-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
aminoterminal verkürzte
RANTES, welchen die NH2terminalen Aminosäuren fehlen,
die den Aminosäureresten
1–2 der
natürlich
vorkommenden RANTES entsprechen und welche Chemokin-antagonistische
Aktivität
aufweisen, sowie cDNA-Sequenzen, welche sie kodieren, ihre Verwendung
in der Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen eine
antagonistische Aktivität
der Chemokinwirkungen benötigt
wird und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche sie umfassen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Chemokine bilden eine Familie von
kleinen pro-inflammatorischen Zytokinen mit Leukozyten-chemotaktischen
und -aktivierenden Eigenschaften. In Abhängigkeit von der Position des
ersten Cysteins kann die Chemokinfamilie in C-C-, C-X-C- und C-X3-C-Chemokine
unterteilt werden (Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et
al., 1997 und Taub D. et al., 1996).
-
Viele C-X-C-Chemokine, wie z. B.
Interleukin-8 (IL-8) wirken chemotaktisch auf Neutrophile, während die
C-C-Chemokine, wie z. B. das Monozyten-chemotaktische Protein-3
(MCP-3), aktiv auf eine Vielzahl von Leukozyten wirken, einschließlich Monozyten,
Lymphozyten, Eosinophile, Basophile, NK-Zellen und dentritische
Zellen.
-
Die NH2-treminale
Domäne
von Chemokinen ist in die Rezeptorbindung involviert, und die NH2-terminale Prozessierung kann die Chemokine
aktivieren, ihre Chemokinaktivität
vermindern oder die Chemokine vollständig inaktiv machen.
-
Das C-X-C-Chemokin Plättchen-basisches
Protein (platelet basic protein) wird nur nach Entfernung der 24
NH2-terminalen Reste zu einem Neutrophilen-chemotaktischen
Peptid (NAP-2)(Walz A. et al., 1989 und Van Damme J. et al., 1990).
-
Die Deletion von bis zu 8 NH2-terminalen Resten von IL-8 resultiert in
einer verstärkten
chemotaktischen Aktivität,
die weitere Spaltung des Glu-Leu-Arg-Motivs jedoch, welches in allen
Neutrophilen-chemotaktischen C-X-C-Chemokinen vor dem ersten Cys
lokalisiert ist, verursacht eine vollständige Inaktivierung (Clark-Lewis
I. et al., 1991).
-
Auf ähnliche Weise hat die NH2-terminale Proteolyse (bis zu 8 Aminosäuren) eines
anderen C-X-C-Chemokins, dem Granulozyten-chemotaktischen Protein-2
(GCP-2), keinen Effekt auf die Neutrophilen-chemotaktische Aktivität (Proost
P. et al., 1993a).
-
Bei RANTES (ein Akronym für "Regulated upon Activation,
Normally T Expressed, and presumably Secreted") handelt es sich um ein C-C-Chemokin,
dessen cDNA-Klon von einer cDNA-Bibliothek, welche für T-Zell-spezifischen
Sequenzen angereichert wurde, isoliert wurde (Schall T. J. et al.,
1988).
-
Die synthetischen C-C-Chemokine MCP-1,
MCP-3 und RANTES, welchen die 8 bis 9 NH2-terminalen Aminosäuren fehlen,
sind inaktiv in ihrer Wirkung auf Monozyten und sind nützlich als
Rezeptorantagonisten (Gong J. et al., 1996; und Gong J. et al.,
1995).
-
Die Verlängerung von RANTES mit einem
Methionin resultiert in der vollständigen Inaktivierung des Moleküls, und
Met-RANTES verhält
sich als ein Antagonist gegenüber
authentischem RANTES (Proudfoot A. E. et al., 1996).
-
BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die Hauptaufgabe der vorliegenden
Erfindung sind aminoterminal verkürzte RANTES, welchen die NH2-terminalen Aminosäuren fehlen, die den Aminosäureresten
1–2 der
natürlich
vorkommenden RANTES entsprechen und welche eine Chemokinantagonistische
Aktivität
aufweisen.
-
Eine besondere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist RANTES (3–68),
welches ein RANTES ist, dem die ersten 2 Aminosäuren fehlen, wie in 1 und SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
-
Das aminoterminal verkürzte RANTES
gemäß der Erfindung
kann in einer glycosylierten oder einer nicht-glycosylierten Form
vorliegen.
-
Der Begriff "Chemokin-Antagonist" bedeutet "welcher als ein Antagonist auf die reifen,
vollständig
langen (full-length), natürlich
vorkommenden Chemokine wirkt".
-
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung sind DNA-Moleküle,
welche die DNA-Sequenzen umfassen,
die für
die aminoterminal verkürzten
RANTES gemäß der Erfindung
kodieren, einschließlich
solcher Nukleotidsequenzen, welche im Wesentlichen die Gleichen
sind. Die cDNA-Sequenz von intaktem RANTES ist in Schall T. J. et
al. (1988) offenbart, und die cDNA des verkürzten RANTES kann einfach abgeleitet
werden.
-
"Nukleotidsequenzen,
welche im Wesentlichen die Gleichen sind" beinhalten alle weiteren Nukleinsäuresequenzen,
welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ebenfalls
für die
angegebenen Aminosäuresequenzen
kodieren.
-
Die Erfindung beinhaltet außerdem Expressionsvektoren,
welche die oben genannten DNAs umfassen, Wirtszellen, welche mit
solchen Vektoren transformiert wurden und ein Verfahren zur Herstellung
der aminoterminal verkürzten
RANTES gemäß der Erfindung
durch die Kultivierung der genannten transformierten Zellen in geeigneten
Kulturmedien.
-
Die DNA-Sequenz, welche für die Proteine
gemäß der Erfindung
kodiert, kann in ein geeignetes Plasmid insertiert und ligiert werden.
Sobald er fertiggestellt ist, wird der Expressionsvektor in eine
geeignete Wirtszelle eingeführt,
welche anschließend
den Vektor (die Vektoren) exprimiert, um das gewünschte Protein hervorzubringen.
-
Die Expression von jedem der rekombinanten
Proteine gemäß der Erfindung
wie hierin erwähnt
kann in eukaryontischen Zellen (z. B. Hefen, Insekten- oder Säugetierzellen)
oder in prokaryontischen Zellen, unter Verwendung der geeigneten
Expressionsvektoren durchgeführt
werden. Jedes auf dem Gebiet bekannte Verfahren kann angewendet
werden.
-
Zum Beispiel werden die DNA-Moleküle, welche
für die
durch eines der oben genannten Verfahren erhaltenen Proteine kodieren,
durch auf dem Gebiet wohl bekannte Verfahren in auf geeignete Weise
konstruierte Expressionsvektoren insertiert (siehe Sambrook et al.,
1989). Doppelsträngige
cDNA wird durch Ankoppeln von Homopolymerschwänzen (homopolymeric tailing)
oder durch Restriktionslinking, welches die Verwendung von synthetischen
DNA-Linkern oder von Bluntend-Ligationsmethoden involviert, mit
Plasmidvektoren verbunden: DNA-Ligasen werden verwendet, um die
DNA-Moleküle
zu ligieren, und unerwünschtes
Verbinden wird durch die Behandlung mit Alkalischer Phosphatase
vermieden.
-
Um im Stande zu sein, das gewünschte Protein
zu exprimieren, sollte ein Expressionsvektor außerdem spezifische Nukleotidsequenzen
umfassen, welche transkriptionelle und translationelle regulatorische
Informationen enthalten, die mit der für das gewünschte Protein kodierenden
DNA auf solche Art und Weise verknüpft sind, dass sie die Genexpression
und die Produktion des Proteins ermöglichen. Damit das Gen transkribiert
werden kann, muss ihm zunächst
ein Promotor vorangehen, welcher für die RNA-Polymerase erkennbar
ist und an welchen die Polymerase bindet und somit den Transkriptionsvorgang
initiiert. Verschiedene solcher Promotoren werden verwendet, welche
mit unterschiedlichen Effizienzen funktionieren (starke und schwache
Promotoren).
-
Für
eukaryontische Wirte können
verschiedene transkriptionelle und translationelle regulatorische
Sequenzen verwendet werden, in Abhängigkeit von der Art des Wirtes.
Sie können
von viralen Quellen, wie z. B. dem Adenovirus, dem bovinen Papillomavirus,
dem Simianvirus oder dergleichen stammen, in welchen die regulatorischen
Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, welches eine Expression
auf hohem Niveau aufweist. Beispiele sind der TK-Promotor des Herpesvirus,
der SV40-frühe
Promotor, der Hefe-gal4-Genpromotor, etc. Regulatorische Signale
für die
transkriptionelle Initiation können
ausgewählt
werden, welche die Repression und Aktivierung erlauben, so dass
die Expression der Gene moduliert werden kann.
-
Das DNA-Molekül, welches die für das Protein
gemäß der Erfindung
kodierende Nukleotidsequenz umfasst, wird in einen Vektor (Vektoren)
insertiert, welcher) die in funktioneller Weise verbundenen transkriptionellen
und translationellen regulatorischen Signale aufweist und welcher
fähig ist,
die gewünschten
Gensequenzen in die Wirtszelle zu integrieren.
-
Die Zellen, welche durch die eingefügte DNA
stabil transformiert wurden, können
dadurch selektiert werden, dass außerdem ein oder mehrere Marker
eingeführt
werden, welche die Selektion der Wirtszellen, die den Expressionsvektor
beinhalten, erlauben. Der Marker kann außerdem einem auxotrophen Wirt
Phototrophie zur Verfügung
stellen, Biozidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle,
wie z. B. Kupfer und dergleichen. Das selektierbare Markergen kann
entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Sequenzen verbunden
sein oder durch Kotransfektion in die gleiche Zelle eingeführt werden.
Zusätzliche
Elemente können außerdem für die optimale
Synthese von Proteinen gemäß der Erfindung
erforderlich sein.
-
Wichtige Faktoren bei der Auswahl
eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors beinhalten: die Leichtigkeit,
mit welcher die Rezipientenzellen, die den Vektor enthalten, erkannt
werden können
und aus solchen Rezipientenzellen, die den Vektor nicht enthalten,
selektiert werden können;
die Anzahl von Kopien des Vektors, welcher in einem bestimmten Wirt
gewünscht
wird; und ob es wünschenswert
ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher
Spezien zu "shutteln".
-
Sobald der Vektor (die Vektoren)
oder die das Konstrukt (die Konstrukte) enthaltene DNA-Sequenz für die Expression
hergestellt wurde, kann das DNA-Konstrukt (die Konstrukte) durch
jedes von einer Vielzahl von geeigneten Mitteln in eine geeignete
Wirtszelle eingeführt
werden: durch Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion,
Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, direkte Mikroinjektion,
etc.
-
Die Wirtszellen können entweder prokaryontisch
oder eukaryontisch sein. Bevorzugt sind eukaryontische Wirte, z.
B. Säugetierzellen
wie z. B. humane Zellen, Affenzellen, Mauszellen und Ovarzellen
des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary, CHO), da sie Proteinmolekülen posttranslationelle
Modifikationen zur Verfügung
stellen, einschließlich
einer korrekten Faltung oder der Glycosylierung an den korrekten
Positionen. Auch Hefezellen können
posttranslationelle Peptidmodifikationen, einschließlich der
Glycosylierung, ausführen.
Eine ganze Anzahl von rekombinanten DNA-Strategien existiert, welche
starke Promotorsequenzen und hohe Kopienzahlen von Plasmiden verwenden,
welche für
die Produktion der gewünschten
Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt die Leadersequenzen
in klonierten Säugetier-Genprodukten und
sezerniert Peptide, welche Leadersequenzen tragen (d. h. Präpeptide).
-
Nach der Einführung des Vektors (der Vektoren)
werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium vermehrt, welches
aufgrund des Wachstums von Vektor-enthaltenden Zellen selektioniert.
Die Expression der klonierten Gensequenzen) resultiert in der Produktion
der gewünschten
Proteine.
-
Das aminoterminal verkürzte RANTES
gemäß der Erfindung
kann durch jede andere auf dem Gebiet wohl bekannte Prozedur hergestellt
werden, insbesondere durch die gut etablierten Verfahren der chemischen Synthese,
welche automatisierte Festphasenpeptidsynthesizer verwenden, gefolgt
von chromatografischer Reinigung.
-
Die Chemokine gemäß der Erfindung können z.
B. durch Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), tBoc (t-Butoxycarbonyl)
oder jede andere vergleichbare chemische Synthese mit oder ohne
geeignete Seitenkettenschutzgruppen auf den verschiedenen Aminosäuren synthetisiert
werden. Die Aminosäuren
mit oder ohne geeignete Seitenkettenschutzgruppen werden voraktiviert-
z. B. mit HBTU/HOBt [2-(1H-Benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluromiumhexafluorphosphat/1-Hydroxybenzotriazol] – und an
die wachsende Peptidkette gekoppelt. Vor dem Einfügen der
nachfolgenden Reste wird die Schutzgruppe (z. B. Fmoc) von der α-Aminogruppe
entfernt. Nach der Synthese werden alle Schutzgruppen entfernt,
die intakten full length-Peptide werden gereinigt und chemisch oder
enzymatisch in die korrespondierenden Chemokine gemäß der Erfindung
gefaltet (einschließlich
der Ausbildung von Disulfidbrücken
zwischen den Cysteinen).
-
Die Reinigung der natürlichen,
synthetischen oder rekombinanten Proteine wird durch irgendein der zu
diesem Zwecke bekannten Verfahren ausgeführt, d. h. durch jede beliebige
konventionelle Prozedur, welche die Extraktion, Präzipitation,
Chromatografie, Elektrophorese oder dergleichen (siehe z. B. Proost
P. et al., 1996) umfasst. Eine weitere Reinigungsmethode, welche
vorzugsweise für
die Reinigung des Proteins gemäß der Erfindung
verwendet werden kann, ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung
monoklonaler Antikörper
oder der Affinität
für Heparin,
welche das Zielprotein binden und welche hergestellt und auf einer
Gelmatrix immobilisiert werden, die in einer Säule enthalten ist. Unreine
Herstellungen, welche die Proteine enthalten, werden über die
Säule gegeben.
Das Protein wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden,
während
die Verunreinigungen hindurchlaufen werden. Nach dem Waschen wird
das Protein durch einen Wechsel im pH oder in der Ionenstärke von
dem Gel eluiert.
-
Die aminoterminal verkürzten RANTES
gemäß der Erfindung
sind nützlich
in der Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen eine
antagonistische Aktivität
der Chemokinwirkungen benötigt
wird. Beispiele für
solche Krankheiten beinhalten: inflammatorische Krankheiten, Angiogenese-
und Hämatopoese-abhängige Krankheiten,
Tumore, Infektionskrankheiten, einschließlich HIV, Autoimmunkrankheiten,
Atherosklerose, Lungenkrankheiten und Hautstörungen. Die bevorzugte Verwendung
erfolgt auf dem Gebiet der HIV-Infektion.
-
Folglich stellt die vorliegende Erfindung
in einem weiteren Aspekt die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine
in der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung der oben genannten
Krankheiten zur Verfügung.
-
Das Medikament besteht vorzugsweise
in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die
Proteine gemäß der Erfindung
zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägem und/oder
Exzipienzien. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen bilden noch
einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
-
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
das Verfahren zur Behandlung der oben erwähnten Krankheiten, welches
die Verabreichung einer pharmakologisch aktiven Menge der aminoterminal
verkürzten RANTES
gemäß der Erfindung
an Individuen, welche gefährdet
sind, solche Krankheiten zu entwickeln, oder an Individuen, welche
bereits solche Pathologien zeigen, umfasst.
-
Es wurde außerdem festgestellt, dass CD26/DPP
IV geeignet ist, NH2-terminal verkürzte RANTES
in vitro zu generieren. RANTES ist das erste Zytokin, von welchem
berichtet wird, dass dessen biologische Aktivität durch CD26/DPP IV modifiziert
werden kann.
-
Daher kann CD26/DPP IV in der Therapie
und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen eine antagonistische
Aktivität
der Chemokinwirkungen benötigt
wird, mit besonderem Fokus auf inflammatorische Krankheiten, Immun-
und Infektionskrankheiten, ver wendet werden. Dieses stellt das erste
Beispiel eines identifizierten Mechanismus für endogen regulierte Chemokinmodifikation
in einen Antagonisten dar, ähnlich
der physiologischen Prozessierung, jedoch vermittelt durch andere
Faktoren (Proteasen).
-
Die Erfindung wird nun mittels der
folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht als in irgendeiner Weise
die vorliegende Erfindung limitierend betrachtet werden sollten.
Die Beispiele werden sich auf die Figuren beziehen, welche weiter
unten spezifiziert werden.
-
BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1:
zeigt die Aminosäuresequenz
von RANTES. Signalsequenzen sind kursiv angegeben, während C-Reste
fett gedruckt sind. Pfeile zeigen die ersten Aminosäuren des
aminoterminal verkürzten
RANTES gemäß der Erfindung
an, auch RANTES (3–68)
genannt.
-
2:
Die chemotaktischen Wirksamkeiten von intakten und NH
2-terminal
verkürzten
Formen von natürlichen
oder rekombinanten RANTES gegenüber
monozytischen THP-1-Zellen wurden in dem Boyden-Mikrokammerassay
verglichen: natürliches
RANTES (1–68)(Δ), natürliches
verkürztes
RANTES (3–68)
(☐), intaktes rekombinantes RANTES (1–68)
und
CD26/DPP IVgespaltenes rekombinates RANTES (3–68)(∎). Die Ergebnisse
stellen den mittleren chemotaktischen Index ± SEM (standard error of mean,
Standardabweichung) von vier oder mehr unabhängigen Experimenten dar.
-
3:
Effekt von natürlichem
RANTES (3–68)(⎕),
natürlichem
RANTES (1–68)
(Δ), rekombinantem RANTES
(1–68)
(
und
rekombinantem CD26/DPP IVbehandeltem RANTES (3–68)(∎) auf das [Ca
2+]
i in THP-1-Zellen.
Die Ergebnisse stellen die mittlere Zunahme an [Ca
2+]
i ± SEM
von drei oder mehr unabhängigen Experimenten
dar.
-
4:
zeigt die Desensibilisierung der Ca2+-mobilisierenden
Aktivität
von intaktem recRANTES (1–68) durch
RANTES (3–68).
THP-1-Zellen wurden zunächst
mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen an rekombinantem RANTES (1–68) oder
RANTES (3–68)
stimuliert. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM (von
drei oder mehr unabhängigen
Experimenten) der Zunahme an [Ca2+]i in Antwort auf 30 ng/ml intaktem rekombinantem
RANTES als ein zweiter Stimulus dar.
-
5:
Vergleich der chemotaktischen Potenz von verkürztem RANTES (3–68) mit
intaktem RANTES (1–68).
Die Eosinophilen-Granulozyten-chemotaktische Aktivität von natürlichem
(nat) und rekombinantem (rec) verkürztem RAN-TES, intaktem RANTES und synthetischem
MCP-3 wurden in dem Mikrokammerassay bestimmt. Die Ergebnisse stellen
den mittleren chemotaktischen Index (Cl) ± SEM von zwei oder mehr unabhängigen Experimenten
(jeweils als Triplikat durchgeführt)
dar.
-
6:
Desensibilisierung der Calciummobilisierung durch intaktes RANTES
in CCR-Transfektanten. Calciummobilisierungsexperimente wurden in
HOS-Zellen, welche
mit CD4 und den CC-Chemokinrezeptoren CCR1 oder CCR5 transfiziert
wurden, durchgeführt.
Die Zellen wurden zunächst
mit verschiedenen Konzentrationen an intaktem oder verkürztem RANTES
stimuliert, gefolgt von einer Stimulation mit 100 ng/ml intaktem RANTES.
Der prozentuale Anteil der Inhibition des [Ca2+]i-Anstiegs, welcher durch den zweiten Stimulus
induziert wurde, ist gezeigt. Dieser prozentuale Anteil wurde berechnet
durch Vergleichen der Antwort von 100 ng/ml intaktem RANTES nach
der Zugabe von RANTES (1–68)
oder RANTES (3–68)
mit der Antwort nach der Stimulation mit Puffer (100%). Die Ergebnisse
stellen die mittlere prozentuale Inhibition ± SEM von zwei oder mehr Experimenten
dar.
-
7:
Starker inhibitorischer Effekt von RANTES (3–68) auf die Infektion von
mononukleären
Zellen durch HIV-1. PHA-aktivierte PBMC wurden mit dem Mtropischem
HIV-1 Ba-L-Stamm in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen
an RANTES (1–68)
oder RANTES (3–68)
(0 bis 1000 ng/ml, zugegeben zum Zeitpunkt der Infektion) infiziert.
Nach zehn Tagen wurden die Virusausbeuten in dem Zellüberstand
durch einen p-24 Ag-ELISA kontrolliert (ein repräsentatives Experiment von vier
Experimenten ist gezeigt).
-
8:
Wirkungen von RANTES (1–68)
und RANTES (3–68)
auf die Infektion durch den HIV-1 SF162-Stamm in PHA-aktivierten
PBMC. Die Virusausbeuten wurden zehn Tage nach der Infektion durch
einen p24 Ag-ELISA in dem Zellüberstand
kontrolliert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes von dreien
sind gezeigt. *Unter dem Detektionslimit des p24 Ag-ELISAs (<5 pg/ml).
-
9:
Expression von CD26 auf HOS.CD4.CCR5-Zellen, U87.CD4.CCR5-Zellen
und frisch isolierten PBMC. Der prozentuale Anteil (%) an CD26-positiven
Zellen wird in jedem Histogramm angegeben.
-
10:
Wirkungen von RANTES (1–68),
RANTES (1–68)
plus sCD26 (50 U/L) und RANTES (3–68) auf die Infektion von
HOS.CD4.CCR5-Zellen durch den HIV-1 Ba-L-Stamm. Die Virusausbeuten
wurden 8 Tage nach der Infektion in dem Zellüberstand durch einen p24 Ag-ELISA
kontrolliert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes von
dreien werden gezeigt.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1: Aminoterminal
verkürztes
RANTES
-
Material und Methoden
-
Reagenzien
-
Natürliches humanes RANTES wurde
durch humane Malavu-Hepatosarkomzellen, MG-63 Osteosarkomzellen
oder Leukozyten des peripheren Blutes (Bluttransfusionscenter von
Antwerpen und Leuven) hergestellt und wie zuvor beschrieben gereinigt
(Proost P. et al., 1996 und Proost P. et al., 1993). MCP-2, MCP-3 und
GCP-2 wurden durch Fmoc-Chemie synthetisiert (Proost P. et al.,
1995 und Wuyts A. et al., 1997), rekombinantes humanes RANTES wurde
von Peprotech (Rocky Hill, NJ) erhalten und rekombinantes MCP-1
war ein Geschenk von Dr. J. J. Oppenheim (NCI-NIH, Frederick, MD).
-
Humane Osteosarkom (HOS)-Zellen,
welche mit CD4 und einem der CC-Chemokinrezeptoren CCR1, CCR3 oder
CCRS (Deng H., et al., 1996) transfiziert wurden, wurden in DMEM
mit Glutamax vermehrt. Puromycin (1 μg/ml) wurde dem Medium als ein
Selektionsmittel dazugegeben. Alle Wachstumsmedien (Gibco BRL/Liefe
Technolgies, Paisley, UK) wurden mit 10% FCS angereichert.
-
Humanes CD26/DPP IV wurde von Prostasomen,
Prostata abgeleiteten Organellen, welche frei in der Samenflüssigkeit
vorkommen, erhalten. Das Enzym wurde wie zuvor beschrieben unter
Verwendung von Ionenaustauschchromatografie, gefolgt von Affinitätschromatografie
auf Adenosindeaminase bis zur Homogenität gereinigt (De Meester I.
et al., 1996).
-
Inkubation von Chemokinen
mit CD26/DPP IV und Detektion von proteolytischer Prozessierung
-
Ein 100 bis 1000 molarer Überschuss
an Chemokin wurde über
Nacht mit CD26/DPP IV in 100 mM Tris/HCl pH 7,7 inkubiert. Die Chemokine
wurden durch SDS-PAGE auf einem Tris/Tricingelsystem, wie zuvor beschrieben
(Proost P. et al., 1996), von CD26/DPP IV getrennt.
-
Die Proteine wurden auf PVDF (Polyvinylidenfluorid)-Membranen
(Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) elektrogeblottet und mit
Coomassiebrilliantblau R250 gefärbt.
Nach der Entfärbung
wurden die Membranen wenigstens fünfmal mit ultrareinem Wasser
(Milli Q; Millipore, Bedford, MA) gespült.
-
Um ausreichende Mengen an reinem
verkürztem
Chemokin für
biologische Assays zu erhalten, wurden etwa 50 μg rekombinantes Chemokin mit
CD26/DPP IV behandelt, und das Spaltprodukt wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure (trifluoroacefic
acid, TFA) azidifiziert. Tween 20 (0,01%) wurde dazugegeben, um
zu verhindern, dass die Chemokine an den Gefäßen kleben bleiben.
-
Die Chemokine wurden von CD26/DPP
IV in einen Acetonitrilgradienten auf einer C-8 Aquapore RP-300-Säule (1 × 50 mm)
(Perkin Elmer) abgetrennt. Fraktionen, welche Proteine enthielten,
wurden durch SDS-PAGE und Silbertärbung wie beschrieben analysiert.
-
CD26/DPP IV-behandelte Chemokine,
welche durch RP-HPLC gereinigt wurden oder aus PVDF-Blots ausgeschnitten
wurden, wurden NH2-terminal durch Edmanabbau
in einem Flüssigfarben-477A/120A-Proteinsequenzierer
(Perkin Elmer) unter Verwendung von N-Methylpiperidin als Kopplungsbase
sequenziert.
-
Nachweis der
chemotaktischen Aktivität
-
Die Chemokine wurden auf frisch isolierten
neutrophilen Granulozyten des peripheren Blutes (106 Zellen/ml)
oder auf kultivierten monzytischen THP-1-Zellen (0,5 × 106 Zellen/ml) in der Boyden-Mikrokammer (Proost
P. et al., 1996 und Proost P. et al., 1993) auf ihre chemotaktische
Potenz getestet.
-
Nach 45 min (Granulozyten) oder 2
Std. (THP-1-Zellen) Inkubation bei 37°C wurden die Zellen fixiert und
gefärbt.
Die Zellen, welche durch die Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 5 μg migrierten, wurden
mikroskopisch in zehn Ölimmersionsfelder
gezählt.
-
Der chemotaktische Index (C. I.)
einer Probe (Triplikate in jeder Kammer) wurde berechnet als die
Anzahl von Zellen, welche zu der Testprobe migrierten, geteilt durch
die Anzahl von Zellen, welche in das Kontrollmedium migrierten.
In Desensibilisierungsexperimenten wurden die Zellen für 10 min
bei 37°C
mit biologisch inaktiven Chemokinvarianten inkubiert, bevor sie
in die Kammer transferiert wurden.
-
Der Prozentsatz an Inhibition des
C. I., welcher durch die Desibilisierung mit HBSS behandelten Kontrollzellen
erhalten wurde, wurde für
die Auswertung der Chemotaxis-Desensibilisierung
berechnet.
-
Detektion von intrazellulären Ca2+-Konzentrationen
-
Die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen
([Ca2+]i) wurden
wie zuvor beschrieben gemessen (Wuyts A., et al., 1997). Kurz beschrieben,
wurden die gereinigten Zellen mit dem Fluoreszenzindikator fura-2
(2,5 μM
Fura-2/AM, Molecular Probes Europe BV, Leiden, Niederlande) und
0,01% Pluronic F-127 (Sigma, St. Louis, MO) inkubier.
-
Nach 30 min wurden die Zellen zweimal
gewaschen, in HBSS mit 1 mM Ca2+ resuspendiert
und 10 min bei 37°C
inkubiert, bevor die Fura-2-Fluoreszenz in einem LS50B-Lumineszenzspektrofotometer
(Perkin Elmer) gemessen wurde. Nach der Anregung bei 340 und 380
nm wurde die Fluoreszenz bei 510 nm detektiert. [Ca2+]i wurde berechnet durch die Grynkiewicz-Gleichung
(Grynkiewicz G. et al., 1985).
-
Um den Rmax zu
bestimmen, wurden Zellen mit 50 μM
Digitonin lysiert. Anschließend
wurde der pH mit 20 mM Tris auf 8,5 eingestellt und Rmin wurde
durch die Zugabe von 10 mM EGTA zu den lysierten Zellen erhalten.
Der für
die Kalibrierung verwendete Kd betrug 224
nM. Für
Desensibilisierungsexperimente wurden die Zellen zunächst mit
Puffer oder Chemokin mit verschiedenen Konzentrationen stimuliert.
Als ein zweiter Stimulus wurden Chemokine mit einer Konzentration
dazugegeben, welche eine signifikante Zunahme in dem [Ca2+]i nach Vorstimulierung
mit Puffer induziert. Der Prozentsatz der Inhibition der [Ca2+]i-Zunahme in Antwort auf
den zweiten Stimulus wurde berechnet.
-
Inhibition der HIV-1-Infektion
-
Die HIV-1 M-tropischen Stämme BaL
und SF162 wurden von dem MRC AIDS-Reagenzprojekt (Herts, UK) erhalten.
Mononukleäre
Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells,
PBMC) von gesunden Spendern wurden durch Dichtegradientenzentrifugation
(5,23) isoliert und mit PHA mit einer Konzentration von 1 μg/ml (Sigma,
Bornem, Belgien) 3 Tage lang bei 37°C stimuliert. Die aktivierten
Zellen (PHA-stimulierte Blasten) wurden dreimal mit PBS gewaschen
und mit einem Virus, wie zuvor beschrieben (Schols D. et al., 1997),
infiziert. HIV-1-infizierte oder scheininfizierte PHAstimulierte
Blasten wurden in Anwesenheit von 25 U/ml IL-2 und variierenden
Konzentrationen an RANTES (1–68)
oder RANTES (3–68)
kultiviert. Der Zellüberstand
wurde an Tag 10 gesammelt, und HIV-1-Kernantigen in dem Überstand
wurde durch einen p-24 Ag-ELISA-Kit (DuPont/NEN Life Science Products,
Brüssel,
Belgien) analysiert.
-
Ergebnisse
-
Identifizierung und biologische
Charakterisierung von natürlichem
NH2-terminal verkürztem RANTES
-
Eine andere NH2-terminal
verkürzte
Form von humanem GCP-2 wurde zuvor isoliert (Proost P. et al., 1993).
Die am wenigsten verkürzte
GCP-2-Form wurde hinter dem Pro an der vorletzten Position [GCP-2(3-75)]
gespalten. Unter Verwendung eines ähnlichen Standardreinigungsverfahrens
wurde das C-C-Chemokin RANTES von Leukozyten des peripheren Blutes
oder Sarkomzellen gereinigt (Proost P. et al., 1996).
-
Insbesondere wurde konditioniertes
Medium von MG-63- oder Malavu-Sarkomzellen, welche mit einer Zytokinmischung
induziert wurden, fraktioniert, um natürliche Chemokinvarianten zu
isolieren. Die Chemokine wurden durch anschließende Antikörper- oder Heparin-Affinitätschromatografie,
Kation-Austauscherchromatografie (Mono S FPLC) und RP-HPLC gereinigt,
und immunreaktive Formen wurden durch spezifische Chemokin-ELISAs
detektiert. Auf einer Kationenaustauschersäule wurde von IL-8 beobachtet,
dass es in unmittelbarer Nachbarschaft von RANTES (zwischen 0,7
und 0,75 M NaCl) eluiert. Nichtsdestotrotz wurden beide Chemokine
durch RP-HPLC voneinander getrennt (RANTES und IL-8 eluieren bei
27,5% bzw. 30% Acetonitril). Aminosäuresequenzanalysen der gereinigten
Proteine bestätigte,
dass IL-8 in verschiedenen NH2terminal verkürzten Formen
erscheint, welche zuvor auf der Grundlage ihrer chemotaktischen
Aktivität
isoliert wurden (Van Damme J. et al., 1989). Für RANTES jedoch wurde nur eine
einzige Form isoliert, welcher zwei NH2-terminate
Reste im Vergleich zu intaktem RANTES fehlte. Angesichts seines
vorherrschenden Auftretens wurde dieses RAN-TES (3–68) in größerem Detail analysiert, um
seine chemotaktische Aktivität
auf Monozyten und Eosinophile zu überprüfen. Insbesondere wurde RANTES
(3–68)
auf seine chemotaktische Aktivität
und/oder Aktivität
zur Freisetzung intrazellulären
Ca2+ getestet, und ihre biologische Potenz
wurde mit der von den entsprechenden intakten Chemokinen verglichen.
-
Die NH2-terminale
Deletion von zwei Resten von RANTES resultierte in beträchtlich
abgeschwächten Monozyten-chemotaktischen
und Ca2+-freisetzenden Aktivitäten. Im
Vergleich mit intaktem RANTES (minimale effektive Dosis von 3–10 ng/ml)
war natürliches RANTES
(3–68)
vollständig
inaktiv, wenn es mit so hohen Konzentrationen wie 300 ng/ml in der
Boydenmikrokammer getestet wurde (2).
Zusätzlich
waren 10 mal höhere
Konzentrationen an natürlichem
RANTES (3–68)
im Vergleich zu RANTES (1–68)
notwendig, um eine ähnliche
Ca2+-Antwort zu erhalten (3).
-
CD26/DPP IV entfernt die
NH2-terminalen Dipeptide von Chemokinen
-
Um zu untersuchen, ob die Aminopeptidase
CD26/DPP IV verantwortlich sein könnte für die NH2-terminale
Verkürzung
von RANTES, wurde das intakte Chemokin über Nacht mit CD26/DPP IV inkubiert,
auf PVDF-Membranen geblottet, mit Coomassieblau gefärbt und
einem automatischen Edmanabbau unterzogen. Die Behandlung von RANTES
mit CD26/DPP IV resultierte in der Entfernung der NH2-terminalen
Dipeptide. Die parallele Inkubation von Chemokin in Puffer ohne
CD26/DPP IV hatte keinen Effekt.
-
Da weitere Chemokine die Konsensussequenz
für die
CD26/DPP IV-Spaltung enthielten, und da von dem NH2-Terminus
von MCPs gezeigt wurde, dass er für die biologische Aktivität entscheidend
ist (Gong J. et al., 1996 und Gong J. et al., 1995), wurden MCP-1,
MCP-2 und MCP-3 ebenfalls mit CD26/DPP IV inkubiert.
-
Nach der Behandlung wurden die MCPs
auf PVDF-Membranen geblottet und mit Coomassieblau gefärbt, um
zu bestätigen,
dass eine ausreichende Menge an Protein für den Edmanabbau gewonnen wurde.
-
Jedoch konnte keine NH2-terminale
Sequenz nachgewiesen werden, was andeutet, dass CD26/DPP IV den
Endterminus von MCPs, welcher für
den Edmanabbau durch eine Pyroglutaminsäure blockiert ist, nicht verändert.
-
Vergleich der biologischen
Aktivität
von intaktem und mit CD26/DPP IV-behandeltem RANTES.
-
Ähnlich
wie natürliches
RANTES (3–68),
welches durch C-8 RP-HPLC gereinigt wurde, war CD26/DPP IV-behandeltes
rekombinantes RANTES in Boyden-Mikrokammer-Chemotaxisexperimenten inaktiv, wenn
es mit Konzentrationen von bis zu 1 μg/ml verwendet wurde, während mit
intaktem rekombinantem RANTES von 30 bis 100 ng/ml aufwärts eine
signifikante Monozyten-chemotaktische Antwort nachgewiesen wurde
(2).
-
Als der Verkürzungseffekt in den Ca2+-Mobilisierungsassay untersucht wurde,
induzierte RANTES (3–68)
eine geringe, aber signifikante Zunahme bei einer Konzentration
von 100 ng/ml. Intaktes RANTES jedoch war bereits bei einer Konzentration
von 10 ng/ml aktiv (3).
Schlussfolgernd gesagt, nahm die Monozyten-chemotaktische und Ca2+mobilisierende Potenz von RANTES 10- bis
100fach ab, obwohl nur zwei NH2-terminale
Reste entfernt wurden.
-
RANTES (3–68) ist
ein natürlicher
Chemotaxis-Antagonist für
intaktes RANTES
-
Angesichts der Inaktivität von RANTES
(3–68)
in Monozyten-Chemotaxisexperimenten untersuchten wir, ob dieses
verkürzte
RANTES als ein Antagonist wirken könnte. RAN-TES (3–68) desensibilisierte bei
einer Konzentration von 1 μg/ml
fast vollständig
(82%) für
den chemotaktischen Effekt von 100 ng/ml intaktem RANTES (Tabelle
I).
-
Wenn ein 3facher Überschuss an RANTES (3–68) in
die obere Vertiefung gegeben wurde, wurde die Chemotaxis von THP-1-Zellen
in Richtung intaktem RANTES um etwa 50–70% inhibiert. RANTES (3–68) mit einer
Konzentration von 100 ng/ml konnte immer noch etwa 30% der chemotaktischen
Antwort gegenüber
einer gleichen Konzentration an intaktem RANTES inhibieren.
-
in Ca2+-Mobilisierungsexperimenten
mit THP-1-Zellen (4)
konnten 30 ng/ml intaktes RANTES für den Effekt von 30 ng/ml intaktem
RANTES zu 39 ± 5%
desensibilisieren. Etwa zehnfach höhere Konzentrationen von RANTES
(3–68)
waren notwendig, um dieselbe Menge an Desensibilisierung zu erreichen.
Bei einer Konzentration von 300 ng/ml jedoch ergab RANTES (3–68) selbst
eine signifikante Ca2+-Antwort. Diese Ca2+-Antwort
war vergleichbar mit der Antwort, welche mit 300 ng/ml intaktem
RANTES erhalten wurde.
-
TABELLE
I
RANTES (3–68)
desensibilisiert für
die durch RANTES (1–68)
induzierte Monozytenchemotaxis
1
-
Beeinträchtigte
chemotaktische Aktivität
von RANTES (3–68)
auf humane Monozyten und Eosinophile
-
In Tabelle II wird die chemotaktische
Potenz von natürlichem
RANTES (3–68)
mit der des Monozyten-chemotaktischen Proteins MCP-3 und der von
intaktem RANTES (1–68)
verglichen. Es ist zu erkennen, dass MCP-3 und RANTES (1–68) noch
bei Konzentrationen von 3 ng/ml bzw. 30 ng/ml chemotaktisch wirken auf
frisch isolierte Monozyten des peripheren Blutes, während natürliches
RANTES (3–68)
bei 100 ng/ml inaktiv blieb.
-
Die reduzierte chemotaktische Wirksamkeit
dieser natürlichen
Variante wurde mit rekombinantem RANTES (3–68) bestätigt. Obwohl es auf Monozyten
(bei 1 μg/ml)
schwach chemotaktisch wirkte, zeigte gereinigtes rekombinantes RANTES
(3–68)
eine spezifische Aktivität,
welche 10fach geringer ist als die von intaktem rekombinantem RANTES.
-
Schließlich wurde die chemotaktische
Potenz von RANTES (3–68)
auf humane Eosinophile verifiziert, welche noch ansprechempfindlich
waren gegenüber
100 ng/ml intaktem RANTES und 30 ng/ml MCP-3 (5). Ähnlich
wie bei Monozyten wurde die Eosinophilen-Migration nur durch RANTES
(3–68)
mit einer Konzentration von 1 μg/ml
stimuliert.
-
TABELLE
II
Vergleich der Monozyten-chemotaktischen Aktivität von RANTES
(3–68)
mit RAN-TES (1–68) und
MCP-3
-
RANTES (3–68) signalisiert
und desensibilisiert für
RANTES (1–68) über CCRS,
nicht jedoch über
CCR1 und CCR3
-
Um die reduzierte chemotaktische
Aktivität
von RANTES (3–68)
zu erklären,
wurde die Fähigkeit
dieser Chemokinvariante, an die bekannten Rezeptoren, welche von
RANTES verwendet werden, zu binden und über diese zu signalisieren, überprüft.
-
HOS-Zellen, welche mit den Chemokinrezeptoren
CCR1, CCR3 oder CCRS transfiziert wurden, wurden in einem Signalgebungsassay
(signaling assay) verwendet, welches die Zunahmen der intrazellulären Calciumkonzentration
misst. Bei Konzentrationen von bis zu 300 ng/ml erhöhte RANTES
(3–68)
nicht das [Ca2+]i in
HOS-Zellen, welche mit CCR1 transfiziert wurden (Tabelle III) oder
mit CCR3 (Daten nicht gezeigt), während 30 ng/ml und 100 ng/ml
von intaktem RANTES ausreichend waren, um eine Erhöhung von
[Ca2+]i in CCR1-
bzw. CCR3-Transfektanten zu induzieren.
-
Jedoch waren sowohl intaktes als
auch verkürztes
RANTES fähig,
eine signifikante Zunahme von [Ca2+]i in CCR5-Transfektanten bei einer Konzentration
von 30 ng/ml zu induzieren. Darüber
hinaus wurde durch eine Präinkubation
von CCR5 transfizierten Zellen mit einem 3 bis 10fachen Überschuss
an entweder RANTES (3–68)
oder an intaktem RANTES eine vergleichbare Inhibition (etwa 75%)
der [Ca2+]i-Erhöhung durch
eine anschließende
erneute Stimulierung (challenge) mit intaktem RANTES (100 ng/ml)
erhalten (6).
-
Dagegen konnten 300 ng/ml RANTES
(3–68)
für die
Calciumantwort von CCR1- und CCR3-transfizierten Zellen gegenüber 100
ng/ml intaktem RANTES nur marginal desensibilisieren, während ein
3facher Überschuss
an intaktem RANTES als erster Stimulus die [Ca2+]i-Erhöhung
in diesen Zellen durch anschließend
gegebenes RANTES (1– 68)
fast vollständig
inhibierte. Daraus muss geschlossen werden, dass die Entfernung von
zwei NH2-terminalen Resten von RANTES eine
signifikante Auswirkung auf die Signaltransduktion hat, insofern,
als die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR3 nicht länger funktionell erkannt werden.
Folglich kann die beeinträchtigte
chemotaktische Potenz von RANTES (3–68) erklärt werden durch dessen Unfähigkeit, über CCR1
und CCR3 zu wirken. Dagegen behält
RANTES (3–68)
die CCR5-Signalisierungseigenschaften von intaktem RANTES vollständig. RANTES
(3–68)
kann durch Kompetitieren mit intaktem RANTES antünflammatorisch wirken, jedoch
aufgrund des Erhalts seiner Fähigkeit,
an CCRS zu binden, weiterhin als ein HIV-Inhibitor fungieren.
-
TABELLE
III
Calciummobilisierung durch RANTES-Formen in CCR1- und CCRS-Transfektanten
-
Inhibition von CC-Chemokin-induzierter
Chemotaxis durch RANTES (3–68)
in humanen monozytischen Zellen
-
Um zu überprüfen, ob die Inhibition der
CC-Chemokinsignalgebung durch RANTES (3–68) auch in monozytischen
Zellen auftrat, wurden Inhibitionsexperimente in THP-1-Zellen durchgeführt. Es
wurde bewiesen, dass RANTES (3–68)
eine 10fache Verminderung in der Fähigkeit, [Ca2+]i in monozytischen Zellen zu erhöhen, im
Vergleich mit intaktem RANTES zeigte (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich war
die chemotaktische Wirkung von intaktem RANTES (30 ng/ml) auf monozytische
Zellen durch Inkubation der Testzellen mit 300 ng/ml RANTES (3–68) inhibiert
(71%), wie in Tabelle IV gezeigt.
-
Darüber hinaus verminderte RANTES
(3–68)
die chemotaktische Antwort auf andere CC-Chemokine, einschließlich dem
Monozyten-chemotaktischen Protein-3 (MCP-3) (67 %), dem Makrophagen-inflammatorischen
Protein-1a (MIP-1α)(61%)
und MIP-1β (80
%).
-
Dies veranschaulicht, dass RANTES
(3–68)
als ein Breitspektruminhibitor auf die durch andere CC-Chemokine
induzierte monozytische Zellmigration wirkt.
-
TABELLE
IV
Inhibition der Chemotaxis von monozytischen Zellen gegenüber CC-Chemokinen
durch RANTES (3–68)
-
Die CD26-spezifische Verkürzung von
RANTES ist notwendig für
dessen antivirale Aktivität
-
Die Wirkungen von verschiedenen Formen
von RANTES wurden zunächst
gegenüber
zwei verschiedenen M-tropischen HIV-1-Stämmen (BaL und SF162) in humanen
PBMC, welche von gesunden Blutspendern erhalten wurden, untersucht.
Der IC50 von intaktem RANTES (1–68) gegenüber dem
BaL-Stamm war 3,4 nM und für
RANTES (3–68)
war der IC50 0,39 nM. Der IC50-Wert
für RANTES
(1–68)
betrug 71 nM, was in etwa das 10fache des IC50 für RANTES
(3–68)
war. Bei der Untersuchung in PBMC war RANTES (1–68)(IC50:
23 nM; IC50: 95 nM) mehr als 10fach weniger
aktiv als RANTES (3–68)
(IC50: 2 nM; IC90:
8,2 nM) (Tabelle V). Die konzentrationsabhängigen Wirkungen von beiden
Chemokinen bei Konzentrationen in einem Bereich von 133 bis hinunter
auf 0,2 nM gegen HIV-1 SF162-Replikation in PBMC sind in 8 gezeigt. Eine Konzentration von
5,2 nM RANTES (3–68)
war klar wirksam in der Reduzierung der Virusreplikation, während RANTES (1–68) bei
dieser Konzentration inaktiv war. Kein Unterschied in der antiviralen
Aktivität
wurde zwischen intaktem RANTES, welches von PeproTech oder von R&D Systems erhalten
wurde, beobachtet.
-
Der erstaunliche Unterschied in der
antiviralen Aktivität
zwischen den beiden Formen von RANTES wurde noch offensichtlicher,
wenn sie in den humanen CCRS-transfizierten Zellen untersucht wurde.
In U78.CD4.CCR5-Zellen war der IC50 für RANTES
(1–68)
und RANTES (3–68)
gegen den BaL-Stamm 21 nM bzw. 0,65 nM. Der IC50 für RANTES
(1–68)
betrug mehr als 133 nM, während
der IC50 für RANTES (3–68) 63 nM betrug. In Tabelle
V wird außerdem
gezeigt, dass RANTES (1–68)
praktisch inaktiv war in den HOS.CD4.CCR5-Zellen (IC50 > 133 nM), während RANTES
(3–68)
ein starker Inhibitor der HIV-1 BaL-Replikation in diesen Zellen
ist (IC50: 5,5 nM). Jedoch wurden keine
IC50-Werte
für beide
Formen von RANTES in diesen Zellen erreicht.
-
Die antivirale Aktivität von RANTES
ist abhängig
von der Anwesenheit von membrangebundenem oder löslichem CD26 (sCD26).
-
Die CD26-Expression auf den beiden
verschiedenen CCRS-transfizierten Zelllinien und auf frisch isolierten
PBMC wurde untersucht. HOS-Transfektanten waren negativ für die CD26-Expression,
wie durch durchflusszytometrische Analyse bestimmt, während U87- Transfektanten schwach,
jedoch signifikant positiv mit dem Anti-CD26-Mausantikörper (anti-CD26
mAb, 9) gefärbt wurden.
Zusätzlich
wurde von einer Subpopulation von frisch isoliertem PMBC festgestellt,
dass sie stark positiv für
die CD26-Expression ist (9).
-
Die konzentrationsabhängige Wirkung
von RANTES (1–68)
und RANTES (3–68)
auf die virale p24 Ag-Produktion durch den BaL-Stamm in HOS.CD4.CCR5-transfizierten
Zellen in der Anwesenheit von sCD26 ist in 10 gezeigt. Die Zugabe von sCD26 zusammen
mit RANTES (1–68)
zu Beginn der HIV-Infektion verstärkte die antivirale Aktivität des intakten
RANTES in HOS.CD4.CCR5-Zellen signifikant. Wenn sCD26 mit einer
Konzentration von 50 U/I zusammen mit RANTES dazugegeben wurde,
wurde ein IC50 von 13 nM für RANTES
erhalten. Die Zugabe von sCD26 allein hatte keinen Effekt auf die
Virusreplikation. Die Zugabe von sCD26 zu RANTES (3–68) veränderte die
antivirale Aktivität
von RANTES (3–68)
ebenfalls nicht (Daten nicht gezeigt). Folglich ist die Anwesenheit
von CD26 essentiell, damit intaktes RANTES antiviral aktiv wird.
-
Die aminoterminale Verkürzung von
natürlichem
MIP-1α beeinträchtigt seine
anti-HIV-1-chemotaktische
und Ca2+-mobilisierende Aktivität nicht.
-
Da die Mehrheit von natürlichem
MIP-1α NH2-terminal verkürzt ist (vier Aminosäuren), haben
wir untersucht, ob dieses verkürzte
MIP-1α(5–70) eine
veränderte
HIV-1-inhibitorische Eigenschaft aufwies. Im Gegensatz zu den Ergebnissen,
welche für
RANTES erhalten wurden, wurden für
die IC50-Werte von intaktem MIP-1α und MIP-1α(5–70) in
PMBC oder CCR5-transfizierten Zellen keine Unterschiede nachgewiesen
(Tabelle V, 8). Zusätzlich wurden
intaktes MIP-1α und
verkürztes
MIP-1α(5–70) in
Chemotaxis-Assays und Mobilisations-Assays für intrazelluläres Ca2+ auf THP-1-monozytischen Zellen verglichen.
Tabelle VI zeigt, dass die minimale wirksame Dosis von MIP-1α(5– 70), welche
eine Erhöhung
des [Ca2+]i induziert,
nur wenig geringer war als die von intaktem MIP-1α. Darüber hinaus
waren die minimalen wirksamen Konzentrationen von beiden MIP-1α Isoformen
relativ ähnlich,
obwohl die maximale Migration, welche mit 0,13 nM in dem Chemotaxisassay
erhalten wurde, höher
für intaktes
MIP-1α war.
Zusammenfassend muss daraus geschlossen werden, dass die NH2-terminale Prozessie rung von MIP-1α im Gegensatz
zu RANTES dessen inflammatorische Aktivität und Anti-HIV-1-Aktivität nur minimal schwächt.
-
TABELLE
V
Anti-HIV-1-Aktivität
von RANTES und MIP-1α in
PHA-stimulierten PBMC, U87.CD4.CCR5-Zellen.
-
Die Virusausbeute wurde 8–12 Tage
nach der Infektion in dem zellfreien Überstand durch den viralen p24
Ag-ELISA kontrolliert. Die durchschnittlichen IC50-
und IC90-Werte (in nM) werden gezeigt. Die
Daten stellen die Durchschnittswerte von zwei bis 4 unabhämgigen Experimenten
dar. Der Wert, welcher durch ">130" gekennzeichnet ist, zeigt an, dass
eine 50%- oder 90%-Inhibition bei 130 nM nicht erreicht wird. ND,
nicht durchgeführt.
-
TABELLE
VI
Fehlen eines Unterschiedes in der biologischen Potenz zwischen
intaktem und verkürztem
MIP-1α.
-
REFERENZEN
-
Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol.,
55, 97–179,
1994.
-
Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol.,
15, 675–705,
1997.
-
Clark-Lewis I. et al., J. Biol. Chem.,
266, 23128–23134,
1991.
-
De Meester I. et al., J. Immunol.
Methods 189, 99–10526,
1996.
-
Deng H. et al., Nature, 381, 661–666, 1996.
-
Gong J. et al., J. Exp. Med., 181,
631–640,
1995.
-
Gong J. et al., J. Biol. Chem. 271,
10521–10527,
1996.
-
Grynkiewicz G. et al., J. Biol. Chem.
260, 3440, 1985.
-
Proost P. et al., Biochemistry, 32,
10170–10177,
1993a.
-
Proost P. et al., J. Immunol., 150,
1000–1010,
1993.
-
Proost P. et al., Cytokine, 7, 97–104, 1995.
-
Proost P. et al., Methods: A companion
to Methods in Enzymol., 10, 82, 1996.
-
Proudfoot A. E. et al., K- Bopö- Chem.,
271, 2599–2603,
1996.
-
Sambrook et al., Molecular Cloning:
A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY, 1989.
-
Schall T. J. et al., J. Immunol.,
141, 1918–1025,
1988.
-
Schols D. et al., J. Exp. Med., 186,
1383–1388,
1997.
-
Sozzani S. et al., J. Immunol, 152,
3615, 1994.
-
Taub D. et al., Cytokine & Growth Factor
Reviews, 7, 335–76,
1996.
-
Van Damme J. et al., Eur. J. Biochem.,
181, 337–344,
1989.
-
Van Damme J. et al., Eur. J. Immunol.,
20, 2113–8,
1990.
-
Van Damme J. et al., J. Exp. Med.,
176, 59, 1992.
-
Walz A. et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 159, 969–75,
1989.
-
Wuyts A. et al., Biochemistry 36,
2716–2723,
1997.
-
-
-