JPH02296A - ８因子のフォン・ビルブラント因子結合ドメイン - Google Patents

８因子のフォン・ビルブラント因子結合ドメイン

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JPH02296A
JPH02296A JP63306758A JP30675888A JPH02296A JP H02296 A JPH02296 A JP H02296A JP 63306758 A JP63306758 A JP 63306758A JP 30675888 A JP30675888 A JP 30675888A JP H02296 A JPH02296 A JP H02296A
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JP
Japan
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factor viii
factor
von willebrand
peptide
amino acid
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JP63306758A
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English (en)
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Theodore S Zimmerman
シアドー　エス、チマーマン
Richard A Houghten
リチャード　エイ、ホートン
Paul A Foster
ポール　エイ、フォスター
Carol A Fulcher
キャロル　エイ、フルチャー
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Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Clinic and Research Foundation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 本発明は、■因子（Ｆ■）のフォン・ビルブラント因子
（ｖ　Ｗ　Ｆ　）への結合を阻止するペプチドに関する
。
本発明はまた、ｖ　Ｗ　Ｆの結合能力が少ないが全くな
い組換えＤＮＡで生産された突然変位種のＦ■分子の生
産に関する。
ｖ　Ｗ　ＦおよびＦ■は、止血の保持に重要ではあるが
異なった機能を有する。ＶＷＦは導管の損傷部位での血
小板−管壁の相互作用に関与し、Ｆ■は血小板およびカ
ルシウムイオンの存在においてＩＸａ因子によるＸ因子
の活性化を促進する。ｖＷＦおよびＦ■は、静電気力お
よび疎水力の両方で保持されると思われる比共有結合の
錯体として血漿内を循環する。ｖ　Ｗ　Ｆはインビボお
よびインビトロの両方で血漿内のＦ■を安定化し、循環
中のその半減期を延長することが示されている。従って
、内因性のＷＷＦの不在においてはＦ■の循環半減期は
著しく短縮される。Ｆ■は血液凝固の固有の経路に関与
するので、Ｆ■とｖ　Ｗ　Ｆの相互作用に干渉しうる薬
剤は血漿中のＦ■の水準を変えこの形で抗血栓症剤とし
て働く６本発明のペプチドは、Ｆ■へのｖＷＦの結合を
阻止することによって抗血栓症剤として働く能力を有す
る。また、本発明の組換えＤＮＡで生産された突然変位
種Ｆ■分子は、循環するｖ　Ｗ　Ｆへの阻止性の抗体に
よって患者に治癒力を与える能力を持つ。
Ｆ■の精製には種々の方法が開発されてきた。
しかし、高い収量でＦ■を得るＦ■精製の改良法への要
求がある。本発明は、ｖ　Ｗ　Ｆ結合ドメインを含むＦ
■のアミノ酸配列に基づくペプチドをＦ■の精製に使用
することによってこれを達成した。
これによって温和な条件でＦ■の精製ができ、Ｆ■の収
量が向上できた。
（発明の要約） 本発明は、フォン・ビルブラント因子の■因子への結合
を阻止し、下記のアミノ酸配列：ＬＱＳＤＱＥＥ　ＩＤ
ＹＤＤＴＩ　ＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤｒＹＤＥＤＥＮＱＳ
ＰＲ３ＦＱＫＫを含むフォン・ビルブラント因子結合ド
メインを含む■因子の領域に特異的に結合できるモノク
ローナル抗■因子抗体Ｃ４およびポリクローナル抗■因
子ペプチド抗体２６４５と反応するペプチドまたは■因
子ポリペプチド切片（フラグメント）を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、下記のアミノ酸配列：ＬＱＳＤＱＥＥＩ
ＤＹＤＤ”１ＭＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　　ＩＹＤＥＤＥ
ＮＱＳＰＲ５ＦＱＫＫの逐次サブセットを含むフォン・
ビルブラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特
異的に結合できるモノクローナル抗■因子抗体Ｃ４およ
びポリクローナル抗■因子ペプチド抗体２６４５と反応
するペプチドまたは■因子ポリペプチド切片を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、下記のアミノ酸配列：ＶＥＭＫＫＥＤＦ
Ｄ　　ＩＹＤＥＤＥ を含むフォン・ビルブラント因子結合ドメインを含む■
因子の領域に特異的に結合できるモノクローナル抗■因
子抗体Ｃ４およびポリクローナル抗■因子ペプチド抗体
２６４５と反応するペプチドまたは■因子ポリペプチド
切片を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、下記のアミノ酸配列；ＶＥＭＫＫＥＤＦ
Ｄ　ＩＹＤＥＤＥ の逐次サブセットを含むフォン・ビルブラント因子結合
ドメインを含む■因子の領域に特異的に結合できるモノ
クローナル抗■因子抗体Ｃ４およびポリクローナル抗■
因子ペプチド抗体２６４５と反応するペプチドまたは■
因子ポリペプチド切片を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基１６５５−１６９４のそれであり、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体Ｃ４およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体２６４５と反応する下
記のアミノ酸配列： ＬＱＳＤＱＥＥ　　Ｉ　　ＤＹＤＤＴ　　Ｉ　　ＳＶＥ
ＭＫＫＥＤＦＤ　　ＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲ３ＦＱＫＫ
を持つペプチドを含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基１６５５−１６９４のそれで、ｌ、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体Ｃ４およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体２６４５と反応する下
記のアミノ酸配列： ＬＱＳＤＱＦ、ＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤ
　ＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲ５ＦＱＫＫを持つペプチドの
逐次サブセットから成るペプチドを含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基１６５５−１６９４のそれであり、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体Ｃ４およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体２６４５と反応する下
記のアミノ酸配列： ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＥ を持つペプチドを含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基１６５５−１６９４のそれであり、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体Ｃ４およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体２６４５と反応する下
記のアミノ酸配列： ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＥ を持つペプチドの逐次サブセットから成るペプチドを含
む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子結合部位が欠
失しているか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変
化が生じたか、またはフォノ。ビルブラント因子の結合
部位に作用する■因子の配列に欠失または変化を生じ、
その結果フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか
、または無くなっているヒト■因子の突然変位種を含む
。
本発明はさらに、アミノ酸残基１６５５−１６９４のな
かに、フォン・ビルブラント因子結合部位が欠失してい
るか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変化が生じ
たか、またはフォン・ビルブラント因子の結合部位に作
用する■因子の配列に欠失または変化を生じ、その結果
フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか、または
無くなっているヒト■因子の突然変位種を含む。
本発明はさらに、アミノ酸残基１６７０−１６８４のな
かに、フォン・ビルブラント因子結合部位が欠失してい
るか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変化が生じ
たか、またはフォン・ビルブラント因子の結合部位に作
用する■因子の配列に欠失または変化を生じ、その結果
フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか、または
無くなっているヒト■因子の突然変位種を含む。
本発明はさらに、薬理学的に受容できる担体と一緒に、
患者のなかでフォン・ビルブラント因子の■因子への結
合を阻止するのに有効な量のペプチドを含む治療薬組成
物を含む。
本発明はさらに、これらのペプチドの有効量を色者に投
与することによって患者の血栓痙を阻止する方法を含む
。
本発明はさらに、薬理学的に受容できる担体と一緒に、
フォン・ビルブラント因子阻止活性から来る患者の■因
子欠乏を治療するのに有効な量のヒト■因子の突然変位
種を含む治療薬組成物を含む。
本発明はさらに、これらの突然変位種■因子の有効量を
患者に投与することによって患者のフォン・ビルブラン
ト因子阻止活性から来る■因子欠乏を軽減する方法を含
む。
本発明はさらに、フォン・ビルブラント因子結合ドメイ
ンを含む■因子のアミノ酸配列に基づくペプチドおよび
これらのペプチドの逐次サブセットを使う精製された■
因子の調製の改良法を含む。
（発明の詳細な説明） 上記のように、本発明はｖ　Ｗ　ＦへのＦ■の結合を阻
止し、アミノ酸配列はＦ■の切片のそれであり、ｖ　Ｗ
　Ｆ結合ドメインを含むＦ■の領域に特異的に結合する
ことができるモノクローナル抗Ｆ■抗体Ｃ４およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体２６４５と反応するポ
リペプチド切片および合成ペプチドを包含する。
さらに、本発明はｖ　Ｗ　ＦのためのＦ■の結合ドメイ
ンとしてＦＶＩ配列ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＥ
　（１６７０−１６８４）およびＬＱＳＤＥＥ［ＤＹＤ
ＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲ３
ＦＱＫＫ　（１６５５−１６９４）を同定する。これら
の発見はｖ　Ｗ　ＦからＦ■を完全に除（能力を持つＦ
■合成ペプチドの設計のための基礎を与える。そのよう
なペプチドは、生理学的イオン濃度においてｖ　Ｗ　Ｆ
からＦ■を除くのに使用できる可能性がある。インビト
ロではこの排除は他の分子を含まないＦ■またはｖ　Ｗ
　Ｆの精製に使用できる。インビボでは、そのような排
除は循環するＦ■の半減期を短縮させることによって抗
血栓症的介入物として使用できる。
Ｆ■−ｖ　Ｗ　Ｆ錯体を解離させうるＦ■ペプチドの開
発は、血漿および市販のＦＶＩ濃厚品からのＦ■の精製
に有用である。若干の方法は、生成物の凝集試験を阻害
しまた追加の脱塩工程の要る０、　３Ｍ　ＣａＣ１ｚの
ような高濃度の塩を含む緩衝液で支持媒体に結合した抗
ｖＷＦ抗体に結合したｖＷＦからＦ■を溶出させるやり
方に頼っている。ＶＦ、ＭＫＫＥＤＦＤ　Ｉ　ＹＤＥＤ
ＥおよびＬＱＳＤＥＥ　ＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥ
ＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲ３ＦＱＫＫまたはそれら
のサブセットによる溶出は、この問題を解消することが
できる。
更に、これらのペプチドによる血漿中のｖ　Ｗ　Ｆから
のＦ■の解離は、Ｆ■モノクローナル抗体による血埜か
らの直接の精製を可能にする。これで、低温沈澱工程で
失われるＦ■の約４０−５０％の回収が可能になる。Ｖ
ＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＢまたはそのサブセット
への抗体は、トロンビンで活性化したＦ■から不活性化
したＦ■を分離すルノニ使用できる。ＶＥＭＫＫＥＤＦ
Ｄ　ＩＹＤＥＤＥはトロンビンによってＬ−１ｉｌｌか
ら切断されたＦ■分子の一部の上に存在する。すなわち
、その後イミュノアフィニティー・クロマトグラフィー
の間に、未解裂のＬ　−１１だけがＶＥＭＫＫＥＤＦＤ
ＩＹＤＥＤＥへの抗体に結合する。ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ
　ＩＹＤＥＤＥまたはそのサブセットは、溶出に使用で
きる。
ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＥまたはＬＱＳＤＥＥ
ＩＤＹＤＤＴｒＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱ
ＳＰＲ３ＦＱＫＫまたはＣ４および２６４５のようなモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗Ｆ■抗体によるｖ
　Ｗ　ＦからのＦ■の解離は、Ｆ■水準の低下および抗
擬集状態の導入のよる抗血栓症治療法として使用できる
。
ｖ　Ｗ　Ｆ結合が減少するか、または無くなってしまう
ｖ　Ｗ　Ｆ結合部位の欠失、またはｖ　Ｗ　Ｆ結合部位
の変化による、合成の組換えＤＮＡで生産されたＦ■は
、ｖ　Ｗ　ＦまたはＦ■活性がほとんどないか、又は測
定不能である、ｖ　Ｗ　Ｆへの獲得抑制性抗体（後天性
阻止抗体）を持った患者の治療に有用である。ｖＷＦ結
合能力のないＦ■の投入は、そのような抗ｖ　Ｗ　Ｆ抗
体の影響を受けず、Ｆ■の治療濃度は患者の出血体質を
部分的に補正することによって達成できる。
モノクローナル抗Ｆ■抗体Ｃ４は放射能標識法およびＥ
ＬＩＳＡ法において、ｖ　Ｗ　ＦへのＦ■の結合をブロ
ックすることがわかった。Ｃ４のエピトープはＦ■のｖ
　Ｗ　Ｆ結合ドメインのそれの近くに存在しなければな
らない。それゆえＣ４抗体はｖ　Ｗ　Ｆ結合ドメインの
マーカーとして使用された。
固相のｖ　Ｗ　ＦへのＦ■結合の競合的阻止試験は１ｍ
ｌの０．　ＯＩ　Ｍ　　Ｐ　０．０．１５　Ｍ　　Ｎ　
ａ　Ｃ＋、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ　　ｐＨ７，３（
Ｐ　Ｂ　Ｓ　）中５／ｊｇの全未還元ｖＷＦを用い、１
６１１Ｎ径の組織培養ウェルあたり１／４インチ径のポ
リスチレンビーズ（イリノイ州、ロックフォード、ピア
ス・ケミカル・カンパニー）３個を使って室温で２時間
培養して行った。溶液を取り出し、ウェルとビーズを、
０．０５％ツイーン−２０および３％ヒト血清アルブミ
ンを含むＰＢ３１ｍｌで１時間室温でブロックした。ウ
ェルとビーズはこのあと使用するまで４℃でこの溶液中
に貯蔵した。ウェルとビーズは使用の前にツイーン−２
０を０．０５％含むＰＢＳで２回洗い、０．０５Ｍイミ
ダゾール、０．１５ＭＮａｃｔ、０．０２％　Ｎａ　Ｎ
　ｓ　　ｐＨ７，Ｃ１３ｍＭＣａＣｌ、中１．５単位の
精製Ｆ■および０−２００μｇのモノクローナル抗Ｆ■
抗体Ｃ４または０−４００μｇのポリクロナール抗Ｆ■
抗体２６４５で１時間半室温で培養した。つぎに、ビー
ズをツイーン−２０を０．０５％含むＰＢＳで３回洗い
、ツイーン−２０を０．０５％含み０．５％のウシ・ガ
ンマアルブミンを含むＰＢＳＬｍｌ中１．２−２．４　
Ｘｌ　０　”　ｃｐｓの１２５■−モノクローナル抗Ｆ
■抗体Ｃ２（比活性８．３　９．９　Ｘ　ｌ　０９ｃｐ
ｎ＋／ｎｇ）または２．４−４．９Ｘ１０＆ｃｐｓの目
ＳＩ−モノクローナル抗Ｆ■抗体Ｃ５（比活性１．２−
３．２Ｘ１０１０ｃｐｍ／＋＋＋ｇ）で室温で１時間半
培養した。培養のあと、ウェルとビーズはツイーン−２
０を０．０５％含むＰＢＳで２回洗った。ビーズを綺麗
なウェルに移し、もう２回洗い別々に結合放射能を測定
した。
放射能はガンマ計数管で測った。
＋ｔ％ｌ　　Ｃ２またはＣ５が結合していないことはＣ
４または２６４５がｖ　Ｗ　ＦのＦ■への結合をブロッ
クしたことを示している。Ｃ４も２６４５も投与量依存
の形でｖ　Ｗ　ＦへのＦ■の結合を阻止した０代表的な
実験では、固定されたｖ　Ｗ　Ｆに錯体化されたＦ■へ
の結合を示すＩｔｓ（Ｃ２の結合総カウント数は４２２
６ｃｐｎ＋（バックグラウンド上カウント）であった、
１０μｇ／ｍｌの濃度の０４をＦＶＩ溶液に加えてポリ
スチレンビーズと一緒に培養したとき、結合カウントは
１９４７ｃｐｍに減少し、すなわちｖ　Ｗ　Ｆに結合し
たＦ■の量は５４％減少した。＋！５１　　Ｃ５を使用
したときは結合カウントの同様の減少が見られたのでこ
のＣ４の効果は目５７　　Ｃ２の結合の阻止を含まない
ことがわかった。Ｃ５はＦ■のＨ−１１１上の部位に結
合し、Ｃ２が結合しｖ　Ｗ　Ｆの結合ドメインがあるし
一鎖には結合しない、Ｃ４の濃度を１００μｇ７ｍｌに
増すと、総カウントはバンクグラウンド上２７　ｃｐｍ
　となりＦ■結合をほぼ完全に阻止した。
下記の表は、Ｃ４の添加濃度を増して行ったときのＦ■
結合の阻止率を要約したものである二Ｃ４（μｇ／ｍｌ
）　　　阻止率％　　　　ＣＰＭＯ０％　　　　　　４
２２６ １０　　　　　　５４％　　　　　１９４７２０　　　
　　　６３％　　　　　１５７７５０　　　　　　９１
％　　　　　４８５１００　　　　　　１００％　　　
　２７２００　　　　　　１００％　　　　０ポリクロ
一ナル抗Ｆ■ペプチド抗体２６４５を５０μｇ／ｍｌの
濃度でＦ■培養工程に加えた場合は、結合カウントは４
１４６から２６９８に減少した。
３００μｇ／ｍｌの濃度を加えた場合は結合カウントは
バックグラウンド上３００ｃｐｍに減少した。下記の表
は、ポリクローナル抗体２６４５の添加濃度を増して行
ったときのＦ■結合の阻止率を要約したものである： ２６４５　（ｐｇ／ｎ＋１）　　阻止率％　　　　ＣＰ
Ｍｏ　　　　　　　　０％（定義”）　　　４１４６２
　　（１２０％　　　　　　　　　　３３２６５０　　
　　　　　　　　　　　３５　％　　　　　　　　　　
２６９８１００　　　　　　　　　　　　５９　　％　
　　　　　　　　　１７０６２００　　　　　　　　　
　　　８４　　％　　　　　　　　　　６６９３００　
　　　　　　　　　　　９３　　％　　　　　　　　　
　３００４００　　　　　　　　　　　　９９　　％　
　　　　　　　　　２５濃度２００μｇ’／ｍｌ以下の
アミノ酸残基１６６０−１６７４から成るＦ■合成ペプ
チドに対して製造されたモノクローナル抗体または濃度
４００μｇ／ｍｌ以下のアミノ酸残基１６８０−１６９
４から成るＦ■合成ペプチドに対して製造されたポリク
ローナル抗体の添加は、Ｆ■結合の有意の阻止を示さな
かった。すなわち、Ｆ■のｖ　Ｗ　Ｆ結合ドメインは、
ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＥ　（１６７０−１６
８４）またはそのサブセット内に存在する。
Ｃ４の結合エピトープの部位は、ＥＬＩＳＡ法における
このペプチドによるＦ■への０４の結合の競合的阻止に
よってやはりＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥ　（１６
７０−１６８４）内に含まれることか示された。この方
法では、精製したヒトＦ　■　を　２　０　ＩＩＭ　ト
　　リ　　ス　−　　ＨＣＩ　　　Ｘ　　Ｏ，０２％　
ＮａＮ　　３ｐ　Ｈ９，６に１あたり約３単位に希釈し
、１００μｌを多つェルＭｉ織培養プレート（リンプロ
、フロー・ラボラトリーズ・インコーポレイション）の
各１．　ＯＸ　Ｏ，６ｃｍのウェルに入れ、室温で２時
間培養した。つぎに、このプレートを使用するまで、こ
の溶液中に４℃で貯蔵した。使用の前に溶液を除きウェ
ルを２０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、０．０２％ＮａＮ５　　
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の２００μｍで室温
で１時間ブロックした。ブロッキングのあと溶液を除き
、ウェルを０．１４ＭＮａＣ１，０，００１５Ｍ　ＫＨ
ｚ　　ＰＯ４０，００８４Ｍ　ＮａｚＨＰＯａ　　　０
．０５％ノニデソトＰ−４０を含む緩衝液（洗浄緩衝液
）の２５０μｍで３回洗浄した。
別に、精製したＦ■を０．ＯＬＭ　Ｎａ　ＨＣＯｓ中に
希釈して１００μｌを各ウェルに入れた。その後、プレ
ートを室温で乾燥し、使用するまで４℃で貯蔵した。使
用の前にウェルは上述のようにプロックし洗浄した。つ
ぎに、モノクローナル抗体Ｃ４およびＦ■ペプチドを含
む試料溶液１００μを各ウェルに加えた。１％ＢＳＡを
含む洗浄緩衝液中０．１ないし１Ｍｇ／ｍｌの最終濃度
の０４および１ｎＭないし１ｍＭの最終濃度のＦ■ペプ
チドをウェルへの添加の前に３７℃で１時間または４℃
で一夜予備培養した。室温で１時間の培養の後、試料溶
液を取り出しウェルを２５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗
浄した。１％ＢＳＡを含む洗浄緩衝液で１　ｊ　２００
０に希釈したパーオキシダーゼ・ヤギ抗マウスＩｇＧ　
（Ｈ＋Ｌ）（ザイメッド・ラボラトリーズ・インコーホ
レイシラン）１００μｌを各ウェルに加え、１時間室温
で培養した０次いで溶液を除き、ウェルを２５０μｍの
洗浄緩衝液で４回洗浄した。０．０２４Ｍ　クエン酸、
０．０５１阿ＮａｔＨＰＯａ　　　０．０３％過酸化水
素を溶かした０−フェニレンジアミン基体（ザイメソド
）１００ｕｌを各つ：ｆ：、　ルニ加え、２Ｍ　Ｈｚ　
Ｓ　Ｏｓ　　１００μｌでクエンチングする前に室温で
５ないし１０分間培養した。各ウェルの色の変化をＭＲ
６００マイクロプレート・リーダー（ダイナチック・イ
ンスッルーメント・インコーホレイシラン）で読み取っ
た。
この系では、色のないことがＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤ
ＥＤＥ　（１６７０−１６８４）による抗体結合のブロ
ッキングを示した。代表的な実験では、０．７．１７　
（／ｍ１（７）　ｔａ度の０４がＦ■に結合し、０゜８
６９という吸光度（ＯＤ）の読みを与えた。■、ｕＭＯ
）濃度（７）ＶＥＭＫＫＥＤＦＤ　ＩＹＤＥＤＥ（１６
７０−１６８４）によるＣ４の予備培養は、測定ＯＤが
０．０４４に減る結果となりＦ■への抗体の結合の９５
％の減少を示した。さらに、アミノ酸残基１６６５−１
６７９および１６８０−１６９４から成るペプチドは、
Ｆ■への０４の結合を有意にブロックできなかった。１
Ｍ台の濃度ではこれらのペプチドはそれぞれ１５％およ
び２１％しかＣ４結合を減少させなかった。　■因子の
アミノ酸配列にもとすくペプチドおよびこのペプチドの
少なくとも３個のアミノ酸残基の逐次サブセットは、ホ
ートンら、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナシジナル
・アカデミ−・オプ・サイエンシズ、第８２巻、５１３
５頁（１９８５年）に記載された方法で合成した。
ペプチドの固相合成の公知の方法では、所望のペプチド
はベンズヒドリルア°ミンまたはクロルメチル化樹脂（
架橋ポリスチレンから誘導され、化学品業者から入手で
きる）のような不溶性の支持体から出発して組み立てら
れる。所望のポリペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸
は、α−アミノ窒素および他の反応性部位に保護基を有
しており公知のペプチド結合法を用いて溶液から樹脂に
接続される。α−アミノ基の保護基は除去され（他の保
護基は、もしあればそのまま残す）、所望の配列の次の
アミノ酸（適当な保８１を基を持つ）が接続され、それ
が操り返される。所望のポリペプチドが完全に出来上が
ったならば、それは樹脂支持体から切り離され、すべて
の保護基が除去され、ポリペプチドが回収される。適当
な保護基の例は：α−アミノ基にはα−ｔｅｒｔ−ブチ
ルオキシカルボニル；システィンのチオール基、アスパ
ラギン酸のβ−カルボン酸基、グルタミン酸のγ−カル
ボン酸基およびセリン、スレオニンおよび千ロジンの水
酸基にはベンジル、４−メトキシベンジルまたは４−メ
チルベンジル；ヒスチジンおよびトリプトファンの環内
窒素およびリシンのε−アミノ基にはベンジルオキシカ
ルボニルまたはその２−クロロ−または３，４−ジメト
キシ誘導体；アスパラギンおよびグルタミンのアミド窒
素にはｐ−ニトロフェニル；およびアルギニンのグアニ
ジン基にはニトロまたはトシルである。
この開示の目的のために、受容されているアミノ酸の略
記法を使用した。完全な一覧表を下記に示す。
一字および工学のアミノ酸略記法 Ａ　　Ａｌａ　　アラニン ＣＣｙｓ　　システィン Ｄ　　Ａｓｐ　　アスパラギン酸 Ｅ　　Ｇｌｕ　　グルタミン酸 Ｆ　　Ｐｈｅ　　フェニルアラニン Ｇ　　Ｇｕｙ　　グリシン ＨＨ４ｓ　　ヒスチジン Ｉ　　ｌｉｅ　　イソロイシン Ｋ　　Ｌｙ３　　リジン Ｌ　Ｌｅｕ　ロイシン Ｍ　　Ｍｅｔ　　メチオニン Ｎ　　Ａｓｎ　　アスパラギン Ｐ　　Ｐｒｏ　　プロリン Ｑ　　Ｇｌｎ　　グルタミン ＲＡｒｇ　　アルギニン Ｓ　　Ｓｅｒ　　セリン Ｔ　　Ｔｈｒ　　スレオニン Ｖ　　Ｖａｌ　　バリン Ｗ　Ｔｒｐ　トリプトファン Ｙ　　’ｌ”ｙｒ　　チロシン Ｂ　　Ａｓｘ　　ＡｓｐまたはＡｓｎ、識別不能Ｚ　　
Ｇｌｘ　　ＧｌｕまたはＱ　１　ｎ　、　ｉｉａ別不能
Ｘ　Ｘ　　　未測定または非定形アミノ酸突然変位種■
因子分子は、ｖＷＦ結合の減少または消滅をもたらすｖ
　Ｗ　Ｆ結合部位の消滅またはｖ　Ｗ　Ｆ結合部位の変
化を伴う組換えＤＮＡ法によって製造できる。まずｖ　
Ｗ　Ｆのために抗体結合部位を定義づける線状アミノ酸
配列が決定される。
これは抗体が結合する■因子の一番小さい蛋白質分解切
片を決定することによって達成される。配列が分かると
、これらの切片のアミノ酸配列に基づく合成ペプチドが
合成され、個々のアミノ酸が系統的に消去され或いは置
換される。抗体のこれらの配列との反応性から、臨界的
アミノ酸が決定される。エピトープの臨界領域がわかる
と、エピトープの臨界領域内で置換または消去が行われ
る突然変位種■因子分子を製造することが出来る。
所望の■因子突然変位種ポリペプチドを組換えＤＮＡ法
で製造するには、ヒト■因子の遺伝子をクローンし、特
定部位の突然変位誘発を含む種々の方法で処理し、細胞
に挿入し、■因子の表現に使用する。遺伝子の説明およ
びその使用法については、ギフトシャイヤー　Ｊ、ら、
「ヒト■因子遺伝子の特徴」、ネイチャー、第３１２巻
、３２６−３３０頁、ウッド、ウィリアム１．ら、「組
換えＤＮＡクローンからの活性ヒト■因子の表現」、ネ
イチャー、第３１２巻、３３０−３３７頁、およびツー
ル、リジンＪ、ら、ｒｃＤＮＡをコードするヒト抗血友
病因子の分子クローニング」、ネイチャー、第３１２巻
、３４２−３４７頁を参照されたい。特定部位の突然変
位誘発の種々の方法が使用でき、例えばシトシン残基の
単一塩基対変化を重亜硫酸塩のような薬品を使って生じ
させうる。この薬品はシトシンを脱アミンしてウラシル
に変えるもので、この塩基がチミンと同様に対を成す。
重亜硫酸ナトリウムによる特定部位の突然変位誘発の説
明については、ジロートル、ダビツトら「特定部位の突
然変位誘発」、アニュアル・レビュー・オブ・ジェネテ
ィソクス、第１５巻、２６５−２９４頁を参照されたい
。別の方法として、オリゴヌクレオチド−指向の突然変
位誘発を使うことができる。説明としては、シラー、マ
ークＪ、およびスミス、マイケル、「Ｍ１３ベクトル中
ヘクローンされたＤＮＡ切片のオリゴヌクレオチド−指
向の突然変位誘発」メソード・イン・エンザイモロジー
、組換えＤＮＡ、Ｂの部、第１００巻、４６８−５００
頁を参照されたい。
ポリクローナル抗体２６４５は、ペプチドＶＥＭＫＫＥ
ＤＦＤＩＹＤＥＤＥ　（１６７０−１６８４）によるウ
サギの免疫によってレイズ（ｒａｉｓｅ）即ち高められ
た。Ｆ■配列からのアミノ酸残基１６７０−１６８４を
含む合成ＶＥＭＫＫＥＤＦＤＴＹＤＥＤＥペプチドは前
記の方法で合成された。
つぎに、合成ペプチドは担体蛋白質であるキーホール・
リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に下記のようにし
て結合させた： １）　所望量のペプチドおよび等量の担体を秤量する。
２）　ペプチドおよび担体蛋白質を燐酸塩緩衝塩水（Ｐ
ＢＳ）に溶解し、２　ｍｇ／ｍｌ　の担体最終濃度に希
釈する。
３）　担体−ペプチド溶液１ｍｌあたり１２４μｌの作
用グルタルアルデヒドを加える。
４）　室温で一夜撹拌する。
５）　上流水に対して少なくとも６時間透析する。
６）　凍結乾燥する。
７）　回収された物質を秤量し、結合パーセントを知る
。
担体蛍白質の９０％の回収が推定された０例えば、２０
ｍｇの担体と２（ｌａｇのペプチドから出発して透析と
冷凍乾燥のあと３０ｍｇが回収された。３０ｍｇのうち
１８ｍｇが担体蛍白質、１２ｍｇがペプチドであった。
完全フロインドアジュバント中１ミリグラムの結合ペプ
チドをニューシーラント白ウサギに複数の注射部位で皮
下注射した。不完全フロインドアジュバント中１ｍｇの
結合ペプチドを一週間おきに３回同じ方法で追加免疫し
た。動物は最終の注射の後およびそのあと２週間毎に採
血した。
ウサギの抗体の精製は、蛋白質Ａ−セファロース上での
アフィニティー・クロマトグラフィーによった。エイら
、「蛋白ｔＡセファロースを使用するマウス血清からの
純粋のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩ　ｇＧ２　ｂ免疫
グロブリンの単離」、イミュノケミストリー、第１５巻
、４２９−４３６Ｍ（１９７８年）を参照されたい、ウ
サギ血清の３ｍｌの試料を０．１４モルの燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）中に１＝５に希釈し、９．５ｃｍＸ
１ｃｍの蛋白ＷＡ−セファロース（ファーマシア）のカ
ラムに加えた。次に、カラムをこの緩衝液で洗うで、吸
着されていない蛋白質を除去した。０．１０モルのクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ３）でウサギＩｇＧをカ
ラムから溶出した。蛋白質のピークを０．０５モルトリ
ス（ＭＣＩ）、０．１５モル塩化ナトリウム、０．０２
％アジ化ナトリウム（ｐＨ７，３５）に対して透析した
。
モノクローナル抗体Ｃ４（フルチャーら、ヒト■因子プ
ロコアキュラント蛋白質：モノクローナル抗体が前駆体
生成物の関係および機能エピ）−プを決める、ジャーナ
ル・オブ、ザ・クリニカル・インベスティゲーション、
第７６巻、１１７１２４頁（１９８５年）に既に記載さ
れている〕は、■因子のＶＷＦへの結合を阻止するＦ■
：Ｃのための抗体である。
ハイプリドーマ細胞系を産生ずるモノクローナル抗体Ｃ
４を造るために、完全フロインドアジュバント中１μｇ
の精製■因子二〇を腹膜内注射してＢ　ａ　ｌ　ｂ　／
　ｃマウスを免疫した。不完全フロインドアジュバント
中１０−および５０μｇの追加免疫を１週間間隔で与え
た。最終の１００μｇの追加免疫は、アジュバントなし
で融合の３日前に与えた。４週間目に、ブラウンら、ジ
ャーナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリー、
第２５５巻、４９８０−４９８３頁＜１９８０年）に記
載された方法でマウスの肺臓細胞をＰ３Ｘ６３マウス形
質細胞腫細胞と融合させた。細胞の培養およびマウス腹
水中のモノクローナル抗体の産生は実質上、リューら、
ジャーナル・オブ・ザ・イミュノロジー、第１２４巻、
２７２８−２７３６ｇ（ｘ９ｓｏ年）によった。抗体は
、リンプロータイターチック（カリフォルニア州、イン
グルウッド、フロー・ラボラトリーズ）プレート中での
固相試験を用い、またパーオキシダーゼ−抗体コンジュ
ゲート（カリフォルニア州、パーリンガム、ザイメッド
）を使用するイングバルおよびパールマン、イミュノケ
ミストリー、第８巻、８７１−８７４頁（１９７１年）
に記載された方法による酵素結合の免疫吸着検出システ
ムを使って選択した。プレートをＬＱＯｎＨの精製■因
子：Ｃでコーティングした。クローンはまた、ウェルあ
たり１１００ｎのヒトフィブロノーゲンでコーティング
したプレート、１００ｎＨのヒトフィブロネクチンでコ
ーティングしたプレートおよび１１００ｎのヒトフォン
・ビルプラント因子でコーティングしたプレートに対し
てスクリーニングした。この各蛋白質は、免疫源の潜在
的な汚染物である。■因子：Ｃでコートしたプレート上
でだけ陽性であったクローンは、改良カスパー試験（カ
スパーら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍｏ
ｒｒｈ、　　第３４Ｓ８６９−８７２頁（１９７５年）
参照）を使って血漿■因子：Ｃ活性を阻止する能力をも
試験した。培養液の上澄液は、等容量の正常なプールし
たヒト血漿と一緒に培養し、フルチャーら、プロシーデ
インゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・
サイエンシズ、第７９巻、１６４８−１６５２頁（１９
８２年）に記載された試験緩衝液に０゜５Ｍクエン酸ナ
トリウムの２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を加えたもの（ｐ　
Ｈ６，５）に１＝１０または１：２０に希釈した。培養
は３７℃で２時間行い、そのあと試料は■因子：Ｃプロ
コアギュラント活性について試験した。クローンＣ４か
らの培養液上澄液は、対照の（非抗■因子：Ｃの上澄液
）培養物に比べて残留血漿■因子：Ｃ活性の７５％を阻
止した。
培養液上澄液は、市販の抗血清（インデイアナ州、エル
クハート、マイルス・ラボラトリーズ・インコーポレイ
ション）を使ってアガロースゲル中の二重拡散法で免疫
グロブリンのクラスおよびサブクラスについて試験した
。マウス腹水液の蛋白質Ａ−セファロースクロマトグラ
フィーにュージャージー州、ビスキャタウエー、ファー
マシア・ファインケミカルズ）は、エイら、イミュノケ
ミストリー、第１５巻、４７９−４３６頁（１９７８年
）に記載された方法で行った。精製された抗体は、ＹＭ
−１０メンプランを使用して加圧限外濾過撹拌セル（マ
サチュセソツ州、デンバース、アミコン・コーポレイシ
ョン）中で濃縮し、小分けして一７０℃で貯蔵した。蛋
白質Ａ−セファロースで精製したモノクローナル抗体は
、改良カスパー試験（カスパーら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄ
ｉａｔｈ。
Ｈａｅｍｏｒｒｈ、　　第３４巻８６９−８７２頁（１
９７５年）参照）を使って血漿■因子：Ｃブロコアギュ
ラント活性を阻止する能力を試験した。
本発明の一つ以上のペプチドは、治療、診断その他の用
途に、医薬調合品に配合することができる。静脈内投与
用にそれらを調製するためには、塩化ナトリウム（例え
ば０．３５−２．０Ｍ）、グリシンなどのような生理学
的に共存しつる物質を含み、生理学的条件と共存しうる
緩衝されたｐＨを有する水に組成物を溶かす。血栓症の
防止のための投与量は、患者の血栓症のひどさに左右さ
れるが、個々の患者について容易に決めることができる
。
ンデイシッン 代　　理　　人　　新　　実　　健　　部　（外１名）
１、事件の表示 ２１発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 ４゜ 代 理 手 続 補 正 書 昭和６３年特許願第３０６７５８号 ■因子のフォン・ビルブラント因子結合ドメイン

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むフォン・ビルブラント因子結合ドメインを含むV
    III因子の領域に特異的に結合できるモノクローナル抗
    VIII因子抗体Ｃ４およびポリクローナル抗VIII因子ペプ
    チド抗体２６４５と反応するペプチドまたはVIII因子ポ
    リペプチド切片。
  2. （２）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 の逐次サブセットを含むフォン・ビルブラント因子結合
    ドメインを含むVIII因子の領域に特異的に結合できるモ
    ノクローナル抗VIII因子抗体Ｃ４およびポリクローナル
    抗VIII因子ペプチド抗体２６４５と反応するペプチドま
    たはVIII因子ポリペプチド切片。
  3. （３）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むフォン・ビルブラント因子結合ドメインを含むV
    III因子の領域に特異的に結合できるモノクローナル抗
    VIII因子抗体Ｃ４およびポリクローナル抗VIII因子ペプ
    チド抗体２６４５と反応するペプチドまたはVIII因子ポ
    リペプチド切片。
  4. （４）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 の逐次サブセットを含むフォン・ビルブラント因子結合
    ドメインを含むVIII因子の領域に特異的に結合できるモ
    ノクローナル抗VIII因子抗体Ｃ４およびポリクローナル
    抗VIII因子ペプチド抗体２６４５と反応するペプチドま
    たはVIII因子ポリペプチド切片。
  5. （５）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基１６５５−１６９４のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体Ｃ４および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体２６４５と反応
    する下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を持つペプチド。
  6. （６）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基１６５５−１６９４のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体Ｃ４および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体２６４５と反応
    する下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を持つペプチドの逐次サブセットを含むペプチド。
  7. （７）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基１６７０−１６８４のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体Ｃ４および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体２６４５と反応
    する下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を持つペプチド。
  8. （８）フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基１６７０−１６８４のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体Ｃ４および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体２６４５と反応
    する下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を持つペプチドの逐次サブセットを含むペプチド。
  9. （９）フォン・ビルブラント因子結合部位が欠失してい
    るか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変化が生じ
    たか、またはフォン・ビルブラント因子の結合部位に作
    用するVIII因子の配列に欠失または変化を生じ、その結
    果フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか、又は
    無くなっているヒトVIII因子の突然変位種。
  10. （１０）アミノ酸残基１６５５−１６９４のなかにフォ
    ン・ビルブラント因子結合部位が無いか、フォン・ビル
    ブラント因子結合部位に変化を生じたか、またはフォン
    ・ビルブラント因子の結合部位に作用するVIII因子の配
    列に欠失または変化を生じ、その結果フォン・ビルブラ
    ント因子の結合が減少するか、又は無くなっているヒト
    VIII因子の突然変位種。
  11. （１１）アミノ酸残基１６７０−１６８４のなかにフォ
    ン・ビルブラント因子結合部位が無いか、フォン・ビル
    ブラント因子結合部位に変化を生じたか、またはフォン
    ・ビルブラント因子の結合部位に作用するVIII因子の配
    列に欠失または変化を生じ、その結果フォン・ビルブラ
    ント因子の結合が減少するか、又は無くなっているヒト
    VIII因子の突然変位種。
  12. （１２）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項１のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  13. （１３）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項２のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  14. （１４）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項３のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  15. （１５）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項４のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  16. （１６）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項５のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  17. （１７）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項６のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  18. （１８）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項７のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  19. （１９）薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項８のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  20. （２０）請求項１の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  21. （２１）請求項２の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  22. （２２）請求項３の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  23. （２３）請求項４の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  24. （２４）請求項５の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  25. （２５）請求項６の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  26. （２６）請求項７の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  27. （２７）請求項８の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  28. （２８）薬理学的に受容できる担体と共に、フォン・ビ
    ルブラント因子阻止活性から来る患者のVIII因子欠乏を
    治療するのに有効な量の請求項９のヒトVIII因子の突然
    変位種を含む治療薬組成物。
  29. （２９）薬理学的に受容できる担体と共に、フォン・ビ
    ルブラント因子阻止活性から来る患者のVIII因子欠乏を
    治療するのに有効な量の請求項１０のヒトVIII因子の突
    然変位種を含む治療薬組成物。
  30. （３０）薬理学的に受容できる担体と共に、フォン・ビ
    ルブラント因子阻止活性から来る患者の因子欠乏を治療
    するのに有効な量の請求項１１のヒトVIII因子の突然変
    位種を含む治療薬組成物。
  31. （３１）請求項９の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする、患者のフォン・ビルブラント因子阻止
    活性から来るVIII因子欠乏を軽減する方法。
  32. （３２）請求項１０の生成物の有効量を患者に投与する
    ことを特徴とする、患者のフォン・ビルブラント因子阻
    止活性から来るVIII因子欠乏を軽減する方法。
  33. （３３）請求項１１の生成物の有効量を患者に投与する
    ことを特徴とする、患者のフォン・ビルブラント因子阻
    止活性から来るVIII因子欠乏を軽減する方法。
  34. （３４）（ａ）フォン・ビルブラント因子結合ドメイン
    およびそのペプチドの逐次サブセットを含むVIII因子の
    アミノ酸配列に基づくペプチドに対して高められたモノ
    クローナル抗体に結合した粒子の上に組み換えで製造し
    た血漿または市販の濃厚品からのVIII因子を吸収させ、 （ｂ）吸収されたVIII因子を溶出させ、 （ｃ）高度に精製されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子調製の改良法。
  35. （３５）モノクローナル抗体が下記のアミノ酸配列：【
    遺伝子配列があります】 のペプチドに対して高められ、かつアミノ酸配列がVII
    I因子配列のアミノ酸残基１６５５−１６９４およびそ
    のペプチドの逐次サブセットのそれであることを特徴と
    する請求項３４の方法。
  36. （３６）モノクローナル抗体が下記のアミノ酸配列：【
    遺伝子配列があります】 のペプチドに対して高められ、かつアミノ酸配列がVII
    I因子配列のアミノ酸残基１６７０−１６８４およびそ
    のペプチドの逐次サブセットのそれであることを特徴と
    する請求項３４の方法。
  37. （３７）（ａ）VIII因子を結合するモノクローナル抗体
    に結合した粒子の上に組み換えで製造した血漿または市
    販の濃厚品からのVIIIを吸収させ、 （ｂ）吸収されたVIII因子をフォン・ビルブラント因子
    結合ドメインおよびそのペプチドの逐次サブセットを含
    むVIII因子のアミノ酸配列に基づくペプチドで溶出させ
    、 （ｃ）高度に精製されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子調製の改良法。
  38. （３８）工程（ｂ）に使用される溶出剤が下記のアミノ
    酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有するペプチドであり、そのアミノ酸配列がVIII因子
    の配列のアミノ酸残基１６５５−１６９４およびそのペ
    プチドの逐次サブセットのそれであることを特徴とする
    請求項３４または３７の方法。
  39. （３９）工程（ｂ）に使用される溶出剤が下記のアミノ
    酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有するペプチドであり、かつアミノ酸配列がVIII因子
    の配列のアミノ酸残基１６７０−１６８４およびそのペ
    プチドの逐次サブセットのそれであることを特徴とする
    請求項３４または３７の方法。
  40. （４０）工程（ｂ）に使用される溶出剤がフォン・ビル
    ブラント因子結合ドメインおよびそのペプチドの逐次サ
    ブセットを含むVIII因子のアミノ酸配列にもとずくペプ
    チドであることを特徴とする請求項３４の方法。
  41. （４１）工程（ｂ）に使用される溶出剤が塩溶液である
    ことを特徴とする請求項３４の方法。
  42. （４２）塩溶液が塩化カルシウムであることを特徴とす
    る請求項４１の方法。
  43. （４３）工程（ａ）における吸収剤粒子がアガロースで
    あることを特徴とする請求項３４または３７の方法。
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