DK172036B1

DK172036B1 - Faktor VIII:C-koaguleringsmiddel, fremgangsmåde til fremstilling heraf samt fremgangsmåde til udvinding heraf

Info

Publication number: DK172036B1
Application number: DK174984A
Authority: DK
Inventors: Theodore S Zimmerman; Carol A Fulcher
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1983-03-31
Filing date: 1984-03-30
Publication date: 1997-09-22
Also published as: EP0123945B2; JPH0638790A; AU2627284A; JPH0829089B2; NO167533C; DK174984A; EP0123945A1; EP0561427B1; NO841277L; SG49675A1; DE3486423T2; ZA842418B; SG48229A1; DE3486423T3; EP0123945B1; AU572128B2; DE3486423D1; JPS59184130A; IE80858B1; ATE135400T1

Description

DK 172036 B1

Denne opfindelse angår hidtil ukendte faktor VIII:C-koaguleringsmidler, dvs. proteiner, der udviser koagulerende aktivitet . Opfindelsen finder derfor anvendelse ved behandling af klassisk hæmophili og til nærmere studium og karakterisering 5 af det polypeptid eller de polypeptidkomplekser, der tilvejebringer den ønskede koagulationsopførsel i blod af mennesker og andre pattedyr. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af disse faktor VIII:C-koaguleringsmidler samt en fremgangsmåde til udvinding heraf.

10 Det har længe været kendt, at plasma faktor VIII spiller en afgørende rolle ved blodkoagulering, og at thrombin aktiverer faktor VIII's koagulerende virkning. Nyligt stedfundne forsøg på at karakterisere faktor VIII har postuleret, at faktor VIII er et kompleks af mindst to polypeptider, der kendes som 15 VIII:C og VIII:R, og har fundet, at den koagulerende aktivitet findes i VIII:C-delen. Studier af virkningen af thrombin på faktor VIII :C har ført til den konklusion, at thrombin aktiverer denne faktor ved at nedbryde den til flere mindre polypeptider. Ingen tidligere studier har dog været i stand 20 til at forbinde thrombininduceret faktor VIII-aktivering i mennesker med nogle af de definerede polypeptider, der dannes fra human faktor VIII:C.

F.eks. forsøgte Hoyer og Trabold i "The effect of thrombin on human factor VIII", J. Lab. Clin. Med. 97:50-64 (1981) at 25 oprense human faktor VIII:C ved immunoadsorbent-kromatografi under anvendelse af et polyklont antistof over for faktor VIII:R, der var dyrket i en kanin. Derefter inkuberede de faktoren VIII:C med oprenset human α-thrombin og fastslog, at små mængder af thrombinen aktiverede faktoren VIII:C, medens 30 mindre mængder aktiverede den mindre eller overhovedet ikke.

De konkluderede også, at thrombinaktivering ledsages af en formindskelse af proteinets størrelse, og de foreslog en molekylvægt på ca. 116.000 for den aktiverede faktor VIII:C.

Som det mest signifikante kunne de ikke identificere speci-35 fikke polypeptider, der tilbageholdt faktor VIII:C-aktivitet 2 DK 172036 B1 og VIII:C-antigendeterminanter.

C.A. Fulcher og T.S. Zimmerman opnåede i "Characterization of the human factor VIII procoagulant protein with a heterologous precipitating antibody", Proc. Natl. Acad, of Sci. USA, 5 79:1648-1652 (1982) meget ren human faktor VIII:C fra plasma koncentrat ved at føre koncentratet gennem en søjle indeholdende et monoklont antistof over for faktor VIII:R og derefter eluere VIII:C fra det adsorberede VIII :C/VIII:R-kompleks og koncentrere faktoren VIII:C på en anden søjle. Den opren-10 sede faktor VIII:C blev derefter analyseret ved natriumdode-cylsulfat/polyacrylamid-gelelektroforese (herefter "SDS-PA-GE") både før og efter tilsætning af thrombin til det opren-sede materiale. Den oprensede faktor VIII:C viste før throm-bintilsætning en bred række bånd på SDS-PAGE, svarende til 15 polypeptider med forskellige molekylvægte (Mr) omfattende en relativt stærk dublet ved en Mr på 80.000 og 79.000 og mindst seks yderligere svagtfarvende polypeptider med større Mr omfattende et ved en Mr på ca. 92.000. Tilsætning af thrombin til den oprensede faktor VIII:C forårsagede formindskelse 20 eller fjernelse af alle de polypeptider, der havde vist sig før thrombintilsætning.

Plasmakoncentratets koagulerende virkning steg efter throm-bintilsætning til et maksimum på tre gange den for materialet før thrombintilsætning og formindskedes derefter. Den opren-25 sede faktor VIII:C's koagulerende virkning steg også til et maksimum på tre gange den for det præaktiverede materiale.

Dvs. thrombin havde i alt væsentligt den samme aktiverende virkning på faktoren VIII:C i hvert tilfælde. Eftersom den oprensede VIII:C besad en rapporteret specifik aktivitet på 30 ca. 3280 gange den for udgangsmaterialet, ville fagmanden inden for området således konkludere, at forøgelsen i specifik aktivitet skyldtes den opnåede høje rensningsgrad. Der er i denne artikel ingen basis for at tillægge et eller flere specifikke polypeptider af det store antal polypeptider, der 35 er forbundet med de bånd, der er observeret i den oprensede 3 DK 172036 B1 faktor VIII:C før thrombinaktivering, aktiveret koagulerende aktivitet.

Den foreliggende opfindelse angår et faktor VIII:C-koagule-ringsmiddel, som er ejendommeligt ved, at det i det væsentli-5 ge består af: (a) et kompleks af et polypeptid med Mr = 92.000 og et polypeptid med Mr = 79.000 - 80.000; eller (b) et kompleks af et polypeptid med Mr = 92.000 og et polypeptid med Mr = 71.000 - 72.000; eller 10 (c) en kombination af kompleks (a) og (b).

Koaguleringsmidlet ifølge opfindelsen kan anvendes til behandling af hæmophilis koaguleringsforstyrrelser ved administration af koaguleringsmidlet eller biologiske præparater indeholdende koaguleringsmidlet.

15 Endnu et andet aspekt af den foreliggende opfindelse omfatter en fremgangsmåde til fremstilling af koaguleringsmidlet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter trinnene: (a) digestion af faktor VIII:C i en digestionsblanding 20 med thrombin eller en protease med tilsvarende virk ning under digestionbetingelser til dannelse af de ovenfor definerede polypeptider, (b) afbrydelse af digestionen i trin (a), medens polypep-tideme er til stede i digestionsblandingen, og 25 (c) udvinding af det resulterende koaguleringsmiddel.

4 DK 172036 B1

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til udvinding af koaguleringsmidlet ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter trinnene: (a) adsorption af koaguleringsmidlet i aktiv form til en 5 immunoadsorbent indeholdende monoklonale antistoffer over for faktor VIII:C, og (b) eluering af koaguleringsmidlet fra immunoadsorbenten med en vandig opløsning indeholdende calciumioner under elueringsbetingelser, der er effektive til at 10 desorbere koaguleringsmidlet fra immunoadsorbenten uden denaturering af koaguleringsmidlet.

Som anført angår den foreliggende opfindelse polypeptidkoaguleringsmidler, der udviser faktor VIII:C-koaguleringsmid-delaktivitet og faktor VIII:C-immunologisk opførsel, og som 15 viser karakteristisk(e) Mr-værdi(er), når de analyseres ved natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-gelelektroforese (herefter "SDS-PAGE"). Med "polypeptidkompleks" menes herefter et koaguleringsmiddel indbefattende kombinationer af to eller flere polypeptider, der vides at være fysisk adskilte, men også 20 præparater, der kun indeholder ét skelneligt polypeptid, dvs. et, der udviser et bånd ved en Mr på ca. 92.000.

Nedenstående beskrivelse, der viser fremstillingen af koaguleringsmidlet ifølge patentkravene, anvender human faktor VIII:C, der er blevet højt renset for at befri identifikatio-25 nen og karakteriseringen af det hidtil ukendte produkt for uvedkommende polypeptiders virkning. Det bør dog erkendes, at opfindelsen i sig selv ikke er afhængig af, hvordan udgangsmaterialet i forvejen er blevet behandlet, undtagen hvor det specifikt anføres. De aktive faktor VIII:C-polypeptider iføl-30 ge den foreliggende opfindelse kan ikke blot fremstilles ved digestion med thrombin som beskrevet i flere detaljer nedenfor eller med andre lignende virkende proteaser, såsom faktor Xa, faktor IXa eller Russell's hugormegift-V, men også ved 5 DK 172036 B1 rekombinant-DNA-teknikker, hvori de polypeptider, der har interesse, fremstilles af bakterier, gær eller andre celler, i hvilke et eller flere gener til fremstilling af de polypeptider, der har interesse, indsættes ved hjælp af teknikker, 5 der kendes af fagmanden inden for området. En hvilken som helst fremgangsmåde til fremstilling af det kompleks, der har interesse, kan forventes at føre til komplekset i en blanding med et eller flere andre polypeptider.

Ethvert plasma eller plasmakoncentrat indeholdende human fak-10 tor VIII:C kan med fordel anvendes. Det hidtil ukendte koaguleringsmiddel kan fremstilles fra human faktor VIII:C, der er blevet ultraoprenset i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet i US-patent nr. 4.361.509, hvilken beskrivelse inkorporeres heri ved henvisning dertil. Ved denne fremgangsmå-15 de føres en kilde af faktor VIII:C, såsom plasma eller et plasmakoncentrat, gennem en immunoadsorbentkolonne, hvortil er blevet fæstnet monoklone antistoffer over for faktor VIII:R. Faktor VIII:R/VIII:C-komplekset adsorberes på kolonnen, og derefter elueres faktoren VIII:C og føres gennem en 20 anden kolonne, såsom aminohexylagarose. Det skal noteres, at den anden kolonne også kan være en immunoadsorbent indeholdende antistoffer over for faktor VIII:C. Faktoren VIII:C bør holdes fri for Gf-thrombin og andre proteaser. Faktoren VIII:C opbevares passende i en saltholdig pufret opløsning indehol-25 dende f.eks. 0,3M calciumchlorid ved en pH-værdi på ca. 6,8 til ca. 7,4.

Den humane faktor VIII:C digesteres derefter med a-thrombin under betingelser, der er effektive til at danne polypeptid-komplekset beskrevet nedenfor. Den rensede α-thrombin kan 30 fremstilles ved fremgangsmåden beskrevet af Fenton, J.W. II, Fasco, M.J, Stackrow, A.B., Aronson, D.L., Young, A.M. og Finlayson, J.S. "Human Thrombin. Production, Evaluation, and Properties of α-Thrombin". J. Biol. Chem. 3587-3598 (1977).

DK 172036 Bl 6 α-thrombinen og faktoren VIII:C kombineres i et vandigt system, fortrinsvis pufret ved en pH-værdi på ca. 6,8 til ca.

7,4. Thrombinen bør være til stede i en mængde i forhold til faktor VIII:C, der er tilstrækkelig til at muliggøre reaktion 5 med faktoren VIII:C, men ikke så stor en mængde, at faktoren VIII:C nedbrydes til inaktive polypeptider, før det ønskede aktive polypeptidkompleks kan udvindes. Som en illustration bør et præparat indeholdende 200-400 enheder (0,2 mg/ml) af faktor VIII:C pr. ml digesteres med ca. 0,1 til ca. 0,5 enhe-10 der/ml a-thrombin. Digestionen kan foregå ved stuetemperatur.

For høj en temperatur kan denaturere polypeptiderne, og en for lav temperatur kan retardere digestionsudviklingen.

Digestionen får lov til at fortsætte i et tidsrum, der er langt nok til at muliggøre dannelse af det ønskede polypep-15 tidkompleks. Det optimale tidsrum vil være fra 0,1 til ca. 60 min., fortrinsvis et tidsrum fra 0,1 til 30 min. Tidsrum fra 1 til 10 min. har vist sig meget tilfredsstillende, skønt det må erkendes, at optimale tidsrum kan identificeres med minimal eksperimentation under anvendelse af aliquoter af det 20 faktor VIII:C-udgangsmateriale, der skal behandles. Et optimalt tidsrum er et, i hvilket der dannes den maksimale mængde af det polypeptidkompleks, der udviser en Mr på ca.

92.000 fulgt af dannelsen af et proteinkompleks udvisende en Mr-dublet på ca. 79.000 og ca. 80.000 uden signifikant ned- 25 brydning af Mr-92.000-polypeptidet. Mr-79.000-80.000-dubletten kan muligvis fungere, efter at den har undergået nedbrydning til et kompleks, der udviser en dublet ved Mr-værdier på 71.000 - 72.000. 71.000-72.000-dubletten alene udviser ikke faktor VIII:C-aktivitet.

30 Digestionen afbrydes derefter ved at sætte en effektiv mængde (p-amidinophenyl)methansulfonylfluorid (herefter "p-APMSF") eller en anden thrombininhibitor til reaktionsblandingen. p-APMSF forhindrer or-thrombinen i at reagere yderligere med faktor VIII:C-proteinerne uden selv at nedbryde disse protei-35 ner. Den mængde p-APMSF, der skal tilsættes, bør udgøre ca.

7 DK 172036 B1 1,5 til ca. 2,5 mmol pr. α-thrombinaktivitetsenhed, der oprindeligt var til stede i reaktionsblandingen.

p-APMSF kan fås fra California Medicinal Chemistry Company,

San Francisco, Californien, og fremstillingen deraf er be-5 skrevet i Laura, R., Robinson, D.J. og Bing D.H. "(p-amidino-phenyl)methanesulfonyl Fluorid, an Irreversible Inhibitor of Serine Proteases", Biochemistry (1980) 19, 4859-4864, ved 4861.

Reaktionsblandingen kan derefter behandles for at koncentrere 10 polypeptidkomplekset, der udgør den foreliggende opfindelse. Fortrinsvis koncentreres polypeptidkomplekset med hensyn til andet faktor VIII- og ikke-faktor VIII-proteinholdigt materiale for at tilvejebringe komplekset i en form, der giver den meget høje aktivitet, som komplekset besidder i oprenset 15 form. Oprensningsteknikker omfatter f.eks. ultrafiltrering, ultracentrifugering, ionbytning, gelpermeationskromatografi, præparativ elektroforese, isoelektrisk fokusering og gel- og affinitetskromatografi.

Det ønskede kompleks kan også koncentreres og/eller udvindes 20 ved at føre reaktionsblandingen, som allerede kan være blevet koncentreret ved hjælp af en anden metode, gennem en immuno-adsorbentkolonne indeholdende anti-human VIII:C-antistoffer eller andre end humane ækvivalente antistoffer mod VIII:C, og som reagerer med kompleksets polypeptid(er). Antistofferne 25 fæstnes til agarose (se eksempel 1 nedenfor). Adskillige antistoffer, der kan anvendes til at koncentrere komplekset og/eller isolere visse af polypeptiderne deraf, er beskrevet nedenfor. Det aktive VIII:C-kompleks adsorberer fortrinsvis til kolonnen og elueres derefter fra kolonnen med en opløs-3 0 ning af calciumioner (f.eks. CaCl2) , der valgfrit også kan indeholde et ikke-ionogent overfladeaktivt stof. Egnede ik-ke-ionogene overfladeaktive stoffer omfatter alkylphenyl-polyoxyethylener, såsom "Triton"-X-100, -N-101 eller -X-405 (Eastman Chemical Company), "Tween"-20, -60 eller -80 (Sigma

Chemical Company) og "Nonidet" P-40 (Sigma Chemical Company).

Alle disse er velkendte handelsvarer, der har kendte kemiske formler.

DK 172036 Bl 8

De mængder calciumioner og overfladeaktive stoffer, der skal 5 anvendes, bør være tilstrækkeligt store til at desorbere po-lypeptidkomplekset, men ikke så store, at elueringsmidlet inaktiverer polypeptider. En calciumionkoncentration på op til ca. 0,5 M eller endda op til 1,0 M er tilfredsstillende, og 0,25 M foretrækkes. En koncentration af overfladeaktivt 10 stof på op til ca. 1 vægt% er tilfredsstillende, og ca. 0,1 vægt% foretrækkes. Elueringsmidlet påføres immunoadsorbent-kolonnen med ca. 1 til ca. 8 lejevolumener pr. time og fortrinsvis ca. 3-4 pr. time. Ved for høj strømningshastighed risikerer man opsplitning af kolonnen og ikke-absorption af 15 polypeptidkomplekset. Den praktiserende fagmand vil nemt tilpasse disse retningslinier til andre immunoadsorbentfremgangsmåder end kolonner med fast leje.

VIII:C-polypeptidkomplekset udvindes i en passende puffer ved en pH-værdi på ca. 6,8 til 7,4, der også indeholder calciumi-20 on og overfladeaktivt stof fra elueringsmiddelopløsningen. Calciumkoncentrationen og koncentrationen af overfladeaktivt stof kan sænkes, og fortrinsvis fjernes det overfladeaktive stof, f.eks. ved dialyse af opløsningen mod en puffer, såsom VIII:C-pufferen, der er anvendt i eksempel 1, og som indehol-25 der en lavere mængde calciumion. Komplekset ifølge opfindelsen kan opbevares i denne opløsning eller lyofiliseres. Komplekset kan administreres til patienter med hæmophiliske forstyrrelser ved blodkoagulation ved at justere calciumindholdet til at være fysiologisk forligeligt og injicere en steril 30 saltopløsning deraf.

Ved analyse på SDS-PAGE, som vist nedenfor, udviser koaguleringsmidlet ifølge denne opfindelse en Mr på ca. 92.000 og kan sædvanligvis indeholde materiale, der udviser en Mr-dub-let på ca. 79.000 og ca. 80.000, hvoraf nogle kan have under- 9 DK 172036 B1 gået nedbrydning til udvisning af en Mr-dublet på ca. 71.000 og 72.000. I oprenset form er dette bånd eller den gruppe af disse bånd i alt væsentligt de eneste bånd, der kommer til syne. Faktor VIII:C-koaguleringsmidlet ifølge opfindelsen kan 5 indgå i biologiske præparater, i hvilke mindre end 100%, dvs.

95%, 90% eller endda 80%, 70% eller 60% eller endda så lidt som 30%, 20%, 10% eller 1% af det tilstedeværende protein- holdige materiale omfatter koaguleringsmidlet ifølge den foreliggende opfindelse. I sådanne præparater skyldes faktor 10 VIII:C-aktiviteten tilstedeværelsen af koaguleringsmidlet.

Proteinkomplekset ifølge den foreliggende opfindelse besidder en specifik VIII:C-koagulerende aktivitet (dvs. aktivitet pr. mg af total tilstedeværende protein) , der er højere end den, der udvises af oprenset human faktor VIII:C, f.eks. human 15 faktor VIII :C, der er oprenset ved fremgangsmåden, som beskrevet og angivet i patentkravene i det førnævnte US patent nr. 4.361.509. Aktiviteten af det rensede kompleks skulle i virkeligheden være flere gange, f.eks. 3-5 gange, større end den for oprenset human faktor VIII:C og er fordelagtigt 20 mindst 10 gange eller endda 50 gange så aktiv. På samme måde kan der fremstilles biologiske præparater, indbefattende komplekset ifølge den foreliggende opfindelse i forbindelse med et eller flere andre proteiner, som udviser større specifik aktivitet end den, der opnås i hidtil kendte koagulerings-25 middelpræparater. Den specifikke aktivitet af komplekset og af biologiske præparater indeholdende dette er større end 1800 enheder/mg, fordelagtigt større end 5400 enheder/mg og overskrider i mere fordelagtige udførelsesformer 7500 eller endda 10.000 enheder/mg. Fortrinsvis overskrider den speci-30 fikke aktivitet af præparaterne ifølge opfindelsen den for den oprensede humane faktor VIII:C, der er anvendt heri, med en faktor 3-5 og mere fordelagtigt mindst 10 gange eller 50 gange eller endda 100 gange.

Proteinkomplekset ifølge den foreliggende opfindelse og bio- 35 logiske præparater deraf karakteriseres ved, at den forøgede 10 DK 172036 B1 aktivitet beskrevet nedenfor forbliver til stede over en kontinuert periode på mindst ca. 10 min. og fortrinsvis mindst ca. 30 min. Aktiviteten vil selvsagt sædvanligvis være stabil meget længere. Komplekset besidder også de immunologiske ka-5 rakteristika for et faktor VIII:C-protein, dvs. det binder til et antistof over for human faktor VIII:C. Dette kan man f.eks. forvisse sig om ved at dyrke et monoklont antistof over for faktor VIII:C, som beskrevet nedenfor, knytte antistoffet til en agarosekolonne, føre en vandig opløsning af 10 komplekset gennem kolonnen og undersøge den resulterende opløsning for faktor VIII:C-aktivitet.

En yderligere ønskelig egenskab ved denne opfindelse er, at polypeptiderne med Mr = 92.000 og Mr = 79.000-80.000 er stabile i forhold til naturlig human faktor VIII:C, der, som det 15 er almindeligt kendt, er påvirkelig over for proteolyse, nedbrydning og resulterende tab af koaguleringsmiddelaktivitet. Denne stabilitet demonstreres af polypeptidernes evne til at overleve behandlingstrinnene beskrevet heri.

Eksempel 1 20 Dette eksempel viser, hvordan faktor VIII:C blev oprenset fra et kommercielt koncentrat og digesteret med oprenset a-thrombin.

Et monoklont antistof over for faktor VIII:C blev fremstillet og anvendt til at identificere VIII:C-polypeptider. På flere 25 udvalgte punkter under digestionen blev portioner af digestionsblandingen undersøgt for VIII:C (koaguleringsmiddel) -aktivitet og for proteinbånd under anvendelse af SDS-PAGE.

Oprensning af VIII:C. Alle trin foregik ved stuetemperatur. Kemikalierne havde analysekvalitet. 40 flasker kommmercielt 30 faktor VIII-koncentrat (fra Armour Pharmaceutical) blev gen-fortyndet i 1000 ml VIII:C-puffer (0,02M imidazol/ 0,15M na-triumchlorid/0,1M L-lysin HCl/0,02% natriumazid, pH 6,8).

11 DK 172036 B1

Denne prøve, der i alt indeholdt 17.000 enheder VIII:C-akti-vitet, påførtes en immunoadsorbent-kolonne med 2,5-3,0 liter lejevolumen. Kolonnen var cyanogenbromid-aktiveret agarose ("Sepharose" 4B, Pharmacia, Piscataway, New Jersey), hvortil 5 monoklone antistoffer over for VIII:R var blevet bundet covalent . Antistofferne blev dyrket og knyttet til kolonnen som beskrevet i det førnævnte US patent nr. 4.361.509. Antistofferne blev udfældet fra ascites-væske under anvendelse af 50% ammoniumsulfat, genudfældet to yderligere gange og derefter 10 knyttet til kolonnen med en densitet på 2-4 mg/ml "Sepharose". Immunoadsorbenten blev præelueret med 3M natriumthiocya-nat, vasket med VIII:C-puffer (0,02M imidazol HCl pH 7,0, 0,15M NaCl, 0,1M L-lysin-HCl, 0,02% natriumazid) og behandlet to gange med 2mM diisopropylfluorphosphat, hvorefter koncen-15 tratet blev tilsat.

Kolonnen blev vasket med 20 liter VIII:C-puffer indeholdende 0,15M natriumchlorid, og VIII:C blev derefter elueret fra VIII:R med VIII:C-puffer indeholdende 0,35M calciumchlorid.

De aktive fraktioner blev samlet og koncentreret under nitro-20 gentryk 100 gange i en omrørt Amicon-celle med en YMlO-mem-bran. Koncentratet blev derefter elueret 1:10 i VIII:C-puffer og påført en 4 ml kolonne af aminohexyl-"Sepharose" (Pharmacia) ækvilibreret i VIII:C-puffer indeholdende 0,025M calciumchlorid, og VIII:C blev elueret i høj koncentration med 25 VIII:C-puffer indeholdende 0,3M calciumchlorid ved en strømningshastighed på 10 ml/hr. Det koncentrerede immunoadsor-bentforråd blev justeret til 0,25M calciumchlorid og adsor-beret to gange i hver gang 1 time med 1/10 volumen/volumen af en blanding af monoklont anti-fibrinogen, anti-fibronectin og 30 anti-vWF-antistoffer, der var blevet koblet til cyanogenbro-midaktiveret "Sepharose".

Fremstilling af monoklont antistof over for VIII:C. Monoklone antistoffer blev fremstillet som beskrevet i US patent nr. 4.361.509 under anvendelse af oprenset VIII:C som immunogen.

35 Antistofferne blev udvalgt med en fastfaseprøve i Linbro-Ti- 12 DK 172036 B1 tertek (Flow Laboratories, Inglewood, CA-plader og et enzymbundet immunoadsorbent (ELISA) -påvisningssystem, beskrevet i Engval1, E. og Perlmann, P. "Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA), Quantitative assay of immunoglobulin G" Immu-5 nochemistry 8:871-874 (1971)) under anvendelse af peroxida- se-antistof-konjugat (Zymed Laboratories, Burlingame, CA) . Pladerne blev belagt med 100 ng oprenset VIII:C pr. rum. Den overliggende væske med ELISA-positiv kultur af klonen, der var udvalgt til brug i dette forsøg, inhiberede også plasma 10 VIII:C-aktivitet.

Thrombinaktiverinastidsforløbs-analvse af oprenset VIII:C. Oprenset human α-thrombin (specifik aktivitet 2534 enhe-der/mg, endelig koncentration 0,5 enheder/ml) blev sat til den oprensede VIII :C (endelig koncentration 167 /xg/ml) i en 15 imidazolsaltpuffer indeholdende 0,04M CaCl2. Puffer alene blev sat til en kontrolaliquot. Opløsningerne blev inkuberet ved stuetemperatur og med forskellige tidsintervaller blev prøver af VIII:C-thrombinblandingen sat til rør indeholdende p-APMSF (California Medicinal Chemistry Co.) for at inak-20 tivere thrombinen hurtigt og irreversibelt. For at minimali-sere hydrolyse af p-APMSF blev det fortyndet 1:10 fra en stamopløsning (100 mM i methanol) i en imidazol-saltpuffer 60 sek. før reaktion med VIII:C-thrombinprøverne. Den endelige p-APMSF-koncentration var 1 mM. Kontrolaliquoten blev behand-25 let tilsvarende med p-APMSF ved starten af forsøget. Ved slutningen af 60 min. tidsforløbet blev alle VIII:C-prøver undersøgt for VIII:C-aktivitet under anvendelse af en aktiveret delvis thromboplastin-tidsprøve, beskrevet i litteraturen, og blev derefter klargjort til SDS-PAGE.

30 SDS-PAGE 11 fremgangsmåde A11: Afbrudt SDS-polyacrylamid-plade-gelelektroforese blev udført baseret på fremgangsmåden ifølge Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685, 1970. Den fulgte "frem gangsmåde A" er: 13 DK 172036 B1 I. Prøvepræparering 1. Dialyser proteinprøven (ideelt 50-100 mikroliter indeholdende 5-60 mikrogram protein) mod prøvepuffer natten over ved stuetemperatur. Inkluder 10 milli- 5 molær ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i prøvepuf feren såfremt prøven indeholder calciumion.

2. Placer den dialyserede prøve i et rør og tilsæt 1/10 volumen 10% SDS. Dæk røret med aluminiumsfolie. Opvarm prøven i et kogende vandbad i 10 min.

10 3. Fjern prøven fra vandbadet og tilsæt 1/10 volumen 500 millimolær dithiothreitol. Inkuber den ved 56°C i 4 timer.

4. Lad prøven afkøle til stuetemperatur og klargør den til påføring i lag på gelen ved at tilsætte glycerol-15 stamopløsning til 10% endelig koncentration og brom- phenol-blå-farve-stamopløsning til 0,05% endelig koncentration.

II. Tilberedning af gelopløsninger (anvend deioniseret, destilleret vand) 20 1. Glycerol-stamopløsning: 50% glycerol 2. Bromphenol-blå-farve-stamopløsning; 0,5% bromphenolblå 3. Nedre gelstamopløsning; 25 18,2 g Tris-base

4 ml 10% SDS

Endeligt volumen 100 ml.

Juster pH til 8,8 med koncentreret saltsyre. Filtrer.

DK 172036 Bl 14 4. Øvre qelstamopløsninq: 6,1 g Tris-base 4 ml 10% SDS.

Endeligt volumen 100 ml 5 Juster pH til 6,8 med koncentreret saltsyre. Filtrer.

5. Prøveouffer

0,01 M natriumphosphat 1,0% SDS

10 millimolær dinatrium-EDTA 10 Endeligt volumen 1 liter pH justeret til 7,0 med natriumhydroxid eller phos-phorsyre.

6. Acrvlamid-stamopløsning:

Opløs 30 g acrylamid i 50 ml vand og tilsæt 0,8 g 15 bisacrylamid og opløs. Bring opløsning til 100 ml endeligt volumen. Filtrer opløsningen og opbevar den i mørke ved 4°C.

7. Stamelektrode-pufferopløsninq; 30,3 g Tris-base 20 144,1 g glycin

Endeligt volumen 1 liter.

8. Elektrodepuffer 100 ml stamelektrode-pufferopløsning 890 ml vand 25 10 ml 10% SDS.

9. Coomassie-blå-farve-stamopløsning 1% Coomassie-blå R 250 i vand

Opløs med omrøring i mindst 30 min. ved stuetemperatur og filtrer.

30 10. Ammoniumpersulfatopløsninq 10% ammoniumpersulfat 15 DK 172036 B1

Opbevares i mørke ved 4°C og fremstilles frisk hver uge.

III. Geloræparering οσ kørsel: Endelig acrylamidkoncentra- tion = 7,5% 5 1. Nedre gelooløsnina 20 ml nedre gel

Nedre gelstamopløsning 5 ml acrylamid-stamopløsning 5 ml vand 10 ml 10 Ν,Ν,Ν',N'-tetramethylethylendiamin (TEMED) 0,005 ml 10% ammoniumpersulfat 0,1 ml 2. Øvre qelopløsninq 10 ml øvre gel Øvre gelstamopløsning 2,5 ml 15 Acrylamidstamopløsning 0,1 ml vand 6,5 ml Ν,Ν,Ν',N'-tetramethylethylendiamin (TEMED) 0,01 ml 10% ammoniumpersulfat 0,03 ml 3. Fremgangsmåde: 20 a) Klargør pladegelapparaturet til en 14,5 cm x 9,0 cm x 0,8 mm pladegel. Apparaturet er et standard gelelektroforese-apparatur, der f.eks. kan fås fra Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, Californien.

b) Bland alle nedre gelbestanddele undtagen TEMED og ammoni-25 umpersulfat i en 50 ml vakuumkolbe og afluft. Tilsæt der efter TEMED og ammoniumpersulfat, bland forsigtigt og udhæld den nedre gel øjeblikkeligt. Læg den nedre gel som lag med vandmættet butanol og lad den polymerisere uforstyrret i mindst 1 time, fortrinsvis 2-6 timer.

16 DK 172036 B1 c) Hæld butanollaget væk og skyl toppen af den nedre gel med den fuldstændige øvre gelblanding. (Den øvre gelblanding klargøres, afluftes, og TEMED og ammoniumpersulfat tilsættes som for den nedre gel ovenfor).

5 d) Udhæld den øvre gel og indsæt kammen i den øvre gel og lad der være mindst 1,0 cm mellem bunden af kamtændeme og grænsefladen mellem den øvre og den nedre gel. Fyld med den øvre gelopløsning så fuldt som muligt. Lad den øvre gel polymerisere mindst 1 time, før gelen køres.

10 e) Pipetter, for at fjerne kammen, elektrodepuffer over toppen af den øvre gel og fjern forsigtigt kammen. Skyl de øvre gelrum med elektrodepuffer flere gange.

f) Saml apparaturet til kørsel og tilsæt elektrodepuffer. Påfør prøven(erne) ved at lægge den (dem) i lag i de øvre 15 gelrum under pufferlaget.

g) Kør gelen under anvendelse af konstant strøm: 8 milliampere, medens prøverne er i den øvre gel og 15 milliampere, når prøverne er i den nedre gel. Stands e-lektroforesen, når bromphenol-blå-farve-fronten er 1,0 cm 20 fra bunden af den nedre gel.

IV. Fiksering og farvning af gelen

Reference: Fairbanks, G., Steck, T.L. og Wallach, D.F.N., Biochemistry 10, 2606-2617, 1971.

1. Fikser gelen mindst natten over i et forseglet kammer 25 i en opløsning indeholdende 25% isopropanol, 10% ed dikesyre og 10 ml 1% Coomassie-blå-stamopløsning, endeligt volumen 400 ml.

2. Gennemvæd derefter gelen mindst 1 time i 10% isopropanol, 10% eddikesyre og 1 ml 1% Coomassie-blå-stam- 17 DK 172036 B1 opløsning, endeligt volumen 400 ml.

3. Gennemvæd gelen ca. 4 timer i 10% eddikesyre med ændringer eller indtil fuldstændig affarvning.

4. Den affarvede gel kan tørres på filterpapir under an- 5 vendelse af en geltørrer for at forøge kontrast.

Ca. 5-20 g protein blev påført på gelerne. VIII:C-Mr-værdier blev udregnet for reducerede prøver ved semilogaritmiske plot af Mr mod migreringsafstand under anvendelse af reduceret fi-bronectin (Mr 200.000), phosphorylase b (Mr 95.000), bovinser-10 umalbumin (Mr 68.000) og IgG-tung kæde (Mr 50.000) og ovalbumin (Mr 43.000) som standarder. Skanning og integration af et fotografisk tryk af den færdige gel blev udført under anvendelse af et Zeineh blød laser-skanningdensitometer.

Resultater.

15 Den specifikke aktivitet af den oprensede faktor VIII:C var 2000 enheder/mg. Thrombinaktivering af oprenset VIII:C-akti-vitet blev analyseret over et 60 min. tidsforløb. Før udsættelse for thrombin viste den ubehandlede VIII:C-prøve den karakteristiske række af VIII:C-former, der gik fra en dublet 20 ved Mr = 79.000-80.000 til et bånd ved Mr = 188.000. Et bånd over Mr = 188.000 og to bånd under Mr = 79.000 bandt ikke til den monoklone anti-VIII:C-antistof-immunoadsorbent. Båndene mellem Mr = 79.000 og Mr = 188.000 bandt derimod til an-ti-VIII:C-antistoffet.

25 I løbet af de første 5 min. af thrombinaktiveringstidsforløbet forsvandt alle, bortset fra et, af de monoklone anti-VIII :C-antistofreaktive bånd med en Mr større end 92.000 gradvist og kunne ikke påvises, da VIII:C-aktiviteten nåede toppen ved 5 min.

18 DK 172036 B1

Et bånd ved Mr = 122.000 viste sig kun thrombinresistent i nogle forsøg, men efter omfattende thrombinbehandling var hverken dette bånd eller et hvilket som helst andet bånd reaktivt med det immobiliserede monoklone anti-VIII:C-antistof.

5 Et bånd ved Mr = 92.000 forøgedes i intensitet, når VIII reaktiviteten forøgedes. En dublet ved Mr = 79.000 og 80.000 viste sig at blive omdannet til en dublet ved Mr = 71.000- 72.000, hvor den sidste form var dominerende fra 5-60 min., eftersom VIII:C-aktiviteten aftog. To bånd ved Mr = 54.000 og 10 Mr = 44.000 blev klart synlige fra 5-60 min. Mr « 44.000-bån-det kom også til syne som en dublet i nogle forsøg. Mr = 71.000- 72.000-dubletten, Mr « 54.000-båndet og Mr = 44.000 -båndet blev ikke fjernet i væsentlig grad af det immobilise-rede monoklone anti-VIII:C-antistof.

15 Skanning og integration af gelen, diskuteret ovenfor, gav mulighed for en korrelation mellem ændringer i polypeptid koncentration og ændringer i VIII:C-aktivitet. Resultaterne er vist i tabellen. Som vist forøgedes Mr = 92.000-båndet og aftog derefter i koncentration parallelt med VIII:C-aktivite-20 ten. Dette antyder, at Mr = 92.000-båndet er en aktiv form for VIII:C, hvis koncentration forøgedes ved thrombinaktivering. Mr = 54.000- og Mr = 44.000-båndene forøgedes støt i koncentration mellem 1 og 40 min., selv efter at blandingens aktivitet aftog.

25 Det meste af Mr = 79.000-80.000-dubletten blev tabt under de første 0,1-10 min., hvor VIII:C-aktiviteten toppede, medens det meste af Mr = 71.000-72.000-dubletten kom til syne i dette tidsrum og dominerede, selv da VIII .-C-aktiviteten aftog. Disse data antyder, at Mr = 71.000-72.000-dubletten hid-30 rørte fra Mr = 79.000-80.000-dubletten, og at Mr = 71.000- 72.000- dubletten i sig selv er inaktiv. Disse data stemmer overens med Mr = 71.000-72.000-dublettens bevaring af evnen til at danne kompleks med Mr = 92.00 0-polypeptidet. Dette kompleks ville også have aktivitet.

19 DK 172036 B1

Direkte bevis for, at Mr = 92.000-polypeptidet danner kompleks med Mr = 79.000-80.000-dubletten, hidrører fra eksperimenter, der anvender den anti-VIII:C-monoklone immunoadsor-bent. Det blev først vist, at det monoklone antistof overve-5 jende reagerer med Mr = 79.000-80.000-dubletten og ikke med Mr = 92.000-polypeptidet. Dette blev vist ved elektroforetiske overførselseksperimenter. Derefter blev det vist, at den monoklone antiimmunoadsorbent fjernede både Mr = 79.000-80.000-dubletten og Mr = 92.000-polypeptidet fra opløsningen. Mr = 10 92.000-polypeptidet kunne elueres fra anti-VIII:C-immunoad- sorbentkolonnen med 10 mM EDTA, medens Mr = 79.000-80.000-dubletten forblev bundet. Dubletten kunne derefter elueres med 3M natriumthiocyanat. Disse eksperimenter viste, at Mj = 92.000-polypeptidet bandt til immunoadsorbenten, fordi den 15 havde dannet kompleks med Mr = 79.000-80.000-dubletten, og at det var denne dublet, der bandt direkte til immunoadsorbenten.

DK 172036 B1 2 S Ν' m in H r- o ro r~

(N H

5 S <n n« cn t> oo °* ^ > oo n

H H

0 ω r» co oo oo cn ro c*** ^ ** " ** -· rrx V£> 00 CO Η Γ“*

HH

o o ro o t- cn h (N o ' m γ·» cn in o u>

Η H

o w σ\ <f m o in - ,_i (Nj σι oo in σι in

H H

oo o in h r~ o ' i« o Η H in t-' ro

Tji Η Η H

H

in σι <n r- h o ' (\j in h cn cn in ro

O ΓΟ Η Η H

CN H

Η H CN H O

O ..... C

O H VD · H in O -H

ro H H H jQ

η E ri o e u >

£J >H

Η o ιηοοοσιο 4-> <}J

- o i 'O

o cn cn co cn in o 3¾ η Λ U-l c nt <u

* ro σ\ o cn o O

o 2 β "

O σ- H O ^ O -H H

Γ0 CN C M

« >

CD

V C H u

I ·· -H -H -H O

4-> Q 4J d> jj 4J

«HCQ I CUU 4-> .¾

CO -H 2 Η 0) i O

H 4J ft 0) -H Q, tf QX-C

•h< C4J>i4jD< m

4J C I -H H O -H

H ft Ό 4J O Jj d) O) (tf Λ fi >h ft Ό o o

M E Ή (0 d) 14-1 d O O -H <U

won M-liH > CL) <xs di O O iH

Sw (tf Λ in n5 β o · · ο ο -D

D) οι deV>WoocNOO Μ <ϋ • 4-) β D β ήο>>οοογ^οο d)·^ β·Η <U0 ns Μ ε Q> . ι ι Οι -η •HW C 4-1 *Η WO'tJcNCnH^'N· β>

Enj4J -H4J οι η η ιη ^ ·η·η

-- « > 0) Τ3 0) 4-> rH D

01 ffl ·Η d) CnO -— tO II II It II II «β

T3CrH4JdlCd)HrH

-Η -Η -Η Λί -H « 4J 2 -Η H M Vi W W

EH β 4J ^T3 2 01 — Jj 2 2 2 2 2 * in 0 in

rH rH

21 DK 172036 B1

Eksempel II

Dette eksempel beskriver resultaterne af at behandle oprenset human faktor VIII:C med oprenset human aktiveret protein C (herefter "APC"), et kendt antikoagulerende enzym. Human fak-5 tor VIII:C blev oprenset som beskrevet ovenfor. APC blev oprenset ved fremgangsmåden beskrevet i Marlar, R.A. et al., "Mechanism of action of human activated protein C, a-throm-bin-dependent anticoagulant enzyme". Blood, bind 59, 1067 (1982) , bortset fra, at der blev anvendt en mono S kolonne 10 fra et Pharmacia FPLC-system til at separere APC fra thrombin.

Forsøg: Prøver blev undersøgt for VIII:C-aktivitet, som beskrevet ovenfor, under anvendelse af et aktiveret delvis thromboplastin-tidsforsøg med hæmophili A plasmasubstrat.

15 Præparerina af prøver til elektroforese: Eftersom der kræves calciumioner til APC-aktivitet, blev APC standset på forskellige tidspunkter ved tilsætning af 1/10 volumen 100 mM EDTA indeholdende 10 μΜ DAPA til VIII:C + APC-aliquoter samt til kontrol VIII:C- og APC-aliquoter. 1/10 volumen 10% natrium-20 dodecylsulfat blev derefter sat til disse aliquoter. De blev derefter opvarmet i et kogende vandbad i 5 min. og derefter dialyseret for SDS-PAGE, som beskrevet ovenfor.

Afbrudt natriumdodecylsulfat 7,5% polyacrylamid-gelelektro-forese (PAGE) af reduceret VIII:C, farvning med Coomassie-blå 25 R250 og skanning og integration af gelen foregik som beskre vet ovenfor.

Prøvepræparering: En 39 μg prøve af VIII :C i 0,3 ml VIII :C-puffer indeholdende 0,3 M calciumchlorid blev dialyseret natten over mod puffer (50 mM Tris-chlorid, 0,15 M natriumchlo-30 rid, 5 mM calciumchlorid, 0,02% natriumazid, pH 7,4). Til den dialyserede VIII:C-prøve sattes 1,095 ml puffer, 90 μΐ kanin-hjernecephalin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MD, genopløst, 22 DK 172036 B1 opbevaret og optøet ifølge producentens instruktioner) og 15 μΐ 1 mM dansylarginin-N-(3-ethyl-l,5-pentandiyl)amid (DAPA) for at give en endelig DAPA-koncentration på 10 μ . DAPA'et blev inkluderet for at inhibere alle spormængder af tilstede-5 værende thrombin i APC, eftersom 10 μΜ DAPA ikke inhiberer APC signifikant. Det endelige volumen af prøven var 1,5 ml, og den endelige VIII:C-koncentration var 226 μg/ml. 400 μΐ af den 1,5 ml store VIII:C-prøve blev taget fra og sat til side som en kontrol (benævnt VIII:C). Til de resterende 1,1 ml 10 blev sat 20 μΐ (10 μg) APC, hvilket gav en endelig APC-kon-centration på 9 μg/ml (betegnet VIII:C + APC). En anden kontrolprøve, indeholdende alle bestanddele med tilsvarende koncentrationer, bortset fra at VIII:C blev udeladt (betegnet APC), blev klargjort.

15 Tidspunkter: VIII:C alene, blandingen af VIII:C og APC, og APC alene blev placeret i et 37°C vandbad, og på givne tidspunkter blev aliquoter taget fra til SDS-PAGE og/eller VIIII:C-aktivitetsforsøg. Det blev også påvist i en kontrol, at APC forblev aktiv ved hydrolysen af det syntetiske sub-20 strat S-2238 efter langvarig inkubation ved 37°C.

Resultater: Digestion af oprenset VIII:C med APC var forbundet med tab af ca. 85% af kontrol-VIII:C-aktiviteten. APC-in-aktivering af VIII:C-aktivitet resulterede i formindskelse af alle VIII:C-polypeptider med Mr mellem 92.000 og 188.000 og 25 dannelse af et polypeptid med Mr = 45.000, medens dubletten ved Mr = 79-80.000 forblev intakt.

En tidsforløbs-inaktivering af oprenset VIII:C med APC viste den progressive fjernelse af specifikke VIII:C-polypeptider, medens VIII:C-aktiviteten formindskedes over et 360 min.

30 tidsforløb. Skanning og integration af gelen viste, at polyp-eptidet med Mr = 188.000 og polypeptidet med Mr = 92.000 af tog parallelt med VIII:C-aktivitet.

23 DK 172036 B1

Et andet polypeptid med middel Mr blev spaltet af APC, men det var ikke så nemt at bestemme kvantitativt ved gelskanning. I dette forsøg var nogle VIII:C-polypeptider med Mr = 92.000-188.000, i modsætning til digestion med APC, resi-5 stente over for APC-digestionen. Dublet-polypeptidet med Mr » 79-80.000 blev dog, som ved digestion med APC, ikke proteoly-seret af APC.

Et polypeptid med Mr = 45.000 viste sig at forøges i koncentration, efterhånden som polypeptiderne med Mr = 188.000 og 10 92.000 aftog, hvilket antyder, at det er et proteolytisk fragment hidrørende fra disse. Ingen andre digestionsprodukter kunne iagttages med Coomassie-blå.

Som vist i eksempel 1 forøgedes Mr = 92.000-polypeptidet under thrombinaktivering af VIII:C og aftog parallelt med 15 VIII:C-aktiviteten. For at fastslå om der eksisterede et lineært forhold mellem proteolyse af polypeptidet med Mr = 92.000 og tabet af VIII:C-aktivitet, blev dataene fra denne tidsforløbsinaktiveringskørsel atter plottet for at undersøge procent VIII:C-aktivitet mod procent polypeptid med Mr = 20 92.000. Mængden af VIII:C-aktivitet viste sig at være propor tional med mængden af polypeptid med Mr = 92.000.

Monoklonale antistoffer, som er egnede ved udvinding af koaguleringsmidlet ifølge opfindelsen, er specifikke i en uforudsigelig måde over for de forskellige polypeptider, der dan-25 nes ved reaktionen mellem faktor VIII:C og en protease, såsom α-thrombin. Hvert antistof reagerer med human faktor VIII :C, der ikke er blevet aktiveret eller digesteret med thrombin eller tilsvarende proteaser. I en udførelsesform for opfindelsen udviser de monoklonale antistoffer en af de følgende 30 bindingsprofiler med polypeptider, som hidrører fra human faktor VIII:C: (A) Binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på 92.000, a DK 172036 Bl 24 108.000 og 44.000, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke udviser en dublet på Mr = 79.000 - 80.000 eller sådanne, som udviser en dublet på Mr = 71.0000 - 72.000; 5 (B) Binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på 92.000, 2 108.000 og 54.000, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke udviser en dublet på Mr = 79.000 - 80.000, eller sådanne, som 10 udviser en dublet på Mr = 71.000 - 72.000; (C) Binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke udviser en dublet på Mr = 79.000 -

80.000 og 2 108.000-polypeptider, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C

15 hvilke har en molekylvægt på 44.000, 54.000, 92.000, og polypeptider, som udviser en dublet på Mr = 71.000 - 72.000; (D) Binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på 2 108.000, men 20 ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på mindre end 108.000; hvori molekylvægtene bestemmes ved at underkaste polypepti-derne SDS-PAGE under reducerende betingelser.

25 Hvert af disse antistoffer kan anvendes til at koncentrere komplekset beskrevet ovenfor fra blandinger, der også indeholder andre polypeptider. En sådan blanding fremstilles ved delvis digestion af human faktor VIII:C med α-thrombin eller en tilsvarende protease. En anden sådan blanding er en sådan, 30 der fremstilles ved rekombinant-DNA-teknikker, hvori et ønsket polypeptid eller -kompleks udtrykkes af en mikroorganisme og må genvindes fra en blanding med andre proteinholdige DK 172036 Bl 25 forbindelser. Antistof (A) , (B), (C) eller (D) eller en kom bination af to, tre eller alle disse kan knyttes til en immu-noadsorbentkolonne på den i eksempel 1 beskrevne måde, hvorefter en fødeopløsning af blandingen indeholdende polypepti-5 det(erne) indbefattende komplekset hældes gennem kolonnen. De polypeptider, der har Mr-værdier på 92.000, 79.000-80.000 og 71.000- 72.000, og som er til stede i fødeopløsningen, adsor-beres på kolonnen, hvorfra de kan elueres, som fortalt ovenfor, efter at kildeopløsningen er blevet vasket gennem kolon- 10 nen. Den resulterende eluerede opløsning koncentreres derved i det ønskede aktiverede VIII:C-kompleks i sammenligning med fødeopløsningen.

De hidtil ukendte antistoffer er også nyttige til analytiske formål til påvisning af forekomsten af reaktionen mellem 15 human VIII:C og thrombin eller andre proteaser på grund af deres evne til at reagere med produkter fra denne reaktion.

Et antistof med profil (B) og et antistof med profil (C) har vist sig at neutralisere VIII:C-koaguleringsmiddelaktivitet, når et af dem er bundet til faktor VIII:C. Denne yderligere 20 egenskab kan være af værdi ved diagnose af forstyrrelser, der har forbindelse med hæmophili.

Opdagelsen af disse antistoffer muliggør også yderligere karakterisering af bestanddelene af det heri beskrevne polypep-tidkompleks. Således indeholder det polypeptid, der udviser 25 et bånd ved Mr = 92.000 (mindst) to epitoper (dvs. antistof-bindingssteder), som ikke ødelægges ved thrombindigestion, og som ikke er til stede på de polypeptider, der udviser dubletten ved Mr = 79.000-80.000 og heller ikke ved dubletten med My = 71.000-72.000.

30 En af disse epitoper er også til stede på polypeptidet med Mr = 44.000 og den anden på polypeptidet med Mr = 54 000. Mj. = 54.000- og Mr = 44.000-polypeptiderne hidrører således fra = 92.000-polypeptidet. Mr * 92.000- og Mr = 79.000-80.000-po-lypeptiderne hidrører også fra et fælles forstadium eller 26 DK 172036 B1 forstadier. Opdagelsen af antistoffer med profil (B) og profil (C), der begge neutraliserer faktor VIII:C-koagule-ringsmiddelaktivitet, er yderligere understøttelse for, at Mr = 92.000- og Mr = 79.000-80.000-polypeptiderne er vigtige for 5 den koagulerende funktion. De polypeptider, der udviser en dublet med Mr = 79.000-80.000, indeholder en epitop, der ødelægges ved thrombindigestion, og som ikke er til stede på polypeptidet med Mr = 92.000.

Disse monoklone antistoffer kan fremstilles ved de sædvanlige 10 trin til oprensning af human faktor VIII:C, dyrkning af monoklone antistoffer over for den oprensede VIII:C, delvis digestion og aktivering af oprenset VIII:C til fremstilling af polypeptidkomplekset beskrevet ovenfor, herunder identifikation af de specifikke polypeptider, reaktion mellem anti-15 VIII:C-antistofferne og produkterne fra aktiveringen, og karakterisering af et antistof ved identifikation af polypeptidet (erne), med hvilke(t) det har reageret. Denne sekvens er anført i flere detaljer i eksempel III nedenfor. Alternativt kan man fremstille et antistof ved at isolere det bestemte 20 polypeptid, der har interesse, fra produkterne fra den delvise thrombindigestion, f.eks. ved immunoadsorption på og derefter eluering fra en kolonne omfattende agarose, hvortil er koblet et monoklont antistof, der vides at reagere med det polypeptid, der har interesse, og derefter dyrke et monoklont 25 antistof over for dette polypeptid under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i eksempel III.

BVaemnel TTT

Monoklone antistoffer over for human faktor VIII:C blev dyrket under anvendelse af den følgende fremgangsmåde med ud-30 gangspunkt i højt oprenset VIII:C, der var blevet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge US patent nr. 4.361.509.

Mus blev injiceret med højt oprenset faktor VIII:C ifølge den følgende fremgangsmåde. På dag nul blev musene injiceret in- 27 DK 172036 B1 traperitonealt med et middel, der var fremstillet ved at opløse (eller suspendere) 10 μg af proteinet i 0,1 ml puffer indeholdende 0,05 M Tris, 0,15 M natriumchlorid, 0,02% natri-umazid, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, trasylol 10 en-5 heder/ml ved pH-værdi 7,3 og ryste med det samme volumen Freund's komplette hjælpestof. På dag 14 blev musene igen injiceret med det samme materiale, bortset fra at Freund's komplette hjælpestof var substitueret med Freund's ufuldstændige hjælpestof. På dag 21 blev injektionen fra dag 14 genta-10 get. På dag 38 blev kun musene injiceret med kun oprenset VIII:C. På dag 42 blev musenes milt fjernet og sammensmeltet ifølge en standardfremgangsmåde af typen beskrevet af J.P. Brown et al., "Protein Antigens of Normal and Malignant Human Cells Identified by Immunoprecipitation with Monoclonal Anti-15 bodies", Journal of Biological Chemistry, bind 225, side 4980-4983 (1980). Standardteknikken blev kun varieret i den grad, at 50% polyethylenglycol blev substitueret med 35% po-lyethylenglycol 1000.

Antistofferne blev udvalgt under anvendelse af forsøgsfrem-20 gangsmåden beskrevet ovenfor i eksempel l i afsnittet med overskriften "Fremstilling af monoklont antistof over for VIII:C" bortset fra, at antistoffer, som ikke neutraliserede VIII:C-aktivitet, også blev subklonet og behandlet som beskrevet nedenfor.

25 De kloner, der var positive, blev subklonet to gange, og stabile kloner, der dannede antistoffer over for VIII:C, blev derefter injiceret i de peritoneale kaviteter fra Balb/C-mus, der var blevet forbehandlet intraperitonealt med 0,5 ml pri-stan mindst fire dage før injektion af celler. Hybridomacel-3 0 ler blev injiceret med koncentrationer på ca. 5 x 106 celler pr. mus i 0,5 ml Delbecco's modificerede Eagle's medium uden føtal bovinserum. Musene blev tappet, da de var svulmet op, og ascitesvæske blev opsamlet i heparin med ca. 10 enheder/ml. Ascitesvæske fra flere mus blev opsamlet for at til-35 vejebringe et passende volumen til efterfølgende isolation af 28 DK 172036 B1 det monoklone IgG. Antistofferne blev udfældet fra ascitesvæ-ske under anvendelse af 50% ammoniumsulfat og derefter genud-fældet to yderligere gange. De således dyrkede anti-VIII:C-antistoffer, svarende til (B), (C) , (D) ovenfor, blev bundet 5 til agaroseperler og viste sig at binde oprenset VIII:C fra opløsningen.

Separate charger af VIII:C, én ubehandlet og én udsat for thrombinproteolyse, blev derefter analyseret ved SDS-PAGE-trinnene beskrevet i eksempel 1. Derefter blev hvert bånd 10 overført elektroforetisk (Western-overførsler) fra gelen til en nitrocelluloseplade. Det anvendte apparatur var Bio-Rad "transblot"-celle og Bio-Rad model 160.1.6 strømfordelingsenhed (BioRad Laboratories, Richmond, Californien). Overførselspufferen var 25 mM Tris med glycin tilsat til pH 8,3, 20% 15 methanol. Overførslerne blev udført over 16-24 timer ved 90 V og 100 milliampere.

De specifikke polypeptider, med hvilke hvert af antistofferne reagerede, blev bestemt under anvendelse af en fremgangsmåde, der var tilpasset fra W.M. Burnette, "Western Blotting: Elec-20 trophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radio-graphic Detection with Antibodies and Radioiodinated Protein A", Analytical Biochemistry, bind 112, side 195-203 (1981).

"Puffer D" var 10 mM Tris-chlorid, 0,15 M NaCl, 0,02% natri-25 umazid, pH 7,4. All reaktioner blev udført ved stuetemperatur.

1. Placer nitrocellulosepladen med det overførte protein i en bakke indeholdende 100 ml puffer D og 0,25% gelatine. Placer bakken på en rotationsryster og ryst langsomt i 30 30 min.

2. Tilsæt derefter det monoklone antistof til bakken (enten 0,1%-1% ascitesvæske eller 1 mg oprenset IgG). Ryst i 120 29 DK 172036 B1 min.

3. Vask nitrocellulosepladen som følger: (a) 10 min. med 100 ml puffer D.

(b) 30 min. med 100 ml puffer D og 0,05% "Nonidet"- 5 P-40 med ændringer ved 10 og 20 min.

(c) 10 min. med 100 ml puffer D.

4. Gennemvæd nitrocellulosepladen i puffer D samt 0,25% gelatine og I125-mærket oprenset kanin-anti-muse-IgG i 30 min.

10 5. Vask nitrocellulosepladen som følger: (a) 10 min. med 100 ml puffer D.

(b) 16-24 timer med 100 ml puffer D samt 0,1% "Noni-det"-P-40 og 0,5 M NaCl.

(c) 10 min. med 100 ml puffer D.

15 6. Aftryk nitrocellulosepladen mellem to plader filterpapir og opbevar derefter nitrocellulosepladen i en forseglet plastsæk.

7. For at bestemme,hvilke antistoffer og polypeptider, der har reageret: 20 (a) fremstil en autoradiograf af nitrocelluosepladen under anvendelse af standardfremgangsmåder, der kendes i litteraturen.

(b) sammenlign autoradiografen med en nitrocel luloseplade, hvortil VIII:C var blevet overført, 25 men som var blevet farvet med Coomassie-blå R250 i stedet for at være blevet omsat med monoklont antistof.

Disse trin viste, at følgende forskellige antistoffer var blevet dyrket.

30 DK 172036 B1

Fire antistoffer reagerede med polypeptidet med Mr = 92.000,

Mr = 108.000 og større polypeptider, det ene eller det andet af polypeptiderne med Mr = 54.000 eller 44.000, der var til stede i de endelige thrombindigestionsprodukter, og ingen 5 andre polypeptider. Dette viser disse sidste to polypeptiders oprindelse fra polypeptidet med Mr = 92.000 som resultatet af thrombinspaltning. Det viser også, at to epitoper på Mr = 92.000-polypeptidet overlever denne spaltning, og at disse epitoper ikke er til stede på Mr = 79.000-80.000-dubletten.

10 Et femte antistof reagerede med dubletten med Mr = 79.000- 80.000 og med polypeptidet med Mr = 108.000 og større, men ikke med polypeptidet med Mr = 92.000 og heller ikke med nogen af de polypeptider, der var til stede i de endelige thrombindigestionsprodukter. Dette viser, at Mr = 79.000- 15 80.000 dubletten besidder en epitop, der ikke er til stede på

Mr = 92.000-polypeptidet, og at epitopen ødelægges ved throm-bindigestion af Mr = 79.000-80.000-dubletten.

Reaktionsprofilerne for disse fem antistoffer antyder, at Mr = 92.000- og Mr = 79.000-80.000-polypeptiderne hidrører fra 20 et fælles forstadium eller forstadier.

Et sjette antistof reagerede kun med polypeptider med Mr = 108.000 og større. Eftersom det ikke reagerede med nogen af de polypeptider, der var til stede i de endelige thrombindigestionsprodukter, ødelægges den epitop, med hvilken det rea- 25 gerede, ved thrombindigestion.

For at fremstille og lagre et biologisk præparat af et eller flere af disse antistoffer kan den tilsvarende monoklone IgG isoleres fra hepariniseret opsamlet ascitesvæske umiddelbart efter opsamling, eller en frossen del af den lagrede opløs-30 ning kan optøs. Hvadenten der anvendes frisk eller frosset materiale, bringes opløsningen til 4°C og behandlet med samme volumen phosphatpufret saltopløsning (PBS) (PBS: 1,6 g natri-umphosphat, monobasisk monohydrat, 8,4 g natriumphosphat, 31 DK 172036 B1 dibasisk, vandfrit, 61,4 g natriumchlorid, vand til 7 liter, pH = 7,2). Den fortyndede ascites udfældes ved dråbevis tilsætning med omrøring ved 4°C. Centrifugeringer udføres fortrinsvis ved 14.000 omdrejninger/min. i 60 min. (30.000 x g).

5 Den overliggende opløsning af ascites udfældes to yderligere gange med SAS, og blandingen af bundfald og overliggende væske omrøres og centrifugeres på samme måde som i den første cyklus. De "piller", der resulterer fra den tredje udfældning, resuspenderes i et volumen PBS, der er lig med det for 10 den fortyndede ascitesvæske og dialyseres derefter grundigt mod PBS. Pletter, der kommer til syne i dialysesækkene, fjernes ved centrifugering ved 20°C. Den dialyserede IgG adsor-beres ved at omrøre den med en 5% vandig opløsning af aluminiumhydroxid ved stuetemperatur og centrifugering ved 20°C 15 efter adsorption. Adsorptionsbehandlingen gentages mindst tre yderligere gange under anvendelse af en 2,5% aluminiumhy-droxidopløsning til hver behandling efter den første. Den adsorberede IgG bringes til 4°C og genudfældes en gang med SAS, som beskrevet ovenfor. De udfældede "piller" kan op-20 bevares ved -20°C indtil brug.

To foretrukne fremgangsmåder til oprensning af monoklone antistoffer og vedligeholdelse af biologiske præparater indeholdende disse er beskrevet i P.L. Ey et al., "Isolation of Pure IgG1# IgG2a, and IgG2b Immunoglobulins from Mouse Serum 25 Using Protein A-Sepharose", Immunochemistry, bind 15, side 429-436 og C. Bruck et al., "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascites Fluid by DEAE Affi-Gel Blue Chromatography", J. Immunological Methods, bind 53, side 313-319 (1982).

Claims

32 DK 172036 B1

1. Faktor VIII :C-koaguleringsraiddel, kendetegnet ved, at det i det væsentlige består af 5 (a) et kompleks af et polypeptid med Mr = 92.000 og et polypeptid med Mr = 79.000 - 80.000; eller (b) et kompleks af et polypeptid med Mr = 92.000 og et polypeptid med Mr = 71.000 - 72.000; eller (c) en kombination af komplekserne (a) og (b).

2. Koaguleringsmiddel ifølge krav 1, hvori polypeptiderne er kompleksbundet ved hjælp af et middel, som kan danne et che-lat med EDTA.

3. Koaguleringsmiddel ifølge krav 1, hvori mindst ét af po-lypeptiderne af komplekset kan opnås ved a-thrombin-behand- 15 ling.

4. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, som udviser følgende træk: (a) koaguleringsmiddelaktiviteten er højere end 1800 en-heder/mg og udvises i et kontinuert tidsrum på mindst 20 10 min., og (b) polypeptidfragmenterne har human faktor VIII:C-anti-stofbindingskapacitet.

5. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at den specifikke akti- 25 vitet er større end 5400 enheder/mg. 33 DK 172036 B1

6. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at det har en specifik aktivitet, som overstiger 7.500 enheder/mg.

7. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 5. til 6, kendetegnet ved, at det har en specifik aktivitet, som overstiger 10.000 enheder/mg.

8. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, kendetegnet ved, at det er fri for a-thrombin og tilsvarende proteaser i aktiv form.

9. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8, hvori koaguleringsmidlet er lyofiliseret.

10. Koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8, kendetegnet ved, at det er opløst i en farmaceutisk acceptabel saltopløsning.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et koaguleringsmiddel ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 10, kendetegnet ved, at den omfatter trinnene: (a) digestion af faktor VIII:C i en digestionsblanding med thrombin eller en protease med tilsva- 20 rende virkning under digestionsbetingelser til dannelse af polypeptiderne ifølge krav 1, (b) afbrydelse af digestionen i trin (a), medens po-lypeptiderne er til stede i digestionsblandingen, og 25 (c) udvinding af det resulterende koaguleringsmiddel.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at faktor VIII:C i forvejen er blevet oprenset. 34 DK 172036 B1

13. Fremgangsmåde til udvinding af et koaguleringsmiddel i-følge et hvilket som helst af kravene 1 til 10, kendetegnet ved, at den omfatter trinnene: (a) adsorption af koaguleringsmidlet i aktiv form til 5 en immunoadsorbent indeholdende monoklonale an tistoffer over for faktor VIII:C-epitoper og (b) eluering af koaguleringsmidlet fra immunoadsor-benten med en vandig opløsning indeholdende calciumioner under elueringsbetingelser, der er ef- 10 fektive til at desorbere koaguleringsmidlet fra immunoadsorbenten uden denaturering af koaguleringsmidlet .

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at opløsningen indeholder op til ca. 1,0 M calciumioner, og 15 at opløsningen påføres på immunoadsorbenten med op til ca. 8 lejevolumener pr. time.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at de monoklonale antistoffer binder human faktor VIII :C og udviser en af de følgende bindingsprofiler med po- 20 lypeptider, der hidrører fra human faktor VIII:C: (A) Binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på 92.000, a 108.000 og 44.000, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, 25 hvilke udviser en dublet på Mr = 79.000 - 80.000, eller sådanne, som udviser en dublet på Mr = 71.000 - 72.000; (B) binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på 30 92.000 s 108.000 og 54.000, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, DK 172036 Bl 35 hvilke udviser en dublet på Mr = 79.000 - 80.000, eller sådanne, som udviser en dublet på Mr » 71.000 - 72.000; (C) Binding til polypeptider hidrørende fra human 5 faktor VIII:C, hvilke udviser en dublet på Mr = 79.000 - 80.000, og til a 108.000-polypeptider, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på 44.000, 54.000, 92.000, og til polypeptider, som 10 udviser en dublet på Mr = 71.000 - 72.000; (D) binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en molekylvægt på a 108.000, men ikke binding til polypeptider hidrørende fra human faktor VIII:C, hvilke har en mo- 15 lekylvægt på mindre end 108.000; hvori molekylvægtene bestemmes ved at underkaste polypepti-derne SDS-PAGE under reducerende betingelser.