DE69531955T2

DE69531955T2 - PROGRESSIVE ANDERUNG VON SIGNAL-PROTEINEN UND PEPTIDEn UND DIE HERGESTELLTEN SUPERAGONISTEN UND ANTAGONISTEN

Info

Publication number: DE69531955T2
Application number: DE69531955T
Authority: DE
Inventors: Victor Smit; Willem Huppes
Original assignee: PHARMA KEY BV
Current assignee: STICHTING PHARMA PARK IP, ALMERE, NL
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: WO1996006860A3; DE69531955D1; JPH10507161A; EP0796276A1; AU3266895A; NL1000332C1; US20020150551A1; ES2208691T3; EP0796276B1; CA2198919A1; WO1996006860A2

Description

Wissenschaftliches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung liegt im Gebiet der chemischen Modifikationstechnologie von biologisch aktiven Proteinen und Peptiden. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von chemischer Modifikation zum Erhalt eines Proteins oder Peptids mit herausragenden Eigenschaften oder mit neuen oder sogar entgegengesetzten Eigenschaften. Zudem betrifft die Erfindung auch ein neues Verfahren zur Strukturfunktionsanalyse unter Verwendung von gradueller chemischer Modifikation, ein biologisches Prinzip, nämlich die katalytische Aktivität von Signalpeptiden und die Aushebung davon, was zu einem sehr wirksamen Hemmstoff für akute myeloide Leukämiezellen führt.
Als Veranschaulichung, jedoch nicht als Beschränkung zeigen wir die chemische Modifikation von menschlichem IL-3, ein Protein, das auch einen wesentlichen therapeutischen Wert nach der Modifikation aufweist. Diese Patentbeschreibung enthält auch spezifische Beispiele innerhalb des therapeutischen Gebiets der Erfindung.
Gebiet der Anwendung
Es gibt zwei mögliche Anwendungsgebiete, die für die Erfindung wichtig sind: ein Gebiet für ein IL-3 mit herausragenden Eigenschaften (Superagonist) oder ein Gebiet für ein IL-3 mit gegenwirkenden oder neuen Eigenschaften (Antagonist). In dieser Patentbeschreibung sind Superagonisten z. B. ein IL-3 mit einer verminderten Antigenizität und/oder einer höheren biologischen Aktivität und/oder einer höheren Stabilität.
Mögliche Anwendungen für IL-3-Superagonisten sind:

– Reduktion der zytogenen Phase nach myelo-entfernender Therapie, wie nach induktiver Therapie für Knochenmarkstransplantation oder nach unbeabsichtigter Strahlung;
– Einbringen eines synchronisierten Zellzyklus von Zellen mit einem IL-3-Rezeptor, z. B. zur Chemotherapie von Leukämien;
– Einbringen einer Erhöhung der IL-3-abhängigen Nachkommenschaft sowohl für die Anzahl an Zellen und deren Aktivierung zur Behandlung von Erkrankungen wie Wurminfektionen, Tuberkulose, Pilzinfektionen und bestimmte virale Infektionen;
– selektives Auswachsen des Knochenmarks gegen kernhaltigen Zellen, mit der Ausnahme von Lymphozyten, z. B. mit Brandwunden und nicht homologen Hauttransplantaten.

Einige, jedoch nicht alle Beispiele für Anwendungen von Signalsubstanzantagonisten (mit gegenwirkender oder Zell-hemmender Aktivität), insbesondere von IL-3 sind:

– Hemmung und/oder Neutralisation von myeloiden Zellen bei Knochenmarkstransplantation;
– Myelo-Unterdrückung bei Autoimmunerkrankungen, Krebs und Erkrankungen der blutbildenden Organe wie Sichelzellenanämie und Thallisämie;
– Behandlungen zum Heilen aller Krebsarten, die Zellen mit dem IL-3-Rezeptor beinhalten, insbesondere fast aller Formen von akuter myeloider Leukämie oder chronischer myeloider Leukämie, B-Zellen-Lymphoidtumoren oder anderen Krebsformen, die durch IL-3 stimuliert werden, z. B. bestimmter Follikelzelltumoren;
– Induzieren von Selbsttoleranz gegenüber dem Gewebe bei Autoimmunerkrankungen wie Arthritis, rheumatische Arthritis und Erkrankungen des zentralen Nervensystems durch Unterdrückung oder Eliminierung von lymphoiden Zellen, die den IL-3-Rezeptor enthalten. Dies kann auch zu der beeinträchtigten Bildung und Eliminierung von Effektor-Zellen wie das eosinophile Granulozyt führen. Schließlich ist es möglich, dass eine direkte Wechselwirkung mit diesen Zellen vorliegt, womit eine direkte Heilung des eosinophilen Syndroms ermöglicht wird. Dies ist auch in akuten Phasen von Wurminfektionen und Hypersensitivitätsreaktionen z. B. auch gegenüber medizinischen Arzneimitteln von größter Wichtigkeit;
– Heilen von eosinophilen Syndromen wie bei eosinophiler Gastritis und Enteritis, Faszitis, Granulomatose, Sinusitis, Pheumänie, Asthma, Churg-Strauss-Syndrom und anderen angitischen Behandlungen des Schock-Syndroms, z. B. durch Abtöten oder Unterdrücken der Anzahl an Effektor-Zellen;
– Entfernung oder Unterdrückung von Zellen mit einem IL-3-Rezeptor, wie Lymphoid-Zellen und/oder Effektor-Zellen, wie das eosinophile Granulozyt, zur Behandlung von Allergien. In diesen Fällen sind die Unterdrückung der Allergie und das Einbringen von Toleranz gegenüber dem Antigen möglich;
– andere allergetische Reaktionen, an welchen die Wirkung von IL-3 beteiligt ist;
– Behandlungen zum Vorbeugen von Metastasen, die von IL-3-vermittelter Haftung stimuliert werden;
– Behandlung von infektiösen Erkrankungen, z. B. durch Unterdrücken einer akuten Phase, wobei ein Auftreten von überschüssigen Mengen an Wachstumsfaktor im Blutstrom vorliegt.

Eine oder mehrere dieser Anwendungen können auch für andere Wachstumsfaktoren wie die anderen Interleukine 1–8, GM-CSF, TNF und Gamma-IFN erwähnt werden, die ebenso gute Kandidaten für die erfindungsgemäße Modifikation sind. Hierbei soll „IL-3" durch die anderen Signalsubstanzen ersetzt werden. Da die Wechselwirkungsarten der verschiedenen Substanzen in verschiedenen Erkran kungen von Substanz zu Substanz variieren können, können auch verschiedene synergistische Wirkungen erwartet werden. Deshalb sind diese ebenfalls in der Erfindung verkörpert. Schließlich können die folgenden Anwendungen zugefügt oder spezifiziert werden:

– IL-1-Hemmung zur Unterdrückung von IL-1-stimulierten Metastasen von Melanomen und Formen von Lungenkrebs
– IL-1-Hemmung zur Unterdrückung von Alzheimer-Krankheit
– IL-2-Hemmung zur Unterdrückung des Syndroms der blutenden Kapillaren
– IL-2-Hemmung zur Unterdrückung von Periodontitis
– IL-4-Hemmung zur Unterdrückung von Periodontitis
– IL-4-Hemmung zur Unterdrückung von IL-4-stimulierten Viren, wie z. B. des Bestrahlungs-Leukämieviruses in Mäusen
– IL-5-Hemmung zur Unterdrückung von IL-5-stimulierten Infektionen des Atemwegtrakts
– IL-6-Hemmung zur Unterdrückung von rheumatoider Arthritis
– IL-10-Hemmung zur Unterdrückung von Infektionen von Mycobakterium.

Da man feststellen kann, dass die modifizierten Signalpeptide auch durch Molekularbiologie gebildet werden können, werden diese Mutantproteine, DNA-Konstrukte und die Verwendung davon ebenfalls im Rahmen der Erfindung betrachtet. Hierbei kann man Gentherapie mit den Konstrukten, die den Code für solche Peptide und/oder Proteine enthalten, einschließen. Die Verwendung in der Gentherapie kann zu Zellen führen, die den Superagonisten oder den Antagonisten produzieren und absondern. Deshalb gibt es in einem der Beispiele auch eine Ausarbeitung über die Möglichkeit, einen Wachstumsfaktor mit einer reduzierten Stabilität zu konstruieren. Dieser kann insbesondere in Kombination mit antagonistischer Wirkung verwendet werden, wodurch eine selektive Verabreichung erhalten wird, wobei die hohe Geschwindigkeit des Abbrechens des Antagonisten die Wirkung auf eine sehr lokalisierte Umgebung enthalten kann. Dies ist besonders interessant in der Gentherapie für feste Tumore. Liegt dort eine solche Zelle im Tumor oder in dessen Nähe vor, wird insbesondere dieser Tumor der maxi malen Wirkung ausgesetzt. Liegt dort eine zusätzliche Instabilität des produzierten Signalpeptids vor, kann die Wirkung des Peptids sehr lokalisiert sein, was folglich zu der Erwartung von weniger Nebenreaktionen führt. In einem der Beispiele wird gezeigt, dass es möglich ist, ein Signalpeptid mit verminderter Stabilität zu bilden. Da solche Peptide auch unter Beseitigung und/oder Substitution von Mutanten gebildet werden können, betrachtet man solche gentherapeutischen Anwendungen und Gentherapie-Konstrukte innerhalb des Anwendungsgebiets der Erfindung.
Diese Patentbeschreibung arbeitet ebenso die Verwendung von chemischer Modifikation, Protease-Behandlung und Massenspektrometrie heraus. Dies kann auf jede Modifikation jedes Peptids oder Proteins angewandt werden, mit der Maßgabe, dass es z. B. mit Proteasen speziell fragmentiert werden kann. Der Teil der quantitativen Strukturfunktionsanalyse der Beschreibung enthält die erfolgreiche Verwendung der Kombination aus gradueller chemischer Modifikation, Protease-Behandlung und Laserdesorptions-Massenspektrometrie mit biologischen Versuchen. Deshalb wird die Anwendung dieser Analyse oder jedes beliebigen Peptids und/oder Proteins, das modifiziert, insbesondere fragmentiert werden kann und biologisch aktiv ist, ebenso im Rahmen der Erfindung berücksichtigt. Es ist auch möglich, andere massenspektrometrische Techniken wie Elektrospray-Massenspektrometrie zu verwenden, die z. B. nach Exoprotease-Behandlung besonders geeignet ist.
Schließlich offenbart die Beschreibung der Erfindung auch die Wichtigkeit von Metallionen mit mehr als einer Wertigkeit in der Ladung, wobei Zinkionen insbesondere für katalytische Aktivität und die anschließende Effizienz besonders bevorzugt werden. Deshalb ist es möglich, die Wachstumsfaktor-Wirkung durch Manipulieren der (lokalen) Metallionen-Konzentrationen zu beeinflussen. Da ein übliches Optimum in der Effizienz der Metallionen-Konzentration vorliegt, kann jede beliebige Konzentration unter oder jenseits dieses Optimums zur Reduktion der Wirksamkeit des Wachstumsfaktors führen. Dies ermöglicht die Manipulation der Effizienz des Wachstumsfaktors. Auf diese Weise können auch indirekte therapeutische Wirkungen mit Metall-, vorzugsweise Zinkionen, erzielt werden. Dies kann bei der Behandlung von Hauterkrankungen wie Warzen in Form von Salben verwendet werden. Auch ist die Verwendung von Inhalationssprays zur Behandlung von Lungeninfekten möglich.
Hintergrund der Erfindung
Menschliches Interleukin-3:
Es zeigte sich, dass Interleukin-3, das zuerst aus T-Zellen als Glykoprotein isoliert wurde, auf Knochenmarkszellen wirkt. Es zeigte sich, dass entweder mit oder ohne andere Wachstumsfaktoren die Bildung von verschiedenen Blutzellen aus diesen Knochenmarkszellen induziert wird. Menschliches IL-3 wurde zuerst 1987 von Dorssers et al. geklont, der eine menschliche cDNA-Genbank und Hybridisierung mit einer Sonde von Mäuse-DNA verwendete (Gene 55: 115 (1987)).
Strukturfunktionsbeziehung von menschlichem Interleukin-3:
Verschiedene Artikel wurden veröffentlicht, die die Strukturfunktionsbeziehung von menschlichem Interleukin-3 betreffen (J. Biol. Chem. 266: 21310 (1991); J. Clin. Invest 90: 1879 (1992); J. Immunol. 146: 83 (1991); EMBO J. 10: 2125 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11842 (1992)).
Bei ihrer Forschung verwendeten sie alle molekularbiologische Techniken, wie die Bildung von Beseitigungs- und Substitutionsmutanten. In dem Falle, in welchem Substitutionsmutanten verwendet wurden, basierte die Wahl auf der Aminosäure-Homologie von IL-3 mit anderen Spezien (Maus, Rhesusaffe, Gibbon) oder auf bewussten Änderungen der Polarität oder Struktur. Mit Deletionsmutanten wurde das Protein auf biologische Wichtigkeit durch Entfernen von Teilen des Proteins gescannt. Aufgrund von praktischen Problemen im Hinblick auf die Reinigung der Mutantproteine (Muteine) wurden diese Mutantproteine näher auf Hauptstrukturänderungen überprüft. Dies ist ein Hauptproblem, da diese Strukturänderungen für gewöhnlich tatsächlich auftreten. Wie beschrieben, werden sie manchmal bewusst eingebracht. Als Ergebnis kann eine Äußerung im Hinblick auf die Beteiligung von verschiedenen Aminosäuren auf die biologische Aktivität nur mit größter Zurückhaltung gemacht werden. In WO-A-89 05824 ist eine Variante von IL-3 beschrieben, die durch Kombination von Stellen-gerichteter Mutagenese und chemischer Modifikation erhalten wird. Die Lysinreste an den Aminosäurepositionen 10, 28, 100, 110 und 116 werden durch Argininreste ersetzt und die Lysinreste 66 und 79 werden an Polypropylenglykol gekuppelt. Elektrophoresis 15: 251 (1994) beschreibt die chemische Modifikation von hIL-3 durch Essigsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid bei pH-Werten zwischen 5,5 und 9,5, um die verbesserte Qualität der Abtrennung eines neuen Elektrophorese-Puffersystems zu zeigen.
Die vorliegende Erfindung zeigt einen anderen Zugang. Das natürliche IL-3 wird als Ausgangsmaterial verwendet. Unter Verwendung von schrittweiser, graduell ansteigender Modifikation wird eine Extra-Selektivität in die chemische Reaktion eingebracht. Die Modifikation, die gleichzeitig mit der ersten Änderung in der biologischen Aktivität auftritt, kann mit spezifischen Proteasen und neuen Formen von Massenspektrometrie einfach lokalisiert werden. Als Ergebnis können wichtige Aminosäurereste schnell lokalisiert werden, und kann minimale Änderung (und deshalb maximale Steuerung) in der Einbringung oder Änderung einer gewünschten Eigenschaft erzielt werden. Es besteht kein Bedarf danach, das modifizierte Material zu reinigen und folglich gibt es keine Probleme von Verlusten während Reinigungen. Dies ermöglicht wieder eine leichte Verifizierung der sekundären Struktur. Deshalb ist die Erfindung eine Verbesserung verglichen mit molekularbiologischen Techniken, da der Zugang bequemer, besser verifizierbar und schneller als der molekularbiologische Zugang ist.
Modifizierte Wachstumsfaktoren
Superagonisten:
In vielen Strukturfunktions-Forschungsbemühungen mit den verschiedenen Wachstumsfaktoren wurde gefunden, dass Muteine eine verbesserte Aktivität aufweisen. Zum Beispiel ist in der Europäischen Patentanmeldung EP-131816 das beschriebene Ziel, ein beta-Interferon mit verbesserter biologischer Aktivität und/oder weniger Nebenreaktivität zu erhalten. Ebenso sind verschiedene Beispiele von chemischen Modifikationen verfügbar: Zum Beispiel beschreibt die Europäische Anmeldung EP 236987 die Modifikation von IL-2, zum Erhalt einer weniger toxischen und weniger immunogenen Substanz mit verbesserten Kinetiken beim Beseitigen aus dem Körper. Patentanmeldung EP 0442724 beschreibt PEG-yliertes IL-6, das ein Produkt mit längerer Halbwertszeit und verbesserter biologischer Aktivität ist. Patentanmeldung WO 88/01511 beschreibt die Succinylierung von IL-2, wobei eine verbesserte Löslichkeit erzielt wird. In keiner dieser Patentanmeldungen gibt es irgendeine Modifikationsstrategie neben einem Versuch-und-Irrtum-Zugang, in welchem statistische schwache Modifikation zum Erhalt einer oder weniger Modifikationen im Molekül verwendet wird. Zudem können wesentliche Verluste bei der Reinigung auftreten, wie es auch im Falle des Beispiels der PEG-ylierung von IL-6 der Fall war, wobei nur eine 10%ige Ausbeute des gewünschten Proteins erhalten wurde. Die Lokalisierung der Modifikation wurde in keiner dieser Erfindungen durchgeführt.
In der vorliegenden Erfindung gibt es fast keinen Verlust und die Lokalisierung der Modifikation kann gut durchgeführt werden. Zudem macht es eine graduelle chemische Modifikation sogar möglich, einen bestimmten Rest an einer bestimmten Stelle im Molekül, wie in den Beispielen 1 und 2 gezeigt, speziell zu modifizieren. Obwohl die meisten Modifikationen mit irreversiblen Mitteln durchgeführt werden, können auch reversible Mittel verwendet werden. Dies ermöglicht auch die sehr spezifische Modifikation von anderen Resten.
Antagonisten:
In der Europäischen Patentanmeldung EP-0413383A1 ist eine antagonistische Wirkung eines menschlichen IL-3-Mutanten erwähnt. Jedoch betrifft sie in diesem Fall das Verhältnis von verbleibender biologischer Aktivität verglichen mit ihrer Rezeptor-Bindungskapazität. Folglich wurde eine wirkliche Unterdrückung der Aktivität des natürlichen IL-3 nicht dargestellt.
In den Patentanmeldungen PCT/U/S93/11197 und PCT/LTS93/11198 sind alle Arten von IL-3-Mutanten beansprucht, jedoch gibt es auch in diesem Fall keinen Anhalt über die wahre hemmende Aktivität. Zudem ist es nicht wahrscheinlich, dass die Mutanten mit der niedrigsten Aktivität auch die besten Hemmstoffe sind, da die Chance von Strukturverformung viel höher als die Chance für spezifische Eliminierung der katalytischen Aktivität ist.
Es gibt auch andere wahre Antagonisten für Rezeptoren von Rinderwachstumshormon (Endocrinology 130: 2284 (1992)), Mäuse-Interleukin-2 (EMBO J. 11: 3905 (1992)), menschlichem Hepatocyten-Wachstumsfaktor (Biochemistry 31: 9555 (1995)), IL-1 (Scand, J. Immunol. 36: 27 (1992)) und IL-4 (J. Exp. Med. 178: 2213 (1993)). In all diesen Veröffentlichungen wurde keine Modifikationsstrategie beschrieben, alle Antagonisten waren Nebenprodukte der Strukturfunktionsanlyse-Forschung. Zudem waren die Hemmstoffkonzentrationen, die zum Erhalt von deutlicher Hemmung benötigt wurden, durchschnittlich um das Hundertfache höher, als die Konzentration des natürlichen Wachstumsfaktors. Dies sind Konzentrationen, die für den klinischen Wert dieser Antagonisten schädlich sind.
Die einzige Strategie zum Bilden eines Wachstumsfaktor-Antagonisten wurde für menschliches Wachstumshormon verwendet (Science 256: 1677 (1992)). Dies basierte auf der Spaltung von einer der beiden Rezeptorbindungsstellen des Hormons. Auch in diesem Fall gab es eine Verminderung um einen Faktor von 50 in der Rezeptor-Bindungskapazität, weshalb ein problematischer Überschuss von Hemmstoff verglichen mit dem Wachstumsfaktor erforderlich war.
Jedoch ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich, eine klinisch anwendbare Hemmung zu erhalten, die sogar mit einer verbesserten Rezeptor-Bindungskapazität möglich ist. Dies kann durch die Hypothese erklärt werden, dass der Wachstumsfaktor selbst eine Art an katalytischer Aktivität nach der Rezeptorbindung ausübt. Diese Hypothese wurde durch die Tatsache unterstützt, dass IL-3 ein katalytisches Zinkion enthält (Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 859 (1992)). Es ist nicht nötig, dass der Wachstumsfaktor ein vollständiges katalytisches Zentrum enthält. Es ist sehr gut möglich, dass das katalytische Zentrum nur in der Wachstumsfaktor-Rezeptorbindung vollständig ist. Deshalb richtet sich die betreffende chemische Modifikation so spezifisch wie möglich auf Reste, die direkt oder indirekt an einer solchen Zinkbindung und/oder Katalyse beteiligt sind und dies ohne Entstellung der Rezeptor-Bindungsfähigkeit. Das Ausgangsmaterial kann jede beliebige Protein- oder Peptid-enthaltende Substanz sein. Da jedoch Zinkionen vor einer Denaturierung schützen, kann es nötig sein, das Molekül reversibel zu denaturieren und Chelat-Bildner zum Entfernen dieses Zinks aus dem Molekül zuzusetzen. Als Veranschaulichung, jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung, ist die Modifikation von IL-3 mit Iodacetat beschrieben. Bei dem betreffenden pH-Wert richtet sich diese Modifikation auf die Alkylierung von His-Resten. Das Verfahren kann jedoch auch leicht mit anderen Reagenzien durch den Fachmann durchgeführt werden. Dasselbe kann für die Modifikation von anderen Aminosäuren genannt werden, die an der katalytischen Aktivität und/oder Zinkbindung beteiligt sind. Auch können diese Reste leicht durch andere chemische Wege oder mikrobiologische Wege, z. B. unter Verwendung von Beseitigungs- oder Substitutionsmodifikationen modifiziert werden. Zudem ist dies nicht auf IL-3 alleine beschränkt: Es liegt eine deutliche Homologie unter verschiedenen Rezeptoren der Cytokin-Superfamilie vor: Zum Beispiel Interleukine 2–7 Epo und GM-CSF. Obendrein wurde die spezifische Zinkbindung auch für IL-2, IL-6, GM-CSF und Gamma-IFN gefunden. Es ist auch denkbar, dass die Erfindung auf viele Signalpeptide und/oder -proteine angewandt werden kann, da z. B. Insulin, menschliches Wachstumshormon und Prolactin ebenso spezifische Bindungsei genschaften aufweisen. Zudem wurde gefunden, dass für bestimmte IL-3-Zellreihen z. B. durch Insulin ersetzt werden kann. Schließlich ist es möglich, dass die Alkylierung eines Wachstumsfaktors ebenso ein anderer Mechanismus bei der Bildung eines Antagonisten oder Zell-Hemmstoffs ist. Deshalb soll im Allgemeinen auch die Alkylierung, vorzugsweise mit Jodacetat als einzelner Zugang in der Erfindung angesehen werden. Deshalb sind alle vorstehend erwähnten Anwendungen und/oder modifizierten Substanzen und/oder DNA-Konstrukte und die Verwendung davon im Rahmen der Erfindung enthalten.
Beispiele
Beispiel 1:
Graduelle chemische Modifikation von IL-3 mit Essigsäureanhydrid zum Erhalt eines IL-3 mit verbesserter biologischer Aktivität oder veränderter Stabilität.
Materialien und Verfahren:
Chemische Modifikation:
Essigsäure, Dioxan, Lysinhydrochlorid und MES waren von Sigma, das Modifikationsmittel war von Fluka.
Puffer: Acetat/NaOH wurde für die Modifikation bei pH 5,0 verwendet, MES/NaOH wurde für die Modifikation bei pH 5,5, 6,0 und 6,5 verwendet. Bei pH 7,0 wurde ein NaHP₂O₄/NaOH-Puffer verwendet. Zehnfach konzentrierte Stammlösungen wurden hergestellt und direkt durch einen 0,22-Mikronfilter filtriert.
Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Puffer, 2 mg/ml hIL-3 und 3 mM Essigsäureanhydrid bzw. Bernsteinsäureanhydrid. Die 10-fach konzentrierten Stammlösungen wurden frisch am Versuchstag hergestellt. Die Modifikation des hIL-3 wurde über Nacht bei 30°C durchgeführt. Nach der Modifikation wurde durch SDS-Elektrophorese bestimmt, dass das IL-3 nicht zersetzt war.
Tests der biologischen Aktivität:
MO-7-Zellen waren ein Geschenk von Dr. I. P. Touw (Erasmus University of Rotterdam, Niederlande). EPMI-Kulturmedium war von Gibco (Paisly, UK.), ergänztes Rinder-Kalb-Serum war von Hyclone (Logan, Utah, USA). Das Zellkulturmedium bestand aus RPMI mit 10% des Kalb-Serums. Während normaler Gewebekultur der Zellen wurden auch 100 ng/ml IL-3 zugesetzt.
Zuerst wurden 10-fache Stammlösungen, bestehend aus 3-fachen Serienverdünnungen im Bereich von 10 μg/ml bis 1 ng/ml im Zellkulturmedium hergestellt. Nach gründlichem Mischen wurden zu 25 μl der Stammlösung 225 μl Zellkulturmedium gegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C. Für die 6-tägige Gewebekultur wurden 2 × 10⁵ MO7-Zellen/ml als Endkonzentration und für die 10-tägige Kultur 4 × 10³ MO7-Zellen/ml verwendet. Nach dem Züchten des Gewebes wurde über Nacht durch Einbringen von Tritiumthymidin die biologischen Aktivitäten bestimmt. Aus mindestens zwei unabhängigen Wachstums-Ansprechkurven ergab sich eine Bestimmung des Mittelwerts (und Bereichs von) der Konzentrationen, die zu 50%-iger maximaler Stimulierung führten. Die relative Aktivität der modifizierten Substanzen wurde als Verhältnis dieser 50%igen Konzentrationen des modifizierten bzw. des natürlichen IL-3 bestimmt ([IL-3_modifiziert]^50%/[IL-3_natürlich]^50%). Die Standardaktivität für das natürliche IL-3 am Tag 6 betrug 1,0 Millionen Einheiten/mg Protein (n = 10, Sigma_(n–1) = 20%). Am Tag 10 betrug sie 0,2 Millionen Einheiten/mg Protein (n = 10, Sigma_(n–1) = 30%).
Ergebnisse:
Alle Ergebnisse im Hinblick auf die präzisere Charakterisierung in Bezug auf die durchschnittliche Gruppenanzahl, die Spezifität und die Modifikationsstellen am Molekül sind später in dieser Patentbeschreibung beschrieben. Die Ergebnisse der biologischen Tests sind in Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle 1: Relative biologische Aktivitäten von acylierten IL-3
Aus der Tabelle kann gefolgert werden, dass ein deutlicher Unterschied in der relativen Aktivität zwischen Tag 6 und Tag 10 nach der Modifikation bei pH 6,5 und pH 7,0 vorliegt. Deshalb kann angenommen werden, dass dies die Bildung einer Substanz mit deutlich verminderter Stabilität zeigt. Bei pH 5 könnte eine Verbesserung der biologischen Aktivität vorliegen. Weitere Aspekte sind in den Beispielen 5 und 6 erörtert.
Beispiel 2:
Graduelle chemische Modifikation von IL-3 mit Bernsteinsäureanhydrid zur Bildung eines verbesserten IL-3 mit verbesserter Aktivität oder Stabilität.
Chemische Modifikation:
Essigsäure, Dioxan, Lysinhydrochlorid und MES waren von Sigma, das Modifikationsmittel war von Fluka.
Puffer: Acetat/NaOH wurde zur Modifikation bei pH 5,0, MES/NaOH zur Modifikation von pH 5,5, 6,0 und 6,5 verwendet. Bei pH 7,0 wurde ein NaHP₂O₄ /NaOH-Puffer verwendet. Zehnfach konzentrierte Stammlösungen wurden hergestellt und direkt durch einen 0,22-Mikronfilter filtriert.
Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Puffer, 2 mg/ml hIL-3 und 3 mM Essigsäureanhydrid bzw. Bernsteinsäureanhydrid. Die 10-fach konzentrierten Stammlösungen wurden am Tag des Versuchs frisch hergestellt. Die Modifikation von hIL-3 wurde über Nacht bei 30°C durchgeführt. Nach der Modifikation wurde durch SDS-Elektrophorese bestimmt, dass das IL-3 nicht zersetzt war.
Ergebnisse:
Alle Ergebnisse im Hinblick auf präzisere Charakterisierung in Bezug auf durchschnittliche Gruppenanzahl, die Spezifität und die Modifikationsstellen am Molekül sind später in dieser Patentbeschreibung beschrieben. Die Ergebnisse der biologischen Tests (wie durchgeführt in Beispiel 1) sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Relative biologische Aktivitäten von succinyliertem IL-3
Aus Tabelle 2 kann gefolgert werden, dass die Succinylierung bei pH 5 zu einer deutlichen Verbesserung der Aktivität und die Succinylierung bei einem pH von > 6 zu einer verminderten Aktivität führt.
Beispiel 3:
Ein Verfahren zum chemischen Modifizieren von biologisch aktiven Peptiden oder Proteinen zur Bildung eines Protein- oder Peptid-Antagonisten.
Materialien und Verfahren
Harnstoff, EDTA, MES und NaOH waren von Sigma, das Na-Iodacetat war von Fluka.
Puffer: MES/NaOH wurde zur Modifikation bei pH 6,0 verwendet. Zehnfach konzentrierte Stammlösungen wurden in 8 M Harnstoff hergestellt und direkt anschließend mit einem 0,22-Mikronfilter filtersterilisiert. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Puffer, 5,5 M Harnstoff und 50 mM EDTA. Aus diesen Reagenzien wurden zehnfach konzentrierte Stammlösungen in 8 M Harnstoff frisch am Versuchstag hergestellt.
1. Mäßige chemische Modifikation von hIL-3:
Iodacetat wurde in einer Konzentration von 3, 10 und 30 mM zugesetzt. Die IL-3-Konzentration betrug 2 mg/ml. Die Modifikation wurde während 24, 48 und 72 Stunden bei 37°C durchgeführt und anschließend durch native Elektrophorese untersucht. Nach 2 Tagen und 30 mM Iodacetat lag eine maximale Modifikation ohne schwere Störung der Banden des modifizierten Materials vor (ein Anzeichen von schwerer Denaturierung der Moleküle). In diesem Fall wurde weniger als 2% des Ausgangsmaterials zurückgelassen. Da in diesem Fall eine Erwartung einer minimalen biologischen Aktivität ohne ernsthafte Denaturierung des Proteins vorlag, wurde diese Probe in weiteren Versuchen verwendet. Anschließend wurde Elektrophorese zum Zeigen dessen verwendet, dass keine Zersetzung des Moleküls nach der Modifikation zu finden war.
2. Teilweise chemische Modifikation:
Zum Optimieren der Hemmungskapazität des modifizierten hIL-3 wurde auch eine teilweise Modifikation durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde 1 mg/ml IL-3 über eine Dauer von 18 Stunden bei 37°C mit 10, 30 und 100 mM Iodacetat modifiziert. Nach nativer Elektrophorese und Coomassie-Färbung der Probe von 100 mM wurde eine maximale Modifikation ohne übermäßige Störung der Banden im Gel erhalten. Etwa 5% des Ausgangsmaterials lag noch vor. Da nur diese Probe Hemmungsaktivität in den Aktivitätstests zeigte, wurde diese Probe in weiteren Versuchen verwendet.
3. Die Aktivitäts- und Hemmungsversuche:
Die Aktivitätstests wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Wachstums-Ansprechkurven (n ≥ 2) für beide Kontrollen und alkyliertes IL-3 wurden durch 10-fache Reihenverdünnung im Bereich von 1000 bis 1 ng/ml hergestellt. Die Hemmungsaktivität des alkylierten IL-3 wurde durch Durchführen derselben Titration von Kontroll-IL-3, jedoch nun in Gegenwart von 3 ng/ml alkyliertem IL-3 getestet.
Zur Bestimmung der maximalen Rezeptorbindungskapazität wurde teilweise modifiziertes IL-3 in 7-fachen Reihenverdünnungen in Gegenwart von 3 ng/ml natürlichem IL-3 titriert. Der Titrationsbereich betrug 15 μg/ml bis 0,1 ng/ml und die Titration wurde nur von 4000 MO7-Zellen/ml durchgeführt, um jegliches Entkräftungsphänomen auszuschließen.
Ergebnisse:
In 1 ist gezeigt, dass das modifizierte IL-3 zum Hemmen des Kontroll-IL-3 um einen Faktor von 10–100 fähig ist. Zudem sind 3 ng/ml des modifizierten IL-3 zum Unterdrücken von Thymidin-Einbringung von 30–100 ng/ml Kontroll-IL-3 für 80 bis 90% fähig. Deshalb weist das modifizierte IL-3 nicht nur eine Hemmungsaktivität, sondern auch eine verbesserte Rezeptorbindungskapazität auf. Dies wird in der Titration von teilweise modifiziertem IL-3 (2) festgestellt: Nur 0,1 ng von teilweise modifiziertem IL-3 ist für fast 50%ige Hemmung von 3 ng/ml ursprünglichem IL-3 ausreichend.
Beispiel 4:
Verfahren für graduell enzymatische Exoprotease-Behandlung von IL-3 zur Bildung eines modifizierten IL-3 mit modifizierter Stabilität und/oder Aktivität.
Materialien und Verfahren:
Exoprotease-Behandlungen wurden mit Cathepsine-C und mit Carboxypeptidase-Y von Boehringer durchgeführt. 1 mg/ml IL-3 wurde 18 Stunden bei 37°C in Gegenwart der Protease inkubiert. Cathepsine-C wurde in zweifachen Reihenverdünnungen in einem Bereich von ½ bis 1/128 mg/ml durchgeführt. Die anderen Reaktionsbedingungen waren wie durch den Hersteller beschrieben.
Biologische Aktivitäten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Ergebnisse:
Der Zugang führte zu den Ergebnissen in Tabelle 3. Die Modifikationen, die nicht zu einer Änderung in der biologischen Aktivität führten, sind nicht dargestellt.
Tabelle 3: Veränderte Aktivitäten nach gradueller Exoprotease-Behandlung
Aus dieser Tabelle kann gefolgert werden, dass die Behandlung mit Carboxypeptidase Y mit einer Konzentration von 1/40 und 1/20 zu einer Substanz mit einer relativen Aktivität führt, die am Tag 6 geringer als am Tag 10 ist. Deshalb zeigt dies eine Substanz mit einer höheren Stabilität verglichen mit natürlichem IL-3 an.
Es kann auch aus der Tabelle gefolgert werden, dass Cathepsine C die Aktivität am Tag 6 deutlich verbessert, jedoch nicht am Tag 10. Deshalb liegt auch eine Substanz mit verminderter Stabilität vor.
Beispiel 5:
Lokalisierung von Modifikationen in einem Peptid oder Protein durch die Kombination von Proteasebehandlung und Massenspektrometrie.
Materialien und Verfahren:
Proteasebehandlung:
Für die Lokalisierung von modifizierten Resten wurde das modifizierte Material gegen den geeigneten Puffer dialysiert und anschließend durch Endo-Glu-C oder Endo-Lys-C wie durch den Hersteller (Boehringer Mannheim, Deutschland) beschrieben fragmentiert. Die Inkubation wurde über Nacht bei 37°C, mit 2 mg/ml hIL-3 und einem Protein-zu-Protease-Verhältnis von 30 durchgeführt.
Laser-Desorptions-Massenspektormetrie (LDMS):
Vorbehandlung:
Lösungen von 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB, M_r = 154,12; 10 g/l) in Milli-Q-Wasser wurden frisch vor jedem Versuch hergestellt. Sowohl die (un)modifizierten IL-3-Lösungen als auch deren Aufschlüsse wurden auf 0,1 mg/ml verdünnt. Aus diesen verdünnten Lösungen wurden 0,5 μl mit 0,5 μl DHB-Lösung auf dem Ziel vermischt. Anschließend wurde das Ziel an Luft bei Raumtemperatur in einem langsamen Luftstrom getrocknet.
Massenspektrometrie:
Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Massenspektrometrie wurden auf einem Laser-Desorptions-Massenspektrometer des Typs Finnegan MAT Vision 200, ausgestattet mit einem pulsierten Stickstofflaser (337 nm, Pulsbreite 3 ns) durchgeführt. Die Probe wurde direkt über dem Ionisierungsgrenzwert (10⁶–10⁷ W/cm²) abgegeben. Die Beschleunigungsspannung betrug 6,5 kV. Die Ionen wurden zu der Konversions-Dynode auf –10 kV für die Elektronenamplifikation nachbeschleunigt. Die Standardgenauigkeit betrug etwa 0,05%, jedoch kann sich diese auf 0,1 bis 0,2% aufgrund von Versuchsbedingungen verschlechtern.
Ergebnisse:
Da das Signal des LDMS trotz der höheren Molekulargewichte immer noch ausreichend war, wurde es möglich, alle Modifikationen zu lokalisieren. Zwei Beispiele sind dargestellt:

1. Lokalisation von Modifikation mit Bernsteinsäureanhydrid (pH 5,0) mittels Endo-Lys-C-Behandlung und LDMS: Bei pH = 5,0, Bernsteinsäureanhydrid-Modifikation und anschließendem Endo-Lys-C-Aufschluss verschob sich ein Peak von 1085d bis 1185d und ebenso der Peak bei 1108d (1085 + 23 von Na⁺) auf 1208d. Basierend auf der Proteasespezifität und der Aminosäuresequenz kann dieser Peak mit 1085d nur Ala¹–Lys¹⁰ entsprechen. Da die Modifikation von Lys¹⁰ den Aufschluss dieser Aminosäure unmöglich macht, läge überhaupt kein Ala¹–Lys¹⁰-Fragment vor. Deshalb ist der modifizierte Aminosäurerest der Amino-Terminus Ala¹.
2. Nachweis von Modifikation von Lys²⁸ mit Essigsäureanhydrid sowohl durch Endo-Glu-C-Behandlung mit anschließendem LDMS als auch durch Endo-Lys-C-Behandlung mit anschließendem LDMS. Bei pH 7, Essigsäureanhydrid-Modifikation und anschließender Endo-Gluc-C-Behandlung verschob sich der Peak bei 1598d gegen 1640d. Diese Verschiebung entspricht genau der Masse von einer Acetylgruppe. Auch in diesem Fall ermöglichte die Aminosäuresequenz die Lokalisierung von Ile²³–Asp³⁶. Da Lys²⁸ der einzige Aminosäurerest in diesem Fragment ist, kann abgeleitet werden, dass dies der modifizierte Rest ist. Dies wurde durch den Endo-Lys-Aufschluss bestätigt, wobei ein Fragment von 5815d entstand. Dieses Fragment kann nur erklärt werden, wenn Lys²⁸ der modifizierte Rest ist, womit der Aufschluss nach dem Rest unmöglich gemacht wird.

Die anderen Modifikationen wurden in ähnlicher Weise analysiert, wodurch Tabelle 4 erhalten wurde.
Tabelle 4: Lokalisierung von Modifikationen von IL-3:
Die Tabelle zeigt, dass beide Modifikationen dieselben Zielreste am Protein aufweisen. Die einzigen Ausnahmen sind, dass Essigsäureanhydrid einen leicht höheren Modifikationsgrad bei pH ≥ 5,5 aufweist, und dass bei pH 7 Lys¹⁰ teilweise im Gegensatz zu dem Lys¹⁰ des Bernsteinsäureanhydrid-modifizierten Materials modifiziert war.
Tabelle 4 zeigt auch, dass Lys¹¹⁶ zumindest teilweise bei pH = 7 geschützt war. Da ein Phosphatpuffer bei diesem pH-Wert verwendet wurde, erhebt sich die Möglichkeit, dass eine Phosphatgruppe an dieser Stelle gebunden wird und deshalb das Lys¹¹⁶ für die Modifikation verschoben wird. Um diese Hypothese zu testen, wurde hIL-3 bei 50 mM Puffersubstanz, bestehend aus MES und Phosphat, modifiziert. Essigsäureanhydrid (1, 2 bzw. 3 mM) wurde für die Modifikation bei pH 6,8, was gut innerhalb des Pufferbereichs von beiden Puffern liegt, verwendet. In Gegenwart von 10 mM oder mehr Phosphat lag der Schutz der 1-Gruppe Lys¹¹⁶ vor. Bei einer Phosphatkonzentration unter 1 mM fehlte dieser Schutz. Da 10 mM die physiologische Phosphatkonzentration ist, kann angenommen werden, dass das vorliegende Lokalisierungsverfahren die Demonstration und Lokalisierung einer biologisch bemerkenswerten Phosphatbindung ermöglicht. Deshalb ist es sehr denkbar, dass ein Antagonist oder Zell-Wachstumshemmstoff durch Stö rung dieser Phosphatbindung gebildet werden kann. Deshalb liegt es auch innerhalb des Rahmens der Erfindung. Es kann auch angemerkt werden, dass die Reste Lys²⁸ und Lys²⁶ ebenso einen leichten Schutz durch das Phosphat aufwiesen, was eine enge Nachbarschaft in der 3-D-Struktur nahelegt. Folglich kann auf diese Weise sogar eine Strukturinformation bereitgestellt werden.
Schließlich kann auch angemerkt werden, dass die graduelle chemische Modifikation mit einem solchen minimalen Ausmaß durchgeführt werden kann, dass eine Spezifität erzielt werden kann, die nicht auf einige Arten von Resten, nicht nur auf Aminreste, jedoch sogar auf 1-Aminreste am vollständigen Molekül, nämlich Ala¹ beschränkt ist. Deshalb ist diese Spezifität auch in den Ansprüchen eingeschlossen.
Beispiel 6:
Quantitative Strukturfunktionsanalyse-Forschung unter Verwendung von gradueller chemischer Modifikation, Proteasebehandlung und Laserdesorptions-Massenspektrometrie.
Materialien und Verfahren:
QSAR-Strategie:
Dieses Beispiel wurde mit Lysin-Modifikationen von hIL-3 demonstriert. Die Strategie besteht aus fünf Schritten, wobei Schritt 1 die graduelle chemische Modifikation des Proteins betrifft. Obwohl die Mikroumwelt der verschiedenen Reste in der 3-D-Struktur nicht bekannt ist, können Unterschiede in der Aminosäuresequenz allein erwartet werden. Sogar noch mehr Unterschiede können in der 3-D-Struktur erwartet werden.
Wir erforschten Acylierungsreaktionen von hIL-3 (Schritt 1). Diese Reaktionen finden nur an ungeladenen Lys-Resten statt, wodurch die graduelle Modifikation durch eine schrittweise Erhöhung des pH-Werts der Modifikationsreaktionen ermöglicht wird.
Der zweite Schritt ist das Überwachen der Modifikationsreaktion. Um eine ausreichende Anzahl an möglichen Bedingungen zu untersuchen, so dass die optimalen Bedingungen erzielt werden können, ist ein mildes und empfindliches Verfahren notwendig. Dieses Verfahren ist native Elektrophorese (Electrophoresis 15: 251 (1994)). Jedoch kann auch Elektronenspray-Massenspektrometrie eine geeignete Alternative bilden. Dies ist in 3 dargestellt: Elektronenspray-Massenspektrometrie von succinyliertem IL-3 bei pH 5–7. Insbesondere ermöglicht die Kombination von beidem die Demonstration von vollständiger Spezifität auf Aminresten.
Der dritte Schritt ist die Feststellung der gesamten Strukturintegrität. Zirkulardichroismus-Spektroskopie kann für diesen Zweck verwendet werden (Electrophoresis 15: 251 (1994)). Obwohl kleine Unterschiede durch dieses Verfahren nicht sichtbar sind, werden wesentliche Strukturänderungen deutlich nachgewiesen.
Der vierte Schritt ist die Charakterisierung und Lokalisierung von modifizierten Resten, für welche die folgenden Techniken verwendet wurden: natürlicher Aufschluss mittels spezifischer Proteasen, Elektrophorese, Elektronenspray-Massenspektrometrie und LDMS. Die Reaktionsspezifität wurde durch die Kombination von natürlicher Elektrophorese und Elektronenspray-Massenspektrometrie bestimmt. Die Lokalisierung wurde mit Endoproteasen und LDMS wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben durchgeführt.
Der fünfte und letzte Schritt ist das Testen von biologischer Aktivität der verschiedenen modifizierten Formen des Proteins. Nach dieser Aktivitätsbestimmung kann die wahre Beteiligung der verschiedenen lokalisierten Reste abgeleitet werden.
Ergebnisse
Chemische Modifikation, Strukturfeststellung und Überwachung der Reaktion: Die chemische Modifikation von hIL-3 und das Überwachen wurde mit Bernsteinsäureanhydrid oder mit Essigsäureanhydrid wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Anschließend wurde durch Zirkulardichroismus gefunden, dass Bernsteinsäureanhydrid-Modifikationen bei einem pH-Wert von > 7 zu einer gesamten Strukturänderung (Denaturierung) führten. Deshalb wurden nur die Modifikationen bei oder unter pH 7 für weitere Untersuchung verwendet.
Charakterisierung und Lokalisierung der Modifikationen:
Siehe vorstehendes Beispiel.
Aktivitätstests der verschiedenen modifizierten Formen des Proteins und Lokalisierung von biologisch wichtigen Resten:
Sowohl die Verfahren als auch die Ergebnisse der Tests für biologische Aktivität sind in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Die Kombination dieser Ergebnisse und die Ergebnisse der Lokalisation der modifizierten Reste (Tabelle 1 und 2 und vorstehendes Beispiel) ermöglicht Aussagen über die Beteiligung von verschiedenen Resten. Hier liegt eine bedeutende Veränderung von unmodifiziert zu modifiziert bei pH 5 vor, die von einer Verbesserung in der Aktivität begleitet ist. Andere wichtige Veränderungen liegen von pH 6 bis pH 6,5 vor (Aktivität – Verminderung um einen Faktor von 2) und von 6,5 bis 7 (Aktivitätserhöhung um einen Faktor von 2).
Da Bernsteinsäureanhydrid-Modifikation bei pH 5 von der Modifikation von nur einer Gruppe, nämlich dem Amino-Terminus (Ala¹) begleitet ist, kann gefolgert werden, dass diese Gruppe eine beschränkende oder regulierende Wirkung aufweist. Diese Erhöhung in der Aktivität wurde auch in der Strukturfunktionsforschung mit Deletionsmutanten gefunden (J. Biol. Chem. 266, 21310 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 11842 (1992)), wurde aber nie dem ersten Rest alleine zugewiesen.
Mit den Unterschieden zwischen pH 6 und pH 6,5 liegt ein kompletteres Muster vor. Für Essigsäureanhydrid wurde die Verminderung in der Aktivität um einen Faktor von 2 bis 4 von einer Modifikation von Lys²⁸ von 45% bis 70% der Gruppen, für Lys⁶⁶ von 20% bis 50% der Gruppen und für Lys¹⁰⁰ von 40% bis 65% der Gruppen begleitet. Schließlich fand eine Modifikation an Lys¹¹⁶ von 45% bis 80% der Gruppen statt, was eine Verminderung von unmodifizierten Gruppen von 60% bis 20% zu einem Unterschied im Faktor von 3 ist. Da dieser Unterschied genau der Aktivitätsverminderung entspricht, ist Lys¹¹⁶ der beste Kandidat für biologische Aktivität. Dies wird durch die verminderte Modifikation um einen Faktor von 3 bei pH 7 (im Vergleich mit pH 6,5) bestätigt, der mit einer Erhöhung in der Aktivität um einen Faktor von 3 begleitet ist. Deshalb ist Lys¹¹⁶ für biologische Aktivität wichtig. Dies alles wurde durch eine Modifikation mit Bernsteinsäureanhydrid bestätigt. In diesem Fall lag keine Verminderung in der Modifikation für das bei pH 7 modifizierte Material, verglichen mit dem bei pH 6,5 modifizierten Material, vor. Dieses Phänomen begleitend lag keine Verbesserung von jeglicher Aktivität vor.
Folglich wurde gezeigt, dass die Reste Lys¹¹⁶ und der Amino-Terminus von biologischer Bedeutung sind, während der Amino-Terminus einen hemmenden oder regulierenden Einfluss aufzuweisen und Lys¹¹⁶ wichtig für die biologische Aktivität zu sein scheint. Zudem ist Lys¹¹⁶ auch durch Phosphat geschützt, was eine Phosphatbindung durch diesen Rest nahelegt. Da der Rest auch für die biologische Aktivität des Interleukins wichtig ist, legt dies nahe, dass Phosphatbindung für die Wirkungsart von IL-3 von Wichtigkeit ist, und wenn dieser Prozess für IL-3 von Wichtigkeit ist, kann es auch von Wichtigkeit für andere Peptide und Proteine sein.
Zusammengefasst ermöglicht dieses Verfahren die Lokalisierung von biologisch wichtigen Resten, und die gezeigte Phosphatbindung ermöglichte auch die Etablierung und Lokalisierung eines möglicherweise wichtigen physiologischen Verfahrens. Deshalb enthält die Erfindung die Modifikation eines Proteins oder Peptids zum Einbringen einer neuen, vorzugsweise antagonistischen Aktivität mittels der Manipulation der Phosphatbindung des Proteins oder Peptids.

Claims

Verfahren zur quantitativen Strukturfunktionsanalyseforschung von biologisch aktiven Proteinen oder Peptiden, die aus humanen Rezeptoren wie z. B. Interleukinen, haemopoietischen Wachstumsfaktoren, Peptidhormonen oder Proteinhormonen, Signalpeptiden oder Signalproteinen zur Einführung von einer oder mehreren der folgenden Eigenschaften ausgewählt werden: erhöhte biologische Aktivität, erhöhte Stabilität, unterdrückte Antigenität, erworbene antagonistische Aktivität oder zellinhibitorische Aktivität, wobei das Verfahren umfasst: die Anwendung einer speziellen chemischen Modifikation von ausgewählten Aminosäuren unter Verwendung von a) gradueller chemischer Modifikation des Proteins oder Peptids, gefolgt von b) Kontrolle der Modifizierungsreaktion mit einer milden und sensitiven Methode wie nicht-denaturierender Elektrophorese und/oder Elektrospray-Massenspektrometrie und genannte Kontrolle umfasst ferner wahlweise die Bestätigung der gesamten strukturellen Integrität, z. B. unter Verwendung der Zirkulardichroismus-Spektroskopie c) Protease-Behandlung, d) Massenspektrometrie und e) Prüfung der biologischen Aktivität des modifizierten Produkts und wahlweise einer Prüfung der Stabilität des modifizierten Produkts, genannte Proteine oder Peptide werden wahlweise aus den Interleukinen 1 bis 8, dem Interleukin 10, GM-CSF, TNF, Insulin, Prolactin und gamma IFN, mehr bevorzugt GM-CSF, EPO oder einem Interleukin, das aus den Interleukinen 2 bis 7, ausgewählt aus der Zytokin-Superfamilie, ausgewählt wird, ausgewählt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin spezifisches Verdauen mit spezifischen Proteasen und Massenspektrometrie zur Charakterisierung und Lokalisation der abgeänderten Aminosäuren ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin spezifisches Verdauen mit spezifischen Endoproteasen und LDMS zur Charakterisierung und Lokalisation der abgeänderten Aminosäuren ausgeführt wird, wobei die Endoprotease z. B. Endo Glu C oder Endo Lys C ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Modifikation durch spezifisches Verdauen mit spezifischen Exoproteasen ausgeführt wird und Elektrospray-Massenspektrometrie zur Charakterisierung und Lokalisation der modifizierten Aminosäuren ausgeführt wird, geeigneter Weise ist die Exoprotease N-terminal, z. B. Cathepsin C, oder C-terminal, z. B. Carboxypeptidase Y.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Modifikation eine chemische Modifikation ist, wobei die Modifikation eine Alkylierung ist und/oder die Modifikation eine Acylierung, wie z. B. Acetylierung, z. B. durch Iodoacetat oder Succinylierung, z. B. durch Bernsteinsäureanhydrat, und die Modifikation geeigneterweise eine Modifikation unter graduell variierenden Bedingungen ist, worin eine oder mehrere der folgenden Bedingungen wie folgt variiert werden: pH zwischen 5,0 und 7,0, vorzugsweise in Schritten von 0,5 pH-Einheiten, und/oder Zeit oder Reagenskonzentrationen werden variiert.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Modifikation in der Anwesenheit von Phosphatpuffer, vorzugsweise in Verbindung mit Acetanhydrid, ausgeführt wird.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche zum Einführen einer antagonistischen und/oder zellinhibitorischen Aktivität, worin die Modifikation eine spezifische Wirkung auf einen oder mehrere Reste, die an katalytischer Aktivität beteiligt sind, hat, z. B. worin die Modifikation innerhalb oder in enger Nachbarschaft zu einem teilweisen oder gesamten katalytischen Zentrum liegt, wobei die Modifikation vorzugsweise die katalytische Aktivität ändert, und der Rest geeigneterweise ein Histidinrest ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Modifikation innerhalb oder in enger Nachbarschaft zu einem Metallbindungszentrum liegt, vorzugsweise ein Zinkbindungszentrum und der Rest geeigneterweise ein Histidinrest ist.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, worin die Modifikation durch reversible Denaturierung des Substrats und durch Zugabe eines Chelatbildners zur Entfernung des Metallions, z. B. in der Anwesenheit von Harnstoff und EDTA durchgeführt wird und der Harnstoff vorzugsweise eine Konzentration höher als 5 M und das EDTA vorzugsweise eine Konzentration von 50 mM aufweisen.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorhergehenden Ansprüche, worin die Modifikation für eine An von Aminosäure spezifisch ist, z. B. ein Aminrest, und/oder sogar für nur einen Aminrest in dem Peptid oder Protein spezifisch ist, woher das Amin z. B. der N-Terminus ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Substrat humanes Interleukin-3 ist, und das Verfahren vorzugsweise Interleukin 3 bereit stellt, das nur an einem oder mehreren der folgenden Reste abgeändert wurde: Ala¹, His²⁶, Lys²⁸, Lys⁶⁶, His⁹⁵, His⁹⁸, Lys¹⁰⁰, oder Lys¹¹⁶.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zum Einführen einer antagonistischen und/oder zellinhibitorischen Aktivität, wobei das Verfahren die Störung der Phosphatbindungen umfasst.
Modifizierte Signalsubstanz mit superagonistischer oder antagonistischer Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Wachstumsfaktor, einem Interleukin, einem Kolonie-stimulierenden Faktor, einem TNF und einem Interferon besteht, worin die Modifikation eine chemische und/oder molekularbiologische Modifikation ist, innerhalb oder in enger Nachbarschaft zu einem teilweisen oder gesamten katalytischen Zentrum liegt, und genannte Abänderung liegt innerhalb oder in enger Nachbarschaft zu einem Metallbindungszentrurri und/oder innerhalb eines Phosphatbindungszentrums.
Modifizierte Signalsubstanz gemäß Anspruch 13, worin das Metallbindungszentrum ein Zinkbindungszentrum ist.
Modifizierte Signalsubstanz gemäß Anspruch 13 oder 14, worin die chemische Modifikation eine graduelle chemische Modifikation ist.
Modifizierte Signalsubstanz gemäß den Ansprüchen 13 bis 15, worin die Modifikation eine Deletion und/oder Substitution einer Aminosäure ist, die an der Bindung eines Metallions beteiligt ist.
Modifizierte Signalsubstanz gemäß den Ansprüchen 13 bis 15, worin die Modifikation eine Alkylierung oder eine Acylierung ist.
Modifizierte Signalsubstanz gemäß den Ansprüchen 13 bis 17, worin sich die Modifikation in einem Histidin in dem Metallbindungszentrum befindet.
Modifizierte Signalsubstanz gemäß den Ansprüchen 13 bis 18, worin die modifizierte Signalsubstanz ein Interleukin 1 bis 8, GM-CSF, TNF oder gamma-Interferon ist.
Verwendung einer modifizierten Signalsubstanz gemäß den Ansprüchen 13 bis 19 oder einer diese kodierenden Nukleinsäuresequenz zur Herstellung eines Arzneimittels für die Anwendung in einer Behandlung, die das Stimulieren der Stammzellreplikation oder Gentherapie umfasst.