DE3486453T2 - Monoklonale Antikörper gegen neue Faktor-VIII Gerinnungspolypeptide - Google Patents
Monoklonale Antikörper gegen neue Faktor-VIII GerinnungspolypeptideInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoclonalen Antikörper der IgG-Klasse, der von einem Hybridom produziert wird, das durch Fusion von Maus-Myelom-Zellen und Milzzellen einer vorher mit dem menschlichen Faktor VIII:C immunisierten Maus gebildet worden ist, wobei der Antikörper mit menschlichen Faktor-VIII:C-Polypeptiden reagiert. Die Erfindung läßt sich daher bei der Therapie der klassischen Hämophilie sowie der weiteren Untersuchung und Charakterisierung von Polypeptiden oder Polypeptid- Komplexen anwenden, die bei Blut vom Mensch und anderen Säugern die gewünschte Gerinnung auslösen.
- Es ist seit langem bekannt, daß der Plasmafaktor VIII eine entscheidende Rolle bei der Blutgerinnung spielt und daß Thrombin die Koagulationswirkung von Faktor VIII aktiviert. Aufgrund jüngster Versuche zur Charakterisierung von Faktor VIII hat man postuliert, daß Faktor VIII ein Komplex aus mindestens zwei Polypeptiden ist, die als VIII:C und VIII:R bekannt sind. Man hat festgestellt, daß die Koagulationsaktivität im VIII:C-Anteil lokalisiert ist. Untersuchungen zur Wirkung von Thrombin auf den Faktor VIII:C haben zu der Schlußfolgerung geführt, daß Thrombin diesen Faktor durch Spaltung in mehrere kleinere Polypeptide aktiviert. In früheren Untersuchungen konnte man die durch Thrombin induzierte Aktivierung von Faktor VIII im Menschen jedoch nicht mit definierten, aus dem menschlichen Faktor VIII:C gebildeten Polypeptiden in Verbindung bringen.
- Beispielsweise versuchten Hoyer und Trabold, in "The effect of thrombin on human factor VIII", J. Lab. Clin. Med., 97 (1981), 50-64, den menschlichen Faktor VIII:C mittels Immunadsorptions-Chromatographie unter Verwendung eines in Kaninchen produzierten polyclonalen Antiserums gegen Faktor VIII:R aufzureinigen. Sie inkubierten danach den Faktor VIII:C mit gereinigtem menschlichen α-Thrombin und stellten fest, daß kleine Thrombin-Mengen den Faktor VIII:C aktivierten, während größerer Mengen ihn weniger oder überhaupt nicht aktivierten. Sie kamen ferner zu dem Schluß, daß die Thrombin-Aktivierung von einer Verringerung der Proteingröße begleitet wird und nahmen für den aktivierten Faktor VIII:C ein Molekulargewicht von etwa 116 000 an. Bezeichnenderweise konnten sie keine spezifischen Polypeptide identifizieren, bei denen die Aktivität des Faktors VIII:C sowie VIII:C-Antigendeterminanten erhalten blieben.
- Fulcher, C. A. und Zimmerman, T.S., in "Characterization of the human factor VIII procoagulant protein with a heterologous precipitating antibody", Proc. Natl. Acad. of Sci. USA, 79 (1982), 1648-1652, gewannen hochgereinigten menschlichen Faktor VIII:C aus Plasmakonzentrat, indem sie das Konzentrat über eine Säule, die einen monoclonalen Antikörper gegen Faktor VIII:R enthielt, laufen ließen, VIII:C aus dem adsorbierten VIII:C/VIII:R-Komplex eluierten und den Faktor VIII:C auf einer zweiten Säule konzentrierten. Sowohl vor als auch nach Zugabe von Thrombin zum gereinigten Material wurde dann der gereinigte Faktor VIII:C mittels Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid- Gelelektrophorese (nachstehend "SDS-PAGE") untersucht. Bei der SDS-PAGE zeigte der gereinigte Faktor VIII:C vor Thrombin-Zugabe eine Reihe von Banden, die Polypeptiden verschiedenen Molekulargewichts (Mr) entsprachen und eine relativ starke Doppelbande mit einem Mr von 80 000 und 79 000 sowie mindestens sechs zusätzliche, schwach angefärbte Polypeptide mit größerem Mr einschließlich eines Polypeptids mit einem Mr von etwa 92 000 umfaßten. Die Zugabe von Thrombin zum gereinigten Faktor VIII:C verursachte eine Abnahme oder ein Verschwinden aller Polypeptide, die vor Thrombin-Zugabe zu sehen waren.
- Im Anschluß an die Thrombin-Zugabe erhöhte sich die Koagulationsaktivität des Plasmakonzentrats auf das maximal Dreifache der Aktivität, die das Material vor Thrombin-Zugabe zeigte, und nahm dann ab. Die Koagulationsaktivität des gereinigten Faktors VIII:C erhöhte sich ebenfalls auf das maximal Dreifache der Aktivität, die das Material vor Aktivierung zeigte. D.h., in jedem Fall übte Thrombin im wesentlichen die gleiche Aktivierungswirkung auf den Faktor VIII:C aus. Da der gereinigte Faktor VIII:C wie in der Veröffentlichung beschrieben eine spezifische Aktivität besitzt, die etwa das 3280fache der Aktivität des Ausgangsmaterials beträgt, kommt ein Fachmann somit zu dem Schluß, daß die Zunahme der spezifischen Aktivität auf den erreichten hohen Reinigungsgrad zurückzuführen ist. Es gibt in dieser Veröffentlichung keinen Anhaltspunkt dafür, die aktivierte Koagulationsaktivität einem spezifischen oder mehreren der zahlreichen Polypeptide zuzuschreiben, die im Zusammenhang mit den Banden stehen, die bei dem gereinigten Faktor VIII:C vor Thrombin-Aktivierung festgestellt wurden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoclonal Antikörper, der an den menschlichen Faktor VIII:C bindet und mit von menschlichem Faktor VIII:C stammenden Polypeptiden eines der folgenden Bindungsprofile zeigt:
- (A) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92 000, ≥ 108 000 und 44 000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 79 000 - 80000 zeigen, oder solche, die eine Doppelbande mit einem Mr von 71 000- 72 000 zeigen;
- (B) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92 000, ≥ 108 000 und 54 000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 79 000 - 80000 zeigen, oder solche, die eine Doppelbande mit einem Mr von 71 000- 72 000 zeigen;
- (C) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 79 000 - 80000 zeigen, und Polypeptide mit einem Mr von ≥ 108 000, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 44000, 54000 oder 92 000 zeigen, oder Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 71 000 - 72 000 zeigen;
- (D) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von ≥ 108 000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von weniger als 108 000 zeigen;
- wobei die Molekulargewichte dadurch bestimmt werden, daß man die Polypeptide einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterwirft.
- Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen biologische Präparate, die Antikörper mit unterschiedlichen Reaktionsprofilen enthalten, solche Antikörper sezernierenden Hybridome und eine Immunadsorbens-Säule, an die solche Antikörper binden.
- Sowohl Polypeptid-Koagulantien, die die Koagulationsaktivität und immunologischen Eigenschaften von Faktor VIII:C aufweisen und bei Untersuchung mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (einen) charakterististische(n) Mr-Wert(e) zeigen, als auch Präparate davon sowie charakteristische Eigenschaften davon sind in der Stamm- Patentanmeldung EP 84 10 3630.4 (EP-A 0 123 945) beschrieben.
- Bei dem Verfahren zur Herstellung des Koagulans kann der gewünschte Komplex auch konzentriert und/oder gewonnen werden, indem man das Reaktionsgemisch, das bereits mittels eines anderen Verfahrens konzentriert worden sein kann, über eine Immunadsorbens-Säule laufen läßt, die erfindungsgemäße Antikörper gegen menschlichen Faktor VIII: C oder äquivalente Antikörper gegen nichtmenschlichen VIII:C enthält, welche mit dem/den Polypeptid(en) des Komplexes reagieren. Die Antikörper sind an Agarose gebunden (vgl. Beispiel I, nachstehend). Verschiedene Antikörper, die zum Konzentrieren des Komplexes und/oder zur Isolierung bestimmter Polypeptide davon verwendet werden können, sind nachstehend beschrieben. Der aktive VIII:C-Komplex adsorbiert vorzugsweise an die Säule und wird danach von der Säule mit einer Calciumionen-Lösung (z.B. CaCl&sub2;) eluiert, die gegebenenfalls auch ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel enthalten kann. Geeignete nichtionische oberflächenaktive Mittel umfassen Alkylphenyl-polyoxyethylene, wie z.B. Triton-X-100 , -N-101 oder -X-405 (Eastman Chemical Co.), Tween-20 , -60 oder 80 (Sigma Chemical Co.) sowie Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co.), wobei alle diese Verbindungen wohlbekannte Handelsartikel mit bekannten chemischen Formeln sind.
- Die Menge der zu verwendenden Calciumionen und des oberflächenaktiven Mittels sollte ausreichend hoch sein, um den Polypeptid-Komplex zu desorbieren, jedoch nicht so hoch, daß das Elutionsmittel das Polypeptid inaktiviert. Eine Konzentration der Calciumionen bis zu 0,5 M oder sogar bis 1,0 M ist ausreichend, wobei 0,25 M bevorzugt sind. Eine Konzentration des oberflächenaktiven Mittels bis zu etwa 1 Gew.-% ist ausreichend, wobei etwa 0,1 Gew.-% bevorzugt ist. Pro Stunde werden etwa 1 bis etwa 8 Bettvolumina, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 4, des Elutionsmittels über die Immunadsorbens- Säule gegeben. Bei einer zu hohen Durchflußgeschwindigkeit riskiert man eine Störung der Säule und daß der Polypeptid-Komplex nicht adsorbiert. Der Fachmann kann diese Vorgaben ohne weiteres so modifizieren, daß er auch Immunadsorbens-Verfahren, die keine Festbett-Säulen umfassen, damit durchführen kann.
- Das vorliegende Beispiel zeigt, wie Faktor VIII:C aus einem handelsüblichen Konzentrat aufgereinigt und mit gereinigtem α-Thrombin gespalten wurde. Es wurde ein monoclonaler Antikörper gegen den Faktor VIII:C hergestellt und zur Identifizierung der VIII:C-Polypeptide verwendet. Während der Spaltung wurden zu verschiedenen ausgewählten Zeiten Teile des Spaltgemisches auf VIII:C (Koagulations)-Aktivität und unter Verwendung von SDS-PAGE auf Proteinbanden hin untersucht.
- Alle Schritte erfolgten bei Raumtemperatur. Die verwendeten Chemikalien waren analysenrein. 40 Flaschen eines im Handel erhältlichen VIII:C-Konzentrats (geliefert von Armour Pharmaceutical) wurden in 1000 ml VIII:C-Puffer (0,02 M Imidazol/0,15 M Natriumchlorid/0,1 M L-Lysin-HCl/0,02% Natriumazid, pH 6,8) zubereitet. Diese Probe, die insgesamt 17 000 Einheiten VIII:C-Aktivität enthielt, wurde auf eine Immunadsorbens- Säule mit einem Bettvolumen von 2,5 - 3 Liter aufgetragen. Die Säule enthielt Bromcyan-aktivierte Agarose (Sepharose 48, Pharmacia, Piscataway, New Jersey), an die monoclonale Antikörper gegen VIII:R kovalent gebunden worden waren. Die Herstellung und Bindung der Antikörper an die Säule erfolgte wie im vorstehend erwähnten US-Patent 4,361,509 beschrieben. Die Antikörper wurden aus Ascites-Flüssigkeit unter Verwendung von 50% Ammoniumsulfat präzipitiert, erneut zweimal präzipiert und danach in einer Dichte von 2 - 4 mg/ml Sepharose an die Säule gebunden. Das Immunadsorbens wurde mit 3 M Natriumthiocyanat voreluiert, mit VIII:C-Puffer (0,02 M Imidazol-HCl, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,1 M L-Lysin-HCl, 0,02% Natriumazid) gewaschen, zweimal mit 2 mM Diisopropylfluorphosphat behandelt und danach wurde das Konzentrat zugegeben.
- Die Säule wurde mit 20 Liter 0,15 M Natriumchlorid enthaltendem VIII:C- Puffer gewaschen und danach wurde VIII:C mit 0,35 M Calciumchlorid enthaltendem VIII:C-Puffer vom VIII:R eluiert. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und in einer Amicon-Zelle unter Rühren mit einer YM10-Membran unter Stickstoff-Druck 100fach konzentriert. Das Konzentrat wurde danach in VIII: C-Puffer 1:10 verdünnt und auf eine 4 ml-Aminohexyl-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 0,025 M Calciumchlorid enthaltendem VIII:C-Puffer äquilibriert worden war. VIII:C wurde in hoher Konzentration mit 0,3 M Calciumchlorid enthaltendem VIII:C-Puffer bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 10 ml/h eluiert. Die vereinigten konzentrierten Immunadsorbens-Fraktionen wurden auf 0,25 M Calciumchlorid eingestellt und zweimal jeweils 1 h an 1/10 Volumen (Vol./Vol.) eines Gemisches aus monoclonalen Antikörpern gegen Fibrinogen, Fibronectin und VWF adsorbiert, das an Bromcyan-aktivierte Sepharose gekoppelt war.
- Monoclonale Antikörper wurden wie in US-Patent 4,361,509 beschrieben unter Verwendung von gereinigtem VIII:C als Immunogen hergestellt. Die Antikörper wurden mittels eines Festphasen-Tests in Linbro-Titertek -Platten (Flow Laboratories, Inglewood, Kalifornien) und eines enzymgebundenen Immunadsorptions-Nachweissystems (ELISA), das in Engvall, E. und Perlman, P., "Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA), Quantitative assay of immunoglobulin G", Immunochemistry, 8 (1971), 871-874, beschrieben ist, unter Verwendung eines Peroxidase-Antikörper-Konjugats (Zymed Laboratories, Burlingame, Kalifornien) selektiert. Die Platten wurden mit 100 ng gereinigtem VIII:C pro Vertiefung beschichtet. Die Kulturüberstände der Clone, die sich im ELISA-Test als positiv erwiesen hatten und zur Verwendung in der vorliegenden Untersuchung ausgewählt worden waren, hemmten auch die Aktivität von Plasma-VIII:C.
- Gereinigtem VIII:C (Endkonzentration 167 µg/ml) wurde gereinigtes menschliches α-Thrombin (spezifische Aktivität 2534 E/mg, Endkonzentration 0,5 E/ml) in 0,04 M CaCl&sub2; enthaltendem Imidazol-Kochsalz- Puffer zugegeben. Einem Kontroll-Aliquot wurde nur Puffer zugesetzt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur inkubiert. In verschiedenen Abständen wurden Proben des VIII:C-Thrombin-Gemisches zur schnellen und irreversiblen Inaktivierung von Thrombin in p-APMSF (California Medicinal Chemistry Co.) enthaltende Teströhrchen gegeben. Um die p-APMSF-Hydrolyse auf ein Minimum zu reduzieren, wurde p-APMSF aus einer Stammlösung (100 mM in Methanol) 60 Sekunden vor der Umsetzung mit den VIII:C- Thrombin-Proben 1:10 in Imidazol-Kochsalz-Puffer verdünnt. Die Endkonzentration von p-APMSF betrug 1 mM. Das Kontroll-Aliquot wurde zu Beginn des Experimentes in gleicher Weise mit p-APMSF behandelt. Am Ende der 60-minütigen Zeitspanne wurden alle VIII:C-Proben unter Verwendung eines in der literatur beschriebenen, aktivierten partiellen Thromboplastin- Zeittests auf VIII:C-Aktivität hin untersucht und dann wie in der Stammanmeldung beschrieben, für die SDS-PAGE aufbereitet.
- Die spezifische Aktivität des gereinigten Faktors VIII:C betrug 2000 Einheiten/mg. Die Aktivierung der gereinigten VIII:C-Aktivität durch Thrombin wurde über einen Zeitraum von 60 Minuten untersucht. Vor der Thrombin-Behandlung zeigte die unbehandelte VIII:C-Probe die charakteristische Palette von VIII:C-Formen, die von einer Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 bis zu einer Bande mit Mr = 188 000 reichten. Eine Bande über Mr = 188 000 und zwei Banden unter Mr = 79 000 zeigten keine Bindung an das gegen VIII:C gerichtete monoclonale Antikörper-Immunadsorbens. Die Banden zwischen Mr = 79 000 und Mr = 188 000 banden an den gegen VIII:C gerichteten Antikörper.
- Während der ersten fünf Minuten des Thrombinaktivierungs-Zeitraums verschwanden nach und nach bis auf eine Bande alle Banden mit einem Mr größer als 92 000, die mit monoclonalen gegen VIII:C gerichteten Antikörpern reagierten, und waren nicht nachweisbar, wenn die VIII:C-Aktivität nach 5 Minuten ihren Peak erreichte.
- Eine Bande mit Mr = 122 000 zeigte sich nur in einigen Experimenten resistent gegen Thrombin. Nach ausgedehnter Thrombin-Behandlung reagierten jedoch weder diese Bande noch irgendeine andere Bande mit dem immobilisierten, gegen VIII:C gerichteten monoclonalen Antikörper.
- Die Intensität einer Bande mit Mr = 92 000 erhöhte sich mit wachsender VIII:C-Aktivität. Eine Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 schien in eine Doppelbande mit Mr = 71 000 - 72 000 umgewandelt zu sein, wobei die letztere Form zwischen der 5. und 60. Minute vorherrschte, während die VIII:C- Aktivität abnahm. Zwischen der 5. und 60. Minute wurden zwei Banden mit Mr = 54000 und Mr = 44 000 deutlich sichtbar. Die Bande mit Mr = 44 000 zeigte sich in einigen Experimenten auch als Doppelbande. Die Doppelbande mit Mr = 71 000 - 72 000, die Bande mit Mr = 54 000 und die Bande mit Mr = 44 000 wurden durch den immobilisierten monoclonalen Antikörper gegen VIII:C nicht signifikant entfernt.
- Das vorstehend diskutierte Scanning-Verfahren und die Auswertung des Gels ermöglichten es, Veränderungen in der Polypeptid-Konzentration mit Veränderungen der VIII:C-Aktivität zu korrelieren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle gezeigt. Wie ersichtlich, wurde die Bande mit Mr = 92 000 parallel zur VIII:C-Aktivität stärker und danach schwächer. Das deutet darauf hin, daß die Bande mit Mr = 92 000 eine aktive VIII:C-Form ist, deren Konzentration sich mit der Thrombin-Aktivierung erhöht. Die Banden mit Mr = 54 000 und Mr = 44 000 wurden zwischen der 1. und 40. Minute konstant stärker, selbst nachdem die Aktivität des Gemisches abnahm.
- Während der ersten 0,1 bis 10 Minuten, als die VIII:C-Aktivität ihr Maximum erreichte, verschwand der größte Teil der Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000, während sich in dieser Zeit der größte Teil der Doppelbande mit Mr = 71 000 - 72 000 zeigte und selbst dann noch vorherrschte, als die VIII:C-Aktivität abnahm. Diese Daten deuten darauf hin, daß die Doppelbande mit Mr = 71 000- 72 000 von der Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 stammt und daß das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 71 000 - 72 000 zeigt, allein nicht aktiv ist. Diese Daten stimmen damit überein, daß das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 71 000 - 72 000 zeigt, die Fähigkeit zur Komplexbildung mit dem Polypeptid mit Mr = 92 000 beibehält; dieser Komplex besitzt auch Aktivität.
- Ein direkter Beweis, daß das Polypeptid mit Mr = 92 000 einen Komplex mit dem Polypeptid bildet, das die Doppelbande mit Mr = 79 000-80 000 zeigt, stammt aus Experimenten, in denen das gegen VIII:C gerichtete monoclonale Immunadsorbens verwendet wurde. Es wurde zunächst gezeigt, daß der monoclonale Antikörper vorwiegend mit dem Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 zeigt, und nicht mit dem Polypeptid mit Mr = 92 000 reagiert. Das wurde durch elektrophoretische Übertragungsexperimente gezeigt. Danach wurde gezeigt, daß das monoclonale Antikörper- Immunadsorbens sowohl das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79 000- 80 000 zeigt, als auch das Polypeptid mit Mr = 92 000 aus der Lösung entfernt hatte. Das Polypeptid mit Mr = 92 000 konnte von der den gegen VIII:C gerichteten Antikörper enthaltenden Immunadsorbens-Säule mit 10 mM EDTA eluiert werden, während das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79 000- 80 000 zeigt, gebunden blieb. Das Polypeptid, das die Doppelbande zeigt, konnte anschließend mit 3 M Natriumthiocyanat eluiert werden. Diese Experimente zeigten, daß das Polypeptid mit Mr = 92 000 an das Immunadsorbens bindet, weil es mit dem Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 zeigt, einen Komplex bildet und daß es dieses Polypeptid ist, das direkt an das Immunadsorbens binden kann.
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, die auf eine nicht vorhersehbare Weise für verschiedene Polypeptide spezifisch sind, die durch die Reaktion von Faktor VIII:C mit einer Protease, wie z.B. α-Thrombin, gebildet werden. Jeder Antikörper reagiert mit menschlichem Faktor VIII:C, der weder aktiviert noch mit Thrombin oder äquivalenten Proteasen gespalten worden ist. Die Antikörper sind weiterhin wie folgt durch ihre individuellen Eigenschaften charakterisiert:
- (A) Ein Antikörper reagiert mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92 000 aufweist, mit Polypeptiden, die einen Mr-Wert = 108 000 oder größer aufweisen, sowie mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 44 000 aufweist und im Endprodukt der Thrombin-Spaltungen vorhanden ist. Er reagiert weder mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 79 000 - 80 000 zeigt, noch mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 71 000 - 72 000 zeigt.
- (B) Ein Antikörper reagiert mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92 000 aufweist, mit Polypeptiden, die einen Mr-Wert = 108 000 oder größer aufweisen, sowie mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 54 000 aufweist und im Endprodukt der Thrombin-Spaltungen vorhanden ist. Er reagiert weder mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 79 000 - 80 000 zeigt, noch mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 71 000 - 72 000 zeigt.
- (C) Ein Antikörper reagiert mit dem Polypeptid, das die Doppelbande von Mr = 79 000 - 80 000 zeigt, sowie mit Polypeptiden, die Mr-Wert = 108 000 und größer aufweisen, aber weder mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92 000 aufweist, noch mit Polypeptiden, die Mr-Werte = 71 000-72 000, Mr = 54000 oder Mr = 44000 aufweisen.
- (D) Ein Antikörper reagiert nur mit Polypeptiden, die Mr-Werte = 108 000 und größer aufweisen.
- Jeder dieser Antikörper kann verwendet werden, um den vorstehend beschriebenen Komplex aus Gemischen, die auch andere Polypeptide enthalten, zu konzentrieren. Ein solches Gemisch wird durch partielle Spaltung von menschlichem Faktor VIII:C mit α-Thrombin oder einer äquivalenten Protease hergestellt. Ein weiteres derartiges Gemisch wird mit Hilfe von DNA- Rekombinationsverfahren hergestellt, wobei ein gewünschtes Polypeptid oder ein Komplex in einem Mikroorganismus exprimiert wird und aus einem Gemisch mit anderen Protein-Verbindungen gewonnen werden muß. Der Antikörper (A), (B), (C) oder (D) oder eine Kombination aus zwei, drei oder allen Antikörpern kann in der in Beispiel I beschriebenen Weise an eine Immunadsorbens-Säule gebunden werden. Über die Säule wird eine Ausgangslösung des Gemisches gegeben, die das/die Polypeptid(e) enthält, die den Komplex umfassen. Die in der Ausgangslösung vorhandenen Polypeptide mit Mr-Werten von 92 000, 79000 - 80000 und 71 000 - 72000 adsorbieren an die Säule, von der sie, wie vorstehend gelehrt, eluiert werden können, nachdem die Ausgangslösung durch die Säule gelaufen ist. Der gewünschte aktivierte VIII:C- Komplex wird dadurch in der erhaltenen eluierten Lösung im Vergleich zur Ausgangslösung konzentriert.
- Die neuen Antikörper lassen sich auch für analytische Zwecke verwenden, beispielsweise zum Nachweis der Reaktion von menschlichem VIII:C mit Thrombin oder anderen Proteasen, da sie mit Produkten dieser Umsetzung reagieren können. Es ist festgestellt worden, daß ein Antikörper mit dem Profil (B) und ein Antikörper mit dem Profil (C) die Koagulationsaktivität von VIII:C aufheben können, wenn einer von beiden an den Faktor VIII:C gebunden ist. Diese zusätzliche Eigenschaft kann bei der Diagnose von Krankheiten, die mit Hämophilie verwandt sind, nützlich sein.
- Die Entdeckung dieser Antikörper erlaubt auch eine weitere Charakterisierung der Bestandteile des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid-Komplexes. Die Polypeptide, die eine Bande mit Mr = 92 000 zeigen, enthalten daher (mindestens) zwei Epitope (d.h. Antikörper- Bindungsstellen), die durch Thrombin-Spaltung nicht zerstört werden und auf Polypeptiden nicht vorhanden sind, die entweder die Doppelbande mit Mr = 79 000-80000 oder die Doppelbande mit Mr = 71 000-72 000 zeigen. Eines dieser Epitope ist auch auf dem Polypeptid mit Mr = 44 000 vorhanden und das andere auf dem Polypeptid mit Mr = 54 000. Die Polypeptide mit Nir = 44 000 sowie Mr = 54 000 stammen daher vom Polypeptid mit Mr = 92 000 ab. Die Polypeptide mit Mr = 92 000 und Mr = 79 000 - 80 000 stammen ebenfalls von (einem) gemeinsamen Vorläufer(n) ab. Die Entdeckung der Antikörper mit Profil (B) und Profil (C), von denen jeder die Koagulationsaktivität von Faktor VIII:C aufhebt, erhärtet weiterhin die Bedeutung der Polypeptide mit Mr = 92 000 und Mr = 79 000 - 80 000 für die Koagulationsfunktion. Das Polypeptid, das eine Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 zeigt, enthält ein Epitop, das durch Thrombin-Spaltung zerstört wird und nicht auf dem Polypeptid mit Mr = 92 000 vorhanden ist.
- Diese monoclonalen Antikörper können hergestellt werden, indem man die allgemeinen Reinigungsschritte für den menschlichen Faktor VIII:C durchführt; monoclonale Antikörper gegen gereinigten VIII:C-Faktor herstellt; zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Polypeptid-Komplexes einschließlich des Nachweises der spezifischen Polypeptide gereinigten VIII:C- Faktor partiell spaltet und aktiviert; die gegen VIII:C gerichteten Antikörper mit den Aktivierungsprodukten reagieren läßt; und einen Antikörper durch Nachweis des/der Polypeptids/Polypeptide, mit dem er reagiert, charakterisiert. Diese Reihenfolge ist nachstehend in Beispiel II genauer dargelegt. In einer anderen Ausführungsform kann man einen Antikörper herstellen, indem man aus den Produkten der partiellen Thrombin-Spaltung ein bestimmtes Polypeptid von Interesse isoliert, beispielsweise durch Immunadsorption an einer Säule und Elution von dieser Säule, wobei diese Agarose enthält, an die ein monoclonaler Antikörper gekoppelt ist, von dem bekannt ist, daß er mit dem Polypeptid von Interesse reagiert, und dann unter Verwendung des in Beispiel II beschriebenen Verfahrens einen monoclonalen Antikörper gegen dieses Polypeptid erzeugt.
- Unter Verwendung des folgenden Verfahrens wurden monoclonale Antikörper gegen menschlichen Faktor VIII:C hergestellt, wobei der Ausgangspunkt hochgereinigtes VIII:C war, das mit Hilfe des Verfahren des US- Patents 4,361,509 hergestellt worden war.
- Mäusen wurde entsprechend dem folgenden Verfahren hochgereinigter Faktor VIII:C injiziert. Am Tag Null wurde den Mäusen ein Mittel intraperitoneal injiziert, das durch Lösung (oder Suspension) von 10 µg Protein in 0,1 ml Puffer, der 0,05 M Tris, 0,15 M Natriumchlorid, 0,02% Natriumazid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 Einheiten Trasylol/ml enthielt und einen pH-Wert von 7,3 aufwies, und durch Schütteln mit einer gleichen Menge an komplettem Freundschem Adjuvans hergestellt worden war. Am 14. Tag wurde den Mäusen das gleiche Mittel injiziert, wobei allerdings das komplette Freundsche Adjuvans durch inkomplettes Freundsches Adjuvans ersetzt wurde. Am 21. Tag wurde die Injektion vom 14. Tag wiederholt. Am 38. Tag wurde den Mäusen nur gereinigter VIII:C-Faktor injiziert. Am 42. Tag wurde den Mäusen die Milz entfernt und entsprechend einem in J. P. Brown et al., "Protein Antigens of Normal and Malignant Human Cells Identified by Immunoprecipitation with Monoclonal Antibodies", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Bd. 225 (1980), S.4980-4983, beschriebenen Standard-Verfahren fusioniert. Dieses Standardverfahren wurde nur insofern verändert, als 50% Polyethylenglykol durch 35% Polyethylenglykol 1000 ersetzt wurden.
- Die Antikörper wurden unter Verwendung des Testverfahrens selektiert, das vorstehend in Beispiel I im Absatz unter der Überschrift "Herstellung eines monoclonalen Antikörpers gegen VIII:C" beschrieben ist, wobei allerdings auch Antikörper, die die VIII:C-Aktivität nicht aufhoben, subcloniert und wie nachstehend beschrieben behandelt wurden.
- Clone, die sich als positiv erwiesen, wurden zweimal subcloniert. Clone, die Antikörper gegen VIII:C konstant produzierten, wurden danach in die Bauchfellhöhle von Balb/C-Mäusen injiziert, die mindestens vier Tage vor Injektion der Zellen mit 0,5 ml Pristan intraperitoneal vorbehandelt worden waren. In 0,5 ml des nach Dulbecco modifizierten Eagle-Mediums ohne foetales Rinderserum wurden Hybridomzellen in Konzentrationen von etwa 5 x 10&sup6; Zellen pro Maus injiziert. Nach Eintreten der Schwellung wurden die Mäuse punktiert. Ascitesflüssigkeit wurde in Heparin in einer Konzentration von etwa 10 Einheiten/ml gesammelt. Zur Bereitstellung einer zweckmäßigen Menge für die anschließende Isolierung von monoclonalem IgG wurde die von mehreren Mäusen stammende Ascitesflüssigkeit vereinigt. Aus der Ascitesflüssigkeit wurden die Antikörper unter Verwendung von 50%-igem Ammoniumsulfat präzipitiert und anschließend zweimal erneut präzipitiert. Die so erzeugten, (B), (C) und (D) entsprechenden Antikörper gegen VIII:C wurden an Agarose- Perlen gebunden und es zeigte sich, daß sie gereinigtes VIII:C aus Lösungen binden.
- Separate VIII:C-Ansätze, wobei ein Ansatz unbehandelt war und der andere einer Thrombin-Proteolyse unterworfen worden war, wurden danach mittels der in der Stammanmeldung beschriebenen SDS-PAGE-Schritte untersucht. Dann wurde jede Bande elektrophoretisch vom Gel auf ein Nitrocellulose-Filter übertragen (Westem-Übertragungen). Die verwendete Apparatur bestand aus einer Bio-Rad-"Trans-Blot"-Zelle und einem Bio-Rad-Stromversorgungsgerät, Modell 160.1.6. (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien). Der Übertragungspuffer enthielt 25 mM Tris sowie Glycin, das bis zu einem pH-Wert von 8,3 zugegeben worden war, und 20% Methanol. Die Übertragungen wurden 16 - 24 Stunden bei 90 Volt und 100 Milliampere durchgeführt.
- Die spezifischen Polypeptide, mit denen jeder der Antikörper reagierte, wurden unter Verwendung eines Verfahrens bestimmt, das dem von W.M. Burnette in "Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibodies and Radioiodinated Protein A", Analytical Biochemistry, Bd. 112 (1981), S. 195-203, beschriebenen angepaßt worden war.
- "Puffer D" bestand aus 10 mM Tris-chlorid, 0,15 M NaCl, 0,02% Natriumazid, pH-Wert 7,4. Mle Umsetzungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
- 1. Der Nitrocellulose-Filter mit den übertragenen Proteinen wurde in eine Schale gegeben, die 100 ml Puffer D und 0,25% Gelatine enthielt. Die Schale wurde auf einen Rotations-Schüttler gegeben und langsam 30 Minuten geschüttelt.
- 2. Danach wurde der monoclonale Antikörper in die Schale gegeben (entweder 0,1% - 1% Ascitesflüssigkeit oder 1 mg gereinigtes IgG). Es wurde 120 Minuten geschüttelt.
- 3. Der Nitrocellulose-Filter wurde wie folgt gewaschen:
- (a) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
- (b) 30 Minuten mit 100 ml Puffer D und 0,05% Nonidet-P-40 mit Pufferwechsel nach 10 und 20 Minuten.
- (c) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
- 4. Der Nitrocellulose-Filter wurde in Puffer D plus 0,25% Gelatine und J¹²&sup5;- markiertem, gereinigtem, gegen Maus-IgG gerichtetem Kaninchen-IgG 30 Minuten getränkt.
- 5. Der Nitrocellulose-Filter wurde wie folgt gewaschen:
- (a) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
- (b) 16 - 24 Stunden mit 100 ml Puffer D plus 0,1% Nonidet-P-40 und 0,5 M NaCl.
- (c) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
- 6. Der Nitrocellulose-Filter wurde zwischen zwei Filterpapier-Bögen getrocknet und danach wurde der Nitrocellulose-Filter in einem verschweißten Plastikbeutel aufbewahrt.
- 7. Zur Bestimmung, welche Antikörper und Polypeptide reagiert haben,
- (a) wurde ein Autoradiogramm des Nitrocellulose-Filters unter Verwendung von Verfahren, die in der Literatur bekannt sind, hergestellt,
- (b) das Autoradiogramm wurde mit einem Nitrocellulose-Filter verglichen, auf den VIII:C übertragen worden war, der jedoch mit Coomassie-Blau R250 angefärbt und nicht mit einem monoclonalen Antikörper umgesetzt worden war.
- Durch diese Schritte wurde gezeigt, daß die folgenden unterschiedlichen Antikörper produziert worden waren.
- Vier Antikörper reagierten mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92 000 aufwies, den Polypeptiden, die Mr-Werte von 108 000 und größer aufwiesen, sowie einem der beiden Polypeptide, die einen Mr-Wert = 54 000 oder 44 000 besaßen, die in den Endprodukten der Thrombin-Spaltung vorhanden sind, aber mit keinen anderen Polypeptiden. Das zeigt, daß die beiden letzteren Polypeptide aus der Thrombin-Spaltung des Polypeptids mit Mr = 92 000 hervorgegangen sind. Es zeigt auch, daß auf dem Polypeptid mit Mr = 92 000 zwei Epitope diese Spaltung unbeschadet überstehen und daß diese Epitope nicht auf dem Polypeptid vorhanden sind, das die Doppelbande mit Mr = 79 000- 80000 zeigt.
- Ein fünfter Antikörper reagierte mit dem Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr-Werten = 79 000 - 80 000 zeigte, sowie mit den Polypeptiden, die Mr- Werte von 108 000 und größer besaßen, jedoch weder mit dem Polypeptid mit einem Mr = 92 000 noch mit einem der Polypeptide, die in Endprodukten der Thrombin-Spaltung vorhanden sind. Das zeigt, daß das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000 aufweist, ein Epitop besitzt, das nicht auf dem Polypeptid mit Mr = 92 000 vorhanden ist, und daß dieses Epitop durch Thrombin-Spaltung des Polypeptids, das die Doppelbande mit Mr = 79 000- 80 000 aufweist, zerstört wird.
- Die Reaktionsprofile dieser fünf Antikörper zeigen, daß die Polypeptide mit Mr = 92 000 und Mr = 79 000 - 80 000 von (einem) gemeinsamen Vorläufer(n) abstammen.
- Ein sechster Antikörper reagierte nur mit den Polypeptiden, die Mr-Werte = 108 000 und größer besaßen. Da er mit keinem der Polypeptide reagierte, die in den Endprodukten der Thrombin-Spaltung vorhanden sind, wird das Epitop, mit dem dieser Antikörper reagierte, durch Thrombin-Spaltung zerstört.
- Zur Herstellung und Aufbewahrung eines biologischen Präparats aus einem oder mehreren dieser Antikörper kann das entsprechende monoclonale IgG aus der vereinigten, mit Heparin behandelten Ascitesfiüssigkeit sofort nach deren Gewinnung isoliert werden. Man kann dazu auch eine eingefrorene Portion der aufbewahrten Lösung auftauen. Unabhängig davon, ob frisches oder eingefrorenes Material verwendet wird, bringt man die Lösung auf 4ºC und behandelt sie mit einer gleichen Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (PBS: 1,6 g Natriumphosphat, einbasisches Monohydrat; 8,4 g Natriumphosphat, dibasisch, wasserfrei; 61,4 g Natriumchlorid, mit Wasser auf 7 Liter aufgefüllt; pH = 7,2). Die verdünnte Ascitesflüssigkeit wird präzipitiert, indem sie bei 4ºC tropfenweise unter Rühren zugegeben wird. Zentrifugationen werden vorzugsweise 60 Minuten bei 14 000 Upm (30 000 x g) durchgeführt. Die Überstandslösung der Ascitesflüssigkeit wird noch zweimal mit SAS präzipitiert. Das Gemisch aus Präzipitat und Überstandsflüssigkeit wird gerührt und in gleicher Weise wie im ersten Zyklus zentrifugiert. Die aus der dritten Präzipitation erhaltenen Pellets werden in PBS in gleicher Menge wie die der verdünnten Ascitesflüssigkeit resuspendiert und dann ausgiebig gegen PBS dialysiert. In den Dialyseschläuchen erscheinende Klümpchen werden durch Zentrifugation bei 20ºC entfernt. Das dialysierte IgG wird durch Rühren mit einer 5%-igen wäßrigen Aluminiumhydroxid-Lösung bei Raumtemperatur adsorbiert und nach Adsorption bei 20ºC zentrifugiert. Die Adsorptionsbehandlung wird mindestens dreimal wiederholt, wobei nach der ersten Behandlung für jede folgende eine 2,5 %-ige Aluminiumhydroxid-Lösung verwendet wird. Das adsorbierte IgG wird auf 4ºC gekühlt und wie vorstehend beschrieben noch einmal mit SAS präzipitiert. Die präzipitierten Pellets können bis zur Verwendung bei -20ºC aufbewahrt werden.
- Zwei bevorzugte Verfahren zur Aufreinigung der monoclonalen Antikörper und zur Aufbewahrung von biologischen Präparaten, die diese enthalten, sind in der Veröffentlichung von P. L. Ey et al., "Isolation of Pure IgG&sub1;, IgG2a, and IgG2b Immunoglobulins from Mouse Serum Using Protein A- Sepharose", Immunochemistry, Bd. 15, S.429-436, sowie in der Arbeit von C. Bruck et al., "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid by DEAE Affi-Gel Blue Chromatography", J. Immunological Methods, Bd. 53( 1982), 313-319, beschrieben.
Claims (14)
1. Monoclonaler Antikörper, der an menschlichen Faktor
VIII:C bindet und eines der folgenden Bindungsprofile
mit Polypeptiden zeigt, die von menschlichem Faktor
VIII:C stammen:
(A) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende
Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92 000, ≥
108 000 und 44 000 aufweisen, aber keine Bindung an
von menschlichem Faktor VIII:C stammende
Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr 79 000 - 80 000
zeigen, oder an solche, die eine Doppelbande mit Mr
= 71 000 - 72 000 zeigen;
(B) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende
Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92 000,
≥ 108 000 und 54 000 aufweisen, aber keine Bindung
an von menschlichem Faktor VIII:C stammende
Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr = 79 000 - 80 000
zeigen, oder an solche, die eine Doppelbande mit Mr
= 71 000 - 72 000 zeigen;
(C) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende
Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr = 79
000- 80 000 zeigen, und an Polypeptide mit einem
Molekulargewicht von ≥ 108 000, aber keine Bindung an von
menschlichem Faktor VIII:C stammende Polypeptide,
die ein Molekulargewicht von 44 000, 54 000 oder
92 000 aufweisen, und an Polypeptide, die eine
Doppelbande mit Mr = 71 000 - 72 000 zeigen;
(D) Bindung an von menschlichem Faktor VIII:C stammende
Polypeptide, die ein Molekulargewicht von ≥ 108 000
aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem
Faktor VIII:C stammende Polypeptide, die ein
Molekulargewicht von weniger als 108 000 aufweisen,
wobei die Molekulargewichte dadurch bestimmt werden, daß
man die Polypeptide einer SDS-PAGE unter reduzierenden
Bedingungen unterwirft.
2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 11 wobei der
Antikörper erhältlich ist von einem Hybridom, das durch
Fusion von Mausmyelomzellen und Milzzellen von einer Maus
erzeugt wird, die vorher mit menschlichem Faktor VIII:C
immunisiert wurde, und wobei der Antikörper zur IgG-
Klasse gehort.
3. Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder
2 mit dem darin angegebenen Bindungsprofil (B) oder (C),
weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß er die
Koagulationsaktivität von menschlichem Faktor VIII:C
neutralisiert, wenn der Faktor VIII:C an den Antikörper gebunden
ist.
4. Biologisches Präparat, umfassend einen Antikörper, der
folgende Eigenschaften besitzt:
(a) Bindungsprofil A nach Anspruch 1, im wesentlichen
frei von Antikörpern, die die anderen drei
Bindungsprofile zeigen, oder
(b) Bindungsprofil B nach Anspruch 1, im wesentlichen
frei von Antikörpern, die die anderen drei
Bindungsprofile zeigen, oder
(c) Bindungsprofil C nach Anspruch 1, im wesentlichen
frei von Antikörpern, die die anderen drei
Bindungsprofile zeigen, oder
(d) Bindungsprofil D nach Anspruch 1, im wesentlichen
frei von Antikörpern, die die anderen drei
Bindungsprofile zeigen.
5. Biologisches Präparat, umfassend ein Gemisch von
Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 oder 2, die
Bindungsprofile A und B zeigen, im wesentlichen frei von
Antikörpern
nach Anspruch 1 oder 2, die Bindungsprofile C
und D zeigen.
6. Biologisches Präparat, umfassend ein Gemisch von
Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 oder 2, die
Bindungsprofile A, B und C zeigen, im wesentlichen frei von
Antikörpern nach Anspruch 1 oder 2, die Bindungsprofil D
zeigen.
7. Hybridom, das einen monoclonalen Antikörper nach
Anspruch 1(A) sezerniert.
8. Hybridom, das einen monoclonal Antikörper nach
Anspruch 1(B) sezerniert.
9. Hybridom, das einen monoclonal Antikörper nach
Anspruch 1(C) sezerniert.
10. Hybridom, das einen monoclonal Antikörper nach
Anspruch 1(D) sezerniert.
11. Monoclonaler Antikörper gegen menschlichen Faktor
VIII:C, erzeugt als Antwort auf eine Immunisierung mit
einer Faktor VIII:C Protein-Zusammensetzung, enthaltend
ein Faktor VIII:C Protein, das eine Doppelbande mit Mr =
79 000-80 000 zeigt, im Komplex mit einem 92
000-Protein, wobei die Zusammensetzung eine biologische
Aktivität von Faktor VIII:C aufweist, und wobei der Antikörper
spezifisch an mindestens ein aus der Zusammensetzung
stammendes Polypeptid bindet.
12. Monoclonale Antikörper, die als Antwort auf ein
Immunogen erzeugt werden und spezifisch an das Immunogen
binden, wobei das Immunogen aus einer
Proteinzusammensetzung besteht, die im wesentlichen frei von anderen
Proteinen ist und aus einem Komplex eines Proteins, das
eine Doppelbande von Mr = 79 000 bis 80 000 zeigt, und
eines Proteins mit Mr = 92 000 besteht, wobei das der
Doppelbande entsprechende Protein und das Protein mit
dem Molekulargewicht 92 000 durch ein Mittel komplexiert
sind, das empfindlich gegenüber Chelatierung durch EDTA
ist, wobei der Komplex eine biologische Aktivität des
Faktor VIII:C zeigt.
13. Immunoadsorbens-Säule, umfassend Teilchen eines festen,
immunologisch inerten Adsorbensmaterials, an das ein
Antikörper gebunden ist, der die Profile (A), (B), (C)
oder (D) nach Anspruch 1 oder 2 zeigt.
14. Säule nach Anspruch 13, wobei das Adsorbensmaterial
Agarose ist.
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