DE3486423T3

DE3486423T3 - Neue Faktor VIII Polypeptidkoagulantien

Info

Publication number: DE3486423T3
Application number: DE3486423T
Authority: DE
Inventors: Carol A. Fulcher; Theodore S. Zimmerman
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1983-03-31
Filing date: 1984-04-02
Publication date: 2001-02-08
Anticipated expiration: 2004-04-03
Also published as: ATE155490T1; IE840788L; IE960783L; DK174984A; DK174984D0; DE3486453D1; DE3486453T2; SG49675A1; EP0770396A2; ATE135400T1; EP0561427A1; AU572128B2; NO167533C; AU2627284A; CA1341506C; FI841281A0; NO167533B; IE80638B1; JPH0829089B2; IE80858B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Faktor VIII-Polypeptide, d. h. Proteine, die Koagulationsaktivität zeigen. Die Erfindung läßt sich daher bei der Therapie der klassischen Hämophilie sowie der weiteren Untersuchung und Charakterisierung von Polypeptiden oder Polypeptid-Komplexen anwenden, die bei Blut vom Mensch und anderen Säugern die gewünschte Gerinnung auslösen.
Es ist seit langem bekannt, daß der Plasmafaktor VIII eine entscheidende Rolle bei der Blutgerinnung spielt und daß Thrombin die Koagulationswirkung von Faktor VIII aktiviert. Aufgrund jüngster Versuche zur Charakterisierung von Faktor VIII hat man postuliert, daß Faktor VIII ein Komplex aus mindestens zwei Polypeptiden ist, die als VIII : C und VIII : R bekannt sind. Man hat festgestellt, daß die Koagulationsaktivität im VIII : C-Anteil lokalisiert ist. Untersuchungen zur Wirkung von Thrombin auf den Faktor VIII : C haben zu der Schlußfolgerung geführt, daß Thrombin diesen Faktor durch Spaltung in mehrere kleinere Polypeptide aktiviert. In früheren Untersuchungen konnte man die durch Thrombin induzierte Aktivierung von Faktor VIII im Menschen jedoch nicht mit definierten, aus dem menschlichen Faktor VIII : C gebildeten Polypeptiden in Verbindung bringen.
Beispielsweise versuchten Hoyer und Trabold, in "The effect of thrombin on human factor VIII", I. Lab. Clin. Med., 97 (1981), 50-64, den menschlichen Faktor VIII : C mittels Immunadsorptions-Chromatographie unter Verwendung eines in Kaninchen produzierten polyclonalen Antiserums gegen Faktor VIII : R aufzureinigen. Sie inkubierten danach den Faktor VIII : C mit gereinigtem menschlichen α-Thrombin und stellten fest, daß kleine Thrombin-Mengen den Faktor VIII : C aktivierten, während größerer Mengen ihn weniger oder überhaupt nicht aktivierten. Sie kamen ferner zu dem Schluß, daß die Thrombin-Aktivierung von einer Verringerung der Proteingröße begleitet wird und nahmen für den aktivierten Faktor VIII : C ein Molekulargewicht von etwa 116000 an. Bezeichnenderweise konnten sie keine spezifischen Polypeptide identifizieren, bei denen die Aktivität des Faktors VIII : C sowie VIII : C-Antigendeterminanten erhalten blieben.
Fulcher, C. A. und Zimmerman, T. S., in "Characterization of the human factor VIII procoagulant protein with a heterologous precipitating antibody", Proc. Natl. Acad. of Sci. USA. 79 (1982), 1648-1652, gewannen hochgereinigten menschlichen Faktor VIII : C aus Plasmakonzentrat, indem sie das Konzentrat über eine Säule, die einen monoclonalen Antikörper gegen Faktor VIII : R enthielt, laufen ließen, VIII : C aus dem adsorbierten VIII : C/VIII : R-Komplex eluierten und den Faktor VIII : C auf einer zweiten Säule konzentrierten. Sowohl vor als auch nach Zugabe von Thrombin zum gereinigten Material wurde dann der gereinigte Faktor VIII : C mittels Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid- Gelelektrophorese (nachstehend "SDS-PAGE") untersucht. Bei der SDS-PAGE zeigte der gereinigte Faktor VIII : C vor Thrombin-Zugabe eine Reihe von Banden, die Polypeptiden verschiedenen Molekulargewichts (Mr) entsprachen und eine relativ starke Doppelbande mit einem Mr von 80000 und 79000 sowie mindestens sechs zusätzliche, schwach angefärbte Polypeptide mit größerem Mr einschließlich eines Polypeptids mit einem Mr von etwa 92000 umfaßten. Die Zugabe von Thrombin zum gereinigten Faktor VIII : C verursachte eine Abnahme oder ein Verschwinden aller Polypeptide, die vor Thrombin-Zugabe zu sehen waren.
Im Anschluß an die Thrombin-Zugabe erhöhte sich die Koagulationsaktivität des Plasmakonzentrats auf das maximal Dreifache der Aktivität, die das Material vor Thrornbin-Zugabe zeigte, und nahm dann ab. Die Koagulationsaktivität des gereinigten Faktors VIII : C erhöhte sich ebenfalls auf das maximal Dreifache der Aktivität, die das Material vor Aktivierung zeigte. D. h., in jedem Fall übte Thrombin im wesentlichen die gleiche Aktivierungswirkung auf den Faktor VIII : C aus. Da der gereinigte Faktor VIII : C wie in der Veröffentlichung beschrieben eine spezifische Aktivität besitzt, die etwa das 3280fache der Aktivität des Ausgangsmaterials beträgt, kommt ein Fachmann somit zu dem Schluß, daß die Zunahme der spezifischen Aktivität auf den erreichten hohen Reinigungsgrad zurückzuführen ist. Es gibt in dieser Veröffentlichung keinen Anhaltspunkt dafür, die aktivierte Koagulationsaktivität einem spezifischen oder mehreren der zahlreichen Polypeptide zuzuschreiben, die im Zusammenhang mit den Banden stehen; die bei dem gereinigten Faktor VIII : C vor Thrombin-Aktivierung festgestellt wurden.
Die vorliegende, Erfindung betrifft ein Faktor VIII : C-Koagulans, im wesentlichen bestehend aus:
(a) einem Komplex aus einem Polypeptid mit Mr = 92000 und einem Polypeptid mit Mr = 79000-80000; oder
(b) einem Komplex aus einem Polypeptid mit Mr = 92000 und einem Polypeptid mit Mr = 71000-72000; oder
(c) einer Kombination der Komplexe (a) und (b).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Herstellung des Koagulans oder eines konzentrierten Präparats davon durch Spaltung des menschlichen Faktors VIII : C mit α-Thrombin, Abbruch der. Spaltung in Gegenwart des vorstehend beschriebenen Koagulans und Gewinnung des -Koagulans. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von VIII : C-Polypeptiden ohne Verlust der Koagulationsaktivität von einem Immunadsorbens, das monoclonale Antikörper gegen Faktor VIII : C enthält.
Der monoclonale Antikörper, der zur Gewinnung des Koagulans der Erfindung verwendet werden kann, bindet an den menschlichen Faktor VIII : C und zeigt mit Polypeptiden, die vom menschlichen Faktor VIII : C abstammen, eines der folgenden Bindungsprofile:
(A) Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92000, 108000 und 44000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 79000-80000 zeigen, oder solche, die eine Doppelbande mit einem Mr von 71000- 72000 zeigen;
(B) Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92000, 108000 und 54000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 79000-80000 zeigen, oder solche, die eine Doppelbande mit einem Mr von 71000- 72000 zeigen;
(C) Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 79000-80000 zeigen, und Polypeptide mit einem Mr von z 108000, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 44000, 54000 oder 92000 zeigen, oder Polypeptide, die eine Doppelbande mit einem Mr von 71000-72000 zeigen;
(D) Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von ≥ 108000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von weniger als 108000 zeigen;
wobei die Molekulargewichte dadurch bestimmt werden, daß man die Polypeptide einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterwirft.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung Polypeptidkoagulantien, die die Koagulationsaktivität sowie die immunologischen Eigenschaften von Faktor VIII : C zeigen und bei Analyse mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (nachstehend "SDS-PAGE") charakteristische Mr-Werte aufweisen. Nachstehend bedeutet "Polypeptid-Komplex" ein Koagulans, das Kombinationen aus zwei oder mehreren Polypeptiden umfaßt, von denen bekannt ist, daß sie physikalisch verschieden sind.
Die nachstehende Beschreibung zeigt die Herstellung des Koagulans, bei der hochgereinigter menschlicher Faktor VIII : C verwendet wird, um eine von Fremd-Polypeptiden nicht beeinträchtigte Identifizierung und Charakterisierung des neuen Produkts zu ermöglichen. Die Erfindung selbst hängt jedoch nicht davon ab, wie das Ausgangsmaterial zuvor behandelt worden ist, außer wenn dies ausdrücklich angegeben ist. Die erfindungsgemäßen aktiven Faktor VIII : C-Polypeptide können nicht nur wie nachstehend genauer beschrieben durch Spaltung mit Thrombin oder mit anderen ähnlich wirkenden Proteasen, wie z. B. Faktor Xa, Faktor IXa oder Russel-Schlangengift-V, hergestellt werden, sondern auch mit Hilfe von DNA- Rekombinationstechniken, wobei die interessierenden Polypeptide von Bakterien, Hefe oder anderen Zellen produziert werden, in die ein oder mehrere Gen(e) mittels dem Fachmann bekannter Verfahren zur Erzeugung der Polypeptide, die von Interesse sind, insertiert sind. Es ist zu erwarten, daß bei beiden Verfahren zur Herstellung des interessierenden Komplexes dieser im Gemisch mit einem oder mehreren anderen Polypeptiden produziert wird.
Jedes Plasma oder Plasmakonzentrat, das menschlichen Faktor VIII : C enthält, kann mit Erfolg eingesetzt werden. Das neue Koagulans kann aus menschlichem Faktor VIII : C hergestellt werden, der entsprechend dem Verfahren, das in dem am 30. November 1982 erteilten US-Patent 4,361,509 beschrieben ist, hochgereinigt worden ist. Bei diesem Verfahren läßt man ein Ausgangsmaterial von Faktor VIII : C, wie z. B. Plasma oder ein Plasmakonzentrat, über eine Immunadsorbens-Säule laufen, an die monoclonale Antikörper gegen Faktor VIII : R gebunden sind. Der Faktor VIII : R/VIII : C-Komplex wird an die Säule adsorbiert. Danach eluiert man den Faktor VIII : C und läßt ihn über eine zweite Säule, wie z. B. Aminohexyl-Agarose, laufen, wobei die zweite Säule auch ein Immunadsorbens sein kann, das Antikörper gegen Faktor VIII : C enthält. Der Faktor VIII : C sollte weder α-Thrombin noch andere Proteasen enthalten. Der Faktor VIII : C wird zweckmäßigerweise in einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung, die z. B. 0,3 M Calciumchlorid enthält, bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,4 aufbewahrt.
Menschlicher Faktor VIII : C wird dann mit α-Thrombin unter Bedingungen gespalten, die die Bildung des nachstehend beschriebenen Polypeptid- Komplexes bewirken. Gereinigtes a-Thrombin kann mit Hilfe des von Fenton, J. W. II, Fasco, M. J., Stackrow, A. B., Aronson, D. L, Young, A. M. und Finlayson, I. S., "Human Thrombin. Production, Evaluation, and Properties of a-Thrombin", L Biol. Chem., 252 (1977), 3587-3598, beschriebenen Verfahrens hergestellt werden.
α-Thrombin und Faktor VIII : C werden in einem wäßrigen System kombiniert, das vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,4 gepuffert ist. Im Vergleich zu Faktor VIII : C sollte Thrombin in einer Menge vorliegen, die zur Umsetzung mit Faktor VIII : C ausreicht, aber nicht so hoch ist, daß Faktor VIII : C zu inaktiven Polypeptiden abgebaut wird, bevor der gewünschte aktive Polypeptid-Komplex gewonnen werden kann. Beispielsweise sollte ein Präparat, das 200-400 Einheiten Faktor VIII : C pro ml (0,2 mg/ml) enthält, mit etwa 0,1 bis etwa 0,5 Einheiten/ml α-Thrombin gespalten werden. Man kann die Spaltung bei Raumtemperatur ablaufen lassen. Eine zu hohe Temperatur kann zur Denaturierung der Polypeptide führen und eine zu niedrige Temperatur den Ablauf der Spaltung verzögern.
Man läßt die Spaltung über eine ausreichend lange Zeitspanne ablaufen, um die Bildung des gewünschten Polypeptid-Komplexes zu ermöglichen. Die optimale Zeitspanne beträgt 0,1 bis etwa 60 Minuten, wobei Zeiten von 0,1 bis 30 Minuten bevorzugt sind. Es hat sich herausgestellt, daß Zeiten von 1 bis 10 Minuten ausreichend sind, obwohl optimale Zeiten selbstverständlich durch einige wenige Experimente unter Verwendung von Aliquots des behandelten Faktor VIII : C-Ausgangsmaterials bestimmt werden können. Eine optimale Zeit ist die Zeit, in der die maximale Menge des Polypeptid-Komplexes, der ein Mr von etwa 92 000 zeigt, zusammen mit einem Proteinkomplex gebildet wird, der eine Doppelbande mit einem Mr von 79000-80000 zeigt, ohne daß das Polypeptid mit einem Mr von 92000 signifikant abgebaut wird. Das Polypeptid, das eine Doppelbande mit Mr-Werten von 79000 bis 80000 zeigt, ist möglicherweise nach Abbau zu einem Komplex, der eine Doppelbande bei Mr- Werten von 71000-72000 zeigt, funktionsfähig. Das Polypeptid, das eine Doppelbande mit Mr-Werten von 71000-72000 zeigt, weist allein keine Faktor VIII : C-Aktivität auf.
Die Spaltung wird danach abgebrochen, indem dem Umsetzungsgemisch eine wirksame Menge von (p-Amidinophenyl)-methansulfonylfluorid (nachstehend "p-APMSF") oder einem anderen Thrombin-Inhibitor zugegeben wird. p-APMSF verhindert die weitere Umsetzung von α-Thrombin mit den Faktor VIII : C-Proteinen, ohne diese Proteine abzubauen. Die zuzugebende p-APMSF-Menge sollte etwa 1,5 bis etwa 2,5 Millimol pro Einheit der ursprünglich im Umsetzungsgemisch vorhandenen α-Thrombin-Aktivität umfassen.
p-APMSF kann von California Medicinal Chemistry Company, San Fransisco, Kalifornien, bezogen werden. Seine Herstellung ist von Laura, R., Robinson, D. J. und Bing, D. H. in "(p-Amidinophenyl)methansulfonyl Fluoride, an Irreversible Inhibitor of Serine Proteases", Biochemistry 19 (1980), 4859-4864, auf Seite 4861 beschrieben.
Das Umsetzungsgemisch kann dann zur Konzentration des erfindungsgemäßen Polypeptid-Komplexes behandelt werden. Vorzugsweise wird der Polypeptid-Komplex konzentriert und nicht das Material, das andere Faktor VIII-Proteine sowie Proteine enthält, die nicht Faktor VIII sind, um den Komplex in einer Form bereitzustellen, die die sehr hohe Aktivität bietet, welche der Komplex in gereinigter Form besitzt. Reinigungsverfahren umfassen beispielsweise Ultrafiltration, Ultrazentrifugation, Ionenaustausch, Gel-Permeations-Chromatographie, präparative Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung sowie Gel- und Affinitätschromatographie.
Der gewünschte Komplex kann auch konzentriert und/oder gewonnen werden, indem man das Umsetzungsgemisch, das bereits durch ein anderes Verfahren konzentriert worden sein kann, über eine Immunadsorbens-Säule laufen läßt, die Antikörper gegen menschlichen VIII : C oder äquivalente Antikörper gegen nichtmenschlichen VIII : C enthält, welche mit dem/den Polypeptid(en) des Komplexes reagieren. Die Antikörper sind an Agarose gebunden (vgl. Beispiel I, nachstehend). Verschiedene Antikörper, die zum Konzentrieren des Komplexes und/oder zur Isolierung bestimmter Polypeptide davon verwendet werden können, sind nachstehend beschrieben. Der aktive VIII : C-Komplex adsorbiert vorzugsweise an die Säule und wird danach von der Säule mit einer Calciumionen-Lösung (z. B. CaCl&sub2;) eluiert, die gegebenenfalls auch ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel enthält. Geeignete nichtionische oberflächenaktive Mittel umfassen Alkylphenylpolyoxyethylene, wie z. B. Triton-X-100, -N-101 oder -X-405 (Eastman Chemical Co.), Tween-20, -60 oder -80 (Sigma Chemical Co.) sowie Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co.), wobei alle diese Verbindungen wohlbekannte Handelsartikel mit bekannten chemischen Formeln sind.
Die Mengen der verwendeten Calciumionen und des oberflächenaktiven Mittels sollten ausreichend hoch sein, um den Polypeptid-Komplex zu desorbieren, aber nicht so hoch, daß das Elutionsmittel die Polypeptide inaktiviert. Eine Konzentration der Calciumionen bis zu etwa 0,5 M oder sogar bis zu 1,0 M ist ausreichend, wobei 0,25 M bevorzugt sind. Eine Konzentration des oberflächenaktiven Mittels bis zu etwa 1 Gew.-% ist ausreichend, wobei etwa 0,1 Gew.-% bevorzugt ist. Pro Stunde werden etwa 1 bis etwa 8 Bettvolumina, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 4, des Elutionsmittels über die Immunadsorbens- Säule gegeben. Bei einer zu hohen Durchflußgeschwindigkeit riskiert man eine Störung der Säule und daß der Polypeptid-Komplex nicht adsorbiert. Der Fachmann kann diese Vorgaben ohne weiteres so modifizieren, daß er auch LAs-Verfahren, die keine F. B. S. -Verfahren sind, damit durchführen kann.
Der VIII : C-Polypeptid-Komplex wird bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,4 in einem geeigneten Puffer gewonnen, der auch Calciumionen und das oberflächenaktive Mittel der Elutionsmittel-Lösung enthält. Die Konzentrationen von Calcium und dem oberflächenaktiven Mittel können dann herabgesetzt werden und das oberflächenaktive Mittel wird vorzugsweise entfernt, wie z. B. durch Dialyse der Lösung gegen einen Puffer, beispielsweise den in Beispiel 1 verwendeten VIII : C-Puffer, der eine geringere Menge von Calciumionen enthält. Der erfindungsgemäße Komplex kann in dieser Lösung aufbewahrt oder lyophilisiert werden. Der Komplex kann Patienten mit Blutgerinnungsstörungen verabreicht werden, wobei der Calciumgehalt so eingestellt wird, daß er physiologisch verträglich ist, und eine sterile Kochsalzlösung davon injiziert wird.
Bei nachstehend gezeigter Untersuchung mittels SDS-PAGE zeigt das erfindungsgemäße Koagulans einen Mr-Wert von etwa 92000 und kann normalerweise Material enthalten, das eine Doppelbande mit einem Mr von 79000-80000 zeigt, wobei ein Teil davon einen Abbau erfahren haben kann und eine Doppelbande mit einem Mr von 71000-72000 zeigt. In seiner gereinigten Form zeigen sich im wesentlichen nur diese Bande oder Gruppe von Banden. Jedoch umfaßt die vorliegende Erfindung auch biologische Präparate, in denen weniger als 100%, d. h. 95%, 90% oder sogar nur 80%, 70%, oder 60% oder sogar nur 30%, 20%, 10% oder 1% der vorhandenen proteinartigen Stoffe das erfindungsgemäße Koagulans umfassen. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher Präparate, in denen die Faktor VIII : C- Aktivität auf die Gegenwart des Koagulans zurückzuführen ist.
Die spezifische VIII : C-Koagulationsaktivität (d. h. Aktivität pro Milligramm des gesamten vorliegenden Proteins) des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes ist höher als die Aktivität, die gereinigter menschlicher Faktor VIII : C zeigt, beispielsweise menschlicher Faktor VIII : C, der mittels des im vorstehend erwähnten US-Patent 4,361,509 offenbarten und beanspruchten Verfahrens aufgereinigt wurde. Tatsächlich sollte die Aktivität des gereinigten Komplexes ein Mehrfaches der Aktivität des gereinigten menschlichen Faktors VIII : C betragen, z. B. das 3- bis 5-fache. Der Komplex ist vorteilhafterweise mindestens 10mal oder sogar 50mal so aktiv. Ebenso können biologische Präparate hergestellt werden, die den erfindungsgemäßen Komplex in Verbindung mit einem oder mehreren anderen Proteinen umfassen und eine höhere spezifische Aktivität zeigen als die bislang bekannten Koagulans- Präparate. Die spezifische Aktivität des Komplexes und biologischer Präparate, die diesen enthalten, ist höher als 1800 Einheiten/mg, vorteilhafterweise höher als 5400 Einheiten/mg und übersteigt in besonders vorteilhaften Ausführungsformen 7500 oder sogar 10000 Einheiten/mg. Vorzugsweise übersteigt die spezifische Aktivität der erfindungsgemäßen Präparate die spezifische Aktivität des in der vorliegenden Erfindung verwendeten, gereinigten menschlichen Faktors VIII : C um den Faktor 3 bis 5 und besonders vorteilhafterweise mindestens um das 10fache, 50fache oder sogar 100fache.
Der erfindungsgemäße Proteinkomplex und biologische Präparate davon sind dadurch charakterisiert, daß die vorstehend beschriebene erhöhte Aktivität kontinuierlich über eine Zeitdauer von mindestens 10 Minuten, vorzugsweise von mindestens 30 Minuten, erhalten bleibt. Die Aktivität bleibt natürlich im allgemeinen viel länger stabil. Der Komplex besitzt auch die immunologischen Merkmale eines Faktor VIII : C-Proteins, d. h. er bindet an Antikörper gegen den menschlichen Faktor VIII : C. Dies läßt sich feststellen, indem man wie nachstehend beschrieben einen monoclonalen Antikörper gegen Faktor VIII : C erzeugt, den Antikörper an eine Agarose-Säule bindet, eine wäßrige Lösung des Komplexes über die Säule laufen läßt und die resultierende Lösung auf Faktor VIII : C-Aktivität hin untersucht.
Ein weiteres wünschenswertes Merkmal der Erfindung ist, daß die Polypeptide mit Mr = 92000 und Mr = 79000-80000 stabil sind im Vergleich zum nativen menschlichen Faktor VIII : C, der für seine Anfälligkeit für Proteolyse, Abbau und den sich daraus ergebenden Verlust der Koagulationsaktivität bekannt ist. Diese Stabilität zeigt sich daran, daß die Polypeptide die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Behandlungsschritte unbeschadet überstehen können.

BEISPIEL I

Das vorliegende Beispiel zeigt, wie Faktor VIII : C aus einem handelsüblichen Konzentrat aufgereinigt und mit gereinigtem α-Thrombin gespalten wurde. Es wurde ein monoclonaler Antikörper gegen den Faktor VIII : C hergestellt und zur Identifizierung der VIII : C-Polypeptide verwendet. Während der Spaltung wurden zu verschiedenen ausgewählten Zeiten Teile des Spaltgemisches auf VIII : C (Koagulations)-Aktivität und unter Verwendung von SDS-PAGE auf Proteinbanden hin untersucht.
VIII : C-Reinigung. Alle Schritte erfolgten bei Raumtemperatur. Die verwendeten Chemikalien waren analysenrein. 40 Flaschen eines im Handel erhältlichen VIII : C-Konzentrats (geliefert von Armour Pharmaceutical) wurden in 1000 ml VIII : C-Puffer (0,02 M Imidazol/0,15 M Natriumchlorid/0,1 M L-Lysin-HCl/0,02% Natriumazid, pH 6,8) zubereitet. Diese Probe, die insgesamt 17000 Einheiten VIII : C-Aktivität enthielt, wurde auf eine Immunadsorbens- Säule mit einem Bettvolumen von 2,5-3 Liter aufgetragen. Die Säule enthielt Bromcyan-aktivierte Agarose (Sepharose 4B, Pharmacia, Piscataway, New Jersey), an die monoclonale Antikörper gegen VIII : R kovalent gebunden worden waren. Die Herstellung und Bindung der Antikörper an die Säule erfolgte wie im vorstehend erwähnten US-Patent 4,361,509 beschrieben. Die Antikörper wurden aus Ascites-Flüssigkeit unter Verwendung von 50% Ammoniumsulfat präzipitiert, erneut zweimal präzipiert und danach in einer Dichte von 2-4 mg/ml Sepharose an die Säule gebunden. Das Immunadsorbens wurde mit 3 M Natriumthiocyanat voreluiert, mit VIII : C-Puffer (0,02 M Imidazol-HCl, pH 7,0, 0,1 S M NaCl, 0,1 M L-Lysin-HCl, 0,02% Natriumazid) gewaschen, zweimal mit 2 mM Diisopropylfluorphosphat behandelt und danach wurde das Konzentrat zugegeben.
Die Säule wurde mit 20 Liter 0,15 M Natriumchlorid enthaltendem VIII : C- Puffer gewaschen und danach wurde VIII : C mit 0,35 M Calciumchlorid enthaltendem VIII : C-Puffer vom VIII : R eluiert. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und in einer Amicon-Zelle unter Rühren mit einer YM 10-Membran unter Stickstoff-Druck 100fach konzentriert. Das Konzentrat wurde danach in VIII : C-Puffer 1 : 10 verdünnt und auf eine 4 ml Aminohexyl-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen; -die vorher mit 0,025 M Calciumchlorid enthaltendem VIII : C-Puffer äquilibriert worden war. VIII : C wurde in hoher Konzentration mit - 0,3 M Calciumchlorid enthaltendem VIII : C-Puffer bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 10 ml/h eluiert. Die vereinigten konzentrierten Immunadsorbens-Fraktionen wurden auf 0,25 M Calciumchlorid eingestellt und zweimal jeweils 1 h an 1/10 Volumen (Vol./Vol.) eines Gemisches aus monoclonalen Antikörpern gegen Fibrinogen, Fibronectin und vWF adsorbiert, das an Bromcyan-aktivierte Sepharöse gekoppelt war.

Herstellung monoclonaler Antikörper gegen VIII : C

Mönoclonale Antikörper wurden wie in US-Patent 4,361,509 beschrieben unter Verwendung von gereinigtem VIII : C als Immunogen hergestellt. Die Antikörper wurden mittels eines Festphasen-Tests in Linbro-Titertek-Platten (Flow Laboratories, Inglewood, Kalifornien) und eines enzymgebundenen Immunadsorptions-Nachweissystems (ELISA), das in Engvall, E. und Perlman, P., "Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA), Quantitative assay of immunoglobulin G", Immunochemistrv, 8 (1971), 871-874, beschrieben ist, unter Verwendung eines Peroxidase-Antikörper-Conjugats (Zymed Laboratories, Burlingame, Kalifornien) selektiert. Die Platten wurden mit 100 ng gereinigtem VIII : C pro Vertiefung beschichtet. Die Kulturüberstände der Clone, die sich im ELISA-Test als positiv erwiesen hatten und zur Verwendung in der vorliegenden Untersuchung ausgewählt worden waren, hemmten auch die Aktivität von Plasma-VIII : C.
Untersuchung des Zeitverlaufs der Aktivierung von gereinigtem VIII : C durch Thrombin. Gereinigtem VIII : C (Endkonzentration 167 ug/ml) wurde gereinigtes menschliches α-Thrombin (spezifische Aktivität 2534 E/mg, Endkonzentration 0,5 E/ml) in 0,04 M CaCl&sub2; enthaltendem Imidazol-Kochsalz- Puffer zugegeben. Einem Kontroll-Aliquot wurde nur Puffer zugesetzt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur inkubiert. In verschiedenen Abständen wurden Proben des VIII : C-Thrombin-Gemisches zur schnellen und irreversiblen Inaktivierung von Thrombin in p-APMSF (California Medicinal Chemistry Co.) enthaltende Teströhrchen gegeben. Um die p-APMSF-Hydrolyse auf ein Minimum zu reduzieren, wurde p-APMSF aus einer Stammlösung (100 mM in Methanol) 60 Sekunden vor der Umsetzung mit den VIII : C- Thrombin-Proben 1 : 10 in Imidazol-Kochsalz-Puffer verdünnt. Die Endkonzentration von p-APMSF betrug 1 mM. Das Kontroll-Aliquot wurde zu Beginn des Experimentes in gleicher Weise mit p-APMSF behandelt. Am Ende der 60-minütigen Zeitspanne wurden alle VIII : C-Proben unter Verwendung eines in der Literatur beschriebenen, aktivierten partiellen Thromboplastin- Zeittests auf VIII : C-Aktivität hin untersucht und dann zur SDS-PAGE aufbereitet.

SDS-PAGE "Verfahren A"

Eine diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Plattengelelektrophorese wurde auf der Basis des Verfahrens von Laemmli, U. K., Nature, 227 (1970), 680-685, durchgeführt. Das "Verfahren A" ist wie folgt:

1. Herstellung der Proben

1. Dialysieren der Proteinprobe (idealerweise 50-100 ul, enthaltend 5- 60 ug Protein) gegen Probenpuffer über Nacht bei Raumtemperatur: Falls die Probe Calcium-Ionen enthält, werden dem Probenpuffer 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben.
2. Überführung der dialysierten Probe in ein Röhrchen und Zugabe von 1/10 Volumen 10%-igem SDS. Das Röhrchen wird mit Aluminiumfolie verschlossen. 10-minütiges Erhitzen der Probe in einem kochenden Wasserbad.
3. Entfernen der Probe aus dem Wasserbad und Zugabe von 1/10 Volumen 500 mM Dithiothreit. Inkubation der Probe 4 Stunden bei 56ºC.
4. Abkühlen der Probe auf Raumtemperatur. Vorbereitung zum Auftragen auf das Gel durch Zugabe einer Glycerin-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 10% und einer Stammlösung des Farbstoffs Bromphenolblau bis zu einer Endkonzentration von 0,05%.
II. Herstellung von Gel-Lösungen (Verwendung von deionisiertem destilliertem Wasser)
1. Glycerin-Stammlösung: 50% Glycerin
2. Stammlösung des Farbstoffs Bromphenolblau: 0,5% Bromphenolblau
3. Stammlösung für unteres Gel (Trenngel):
18,2 g Tris-Base
4 ml 10%-iges SDS
Endvolumen 100 ml.
Einstellen des pH-Wertes auf 8,8 mit konzentrierter Salzsäure. Filtrieren.
4. Stammlösung für oberes Gel (Sammelgel):
6,1 g Tris-Base
4 ml 10%-iges SDS
Endvolumen 100 ml.
Einstellen des pH-Wertes auf 6,8 mit konzentrierter Salzsäure. Filtrieren.
5. Probenpuffer:
0,01 M Natriumphosphat
1,0% SDS
10 mM Dinatrium-EDTA
Endvolumen 1 Liter.
pH-Wert mit Natriumhydroxid oder Phosphorsäure auf 7,0 eingestellt.
6. Acrylamid-Stammlösung
Lösen von 30 g Acrylamid in 50 ml Wasser, Zugabe und Lösen von 0,8 g Bisacrylamid. Auffüllen auf ein Endvolumen von 100 ml. Filtrieren der Lösung und Aufbewahrung in der Dunkelheit bei 4ºC.
7. Elektrodenpuffer-Stammlösung:
30,3 g Tris-Base
144,1 g Glycin
Endvolumen 1 Liter
B. Elektrodenpuffer:
100 ml Elektrodenpuffer-Stammlösung
890 ml Wasser
10 ml 10%-iges SDS
9. Stammlösung des Farbstoffs Coomassie-Blau:
1% Coomassie-Blau R-250 in Wasser.
Mindestens 30-minütiges Lösen unter Rühren bei Raumtemperatur und Filtrieren.
10. Ammoniumpersulfat-Lösung:
10% Ammoniumpersulfat.
Aufbewahrt in der Dunkelheit bei 4ºC und jede Woche frisch hergestellt.
III. Gelherstellung und Durchführung der Elektrophorese: Acrylamid-Endkonzentration = 7,5%

1. Trenngel-Lösung

20 ml Trenngel
Trenngel-Stammlösung 5 ml
Acrylamid-Stammlösung 5 ml
Wasser 10 ml
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) 0,005 ml
10% Ammoniumpersulfat 0,1 ml

2. Sammelgel-Lösung

10 ml Sammelgel
Sammelgel-Stammlösung 2,5 ml
Acrylamid-Stammlösung 1,0 ml
Wasser 6,5 ml
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) 0,01 ml
10% Ammoniumpersulfat 0,03 ml

3. Verfahren:

a. Vorbereitung der Plattengel-Apparatur für ein 14,5 cm · 9,0 cm · 0,8 mm-Plattengel. Diese Apparatur ist eine Standard- Gelelektrophorese-Apparatur, die beispielsweise von Hoeffer Scientific Instruments, San Fransisco, Kalifornien, erhältlich ist.
b. Mischen aller Trenngel-Bestandteile außer TEMED und Ammoniumpersulfat in einer 50 ml-Vakuumflasche und Entgasung. Danach Zugabe von TEMED und Ammoniumpersulfat, sorgfältiges Mischen und sofortiges Gießen des Trenngels. Man überschichtet das Trenngel mit wassergesättigtem Butanol und läßt es mindestens 1 Stunde, vorzugsweise 2-6 Stunden, ungestört polymerisieren.
c. Abgießen der Butanolschicht und Waschen des oberen Teils des Trenngels mit dem vollständigen Trenngel-Gemisch. (Herstellung des Sammelgels, Entgasung und Zugabe von TEMED sowie Ammoniumpersulfat erfolgen wie vorstehend für das Trenngel angegeben.)
d. Gießen des Sammelgels und Einsetzen des Kamms in das Sammelgel, wobei man zwischen dem unteren Ende der Kammzähne und der Sammelgel-Trenngel-Grenzfläche mindestens 1,0 cm Abstand läßt. Es wird mit Sammelgel-Lösung so weit wie möglich aufgefüllt. Man läßt das Sammelgel mindestens 1 Stunde vor der Elektrophorese polymerisieren.
e. Zur Entfernung des Kamms pipettiert man Elektrodenpuffer über das Sammelgel und entfernt vorsichtig den Kamm. Die Vertiefungen des Sammelgels werden mehrmals mit Elektrodenpuffer ausgespült.
f. Zusammenbau der Apparatur für die Elektrophorese und Zugabe von Flektrodenpuffer. Auftragen der Probe(n), indem diese in die Vertiefungen des Sammelgels eingefüllt wird/werden, wobei der Puffer unterschichtet wird.
g. Man läßt das Gel unter Verwendung von Gleichstrom laufen:
8 Milliampere, während sich die Proben im Sammelgel befinden, und 15 Milliampere, während sich die Proben im Trenngel befinden. Beendigung der Elektrophorese, wenn die Front des Farbstoffs Bromphenol-Blau 1,0 cm vom unteren Rand des Trenngels entfernt ist.

IV. Fixieren und Anfärben des Gels

Literaturstelle: Fairbanks, G., Steck, T. L und Wallach, D. F. N., Biochemistry, 10 (1971), 2606-2617.
1. Das Gel wird mindestens eine Nacht in einer verschlossenen Kammer in einer Lösung fixiert, die 25% Isopropanol, 10% Essigsäure und 10 ml 1%-ige Coomassie-Blau-Stammlösung enthält. Endvolumen 400 ml.
2. Sodann wird das Gel mindestens 1 Stunde in 10% Isopropanol, 10% Essigsäure und 1,0 ml 1%-iger Coomassie-Blau-Stammlösung getränkt. Endvolumen 400 ml.
3. Das Gel wird etwa 4 Stunden in 10% Essigsäure unter Wechseln der Lösung oder bis zur vollständigen Entfärbung getränkt.
4. Das entfärbte Gel kann auf Filterpapier unter Verwendung eines Geltrockners zur Kontrasterhöhung getrocknet werden.
Etwa 5-20 g Protein wurden auf die Gele aufgetragen. Für reduzierte Proben wurden die VIII : C-Mr-Werte durch halblogarithmisches Auftragen der Mr- Werte gegen die Wanderungsstrecke berechnet, wobei reduziertes Fibrorlectin (Mr 200000), Phosphorylase b (Mr 95000), Rinderserumalbumin (Mr 68000), die schwere IgG-Kette (Mr 50000) und Ovalbumin (Mr 43000) als Standards verwendet wurden.
Scannen und Bildbearbeitung eines Fotoabzugs des fertigen Gels wurden unter Verwendung eines Zeineh-Soft-Laser-Scanning-Densitometers durchgeführt.
Ergebnisse. Die spezifische Aktivität des gereinigten Faktors VIII : C betrug 2000 Einheiten/mg. Die Aktivierung der gereinigten VIII : C-Aktivität durch Thrombin wurde über einen Zeitraum von 60 Minuten untersucht. Vor der Thrombin-Behandlung zeigte die unbehandelte VIII : C-Probe die charakteristische Palette von VIII : C-Formen, die von einer Doppelbande mit Mr = 79000-80000 bis zu einer Bande mit Mr = 188000 reichten. Eine Bande über Mr = 188000 und zwei Banden unter Mr = 79000 zeigten keine Bindung an das gegen VIII : C gerichtete monoclonale Antikörper-Immunadsorbens. Die Banden zwischen Mr = 79000 und Mr = 188000 banden an den gegen VIII : C gerichteten Antikörper.
Während der ersten fünf Minuten des Thrombinaktivierungs-Zeitraums verschwanden nach und nach bis auf eine Bande alle Banden mit einem Mr größer als 92000, die mit monoclonalen gegen VIII : C gerichteten Antikörpern reagierten, und waren nicht nachweisbar, wenn die VIII : C-Aktivität nach 5 Minuten ihren Peak erreichte.
Eine Bande mit Mr = 122000 zeigte sich nur in einigen Experimenten resistent gegen Thrombin. Nach ausgedehnter Thrombin-Behandlung reagierten jedoch weder diese Bande noch irgendeine andere Bande mit dem immobilisierten, gegen VIII : C gerichteten monoclonalen Antikörper.
Die Intensität einer Bande mit Mr = 92000 erhöhte sich mit wachsender VIII : C-Aktivität. Eine Doppelbande mit Mr = 79000-80000 schien in eine Doppelbande mit Mr = 71000-72000 umgewandelt zu sein, wobei die letztere Form zwischen der 5. und 60. Minute vorherrschte, während die VIII : C- Aktivität abnahm. Zwischen der S. und 60. Minute wurden zwei Banden mit Mr = 54000 und Mr = 44000 deutlich sichtbar. Die Bande mit Mr = 44000 zeigte sich in einigen Experimenten auch als Doppelbande. Die Doppelbande mit Mr = 71 000-72000, die Bande mit Mr = 54000 und die Bande mit Mr = 44000 wurden durch den immobilisierten monoclonalen Antikörper gegen VIII : C nicht signifikant entfernt.
Das vorstehend diskutierte Scanning-Verfahren und die Auswertung des Gels ermöglichten es, Veränderungen in der Polypeptid-Konzentration mit Veränderungen der VIII : C-Aktivität zu korrelieren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle gezeigt. Wie ersichtlich, wurde die Bande mit Mr = 92000 parallel zur VIII : C-Aktivität stärker und danach schwächer. Das deutet darauf hin, daß die Bande mit Mr = 92000 eine aktive VIII : C-Form ist, deren Konzentration sich mit der Thrombin-Aktivierung erhöht. Die Banden mit Mr = 54000 und Mr = 44000 wurden zwischen der 1. und 40. Minute konstant stärker, selbst nachdem die Aktivität des Gemisches abnahm.
Während der ersten 0,1 bis 10 Minuten, als die VIII : C-Aktivität ihr Maximum erreichte, verschwand der größte Teil der Doppelbande mit Mr = 79000-80000, während sich in dieser Zeit der größte Teil der Doppelbande mit Mr = 71000 - 72000 zeigte und selbst dann noch vorherrschte, als die VIII : C-Aktivität abnahm. Diese Daten deuten darauf hin, daß die Doppelbande mit Mr = 71000 - 72000 von der Doppelbande mit Mr = 79000-80000 stammt und daß das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 71000-72000 zeigt, allein nicht aktiv ist. Diese Daten stimmen damit überein, daß das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 71000-72000 zeigt, die Fähigkeit zur Komplexbildung mit dem Polypeptid mit Mr = 92000 beibehält; dieser Komplex besitzt auch Aktivität.
Ein direkter Beweis, daß das Polypeptid mit Mr = 92000 einen Komplex mit dem Polypeptid bildet, das die Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigt, stammt aus Experimenten, in denen das gegen VIII : C gerichtete monoclonale Immunadsorbens verwendet wurde. Es wurde zunächst gezeigt, daß der monoclonale Antikörper vorwiegend mit dem Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigt, und nicht mit dem Polypeptid mit Mr = 92000 reagiert. Das wurde durch elektrophoretische Übertragungsexperimente gezeigt. Danach wurde gezeigt, daß das monoclonale Antikörper- Immunadsorbens sowohl das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79000 - 80000 zeigt, als auch das Polypeptid mit Mr = 92000 aus der Lösung entfernt hatte. Das Polypeptid mit Mr = 92000 konnte von der den gegen VIII : C gerichteten Antikörper enthaltenden Immunadsorbens-Säule mit 10 mM EDTA eluiert werden, während das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79000 - 80000 zeigt, gebunden blieb. Das Polypeptid, das die Doppelbande zeigt, konnte anschließend mit 3 M Natriumthiocyanat eluiert werden. Diese Experimente zeigten, daß das Polypeptid mit Mr = 92000 an das Immunadsorbens bindet, weil es mit dem Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigt, einen Komplex bildet und daß es dieses Polypeptid ist, das direkt an das Immunadsorbens binden kann.
* Messungen unmittelbar vor Zugabe von α-Thrombin. Die Aktivität ist in Einheiten des Faktors VIII : C/ml angegeben.

BEISPIEL II

In diesem Beispiel werden die Ergebnisse der Behandlung von gereinigtem menschlichen Faktor VIII : C mit gereinigtem, aktivierten, menschlichen Protein C (nachstehend "APC"), einem bekannten Antikoagulationsenzym, beschrieben. Menschlicher Faktor VIII : C wurde wie vorstehend beschrieben aufgereinigt. APC wurde mittels des in Marlar, R. A. et al., "Mechanism of action of human activated protein C, a thrombin-dependent anticoagulant enzyme", Blood, Bd. 59 (1982), 1067, beschriebenen Verfahrens aufgereinigt, wobei zur Trennung von APC und Thrombin allerdings eine Mono-S-Säule des Pharmacia- FPLC-Systems verwendet wurde.
Tests: Proben wurden wie vorstehend beschrieben unter Verwendung eines Zeittests mit aktiviertem partiellen Thromboplastin und einem Hämophilie A- Plasmasubstrat auf VIII : C-Aktivität hin untersucht.
Herstellung von Proben zur Elektrophorese: Da für die APC-Aktivität Calcium-Ionen benötigt werden, wurde APC zu verschiedenen Zeiten blockiert, indem sowohl den VIII : C + APC-Aliquots als auch der Kontrolle VIII : C und den APC-Aliquots 1/10 Volumen 100 mM EDTA, enthaltend 10 uM DAPA, zugegeben wurde. Danach wurde den Aliquots 1/10 Volumen 10%-iges Natriumdodecylsulfat zugegeben. Die Proben wurden dann 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt und anschließend wie vorstehend beschrieben zur SDS-PAGE dialysiert.
Die diskontinuierliche Elektrophorese von reduziertem VIII : C auf einem Natriumdodecylsulfat-7,5% Polyacrylamid-Gel (PAGE), das Anfärben mit - Coomassie-Blau-R250 sowie Scannen und Auswertung des Gels wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Probenherstellung: Eine Probe von 339 ug VIII : C in 0,3 ml 0,3 M Calciumchlorid enthaltendem VIII : C-Puffer wurde über Nacht gegen Puffer (50 mM Tris-chlorid, 0,15 M Natriumchlorid, 5 mM Calciumchlorid, 0,02% Natriumazid, pH 7,4) dialysiert. Der dialysierten VIII : C-Probe wurden 1,095 ml Puffer, 90 ul Kaninchenhirn-Cephalin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MD, entsprechend den Anweisungen des Herstellers zubereitet, aufbewahrt und aufgetaut) und 15 ul 1 mM Dansylarginin-N-(3-ethyl-1,5-pentandiyl)-amid (DAPA) zugegeben, wobei eine DAPA-Endkonzentration von 10 uM erhalten wurde. Die Zugabe von DAPA erfolgte zur Hemmung aller im APC vorhandenen Thrombin-Spurenmengen, da 10 uM DAPA APC nicht signifikant hemmen. Das Endvolumen der Probe betrug 1,5 ml und die Endkonzentration von VIII : C war 226 ug/ml. Der 1,5 ml VIII : C-Probe wurden 400 ul entnommen und als Kontrolle (als VIII : C bezeichnet) verwahrt. Zu den restlichen 1,1 ml wurden 20 ul (10 ug) APC gegeben, wobei eine APC-Endkonzentration von 9 ug/ml erhalten wurde. (als VIII : C + APC bezeichnet). Es wurde eine zweite Kontrollprobe hergestellt, die alle Bestandteile in gleichen Konzentrationen enthielt, wobei allerdings VIII : C weggelassen wurde (als APC bezeichnet).
Zeitpunkte: Die Proben, die nur VIII : C, das Gemisch aus VIII : C und APC oder nur APC enthielten, wurden in ein Wasserbad mit 37ºC gegeben. Zu bestimmten Zeiten wurden Aliquots zur SDS-PAGE und/oder zum VIII : C-Aktivitätstest entnommen. In der Kontrolle wurde auch bestimmt, daß APC nach längerer Inkubation bei 37ºC bei der Hydrolyse des synthetischen Substrates S-2238 aktiv blieb.
Ergebnisse: Die Spaltung von gereinigtem VIII : C mit APC ging mit dem Verlust von etwa 85% der in der Kontrolle ermittelten VIII : C-Aktivität einher. Die Inaktivierung der VIII : C-Aktivität durch APC führte zur Verminderung aller VIII : C-Polypeptide mit Mr zwischen 92000 und 188000 und zur Erzeugung eines Polypeptids mit Mr = 45000, wobei das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79-80000 zeigt, intakt blieb.
Eine Untersuchung zum Zeitverlauf der Inaktivierung von gereinigtem VIII : C durch APC zeigte über einen Zeitraum von 360 Minuten das zunehmende Verschwinden spezifischer VIII : C-Polypeptide mit abnehmender VIII : C- Aktivität. Scannen und Auswertung des Gels ergaben, daß die Konzentrationen des Polypeptids mit Mr = 188000 und des Polypeptids mit Mr = 92000 parallel zur VIII : C-Aktivität abnahmen.
Ein anderes Polypeptid mit einem Mr, der zwischen diesen Werten lag, wurde durch APC gespalten, was jedoch durch das Gelscannen nicht ohne weiteres quantitativ bestimmt werden konnte. Im Gegensatz zur Spaltung mit APC erwiesen sich in diesem Experiment einige VIII : C-Polypeptide mit Mr = 92000-188000 resistent gegen die APC-Spaltung. Wie in der Spaltung mit APC wurde das Polypeptid der Doppelbande mit Mr = 79-80000 jedoch nicht durch APC proteolytisch gespalten.
Während die Polypeptide mit Mr = 188000 und 92000 abnahmen; schien sich die Konzentration eines Polypeptids mit Mr = 45000 zu erhöhen, was darauf hindeutete, daß es sich um ein proteolytisches Fragment handelte, das von diesen Polypeptiden stammte. Mit Coomassie-Blau konnten keine anderen Spaltprodukte sichtbar gemacht werden.
Wie in Beispiel I gezeigt, erhöhte bzw. verminderte sich die Konzentration des Polypeptids mit Mr = 92000 während der VIII : C-Aktivierung durch Thrombin parallel zur VIII : C-Aktivität. Zur Bestimmung, ob eine lineare Beziehung zwischen der Proteolyse des Polypeptids mit Mr = 92000 und dem Verlust der VIII : C-Aktivität besteht, wurden die Daten des Inaktivierungs- Zeitverlaufs erneut gegen den prozentualen Anteil des Polypeptids mit Mr 92000 aufgetragen, um die prozentuale VIII : C-Aktivität zu ermitteln. Es zeigte sich, daß die Höhe der VIII : C-Aktivität zur Menge des Polypeptids mit Mr 92000 proportional ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt monoclonale Antikörper, die auf eine nicht vorhersehbare - Weise für verschiedene Polypeptide spezifisch sind, die durch die Umsetzung von Faktor VIII : C mit einer Protease, wie z. B. α-Thrombin, gebildet werden. Jeder Antikörper reagiert mit menschlichem Faktor VIII : C, der weder aktiviert noch mit Thrombin oder äquivalenten Proteasen gespalten worden ist. Die Antikörper sind weiterhin wie folgt durch ihre individuellen Eigenschaften charakterisiert:
(A) Ein Antikörper reagiert mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das einen M r-Wert = 92000 aufweist, mit Polypeptiden, die einen Mr-Wert = 108000 oder größer aufweisen, sowie mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 44000 aufweist und im Endprodukt der Thrombin-Spaltungen vorhanden ist. Er reagiert weder mit dem in der - vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 79000-80000 zeigt, noch mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 71000-72000 zeigt.
(B) Ein Antikörper reagiert mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92000 aufweist, mit Polypeptiden, die einen Mr-Wert = 108000 oder größer aufweisen, sowie mit dem Polypeptid, das einen Mr--Wert = 54000 aufweist und im Endprodukt der Thrombin-Spaltungen vorhanden ist. Er reagiert weder mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 79000-80000 zeigt, noch mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid, das eine Doppelbande von Mr = 71000-72000 zeigt.
(C) Ein Antikörper reagiert mit dem Polypeptid, das die Doppelbande von Mr 79000-80000 zeigt, sowie mit Polypeptiden, die Mr-Werte = 108000 und größer aufweisen, aber weder mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92000 aufweist, noch mit Polypeptiden, die Mr-Werte = 71000-72000, Mr = 54000 oder Mr = 44 000 aufweisen.
(D) Ein Antikörper reagiert nur mit Polypeptiden, die Mr-Werte = 108000 und größer aufweisen.
Jeder dieser Antikörper kann verwendet werden, um den vorstehend beschriebenen Komplex aus- Gemischen, die auch andere Polypeptide enthalten, zu konzentrieren. Ein solches Gemisch wird durch partielle Spaltung von menschlichem Faktor VIII : C mit a-Thrombin oder eine äquivalente Protease hergestellt. Ein weiteres derartiges Gemisch wird mit Hilfe von DNA- Rekombinationsverfahren hergestellt, wobei ein gewünschtes Polypeptid oder ein Komplex in einem Mikroorganismus exprimiert wird und aus einem Gemisch mit anderen Protein-Verbindungen gewonnen werden muß. Der Antikörper (A), (B), (C) oder (D) oder eine Kombination aus zwei, drei oder allen Antikörpern kann in der in Beispiel I beschriebenen Weise an eine Immunadsorbens-Säule gebunden werden. Durch die Säule wird eine Ausgangslösung des Gemisches gegossen, die das/die Polypeptid(e) enthält, die den Komplex umfassen. Die in der Ausgangslösung vorhandenen Polypeptide mit Mr-Werten von 92000, 79000-80000 und 71000-72000 adsorbieren an die. Säule, von der sie, wie vorstehend gelehrt, eluiert werden können, nachdem die Ausgangslösung durch die Säule gelaufen ist. Der gewünschte aktivierte VIII : C- Komplex wird dadurch in der erhaltenen eluierten Lösung im Vergleich zur Ausgangslösung konzentriert.
Die neuen Antikörper lassen sich auch für analytische Zwecke verwenden, beispielsweise zum Nachweis der Umsetzung von menschlichem VIII : C mit Thrombin oder anderen Proteasen, da sie mit Produkten dieser Umsetzung reagieren können. Es ist festgestellt worden, daß ein Antikörper mit dem Profil (B) und ein Antikörper mit dem Profil (C) die Koagulationsaktivität von VIII : C aufheben können, wenn einer von beiden an den Faktor VIII : C gebunden ist. Diese zusätzliche Eigenschaft kann bei der Diagnose von Krankheiten, die mit Hämophilie verwandt sind, nützlich sein.
Die Entdeckung dieser Antikörper erlaubt auch eine weitere Charakterisierung der Bestandteile des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptid-Komplexes. Die Polypeptide, die eine Bande mit Mr 92000 zeigen, enthalten daher (mindestens) zwei Epitope (d. h. Antikörper- Bindungsstellen), die durch Thrombin-Spaltung nicht zerstört werden und auf Polypeptiden nicht vorhanden sind, die entweder die Doppelbande mit Mr = 79000-80000 oder die Doppelbande mit Mr = 71000-72000 zeigen. Eines dieser Epitope ist auch auf dem Polypeptid mit Mr = 44000 vorhanden und das andere auf dem Polypeptid mit Mr = 54000. Die Polypeptide mit Mr = 44000 sowie Mr = 54000 stammen daher vom Polypeptid mit Mr = 92000 ab. Die Polypeptide mit Mr = 92000 und Mr = 79000-80000 stammen ebenfalls von (einem) gemeinsamen Vorläufer(n) ab. Die Entdeckung der Antikörper mit Profil (B) und Profil (C), von denem jeder die Koagulationsaktivität von Faktor VIII : C aufhebt, erhärtet weiterhin die Bedeutung der Polypeptide mit Mr = 92000 und Mr = 79000-80000 für die Koagulationsfunktion. Das Polypeptid, das eine Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigt, enthält ein Epitop, das durch Thrombin-Spaltung zerstört wird und nicht auf dem Polypeptid mit Mr = 92000 vorhanden ist.
Diese monoclonalen Antikörper können hergestellt werden, indem man die allgemeinen Reinigungsschritte für den menschlichen Faktor VIII : C durchführt; monoclonale Antikörper gegen gereinigten VIII : C-Faktor herstellt; zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Polypeptid-Komplexes einschließlich des Nachweises der spezifischen Polypeptide gereinigten VIII : C- Faktor partiell spaltet und aktiviert; die gegen VIII : C gerichteten Antikörper mit den Aktivierungsprodukten reagieren läßt; und einen Antikörper durch. Nachweis des/der Polypeptids/Polypeptide, mit dem er reagiert, charakterisiert. Diese Reihenfolge ist nachstehend in Beispiel III genauer dargelegt. In einer anderen Ausführungsform kann man einen Antikörper herstellen, indem man aus den Produkten der partiellen Thrombin-Spaltung ein bestimmtes Polypeptid von Interesse isoliert, beispielsweise durch Immunadsorption an einer Säule und Elution von dieser Säule, wobei diese Agarose enthält, an die ein monoclonaler Antikörper gekoppelt ist, von dem bekannt ist, daß er mit dem Polypeptid von Interesse reagiert, und dann unter Verwendung des in Beispiel III beschriebenen Verfahrens einen monoclonalen Antikörper gegen dieses Polypeptid erzeugt.

BEISPIEL III

Unter Verwendung des folgenden Verfahrens wurden monoclonale Antikörper gegen menschlichen Faktor VIII : C hergestellt, wobei der Ausgangspunkt hochgereinigtes VIII : C war, das mit Hilfe des Verfahren des US- Patents 4,361,509 hergestellt worden war.
Mäusen wurde entsprechend dem folgenden Verfahren hochgereinigter Faktor VIII : C injiziert. Am Tag Null wurde den Mäusen ein Mittel intraperitoneal injiziert, das durch Lösung (oder Suspension) von 10 ug Protein in 0,1 ml Puffer, der 0,05 Nt Tris, 0,15 M Natriumchlorid, 0,02% Natriumazid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 Einheiten Trasylol/ml enthielt und einen pH-Wert von 7,3 aufwies, und durch Schütteln mit einer gleichen Menge an komplettem Freundschem Adjuvans hergestellt worden war. Am 14. Tag wurde den Mäusen das gleiche Mittel injiziert, wobei allerdings das komplette Freundsche Adjuvans durch inkomplettes Freundsches Adjuvans ersetzt wurde. Am 21. Tag wurde die Injektion vom 14. Tag wiederholt. Am 38. Tag wurde den Mäusen nur gereinigter VIII : C-Faktor injiziert. Am 42. Tag wurde den Mäusen die Milz entfernt und entsprechend einem in J. P. Brown et al., "Protein Antigens of Normal and Malignant Human Cells Identified by Immunoprecipitation with Monoclonal Antibodies", Journal of Biological Chemistry, Bd. 225 (1980), S. 4980-4983, beschriebenen Standard-Verfahren fusioniert. Dieses Standardverfahren wurde nur insofern verändert, als 50% Polyethylenglykol durch 35% Polyethylenglykol 1000 ersetzt wurden.
Die Antikörper wurden unter Verwendung des Testverfahrens selektiert, das vorstehend in Beispiel I im Absatz unter der Überschrift "Herstellung eines monoclonalen Antikörpers gegen VIII : C" beschrieben ist, wobei allerdings auch Antikörper, die die VIII : C-Aktivität nicht aufhoben, subcloniert und wie nachstehend beschrieben behandelt wurden.
Clone, die sich als positiv erwiesen, wurden zweimal subcloniert. Clone, die Antikörper gegen VIII : C konstant produzierten, wurden danach in die Bauchfellhöhle von Balb/C-Mäusen injiziert, die mindestens vier Tage vor Injektion der Zellen mit 0,5 ml Pristan intraperitoneal vorbehandelt worden waren. In 0,5 ml des nach Dulbecco modifizierten Eagle-Mediums ohne foetales Rinderserum wurden Hybridomzellen in Konzentrationen von etwa 5 · 10&sup6; Zellen pro Maus injiziert. Nach Eintreten der Schwellung wurden die Mäuse punktiert. Ascitesflüssigkeit wurde in Heparin in einer Konzentration von etwa 10 Einheiten/ml gesammelt. Zur Bereitstellung einer zweckmäßigen Menge für die anschließende Isolierung von monoclonalem IgG wurde die von mehreren Mäusen stammende Ascitesflüssigkeit vereinigt. Aus der Ascitesflüssigkeit wurden die Antikörper unter Verwendung von 50%-igem Ammoniumsulfat präzipitiert und anschließend zweimal erneut präzipitiert. Die so erzeugten, (B), (C) und (D) entsprechenden Antikörper gegen VIII : C wurden an Agarose- Perlen gebunden und es zeigte sich, daß sie gereinigtes VIII : C aus Lösungen binden.
Separate VIII : C-Ansätze, wobei ein Ansatz unbehandelt war und der andere einer Thrombin-Proteolyse unterworfen worden war, wurden danach mittels der in Beispiel I beschriebenen SDS-PAGE-Schritte untersucht. Dann wurde jede Bande elektrophoretisch vom Gel auf ein Nitrocellulose-Filter übertragen (Western-Übertragungen). Die verwendete Apparatur bestand aus einer Bio- Rad-"Trans-Blot"-Zelle und einem Bio-Rad-Stromversorgungsgerät, Modell 160.1.6. (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien). Der Übertragungspuffer enthielt 25 mM Tris sowie Glycin, das bis zu einem pH-Wert von 8,3 zugegeben worden war, und 20% Methanol. Die Übertragungen wurden 16-24 Stunden bei 90 Volt und 100 Milliampere durchgeführt.
Die spezifischen Polypeptide, mit denen jeder der Antikörper reagierte, wurden unter Verwendung eines Verfahrens bestimmt, das dem von W. M. Burnette in "Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibodies and Radioiodinated Protein A", Analytical Biochemistry, Bd. 112 (1981), S. 195-203, beschriebenen angepaßt worden war.
"Puffer D" bestand aus 10 mM Tris-chlorid, 0,15 M NaCl, 0,02% Natriumazid, pH-Wert 7,4. Alle Umsetzungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
1. Der Nitrocellulose-Filter mit den übertragenen Proteinen wurde in eine Schale gegeben, die 100 ml Puffer D und 0,25% Gelatine enthielt. Die Schale wurde auf einen Rotations-Schüttler gegeben und langsam 30 Minuten geschüttelt.
2. Danach wurde der monoclonale Antikörper in die Schale gegeben (entweder 0,1%-1% Ascitesflüssigkeit oder 1 mg gereinigtes IgG). Es wurde 120 Minuten geschüttelt.
3. Der Nitrocellulose-Filter wurde wie folgt gewaschen:
(a) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
(b) 30 Minuten mit 100 ml Puffer D und 0,05% Nonidet-P-40 mit Pufferwechsel nach 10 und 20 Minuten.
(c) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
4. Der Nitrocellulose-Filter wurde in Puffer D plus 0,25% Gelatine und J¹²&sup5; markiertem, gereinigtem, gegen Maus-IgG gerichtetem Kaninchen-IgG 30 Minuten getränkt.
5. Der Nitrocellulose-Filter wurde wie folgt gewaschen:
(a) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
(b) 16-24 Stunden mit 100 ml Puffer D plus 0,1% Nonidet-P-40 und 0,5 M NaCl.
(c) 10 Minuten mit 100 ml Puffer D.
6. Der Nitrocellulose-Filter wurde zwischen zwei Filterpapier-Bögen abgetupft und danach wurde der Nitrocellulose-Filter in einem verschweißten Plastikbeutel aufbewahrt.
7. Zur Bestimmung, welche Antikörper und Polypeptide reagiert haben,
(a) wurde ein Autoradiogramm des Nitrocellulose-Filters unter Verwendung von Verfahren, die in der Literatur bekannt sind, hergestellt,
(b) das Autoradiogramm wurde mit einem Nitrocellulose-Filter verglichen, auf den VIII : C übertragen worden war, der jedoch mit Coomassie-Blau R250 angefärbt und nicht mit einem monoclonalen Antikörper umgesetzt worden war.
Durch diese Schritte wurde gezeigt, daß die folgenden unterschiedlichen Antikörper produziert worden waren.
Vier Antikörper reagierten mit dem Polypeptid, das einen Mr-Wert = 92000 aufwies, den Polypeptiden, die Mr-Werte von 108000 und größer aufwiesen, sowie einem der beiden Polypeptide, die einen Mr-Wert = 54000 oder 44000 besaßen, die in den Endprodukten der Thrombin-Spaltung vorhanden sind, aber mit keinen anderen Polypeptiden. Das zeigt, daß die beiden letzteren Polypeptide aus der Thrombin-Spaltung des Polypeptids mit Mr = 92000 hervorgegangen sind. Es zeigt auch, daß auf dem Polypeptid mit Mr = 92000 zwei Epitope diese Spaltung unbeschadet überstehen und daß diese Epitope nicht auf dem Polypeptid vorhanden sind, das die Doppelbande mit Mr = 79000 - 80000 zeigt.
Ein fünfter Antikörper reagierte mit dem Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr-Werten = 79000-80000 zeigte, sowie mit den Polypeptiden, die Mr Werte von 108000 und größer besaßen, jedoch weder mit dem Polypeptid mit einem Mr = 92000 noch mit einem der Polypeptide, die in Endprodukten der Thrombin-Spaltung vorhanden sind. Das zeigt, daß das Polypeptid, das die Doppelbande mit Mr = 79000-80000 aufweist, ein Epitop besitzt, das nicht auf dem Polypeptid mit Mr = 92000 vorhanden ist, und daß dieses Epitop durch Thrombin-Spaltung des Polypeptids, das die Doppelbande mit Mr = 79000 - 80000 aufweist, zerstört wird.
Die Reaktionsprofile dieser fünf Antikörper zeigen, daß die Polypeptide mit Mr = 92000 und Mr = 79000-80000 von (einem) gemeinsamen Vorläufer(n) abstammen.
Ein sechster Antikörper reagierte nur mit den Polypeptiden, die Mr-Werte 108000 und größer besaßen. Da er mit keinem der Polypeptide reagierte, die in den Endprodukten der Thrombin-Spaltung vorhanden sind, wird das Epitop, mit dem dieser Antikörper reagierte, durch Thrombin-Spaltung zerstört.
Zur Herstellung und Aufbewahrung eines biologischen Präparats aus einem oder mehreren dieser Antikörper kann das entsprechende monoclonale IgG aus der vereinigten, mit Heparin behandelten Ascitesflüssigkeit sofort nach deren Gewinnung isoliert werden. Man kann dazu auch eine eingefrorene Portion der aufbewahrten Lösung auftauen. Unabhängig davon, ob frisches oder eingefrorenes Material verwendet wird, bringt man die Lösung auf 4ºC und behandelt sie mit einer gleichen Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (PBS: 1,6 g Natriumphosphat, einbasisches Monohydrat; 8,4 g Natriumphosphat, dibasisch, wasserfrei; 61,4 g Natriumchlorid, mit Wasser auf 7 Liter aufgefüllt; pH = 7,2). Die verdünnte Ascitesflüssigkeit wird präzipitiert, indem sie bei 4ºC tropfenweise unter Rühren zugegeben wird. Zentrifugationen werden vorzugsweise 60 Minuten bei 14000 Upm (30000 · g) durchgeführt. Die Überstandslösung der Ascitesflüssigkeit wird noch zweimal mit SAS präzipitiert. Das Gemisch aus Präzipitat und Überstandsflüssigkeit wird gerührt und in gleicher Weise wie im ersten Zyklus zentrifugiert. Die aus der dritten Präzipitation erhaltenen Pellets werden in PBS in gleicher Menge wie die der verdünnten Ascitesflüssigkeit resuspendiert und dann ausgiebig gegen PBS dialysiert. In den Dialyseschläuchen erscheinende Klümpchen werden durch Zentrifugation bei 20ºC entfernt. Das dialysierte IgG wird durch Rühren mit einer 5%-igen wäßrigen Aluminiumhydroxid-Lösung bei Raumtemperatur adsorbiert und nach Adsorption bei 20ºC zentrifugiert. Die Adsorptionsbehandlung wird mindestens dreimal wiederholt, wobei nach der ersten Behandlung für jede folgende eine 2,5%-ige Aluminiumhydroxid-Lösung verwendet wird. Das adsorbierte IgG wird auf 4ºC gekühlt und wie vorstehend beschrieben noch einmal mit SAS präzipitiert. Die präzipitierten Pellets können bis zur Verwendung bei -20ºC aufbewahrt werden.
Zwei bevorzugte Verfahren zur Aufreinigung der monoclonalen Antikörper und zur Aufbewahrung von biologischen Präparaten, die diese enthalten, sind in der Veröffentlichung von P. L. Ey et al., "Isolation of Pure IgG 1, IgG2a, and IgG2b Immunoglobulins from Mouse Serum Using Protein A- Sepharose", Immunochemistry, Bd. 15. S. 429-436, sowie in der Arbeit von C. Bruck et al., "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid by DEAE Afft-Gel Blue Chromatography", T. Immunological Methods, Bd. 53 (1982), 313-319, beschrieben.

Claims

1. Faktor VIII : C-Koagulans, im wesentlichen bestehend aus:

(a) einem Komplex eines Polypeptids mit Mr = 92000 und eins Polypeptids mit Mr = 79000-80000; oder

(b) einem Komplex eines Polypeptids mit Mr = 92000 und eines Polypeptids mit Mr = 71000-72000; oder

(c) einer Kombination aus den Komplexen (a) und (b) wobei der Komplex eine höhere spezifische Koagulationsaktivität als 1800 Einheiten/mg zeigt.

2. Koagulans nach Anspruch 1, in dem die Polypeptide den Komplex mit einem Mittel bilden, das mit EDTA ein Chelat bilden kann.

3. Koagulans nach Anspruch 1, in dem mindestens eines der Polypeptide des Komplexes durch α-Thrombin-Behandlung erhältlich ist.

4. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit den folgenden Merkmalen:

(a) die Koagulationsaktivität ist höher als 4800 Einheiten/mg und wird über einen Zeitraum von mindestens 10 Minuten aufrechterhalten; und

(b) die Polypeptidfragmente haben die Fähigkeit, an Antikörper gegen den menschlichen Faktor VIII : C zu binden.

5. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die spezifische Aktivität mehr als 5400 Einheiten/mg beträgt.

6. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer spezifischen Aktivität, die 7500 Einheiten/mg übersteigt.

7. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer spezifischen Aktivität, die 10000 Einheiten/mg übersteigt.

8. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das frei ist von α-Thrombin und äquivalenten Proteasen in -aktiver Form.

9. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Koagulans lyophilisiert ist.

10. Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das in einer pharmazeutisch verträglichen physiologischen Kochsalzlösung gelöst ist.

11, Verfahren zur Herstellung eines Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Spaltung von Faktor VIII : C in einem Spaltgemisch mit Thrombin oder einer ähnlich wirkenden Protease unter geeigneten Bedingungen, um die Polypeptide nach Anspruch 1 zu erzeugen;

(b) Abbruch der in Schritt (a) durchgeführten Spaltung in Gegenwart der Polypeptide in dem Spaltgemisch; und

(c) Gewinnung des resultierenden Koagulans.

12. Verfahren nach Anspruch 1I, wobei der Faktor VIII : C vorher gereinigt worden ist.

13. Verfahren zur Gewinnung eines Koagulans nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Adsorption des Koagulans in aktiver Form an ein Immunadsorbens, das monoclonale Antikörper gegen Faktor VIII : C enthält, und

(b) Elution des Koagulans von dem Immunadsorbens mit einer wäßrigen, Calciumionen enthaltenden Lösung unter Elutionsbedingungen, die eine Desorption des Koagulans von dem Immunadsorbens ohne Denaturierung des Koagulanc bewirkt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Lösung bis zu 1,0 M Calciumionen enthält und auf das Immunadsorbens mit bis zu etwa 8 Bettvolumen pro Stunde aufgebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die monoclonalen Antikörper an menschlichen Faktor VIII : C binden und eines der folgenden Bindungsprofile mit Polypeptiden zeigen, die von menschlichem Faktor VIII : C stammen:

(A) Bindung an von menschlichem, durch Thrombin gespaltenen Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92000, 108000 und 44000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigen, oder an solche, die eine Doppelbande mit Mr = 71000-72000 zeigen;

(B) Bindung an von menschlichem, durch Thrombin gespaltenen Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 92000 ≥ 108000 und 54000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigen, oder an solche, die eine Doppelbande mit Mr = 71000-72000 zeigen;

(C) Bindung an von menschlichem, durch Thrombin gespaltenen Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr = 79000-80000 zeigen, und an Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 108000, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 44000, 54000 und 92000 aufweisen, und an Polypeptide, die eine Doppelbande mit Mr = 71000 - 72000 zeigen;

(D) Bindung an von menschlichem, duch Thrombin gespaltenen Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 108000 aufweisen, aber keine Bindung an von menschlichem Faktor VIII : C stammende Polypeptide, die ein Molekulargewicht von weniger als 108000 aufweisen;

wobei die Molekulargewichte dadurch bestimmt werden, daß man die Polypeptide einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterwirft.