DE19953732A1 - Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung - Google Patents

Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung

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DE19953732A1 DE1999153732 DE19953732A DE19953732A1 DE 19953732 A1 DE19953732 A1 DE 19953732A1 DE 1999153732 DE1999153732 DE 1999153732 DE 19953732 A DE19953732 A DE 19953732A DE 19953732 A1 DE19953732 A1 DE 19953732A1
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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid (Eiweißstoff) mit inhibierenden Eigenschaften auf die virale Infektion von Zellen: Humanes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine therapeutische und diagnostische Verwendung. Die Erfindung umfaßt die natürlich vorkommende Form des VIRIP sowie abgeleitete Fragmente und/oder Analoga bzw. Derivate sowie schließlich ein Arzneimittel, enthaltend die natürlichen, rekombinanten und synthetischen Peptide zur Verwendung für medizinische Idikationen und zur Verwendung als ein Diagnosemittel. Die Erfindung umfaßt darüber hinaus modifizierte Formen des VIRIP, die eine besonders günstige therapeutische Wirksamkeit aufweisen. Des weiteren eine Nukleinsäuresonde hybridisierend für VIRIP oder eines seiner Fragmente und/oder Drivate und Antikörper bzw. Antagonisten gerichtet gegen VIRIP oder eines seiner Fragmente und/oder Derivate zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken, insbesondere bei viralen Erkrankungen und zur Behandlung von Infektionen mit HIV-1 und HIV-2.

Description

Die VIRIP konnte überraschenderweise mit Hilfe von chromatographischen Methoden und mit Hilfe eines biologischen Assays aus humanem Hämoflitrat isoliert werden. Die biochemische Charakterisierung des erfindungsgemäßen Peptids erfolgte durch Massenspektrometrie und vollständigen Sequenzierung aller Aminosäuren.
Das Peptid besitzt die folgende Aminosäuresequenz:
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF
Die Molekularmasse des erfindungsgemäßen Peptids VIRIP beträgt:
2303 Da
Das erfindungsgemäße Peptid ist überraschenderweise ein 20 Aminosäuren umfassendes Fragment des bekannten humanen Proteins Alpha-1-Antitrypsin (Accession No. P01009), welches in seiner prozessierten Form aus 394 Aminosäuren besteht. Die Funktion des Alpha-1-Antitrypsin wird vornehmlich als Hemmstoff für die Enzyme Elastase sowie Thrombin und Plasmin beschrieben. Die erfindungsgemäße Peptidsequenz des VIRIP beginnt hinter der Aminosäure 352 des Alpha-1-Antitrypsin und umfasst somit die Aminosäuren 353 bis 372 des Alpha-1-Antitrypsin.
Überraschenderweise bewirkt das erfindungsgemäße Peptid eine Unterdrückung der HIV-1-Infektion und/oder -Replikation von bzw. in humanen Blutzellen. Das erfindungsgemäße Peptid ist überraschenderweise koppelbar mit einem Adapterprotein, was eine Aufnahme in infizierte und nicht-infizierte Zellen gewährleistet.
Das erfindungsgemäße Peptid ist durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an.
Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser verdünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1.5 bis 3.5, insbesondere 2.5 bis 3.0. Danach wird das Hämofiltrat über einen Kationenaustauscher geleitet, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierenden Trägermaterial (Fraktogel SP - 650 (M), Merck, Darmstadt). Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Salzlösung eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0.5 bis 1 molaren Ammoniumacetatlösung.
Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaustauscher- Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH-Werten.
Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenen Fraktionen werden mittels präparativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien überprüft.
Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen des gereinigten Peptids erfolgte mittels eines Elektrospray Massenspektrometers (ESI- MS). Die Sequenzanalyse des nativen Peptids erfolgte über einen Edman-Abbau mit einem ABI 473 A Sequenzer. Die erfindungsgemäße Peptidsequenz wurde chemisch synthetisiert und die Struktur des synthetisch hergestellten Peptids wurde ebenfalls aufgeklärt. Dieses synthetisch hergestellte VIRIP bewirkt ebenfalls eine dosis-abhängige Unterdrückung der HIV-1-Infektion und/oder - Replikation von bzw. in humanen Blutzellen.
Das erfindungsgemäße Peptid sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie Antikörper, welche die Wirkung des VIRIP aufheben, können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der Virus­ inhibierender Substanzen. Dabei kann vermutet werden, dass VIRIP aufgrund seiner kurzen, hydrophoben Sequenz in die Blutzellen aufgenommen wird und dort als Hemmstoff von Virus-Enzymen oder als Hemmstoff von Enzymen der Blutzellen wirkt.
Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal-topisch, subkutan oder bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichendem Peptid beträgt 1 µg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter Inhibitoren/Antagonisten gehemmt werden.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv-markierter Form, um in einem an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder Fingerprinting.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1 Isolierung des antiviral wirksamen VIRIP 1. Schritt: Hämofiltrat-Batch-Extraktion
800-1000 L Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH-Wert von 2.7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: 3 L/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Puffer B: 0.5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag der insgesamt 1.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0.5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (6.8 - 7.2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.
2. Schritt Erste präparative Auftrennung (Charge 01/1998)
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in einer Menge von 10.000 L Hämofilttat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2.7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: bis zu 3 L/min während des Auftrages 0.5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0.01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE-Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.
3. Schritt: Zweite präparative Auftrennung
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt
Chromatographiebedingungen
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC,15 µm 10 × 12.5 cm (FineLine 100)
Fluß: 150 mL/min (FineLine 100)
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Nach Auftrag der einzelnen pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert Aliquots der entstandenen Fraktionen werden im Bioassay getestet. Die Fraktion 20 aus pH-Pool I enthielt das erfindungsgemäße Peptid.
4. Schritt: Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie
Insgesamt 500 mg der im Assay bioaktiven Fraktion 20 aus pH-Pool I wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktion 27 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen
Säule: 4,7 cm × 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 30% Methanol, 70% Wasser, 0.1% TFA
Puffer B: 100% Methanol, 0.1% TFA
Gradient: 0-60% B in 2100 ml
Sequenzbestimmung
Die aufgereinigten nativen und chemisch synthetisierten Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard- Programms analysiert Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 µmol aufgetragen. Es ergaben sich sowohl für das aus Hämofiltrat isolierte Peptid (aus den Fraktionen 33+34 des 5. Schritts in Beispiel 1) und das chemisch synthetisierte Peptid (Beispiel 3) folgende identische vollständige Aminosäuresequenz:
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nukleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenz besitzt eine hundertprozentige Identitätit zu dem aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren 353-372 des humanen Proteins Alpha-1-Antitrypsin (Accession No. P01009).
Beispiel 3 Chemische Synthese von VIRIP
Die chemische Synthese von VIRIP wurde mittels konventioneller Festphasensynthese auf einem Peptid-Synthesizer 9050 unter Verwendung der bekannten Fmoc-Chemie durchgeführt. Das erhaltene Peptid wurde über Reverse- Phase Chromatographie aufgereinigt, seine Identität und Reinheit wurde mittels analytischer RP-HPLC sowie der unter Beispiel 2 beschriebenen Massen- und Sequenzbestimmung festgestellt.
Beispiel 4 Bestimmung der antiviralen Aktivität von VIRIP
Die Isolierung der VIRIP erfolgte aufgrund ihrer inhibitorischen Wirkung auf die Vermehrung von HIV-1 in einem Assay, der die Replikation von HIV-1 in peripheren humanen Blutlyrnphozyten (PBMCs) mißt. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay in Mengen von 10 ml bis zu 1 L Hämofiltrat-Äquivalent zugeführt Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.
Humane periphere Blutlymphozyten (PBMCs) wurden aus Vollbut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation in Ficoll gewonnen. Die Zellen wurden für zwei Tage vorstimuliert (RPMI-Medium, 20% FKS, 100 U/ml IL-2, 5 µg/ml Phytohämagglutinin [PHA]. Anschließend wurden die PBMCs durch Zentrifugation für 5 min bei 1200 rpm sedimentiert, in PHA-freiem RPMI-Medium aufgenommen (20% FKS, 100 U/ml IL-2) und in einer Konzentration von etwa
Fluß: 40 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: á 50 ml ab Start des Gradienten
5. Schritt: Analytische Reverse-Phase C4-Chromatographie
Die bioaktive Fraktion 27 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde über eine analytische Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Aliquots wurden im Bioassay getestet. Die Fraktionen 33+34 enthielten die erfindungsgemäße Substanz in aufgereinigter Form.
Chromatographiebedingungen: 5 µm, 100 Å, 20 × 250 mm
Säule: 2 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: RP-C4, 5 µm, 100 A, Biotek Silica, Östringen, Germany
Puffer A: Wasser, 0.1% TFA
Puffer B: 80% Acetonitril, 20% Wasser, 0.1% TFA,
Gradient: 20-60% B in 80 min. 60-100% B in 2 min
Fluß: 8 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1.5 min ab Start des Gradienten
Die erfindungsgemäße Reinsubstanz wurde daraufhin in dosisabhängigerweise im Bioassay untersucht und peptidchemisch charakterisiert.
Beispiel 2 Massenbestimmungen
Die Massenbestimmungen des aus Hämofiltrat isolierten Peptids (aus den Fraktionen 33+34 des 5. Schritts in Beispiel 1) und des chemisch synthetisierten Peptids (Beispiel 3) wurden auf einem ESI Massertspektrometer durchgeführt. Die Molekülmasse der Peptide wurden entsprechend der nachfolgend gezeigten Massenzahlen (MW) bestimmt:
VIRIP, isioliert aus humanem Hämofiltrat: 2303 Da
VIRIP, chemisch synthetisiertes Peptid: 2303 Da

150.000 Zellen pro Loch in 96-Well-Flachboden-Platten in einem Volumen von 80 µl ausgesät.
Am folgenden Tag wurden Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen in Mengen von 10 ml bis zu 1 L Hämofiltrat-Äquivalent zugeführt. Dazu wurden die gefriergetrockneten Chromatographiestufen in Wasser aufgenommen und in verschiedenen Konzentrationen in einem Gesamtvolumen von 10 µl zu den PBMCs pipettiert Nach 2stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen durch die Zugabe von 10 µl HIV-1 Virusstock, der 0,1 bis 10 ng p24 Antigen enthält, infiziert Im folgenden wurden 50 µI des Kulturmediums alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt, welches zusätzlich die korrespondierenden Peptid-Fraktionen enthält. Die Produktion an HiV-Partikeln zu verschiedenen Zeitpunkten (9, 12 und 18 Tage) nach der Infektion der Zellen wurde im Reverse- Transkriptase(RT)-Test quantifiziert Der RT-Test mißt die Aktivität der Reversen- Transkriptase im zellfreien Kultürüberstand und ist somit ein Maß für die Produktion art Viruspartikeln und die virale Vermehrung in den PBMG-Kulturen. Alternativ wurde die Virusproduktion im p24 Antigen-ELISA bestimmt. Fraktionen, die im Vergleich zu Ansätzen ohne potentiell stimulierende oder inhibitorische Peptide zu einer mindestens 90%igen Reduktion der RT-Produktion führten und somit die Vermehrung von HIV-1 in humanen PBMC effizient hemmten, wurden weiter aufgereinigt.
Das aus Hämofiltrat aufgereinigte VIRIP (Beispiel 1) als auch das chemisch synthetisierte VIRIP (Beispiel 3) zeigten eine dosisabhängige Inhibition der HIV-1 Replikation in den PBMCs. Das erfindungsgemäße VIRIP besitzt dagegen keine, zytotoxische Wirkung auf die Blutzellen.

Claims (22)

1. Das Peptid mit nachfolgender Aminosäuresequenz:
Z1-LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF-Z2 (VIRIP)
sowie seine biologisch aktiven Fragmente und/oder Varianten und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosyherte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide, welche die biologische Aktivität von VIRW besitzen,
darin repräsentiert Z eine Anzahl von 0 bis zu 10 Aminosäureresten.
2. Das Peptid VIRIP nach Anspruch 1, wobei einzelne oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenzfolge ausgetauscht, deletiert oder zugefügt werden, sowie chemische Modifizierungen an einzelnen Aminosäuren des VIRIP, die eine verbesserte biologische Aktivität von VIRIP zur Folge haben.
3. Polynukleotide kodierend VIRIP nach Anspruch 1 und Anspruch 2 und/oder dessen Fragmente, Varianten, Derivate und Analoga.
4. Polynukleotide nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus DNA, RNA, genomischer DNA oder PNA aufgebaut ist.
5. Ein Vektor enthaltend die Polynucleotide aus Anspruch 3.
6. Eine gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 5.
7. Polynucleotide hybridisierend mit einem Polynucleotid aus Anspruch 3, das für ein Polypeptid mit VIRIP-Aktivität kodiert.
8. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1 und 2.
9. Antagonist/Inhibitor gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1 und 2.
10. Polypeptide aus Anspruch 1 und 2 in Verbindung mit einem Adapterprotein, das die Aufnahme in Virus-infizierbare Zellen gewährleistet.
11. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die VIRIP benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen der Polypeptide aus Anspruch 1, 2 und 10.
12. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die eine Inhibition des des VIRIP benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen eines Antagonisten/Inhibitors.
13. Galenische Formulierung bestehend aus Polypeptiden nach Anspruch 1, 2 und 10 und einem verträglichen Carrier.
14. Verfahren zur Behandlung von Patienten wobei eine therapeutische Wirkung des Polypeptids durch die Gabe von DNA kodierend für VIRIP und seine Expression in vivo beim Patienten erreicht wird.
15. Verfahren zur Herstellung von VIRIP gemäß Anspruch 1 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaustauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen- Chromatographie.
16. Verfahren zur Herstellung von VIRIP gemäß Anspruch 1 und 2 durch Festphasensynthese im Sinne der Merrifield-Synthese sowie Flüssigphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit geschützten Aminosäuren und dessen Aufreinigung.
17. Verfahren zur Herstellung einer VIRIP gemäß Anspruch 1 und 2 durch dem Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger biotechnologischer Vektoren.
18. Diagnostikmittel enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 8 oder enthaltend für die VIRIP nach Anspruch 1 und 2 kodierende Nukleinsäure oder mRNA.
19. Diagnostikmittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 und 2 oder Polynucleotide nach Anspruch 3 für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln dieser Substanz.
20. Diagnostikmittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 und 2 als Marker für virale Erkrankungen, bakterielle und Pilz-Infektionen, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Wachstumsstörungen, Erkrankungen des Immunsystems sowie als Marker bei Knochenerkrankungen.
21. Arzneimittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1, 2 und 10 als wirksamen Bestandteil von galenischen Formen zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, subcutanen, intrathekalen Anwendung sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
22. Verwendung der Peptide aus Anspruch 1, 2 und 10 sowie der Polynucleotide nach Anspruch 3 sowie der Antikörper/Antagonisten aus Anspruch 8 und 9 sowie einer galenischen Formulierung aus Anspruch 13 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viralen Erkrankungen, dabei insbesondere HIV-1, HIV-2, Herpes-simplex-Virus, Varicella-Zoster-Yirus, Hepatitis-A- und Hepalitis-B-Virus, Zytomegalie-Virus, Influenza-Virus, Polio-Virus, Rhino-Virus, Röteln-Virus, Masern-Virus, Tollwut-Virus, Rous-Sarcom-Virus, Epstein-Barr- Virus sowie zur Behandlung von bakteriellen und Pilz-Infektionen, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Wachstumsstörungen, neuronalen Erkrankungen, Erkrankungen der Blutgerinnung und Blutbildung, Gefäßerkrankungen, Erkrankungen des Immunsystems, sowie zur Wund- und Knochenheilung.
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US6670325B2 (en) * 2001-10-19 2003-12-30 Alpha Med Pharmaceuticals Corp. Treatment of osteocarcinoma with alpha-1—antitrypsin or secretory leucocyte protease inhibitor

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