL5 oder CXCL1 oder 10 ng/ml des humanen CXCL8 zu blockieren, wurde wie oben untersucht. CXCL8_(3-74)K11R/G31P antagonisierte wirksam jedes ELR-CXC-Chemokin, wobei vollständige Inhibierung mit von 3-20 nM CXCL8_(3-74)K11R/G31P erreicht wurde.
4. CXCL8_(3-74)K11R/G31P blockiert die Aktivitäten von CXCL8 und Nicht-CXCL8-Chemolockstoffen („chemoattractants"), die innerhalb pneumonischer Luftwege oder bei Endotoxin-induzierter Mastitis exprimiert werden. Die Wirkung von monoklonalem Anti-IL8-Antikörper 8B6 oder CXCL8_(3-74)K11R/G31P auf Neutrophil-Reaktionen der Chemolockstoffe, die innerhalb der Luftwege von Lebewesen mit pneumonischer Pasteurellose oder den Euterzisternen des Viehs mit Endotoxin-induzierter Mastitis exprimiert werden, wurde wie in 3 untersucht. (A) Verdünnte (1:10) bronchoalveoläre Lavage („bronchoalveolar lavage fluids", BALF) von Läsions-Lungenflügeln von pneumonischem Vieh (PNEUMONIA) oder Zitzenzisternen-Lavage des Viehs mit Mastitits (MASTITIS) wurden, wie sie waren (keine), oder nach der Behandlung mit entweder Anti-CXCL8-Mab-8B6 (5 μg/ml) oder CXCL8_(3-74)K11R/G31P (G31P; 1 oder 10 ng/ml) auf ihre chemotaktischen Aktivitäten, verglichen mit dem Medium allein, getestet. In beiden Proben neutralisierten die Mab-8B6-Antikörper allein ≈ 74% der chemotaktischen Aktivitäten in den Proben, während CXCL8_(3-74)K11R/G31P die Reaktionen um 93-97% reduzierte. (B) Um diese Ergebnisse unter Verwendung einer anderen Strategie zu bestätigen, absor bierten wir nachfolgend die Läsions-BAL-Flüssigkeiten mit Immunoaffinitätsmatrizen des monoklonalen Antikörpers 8B6, wobei > 99% von deren CXCL8-Gehalt entfernt wurde, testeten nachfolgend sowohl deren verbliebene chemotaktische Aktivitäten als auch die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P, diese verbliebenen nicht-CXCL8-chemotaktischen Aktivitäten zu antagonisieren. Es wurde eine dosisabhängige Inhibierung der gesamten und verbliebenen chemotaktischen Aktivitäten in den Proben gefunden, was darauf hindeutet, dass sowohl CXCL8- als auch Nicht-CXCL8-Chemolockstoffe in diesen Läsionen exprimiert werden.
5. CXCL8_(3-74)K11R/G31P kann Endotoxin-induzierte Entzündungsreaktionen in vivo beseitigen. Zwei-Wochen-alte Holstein-Kälber wurden auf ihre neutrophilen Entzündungsreaktionen auf intradermale Endotoxin-Aussetzung (1 μg/Stelle) vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser (i.v.), subkutaner (subcutan.) oder intramuskulärer (i.m.) Injektion von CXCL8_(3-74)K11R-G31P (75 μg/kg) getestet. 15-stündige Endotoxin-Reaktionsstellen-Biopsien wurden nach 0, 16, 48 und 72 h nach der Behandlung erhalten und einer histologischen Untersuchung der Neutrophil-Reaktion unterzogen, wie durch Auszählen der Anzahl von Neutrophilen in neun 40x Objektiv-Mikroskopfeldern pro Schnitt bestimmt wurde. (linkes Feld) Fotoaufnahmen der Gewebsreaktionen auf Endotoxin-Aussetzung um die Blutgefäße innerhalb der Retikulärdermis vor (0 h) und 48 h nach der Behandlung. Große Anzahl an Neutrophilen akkumulierte um die Vaskulatur innerhalb der Retikulärdermis in den Geweben vor der Behandlung, jedoch nicht in denen nach der Behandlung. (B) Grafische Darstellung der Neutrophil-Reaktionen auf die Endotoxin-Aussetzung entweder vor (0 h) oder nach (16, 48, 72 h) der Zufuhr von CXCL8_(3-74)K11R/G31P auf jedem (Verabreichungs-) Weg. ** oder *** = p ≤ 0,01 bzw. 0,001, relativ zu den Reaktionen vor der Behandlung mit der internen Kontrolle.
6. Eosinophile, die aus dem Blut von atopischen asthmatischen oder atopischen nichtasthmatischen Spendern (linke Felder) oder einem Individuum mit einer Hypereosinophilie (rechtes Feld) aufgereinigt wurden, wurden auf ihre Reaktionen auf rekombinante humane CXCL8, CXCL5 oder CCL11 in Gegenwart oder Abwesenheit der angedeuteten Dosen des rekombinanten Rinder-CXCL8_(3-74)K11R/G31P (G31P) untersucht. Niedrige Dosen von G31P waren in der Lage, die Reaktionen dieser Zellen auf jeden der CXCR1 und CXCR2-Liganden zu blockieren, sie wiesen jedoch keine Wirkung auf die Eosinophil-Reaktionen auf den nichtverwandten CCR3-Liganden CCL11/Eotaxin auf.
7. Neutrophile aus dem peripheren Blut eines gesunden Spenders wurden auf deren Reaktion auf rekombinanten humanen CXCL8 oder CXCL5 in Gegenwart oder Abwesenheit des Rinder-CXCL8_(3-74)K11R/G31P (G31P; 10 ng/ml) getestet. G31P blockierte die Neutrophil-Reaktionen auf beide Liganden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
(Die nachfolgenden Abkürzungen werden durch die ganze Offenbarung verwendet: ARDS, „acute respiratory distress syndrome", akutes Atemnotsyndrom; BALF, „bronchoalveolar lavage fluid(s)", bronchoalveoläre Lavage; BHR, Bolton-Hunter-Reagenz; CXCR1-, CXCR2-, CXCR8-Rezeptoren A bzw. B; ELR, Glutamat-Leucin-Arginin-Motiv; CXCL1, „growth-related oncogenealpha", wachstumsbezogenes Onkogen-alpha; CXCL4, „platelet factor-4", Plättchen-Faktor 4; CXCL5, „epithelial-derived neutrophil activator-78; Ephitel-abstammender Neutrophil-Aktivator-78; CXCL6, „granulocyte chemotactic protein-2", Granulocyten-chemotaktisches Protein-2; CXCL8, Interleukin-8; fMLP, Formyl-methionyl-leucylprolin-bakterielles Tripeptid; IPTG, Isopropyl-thio-D-galactopyranosid; MIP-2, „macrophage inflammatory protein-2", Makrophagen-Entzündungsprotein-2; PMSF, Phenylmethylsulfonylfluorid; TMB, Tetramethylbenzidin.)
Wenn amino-terminale Verkürzung des Rinder-CXCL8 mit einer Lysin-zu-Arginin-Substitution bei Aminosäure 11 (d.h. CXCL8_(3-74)K11R) kombiniert wird, belegen dramatische Anstiege der CXCR1- und CXCR2-Rezeptoraffinität, dass CXCL8_(3-74)K11R die Bindung vieler Liganden an beide Rezeptoren kompetitiv inhibiert (Ref. 24). Weiterhin kann die Verkürzung in dem Rezeptor-signalisierenden ELR-Motiv (z.B. Aminosäuren 4-6 des humanen CXCL8) einiger CXC-Chemokine diese in schwache (CXCL8_(6-72)) bis moderate (CXCL1_(8-73)) Rezeptor-Antagonisten umwandeln (Ref. 15, 25). Wie hier offenbart bewirkt die Einführung einer zweiten Aminosäure-Substitution, Glycin31 zu einem Prolin-Rest (d.h., CXCL8_(3-74)K11R/G31P) in den Rinder-CXCL8_(3-74)K11R, dass dieses CXCL8-Analogon zu einem Antagonisten der Rinder- und humanen ELR-CXC-Chemokin-Reaktionen mit sehr hoher Affinität umgewandelt wird. Er antagonisiert vollständig die gesamte Reihe der ELR-CXC-Chemokine, die innerhalb der bakteriellen oder Endotoxin-induzierten Entzündungsfoki exprimiert werden, und blockiert die Endotoxininduzierte Entzündung in vivo.
Obwohl die folgende Diskussion sich hauptsächlich mit Rinder-Neutrophilen befasst, weisen andere Säugetier- (einschließlich Mensch-) Entzündungszellen ebenfalls CXCR1- und CXCR2-Rezeptoren auf (siehe zum Beispiel Ref. 52) und sie sind deshalb anfällig gegenüber der Inhibierung durch CXCL8_(3-74)K11R/G31P. Demgemäß weist die vorliegende Erfindung breite Anwendbarkeit auf Säugetier-ELR-CXC-Chemokin-vermittelte Pathologien auf.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird beabsichtigt, dass Verbindungen, die die gleiche dreidimensionale Struktur an der Bindungsstelle aufweisen, als Antagonisten verwendet werden können. Dreidimensionale Analyse der chemischen Struktur wird verwendet, um die Struktur von aktiven Stellen, einschließlich der Bindungsstellen für Chemokine, zu bestimmen. Chemische Leitverbindungen unter Hochdurchsatz („high throughput-screening") wurden verwendet, um einen selektiven Antagonisten von CXCR2 herzustellen und chemisch zu optimieren (Ref. 17). Ein ähnlicher Ansatz wurde ebenfalls verwendet, um einen CCR3-Antagonisten herzustellen (Ref. 56).
Wells at al. (Ref. 57) setzten kernmagnetische Resonanzspektroskopie ("nuclear magnetic resonance spectroscopy", (NMR)) ein, um die dreidimensionale Struktur von Liganden für CXCR im Detail aufzuklären, einschließlich sowohl ELR- als auch Nicht-ELR-CXC-Chemokinen. Mit dieser NMR-Information erzeugten Wells et al. viele Substitutionen innerhalb der Rezeptorbindungsstellen vieler Chemokine, sodass diese die Rezeptorspezifitäten der Liganden wesentlich verändern konnten.
Materialen und Verfahren
Reagenzien & Ausrüstung. Die folgenden Reagenzien wurden kommerziell bezogen: Glutathion-Sepharose, der Expressionsvektor pGEX-2T, Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia-Biotech, Baie d´Urfé, PQ), Bolton-Hunter-Reagenz, ein Protein-Biotinylierungs-Kit (Pierce Scientific, Rockford, IL), der Sequenzierungsvektor pBluescript II KS, PfuTurbo^TM DNA-Polymerase (Stratagen, La Jolla, CA), ein Ortsgerichtete-Mutagenese-Kit (QuickChange^TM; Boehringer-Mannheim Canada, Laval, PQ), Aprotinin, Benzol, Calcium-lonophor A23187, Chloramin T, Cytochalasin B, Dimethylformamid, Endotoxin (Escherichia coli-Lipopolysaccharid, Serotyp 0127B8), Isopropyl-thio-D-galactopyranosid (IPTG), Leupeptin, p-Nitrophenyl-β-Glucuronid, Mineralöl, Silikonöl, Tetramethylbenzidin (TMB), Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Phorbol-12,13-Myristatacetat (PMA) und Triton X-100 (Sigma Chemical Co., Mississauga, ON), ein Diff-Quick-Färbe-Kit (American Scientific Products, McGaw Pk, IL), humane CXCL1, CXCL5 und CXCL8 (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN), Meerrettich-Peroxidase(„horse radish peroxidase", HRP)-konjugiertes Anti-Kaninchen-Ig (Zymed, South San Francisco, CA), DMEM, HBSS (Gibco, Grand Island, NY), HRP-Streptavidin, (Vector Labs, Burlingame, CA), ABTS-Enzymsubstrat (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD), Rinderserumalbumin („bovine serum albumine", BSA) und Lymphozyten-Trennmedium (ICN Pharmaceuticals, Aurora, IL).
Herstellung von CXCL8_(3-74)K11R-Analoga. Der CXCR1/CXCR2-Ligand mit hoher Affinität CXCL8_(3-74)K11R und dessen T12S/H13F-Analogon wurden in Übereinstimmung mit den in Li und Gordon (Ref. 24) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Gly31Pro- (G31P), Pro32Gly-(P32G) und G31P/P32G-Analoga dieser Proteine wurden entsprechend durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von PCR mit geeigneten „Vorwärts"- und „Rückwärts"-Oligonukleotid-Primern erzeugt (Tabelle 1). Die Produkte jeder Reaktion wurden mit Dpnl verdaut, in den Vektor pGEX-2T ligiert, in HB101-Zellen transfiziert und deren Sequenzen wurden kommerziell nachgeprüft (Plant Biotechnology Institute, Saskatoon). Zusammengefasst wurden die rekombinanten Bakterien in Gegenwart eines Protease-Inhibitor-Cocktails (2 mM PMSF, 2 μg/ml Aprotinin und 2 μg/ml Leupeptin) lysiert und die rekombinanten Fusionsproteine in den Überständen wurden über Affinitätschromatographie aufgereinigt, unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-Beads in Übereinstimmung mit den Verfahren von Caswell et al. (Ref. 26). Die CXCL8_(3-74)K11R-Analoga wurden aus den GST-Fusionsproteinen über den Thrombin-Verdau herausgeschnitten, gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung („phosphate buffered saline", PBS) dialysiert, über kommerzielle Säulen zur Entfernung von Endotoxin gegeben und nachfolgend über Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western-Blot mit einem Ziege-Anti-Rind-CXCL8-Antikörper (durch Dr. M. Morsey zur Verfügung gestellt) charakterisiert. Jedes aufgereinigte Analogon wies eine Molekularmasse von ≈ 8 kDa auf, wurde spezifisch durch den Anti-CXCL8-Antikörper im Western-Blot erkannt und wies eine relative Reinheit von ≥ 96% auf, was durch Dichteanalyse der PAGE-Gele bestimmt wurde.
Markierung der rekombinanten Proteine. Wir verwendeten ^biotCXCL8 für die Anfangsuntersuchungen der Bindung der Analoga an Neutrophile und ¹²⁵I-CXCL8 für die späteren Assays zur relativen Rezeptoraffinität. CXCL8 war biotinyliert und die Niveaus der Biotin-Substitution wurden unter Verwendung eines kommerziellen Kits bestimmt, wie in Li und Gordon (Ref. 24) beschrieben. Der ^biotCXCL8 war mit 2,15 Molen von Biotin pro Mol CXCL8 substituiert. CXCL8 war mit ¹²⁵I unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagenz(BHR)-Verfahrens radiomarkiert, wie im Detail (Li und Gordon 2001, Ref. 24) beschrieben. Das markierte Protein wurde von dem nicht-eingebauten ¹²⁵I-BHR über Chromatographie auf Sephadex G50 getrennt und der markierte CXCL8 wurde auf dessen relative Affinität zu Neutrophilen und die Zeit, die erforderlich ist, um ein Bindungsgleichgewicht zu erreichen, wie in Li und Gordon (Ref. 24) beschrieben, charakterisiert.
Bindungs-Assays vom CXCL8_(3-74)K11R-Analogon. Zellen (85-93% Neutrophile) wurden aus dem Viehblut in Übereinstimmung mit dem Caswell-Verfahren (Ref. 26) aufgereinigt. In den Anfangsexperimenten haben wir bestimmt, dass keines der Analoga die Lebensfähigkeit von Neutrophilen beeinflusste, wie durch Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschluss bestimmt wurde. Für die ausgedehnten Analoga-Untersuchungen wurden Neutrophile in HBSS/0,5% BSA für 2 h bei 4°C mit dem Analogon inkubiert, in kaltem DMEM gewaschen und nachfolgend für weitere 2 h bei 4°C mit ^biotCXCL8 (1000 ng/ml) inkubiert. Das Zell-assoziierte Biotin wurde durch Inkubation der gewaschenen Zellen mit Alkalin-Phophatase-konjugiertem Streptavidin (1:700 Verdünnung) und nachfolgend mit dem ABTS-Enzymsubstrat detektiert. Die OD₄₀₅ der Proben wurde unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts bestimmt. Medium-behandelte Neutrophile haben routinegemäß ausreichend an ^biotCXCL8 gebunden und eine OD₄₀₅ von 0,5-0,6 erzeugt.
Für genauere Studien an CXCL8_(3-74)K11R/G31P verwendeten wir ¹²⁵I-CXCL8 in Bindungs-Inhibitions-Assays mit unmarkiertem CXCL8 oder CXCL8_(3-74)K11R/G31P. In den ersten Experimenten bestimmten wir, dass die Bindungsgleichgewichtszeit von Neutrophilen für ¹²⁵I-CXCL8 bei ≈ 45 Min. lag und dass 20 pM ¹²⁵I-CXCL8 die Rezeptoren der Zelle mit hoher Affinität gerade so gesättigt haben. Somit wurden in unseren Assays 10⁶ aufgereinigte Neutrophile für 45 Min. auf Eis mit 20 pM ¹²⁵I-CXCL8 und unter variierenden Konzentrationen des unmarkierten Kompetitions-Liganden inkubiert. Die Zellen wurden nachfolgend durch 6% Mineralöl in Silikonöl sedimentiert und die Niveaus des Zell-assoziierten Radioliganden unter Verwendung eines γ-Zählers bestimmt. Die nichtspezifische Bindung von ¹²⁵I-CXCL8 an die Zellen wurde in jedem Assay unter Einbeziehung eines 200-fachen molaren Überschusses an unmarkiertem Liganden in einem Probenset untersucht. Dieser Wert wurde verwendet, um den Prozentsatz von spezifischer Bindung zu berechnen (Ref. 27).
Neutrophil-β-Glucuronidase-Freisetzungs-Assay. Der Neutrophil-β-Glucuronidase-Assay wurde im Detail beschrieben (Ref. 24). Zusammengefasst wurden mit Cytochalasin B behandelte Neutrophile für 30 Min. mit den CXCL8-Analoga inkubiert, ihre Sekretionsprodukte wurden nachfolgend kolorimetrisch auf das Enzym untersucht. β-Glucuronidase-Freisetzung wurde als Prozentsatz des Gesamtzellinhalts ausgedrückt, der durch Lysieren der Medium-behandelten Zellen mit 0,2% (v/v) Triton X-100 bestimmt wurde. Die Aussetzung der Neutrophile mit dem positiven Kontroll-Stimulus PMA (50 ng/ml) und A23187 (1 μg/ml) induzierte eine Freisetzung der gesamten zellulären β-Glucuronidase-Speicher von 42 +/- 6%.
Proben aus Entzündungsläsionen. Wir erhielten bronchoalveoläre Lavage („bronchoalveolar lavage fluids", BALF) aus den Lungen vom Vieh (n = 4) mit diagnostizierter klinischer fibrinopurulenter pneumonischer Mannheimiose (Ref. 8), genau so wie die Waschflüssigkeiten der Zitzenzisternen vom Vieh (n = 4) mit experimenteller Endotoxin-induzierter Mastitis (Ref. 28). In anfänglichen Dosis-Reaktions-Experimenten haben wir bestimmt, dass 5 μg von Endotoxin eine starke (≈ 70-80% maximal) Brust- bzw. Euter-Neutrophil-Reaktion induzierte. Somit wurde in den beschriebenen Experimenten Mastitis durch Infusion von 5 μg Endotoxin oder nur Trägermedium (Salzlösung; 3 ml Volumina) in die Zitzenzisternen von nicht-milchgebenden Holstein-Milchkühen induziert und 15 h später wurden die Infiltrate aus den Zisternen durch Spülung mit 30 ml HBSS gewonnen. Die Zellen aus dem BALF und Zitzenzisternen-Waschflüssigkeiten wurden durch Zentrifugation sedimentiert und Differenzauszählungen wurden vorgenommen. Unbehandelte und CXCL8-abgereicherte (unten) Waschflüssigkeiten wurden auf deren Chemokin-Gehalt durch ELISA (nur CXCL8) und Chemotaxis-Assays untersucht.
Neutrophil-Chemotaxis-Assays. Mikrochemotaxis-Assays wurden in doppelt-modifizierten Boyden-Mikrochemotaxis-Kammern unter Verwendung von Polyvinylpyrrolidon-freien Polycarbonat-Filtern mit 5-μm-Porengrößen in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren (Ref. 26, 29) durchgeführt. Für jede Probe wurde die Anzahl der Zellen, die über 20-30 Min. in die Membranen eingewandert ist, durch direktes Auszählen von mindestens neun 40x Objektivfeldern gezählt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert von Zellen/40x Feld (+/- SEM) dargestellt. Die Chemolockstoffe beinhalteten Rinder- oder humanen CXCL8, humanen CXCL5 und CXCL1, pneumonische Mannheimiose-BALF und Mastitis-Lavage (verdünnt 1:10 bis 1:80 in HBSS), während die Antagonisten Maus-Anti-Schaf-CXCL8-Antikörper 8M6 (großzügigerweise durch Dr. P. Wood, CSIRO, Australien, zur Verfügung gestellt) oder die CXCL8_(3-74)K11R-Analoga umfassten. In einigen Assays vorinkubierten wir die Proben mit den Antikörpern (5 μg/ml) für 60 Min. auf Eis (Ref. 30). In anderen Assays stellten wir CXCL8-spezifische Immunoaffinitätsmatrizen mit den 8M6-Antikörpern und Protein-A-Separose-Beads her und verwendeten diese im Überschuss, um die Proben zu absorbieren (Ref. 8, 31); das Ausmaß der CXCL8-Abreicherung wurden durch ELISA von den behandelten Proben bestätigt. Für Versuche mit den rekombinanten Antagonisten wurden die Inhibitoren mit den Proben unverzüglich vor dem Testen direkt vermischt.
CXCL8-ELISA. Für unseren ELISA wurde Mab-8M6 als „Fang"-Antikörper, Kaninchen-Anti-Schaf-CXCL8-Antiserum (ebenfalls von P. Wood, CSIRO) als Sekundärantikörper und HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-Ig und TMB als Detektionssystem, wie in Caswell et al. (Ref. 8) beschrieben, verwendet. Verdünnungsreihen jeder Probe wurden in dreifacher Ausführung untersucht und jeder Assay beinhaltete eine Standardkurve eines rekombinanten Rinder-CXCL8.
CXCL8_(3-74)K11R/G31P-Blockade von Endotoxin-Reaktionen in vivo. Wir verwendeten eine sequentielle Reihe von 15-h-Hauttests, um die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P zum Blockieren von Endotoxin-induzierten Entzündungsreaktionen in vivo zu testen. Für jeden Test setzten wir ≈ 2-Wochen-alte gesunde Holstein-Kühe intradermal 1 μg Endotoxin in 100 μl Salzlösung aus, nachfolgend, 15 h später, entnahmen wir 6-mm-Stempel-Biopsien unter lokaler Anästhesie (Lidokain) und verwendeten diese weiter für die Histopathologie (Ref. 31). Nach dem ersten (internen Positiv-Kontroll-) Test injizierten wir in jedes Lebewesen subkutan, intramuskulär oder intravenös CXCL8_(3-74)K11R/G31P (75 μg/kg) in Salzlösung, setzten diese nachfolgend wieder dem Endotoxin, wie oben, aus. Die Lebewesen wurden insgesamt viermal dem Endotoxin ausgesetzt, sodass 15-h-Reaktionsstellen-Biopsien bei 0, 16, 48 und 72 h nach der Behandlung erhalten wurden. Die Biopsien wurden weiter mit Routineverfahren zu 6-μm-Paraffin-Schnitten verarbeitet, mit Giemsa-Lösung gefärbt und als Blindstudie bei 400x-Vergrößerung (Ref. 31, 32) untersucht. Die Durchschnittsanzahl von Neutrophilen pro 40x Objektiv-Mikroskopfeld wurde bei drei unterschiedlichen Tiefen innerhalb der Haut, der Papillar- (oberflächlich), Intermediär- und Retikulärdermis (tief) bestimmt.
Statistische Analysen. Daten mehrerer Gruppen wurden durch ANOVA und post-hoc eine „Fisher protected Least Significant Difference (PLSD)"-Untersuchung analysiert, während Vergleiche zwischen zwei Gruppen unter Verwendung von Students-T-Tests („two-tailed", mit zwei Enden) gemacht wurden. Die Ergebnisse sind als Mittelwert +/- SEM dargestellt.
Ergebnisse
CXCL8_(3-74)K11R/G31P inhibieren kompetitiv die CXCL8-Bindung an Neutrophile. Wir haben die Fähigkeit jedes CXCL8_(3-74)K11R-Analogons, an CXCL8-Rezeptoren auf Neutrophilen zu binden und dadurch mit CXCL8 als einem Liganden zu kompetitieren, untersucht. In unseren Anfangsuntersuchungen haben wir ^biotCXCL8-Bindungs-Inhibitions-Assays eingesetzt, wobei die Zellen vor der Aussetzung gegenüber dem ^biotCXCL8 (1 μg/ml) mit den Analoga (10 ng/ml) für 2 h bei 4°C inkubiert wurden. Dieses Niveau von CXCL8 liegt ungefähr bei solchen, die in den Lungengeweben von Schafen mit experimenteller pneumonischer Mannheimiose gefunden wurden (Ref. 33). Wir haben festgestellt, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P in diesen Assays ein potenter Antagonist der CXCL8-Bindung war (1), sodass 10 ng/ml CXCL8_(3-74)K11R/G31P ≈ 95% der nachfolgenden ^biotCXCL8-Bindung an die Zellen blockierten. Sofern bei dieser Dosis getestet wurde, blockierte CXCL8_(3-74)K11/P32G nur 48% der CXCL8-Bindung, während unmarkierter CXCL8 selbst 30% der ^biotCXCL8-Bindung kompetitiv inhibierte. Die Einführung von zusätzlichen Aminosäure-Substitutionen bei Thr12 und His13 in CXCL8_(3-74)K11R/G31P oder CXCL8_(3-74)K11R/P32G reduzierte die Antagonist-Aktivitäten der Analoga wesentlich (1). Diese Daten weisen deutlich darauf hin, dass die Vorinkubation von Neutrophilen mit CXCL8_(3-74)11R/G31P die nachfolgende Bindung des CXCL8 stark herunterreguliert.
Um die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P, die Bindung von CXCL8 zu inhibieren, genauer zu bestimmen, setzten wir die Zellen in unserem nächsten Satz an Experimenten gleichzeitig dem ¹²⁵ICXCL8 und variierenden Dosen von CXCL8_(3-74)K11R/G31P oder unmarkiertem CXCL8 aus. Wir haben festgestellt, dass CXCL8_(3-74)K11/G31P um etwa zwei Größenordnungen wirksamer als Wildtyp-CXCL8 in der Inhibierung der Bindung von 20 pM ¹²⁵I-CXCL8 an die Zellen war (1). Die Konzentration zur Inhibierung von 50% der Bindung des markierten Liganden (IC₅₀) betrug ≈ 120 pM für den unmarkierten CXCL8 und ≈ 4 pM für CXCL8_(3-74)K11R/G31P. Diese Daten weisen darauf hin, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P ein sehr potenter kompetitiver Inhibitor der CXCL8-Bindung an Neutrophile ist.
CXCL8_(3-74)K11R/G31P zeigt keine Neutrophil-Agonist-Aktivitäten. Während CXCL8_(3-74)K11R/G31P sicherlich ein Ligand mit hoher Affinität für die Neutrophil-CXCL8-Rezeptoren war, könnte er gleichermaßen gut als ein Agonist oder ein Antagonist dienen. Somit waren unsere nächsten Experimente auf die potentiellen Agonist-Aktivitäten der CXCL8_(3-74)K11R-Analoga, die wir hergestellt haben, gerichtet, wie durch deren Fähigkeiten, diese Zellen chemisch anzuziehen oder die Freisetzung des Neutrophil-Granulen-hydrolytischen Enzyms β-Glucuronidase in vitro zu induzieren, gemessen wurde (2). Wir haben festgestellt, dass sogar bei 100 ng/ml CXCL8_(3-74)K11R/G31P ein schwacher Chemolockstoff war, der 13,9 +/- 4% oder 5,4 +/- 2% der Reaktionen induzierte, die durch 1 bzw. 100 ng/ml CXCL8 (p < 0,001) induziert wurden. Bei 100 ng/ml induzierte das CXCL8_(3-74)K11R/P32G-Analogon eine Reaktion, die ganz wesentlich war (38,3 +/- 2% der CXCL8-Reaktion), während das kombinierte CXCL8_(3-74)K11R/G31P/P32G-Analogon ebenfalls kein wirksamer Chemolockstoff war. Als wir deren Fähigkeiten untersuchten, β-Glucuronidase-Freisetzung zu induzieren, haben wir festgestellt, dass keines der CXCL8_(3-74)K11R-Analoga so wirksam wie CXCL8 bei der Induktion der Vermittler(„mediator")-Freisetzung war. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass nur Hintergrund-Freisetzung mit jedem beliebigen dieser Analoga bei ≤ 10 ng/ml vorlag und dass bei 100 ng/ml nur CXCL8_(3-74)K11R/G31P/P32G die Neutrophil-Reaktionen signifikant induzierte (2). Mit der kombinierten kompetitiven CXCL8-Inhibierung und den Neutrophil-Agonist-Daten haben wie ab hier unsere Aufmerksamkeit auf CXCL8_(3-74)K11R/G31P gerichtet.
CXCL8_(3-74)K11R/G31P blockiert die Neutrophil-chemotaktischen Reaktionen auf sowohl CXCR1- als auch CXCR2-Liganden. Die am meisten pathogene Wirkung von unangemessener ELR⁺-Chemokin-Expression ist die Anziehung von Entzündungszellen in die Gewebe. Somit untersuchten wir im Folgenden die Wirkung von CXCL8_(3-74)K11R/G31P auf die chemotaktischen Reaktionen von Neutrophilen auf hohe Dosen von CXCL8 (3). Wie aus unseren In- vivo-Beobachtungen bei Schafen und Vieh vorhergesagt (Ref. 33), war 1 μg/ml (129 nM) CXCL8 sehr stark chemoanziehend, jedoch sogar sehr geringe Dosen von CXCL8_(3-74)K11R/G31P verbesserten diese Reaktion. Die Zugabe von 12,9 pM CXCL8_(3-74)K11 R/G31P reduzierte die chemotaktische Reaktion der Zellen um ≈ 33%. Die IC₅₀ für CXCL8_(3-74)K11R/G31P lag unter diesen Bedingungen bei ≈ 0,11 nM, während Gesamtblockierung dieser CXCL8-Reaktion mit 10 nM CXCL8_(3-74)K11R/G31P erreicht wurde.
Als wir die Wirksamkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P bei der Blockierung der Reaktionen auf geringfügige Rinder-CXCL8-Aussetzungen getestet haben, dehnten wir die Studie ebenfalls aus, um die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P, die Neutrophil-Reaktionen auf den humanen CXCL8 genauso wie die humanen CXCR2-spezifischen Liganden CXCL1 und CXCL5 zu blockieren, zu untersuchen. Jeder von diesen wird in den betroffenen Geweben bei Pankreatitis-(Ref. 34) oder ARDS-Patienten (Ref. 3) bei ≈ 1-10 ng/ml exprimiert. Wir haben festgestellt, dass Rinder-Neutrophile auf ≈ 1 ng/ml hCXCL1 oder hCXCL5 reagierten und entsprechend auf 10 ng/ml hCXCL8 (3) reagierten, sodass wir diese Dosen eingesetzt haben, um auf die Wirkungen von CXCL8_(3-74)K11R/G31P auf Neutrophil-Reaktionen dieser Liganden zu testen. Die Neutrophil-Reaktionen auf hCXCL1 und hCXCL5 wurden auf 50% durch 0,26 bzw. 0,06 nM CXCL8_(3-74)K11R/G31P reduziert, während ihre Reaktionen auf hCXCL8 auf 50% durch 0,04 nM CXCL8_(3-74)K11R/G31P reduziert wurden (3). Diese Daten deuten darauf hin, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P die Funktionen von vielen Mitgliedern der ELR-CXC-Unterfamilie von Chemokinen antagonisieren kann.
CXCL8_(3-74)K11R/G31P ist ein wirksamer In-vitro-Antagonist der Neutrophil-Chemokine, die in bakteriellen Pneumonie- oder Mastitis-Läsionen exprimiert werden. Wir beabsichtigten, das Ausmaß zu testen, zu welchem unser Antagonist die Anordnung von Neutrophil-Chemolockstoffen blockieren kann, die innerhalb komplexer Entzündungsumgebungen in vivo exprimiert werden. Somit wählten wir zwei Erkrankungen aus, in denen die Chemokingesteuerte Neutrophil-Aktivierung zu den Pathologie-, Mastitis- und pneumonische Mannheimiose-Progression beträchtlich beiträgt. Wir verwendeten ein Endotoxin-Modell der Mastitis (Ref. 35), in welchem wir 5 μg Endotoxin/Zitzenzisterne infudierten und nach 15 h jede Zisterne spülten. Neutrophile umfassten ≈ 82 bzw. 6% der Zellen aus Endotoxin- und Salzlösung-Kontroll-Zisternen, wobei die Menge der verbleibenden Zellen Makrophagen umfasste. Die verdünnten (1:10) Waschflüssigkeiten induzierten starke In-vitro-Neutrophil-chemotaktische Reaktionen und die Zugabe von Anti-CXCL8-Antikörpern zu den Proben reduzierte diese maximal um 73 +/- 8% (4A), relativ zu der Medium-Kontrolle. Auf der anderen Seite reduzier te die Zugabe von 1 ng/ml CXCL8_(3-74)K11R/G31P zu den Proben deren chemotaktische Aktivität um 97 +/- 3%.
Die Neutrophile umfassten 93 +/- 12% der Zellen, die aus BALF des Viehs mit fortgeschrittener pneumonischer Mannheimiose gewonnen wurden. Als diese in vitro getestet wurden, waren die Proben ebenfalls stark chemotaktisch für Neutrophile und die Zugabe von Anti-CXCL8-Antikörpern reduzierte deren Neutrophil-chemotaktischen Aktivitäten maximal um 73 +/- 5% (4A). Behandlung dieser BALF-Proben mit 1 oder 10 ng/ml CXCL8_(3-74)K11R/G31P reduzierte die Neutrophil-Reaktionen um 75 +/- 9 bzw. 93 +/- 9%, relativ zu den Medium-Kontrollen. Diese Daten weisen darauf hin, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P die Funktionen von CXCL8- und Nicht-CXCL8-Chemolockstoffen in diesen Proben blockierte.
Um diese Beobachtung unter Verwendung einer anderen Strategie zu bestätigen, reicherten wir im Folgenden die bakteriellen Pneumonie-BALF-Proben an CXCL8 unter Verwendung von Immunoaffinitätsmatrizen ab, untersuchten nachfolgend die Wirksamkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P beim Blockieren der restlichen Neutrophil-chemotaktischen Aktivitäten in den Proben (4B). Die unbehandelten Läsions-BALF-Proben enthielten 3.215 +/- 275 pg/ml CXCL8, während die Immunoaffinitäts-absorbierten BALF 24 +/- 17 pg/ml CXCL8 enthielten. In diesen Experimentreihen entsprach die Neutrophil-Reaktion auf die CXCL8-abgereicherten BALF-Proben 65,4 +/- 4% von deren Reaktionen auf die unabsorbierten Proben. Es ist bekannt, dass CXCL8 nur zu 15% der Neutrophil-chemotaktischen Aktivitäten bei pneumonischen Mannheimiose-BALF, die aus einer Reihe an klinischen Fällen erhalten wurden, beitragen kann (Ref. 9). Während die CXCL8-Abreicherungs-Behandlungen ≥ 99% wirksam bei der Entfernung von CXCL8 waren, blieben in den Proben wesentliche Mengen an Neutrophil-chemotaktischen Aktivitäten zurück und die Zugabe von 1 ng/ml CXCL8_(3-74)K11R/G31P hob deren kumulative Wirkungen völlig auf (4B). Diese Daten bestätigten eindeutig, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P das Spektrum von Nicht-IL-8-Chemolockstoffen, die in diesen Proben exprimiert wurden, ebenfalls antagonisiert.
CXCL8_(3-74)K11R/G31P ist beim Blockieren von Endotoxin-induzierter neutrophiler Entzündung in vivo hochwirksam. In unseren letzten Experimenten haben wir die Fähigkeit von CXCL8_(3-74)K11R/G31P untersucht, die Endotoxin-induzierten Entzündungsreaktionen in der Haut des Viehs zu blockieren, genauso wie den Zeitrahmen, über welchen er wirksam war. Die Lebewesen wurden intradermal 1 μg bakteriellem Endotoxin 15 h vor (interne Positiv-Kontroll-Reaktion) oder zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser, subkutaner oder intramuskulärer Injektion von CXCL8_(3-74)K11R/G31P (75 μg/kg) ausgesetzt. Somit wurden Stempel- Biopsien von 15-h-Endotoxin-Reaktionsstellen ≈ 15 Min. vor der Behandlung und 16, 48 und 72 h nach der Injektion des Antagonisten in jedes Lebewesen entnommen und die Anzahl der eingewanderten Neutrophile wurde als Blindstudie für die Papillar- (oberflächlich), Intermediär- und Retikulärdermis jeder Biopsie bestimmt. Vor den Behandlungen mit dem Antagonisten waren starke neutrophile Entzündungsreaktionen an den Endotoxin-Aussetzungsstellen in jedem Lebewesen offensichtlich (5). Innerhalb der Biopsien waren die Reaktionen in der Papillardermis schwach in allen Lebewesen (Daten nicht gezeigt) und wurden fortschreitend markanter mit steigender Hauttiefe, sodass die maximale Entzündung (Neutrophil-Infiltration) um die Blutgefäße in der Retikulärdermis beobachtet wurde (5A). Nach den CXCL8_(3-74)K11R/G31P-Behandlungen wurden die Entzündungsreaktionen, die in den 16-h-Biopsien beobachtet wurden, um 88-93% unterdrückt, während die in den 48-h-Biopsien um 57% (intravenös) bis 97% (intradermal) unterdrückt wurden, relativ zu ihren entsprechenden Vorbehandlungsreaktionen. Bei 72-h-Nachbehandlung sind die Wirkungen des intravenös verabreichten Antagonisten abgeklungen, während die Endotoxin-Reaktionen in dem intradermal und subkutan behandeltem Vieh noch um ≈ 60% unterdrückt wurden. Diese Daten deuten eindeutig darauf hin, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P ein hochwirksamer Antagonist der Endotoxin-induzierten Entzündungsreaktionen in vivo ist, dass diese Wirkungen für zwei bis drei Tage anhalten können und dass der Verabreichungsweg die Pharmakokinetiken dieses neuen Antagonisten merklich beeinflusst.
Wir haben festgestellt, dass G31 die chemotaktischen Wirkungen der humanen ELR-CXC-Chemokine CXCL8/IL-8 und CXCL5/ENA-78 auf humanen Neutrophilen ebenfalls antagonisiert. Somit wurden die chemotaktischen Aktivitäten von entweder 0,1 bis 500 ng/ml CXCL8 (6, linkes Feld) oder CXCL5/ENA-78 (6, rechtes Feld) durch die Zugabe von 10 ng/ml unseres Antagonisten zu den Chemotaxis-Assays im Wesentlichen vollständig blockiert. Entsprechend blockierte G31P die chemotaktischen Wirkungen von CXCL8 auf CXCR1/CXCR2-positive Eosinophile. Wir und andere haben festgestellt, dass Eosinophile aus atopischen oder asthmatischen Probanden beide ELR-CXC-Chemokin-Rezeptoren exprimieren und auf CXCL8 reagieren (7, linkes Feld). Die chemotaktischen Wirkungen von 100 ng/ml CXCL8, jedoch nicht des CCR3-Liganden CCL11/Eotaxin, auf aufgereinigte periphere Blut-Eosinphile eines leicht atopischen, nicht asthmatischen Spenders (‰ 99% Reinheit) wurden durch die Zugabe von 10 ng/ml G31P zu den Chemotaxis-Assays vollständig aufgehoben (7, mittleres Feld). Als gegen gereinigte Eosinophile aus einem hypereosinophilen Patienten getestet wurde (7, rechtes Feld), neutralisierte G31P die Reaktionen dieser Zellen auf entweder CXCL8/IL-8 oder CXCL5/ENA-78.
Diese Daten weisen deutlich darauf hin, dass Rinder-G31P ein wirksamer Antagonist der Rinder-ELR-CXC-Chemokine ist, die in vivo als Reaktion auf die Endotoxin-Aussetzung exprimiert werden, er kann jedoch auch Neutrophil- und Eosinophil-ELR/CXC-Chemokin-Rezeptor-Reaktionen auf CXCL8 und CXCL5, für sowohl den CXCR1 als auch CXCR2 bekannte Liganden, vollständig antagonisieren.
Tabelle 1. PCR-Primer, die für die Herstellung jedes CXCL8-Analogons eingesetzt wurden.
Diskussion
Wir zeigten hier, dass CXCL8_(3-74)K11R/G31P ein Antagonist für viele ELR-CXC-Chemokine mit einer hohen Affinität ist. In vitro blockierte dieser Antagonist wirksam alle der Neutrophilchemotaktischen Aktivitäten, die in schwachen bis starken Entzündungsläsionen in zwei Mukosa-Kompartimenten (Lunge, Brust- bzw. Euterdrüsen) exprimiert wurden und blockierte die Endotoxin-induzierten Entzündungsreaktionen in vivo bis zu 97%. Wir erkannten, dass CXCL8 ein Hauptchemolockstoffe in den Pneumonie- und Mastitis-Proben ist, zeigten aber ebenfalls, dass 35% dieser Aktivität in bakteriellen Pneumonie-Proben aufgrund von Nicht-CXCL8-Chemolockstoffen auftrat, die durch CXCL8_(3-74)K11R/G31P ebenfalls wirksam antagonisiert wurden. Basierend auf Studien zu Entzündungsreaktionen in Nagetieren (Ref. 18, 19), Vieh (Ref. 8) und Menschen (Ref. 3) ist es eindeutig, dass diese Proben viele ELR⁺-CXC-Chemokine (z.B. CXCL5 und CXCL8) enthalten können, auf welche CXCL8_(3-78)K11R/G31P eine antagonistische Wirkung zeigt.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4; (ii) einer Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 kodiert; (iii) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, bei der (a) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, (b) Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist und (c) Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist; (iv) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, bei der (a) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, (b) Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist, (c) Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist und (d) Pro32 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Gly substituiert ist; (v) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, bei der (a) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, (b) Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist, (c) Thr12 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Ser substituiert ist, (d) His13 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Phe substituiert ist und (e) Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist;
Isoliertes Polynukleotid, das das Komplement des Polynukleotids gemäß Anspruch 1 umfasst.
Polypeptid, das durch das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
Isolierte Wirtszelle, die das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 (in genetischer Form) enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 4, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bakterien, Hefe, Protozoen, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Viraler Wirt, der das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 (in genetischer Form) enthält.
Isolierte Wirtszelle, die das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 (in genetischer Form) enthält, das mit einer regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, die die Expression des Polynukleotids im Wirt kontrolliert.
Wirtszelle gemäß Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bakterien, Hefe, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Viraler Wirt, der das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 (in genetischer Form) enthält, das mit einer regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, die die Expression des Polynukleotids im Wirt kontrolliert.
Vektor, der das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 umfasst.
Expressionsvektor, der das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 umfasst und mit einer regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, die die Expression des Polynukleotids kontrolliert.
Isolierte Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 11 enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 12, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bakterien, Protozoen, Hefe, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Viraler Wirt, enthaltend den Expressionsvektor gemäß Anspruch 11.
ELR-CXC-Chemokin-Antagonist, umfassend ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz, bei der: (i) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist und Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist; (ii) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist, Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist und Pro32 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Gly substituiert ist; (iii) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist, Thr12 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Ser substituiert ist, His13 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Phe substituiert ist und Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist.
Verwendung des Chemokin-Antagonisten gemäß Anspruch 15 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer CXC-Chemokinvermittelten Erkrankung, wobei das Chemokin an CXCR1- oder CXCR2-Rezeptoren in einem Säugetier bindet.
Verwendung des Chemokin-Antagonisten gemäß Anspruch 15 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer ELR-CXC-Chemokinvermittelten Erkrankung, wobei das Chemokin an CXCR1- oder CXCR2-Rezeptoren in einem Säugetier bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Säugetier ein Mitglied der Familie der Bovidae ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung an ein Säugetier durch Mittel verabreicht werden soll, die ausgewählt werden aus der Gruppe, umfassend intravenöse Verabreichung, intradermale Verabreichung und subkutane Verabreichung.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Erkrankung ausgewählt wird aus der Gruppe, umfassend Ischämie-Reperfusionsschaden, Endotoxämie-induziertes akutes Atemnotsyndrom (ARDS), Immunkomplex-artige Glomerulonephritis, bakterielle Pneumonie und Mastitis.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 3, umfassend: (i) Einbringen eines Gens, das für das Polypeptid kodiert, in eine isolierte Wirtszelle; (ii) Kultivieren der Wirtszelle; (iii) Anreichern des Polypeptids; (iv) Herstellen eines Extrakts, der das Polypeptid enthält; und (v) Aufreinigen des Polypeptids.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Liste, bestehend aus Bakterien, Hefe, Pilzen, Algen, Protozoen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 3 in einer Pflanze, umfassend: (i) Einbringen eines Gens, das für das Polypeptid kodiert, in die Pflanze; (ii) Kultivieren der Pflanze; (iii) Anreichern des Polypeptids in der Pflanze; (iv) Herstellen eines Extrakts, der das Polypeptid enthält; und (v) Aufreinigen des Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 3 in einem nichthumanen Lebewesen, umfassend: (i) Einbringen eines Gens, das für das Polypeptid kodiert, in das Lebewesen; (ii) Aufzucht des Lebewesens; (iii) Anreichern des Polypeptids in dem Lebewesen; (iv) Herstellen eines Extrakts, der das Polypeptid enthält; und (v) Aufreinigen des Polypeptids.
Genfusion, umfassend einen Affinitätstag und ein Polynukleotid, das eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4; (ii) einer Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 kodiert; (iii) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, bei der (a) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, (b) Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist und (c) Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist; (iv) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, bei der (a) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, (b) Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist, (c) Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist und (d) Pro32 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Gly substituiert ist; (v) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein CXCL8-Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, bei der (a) die ersten beiden Aminosäurereste der CXCL8-Wildtyp-Sequenz entfernt sind, (b) Lys11 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Arg substituiert ist, (c) Thr12 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Ser substituiert ist, (d) His13 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Phe substituiert ist, und (e) Gly31 der CXCL8-Wildtyp-Sequenz durch Pro substituiert ist;
Fusionspolypeptid, das durch die Genfusion gemäß Anspruch 26 kodiert wird.
Isolierte Wirtszelle, die die Genfusion gemäß Anspruch 26 (in genetischer Form) enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 28, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bakterien, Hefe, Protozoen, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Viraler Wirt, der die Genfusion gemäß Anspruch 26 (in genetischer Form) enthält.
Isolierte Wirtszelle, die die Genfusion gemäß Anspruch 26 (in genetischer Form) enthält, die mit einer regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, die die Expression der Genfusion im Wirt kontrolliert.
Wirtszelle gemäß Anspruch 31, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bakterien, Hefe, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Viraler Wirt, der die Genfusion gemäß Anspruch 26 (in genetischer Form) enthält, die mit einer regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, die die Expression der Genfusion im Wirt kontrolliert.
Vektor, umfassend die Genfusion gemäß Anspruch 26.
Expressionsvektor, der die Genfusion gemäß Anspruch 26 umfasst und mit einer regulatorischen Sequenz operabel verknüpft ist, die die Expression der Genfusion im Wirt kontrolliert.
Isolierte Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 35 enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 36, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bakterien, Protozoen, Hefe, Pilze, Algen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Viraler Wirt, der den Expressionsvektor gemäß Anspruch 35 enthält.
Verfahren zur Herstellung des Fusionspolypeptids gemäß Anspruch 27, umfassend: (i) Einbringen der Genfusion in eine isolierte Wirtszelle; (ii) Kultivieren der Wirtszelle; (iii) Anreichern des Fusionspolypeptids; (iv) Herstellen eines Extrakts, der das Fusionspolypeptid enthält; und (v) Aufreinigen des Fusionspolypeptids.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Liste, bestehend aus Bakterien, Hefe, Pilzen, Algen, Protozoen, Pflanzenzellen und Zellen von Lebewesen.
Verfahren zur Herstellung des Fusionspolypeptids gemäß Anspruch 27 in einer Pflanze, umfassend: (i) Einbringen der Genfusion in die Pflanze; (ii) Kultivieren der Pflanze; (iii) Anreichern des Fusionspolypeptids in der Pflanze; (iv) Herstellen eines Extrakts, der das Fusionspolypeptid enthält; und (v) Aufreinigen des Fusionspolypeptids.
Verfahren zur Herstellung des Fusionspolypeptids gemäß Anspruch 27 in einem nicht-humanen Lebewesen, umfassend: (i) Einbringen der Genfusion in das Lebewesen; (ii) Aufzucht des Lebewesens; (iii) Anreichern des Fusionspolypeptids in dem Lebewesen; (iv) Herstellen eines Extrakts, der das Fusionspolypeptid enthält; und (v) Aufreinigen des Fusionspolypeptids.
Verfahren zur Aufreinigung des Fusionspolypeptids gemäß Anspruch 27, wobei der Überstand aus einem zellulären Extrakt einer Wirtszelle durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer für einen Affinitätstag spezifischen Affinitätsmatrix aufgereinigt wird, das Polypeptid gemäß Anspruch 3 vom Affinitätstag abgespalten, dialysiert und auf einer für einen Affinitätstag spezifischen Affinitätsmatrix aufgetrennt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei der Affinitätstag ein GST-Fusionsprotein ist, das Fusionspolypeptid vom Überstand unter Verwendung einer Glutathion-Affinitätsmatrix aufgetrennt wird, das Polypeptid gemäß Anspruch 3 vom Affinitätstag mittels Thrombin-Verdau abgespalten, gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert, und auf einer Säule zur Entfernung von Endotoxin aufgetrennt wird.