ES2274957T3 - Antagonistas de elevada afinidad de quimiocinas cxc de elr. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos en la que: (a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, (b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Arg, (c) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Pro; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos, en la que: (a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, (b) LysH 1 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Arg, (c) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Pro; (d) Pro32 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Gly; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos, en la que: (a) los dos primeros restos de aminoácidos de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, (b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Arg, (c) Thr12 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Ser, (d) His13 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Phe; y (e) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Pro;

Description

Antagonistas de elevada afinidad de quimiocinas CXC de ELR.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los antagonistas del receptor de quimiocina CXC.

Antecedentes de la invención

Las quimiocinas CXC que poseen el elemento ácido glutámico-leucina-arginina (ELR) de señalización del receptor (por ejemplo, CXCL1/GRO\alpha, CXCL8/IL-8; ref. 1) son importantes para la afluencia de células inflamatorias que median la mayor parte de las patologías en múltiples estados, incluyendo el daño por reperfusión isquémico (ref. 2, 3), síndrome de dificultad respiratoria agudo inducida por endotoxemia (ARDS; ref. 4), artritis, y glomerulonefritis del tipo complejo inmune, ref. 5. Por ejemplo, las enzimas hidrolíticas liberadas de manera poco apropiada y especies de oxígeno reactivas con neutrófilos activados inician y/o perpetúan los procesos patológicos. Por otra parte, durante la mayoría de las infecciones bacterianas esta respuesta de quimiocina representa una primera línea crítica de defensa, aunque incluso hasta aquí las respuestas de quimiocina CXC de ELR^{+} pueden, vía sus capacidades de activar células inflamatorias que muestran los receptores CXCR1 y CXCR2, exacerbar la patología. Por ejemplo, en la sepsis experimental de punción vermicular y ligadura, la neutralización de MIP-2 reduce la mortalidad de ratón de un 85 a un 38% (ref. 6). Y los tratamientos experimentales que eliminan los neutrófilos circulantes mejoran la patología de la mannheimiosis neumónica (ref. 7), en la que la expresión de CXCL8 en las vías respiratorias efectúa variablemente la quimiotaxia de neutrófilos. (ref. 8, 9). A pesar de la importancia crítica de estas respuestas de quimiocina en muchos estados, las respuestas de células inflamatorias variables son suficientemente perjudiciales para que el desarrollo de herramientas terapéuticas con las que se puedan bloquear las quimiocinas ELR^{+} se ha vuelto una prioridad en la investigación (ref. 10).

Las quimiocinas de “ELR” producen quimiotaxia y activan las células inflamatorias vía sus receptores CXCR1 y CXCR2 (ref. 1, 11). El CXCR1 es específico para CXCL8 y CXCL6/proteína-2 quimiotáctica de granulocito (GCP-2), mientras que el CXCR2 se une a CXCL8 con alta afinidad, aunque también a la proteína-2 inflamatoria de macrófago (MIP-2), CXCL1, CXCL5/ENA-78, y CXCL6 con afinidades algo inferiores (véase, por ejemplo, ref. 10). La señalización de CXCL8 en líneas celulares transfectadas con el CXCR1 o el CXCR2 humano induce respuestas quimiotácticas equipotentes (ref. 13, 14), y aunque los cambios del Ca^{2+} libre citosólico en neutrófilos y la desgranulación celular en respuesta a CXCL8 también están mediadas por ambos receptores, la alergia y la activación de fosfolipasa D según se cree dependen exclusivamente de CXCR1 (ref. 16). Por otra parte, se ha publicado que un antagonista no peptídico de CXCR2, aunque no el CXCR1, antagoniza la quimiotaxia de neutrófilos mediada por CXCL8, pero no la activación celular (ref. 17).

Además, Clark-Lewis et al. (Vol. 269, ejemplar del 10 de junio. págs. 16075-16081, 1994) dieron a conocer los requerimientos estructurales para la función de interleuquina 8 identificada mediante diseño de análogos e híbridos de quimiocina CXC. Clark-Lewis et al. (1994) también han descrito mutaciones en IL-8 en las posiciones de lisina 11 y glicina 31, que sin embargo no mostraron ningún valor de EC_{30} significativo en lo que concierne al tipo silvestre. Hayashi et al. (Journal of Immunology, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, EE.UU., vol. 154, 1995, págs. 814-824) han descrito hexa- y hepta-péptidos sintéticos que inhiben la unión de IL-8 y activan neutrófilos de sangre humana. Además, el documento US 5.665.346 describe análogos humanos de interleuquina-8 (IL-8), que muestran modificaciones en varias posiciones de aminoácidos, por ejemplo en las posiciones Glu4, Leu5 o Arg6.

Finalmente, hay pruebas abundantes de que las quimiocinas son expresadas redundantemente lo más a menudo durante las respuestas inflamatorias (véase, por ejemplo, ref. 8). Pero, a pesar de la investigación activa en el campo, no se conocen antagonistas de quimiocina CXC en la técnica anterior que sean eficaces en la supresión de la actividad celular inflamatoria adversa inducida por ambos receptores de quimiocina ELR-CXC.

Sumario de la invención

Las composiciones según se usan en la presente invención incluyen nuevas proteínas antagonistas de quimiocina ELR-CXC que son capaces de unirse a los receptores CXCR1 o CXCR2 en células inflamatorias de mamíferos. Éstas incluyen a los antagonistas que son capaces de unirse con afinidad alta, en las que "afinidad alta" se refiere a la afinidad del antagonista para al receptor, siendo al menos aproximadamente de un orden de magnitud mayor que la del agonista de quimiocina silvestre. Las nuevas proteínas antagonistas también incluyen las que son sustancialmente equivalentes (es decir, las que contienen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos que no suprimen las funciones de unión de CXCR1 y CXCR2) a una proteína de CXCL8 silvestre bovina (ilustrada en este documento como la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2) y que también lleva un truncamiento de los dos primeros restos de aminoácidos junto con las sustituciones de Lys11 con Arg y Gly31 con Pro. Los análogos de este GXCL_{(3-74)}K11R/G31P también están incluidos, a saber CXCL_{(1-74)}K11R/G31P/P32G y CXCL_{(3-74)}K11R/T12S/H13F/G31P. Además, compuestos que tienen una estructura tridimensional que causa una unión de alta afinidad con los receptores CXCR1 o CXCR2 en células inflamatorias de mamíferos.

Otras composiciones de la invención son nuevos polinucleótidos y polipéptidos que están relacionados con estas proteínas. Un tal nuevo polinucleótido es la secuencia de nucleótidos identificada en este documento como SEQ ID NO: 4, mientras que un tal polipéptido nuevo es la secuencia de aminoácidos identificada en este documento como SEQ ID NO: 1. Además, la invención incluye vectores que comprenden los nuevos polinucleótidos, y vectores de expresión que comprenden los nuevos polinucleótidos asociados operativamente con secuencias reguladoras que controlan la expresión de los polinucleótidos. Las fusiones de gen que comprenden modificaciones por afinidad y los nuevos polinucleótidos están incluidos asimismo en la invención, como son los vectores resultantes y los vectores de expresión que contienen tales fusiones génicas.

La invención también incluye a huéspedes genéticamente modificados que contienen los nuevos polinucleótidos así como huéspedes genéticamente modificados que contienen los nuevos polinucleótidos operativamente asociados con secuencias reguladoras, es decir, asociadas a secuencias reguladoras de tal manera que las secuencias reguladoras controlan la expresión de los nuevos polinucleótidos. También se incluyen los huéspedes que contienen fusiones génicas, asociadas con las secuencias reguladoras de tal manera que las secuencias reguladoras controlan la expresión de las fusiones génicas, o en ausencia de tales secuencias reguladoras. Estos huéspedes pueden ser virus o células, en los que éstas incluyen sin restricción bacterias, levaduras, protozoos, hongos, algas, células de plantas, y células de animales y los derivados de organismos superiores.

La invención comprende además usos de los nuevos polipéptidos en el tratamiento de patologías mediadas por quimiocina CXC que implican a los receptores CXCR1 o CXCR2 en mamíferos. De la misma manera, la invención incluye métodos para tratar patologías mediadas por quimiocina BLR-CXC que implican a los receptores CXCR1 o CXCR2, que comprenden administrar al mamífero afectado una cantidad eficaz de uno de los nuevos polipéptidos. Las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad biológicamente activa de uno de los nuevos polipéptidos también están incluidas en la invención.

Finalmente, los métodos de producción y purificación de los nuevos polipéptidos también están incluidos en la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. El análogo de G31P de CXCL8_{(3-74)}K11R es un inhibidor potente de la unión de CXCL8 a neutrófilos de sangre periférica. Neutrófilos de sangre periférica bovina (pureza del 87-93%) fueron (panel superior) expuestos a 4ºC durante 2 h a análogos de CXCL8_{(3-74)}K11R (10 ng/ml) o al medio (med) solo, luego fueron lavados y fueron igualmente incubados con CXCL8 biotinilado (^{biot}CXCL8; 1000 ng/ml o 129 nM). Estos niveles de CXCL8 se acercan a los encontrados en los tejidos pulmonares de animales con pasteurelosis neumónica (ref. 8,9). Los niveles de unión de ^{biot}CXCL8 a las células fueron determinados usando la tecnología ELISA. Las sustituciones de los aminoácidos representadas en CXCL8_{(3-74)}K11R incluyeron: G31P; P32G; T12S/H13P/G31P; y T12S/H13P/G31P/P32G. El análogo de G31P, pero no P32G, era un antagonista altamente eficaz de la unión de CXCL8 a las células. Tanto con los análogos de G31P como con P32G, las sustituciones adicionales de T12S y H13F redujeron sus actividades antagonistas de CXCL8 (panel inferior). Los neutrófilos fueron expuestos simultáneamente durante 45 minutos a 4ºC a concentraciones variables de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P o CXCL8 no marcado y \sim20 pM de ^{125}I-CXCL8. Este nivel de ^{125}I-CXCL8 fue escogido como casi saturante para los receptores celulares de CXCL8 de alta afinidad (datos no mostrados). Los niveles de ^{125}I-CXCL8 asociados con las células fueron evaluados usando un contador y. Los datos indican claramente que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P tenía una afinidad sustancialmente más alta para los neutrófilos que CXCL8.

Figura 2. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P no es un agonista de respuestas de quimiotaxia de neutrófilos o de la liberación de \beta-glucuronidasa. Los análogos de CXCL8 y G31P, P32G, o G31P/P32G combinados de CXCL8_{(3-74)}K11R fueron analizados respecto a sus actividades agonistas de neutrófilos, usando neutrófilos de sangre periférica bovina recién purificada (panel superior). Las respuestas quimiotácticas a cada proteína fueron analizadas en ensayos de microquimiotaxia de 30 minutos y los resultados fueron expresados como el número promedio (+/-SEM) de células/campo de microscopio de objetivo 40x, como se describe en la sección de métodos. Tanto los análogos de G31P como G31P/P32G mostraron poca actividad quimiotáctica discernible, mientras que el análogo de P32G estimuló respuestas sustanciales a 100 ng/ml (panel inferior). Los neutrófilos fueron expuestos a dosis variables de cada análogo durante 30 minutos, después fueron analizados los productos de secreción celular para \beta-glucuronidasa utilizando el sustrato cromogénico p-nitrofenil-\beta-D-glucuronido, como se presenta en la sección de métodos. La cantidad celular total de \beta-glucuronidasa fue determinada a partir de alícuotas de células lisadas con Triton-X-100. La liberación de enzimas con cada tratamiento se expresa como tanto por ciento de las cantidades celulares totales. Ninguno de los análogos tuvo actividad agonista sustancial, aunque CXCL8 por sí mismo indujo una liberación de enzimas significativa. El tratamiento del control positivo con acetato de forbol-12,13-miristato y el ionóforo del calcio A23187 indujo el 42+/-6% de la liberación de enzimas.

Figura 3. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P es un antagonista altamente eficaz de quimiotaxia de neutrófilo mediada por quimiocina ELR-CXC. La capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P para bloquear las respuestas quimiotácticas de neutrófilos bovinos en varias quimiocinas ELR-CXC fue medida usando ensayos de microquimiotaxia de 20 minutos (panel izquierdo). Las células fueron expuestas simultáneamente a CXCL8 (1 \mug/ml) y a concentraciones variables del análogo. El número de células que respondieron a CXCL8 fue evaluado por recuento directo de las membranas de ensayo de quimotaxia, como en la figura 2. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P fue un inhibidor competitivo altamente eficaz de las respuestas de las células a CXCL8 (panel medio). Curvas-respuesta de dosis para la quimiotaxia de neutrófilos bovinos por CXCL1, CXCL5 o CXCL8 humano. Cada quimiocina mostró un modelo de actividad bifásico, con un máximo a 1-10 ng/ml y a 1 \mug/ml (panel derecho). La capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P para bloquear las respuestas de las células a 1 ng/ml de CXCL5 o CXCL1 humano o 10 ng/ml de CXCL8 humano fue evaluada como antes. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P antagonizó eficazmente cada quimiocina de ELR-CXC, siendo alcanzada la inhibición completa con CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P 3-20 nM.

Figura 4. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P bloquea las actividades de quimiotaxinas CXCL8 y no-CXCL8 expresada dentro de vías respiratorias neumónicas o en mastitis inducida por endotoxina. Los efectos del anticuerpo monoclonal Anti-IL8 8B6 o CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P sobre las respuestas de neutrófilos frente a quimiotaxinas expresadas dentro de las vías respiratorias de animales con pasteurelosis neumónica o en las cisternas mamarias de ganado con mastitis inducida por endotoxina fueron evaluados como en la figura 3. (A) fluidos de lavado broncoalveolar diluido (1:10) (BALF) de lóbulos pulmonares lesionales de ganado neumónico (PULMONÍA) o fluidos de lavado de cisterna de pezón de ganado con mastitis (MASTITIS) fueron analizados como tal (ninguno) o después del tratamiento con uno u otro Mab anti-CXCL8 8B6 (5 \mug/ml) o CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P (G31P; 1 ó 10 ng/ml) respecto a sus actividades quimiotácticas comparadas con el medio solo. Con ambas muestras, los anticuerpos Mab 8B6 por sí mismos neutralizaron el 74% de las actividades quimiotácticas en las muestras, mientras que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P redujo las respuestas en 93-97%. (B) Para confirmar estos resultados usando una estrategia alternativa, después se absorbieron fluidos BAL lesionales con matrices de inmunoafinidad del anticuerpo monoclonal 8B6, eliminando >99% de su contenido de CXCL8, luego se analizaron tanto sus actividades quimiotácticas residuales como la capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P para antagonizar estas actividades quimiotácticas residuales no debidas a CXCL8. Hubo una inhibición dependiente de la dosis de las actividades quimiotácticas totales y residuales en las muestras, indicando que tanto las quimiotaxinas CXCL8 como no-CXCL8 son expresadas en estas lesiones.

Figura 5. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P puede bloquear las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo. Terneros Holstein de dos semanas fueron analizados respecto a sus respuestas inflamatorias neutrofílicas frente a la exposición con endotoxina intradermal (1 \mug/sitio) antes y a varios tiempos después de la inyección de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P (75 \mug/kg) intravenosa (i.v.), subcutánea (subcutan.), o intramuscular (i.m.). Las biopsias locales de reacción de endotoxina por quince horas fueron obtenidas a las 0, 16, 48 y 72 h después del tratamiento y fueron tratadas para su evaluación histopatológica por la respuesta de neutrófilos, como se determina contando los números de neutrófilos en nueve campos de microscopio de objetivo 40x por sección (panel izquierdo). Fotomicrografías de las respuestas en tejido frente a la exposición de endotoxina alrededor de vasos sanguíneos dentro de la dermis reticular antes (0 h) y 48 h después del tratamiento. Grandes números de neutrófilos acumulados alrededor del sistema vascular dentro de la dermis reticular en tejidos antes del tratamiento, pero no después. (B) la representación gráfica de las respuestas de neutrófilos frente a la exposición a endotoxina antes (0 h) o después (16, 48, 72 h) del suministro de CXCL8_{(3-74)}K11R-G31P por cada ruta. ** o *** = p s 0,01 ó 0,001, respectivamente, en relación con las respuestas de pretratamiento de control internas.

Figura 6. Eosinófilos purificados a partir de sangre de donantes asmáticos atópicos o no asmáticos atópicos (paneles izquierdos) o un sujeto con hipereosinofilia (panel derecho) fueron evaluados respecto a sus respuestas frente a CXCL8, CXCL5 o CCL11 recombinantes humanos, en presencia o ausencia de las dosis indicadas de CXCL8_{(3-74)}K11R/GSIP (G31P) recombinante bovino. Bajas dosis de G31P fueron capaces de bloquear las respuestas de estas células frente a cada uno de los ligandos de CXCR1 y CXCR2, pero no tuvieron ningún efecto sobre las respuestas de eosinófilos frente a CCL11 de ligando de CCR3 no relacionada/eotaxina.

Figura 7. Neutrófilos de sangre periférica de un donante sano fueron analizados respecto a sus respuestas frente a CXCL8 o CXCL5 recombinante humano en presencia o ausencia de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P bovino (G31P; 10 ng/ml). G310 bloqueó las respuestas de neutrófilos en ambos ligandos.

Descripción detallada de la invención

(Las siguientes abreviaturas son usadas a lo largo de toda esta descripción: ARDS, síndrome de dificultad respiratoria en adulto; BALF, fluido(s) de lavado broncoalveolar; BHR, Reactivo de Bolton-Hunter; receptores A, B de CXCR1, CXCR2, CXCL8, respectivamente; ELR, elemento ácido glutámico-lisina-arginina; CXCL1, oncogen alfa relacionado con el crecimiento; CXCL4, factor de plaqueta 4; CXCL5, activador-78 de neutrófilo derivado epitelial; CXCL6, proteína-2 quimiotáctica de granulocito; CXCL8, interleuquina-8; fMLP, tripéptido bacteriano formil-metionil-leucilprolina; IPTG, isopropil-tio-D-galactopiranosido; MIP-2, proteína-2 inflamatoria de macrófago; PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo; TMB, tetrametilbencidina).

Cuando el truncamiento de amino terminal de CXCL8 bovino se combina con una sustitución de lisina a arginina en el aminoácido 11 (es decir, CXCL8_{(3-74)}K11R), un aumento drástico de la afinidad del receptor CXCR1 y CXCR2 son evidentes, tal que CXCL8_{(3-74)}K11R inhibe competitivamente la unión de múltiples ligandos frente a ambos receptores (ref. 24). El truncamiento posterior en el elemento de ELR de señalización del receptor (por ejemplo, los aminoácidos 4-6 de CXCL8 humano) de algunas quimiocinas CXC pueden transformarlos en antagonistas del receptor de (CXCL8_{(6-72)}) suaves a (CXCL1_{(8-73)}) moderados (ref. 25). Como se describe en este documento, la introducción en CXCL8_{(3-74)}K11R bovino de una segunda sustitución de aminoácido, glicina 31 a un resto de prolina (es decir, CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P), da a este análogo de CXCL8 una muy alta afinidad antagonista de respuestas de quimiocina de ELR-CXC bovina y humana. Esto antagoniza totalmente la serie entera de quimiocinas de ELR-CXC expresadas dentro de bacterias o focos inflamatorios inducidos por endotoxina y bloquea la inflamación inducida por endotoxina in vivo.

Aunque la siguiente discusión trata principalmente de neutrófilos bovinos, otras células inflamatorias de mamífero (incluyendo a seres humanos) también muestran receptores de CXCR1 y CXCR2 (ref. 52) (véase, por ejemplo, ref. 52) tan vulnerables a la inhibición por CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P. En consecuencia, la presente invención tiene una amplia aplicabilidad en patologías mediadas por quimiocina de ELR-CXC en mamíferos.

En una realización alternativa de la invención, es previsto que los compuestos que tienen la misma estructura tridimensional en el sitio de unión puedan ser usados como antagonistas. El análisis tridimensional de la estructura química se usa para determinar la estructura de sitios activos, incluyendo los sitios de unión para las quimiocinas. Se ha usado química de rastreo de alto rendimiento para generar y optimizar químicamente a un antagonista selectivo de CXCR2 (ref. 17). Un enfoque similar también fue usado para generar un antagonista de CCR3 (ref. 56).

Wells et al. (ref. 57) han empleado espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para detallar la estructura tridimensional de ligandos para CXCR, incluyendo tanto quimiocinas de CXC de ELR como de no ELR. Con su información de RMN, Wells et al. generaron múltiples sustituciones dentro de los sitios de receptor de unión de múltiples quimiocinas, tal que podrían cambiar sustancialmente las especificidades del receptor de ligando.

Material y métodos

Reactivos y suministros. Los reactivos siguientes fueron comprados comercialmente: glutationa-Sepharose, el vector de expresión pGEX-2T, Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia-Biotech, Baie d'Urfé, PQ), reactivo de Bolton-Hunter, un kit de biotinilación de proteínas (Pierce Scientific, Rockford, IL), el vector de secuenciación pBluescript II KS, DNA-polimerasa de PfuTurbo® (Stratagene, La Jolla, CA), kit de mutagénesis dirigida (QuickChange®; Boerhinger-Mannheim Canadá, Laval, PQ), aprotinina, benceno, ionóforo de calcio A23187, cloramine T, citocalasina B, dimetilformamida, endotoxina (lipopolisacárido de Escherichia coli, serotipo 0127B8), isopropil-tio-D-galactopiranosido (IPTG), leupeptina, p-nitrofenil-\beta-D-glucuronido, aceite mineral, aceite de silicio, tetrametilbencidina (TMB), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), acetato de forbol-12,13-miristato (PMA), y Triton X-100 (Compañía Sigma Chemical, Mississauga, ON), un kit de tinción Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Pk, IL), CXCL1, CXCL5, y CXCL8 humano (R & D Systems Inc, Minneapolis, MN), peroxidasa de rábano picante (HRP)-Ig anticonejo conjugada (Zymed, Sur San Francisco, CA), DMEM, HBSS (Gibco, Grand Island, Nueva York), HRP-estreptavidina (Vector Labs, Burlingame, CA), sustrato de enzima ABTS (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD), albúmina de suero bovino (BSA), y Medio de Separación de Linfocitos (ICN Pharmaceuticals, Aurora, IL).

Generación de análogos de CXCL8_{(3-74)}K11R. El CXCL8_{(3-74)}K11R de ligando de CXCR1/CXCR2 de alta afinidad, y su análogo T12S/H13F fue generado conforme a los métodos descritos en Li y Gordon (ref. 24). Los análogos de Gly31Pro (G31P), Pro32Gly (P32G), y G31P/P32G de estas proteínas fueron generados de modo similar por mutagénesis dirigida usando PCR con los cebadores de oligonucleotido apropiados directos e inversos (Tabla 1). Los productos de cada reacción fueron digeridos con DpnI, ligados en el vector pGEX-2T, transfectados en células HB101, y sus secuencias fueron verificadas comercialmente (Plant Biotechnology Institute, Saskatoon). Brevemente, fueron lisadas las bacterias recombinantes en presencia de un cóctel de inhibidor de proteasa (PMSF 2 mM, aprotinina 2 \mug/ml, y leupeptina 2 \mug/ml) y las proteínas de fusión recombinantes en los sobrenadantes fueron purificadas por cromatografía de afinidad, usando perlas de glutationa-Sepharose conforme a los métodos de Caswell et al. (ref. 26). Fueron divididos análogos de CXCL8_{(3-74)}K11R a partir de las proteínas de fusión de GST por digestión de trombina, fueron dializados contra solución salina tamponada con fosfato (PBS), fueron pasados a través de columnas de eliminación de endotoxina comerciales, y luego fueron caracterizados por electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) y fueron sometidos a Western blot con un anticuerpo de CXCL8 antibovino de cabra (proporcionado por el Doctor M. Morsey). Cada análogo purificado tenía una masa molecular de 8 kDa, fue reconocido específicamente por el anticuerpo anti-CXCL8 en el Western blot, y tuvo una pureza relativa de >96%, como se determina por análisis densitométrico de los geles de PAGE.

Marcaje de las proteínas recombinantes. Se usa ^{biot}CXCL8 para los estudios iniciales de unión de análogo a neutrófilos y ^{125}I-CXCL8 para los ensayos de la etapa posterior de afinidad del receptor relativa. CXCL8 fue biotinilado y los niveles de sustitución de biotina fueron determinados utilizando un kit comercial, como se dice en Li y Gordon (ref. 24). El ^{biot}CXCL8 fue sustituido con 2,15 moles de biotina por mol de CXCL8. El CXCL8 fue radiomarcado con ^{125}I utilizando el método del Reactivo de Bolton-Hunter (BHR), como se dice detalladamente (Li y Gordon 2001, ref. 24). La proteína marcada fue separada del ^{125}I-BHR no incorporado por cromatografía en G50 Sephadex, y el CXCL8 marcado fue caracterizado respecto a su afinidad relativa para neutrófilos y el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio de unión, como se dice en Li y Gordon (2001, ref. 24).

Ensayos de unión del análogo de CXCL8_{(3-74)}K11R. Fueron purificadas células (85-93% neutrófilos) a partir de sangre de ganado conforme al método de Caswell (ref. 26). En experimentos preliminares, se determinó que ninguno de los análogos de la invención afectaban a la viabilidad de los neutrófilos, como se determina por la exclusión de tinción de tripano azul. Para los amplios estudios de los análogos, fueron incubados neutrófilos en HBSS/BSA del 0,5% durante 2 h a 4ºC con el análogo, fueron lavados en DMEM frío, y luego fueron incubados durante otras 2 h a 4ºC con ^{biot}CXCL8 (1000 ng/ml). La biotina asociada a las células fue detectada incubando las células lavadas con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (dilución 1:700) y luego con sustrato de enzima ABTS. EL OD_{405} de las muestras fue determinado usando un lector de placas ELISA. Los neutrófilos tratados con medio rutinariamente se unían a CXCL8 lo suficiente para generar un OD_{405} de \sim0,5-0,6.

Para los estudios a fondo con CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P, se usó ^{125}I-CXCL8 en los ensayos de unión de inhibición con CXCL8 no marcado o CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P. En los experimentos preliminares se determinó que el tiempo de equilibrio de unión de neutrófilos para ^{125}I-CXCL8 fue de aprox. 45 minutos y que solamente de ^{125}I-CXCL8 20 pM saturaba los receptores de alta afinidad de la célula. Así, en los ensayos de la invención, fueron incubados 10^{6} neutrófilos purificados durante 45 minutos en hielo con ^{125}I-CXCL8 20 pM y concentraciones variables de ligando competidor no marcado. Las células entonces fueron sedimentadas con aceite mineral del 6% en aceite de silicio y los niveles de radio-ligando asociadas a las células fueron determinados utilizando un contador y. La unión no específica de ^{125}ICXCL8 a las células fue evaluada en cada ensayo por la inclusión de un exceso molar de 200 veces el ligando no marcado en un grupo de muestras. Este valor fue usado para calcular el tanto por ciento de la unión específica (ref. 27).

Ensayo de liberación de \beta-glucuronidasa de neutrófilo. El ensayo de \beta-glucuronidasa de neutrofilo ha sido publicado detalladamente (ref. 24). Brevemente, fueron incubados neutrófilos tratados con citocalasin B durante 30 minutos con los análogos de CXCL8, entonces sus productos de secreción fueron analizados colorimétricamente respecto a la enzima. La liberación de \beta-glucuronidasa fue expresada como el tanto por ciento del contenido celular total, determinado lisando las células tratadas con medio Triton X-100 del 0,2% (v/v). La exposición de neutrófilo con estímulos de control positivo PMA (50 ng/ml) y A23187 (1 \mug/ml) indujo la liberación de 42+/-6% de las cantidades de \beta-glucuronidasa total celular.

Muestras de lesiones inflamatorias. Se obtuvieron fluidos de lavado broncoalveolar (BALF) de pulmones de ganado (n = 4) a los que se les había diagnosticado clínicamente mannheimiosis neumónica fibrinopurvulurenta (ref. 8), así como fluidos de lavado de cisterna de pezón de ganado (n = 4) con mastitis experimental inducida por endotoxina (ref. 28). En los experimentos preliminares de curva-respuesta de dosis se determinó que 5 \mug de endotoxina indujeron una respuesta fuerte (=70-80% máximo) de neutrófilo mamaria. Así, en los experimentos descritos la mastitis fue inducida por la infusión de 5 \mug de endotoxina o medio de vehículo solo (solución salina; volúmenes de 3 ml) en las cisternas de pezón de vacas de leche Holstein que no estaban en periodo de lactación, y 15 h más tarde los infiltrados fueron recuperados de las cisternas por lavado con 30 ml de HBSS. Las células del BALF y de los fluidos de lavado de cisterna de pezón fueron sedimentadas por centrifugación y fueron realizados los recuentos diferenciales. Los fluidos de lavado no tratados y CXCL8-agotados (debajo) fueron evaluados respecto a su contenido de quimiocina por ELISA (CXCL8 sólo) y por ensayos de quimotaxia.

Ensayos de quimotaxia de neutrófilo. Ensayos de microquimiotaxia fueron llevados a cabo por duplicado en cámaras de microquimiotaxia de Boyden modificadas usando filtros de policarbonato de tamaño de poro 5 \mum sin polivinilpirrolidona, conforme a métodos conocidos (ref. 26, 29). Para cada muestra, los números de células que habían emigrado en las membranas en aproximadamente 20-30 minutos fueron contadas por recuento directo de al menos nueve campos con un objetivo de 40x, y los resultados fueron expresados como el número promedio de células/campo de 40x (+/-SEM). Las quimiotaxinas incluían CXCL8 bovino o humano, CXCL5 y CXCL1 humano, BALF de mannheimiosis neumónica y fluidos de lavado de mastitis (diluidos 1:10-1:80 en HBSS), mientras que los antagonistas comprendían anticuerpo de CXCL8 antiovino de ratón 8M6 (generosamente proporcionado por el Doctor P. Wood, CSIRO, Australia) o los análogos de CXCL8_{(3-74)}K11R. En algunos ensayos se preincubaron las muestras con los anticuerpos (5 \mug/ml) durante 60 minutos en hielo (ref. 30). En otros se generaron matrices de inmunoafinidad específicas a CXCL8 con los anticuerpos 8M6 y perlas de Sepharose de Proteína A y se usaron éstas en exceso para absorber las muestras (ref. 8, 31); el ELISA confirmó el grado de agotamiento de CXCL8 de las muestras tratadas. Para los ensayos con los antagonistas recombinantes, los inhibidores fueron mezclados directamente con las muestras inmediatamente antes de las pruebas.

ELISA de CXCL8. Para el ELISA de la invención, fueron usados MAb 8M6 como anticuerpos de captura, antisuero de CXCL8 antiovino de conejo (también de P. Wood, CSIRO) como anticuerpo secundario, y con Ig anticonejo HRP-conjugado, y TMB como el sistema de detección, como se dice en Caswell et al. (ref. 8). Las diluciones sucesivas de cada muestra fueron analizadas por triplicado, y cada ensayo incluyó una curva estándar de CXCL8 recombinante bovino.

Bloqueo de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P de las respuestas de endotoxina in vivo. Se usó una serie secuencial de ensayos de piel de 15 h para analizar la capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P para bloquear las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo. Para cada prueba, se expusieron intradermalmente a vacas sanas Holstein de aprox. 2 semanas a 1 \mug de endotoxina en 100 \mul de solución salina, entonces 15 h más tarde se tomaron biopsias de punción de 6 mm con anestesia local (lidocaína) y se trataron éstas para el análisis de la histopatología (ref. 31). Después de la primera prueba (control positivo interno), se inyectó a cada animal subcutáneamente, intramuscularmente, o intravenosamente CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P (75 \mug/kg) en solución salina, luego se expusieron de nuevo a endotoxina, como anteriormente. Los animales fueron expuestos a un total de 4 veces con endotoxina, tal que fueron obtenidas biopsias del sitio de reacción de 15 h a las 0, 16, 48 y 72 h después del tratamiento. Las biopsias fueron tratadas mediante métodos rutinarios de secciones de 6 \mum de parafina, fueron teñidos con una solución de Giemsa, y examinados con ensayo a ciego con una amplificación de 400x (ref. 31, 32). Los números medios de neutrófilos por campo de microscopio con objetivo de 40x fueron determinados a tres profundidades diferentes dentro de la piel, dermis papilar (superficial), intermedia, y reticular (profunda).

Análisis estadísticos. Los datos de multigrupo fueron analizados por ANOVA y la prueba de la diferencia menos significativa (PLSD) de Fisher protegida post-hoc, mientras que las comparaciones de los dos grupos fueron hechas usando la prueba de t de student (bilateral). Los resultados son expresados como el promedio +/-SEM.

Resultados

CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P inhibe competitivamente la unión de CXCL8 a neutrófilos. Se estudió la capacidad de cada análogo de CXCL8_{(3-74)}K11R para unirse a los receptores de CXCL8 en neutrófilos, y así competir con CXCL8 como un ligando. En los estudios iniciales de los inventores, se emplearon un ensayos de inhibición de unión de ^{biot}CXCL8, incubando las células con los análogos (10 ng/ml) durante 2 h a 4ºC antes de la exposición a ^{biot}CXCL8 (1 \mug/ml). Este nivel de CXCL8 se acerca a los encontrados (ref. 33) en los tejidos pulmonares de oveja con mannheimiosis neumónica experimental (ref. 33). Se encontró que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P era un antagonista potente de la unión de CXCL8 en este ensayo (figura 1), tal que 10 ng/ml de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P bloquearon el 95% de la unión de ^{biot}CXCL8 subsecuente a las células. Cuando se analizó a esta dosis, CXCL8_{(3-74)}K11R/P32G bloqueó sólo el 48% de la unión de CXCL8, mientras que CXCL8 no marcado inhibió por sí mismo competitivamente el 30% de la unión de ^{biot}CXCL8. La introducción en CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P o CXCL8_{(3-74)}K11R/P32G de sustituciones de aminoácidos adicionales a Thr12 y His13 redujo sustancialmente las actividades antagonistas de los análogos (Fig. 1). Estos datos sugieren claramente que la preincubación de neutrófilos con CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P reduce fuertemente la unión subsecuente de CXCL8.

Para trazar un mapa más fino de la capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31 de inhibir la unión de CXCL8, en el siguiente grupo de experimentos que los inventores llevaron a cabo se expusieron simultáneamente células a ^{125}ICXCL8 y a dosis variables de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P o CXCL8 no marcado. Se encontró que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P era aproximadamente dos órdenes de magnitud más eficaz que el CXCL8 silvestre en la inhibición de la unión de ^{125}I-CXCL8 20 pM frente a células (figura 1). La concentración para inhibir el 50% de la unión de ligando marcado (IC_{50}) fue de 120 pM para CXCL8 no marcado, y aprox. 4 pM para CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P. Estos datos sugieren que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P es un inhibidor competitivo muy potente de la unión de CXCL8 a neutrófilos. CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P no muestra actividades de agonista de neutrófilo. Aunque CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P era seguramente un ligando de alta afinidad para los receptores de CXCL8 de neutrófilo, funcionaba igualmente bien como agonista o antagonista. Así, los siguientes experimentos de la invención fueron dirigidos a analizar las actividades agonistas potenciales de los análogos de CXCL8_{(3-74)}K11R que los inventores generaron, tal como se mide por las capacidades quimiotáxicas de estas células o por inducir la liberación de la enzima hidrolítica de gránulo de neutrófilo \beta-glucuronidasa in vitro (figura 2). Los inventores encontraron que hasta a 100 ng/ml, CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P era una quimiotaxina pobre, induciendo 13,9+/-4% o 5,4+/-2% de las respuestas inducidas por 1 o 100 ng/ml de CXCL8 (p <0,001), respectivamente. A 100 ng/ml, el análogo de CXCL8_{(3-74)}K11R/P32G indujo una respuesta que era claramente sustancial (38,3+/-2% de la respuesta de CXCL8), mientras que el análogo de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P/P32G combinado tampoco fue una quimiotaxina eficaz. Cuando se evaluaron sus capacidades para inducir la liberación de \beta-glucuronidasa, los inventores encontraron que ninguno de los análogos de CXCL8_{(3-74)}K11R era tan eficaz como CXCL8 en la inducción de la liberación de mediador. De hecho, los inventores encontraron sólo la liberación de fondo con cualquiera de ellos a \leq10 ng/ml, y a 100 ng/ml sólo CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P/P32G indujo respuestas de neutrófilo significativas (figura 2). Considerando los datos de inhibición competitiva de CXCL8 combinado y de agonista de neutrófilo, a partir de este punto los inventores centraron su atención en CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P.

CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P bloquea las respuestas quimiotácticas de neutrófilos tanto para ligandos de CXCR2 como para CXCR1. El efecto más patógeno de la expresión de quimiocina ELR^{+} inadecuada es la atracción de células inflamatorias en tejidos. Así, después los inventores evaluaron el impacto de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P sobre las respuestas quimiotácticas de neutrófilos a altas dosis de CXCL8 (figura 3). Como se predice por las observaciones de los inventores in vivo en oveja y ganado (ref. 33), 1 \mug/ml (129 nM) de CXCL8 era muy fuerte quimiotáxico, pero hasta dosis muy bajas de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P mejoraron esta respuesta. La adición de 12,9 pM de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P redujo la respuesta quimiotáctica de las células en un 33%. La IC_{50} para CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P en estas condiciones fue de 0,11 nM, mientras que el bloqueo completo de esta respuesta de CXCL8 fue alcanzado con 10 nM de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P.

Cuando se analizó la eficacia de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P en respuestas bloqueantes a más leves exposiciones de CXCL8 bovino, también los inventores ampliaron el estudio para evaluar la capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P de bloquear las respuestas de neutrófilo frente a CXCL8 humano así como a los ligandos específicos a CXCR2 humano CXCL1 y CXCL5. Cada uno de estos se expresa en los tejidos de pacientes afectados de pancreatitis (ref. 34) o ARDS (ref. 3) a 1-10 ng/ml. Los inventores encontraron que los neutrófilos bovinos eran sensibles a \sim1 ng/ml de hCXCL1 o hCXCL5, y de modo similar sensibles a 10 ng/ml de hCXCL8 (figura 3), por lo que los inventores emplearon estas dosis para analizar los efectos de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P en las respuestas de neutrófilos de estos ligandos. Se redujeron las respuestas de neutrófilo a hCXCL1 y hCXCL5 al 50% con CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P 0,26 y 0,06 nM, respectivamente, mientras que sus respuestas frente a hCXCL8 fueron reducidas al 50% por CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P 0,04 nM (la figura 3). Estos datos indican que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P puede antagonizar las acciones de múltiples miembros de la subfamilia ELR-CXC de quimiocinas.

CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P es un eficaz antagonista in vitro de las quimiocinas de neutrófilos expresadas en pulmonía bacteriana o lesiones de mastitis. Los inventores desearon analizar el grado al cual el antagonista de la invención podía bloquear la serie de quimiotaxinas de neutrófilo expresadas dentro de ambientes inflamatorios complejos in vivo. Así, los inventores escogieron dos enfermedades en las cuales la activación de neutrófilos conducida por quimiocina contribuye ampliamente a la progresión de la patología, mastitis y mannheimiosis neumónica. Los inventores utilizaron un modelo de endotoxina de mastitis (ref. 35), en el cual se infundieron 5 \mug de endotoxina/cisterna de pezón y 15 h más tarde se lavó cada cisterna. Los neutrófilos comprendieron el 82 y el 6%, respectivamente, de las células de endotoxina y cisternas control de solución salina, comprendiendo la mayor parte de las células restantes macrófagos. Los fluidos de lavado diluidos (1:10) indujeron fuertes respuestas quimiotácticas de neutrófilo in vitro, y la adición de anticuerpos anti-CXCL8 a las muestras redujeron al máximo estos en 73+/-8% (figura 4A), en relación con el control promedio. Por otra parte, la adición de 1 ng/ml de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P a las muestras redujo su actividad quimiotáctica en un 97+/-3%.

Los neutrófilos también comprendieron el 93+/-12% de las células recuperadas del BALF de ganado con mannheimiosis neumónica avanzada. Cuando se analizaron in vitro, estas muestras también fueron fuertemente quimiotácticas para neutrófilos, y la adición de anticuerpos anti-CXCL8 redujo al máximo sus actividades quimiotácticas de neutrófilo en un 73+/-5% (figura 4A). El tratamiento de estas muestras de BALF con 1 ó 10 ng/ml de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P redujo las respuestas de neutrófilos en un 75 +/-9 ó 93+/-9%, respectivamente, en relación con los controles medios. Estos datos sugieren que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P bloquea las acciones de quimiotaxinas de CXCL8 y no CXCL8 en estas muestras.

Para confirmar estas observaciones usando una estrategia alternativa, después los inventores agotaron las muestras de CXCL8 de BALF de pulmonía bacteriana usando matrices de inmunoafinidad, luego evaluaron la eficacia de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P en el bloqueo de las actividades quimiotácticas de neutrófilo residual en las muestras (figura 4B). Las muestras de BALF lesionales no tratadas contenían 3,215 +/275 pg/ml de CXCL8, mientras que el BALF absorbido por inmunoafinidad de contenía 24 +/-17 pg/ml de CXCL8. En esta serie de experimentos la respuesta de neutrófilos frente a las muestras de BALF de CXCL8 agotadas fue el 65,4+/-4% de sus respuestas frente a las muestras no absorbidas. Se sabe que CXCL8 puede contribuir con tan poco como el 15% de las actividades quimiotácticas de neutrófilos en BALF de mannheimiosis neumónica obtenido de una serie de casos clínicos (ref. 9). Mientras que los tratamientos de agotamiento de CXCL8 fue \geq99% eficaz en la eliminación de CXCL8, quedaron en estas muestras cantidades sustanciales de actividades quimiotácticas de neutrófilo, y la adición de 1 ng/ml de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P abrogó totalmente sus efectos acumulativos (figura 4B). Estos datos sin lugar a dudas confirmaron que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P también antagoniza el espectro de quimiotaxinas no IL-8 expresadas en estas muestras.

CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P es altamente eficaz en bloquear la inflamación neutrofílica inducida por endotoxinas in vivo. En los últimos experimentos de los inventores, se evaluó la capacidad de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P de bloquear las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina en piel de ganado, así como los períodos en los cuales era eficaz. Los animales fueron expuestos intradermalmente con 1 \mug de endotoxina bacteriana 15 h antes (respuesta de control interna positiva), o a tres veces diferentes después, inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular de CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P (75 \mug/kg). Así, fueron tomadas biopsias de punción de sitios de reacción de endotoxina de 15 h a los 15 minutos antes del tratamiento y a las 16, 48 y 72 h después de la inyección del antagonista en cada animal, y los números de infiltrados de neutrófilos fueron determinados a ciego para dermis papilar (superficial), intermedia y reticular de cada biopsia. Antes de los tratamientos de antagonista, las fuertes respuestas inflamatorias neutrofílicas fueron evidentes en los sitios de exposición de endotoxina en cada animal (figura 5). Dentro de las biopsias, las respuestas en la dermis papilar eran suaves en todos los animales (datos no mostrados) y se hicieron cada vez más más marcadas con el aumento de la profundidad de la piel, tal que la inflamación máxima (infiltración de neutrófilo) fue observada alrededor de los vasos sanguíneos en la dermis reticular (figura 5A). Después de los tratamientos con CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P, las respuestas inflamatorias observadas dentro de las biopsias a las 16 h fueron 88-93% deprimidos, mientras que las biopsias a las 48 h fueron 57% deprimidos (intravenoso) al 97% deprimidos (intradermal), en relación con sus respuestas de pretratamiento respectivas. A las 72 h después del tratamiento los efectos del antagonista administrado intravenosamente se habían quitado, mientras que las respuestas de endotoxina en el ganado que había sido tratado intradermalmente y subcutáneamente eran todavía del \sim60% deprimido. Estos datos indican claramente que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P es un antagonista altamente eficaz de respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo, que estos efectos pueden durar durante 2-3 días, y que la ruta de administración afecta notablemente a la farmacocinética de este nuevo
antagonista.

Los inventores han encontrado que G31 antagoniza también los efectos quimiotácticos de las quimiocinas humanas de ELR-CXC CXCL8/IL-8 y CXCL5/ENA-78 en neutrófilos humanos. Así, las actividades quimiotácticas de 0,1 a 500 ng/ml de CXCL8 (figura 6, panel izquierdo) o CXCL5/ENA-78 (figura 6, panel derecho) esencialmente fueron bloqueadas completamente por la adición de 10 ng/ml del antagonista de la invención en ensayos de quimotaxia. Asimismo, G31P bloqueó los efectos quimiotácticos de CXCL8 para eosinófilos CXCR1/CXCR2-positivos. Los inventores y otros han encontrado que los eosinófilos de sujetos atópicos o asmáticos expresan tanto receptores de quimiocina de ELR-CXC, dado que son sensibles a CXCL8 (figura 7, panel izquierdo). Los efectos quimiotácticos de 100 ng/ml de CXCL8, pero no el ligando de CCL11 CCR3 /eotaxina, en eosinófilos de sangre periférica purificada de un donante suavemente atópico, no asmático (‰99% pureza) fueron abrogados completamente por la adición de 10 ng/ml de G31P en ensayos de quimotaxia (figura 7, panel medio). Cuando se analizó contra eosinófilos purificados de un paciente hipereosinofílico (figura 7, panel derecho), G31P fue neutralizado por las respuestas de estas células a CXCL8/IL-8 o CXCL5/ENA-78.

Estos datos indican claramente que G31P bovino es un antagonista eficaz de las quimiocinas de ELR-CXC bovinas expresadas in vivo en respuesta a la exposición a endotoxina, pero también que puede antagonizar totalmente las respuestas del receptor de quimiocina de ELR-CXC de neutrófilos y eosinófilo frente a CXCL8 y CXCL5, ligandos conocidos tanto para CXCR1 como para CXCR2.

TABLA 1 Cebadores de PCR empleados para la generación de cada análogo de CXCL8

1

Se demuestra en este documento que CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P es un antagonista de alta afinidad de múltiples quimiocinas de ELR-CXC. In vitro, este antagonista bloqueó eficazmente todas las actividades quimiotácticas de neutrófilo expresadas en lesiones inflamatorias de suaves a intensas dentro de dos compartimentos mucosos (pulmones, glándulas mamarias), y hasta fueron bloqueadas el 97% de las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo. Los inventores identificaron a CXCL8 como quimiotaxinas principales en muestras de pulmonía y mastitis, pero también han demostrado que el 35% de la actividad en las muestras bacterianas de pulmonía era debida a quimiotaxinas no CXCL8 que fueron también antagonidas eficazmente por CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P. Basado en los estudios de respuestas inflamatorias en roedores (ref. 18, 19), ganado (ref. 8), y seres humanos (ref. 3), es claro que estas muestras podrían contener numerosas quimiocinas CXC ELR^{+} (por ejemplo, CXCL5, y CXCL8) frente a las cuales CXCL8_{(3-74)}K11R/G31P tiene un efecto antagonista.

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<110> Gordon, John R. LI, Fang

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<120> CXCL8_{(3-73)}K11R/G31P ES UN ANTAGONISTA DE ALTA AFINIDAD DE QUIMIOCINA DE ELR-CXC Y BLOQUEA EFECTIVAMENTE LA RECUPERACIÓN DE NEUTRÓFILOS EN RESPUESTAS INFLAMATORIAS

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<130> US001/2178/US

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<150> US 60/273,181

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<151> 2001-03-01

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<160>8

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 72

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 1

2

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<210> 2

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<211> 74

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 2

3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 222

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<212> DNA

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(222)

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<223>

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<400> 3

4

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<210> 4

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<211> 216

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<212> DNA

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(216)

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<223>

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<400> 4

5

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<210> 5

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<211> 45

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador corriente arriba

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagaacttcg atgccagtgc ataagatcat tttccacacc tttcc

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45

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<210> 6

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<211> 43

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador corriente arriba

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagagttatt gagagtccgc cacactgtga aaattcagaa atc

\hfill

43

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 44

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador corriente arriba

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagagttatt gagagtgggg gacactgtga aaattcagaa atc

\hfill

44

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<210> 8

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<211> 43

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador corriente arriba

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\vskip0.400000\baselineskip

<400>8

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagagttatt gagagtccgg gacactgtga aaattcagaa atc

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43

Claims (44)

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(i)

la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4;

(ii)

una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;

(iii)

una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos en la que:

(a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados,

(b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Arg,

(c) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Pro;

(iv)

una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos, en la que:

(a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados,

(b) LysH 1 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Arg,

(c) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Pro;

(d) Pro32 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Gly;

(v)

una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos, en la que:

(a) los dos primeros restos de aminoácidos de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados,

(b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Arg,

(c) Thr12 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Ser,

(d) His13 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Phe; y

(e) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Pro;

2. Un polinucleótido aislado que comprende el complemento del polinucleótido de la reivindicación 1.

3. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1.

4. Una célula huésped aislada genéticamente que contiene el polinucleótido de la reivindicación 1.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, seleccionada a partir del grupo que comprende bacterias, levaduras, protozoos, hongos, algas, células de planta, y células de animal.

6. Un huésped viral que contiene genéticamente el polinucleótido de la reivindicación 1.

7. Una célula huésped aislada genéticamente que contiene el polinucleótido de la reivindicación 1 operativamente asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión del polinucleótido en el huésped.

8. La célula huésped de la reivindicación 7, seleccionada a partir del grupo que comprende bacterias, levaduras, hongos, algas, células de planta y células de animal.

9. Un huésped viral que contiene genéticamente el polinucleótido de la reivindicación 1 operativamente asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión del polinucleótido en el huésped.

10. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

11. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 y que está operativamente asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión del polinucleótido.

12. Una célula huésped aislada que contiene el vector de expresión de la reivindicación 11.

13. La célula huésped de la reivindicación 12, seleccionada a partir del grupo que comprende bacterias, protozoos, levaduras, hongos, algas, células de planta, y células de animal.

14. Un huésped viral que contiene el vector de expresión de la reivindicación 11.

15. Un antagonista de quimiocina de ELR-CXC que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos, en la que:

(i)

los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Arg, y Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Pro;

(ii)

los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Arg, Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Pro, y Pro32 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Gly;

(iii)

los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Arg, Thr12 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Ser, His13 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Phe, y Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Pro.

16. El uso del antagonista de quimiocina de la reivindicación 15 para preparar una composición farmacéutica para tratar una patología mediada por quimiocina de CXC, en la que la quimiocina se une a los receptores CXCR1 o CXCR2 en un mamífero.

17. El uso del antagonista de quimiocina de la reivindicación 15 para preparar una composición farmacéutica para tratar a la patología mediada por quimiocina de ELR-CXC, en la que la quimiocina se une a los receptores CXCR1 o CXCR2 en un mamífero.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que el mamífero es un bovino.

19. El uso de la reivindicación 17, en el que el mamífero es un ser humano.

20. El uso de la reivindicación 17, en el que la composición farmacéutica debe ser administrada al mamífero por un medio seleccionado a partir del grupo que comprende la administración intravenosa, administración intradermal, y administración subcutánea.

21. El uso de la reivindicación 17, en el que la patología se selecciona a partir del grupo que comprende daño por reperfusión de isquemia, síndrome de dificultad respiratoria agudo inducida por endotoxemia, glomerulonefritis compleja inmune, pulmonía bacteriana y mastitis.

22. Un método para producir el polipéptido de la reivindicación 3 que comprende:

(i)

introducir un gen que codifica dicho polipéptido en una célula huésped aislada;

(ii)

cultivar dicha célula huésped;

(iii)

acumular dicho polipéptido;

(iv)

preparar un extracto que contiene dicho polipéptido; y

(v)

purificar dicho polipéptido.

23. Un método de la reivindicación 22, en el que dicha célula huésped se selecciona a partir de la lista que consiste en bacterias, levaduras, hongos, algas, protozoos, células de planta, y células de animal.

24. Un método para producir el polipéptido de la reivindicación 3 en una planta que comprende:

(i)

introducir un gen que codifica dicho polipéptido en dicha planta;

(ii)

cultivar dicha planta;

(iii)

acumular dicho polipéptido en dicha planta;

(iv)

preparar un extracto que contiene dicho polipéptido; y

(v)

purificar dicho polipéptido.

25. Un método para producir el polipéptido de la reivindicación 3 en un animal no humano que comprende:

(i)

introducir un gen que codifica dicho polipéptido en dicho animal;

(ii)

hacer crecer dicho animal;

(iii)

acumular dicho polipéptido en dicho animal;

(iv)

preparar un extracto que contiene dicho polipéptido; y

(v)

purificar dicho polipéptido.

26. Una fusión de gen que comprende una modificación por afinidad y un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(i)

la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4;

(ii)

una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;.

(iii)

una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, teniendo una secuencia de aminoácidos, en la que:

(a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados,

(b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Arg, y

(c) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Pro;

(iv)

una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, que tiene una secuencia de aminoácidos, en la que:

(a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados, CXCL8

(b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Arg,

(c) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Pro; y

(d) Pro32 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Gly;

(v)

una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende una proteína de CXCL8, que tiene una secuencia de aminoácidos, en la que:

(a) los dos primeros restos de aminoácido de la secuencia de CXCL8 silvestre están truncados,

(b) Lys11 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Arg,

(c) Thr12 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Ser,

(d) His 13 de la secuencia de CXCL8 silvestre es sustituida con Phe;

(e) Gly31 de la secuencia de CXCL8 silvestre se sustituye con Pro;

27. Un polipéptido de fusión codificado por la fusión génica de la reivindicación 26.

28. Una célula huésped aislada genéticamente que contiene la fusión génica de la reivindicación 26.

29. La célula huésped de la reivindicación 28, seleccionada a partir del grupo que comprende bacterias, levaduras, protozoos, hongos, algas, células de planta, y células de animal.

30. Un huésped viral que contiene genéticamente la fusión génica de la reivindicación 26.

31. Una célula huésped aislada que contiene genéticamente la fusión génica de la reivindicación 26 operativamente asociada con una secuencia reguladora que controla la expresión de la fusión génica en el huésped.

32. La célula huésped de la reivindicación 31, seleccionada a partir del grupo que comprende bacterias, levaduras, hongos, algas, células de planta, y células de animal.

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33. Un huésped viral que contiene genéticamente la fusión génica de la reivindicación 26 operativamente asociada con una secuencia reguladora que controla la expresión de la fusión génica en el huésped.

34. Un vector que comprende la fusión génica de la reivindicación 26.

35. Un vector de expresión que comprende la fusión génica de la reivindicación 26 y que está operativamente asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión de la fusión génica.

36. Una célula huésped aislada que contiene el vector de expresión de la reivindicación 35.

37. La célula huésped de la reivindicación 36, seleccionada a partir del grupo que comprende bacterias, protozoos, levaduras, hongos, algas, células de planta, y células de animal.

38. Un huésped viral que contiene el vector de expresión de la reivindicación 35.

39. Un método para producir el polipéptido de fusión de la reivindicación 27 que comprende:

(i)

introducir el gen de fusión en una célula huésped aislada;

(ii)

cultivar dicha célula huésped;

(iii)

acumular dicho polipéptido de fusión;

(iv)

preparar un extracto que contiene dicho polipéptido; y

(v)

purificar dicho polipéptido de fusión.

40. Un método de la reivindicación 39, en el que dicha célula huésped se selecciona a partir de la lista que consiste en bacterias, levaduras, hongos, algas, protozoos, células de planta, y células de animal.

41. Un método para producir el polipéptido de fusión de la reivindicación 27 en una planta que comprende:

(i)

introducir el gen de fusión en dicha planta;

(ii)

cultivar dicha planta;

(iii)

acumular dicho polipéptido de fusión en dicha planta;

(iv)

preparar un extracto que contiene dicho polipéptido de fusión; y

(v)

purificar dicho polipéptido de fusión.

42. Un método para producir el polipéptido de fusión de la reivindicación 27 en un animal no humana que comprende:

(i)

introducir el gen de fusión en dicho animal;

(ii)

hacer crecer dicho animal;

(iii)

acumular dicho polipéptido de fusión en dicho animal;

(iv)

preparar un extracto que contiene dicho polipéptido de fusión; y

(v)

purificar dicho polipéptido de fusión.

43. Un método para purificar el polipéptido de fusión de la reivindicación 27, en el que el sobrenadante de un extracto celular de una célula huésped es purificado por cromatografía de afinidad, usando una matriz de afinidad de modificación por afinidad específica, el polipéptido de la reivindicación 3 se divide a partir de modificación por afinidad, se dializa y separa en una una matriz de afinidad de modificación por afinidad específica.

44. El método de la reivindicación 43, en el que la modificación por afinidad es una proteína de fusión GST, el polipéptido de fusión es separado del sobrenadante usando una matriz de afinidad de glutationa, el polipéptido de la reivindicación 3 se divide a partir de la modificación por afinidad por la digestión de trombina, se dializa frente a solución salina tamponada de fosfato (PBS), y se separa en una columna de eliminación de endotoxina.