JPH02296A - 8因子のフォン・ビルブラント因子結合ドメイン - Google Patents

8因子のフォン・ビルブラント因子結合ドメイン

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JPH02296A
JPH02296A JP63306758A JP30675888A JPH02296A JP H02296 A JPH02296 A JP H02296A JP 63306758 A JP63306758 A JP 63306758A JP 30675888 A JP30675888 A JP 30675888A JP H02296 A JPH02296 A JP H02296A
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JP
Japan
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factor viii
factor
von willebrand
peptide
amino acid
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Application number
JP63306758A
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English (en)
Inventor
Theodore S Zimmerman
シアドー エス、チマーマン
Richard A Houghten
リチャード エイ、ホートン
Paul A Foster
ポール エイ、フォスター
Carol A Fulcher
キャロル エイ、フルチャー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Clinic and Research Foundation
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Publication date
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

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  • Veterinary Medicine (AREA)
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (発明の背景) 本発明は、■因子(F■)のフォン・ビルブラント因子
(v W F )への結合を阻止するペプチドに関する
本発明はまた、v W Fの結合能力が少ないが全くな
い組換えDNAで生産された突然変位種のF■分子の生
産に関する。
v W FおよびF■は、止血の保持に重要ではあるが
異なった機能を有する。VWFは導管の損傷部位での血
小板−管壁の相互作用に関与し、F■は血小板およびカ
ルシウムイオンの存在においてIXa因子によるX因子
の活性化を促進する。vWFおよびF■は、静電気力お
よび疎水力の両方で保持されると思われる比共有結合の
錯体として血漿内を循環する。v W Fはインビボお
よびインビトロの両方で血漿内のF■を安定化し、循環
中のその半減期を延長することが示されている。従って
、内因性のWWFの不在においてはF■の循環半減期は
著しく短縮される。F■は血液凝固の固有の経路に関与
するので、F■とv W Fの相互作用に干渉しうる薬
剤は血漿中のF■の水準を変えこの形で抗血栓症剤とし
て働く6本発明のペプチドは、F■へのvWFの結合を
阻止することによって抗血栓症剤として働く能力を有す
る。また、本発明の組換えDNAで生産された突然変位
種F■分子は、循環するv W Fへの阻止性の抗体に
よって患者に治癒力を与える能力を持つ。
F■の精製には種々の方法が開発されてきた。
しかし、高い収量でF■を得るF■精製の改良法への要
求がある。本発明は、v W F結合ドメインを含むF
■のアミノ酸配列に基づくペプチドをF■の精製に使用
することによってこれを達成した。
これによって温和な条件でF■の精製ができ、F■の収
量が向上できた。
(発明の要約) 本発明は、フォン・ビルブラント因子の■因子への結合
を阻止し、下記のアミノ酸配列:LQSDQEE ID
YDDTI SVEMKKEDFDrYDEDENQS
PR3FQKKを含むフォン・ビルブラント因子結合ド
メインを含む■因子の領域に特異的に結合できるモノク
ローナル抗■因子抗体C4およびポリクローナル抗■因
子ペプチド抗体2645と反応するペプチドまたは■因
子ポリペプチド切片(フラグメント)を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、下記のアミノ酸配列:LQSDQEEI
DYDD”1MSVEMKKEDFD  IYDEDE
NQSPR5FQKKの逐次サブセットを含むフォン・
ビルブラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特
異的に結合できるモノクローナル抗■因子抗体C4およ
びポリクローナル抗■因子ペプチド抗体2645と反応
するペプチドまたは■因子ポリペプチド切片を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、下記のアミノ酸配列:VEMKKEDF
D  IYDEDE を含むフォン・ビルブラント因子結合ドメインを含む■
因子の領域に特異的に結合できるモノクローナル抗■因
子抗体C4およびポリクローナル抗■因子ペプチド抗体
2645と反応するペプチドまたは■因子ポリペプチド
切片を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、下記のアミノ酸配列;VEMKKEDF
D IYDEDE の逐次サブセットを含むフォン・ビルブラント因子結合
ドメインを含む■因子の領域に特異的に結合できるモノ
クローナル抗■因子抗体C4およびポリクローナル抗■
因子ペプチド抗体2645と反応するペプチドまたは■
因子ポリペプチド切片を含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基1655−1694のそれであり、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体C4およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体2645と反応する下
記のアミノ酸配列: LQSDQEE  I  DYDDT  I  SVE
MKKEDFD  IYDEDENQSPR3FQKK
を持つペプチドを含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基1655−1694のそれで、l、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体C4およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体2645と反応する下
記のアミノ酸配列: LQSDQF、EIDYDDTISVEMKKEDFD
 IYDEDENQSPR5FQKKを持つペプチドの
逐次サブセットから成るペプチドを含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基1655−1694のそれであり、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体C4およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体2645と反応する下
記のアミノ酸配列: VEMKKEDFD IYDEDE を持つペプチドを含む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子の■因子への
結合を阻止し、アミノ酸配列が■因子の配列のアミノ酸
残基1655−1694のそれであり、フォン・ビルブ
ラント因子結合ドメインを含む■因子の領域に特異的に
結合できるモノクローナル抗■因子抗体C4およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体2645と反応する下
記のアミノ酸配列: VEMKKEDFD IYDEDE を持つペプチドの逐次サブセットから成るペプチドを含
む。
本発明は更に、フォン・ビルブラント因子結合部位が欠
失しているか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変
化が生じたか、またはフォノ。ビルブラント因子の結合
部位に作用する■因子の配列に欠失または変化を生じ、
その結果フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか
、または無くなっているヒト■因子の突然変位種を含む
本発明はさらに、アミノ酸残基1655−1694のな
かに、フォン・ビルブラント因子結合部位が欠失してい
るか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変化が生じ
たか、またはフォン・ビルブラント因子の結合部位に作
用する■因子の配列に欠失または変化を生じ、その結果
フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか、または
無くなっているヒト■因子の突然変位種を含む。
本発明はさらに、アミノ酸残基1670−1684のな
かに、フォン・ビルブラント因子結合部位が欠失してい
るか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変化が生じ
たか、またはフォン・ビルブラント因子の結合部位に作
用する■因子の配列に欠失または変化を生じ、その結果
フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか、または
無くなっているヒト■因子の突然変位種を含む。
本発明はさらに、薬理学的に受容できる担体と一緒に、
患者のなかでフォン・ビルブラント因子の■因子への結
合を阻止するのに有効な量のペプチドを含む治療薬組成
物を含む。
本発明はさらに、これらのペプチドの有効量を色者に投
与することによって患者の血栓痙を阻止する方法を含む
本発明はさらに、薬理学的に受容できる担体と一緒に、
フォン・ビルブラント因子阻止活性から来る患者の■因
子欠乏を治療するのに有効な量のヒト■因子の突然変位
種を含む治療薬組成物を含む。
本発明はさらに、これらの突然変位種■因子の有効量を
患者に投与することによって患者のフォン・ビルブラン
ト因子阻止活性から来る■因子欠乏を軽減する方法を含
む。
本発明はさらに、フォン・ビルブラント因子結合ドメイ
ンを含む■因子のアミノ酸配列に基づくペプチドおよび
これらのペプチドの逐次サブセットを使う精製された■
因子の調製の改良法を含む。
(発明の詳細な説明) 上記のように、本発明はv W FへのF■の結合を阻
止し、アミノ酸配列はF■の切片のそれであり、v W
 F結合ドメインを含むF■の領域に特異的に結合する
ことができるモノクローナル抗F■抗体C4およびポリ
クローナル抗■因子ペプチド抗体2645と反応するポ
リペプチド切片および合成ペプチドを包含する。
さらに、本発明はv W FのためのF■の結合ドメイ
ンとしてFVI配列VEMKKEDFD IYDEDE
 (1670−1684)およびLQSDEE[DYD
DTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPR3
FQKK (1655−1694)を同定する。これら
の発見はv W FからF■を完全に除(能力を持つF
■合成ペプチドの設計のための基礎を与える。そのよう
なペプチドは、生理学的イオン濃度においてv W F
からF■を除くのに使用できる可能性がある。インビト
ロではこの排除は他の分子を含まないF■またはv W
 Fの精製に使用できる。インビボでは、そのような排
除は循環するF■の半減期を短縮させることによって抗
血栓症的介入物として使用できる。
F■−v W F錯体を解離させうるF■ペプチドの開
発は、血漿および市販のFVI濃厚品からのF■の精製
に有用である。若干の方法は、生成物の凝集試験を阻害
しまた追加の脱塩工程の要る0、 3M CaC1zの
ような高濃度の塩を含む緩衝液で支持媒体に結合した抗
vWF抗体に結合したvWFからF■を溶出させるやり
方に頼っている。VF、MKKEDFD I YDED
EおよびLQSDEE IDYDDTISVEMKKE
DFDIYDEDENQSPR3FQKKまたはそれら
のサブセットによる溶出は、この問題を解消することが
できる。
更に、これらのペプチドによる血漿中のv W Fから
のF■の解離は、F■モノクローナル抗体による血埜か
らの直接の精製を可能にする。これで、低温沈澱工程で
失われるF■の約40−50%の回収が可能になる。V
EMKKEDFD IYDEDBまたはそのサブセット
への抗体は、トロンビンで活性化したF■から不活性化
したF■を分離すルノニ使用できる。VEMKKEDF
D IYDEDEはトロンビンによってL−1illか
ら切断されたF■分子の一部の上に存在する。すなわち
、その後イミュノアフィニティー・クロマトグラフィー
の間に、未解裂のL −11だけがVEMKKEDFD
IYDEDEへの抗体に結合する。VEMKKEDFD
 IYDEDEまたはそのサブセットは、溶出に使用で
きる。
VEMKKEDFD IYDEDEまたはLQSDEE
IDYDDTrSVEMKKEDFDIYDEDENQ
SPR3FQKKまたはC4および2645のようなモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗F■抗体によるv
 W FからのF■の解離は、F■水準の低下および抗
擬集状態の導入のよる抗血栓症治療法として使用できる
v W F結合が減少するか、または無くなってしまう
v W F結合部位の欠失、またはv W F結合部位
の変化による、合成の組換えDNAで生産されたF■は
、v W FまたはF■活性がほとんどないか、又は測
定不能である、v W Fへの獲得抑制性抗体(後天性
阻止抗体)を持った患者の治療に有用である。vWF結
合能力のないF■の投入は、そのような抗v W F抗
体の影響を受けず、F■の治療濃度は患者の出血体質を
部分的に補正することによって達成できる。
モノクローナル抗F■抗体C4は放射能標識法およびE
LISA法において、v W FへのF■の結合をブロ
ックすることがわかった。C4のエピトープはF■のv
 W F結合ドメインのそれの近くに存在しなければな
らない。それゆえC4抗体はv W F結合ドメインの
マーカーとして使用された。
固相のv W FへのF■結合の競合的阻止試験は1m
lの0. OI M  P 0.0.15 M  N 
a C+、0.02%N a N s  pH7,3(
P B S )中5/jgの全未還元vWFを用い、1
611N径の組織培養ウェルあたり1/4インチ径のポ
リスチレンビーズ(イリノイ州、ロックフォード、ピア
ス・ケミカル・カンパニー)3個を使って室温で2時間
培養して行った。溶液を取り出し、ウェルとビーズを、
0.05%ツイーン−20および3%ヒト血清アルブミ
ンを含むPB31mlで1時間室温でブロックした。ウ
ェルとビーズはこのあと使用するまで4℃でこの溶液中
に貯蔵した。ウェルとビーズは使用の前にツイーン−2
0を0.05%含むPBSで2回洗い、0.05Mイミ
ダゾール、0.15MNact、0.02% Na N
 s  pH7,C13mMCaCl、中1.5単位の
精製F■および0−200μgのモノクローナル抗F■
抗体C4または0−400μgのポリクロナール抗F■
抗体2645で1時間半室温で培養した。つぎに、ビー
ズをツイーン−20を0.05%含むPBSで3回洗い
、ツイーン−20を0.05%含み0.5%のウシ・ガ
ンマアルブミンを含むPBSLml中1.2−2.4 
Xl 0 ” cpsの125■−モノクローナル抗F
■抗体C2(比活性8.3 9.9 X l 09cp
n+/ng)または2.4−4.9X10&cpsの目
SI−モノクローナル抗F■抗体C5(比活性1.2−
3.2X1010cpm/+++g)で室温で1時間半
培養した。培養のあと、ウェルとビーズはツイーン−2
0を0.05%含むPBSで2回洗った。ビーズを綺麗
なウェルに移し、もう2回洗い別々に結合放射能を測定
した。
放射能はガンマ計数管で測った。
+t%l  C2またはC5が結合していないことはC
4または2645がv W FのF■への結合をブロッ
クしたことを示している。C4も2645も投与量依存
の形でv W FへのF■の結合を阻止した0代表的な
実験では、固定されたv W Fに錯体化されたF■へ
の結合を示すIts(C2の結合総カウント数は422
6cpn+(バックグラウンド上カウント)であった、
10μg/mlの濃度の04をFVI溶液に加えてポリ
スチレンビーズと一緒に培養したとき、結合カウントは
1947cpmに減少し、すなわちv W Fに結合し
たF■の量は54%減少した。+!51  C5を使用
したときは結合カウントの同様の減少が見られたのでこ
のC4の効果は目57  C2の結合の阻止を含まない
ことがわかった。C5はF■のH−111上の部位に結
合し、C2が結合しv W Fの結合ドメインがあるし
一鎖には結合しない、C4の濃度を100μg7mlに
増すと、総カウントはバンクグラウンド上27 cpm
 となりF■結合をほぼ完全に阻止した。
下記の表は、C4の添加濃度を増して行ったときのF■
結合の阻止率を要約したものである二C4(μg/ml
)   阻止率%    CPMO0%      4
226 10      54%     194720   
   63%     157750      91
%     485100      100%   
 27200      100%    0ポリクロ
一ナル抗F■ペプチド抗体2645を50μg/mlの
濃度でF■培養工程に加えた場合は、結合カウントは4
146から2698に減少した。
300μg/mlの濃度を加えた場合は結合カウントは
バックグラウンド上300cpmに減少した。下記の表
は、ポリクローナル抗体2645の添加濃度を増して行
ったときのF■結合の阻止率を要約したものである: 2645 (pg/n+1)  阻止率%    CP
Mo        0%(定義”)   41462
  (120%          332650  
           35 %          
2698100            59  % 
         1706200         
   84  %          669300 
           93  %         
 300400            99  % 
         25濃度200μg’/ml以下の
アミノ酸残基1660−1674から成るF■合成ペプ
チドに対して製造されたモノクローナル抗体または濃度
400μg/ml以下のアミノ酸残基1680−169
4から成るF■合成ペプチドに対して製造されたポリク
ローナル抗体の添加は、F■結合の有意の阻止を示さな
かった。すなわち、F■のv W F結合ドメインは、
VEMKKEDFD IYDEDE (1670−16
84)またはそのサブセット内に存在する。
C4の結合エピトープの部位は、ELISA法における
このペプチドによるF■への04の結合の競合的阻止に
よってやはりVEMKKEDFDIYDEDE (16
70−1684)内に含まれることか示された。この方
法では、精製したヒトF ■ を 2 0 IIM ト
  リ  ス −  HCI   X  O,02% 
NaN  3p H9,6に1あたり約3単位に希釈し
、100μlを多つェルMi織培養プレート(リンプロ
、フロー・ラボラトリーズ・インコーポレイション)の
各1. OX O,6cmのウェルに入れ、室温で2時
間培養した。つぎに、このプレートを使用するまで、こ
の溶液中に4℃で貯蔵した。使用の前に溶液を除きウェ
ルを20mM)リス−MCI、0.02%NaN5  
1%ウシ血清アルブミン(BSA)の200μmで室温
で1時間ブロックした。ブロッキングのあと溶液を除き
、ウェルを0.14MNaC1,0,0015M KH
z  PO40,0084M NazHPOa   0
.05%ノニデソトP−40を含む緩衝液(洗浄緩衝液
)の250μmで3回洗浄した。
別に、精製したF■を0.OLM Na HCOs中に
希釈して100μlを各ウェルに入れた。その後、プレ
ートを室温で乾燥し、使用するまで4℃で貯蔵した。使
用の前にウェルは上述のようにプロックし洗浄した。つ
ぎに、モノクローナル抗体C4およびF■ペプチドを含
む試料溶液100μを各ウェルに加えた。1%BSAを
含む洗浄緩衝液中0.1ないし1Mg/mlの最終濃度
の04および1nMないし1mMの最終濃度のF■ペプ
チドをウェルへの添加の前に37℃で1時間または4℃
で一夜予備培養した。室温で1時間の培養の後、試料溶
液を取り出しウェルを250μlの洗浄緩衝液で3回洗
浄した。1%BSAを含む洗浄緩衝液で1 j 200
0に希釈したパーオキシダーゼ・ヤギ抗マウスIgG 
(H+L)(ザイメッド・ラボラトリーズ・インコーホ
レイシラン)100μlを各ウェルに加え、1時間室温
で培養した0次いで溶液を除き、ウェルを250μmの
洗浄緩衝液で4回洗浄した。0.024M クエン酸、
0.051阿NatHPOa   0.03%過酸化水
素を溶かした0−フェニレンジアミン基体(ザイメソド
)100ulを各つ:f:、 ルニ加え、2M Hz 
S Os  100μlでクエンチングする前に室温で
5ないし10分間培養した。各ウェルの色の変化をMR
600マイクロプレート・リーダー(ダイナチック・イ
ンスッルーメント・インコーホレイシラン)で読み取っ
た。
この系では、色のないことがVEMKKEDFDIYD
EDE (1670−1684)による抗体結合のブロ
ッキングを示した。代表的な実験では、0.7.17 
(/m1(7) ta度の04がF■に結合し、0゜8
69という吸光度(OD)の読みを与えた。■、uMO
)濃度(7)VEMKKEDFD IYDEDE(16
70−1684)によるC4の予備培養は、測定ODが
0.044に減る結果となりF■への抗体の結合の95
%の減少を示した。さらに、アミノ酸残基1665−1
679および1680−1694から成るペプチドは、
F■への04の結合を有意にブロックできなかった。1
M台の濃度ではこれらのペプチドはそれぞれ15%およ
び21%しかC4結合を減少させなかった。 ■因子の
アミノ酸配列にもとすくペプチドおよびこのペプチドの
少なくとも3個のアミノ酸残基の逐次サブセットは、ホ
ートンら、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナシジナル
・アカデミ−・オプ・サイエンシズ、第82巻、513
5頁(1985年)に記載された方法で合成した。
ペプチドの固相合成の公知の方法では、所望のペプチド
はベンズヒドリルア°ミンまたはクロルメチル化樹脂(
架橋ポリスチレンから誘導され、化学品業者から入手で
きる)のような不溶性の支持体から出発して組み立てら
れる。所望のポリペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸
は、α−アミノ窒素および他の反応性部位に保護基を有
しており公知のペプチド結合法を用いて溶液から樹脂に
接続される。α−アミノ基の保護基は除去され(他の保
護基は、もしあればそのまま残す)、所望の配列の次の
アミノ酸(適当な保81を基を持つ)が接続され、それ
が操り返される。所望のポリペプチドが完全に出来上が
ったならば、それは樹脂支持体から切り離され、すべて
の保護基が除去され、ポリペプチドが回収される。適当
な保護基の例は:α−アミノ基にはα−tert−ブチ
ルオキシカルボニル;システィンのチオール基、アスパ
ラギン酸のβ−カルボン酸基、グルタミン酸のγ−カル
ボン酸基およびセリン、スレオニンおよび千ロジンの水
酸基にはベンジル、4−メトキシベンジルまたは4−メ
チルベンジル;ヒスチジンおよびトリプトファンの環内
窒素およびリシンのε−アミノ基にはベンジルオキシカ
ルボニルまたはその2−クロロ−または3,4−ジメト
キシ誘導体;アスパラギンおよびグルタミンのアミド窒
素にはp−ニトロフェニル;およびアルギニンのグアニ
ジン基にはニトロまたはトシルである。
この開示の目的のために、受容されているアミノ酸の略
記法を使用した。完全な一覧表を下記に示す。
一字および工学のアミノ酸略記法 A  Ala  アラニン CCys  システィン D  Asp  アスパラギン酸 E  Glu  グルタミン酸 F  Phe  フェニルアラニン G  Guy  グリシン HH4s  ヒスチジン I  lie  イソロイシン K  Ly3  リジン L Leu ロイシン M  Met  メチオニン N  Asn  アスパラギン P  Pro  プロリン Q  Gln  グルタミン RArg  アルギニン S  Ser  セリン T  Thr  スレオニン V  Val  バリン W Trp トリプトファン Y  ’l”yr  チロシン B  Asx  AspまたはAsn、識別不能Z  
Glx  GluまたはQ 1 n 、 iia別不能
X X   未測定または非定形アミノ酸突然変位種■
因子分子は、vWF結合の減少または消滅をもたらすv
 W F結合部位の消滅またはv W F結合部位の変
化を伴う組換えDNA法によって製造できる。まずv 
W Fのために抗体結合部位を定義づける線状アミノ酸
配列が決定される。
これは抗体が結合する■因子の一番小さい蛋白質分解切
片を決定することによって達成される。配列が分かると
、これらの切片のアミノ酸配列に基づく合成ペプチドが
合成され、個々のアミノ酸が系統的に消去され或いは置
換される。抗体のこれらの配列との反応性から、臨界的
アミノ酸が決定される。エピトープの臨界領域がわかる
と、エピトープの臨界領域内で置換または消去が行われ
る突然変位種■因子分子を製造することが出来る。
所望の■因子突然変位種ポリペプチドを組換えDNA法
で製造するには、ヒト■因子の遺伝子をクローンし、特
定部位の突然変位誘発を含む種々の方法で処理し、細胞
に挿入し、■因子の表現に使用する。遺伝子の説明およ
びその使用法については、ギフトシャイヤー J、ら、
「ヒト■因子遺伝子の特徴」、ネイチャー、第312巻
、326−330頁、ウッド、ウィリアム1.ら、「組
換えDNAクローンからの活性ヒト■因子の表現」、ネ
イチャー、第312巻、330−337頁、およびツー
ル、リジンJ、ら、rcDNAをコードするヒト抗血友
病因子の分子クローニング」、ネイチャー、第312巻
、342−347頁を参照されたい。特定部位の突然変
位誘発の種々の方法が使用でき、例えばシトシン残基の
単一塩基対変化を重亜硫酸塩のような薬品を使って生じ
させうる。この薬品はシトシンを脱アミンしてウラシル
に変えるもので、この塩基がチミンと同様に対を成す。
重亜硫酸ナトリウムによる特定部位の突然変位誘発の説
明については、ジロートル、ダビツトら「特定部位の突
然変位誘発」、アニュアル・レビュー・オブ・ジェネテ
ィソクス、第15巻、265−294頁を参照されたい
。別の方法として、オリゴヌクレオチド−指向の突然変
位誘発を使うことができる。説明としては、シラー、マ
ークJ、およびスミス、マイケル、「M13ベクトル中
ヘクローンされたDNA切片のオリゴヌクレオチド−指
向の突然変位誘発」メソード・イン・エンザイモロジー
、組換えDNA、Bの部、第100巻、468−500
頁を参照されたい。
ポリクローナル抗体2645は、ペプチドVEMKKE
DFDIYDEDE (1670−1684)によるウ
サギの免疫によってレイズ(raise)即ち高められ
た。F■配列からのアミノ酸残基1670−1684を
含む合成VEMKKEDFDTYDEDEペプチドは前
記の方法で合成された。
つぎに、合成ペプチドは担体蛋白質であるキーホール・
リンペット・ヘモシアニン(KLH)に下記のようにし
て結合させた: 1) 所望量のペプチドおよび等量の担体を秤量する。
2) ペプチドおよび担体蛋白質を燐酸塩緩衝塩水(P
BS)に溶解し、2 mg/ml の担体最終濃度に希
釈する。
3) 担体−ペプチド溶液1mlあたり124μlの作
用グルタルアルデヒドを加える。
4) 室温で一夜撹拌する。
5) 上流水に対して少なくとも6時間透析する。
6) 凍結乾燥する。
7) 回収された物質を秤量し、結合パーセントを知る
担体蛍白質の90%の回収が推定された0例えば、20
mgの担体と2(lagのペプチドから出発して透析と
冷凍乾燥のあと30mgが回収された。30mgのうち
18mgが担体蛍白質、12mgがペプチドであった。
完全フロインドアジュバント中1ミリグラムの結合ペプ
チドをニューシーラント白ウサギに複数の注射部位で皮
下注射した。不完全フロインドアジュバント中1mgの
結合ペプチドを一週間おきに3回同じ方法で追加免疫し
た。動物は最終の注射の後およびそのあと2週間毎に採
血した。
ウサギの抗体の精製は、蛋白質A−セファロース上での
アフィニティー・クロマトグラフィーによった。エイら
、「蛋白tAセファロースを使用するマウス血清からの
純粋のIgG1、IgG2aおよびI gG2 b免疫
グロブリンの単離」、イミュノケミストリー、第15巻
、429−436M(1978年)を参照されたい、ウ
サギ血清の3mlの試料を0.14モルの燐酸ナトリウ
ム緩衝液(pH8)中に1=5に希釈し、9.5cmX
1cmの蛋白WA−セファロース(ファーマシア)のカ
ラムに加えた。次に、カラムをこの緩衝液で洗うで、吸
着されていない蛋白質を除去した。0.10モルのクエ
ン酸ナトリウム緩衝液(p H3)でウサギIgGをカ
ラムから溶出した。蛋白質のピークを0.05モルトリ
ス(MCI)、0.15モル塩化ナトリウム、0.02
%アジ化ナトリウム(pH7,35)に対して透析した
モノクローナル抗体C4(フルチャーら、ヒト■因子プ
ロコアキュラント蛋白質:モノクローナル抗体が前駆体
生成物の関係および機能エピ)−プを決める、ジャーナ
ル・オブ、ザ・クリニカル・インベスティゲーション、
第76巻、117124頁(1985年)に既に記載さ
れている〕は、■因子のVWFへの結合を阻止するF■
:Cのための抗体である。
ハイプリドーマ細胞系を産生ずるモノクローナル抗体C
4を造るために、完全フロインドアジュバント中1μg
の精製■因子二〇を腹膜内注射してB a l b /
 cマウスを免疫した。不完全フロインドアジュバント
中10−および50μgの追加免疫を1週間間隔で与え
た。最終の100μgの追加免疫は、アジュバントなし
で融合の3日前に与えた。4週間目に、ブラウンら、ジ
ャーナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリー、
第255巻、4980−4983頁<1980年)に記
載された方法でマウスの肺臓細胞をP3X63マウス形
質細胞腫細胞と融合させた。細胞の培養およびマウス腹
水中のモノクローナル抗体の産生は実質上、リューら、
ジャーナル・オブ・ザ・イミュノロジー、第124巻、
2728−2736g(x9so年)によった。抗体は
、リンプロータイターチック(カリフォルニア州、イン
グルウッド、フロー・ラボラトリーズ)プレート中での
固相試験を用い、またパーオキシダーゼ−抗体コンジュ
ゲート(カリフォルニア州、パーリンガム、ザイメッド
)を使用するイングバルおよびパールマン、イミュノケ
ミストリー、第8巻、871−874頁(1971年)
に記載された方法による酵素結合の免疫吸着検出システ
ムを使って選択した。プレートをLQOnHの精製■因
子:Cでコーティングした。クローンはまた、ウェルあ
たり1100nのヒトフィブロノーゲンでコーティング
したプレート、100nHのヒトフィブロネクチンでコ
ーティングしたプレートおよび1100nのヒトフォン
・ビルプラント因子でコーティングしたプレートに対し
てスクリーニングした。この各蛋白質は、免疫源の潜在
的な汚染物である。■因子:Cでコートしたプレート上
でだけ陽性であったクローンは、改良カスパー試験(カ
スパーら、Thromb、 Diath、 Haemo
rrh、  第34S869−872頁(1975年)
参照)を使って血漿■因子:C活性を阻止する能力をも
試験した。培養液の上澄液は、等容量の正常なプールし
たヒト血漿と一緒に培養し、フルチャーら、プロシーデ
インゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・
サイエンシズ、第79巻、1648−1652頁(19
82年)に記載された試験緩衝液に0゜5Mクエン酸ナ
トリウムの2%(vol/vol)を加えたもの(p 
H6,5)に1=10または1:20に希釈した。培養
は37℃で2時間行い、そのあと試料は■因子:Cプロ
コアギュラント活性について試験した。クローンC4か
らの培養液上澄液は、対照の(非抗■因子:Cの上澄液
)培養物に比べて残留血漿■因子:C活性の75%を阻
止した。
培養液上澄液は、市販の抗血清(インデイアナ州、エル
クハート、マイルス・ラボラトリーズ・インコーポレイ
ション)を使ってアガロースゲル中の二重拡散法で免疫
グロブリンのクラスおよびサブクラスについて試験した
。マウス腹水液の蛋白質A−セファロースクロマトグラ
フィーにュージャージー州、ビスキャタウエー、ファー
マシア・ファインケミカルズ)は、エイら、イミュノケ
ミストリー、第15巻、479−436頁(1978年
)に記載された方法で行った。精製された抗体は、YM
−10メンプランを使用して加圧限外濾過撹拌セル(マ
サチュセソツ州、デンバース、アミコン・コーポレイシ
ョン)中で濃縮し、小分けして一70℃で貯蔵した。蛋
白質A−セファロースで精製したモノクローナル抗体は
、改良カスパー試験(カスパーら、Thromb、 D
iath。
Haemorrh、  第34巻869−872頁(1
975年)参照)を使って血漿■因子:Cブロコアギュ
ラント活性を阻止する能力を試験した。
本発明の一つ以上のペプチドは、治療、診断その他の用
途に、医薬調合品に配合することができる。静脈内投与
用にそれらを調製するためには、塩化ナトリウム(例え
ば0.35−2.0M)、グリシンなどのような生理学
的に共存しつる物質を含み、生理学的条件と共存しうる
緩衝されたpHを有する水に組成物を溶かす。血栓症の
防止のための投与量は、患者の血栓症のひどさに左右さ
れるが、個々の患者について容易に決めることができる
ンデイシッン 代  理  人  新  実  健  部 (外1名)
1、事件の表示 21発明の名称 3、補正をする者 事件との関係 4゜ 代 理 手 続 補 正 書 昭和63年特許願第306758号 ■因子のフォン・ビルブラント因子結合ドメイン

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を含むフォン・ビルブラント因子結合ドメインを含むV
    III因子の領域に特異的に結合できるモノクローナル抗
    VIII因子抗体C4およびポリクローナル抗VIII因子ペプ
    チド抗体2645と反応するペプチドまたはVIII因子ポ
    リペプチド切片。
  2. (2)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 の逐次サブセットを含むフォン・ビルブラント因子結合
    ドメインを含むVIII因子の領域に特異的に結合できるモ
    ノクローナル抗VIII因子抗体C4およびポリクローナル
    抗VIII因子ペプチド抗体2645と反応するペプチドま
    たはVIII因子ポリペプチド切片。
  3. (3)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を含むフォン・ビルブラント因子結合ドメインを含むV
    III因子の領域に特異的に結合できるモノクローナル抗
    VIII因子抗体C4およびポリクローナル抗VIII因子ペプ
    チド抗体2645と反応するペプチドまたはVIII因子ポ
    リペプチド切片。
  4. (4)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 の逐次サブセットを含むフォン・ビルブラント因子結合
    ドメインを含むVIII因子の領域に特異的に結合できるモ
    ノクローナル抗VIII因子抗体C4およびポリクローナル
    抗VIII因子ペプチド抗体2645と反応するペプチドま
    たはVIII因子ポリペプチド切片。
  5. (5)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基1655−1694のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体C4および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体2645と反応
    する下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を持つペプチド。
  6. (6)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基1655−1694のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体C4および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体2645と反応
    する下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を持つペプチドの逐次サブセットを含むペプチド。
  7. (7)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基1670−1684のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体C4および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体2645と反応
    する下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を持つペプチド。
  8. (8)フォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を
    阻止し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
    残基1670−1684のそれであり、フォン・ビルブ
    ラント因子結合ドメインを含むVIII因子の領域に特異的
    に結合できるモノクローナル抗VIII因子抗体C4および
    ポリクローナル抗VIII因子ペプチド抗体2645と反応
    する下記のアミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を持つペプチドの逐次サブセットを含むペプチド。
  9. (9)フォン・ビルブラント因子結合部位が欠失してい
    るか、フォン・ビルブラント因子結合部位に変化が生じ
    たか、またはフォン・ビルブラント因子の結合部位に作
    用するVIII因子の配列に欠失または変化を生じ、その結
    果フォン・ビルブラント因子の結合が減少するか、又は
    無くなっているヒトVIII因子の突然変位種。
  10. (10)アミノ酸残基1655−1694のなかにフォ
    ン・ビルブラント因子結合部位が無いか、フォン・ビル
    ブラント因子結合部位に変化を生じたか、またはフォン
    ・ビルブラント因子の結合部位に作用するVIII因子の配
    列に欠失または変化を生じ、その結果フォン・ビルブラ
    ント因子の結合が減少するか、又は無くなっているヒト
    VIII因子の突然変位種。
  11. (11)アミノ酸残基1670−1684のなかにフォ
    ン・ビルブラント因子結合部位が無いか、フォン・ビル
    ブラント因子結合部位に変化を生じたか、またはフォン
    ・ビルブラント因子の結合部位に作用するVIII因子の配
    列に欠失または変化を生じ、その結果フォン・ビルブラ
    ント因子の結合が減少するか、又は無くなっているヒト
    VIII因子の突然変位種。
  12. (12)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項1のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  13. (13)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項2のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  14. (14)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項3のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  15. (15)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項4のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  16. (16)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項5のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  17. (17)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項6のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  18. (18)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項7のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  19. (19)薬理学的に受容できる担体と一緒に、患者のな
    かでフォン・ビルブラント因子のVIII因子への結合を阻
    止するのに有効な量の請求項8のペプチドまたはVIII因
    子ポリペプチド切片を含む治療薬組成物。
  20. (20)請求項1の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  21. (21)請求項2の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  22. (22)請求項3の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  23. (23)請求項4の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  24. (24)請求項5の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  25. (25)請求項6の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  26. (26)請求項7の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  27. (27)請求項8の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする血栓症に罹った患者の血栓症を阻止する
    方法。
  28. (28)薬理学的に受容できる担体と共に、フォン・ビ
    ルブラント因子阻止活性から来る患者のVIII因子欠乏を
    治療するのに有効な量の請求項9のヒトVIII因子の突然
    変位種を含む治療薬組成物。
  29. (29)薬理学的に受容できる担体と共に、フォン・ビ
    ルブラント因子阻止活性から来る患者のVIII因子欠乏を
    治療するのに有効な量の請求項10のヒトVIII因子の突
    然変位種を含む治療薬組成物。
  30. (30)薬理学的に受容できる担体と共に、フォン・ビ
    ルブラント因子阻止活性から来る患者の因子欠乏を治療
    するのに有効な量の請求項11のヒトVIII因子の突然変
    位種を含む治療薬組成物。
  31. (31)請求項9の生成物の有効量を患者に投与するこ
    とを特徴とする、患者のフォン・ビルブラント因子阻止
    活性から来るVIII因子欠乏を軽減する方法。
  32. (32)請求項10の生成物の有効量を患者に投与する
    ことを特徴とする、患者のフォン・ビルブラント因子阻
    止活性から来るVIII因子欠乏を軽減する方法。
  33. (33)請求項11の生成物の有効量を患者に投与する
    ことを特徴とする、患者のフォン・ビルブラント因子阻
    止活性から来るVIII因子欠乏を軽減する方法。
  34. (34)(a)フォン・ビルブラント因子結合ドメイン
    およびそのペプチドの逐次サブセットを含むVIII因子の
    アミノ酸配列に基づくペプチドに対して高められたモノ
    クローナル抗体に結合した粒子の上に組み換えで製造し
    た血漿または市販の濃厚品からのVIII因子を吸収させ、 (b)吸収されたVIII因子を溶出させ、 (c)高度に精製されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子調製の改良法。
  35. (35)モノクローナル抗体が下記のアミノ酸配列:【
    遺伝子配列があります】 のペプチドに対して高められ、かつアミノ酸配列がVII
    I因子配列のアミノ酸残基1655−1694およびそ
    のペプチドの逐次サブセットのそれであることを特徴と
    する請求項34の方法。
  36. (36)モノクローナル抗体が下記のアミノ酸配列:【
    遺伝子配列があります】 のペプチドに対して高められ、かつアミノ酸配列がVII
    I因子配列のアミノ酸残基1670−1684およびそ
    のペプチドの逐次サブセットのそれであることを特徴と
    する請求項34の方法。
  37. (37)(a)VIII因子を結合するモノクローナル抗体
    に結合した粒子の上に組み換えで製造した血漿または市
    販の濃厚品からのVIIIを吸収させ、 (b)吸収されたVIII因子をフォン・ビルブラント因子
    結合ドメインおよびそのペプチドの逐次サブセットを含
    むVIII因子のアミノ酸配列に基づくペプチドで溶出させ
    、 (c)高度に精製されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子調製の改良法。
  38. (38)工程(b)に使用される溶出剤が下記のアミノ
    酸配列: 【遺伝子配列があります】 を有するペプチドであり、そのアミノ酸配列がVIII因子
    の配列のアミノ酸残基1655−1694およびそのペ
    プチドの逐次サブセットのそれであることを特徴とする
    請求項34または37の方法。
  39. (39)工程(b)に使用される溶出剤が下記のアミノ
    酸配列: 【遺伝子配列があります】 を有するペプチドであり、かつアミノ酸配列がVIII因子
    の配列のアミノ酸残基1670−1684およびそのペ
    プチドの逐次サブセットのそれであることを特徴とする
    請求項34または37の方法。
  40. (40)工程(b)に使用される溶出剤がフォン・ビル
    ブラント因子結合ドメインおよびそのペプチドの逐次サ
    ブセットを含むVIII因子のアミノ酸配列にもとずくペプ
    チドであることを特徴とする請求項34の方法。
  41. (41)工程(b)に使用される溶出剤が塩溶液である
    ことを特徴とする請求項34の方法。
  42. (42)塩溶液が塩化カルシウムであることを特徴とす
    る請求項41の方法。
  43. (43)工程(a)における吸収剤粒子がアガロースで
    あることを特徴とする請求項34または37の方法。
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