DE3854904T2

DE3854904T2 - Peptide, die von der Faktor VIII-Bindungsdomäne des von Willebrand-Faktors abgeleitet sind

Info

Publication number: DE3854904T2
Application number: DE3854904T
Authority: DE
Inventors: Paul A Foster; Carol A Fulcher; Theodore S Zimmerman
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1987-05-01
Filing date: 1988-04-27
Publication date: 1996-07-04
Anticipated expiration: 2008-04-28
Also published as: EP0294025A3; EP0294025A2; DE3854904D1; GR3018870T3; US5260274B1; JP2631127B2; US5043429B1; US5260274A; ATE133183T1; CA1341097C; US5597711A; AU1527188A; US5043429A; EP0294025B1; ES2081804T3; JPS6456697A; AU626255B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft Peptide, die die Bindung von von Willebrand-Faktor (vWF) an Faktor VIII (FVIII) inhibieren.
vWF und FVIII besitzen beide wichtige, aber unterschiedliche Funktionen bei der Aufrechterhaltung der Hemostase. vWF ist an den Blutplättchen-Gefäßwand-Wechselwirkungen an der Stelle einer Gefäßverletzung beteiligt, während FVIII die Aktivierung von Faktor X durch Faktor IXa in Gegenwart von Blutplättchen und Calciumionen beschleunigt. vWF und FVIII zirkulieren im Plasma als nichtkovalent verbundener Komplex, der vermutlich sowohl durch elektrostatische als auch durch hydrophobe Kräfte zusammengehalten wird. Man nimmt an, daß vWF FVIII in vitro stabilisiert und dessen Halbwertszeit im Blutkreislauf verlängert. Folglich führt die Abwesenheit von endogenem vWF zu einer merklichen Verringerung der Halbwertszeit von FVIII im Blutkreislauf. Da FVIII am inneren Blutgerinnungsweg beteiligt ist, würden Mittel, die die Wechselwirkung zwischen FVIII und vWF beeinträchtigen können, den FVIII-Spiegel im Plasma ändern und auf diese Weise als antithrombotische Mittel dienen. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können als antithrombotische Mittel wirken, indem sie die Bindung von vWF an FVIII verhindern. Sie sind außerdem in der Lage, FVIII in einem in vitro-Milieu, in dem FVIII produziert wird, zu stabilisieren.
Einem ersten Aspekt zufolge stellt die vorliegende Erfindung ein von Willebrand-Faktor-Polypeptid mit einem Molekulargewicht, wie durch SDS-PAGE bestimmt, von 29 kDa und einer Sequenz bereit, die eine Teilsequenz der folgenden Sequenz darstellt:
worin X Thr oder Ala bedeutet, die N-terminale Aminosäure des Polypeptids im Bereich von 3 Ser bis 44 Gly liegt, die C-terminale Aminosäure des Polypeptids im Bereich von 244 Leu bis 285 Asn liegt, und das Polypeptid in der Lage ist, die Bindung von von Willebrand-Faktor an Faktor VIII zu inhibieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine aminoterminale Sequenz, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 3 Ser beginnt und ungefähr mit dem carboxyterminalen Aminosäurerest 244 Leu endet. In einer weiteren Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine aminoterminale Sequenz, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 24 Glu beginnt und ungefähr mit dem carboxyterminalen Aminosäurerest 265 Ser endet. In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine aminoterminale Sequenz, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 44 Gly beginnt und ungefähr mit dem carboxyterminalen Aminosäurerest 285 Asn endet.
Einem zweiten Aspekt zufolge stellt die Erfindung ein von Willebrand-Faktor-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz bereit:
das in der Lage ist, die Bindung von von Willebrand-Faktor an Faktor VIII zu inhibieren.
Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII bereit, indem man ein Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung zur Bildung eines Polypeptid/Faktor VII-Komplexes zu Faktor VIII aus einer Rekombinante, aus Plasma oder einem handelsüblichen Konzentrat als Quelle gibt, den Komplex Reinigungsverfahren unterwirft; den Komplex zurückgewinnt und Faktor VIII vom Polypeptid abtrennt.
Einem anderen Aspekt zufolge stellt die Erfindung ein weiter verbessertes Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII bereit, das umfaßt, das man: Faktor VIII aus einer Rekombinante, aus Plasma oder einem handelsüblichen Konzentrat als Quelle an Teilchen absorbiert, die an ein Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung gebunden sind; den Faktor VIII eluiert; den eluierten Faktor VIII in einer weiteren Adsorption zu seiner Konzentration und weiteren Reinigung absorbiert; den absorbierten Faktor VIII eluiert; und den hochgereinigten und konzentrierten Faktor VIII zurückgewinnt.
Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung durch Techniken der DNA-Rekombination oder der Peptidsynthese bereit.
Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Expression von über rekombinante DNA hergestelltem Faktor VIII bereit, das umfaßt, daß man ein Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung durch DNA-Rekombintionstechniken in derselben Zelle exprimiert, in der Faktor VIII durch DNA-Rekombinationstechniken exprimiert wird; sich zwischen dem Peptid und Faktor VIII entweder in der Zelle, während der Sekretion aus der Zelle oder nach der Sekretion aus der Zelle einen Komplex bilden läßt; den Komplex zurückgewinnt; und Faktor VIII vom Peptid abtrennt.
Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Thrombosevorbeugung oder zur Inhibierung der Bindung von von Willebrand- Faktor an Faktor VIII bereit, die wenigstens ein Polypeptid oder Peptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung umfaßt.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den anhängenden Unteransprüchen angeführt. In den Vertragsstaaten GR und ES betrifft die Erfindung Verfahren und Verwendungen, wie sie in dem anhängenden, als für diese Staaten wirksam gekennzeichneten Anspruchssatz aufgeführt werden.
Es wurde gefunden, daß ein monoklonaler Anti-vWF-Antikörper, C3, in der Lage war, die Bindung von gereinigtem Human-FVIII an gereinigten Human-vWF in einem Kreuz-Immunelektrophoresesystem zu hemmen. Folglich muß das Epitop von C3 nahe dem der FVIII-Bindungsdomäne von vWF liegen, und daher wurde dieser Antikörper als Marker für die FVIII-Bindungsdomäne verwendet.
Vollständiger, nichtreduzierter ¹²&sup5;I-markierter vWF wurde mit Subtilisin im Verhältnis von 1/25 (w/w) 24 Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt. Diese Reaktionsmischung wurde dann in Mikrotitervertiefungen gegeben, die zuvor mit monoklonalem AntivWF-Antikörper C3 beschichtet worden waren. Die Vertiefungen wurden gründlich gewaschen und dann mit auf ungefähr 90ºC erwärmtem SDS-Puffer behandelt, und die Lösung wurde auf einem 5- 15%-igem SDS-PAGE-Gradientengel laufen gelassen. Eine Autoradiographie des SDS-PAGE-Gels zeigte überwiegend eine Einzelbande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 29 kDa. Ein ähnlicher Verdau wurde mit unmarkiertem vWF vorgenommen und diese Reaktionsmischung wurde auf eine Chromatographiesäule gegeben, die aus an Sepharose 48 gekoppelten monoklonalen Anti-vWF-Antikörpern C3 aufgebaut war. Die C3-reaktiven Fragmente wurden dann mit 3M NaSCN eluiert, dialysiert und konzentriert. Durch Immun-Blotting wurde eine mit C3 reaktive Bande identifiziert. Eine Aminosäuresequenzierung dieser Bande ergab, daß ungefähr 60% der Aminotermmi mit Aminosäurerest Nummer 44 der reifen vWF-Untereinheit begannen, ungefähr 20% mit Rest Nummer 24 begannen und ungefähr 10% mit Rest Nummer 3 begannen.
Das oben beschriebene Experiment lokalisierte das C3-Epitop und indirekt die FVIII-Bindungsdomäne in der aminoterminalen Region von vWF. Da das Molekulargewicht des so identifizierten Peptids ungefähr 29 kDa betrug und sein Aminoterminus überwiegend der Aminosäurerest 44 der reifen Untereinheit war, sollte der Carboxyterminus, auf Grundlage eines durchschnittlichen Molekulargewichts von ungefähr 120 pro Aminosäure, ungefähr bei Aminosäurerest 285 liegen. Auf Grundlage der von Titani et al., Biochemistry 25, 3174-3184 (1986) veröffentlichten Aminosäuresequenz von vWF ist es möglich, Peptide aus der Region zu synthetisieren, die mit Rest 3 beginnt und mit Aminosäurerest 285 endet und den Bereich von vWF umfaßt, der die FVIII Bindungsdomäne enthält.
Bei Titani et al. wurde Rest 26 durch Sequenzanalyse sowohl als Ala als auch als Thr in einem Molverhältnis von 4:1 identifiziert. Im Gegensatz dazu sagte die Nucleotidsequenz des lammbda HvWF1-Klons nach Sädler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398 (1985) Thr als Rest 26 voraus. Diese Diskrepanz kann auf einem Polymorphismus im Protein oder auf einem Fehler bei der CDNA-Replikation während der Präparation der DNA-Bank beruhen. Im Hinblick auf diese Unsicherheit bei Rest 26 wird die Aminosäure von Rest 26 durch X gekennzeichnet, was eine unbestimmte Aminosäure bedeutet. Diese Peptide können die FVIII-vWF-Wechselwirkung beeinträchtigen und dienen so als antithrombotische Mittel. Weitere monoklonale Antikörper für diese Region können erzeugt werden, die ebenfalls die FVIII-vWF-Wechselwirkung beeinträchtigen und so als antithrombotische Mittel dienen können.
Die experimentellen Verfahren, die für die Lokalisierung des C3- Epitops und indirekt der FVIII-Bindung auf dem 29 kDa Polypeptidfragment angewandt wurden, werden unten genauer erläutert, wenn eben diese Verfahren für die Lokalisierung des C3-Epitops und indirekt der FVIII-Bindung auf dem 170 kDa Polypeptidfragment angewandt werden.
Die Reinigung von FVIII aus handelsüblichem Faktor VIII-Konzentrat (Armour Pharmaceutical, Kankakee, IL) durch Immunadsorptionschromatographie mit monoklonalem Anti-vWF-Antikörper wird bei Fulcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1648-1652 (1982) beschrieben. Die FVIII-Präparationen, die nach diesem Verfahren erhalten und in den folgenden Experimenten verwendet wurden, besaßen spezifische Aktivitäten von 2900-3800 Units/mg. Gereinigter vWF wurde aus handelsüblichem Faktor VIII-Konzentrat (Armour Pharmaceutical, Kankakee, IL) durch Immunadsorptionschromatographie mit einem monoklonalen, an Sepharose gebundenen AntivWF-Antikörper wie bei Fuicher et al. beschrieben erhalten. Der gebundene vWF wurde, wie von Fujimara et al., J. Biol. Chem. 261, 381-385 (1986) beschrieben, mit 3M NaSCN eluiert und mit einem Minitan-Tangentialströmungs-Ultrafiltrationssystem (Millipore, Bedford, MA) mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze fur ein Molekulargewicht von 100000 konzentriert und entsalzt. Das Protein wurde weiter ausgiebig gegen 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,35 (TBS) dialysiert.
Monoklonale Anti-FVIII- und Anti-vWF-Antikörper aus Mäusen wurden wie bei Fulcher et al. und Fujimara et al. beschrieben hergestellt, gereinigt und charakterisiert. Radioiodinierung der monoklonalen Anti-FVIII- und Anti-vWF-Antikörper erfolgte nach der Methode von Fraker und Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978) bis auf eine spezifische Aktivität von 3-10 x 10&sup9; cpm/mg.
SP-Fragment III wurde durch limitierte Proteolyse von vWF mit Protease V8 von Staphylococcus aureus (Sigma, St Louis, MO) erhalten und nach der Methode von Girma et al., Biochemistry 25, 3156-3163 (1986) mit Modifikationen wie bei Titani et al., Biochemistry 25, 3171-3184 beschrieben gereinigt. Alle Fragmente wurden vor dem Testen gegen TBS, pH 7,35, dialysiert.
Reduktion und Alkylierung von vWF erfolgten wie zuvor bei Fujimara et al. beschrieben.
Zweidimensionale Kreuz-Immunelektrophorese von vWF erfolgte wie beschrieben bei Zimmerman et al., Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980's, 5. 339-349, Alan R. Liss, Inc., New York (1980), mit den folgenden Modifikationen. Agarose wurde in einen 1,5 cm Streifen am Ende eines 10,2 cm x 8,3 cm-Gelbondstücks (FMC Corporation, Rockland, ME) gegossen. Gereinigter vWF oder Fragmente von vWF, FVIII und ¹²&sup5;I-markierter monoklonaler Anti-FVIII-Antikörper wurden in der Probenvertiefung gemischt und einer Elektrophorese unterworfen. Dann wurde ein zweites Gel mit 125-250 µl Kaninchenserum, das polyklonale Anti-vWF-Antikörper enthielt, gegossen, und die Elektrophorese in der zweiten Dimension erfolgte im rechten Winkel zur ersten Dimension. Von den Gelen wurden Autoradiographien angefertigt und mit den Coomassie Brilliantblau-Färbungen der Gele verglichen.
Versuche zur kompetitiven Inhibierung der FVIII-Bindung an Festphasen-vWF: 50 µg von vollständigem, nichtreduziertem vWF in 1 ml 0,01 M PO&sub4; 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,3 (PBS), wurden mit drei Polystyrolperlen mit 1/4 Inch Durchmesser (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) pro Gewebekulturvertiefung mit 16 mm Durchmesser 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde entfernt und die Vertiefungen und die Perlen wurden dann mit 1 ml PBS, enthaltend 0,05% Tween-20 und 3% humanes Serumalbumin, 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Vertiefungen und die Perlen wurden in der Blockierlösung vor der Verwendung 16 Stunden bis 10 Tage bei 4ºC aufbewahrt. Die Vertiefungen und die Perlen wurden dann dreimal mit PBS mit 0,05% Tween-20 gewaschen und 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur mit 1,3 µg gereinigtem FVIII und 0-100 µg des kompetitiven Liganden in lml 0,05 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,0, 3mm CaC1&sub2; inkubiert. Die Perlen wurden dann fünfmal mit PBS 0,05% Tween-20 gewaschen und 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur mit 1,5 x 106 cpm ¹²&sup5;I-monoklonalem Anti-FVIII-Antikörper C2 (spezifische Aktivität 3,8 x 10&sup9; cpm/mg) in 1 ml PBS 0,05% Tween-20, enthaltend 0,5% bovines gamma-Globulin, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen und die Perlen zweimal mit PBS 0,05% Tween-20 gewaschen. Die Perlen wurden dann in saubere Vertiefungen überführt und noch viermal gewaschen und getrennt gezählt. Die Gesamt-cpm in Abwesenheit konkurrierender Liganden lagen in verschiedenen Experimenten im Bereich von 1340-2350 cpm. Untergrundzählimpulse waren die Impulse, die man bei der Inkubation von ¹²&sup5;I-monoklonalem Anti-FVIII- Antikörper C2 mit den mit vWF beschichteten Perlen in Abwesenheit von FVIII erhielt. Sie lagen im Bereich von 60-200 cpm.
Die Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
Die Kreuz-Immunelektrophorese zeigte eine Komplexbildung zwischen gereinigtem vWF und gereinigtem FVIII. Dies wurde durch Copräzipitation von 1-markiertem monoklonalem Anti-FVIII-Antikörper und unmarkiertem vWF gezeigt, die nur bei Anwesenheit von gereinigtem FVIII in der Probenvertiefung erfolgte. Um die FVIII- Bindungsdomäne zu lokalisieren, wurden ähnliche Experimente mit durch Verdau mit Protease V8 von Staphylococcus aureus erhaltenen vWF-Fragmenten durchgeführt. Es wurde berichtet, daß ein limitierter Verdau von vWF mit Protease V8 von Staphylococcus aureus hauptsächlich zu einem einzigen Schnitt in vWF führt, der zwei größere Fragmente liefert. SP-Fragment II ist ein 110 kDa-Homodimer, das den carboxyterminalen Teil des vWF-Moleküls (Reste 1366-2050) enthält, und SP-Fragment III ist ein 170 kDa-Homodimer, das den aminoterminalen Teil des vWF-Moleküls enthält. Dieses 170 kDa-Polypeptidfragment besitzt eine aminoterminale Sequenz, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 1 Ser beginnt, und einen carboxyterminalen Aminosäurerest, der nicht über Aminosäurerest 1365 Glu, entsprechend der von Titani et al., Biochemistry, 25, 3171-3184 (1986) veröffentlichten Aminosäuresequenz, hinausgeht. Diese zwei Fragmente stellen 100% der Molekülmasse der vWF-Untereinheit dar. Eine Komplexbildung wurde zwischen FVIII und dem aminoterminalen SP-Fragment III, aber nicht mit dem carboxyterminalen SP-Fragment II nachgewiesen. Dies zeigt, daß das aminoterminale SP-Fragment III in seiner homodimeren Form die Fähigkeit beibehält, mit FVIII in einer qualitativ ähnlichen Weise wie der vollständige vWF in Wechselwirkung zu treten. Das carboxyterminale SP-Fragment II in seiner homodimeren Form zeigt diese Fähigkeit zur FVIII-Bindung nicht.
Der monoklonale Anti-vWF-Antikörper C3, wenn er in der Probenvertiefung vorlag, inhibierte größtenteils die Komplexbildung zwischen FVIII und vWF, während 80 andere monoklonale Anti-vWF-Antikörper (getestet in Pools von jeweils 5) keinen Effekt zeigten. C3 inhbierte in diesem System auch die Komplexbildung zwischen FVIII und SP-Fragment III. Die direkte Reaktivität von C3 mit SP- Fragment III wurde gezeigt, indem man ¹²&sup5;I-markierten C3 in eine Probenvertiefung gab, die gereinigtes SP-Fragment III enthielt. Autoradiographien der Kreuz-Immunelektrophoresegele zeigten eine Copräzipitation des radioaktiv markierten Antikörpers mit SP- Fragment III. In einem ähnlichen Experiment erfolgte mit SP-Fragment II keine Copräzipitation.
-Um die FVIII-Bindung an vWF besser zu charakterisieren, wurde ein kompetitiver Inhibierungstest entwickelt. In diesem Test wurden gereinigter vWF oder gereinigtes SP-Fragment III an der Oberfläche von Polystyrolperlen adsorbiert. Die Perlen wurden dann mit gereinigtem FVIII inkubiert. Gereinigter FVIII band sowohl an nichtreduzierten vWF als auch an nichtreduziertes SP-Fragment III, die an der Oberfläche der Polystyrolperlen immobilisiert waren. Dies wurde durch die Bindung des 1-markierten monoklonalen Anti-FVIII-Antikörpers an hintereinander mit vWF und FVIII inkubierte Polystyrolperlen nachgewiesen.
Sowohl die Bindung von FVIII an vWF als auch die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem monoklonalen Anti-FVIII-Antikörper an FVIII in diesem System waren spezifisch, wie durch die folgenden Experimente nachgewiesen wird. Erstens wurde gezeigt, daß die Bindung von FVIII von der Anwesenheit von vWF abhing, der an der Oberfläche der Polystyrolperlen adsorbiert war. Wenn die Polystyrolperlen mit humanes Serumalbumin beschichtet und dann mit FVIII und anschließend mit ¹²&sup5;I-markiertem monoklonalen Anti-FVIII- Antikörper inkubiert wurden, betrug die Zahl der gemessenen Impulse pro Minute nur 2% der Zahl, die bei der Bindung von FVIII an mit vWF beschichtete Polystyrolperlen beobachtet wurde. Zweitens betrug die Zahl der auf die Perlen zurückzuführenden Impulse pro Minute nur 1% der Zahl, die bei Inkubation mit FVIII beobachtet wurde.
Auch die Reversibilität der Bindung von FVIII an den immobihsierten vWF konnte nachgewiesen werden. Es war gezeigt worden, daß die Dissoziation von FVIII vom vWF-FVIII-Komplex in Gegenwart von 0,25 M CaCl&sub2; [nach Cooper et al., J. Clin. Invest. 54, 1093-1094 (1974)], 10-20 mM EDTA [nach Tran et al., Thromb. Haemostas. 50, 547-551 (1983)] oder 1-1,5 M NaCl [nach Weiss et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27, 212-219 (1972)] erfolgte. In dem System mit den Polystyrolperlen führte ein fünfmaliges Waschen der Polystyrolperlen bei 37ºC mit einer imidazolgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, die 0,25 M CaCl&sub2; enthielt, zu einer 70 ± 4%-igen FVIII-Dissoziation von vWF. Ähnlich führte ein fünfmaliges Waschen der Polystyrolperlen bei 37ºC mit einer imidazolgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, die 20 mM EDTA enthielt, zu einer 66 ± 5%-igen Dissoziation und mit einem Imidazolpuffer, der 1,5 M NaCl enthielt, zu einer 86 ± 1%-igen FVIII- Dissoziation von vWF. Fünfmaliges Waschen mit der gleichen imidazolgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, die 3 mM CaCl&sub2; enthielt, ergab keine FVIII-Dissoziation von an Polystyrolperlen adsorbiertem vWF.
Die Bindungsspezifität von FVIII in fluider Phase für an der Oberfläche der Polystyrolperlen adsorbierten vWF wurde auch durch die Fähigkeit des vollständigen, nichtreduzierten vWF in fluider Phase nachgewiesen, diese Bindung vollkommen zu inhibieren. Reduzierter und alkylierter vWF besaß keinen inhibierenden Effekt auf die FVIII-Bindung. Reduzierter und alkylierter vWF und reduziertes und alkyliertes SP-Fragment III waren im Kreuz-Immunelektrophoresesystem ebenfalls nicht in der Lage, FVIII zu binden. Diese Ergebnisse stimen mit der Beobachtung überein, daß FVIII unter schonenden reduzierenden Bedingungen von vWF dissoziiert werden kann [siehe Blomback et al., Thromb. Res. 12, 1177-1194 (1978)].
SP-Fragment III zeigte eine dosisabhängige Inhibierung der FVIII- Bindung mit einer 90%-igen Inhibierung bei einer Konzentration von 50 µg/ml. SP-Fragment 1, ein Produkt des Verdaus von SP-Fragment III mit Protease V8 von Staphylococcus aureus, das den mittleren Teil des vWF-Moleküls enthält [Reste 911-1365, wie beschrieben bei Titani et al., Biochemistry 25, 3171-3184 (1986)] führte bei Konzentrationen von bis zu 100 µg/ml nur zu einer 15%- igen Inhibierung. Durch diese Daten wurde eine größere FVIII- Bindungsdomäne am aminoterminalen Teil von vWF lokalisiert. Das SP-Fragment II inhibierte die FVIII-Bindung bei einer Konzentration von 50 µg/ml zu 29%. Eine Verdopplung der Konzentration führte zu keiner wesentlichen Steigerung der Inhibierung.
Die vollständige 2050 Aminosäuren lange Sequenz von vWF wurde durch Proteinsequenzierung bestimmt [siehe Titani et al., Biochemistry 25, 3171-3184 (1986)]. Mit dieser Information ist es möglich, eine Nucleotidsequenz in einen geeigneten Vektor zu inserieren, um die 29 kDa- und 170 kDa-Polypeptidfragmente und Teilsequenzen der Polypeptidfragmente, die die Bindung von vWF an FVIII inhibieren, zu exprimieren. Für eine Beschreibung von Techniken der DNA-Rekombination zur Klonierung von vWF-Fragmenten, siehe Ginsburg et al., Science 228:1401-1406 (1985) und Sädler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398 (1985).
Peptide aus der aminoterminalen Region des 29 kDa-Polypeptidfragments mit einer Länge von wenigstens drei Aminosäureresten werden wie von Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5135 (1985) beschrieben synthetisiert.
In dem gut bekannten Verfahren der Festphasensynthese eines Peptids wird das gewünschte Peptid ausgehend von einem unlöslichen Träger, wie Benzhydrylaminharz oder chlormethyliertes Harz (das von vernetztem Polystyrol abstammt und von Chemikalienherstellern erhältlich ist) zusammengebaut. Die Aminosäure am carboxyterminalen Ende des gewünschten Polypeptids, die Schutzgruppen am alpha- Aminostickstoff und an allen weiteren reaktiven Gruppen trägt, wird aus der Lösung mittels bekannter Peptidkupplungsverfahren an das Harz gebunden. Die Schutzgruppe an der alpha-Aminogruppe wird entfernt (wobei weitere Schutzgruppen, so vorhanden, intakt bleiben), und die nächste Aminosäure der gewünschten Sequenz (die geeignete Schutzgruppen trägt), wird angehängt, und so weiter. Wenn das gewünschte Polypeptid vollständig zusammengebaut ist, wird es vom Trägerharz abgespalten, alle Schutzgruppen werden entfernt und das Polypeptid wird zurückgewonnen. Beispiele für geeignete Schutzgruppen sind: alpha-tert-Butyloxycarbonyl für die alpha-Aminogruppe; Benzyl, 4-Methoxybenzyl oder 4-Methylbenzyl für die Thiolgruppe von Cystein, die beta-Carbonsäuregruppe von Asparaginsäure, die gamma-Carbonsäuregruppe von Glutaminsäure und die Hydroxylgruppen von Serin, Threonin und Tyrosin; Benzyloxycarbonyl oder dessen 2-Chlor- oder 3,4-Dimethoxyderivate für die Ringstickstoffatome von Histidin und Tryptophan und die epsilon- Aminogruppe von Lysin; p-Nitrophenyl für die Amidstickstoffatome von Asparagin und Glutamin; und Nitro oder Tosyl für die Guanidingruppe von Arginin.
Für die Zwecke dieser Offenbarung wurden anerkannte Kurzbezeichnungen für die Aminosäuren verwendet. Im folgenden wird eine vollständige Liste gegeben: Ein- und Dreibuchstabenabkürzungen für Amingsäuren Alanin Cystein Asparaginsäure Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan Tyrosin oder nicht unterschieden Unbestimmte oder untypische Aminosäure
Ein oder mehrere der Peptide der vorliegenden Erfindung können zu pharmazeutischen Präparaten für therapeutische, diagnostische oder andere Verwendungen formuliert werden. Zur Präparation für eine intravenöse Verabreichung werden die Zuammensetzungen in Wasser gelöst, das physiologisch verträgliche Substanzen wie Natriumchlorid (z.B. 0,35 - 2,0 M), Glycin u.a. enthält, und einen gepufferten pH besitzt, der unter physiologischen Bedingungen verträglich ist. Die zur Thrombosevorbeugung zu verabreichende Menge hängt von der Schwere der Thrombose beim Patienten ab, ist aber für jeden einzelnen Patienten leicht bestimmbar.
Das folgende Beispiel dient der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung ist nicht allein auf dieses Beispiel beschränkt.

Beispiel 1

Prädaration eines monoklonalen Antikörpers, C3, aus einer Hybridomzellinie

Bei dem Verfahren zur Erzeugung einer Hybridomzellinie, die monoklonalen Anti-vWF-Antikörper C3 produziert, wurden Mäuse vom Stamm BALB/c (Research Institute of Scripps Clinic) intraperitoneal mit gereinigtem FVIII-Immunogen immunisiert, das geringe Mengen an vWF enthielt, der bei der Aufreinigung als Verunreinigung mitanfällt. Der FVIII wurde wie bei Fulcher et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 1648-1652 (1982) beschrieben präpariert. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 1 µg des Immunogens in komplettem Freundschen Adjuvans immunisiert. Sieben Tage später wurden die Mäuse intraperitoneal mit 10 µg Immunogen in inkomplettem Freundschen Adjuvans immunisiert. Sieben Tage nach dieser zweiten Injektion wurden sie intraperitoneal mit 50 µg Immunogen in inkomplettem Freundschen Adjuvans immunisiert. Acht Tage nach dieser dritten Injektion wurde sie intraperitoneal mit 100 µg löslichem Immunogen immunisiert. Drei Tage danach wurde die Milz entfernt, und die Milzzellen wurden mit P3X63-AGB.653 fusioniert (Maus-Myelomzellinie)
P3X653-AGB.653 wurde (vor der Fusion) in einem Medium aus 90% Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (hohe Glucose) und 10% fetalem Rinderserum (FBS) in log-Phase gehalten. Die folgenden empfohlenen Supplementierungsstoffe wurden zu 475 ml des obigen Mediums hinzugegeben: 5 ml Glutamin (100x), 5 ml Natriumpyruvat (100x), 5 ml nichtessentielle Aminosäuren (100x), 5 ml Pen-strepfungizone (100x) und 10 ml 8-Azaguanin 6,6 x 10&supmin;³ M (50x). Milzund Myelomzellen wurden vor der Fusion gründlich ohne FBS in Dulbeccovs modifiziertem Eagle-Medium gewaschen. Die Zellen wurden mit 1 ml 40% PEG 1500 1 Minute lang fusioniert. Dann wurden die Zellen mit Wachstumsmedium 1 Minute lang 1:2 verdünnt. Die Zellen wurden 2 Minuten lang mit Wachstumsmedium 1:5 weiterverdünnt. Als nächstes wurden die Zellen bei 900 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert. Der überstand wurde entfernt, die Zellen wurden durch Suspension in HAT-Medium selektioniert und auf Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. Das HAT-Medium enthielt 90% an Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (hohe Glucose), 10% FBS und die folgenden empfohlenen Supplementierungsstoffe, zugegeben zu 405 ml der obigen zwei Komponenten: 5 ml Glutamin (100x), 50 ml NCTC 109, 5 ml Natriumpyruvat (100x), 5 ml nichtessentielle Aminosäuren (100x), 5 ml Pen-strep-fungizone (100x), 5 ml (Hypoxanthin 10&supmin;² M + Thymidin 1,6 x 10 M) (100x), 5 ml Rinderinsulin (20 I.U./ml) (100x), 5 ml Oxalacetat (101 M) (100x), und 10 ml Aminopterin (2x10&supmin;&sup5; M) (50x). Nach der Selektion wurden die Zellen vier Wochen lang in HT-Wachstumsmedium gehalten (Selektionsmedium minus Aminopterin). Die Subklonierung erfolgte durch limitierte Verdünnung. Vertiefungen mit Wachstum werden mittels ELISA getestet. Testplatten wurden mit 100 ng/Vertiefung Immunogen oder Humanfibrinogen, Humanfibronectin oder Human-vWF beschichtet, wobei jedes Protein eine potentielle Verunreinigung des Immunogens darstellt. 50 µl des Kulturüberstandes wurden getestet. Diejenigen Vertiefungen, die Zellen enthielten, deren Überstand mit einem vWF positiv war, wurden bei 37ºC in 10% CO&sub2; vermehrt.
Zur Produktion von Ascites-Flüssigkeit wurden die Mäuse wenigstens 4 Tage vor der Zellinjektion mit 0,5 ml Pristin sensibihsiert. Die Zellen wurden intraperitoneal (5x10&sup6;/Maus) in 0,5 ml Medium ohne FBS injiziert. Die Ascites-Flüssigkeit wurde geerntet, als sich die Mäuse aufblähten. Der monoklonale Anti-vWF- Antikörper C3, der in der Ascites-Flüssigkeit der Mäuse enthalten war, ist vom Typ IgG-1.
Die folgende Reinigung von monoklonalem Anti-vWF-Antikörper C3 aus Ascites-Flüssigkeit von Mäusen mit Protein A-Sepharose ist eine Verfahrensmodifikation des von Ey et al., Immunochemistry, 15, 429-436 (1978) beschriebenen Verfahrens. Die eingesetzten Mengen waren für eine 1 cm x 15 cm-Säule, die ungefähr 25-30 mg IgG-l band, die aber die Abtrennung von ungefähr 50 mg IgG-1 von nicht-IgG-Proteinen erlaubte. Die Säule kann außerdem 50 mg IgG2a binden. IgG2b bindet ebenfalls an die Säule, aber IgM, IgA und IgE binden nicht. 4-6 ml Ascites-Flüssigkeit wurden bei 30000 Upm 45 Minuten lang zentrifugiert. Die Lipide am oberen Ende wurden entfernt. Die Zugabe von 20% Sucrose Gew./Säule zu der Ascites- Flüssigkeit half bei der Entfernung der Lipide. Die Ascites-Flüssigkeit wurde mit 140 mM NaPO&sub4;-Puffer, pH 8, der 0,02% NaN&sub3; enthielt, auf 25-30 ml verdünnt. Die Ascites-Flüssigkeit wurde verdünnt, um die Beeinträchtigung der IgG-Bindung durch Chloridionen zu verhindern. Ungefähr 29 Protein A-Sepharose (Sigma) wurden in 10 mM phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit 0,02% NaN&sub3; gequollen und in eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm gepackt. Die Säule wurde in 140 mM NaPO&sub4;-Puffer mit 0,02% NaN&sub3; äquilibriert. Die Säule wurde mit verdünnter Ascites-Flüssigkeit mit 0,06-0,08 ml/min oder weniger beladen. Nach dem Beladen ließ man die Säule bei 4ºC über Nacht stehen, um die Bindung von IgG zu erhöhen. Die Säule wurde mit Puffern mit 0,6-0,8 ml/min in der folgenden Reihenfolge gewaschen:
1) 140 mM NaPO&sub4;, pH 8,0; 2) 0,1 M Na-citrat - Zitronensäure, pH 6,0 (IgG-1 eluierte); 3) 0,1 M Na-citrat - Zitronensäure, pH 5, - IgG2a eluierte und ein geringer Prozentsatz des restlichen IgG-1; 4) 0,1 M Na-citrat - Zitronensäure (ein geringer Prozentsatz des restlichen IgG2a eluierte); und 5> 0,1 M Na-citrat - Zitronensäure, pH 3,0 (IgG2b eluierte). Sobald die Säule mit dem Puffer von pH 3,0 gewaschen war, wurde sie mit 140 mM NaPO&sub4;-Puffer, pH 8,0 + 0,02% NaN&sub3; gewaschen, bis der pH des Ausflusses 8, betrug. Die Säule wurde bei 4ºC aufbewahrt. Während des Waschens der Säule wurden Fraktionen von ungefähr 5 ml gesammelt. Zu jeder Fraktion mit pH 5,0 wurde 1 ml 1M Tris-HCL zugegeben.

Claims

1. Von Willebrand-Faktor-Polypeptid mit einem Molekulargewicht, wie bestimmt durch SDS-PAGE, von 29 kDa und einer Sequenz, die eine Teilsequenz der folgenden Sequenz darstellt:

worin X Thr oder Ala bedeutet, die N-terminale Aminosäure des Polypeptids im Bereich von 3 Ser bis 44 Gly liegt, die C-terminale Aminosäure des Polypeptids im Bereich von 244 Leu bis 285 Asn liegt, und das Polypeptid in der Lage ist, die Bindung von von Willebrand-Faktor an Faktor VIII zu inhibieren.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid eine aminoterminale Sequenz besitzt, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 3 Ser beginnt und ungefähr mit dem carboxyterminalen Aminosäurerest 244 Leu endet.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid eine aminoterminale Sequenz besitzt, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 24 Glu beginnt und ungefähr mit dem carboxyterminalen Aminosäurerest 265 Ser endet.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid eine aminoterminale Sequenz besitzt, die mit dem aminoterminalen Aminosäurerest 44 Gly beginnt und ungefähr mit dem carboxyterminalen Aminosäurerest 285 Asn endet.

5. Von Willebrand-Faktor-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz:

das in der Lage ist, die Bindung von von Willebrand-Faktor an Faktor VIII zu inhibieren.

6. Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII, umfassend, daß man:

(a) ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 unter Bildung eines Polypeptid/Faktor VIII-Komplexes zu Faktor VIII aus einer Rekombinante, aus Plasma oder einem handelsüblichen Konzentrat als Quelle gibt;

(b) den Komplex Reinigungsverfahren unterwirft;

(c) den hochgereinigten Komplex zurückgewinnt; und

(d) Faktor VIII vom Polypeptid abtrennt.

7. Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII, umfassend, daß man:

(a) Faktor VIII aus einer Rekombinante, aus Plasma oder einem handelsüblichen Konzentrat als Quelle an Teilchen, die an ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-5 gebunden sind, absorbiert;

(b) den Faktor VIII eluiert;

(c) den in Schritt (b) erhaltenen Faktor VIII in einer weiteren Adsorption zu seiner Konzentration und weiteren Reinigung absorbiert;

(d) den absorbierten Faktor VIII eluiert; und

(e) den hochgereinigten und konzentrierten Faktor VIII zurückgewinnt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1-5 durch Techniken der DNA-Rekombination oder der Peptidsynthese.

9. Verbessertes Verfahren zur Expression von über rekombinante DNA hergestelltem Faktor VIII, umfassend, daß man:

(a) ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 durch DNA-Rekombintionstechniken in derselben Zelle exprimiert, in der Faktor VIII durch DNA-Rekombinationstechniken exprimiert wird;

(b) zwischen dem Peptid und Faktor VIII entweder in der Zelle, während der Sekretion aus der Zelle oder nach der Sekretion aus der Zelle sich einen Komplex bilden läßt;

(c) den Komplex zurückgewinnt; und

(d) den Faktor VIII vom Peptid abtrennt.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Thrombosevorbeugung oder zur Inhibierung der Bindung von von Willebrand-Faktor an Faktor VIII, die wenigstens ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-5 umfaßt.

11. Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-5 umfaßt, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Thrombosevorbeugung.

12. Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1-5 umfaßt, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung der Bindung von von Willebrand-Faktor an Faktor VIII.