DE4445630A1

DE4445630A1 - Humane zirkulierende Peptidfragmente 20-92 und 23-74 des Precursor des Osteoinduktiven Faktors kurz: OIF-20-92 und OIF 23-74

Info

Publication number: DE4445630A1
Application number: DE19944445630
Authority: DE
Inventors: Andreas G Schepky; Wolf-Georg Prof Dr Forssmann; Peter Dr Schulz-Knappe
Original assignee: Forssmann Wolf-Georg Prof Drmeddrhc 30625
Current assignee: Forssmann Wolf-Georg Prof Drmeddrhc 30625
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 1996-06-27

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, humanes Fragment 23-74 und humanes Fragment 20-92 des Precursors des Osteoinduktiven Faktors (oder Osteoglycin) kurz OIF-20-92 und OIF-23-74 sowie von ihnen abgeleiteten Fragmente und/oder Derivate, ein Arzneimittel enthaltend die erfindungsgemäßen Peptide, ein Diagnosemittel, Verwendung von OIF-20-92 und OIF-23-74 für zweite medizinische Indikationen.

Beschreibung

OIF-20-92 und OIF-23-74 konnten überraschenderweise aus humanem Hämofiltrat mit Hilfe von Assays für Tyrosinsulfat isoliert werden. Sie sind jeweils dreifach sulfatiert. Sie bestehen aus den nachstehenden angegebenen Aminosäuresequenzen:

Die erfindungsgemäßen Peptide sind erhältlich durch ein Isolationsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat.

Das humane Hämofiltrat wird mit Wasser 1 : 3 (v/v) verdünnt. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 7,0 bis 7,5, insbesondere 7,0. Danach wird das Hämofiltrat über einen Anionenaustauscher geleitet, beispielsweise einem mit Trimethylammonium modifizierenden Trägermaterial (Macroprep Q, Fa. BioRad, München). Die an den Anionenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Salzlösung eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung entspricht dabei einer 1 molaren Ammoniumacetatlösung mit pH 5,0.

Das aufgefangene Eluat wird gefriergetrocknet.

Das die Peptide enthaltene Lyophilisat wird einer weiteren Anionenaustauscher-Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Gradientenelutions-Chromatographie (Q Sepharose High Performance, Fa. Pharmacia, Freiburg) mit einem Puffer geringerer Ionenstärke bis zu einem Puffer mit höherer Ionenstärke entsprechend einer Ionenstärke von 1,0 M bis 1,1 M Natriumchlorid.

Die die erfindungsgemäßen Peptide enthalten Fraktionen werden mittels semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt. Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen- Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien und der Kapillarzonenelektrophorese überprüft.

Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen der nativen Peptide sowie der proteolytischen Fragmente und chemisch modifizierten Derivate erfolgte mittels eines Sciex API III. Die Aminosäureanalyse wurde zum einen nach einer sauren Totalhydrolyse durchgeführt. Zum anderen wurden Aminosäureanalysen der nativen Peptide sowie der proteolytischen Fragmente nach alkalischer Totalhydrolyse mit Bariumhydroxid durchgeführt. Damit und mit der Massenspektrometrie wurden die Sulfatierungen der Tyrosine 31, 33 und 47 nachgewiesen. Die Sequenzanalyse erfolgte über einen Edman-Abbau der Peptide und ihrer proteolytischen Spaltprodukte mit einem ABI 473 A Sequenzer.

Die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield-Synthese ist auch bei diesen sulfatierten Peptiden möglich. Die Synthesestrategie und der Aufbau der Peptide und von ihm abgeleiteten Derivaten mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.

Das erfindungsgemäße Peptid kann als Arzneimittel Verwendung finden. Es ist daher geeignet, als Arzneimittel bei den in Anspruch *** genannten Indikationen eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal oder bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt *** pro Darreichungseinheit.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktivmarkierter Form um in an sich bekannten ELISA, RIA oder Western-Blot eingesetzt zu werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiel näher beschrieben.

Beispiel 1 Batch-Extraktion

In zwei Ansätzen wurden je 800 l humanes Hämofiltrat mit Wasser auf 2400 l verdünnt. Der pH beträgt 7,0 bis 7,1. Nach Auftrag auf eine Amicon-Vantage Säule wurden die gebundenen Peptide in 6 bis 7 l eluiert (Chromatogramm siehe Fig. 1A).
Chromatographiebedingungen:
Säule: Amicon-Vantage (25 cm Durchmesser × 7 cm Füllhöhe)
Füllmaterial: BioRad Macroprep Q-strong
Batchpuffer: 1 M Ammoniumacetat, pH 5,0
Fluß beim Auftrag: 2 l/min
Fluß beim Eluieren: 1 l/min
Detektion: 214 nm
Anlage: Pilot-Scale Eigenbau.

Anionenaustausch-Chromatographie

Das lyophilisierte Eluat wird mit Wasser gelöst und damit auf eine Leitfähigkeit von 5,7 mS/cm verdünnt und ein pH von 7,7 mit NaOH eingestellt. Die Peptidlösung wird auf eine Amicon- Vantage Säule aufgetragen, welche mit Puffer A gespült und mit Puffer B im Gradienten eluiert wird. Es werden alle zwei Minuten Fraktionen gesammelt. Die Fraktion 40 wurde zur weiteren Bearbeitung unterworfen (Chromatogramm siehe Fig. 1B).
Chromatographiebedingungen:
Säule: Amicon-Vantage (6 cm Durchmesser × 13 cm Füllhöhe)
Füllmaterial: Pharmacia Q Sepharose High Performance
Puffer A: 0,025 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,1
Puffer B: 0,025 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,1, 1 M Ammoniumacetat
Gradient: 0-100% B in 50 min.
Fluß: 50 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: BioPilot (Pharmacia)
Fraktionen: á 2 min ab Start des Gradienten.

Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie

Die Fraktion 13 und 14 wurde in einem Chromatographielauf über eine semipräparative Reverse- Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktion 20 enthielt die erfindungsgemäßen Substanzen (Chromatogramm siehe Fig. 1C).
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm × 30 cm PrePak-Kartusche
Füllmaterial: Vydac^TM RP-C18, 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,06% TFA
Puffer B: 0,05% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0-50% B in 25 min, 50-100% B in 10 min
Fluß: 50 ml/min
Detektion: 214 nm.
Chromatographieanlage: Cedi
Fraktionen: á 1 min ab Start des Gradienten.

Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie

Die Fraktion 20 aus dem semipräparativen Trennschritt wurde auf einer analytischen Säule weiter aufgereinigt. Die Fraktion 49 enthielt die erfindungsgemäßen Substanzen (Chromatogramm siehe Abb. 1D).
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0-50% B in 50 min, 50-100% B in 10 min
Fluß: 0,75 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron.

Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie: Rechromatographie

Die Fraktion 49 aus dem analytischen Trennschritt wurde auf einer Säule weiter aufgereinigt. Die Fraktionen 19 (I; OIF-20-92) und 22 (II; OIF-23-73) enthielten die erfindungsgemäßen Substanzen (Chromatogramm siehe Abb. 1E).
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 30-50% B in 60 min, 50-100% B in 10 min
Fluß: 0,75 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron.

Kapillar-Zonen-Elektrophorese

Zur Überprüfung der Reinheit wurde eine Kapillarzonen-Elektrophorese angefertigt. Die Fraktion 19 und 22 enthält je eine der zu über 98% aufgereinigte Substanz (Elektropherogramme siehe Fig. 1F1 und 1F2).
Bedingungen:
Kapillare: fused silica
Effektive Länge: 50 cm
Gesamtlänge: 57 cm
Puffer: 100 mM NaH₂PO₄ pH 2,5, 0,2% Hydroypropylmethylcellulose
Strom: 120 µA const.
Detektion: 200 nm
Temperatur: 25°C.

Beispiel 2 Massenbestimmung

Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten Peptide und von proteolytischen Fragmenten wurden auf einem Elektrospray-Massenspektrometer (Sciex API III, Fa. Perkin Elmer) durchgeführt. Die Molekülmasse des unbehandelten Peptides OIF-23-74 wurde zu 6430 Dalton bestimmt, die des OIF-20-92 zu 8726.

Saure Aminosäureanalyse

Nach Gasphase-Hydrolyse mit 6 N HCl für 1 Stunde bei 160°C werden die Aminosäuren mit einem automatischen Aminosäureanalysator (AminoQuant, Hewlett-Packard) nach Doppelmarkierung mit OPA/Fmoc mit dem Standardprogramm analysiert. Das Peptid enthält die folgenden mit dieser Methode nachweisbaren Aminosäuren:

Asx 9
Glx 11
Ser 4
His -
Gly 2
Thr 3
Ala 0
Arg 1
Tyr 4
Val 1
Met -
Phe 2
Ile 6
Leu 3
Lys 5
Pro 1

Bestimmung von Tyrosinsulfat

Nach alkalischer Hydrolyse mit 0,2 M Bariumhydroxid für 22 Stunden bei 110°C und Fällung des Bariums mit 2 M Schwefelsäure als Bariumsulfat werden die Aminosäuren mit einem automatischen Aminosäureanalysator (AminoQuant, Hewlett-Packard) nach Doppelmarkierung mit OPA/Fmoc mit dem Standardprogramm analysiert. Dabei werden Tyrosinsulfate im Gegensatz zur sauren Hydrolyse nicht zerstört und können so nachgewiesen werden. Sowohl die nativen Peptide als auch die Spaltprodukte der Asp-N-Spaltung von OIF-23-74 wurden gemessen.

Asp-N-Spaltung

Eine Spaltung des Peptids mit der Endopeptidase Asp-N (E.C. 3.4.21.4) erfolgte bei 37°C über 2 Stunden in den vom Hersteller (Boehringer, Mannheim) angegebenen Puffern bei einem Verhältnis von Enzym zu Peptid von 1 : 25 Die Spaltprodukte wurden über RP-Chromatographie mit einer analytischen Vydac C18 RP-Säule getrennt (Abb. 2). Die Aminosäurenzusammensetzung, die posttranslationalen Modifikationen der Sulfatierung, Sequenz und Massen der einzelnen Peaks wurde bestimmt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0-50% B in 50 min, 50-100% B in 10 min
Fluß: 0,75 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron.

Sequenzbestimmung

Sowohl die nativen Peptide als auch die Spaltfragmente von OIF-23-74 werden mittels Edman- Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Werten aus der Aminosäureanalyse, der Tyrosinsulfatbestimmung und den Massenbestimmungen ergeben sich die folgende Sequenzen:

Datenbankvergleich

Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an der SwissProt Datenbank durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß cDNA des humanen OIF-Precursors (1-298) schon 1991 von MADISEN et al. isoliert, sequenziert und publiziert wurde (Madisen, L., Neubauer, M., Plowman, G., Rosen, D., Segarini, P., Dasch, J., Thompson, A., Ziman, J., Bentz, H., & Purchio, A. F. (1990). Molecular cloning of a novel bone-forming compound: osteoinductive factor. DNA-Cell-Biol, 9, 303-309). Der gesamte humane Precursor wurde auf Proteinebene weder in Fragmenten noch ungespalten isoliert. Tyrosinsulfatierungen sind in der Literatur nicht postuliert oder detektiert worden.

Beispiel 3 Bestimmung der biologischen Aktivität Beispiel 4 Synthese des gesamten Peptids Beispiel 5 Herstellung von Antikörpern durch Immunisierung in Kaninchen Anlage

Abb. 1A:
Pilot-Scale Extraktion des Hämofiltrates durch Anionen-Austauschchromatographie
Abb. 1B:
Präparative Anionen-Austauschchromatographie auf der Biopilotanlage nach der Lyophilisation
Abb. 1C:
Semi-präparative C18-Reverse Phase Chromatographie
Abb. 1D:
Analytische C18-Reverse Phase Chromatographie
Abb. 1E:
Analytische C18-Reverse Phase Re-Chromatographie
Abb. 1F1:
Elektropherogramm des aufgereinigten Peptides OIF-20-92
Abb. 1F2:
Elektropherogramm des aufgereinigten Peptides OIF-23-74.
Abb. 2:
Analytische C18-Reverse Phase Chromatographie der Spaltfragmente der Asp-N-Spaltung von OIF-23-74.

Claims

1. OIF-23-74 mit nachfolgender Aminosäuresequenz und OIF-20-92 mit nachfolgender, ermittelter Aminosäuresequenz sowie dessen biologisch aktiven Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate.

2. Verfahren zur Herstellung eines OIF-23-74 und OIF-20-92 gemäß Anspruch 1 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Anionenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Anionenaustauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Lyophilisates des Eluates sowie eine Umkehrphasen-Chromatographie.

3. Verfahren zur Herstellung eines OIF-20-92 und OIF-23-74 gemäß Anspruch 1 durch Festphasensynthese im Sinne der Merrifield-Synthese mit geschützten Aminosäuren unter Einschluß von Tyrosinsulfat.

4. Arzneimittel enthaltend OIF-20-92 und OIF-23-74 gemäß Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil.

5. Diagnostikmittel enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper gegen OIF-20-92 und OIF- 23-74 oder mit der für die OIF-20-92 und OIF-23-74 kodierenden Nukleinsäure oder mRNA.

6. Verwendung von OIF-20-92 und OIF-23-74 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Störungen:

1. In Testsystemen zur Kontrolle von Plasma-, Urin-, Liquor cerebrospinalis- und Knochenzellen-Spiegeln dieser Substanz
2. Als diagnostischer Marker von Funktionsstörungen des Knochenstoffwechsels und von inflammatorischen Prozessen
3. Zur Verwendung als Arzneimittel bei Knochenstoffwechselerkrankungen
4. Als Therapeutikum von Störungen des lokalen Stoffwechsels
5. Als Therapeutikum zum Aufbau von Knochen- und Knorpelsubstanz
6. Zur Herstellung von Knochenimplantaten
7. Als Marker von entzündlichen Systemerkrankungen
8. Als gewerblich genutztes Peptid zu Test- und Standardzwecken
9. Zur Herstellung von heterologen und monoklonalen Antikörpern, die für Immuntests wie RIA, ELISA und andere Verfahren der Immundiagnostik verwandt werden
10. Zur Ableitung von humanen und anderen Strukturanaloga mit veränderter Modifikation oder/und Aminosäuresequenz mit den Zielen in 1-7
11. Als Extrakt oder als Produkt durch Flüssigphasen- oder Festphasensynthese oder durch gentechnische Produktion auch von Fragmenten für die gewerbliche Anwendung
12. Wirkung auf Osteoklasten
13. Wirkung auf Osteoblasten
14. Wirkung auf osteosarcoma Zellen
15. Wirkung auf Tumore und Krebszellen.