JP2631127B2 - フォン・ビルブラント因子の▲ｖｉｉｉ▼因子結合ドメイン - Google Patents

フォン・ビルブラント因子の▲ｖｉｉｉ▼因子結合ドメイン

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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 本発明は、VIII因子（FVIII）へのフォン・ビルブラ
ント因子−von Willebrand factor−（vWF）の結合を阻
害するペプチドに関する。
vWFおよびFVIIIは、どちらも、止血の持続に重要では
あるが、違った機能を持っている。vWFは、血管の損傷
部位における血小板−管壁の相互作用に関与し、FWIII
は、血小板およびカルシウム・イオンの存在におけるIX
a因子によるＸ因子の活性化を促進する。vWFおよびFVII
Iは、静電気力および疎水力の両方によって結合してい
ると考えられる非共有結合の複合体として血漿内を循環
する。vWFは、インビトロでFVIIIを安定化し循環中のそ
の半減期を延長すると考えられる。そのため、内因性vW
Fの不存在下では、FVIIIの循環半減期は、著しく減少す
る。FVIIIは、血液凝固の固有の進路に参加するので、F
VIIIとvWFの相互作用を妨害できる薬剤は、血漿中のFVI
II濃度を変化させ、こうして、抗血栓剤として作用す
る。本発明のペプチドは、vWFへのFVIIIの結合を阻止す
ることによって、抗血栓剤として作用する機能を有す
る。それらは、また、FVIIIが産生されるインビトロの
環境下でFVIIIを安定化擦る能力をも有する。
（発明の要約） 本発明は、VIII因子へのフォン・ビルブラント因子の
結合を阻害し、そのアミノ酸配列が、フォン・ビルブラ
ント因子のフラグメントのそれであり、かつ、VIII因子
結合ドメインを含むフォン・ビルブラント因子の領域に
特異的に結合することのできるモノクローナル抗vWF抗
体C3と反応する、下記の配列から選ばれる、29kDaポリ
ペプチド・フラグメントから成る。
特に好ましいのは、そのポリペプチドが、アミノ末端
アミノ酸残基3Serで始まり、ほぼカルボキシ末端アミノ
酸残基244Leuで終わるアミノ末端配列を有することを特
徴とする、VIII因子へのフォン・ビルブラント因子の結
合を阻害するポリペプチドである。
そのほかに好ましいのは、そのポリペプチドが、アミ
ノ末端アミノ酸残基24Gluで始まり、ほぼカルボキシ末
端アミノ酸残基265Serで終わるアミノ末端配列を有する
ことを特徴とする、VIII因子へのフォン・ビルブラント
因子の結合を阻害するポリペプチドである。
そのほかに好ましいのは、そのポリペプチドが、アミ
ノ末端アミノ酸残基44Glyで始まり、ほぼカルボキシ末
端アミノ酸残基285Asnで終わるアミノ末端配列を有する
ことを特徴とする、VIII因子へのフォン・ビルブラント
因子の結合を阻害するポリペプチドである。
本発明は、さらに、VIII因子へのフォン・ビルブラン
ト因子の結合を阻害し、かつ、VIII因子結合ドメインを
含むフォン・ビルブラント因子の領域に特異的に結合す
ることのできるモノクローナル抗vWF抗体C3と反応し、
かつ、下記の配列を有するポリペプチド・フラグメント
の少なくとも３個のアミノ酸残基の配列サブセットを含
むペプチドをも含む。
本発明は、さらに、その増殖の上澄液の成分として、VI
II因子結合ドメインを含むフォン・ビルブラント因子の
領域に特異的に結合することのできるモノクローナル抗
vWF抗体C3を提供する、新規なマウス−マウス・ハイブ
リドーマ細胞系を含む。
本発明は、さらに、VIII因子結合ドメインを含むフォ
ン・ビルブラント因子の領域に特異的に結合することの
できるモノクローナル抗vWF抗体を含む。
本発明は、さらに、フォン・ビルブラント因子のVIII
因子への結合を阻害するポリペプチド・フラグメントお
よびそのポリペプチド・フラグメントの少なくとも３個
のアミノ酸のいずれかの配列サブセットの添加によって
VIII因子を製造する改良法をも含む。
本発明は、さらに、フォン・ビルブラント因子のVIII
因子への結合を阻害するポリペプチド・フラグメントお
よびそのポリペプチド・フラグメントの少なくとも３個
のアミノ酸のいずれかの配列サブセットに結合した粒子
を使用してVIII因子を製造する改良法を含む。
本発明は、さらに、組換え体DNA体または合成ペプチ
ド法を使用して、フォン・ビルブラント因子のVIII因子
への結合を阻害するポリペプチド・フラグメントおよび
そのポリペプチド・フラグメントの少なくとも３個のア
ミノ酸のいずれかの配列サブセットを製造する方法をも
含む。
本発明は、さらに、フォン・ビルブラント因子のVIII
因子への結合を阻害するポリペプチド・フラグメントお
よびそのポリペプチド・フラグメントの少なくとも３個
のアミノ酸のいずれかの配列サブセットを使用して、組
換え体DNA体で産生したVIII因子を表現する改良法をも
含む。
（発明の詳細な説明） 前述の如く、本発明は、vWFのFVIIIへの結合を阻害す
る、アミノ酸配列がvWFのフラグメントのそれであり、V
III因子結合ドメインを含むフォン・ビルブラント因子
の領域に特異的に結合することのできるモノクローナル
抗vWF抗体C3と反応するポリペプチド・フラグメントお
よび合成ペプチドを包含する。
モノクローナル抗vWF抗体C3は、交差免疫電気泳動に
おいて、精製されたヒトvWFへのヒトFVIIIの結合を阻止
する能力を有することがかわっている。C3のエピトープ
は、vWFのFVIII結合ドメインの近くに位置しなければな
らない。そのため、C3抗体は、FVIII結合ドメインの標
識として使用された。
すべての未還元の125I−標識vWFを、室温で24時間、1
/25（w/w）の比でスブチリシンで処理した。つぎに、こ
の反応混合物を、予めモノクローナル抗vWF抗体C3でコ
ートしたマイクロタイター・ウエルに入れた。このウエ
ルを充分に洗い、つぎに、約90℃に加熱したSDS緩衝液
で処理し、溶液を５−15％グラジエントSDS−PAGEゲル
に通した。SDS−PAGEゲルのオートラジオグラフは、専
ら、約29kDaの分子量をもつ単一のバンドを示した。未
標識のvWFの同様の消化を行い、この反応混合物を、セ
ファロース4Bに結合したモノクローナル抗vWF抗体C3で
できたクロマトグラフィ・カラム上に置いた。次に、C3
反応性フラグメントを、3MのNaSCNで溶出し、透析し、
濃縮した。免疫ブロッティング法によって、C3反応性の
バンドを同定した。このバンドのアミノ酸配列分析によ
って、アミノ末端の約60％が、成熟vWFのサブユニット
のアミノ酸残基番号44で始まり、約20％が、残基番号24
で、約10％が、残基番号３で始まることがわかった。
上記の実験は、エピトープを、また、間接にはFVIII
結合ドメインを、vWFのアミノ末端領域に局在させた。
こうして同定したペプチドの分子量は、約29kDaであ
り、その主なアミノ末端は、成熟サブユニットのアミノ
酸残基44であるので、カルボキシ末端は、アミノ酸残基
あたり、約120という平均分子量にもとずいて、ほぼ、
アミノ酸残基285の所にあるべきである。チタニらのバ
イオケミストリー第25巻、3174−3184頁（1986年）に発
表されたvWFのアミノ酸配列によれば、残基３で始ま
り、アミノ酸残基285で終わり、FVIII結合ドメインを含
むvWFの領域を含む領域からペプチドを合成することが
可能である。
チタニらの論文では、配列分析で、残基26において、
約4:1のモル比でAlaろThrの両方が同定された。反対
に、サドラーらのプロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA第82巻、639
4−6398頁（1985年）によれば、ラムダHvWF1クローンの
ヌクレオチド配列は、残基26におけるThrを予言した。
この相違は、DNAライブラリーの作成中での蛋白質の多
型現象またはcDNA複製のエラーによることがありうる。
残基26におけるこの不確実性を考えて、残基26における
アミノ酸は、未確認のアミノ酸をあらわすＸで同定し
た。これらのペプチドは、FVIII−vWF相互作用を妨害
し、そうして、抗血栓剤として作用することができる。
同様にFVIII−vWF相互作用を妨害し、そうして、やは
り、抗血栓剤として作用することができるこの領域への
その他のモノクローナル抗体も製造することができる。
C3エピトープを局在化させ、間接的に、FVIIIを29kDa
ポリペプチド・フラグメントに結合させるのに使用する
実験方法は、あとで、これらの同じ方法を、C3エピトー
プを局在化させ、間接的に、FVIIIを170kDaポリペプチ
ド・フラグメントに結合させるのに使用する所で、さら
に詳細に説明する。
モノクローナル抗vWF抗体での免疫吸着クロマトグラ
フィーによる市販のVIII因子濃縮液（イリノイ州、カン
カキー、アーマー・ファーマシューティカル）からのFV
IIIの精製は、ファルチャーらのプロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
USA第79巻、1648−1652頁（1982年）に記載されてい
る。この方法で得られ、下記の実験に使用されるFVIII
製剤は、2900−3800単位/mgの比活性を有した。精製vWF
は、ファルチャーらの論文に記載されたようなセファロ
ースに結合したモノクローナル抗vWF抗体での免疫吸着
クロマトグラフィーによって、市販のVIII因子濃縮液
（ノリノイ州、カンカキー、アーマー・ファーマシュー
ティカル）から得た。結合vWFは、フジマラらのジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第261巻381
−385頁（1986年）に記載されているように、3MのNaSCN
で溶出し、濃縮し、そして、100,000分子量カットオフ
膜を有する接線流ミニタン限外濾過システム（マサチュ
ーセッツ州、ベッドフォードミリポア）で脱塩した。こ
の蛋白質は、さらに、0.05Mトリス、0.15M NaCl、pH7.3
5（TBS）に対して強く透析した。
マウスのモノクローナル抗FVIIIおよび抗vWF抗体を、
ファルチャーらおよびフジマラらの論文に記載されたよ
うにして製造し、精製し、特徴づけた。モノクローナル
抗FVIIIおよび抗vWF抗体の放射性ヨウ素化は、フレイカ
ーおよびスペックのバイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ第80巻、84
9−857頁（1978年）の方法に従って、３−10×109cpm/m
gの比活性まで実施した。
SPフラグメントIIIは、黄色ブドウ球菌V8プロテアー
ゼ（ミズーリ州、セントルイス、シグマ）によるvWFの
限定蛋白質加水分解によって取得し、チタニらのバイオ
ケミストリー第25巻、3171−3184頁に記載されたように
改良したジャーマらのバイオケミストリー第25巻、3156
−3163頁（1986年）の方法で精製した。すべてのフラグ
メントは、試験の前に、TBS（pH7.35）に対して透析し
た。
vWFの還元およびアルキル化は、さきにフジマラらの
論文に記載されたように実施した。
vWFの二次元交差免疫電気泳動は、ツインマーマンら
のイムノアッセイズ:1980年度クリニカル、ラボラトリ
ー・テクニックス、339−349頁、アラン・Ｒ・リス・イ
ンコーポレイション、ニューヨーク（1980年）に記載さ
れた方法を下記のように改良して実施した。ゲルボンド
（ミシシッピ州、ロックランド、FMC・コーポレイショ
ン）の10.2cm×8.3cmの小片の底部に、1.5cmの帯状にア
ガロースを注入した。精製したvWFまたはvWF、FVIIIお
よび125Iで標識づけしたモノクローナル抗体を試料ウエ
ル中で混合し、電気泳動した。つぎに、ポリクローナル
抗vWF抗体を含むウサギ血清が125−250μｌはいった第
二のゲルを注入し第一の次元に直角に第二の次元を電気
泳動した。このゲルのオートラジオグラフを作成し、こ
のゲルのクーマシーブリリアントブルー染色と比較し
た。
固相vWFに結合するFVIIIの拮抗阻害試験:1mlの0.01M
PO4、0.15M NaCl、0.02％ NaN3、pH7.3（PBS）中、50
μｇの全未反応vWFを、直径16mmの組織培養ウエルあた
り３個の1/4インチ径のポリスチレン・ビーズ（イリノ
イ州、ロックフォード、ピアス・ケミカル・カンパニ
ー）とともに、室温で２時間培養した。溶液をとりだし
て、次に、ウエルとビーズを、0.05％のTween−20と３
％のヒト血清アルブミンを含む、1mlのPBSで、室温で１
時間ブロックした。ウエルとビーズを、使用前、16時間
ないし10日間の間、４℃のブロッキィング溶液中に貯蔵
した。次に、ウエルとビーズを、PBS−0.05％Tween−20
で３回洗浄し、0.05Mのイミダゾール、0.15MのNaCl、0.
02％NaN3、pH7.0、3mMのCaClの1ml中、1.3μｇの精製FV
IIIおよび０−100μｓの拮抗リガンドと共に、室温で、
１1/2時間培養した。次に、ビーズを、PBS 0.05％Twee
n−20で５回洗浄し、0.5％コウシ・ガンマ・アルブミン
を含むPBS 0.05％Tween−20の1ml中1.5×106cpmの125I
−モノクローナル抗FVIII抗体C2（比活性3.8×109cpm/m
g）とともに、室温で、１1/2時間培養した。培養のあ
と、ウエルとビーズを、PBS−0.05％Tween−20で２回洗
浄した。つぎに、ビーズを、きれいなウエルに移し、さ
らに４回洗浄して別にカウントした。拮抗リガンドの不
存在における全cpmは種々の実験において、1340−2520c
pmの範囲にわたった。バックグラウンド・カウトは、FV
IIIの不存在において、125I−モノクローナル抗FVIII抗
体C2を、vWFでコートしたビーズとともに培養したとき
にえられたものである。これらは、60−200cpmの範囲に
あった。蛋白質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン
を使用して、ブラッドフォードのアナリティカル・バイ
オケミストリー第72巻、248−254頁（1976年）の方法で
測定した。
交差免疫電気泳動は、精製vWFと精製FVIIIとの間の複
合体の生成を示した。これは、生成物FVIIIを資料ウエ
ルに入れた時にだけ、125I−標識のモノクローナル抗FV
III抗体が、未標識のvWFと共沈することによって示され
た。FVIII結合ドメインを局在化するために、黄色ブド
ウ球菌V8プロテアーゼ消化によって得られたvWFフラグ
メントで、同様の実験を行った。黄色ブドウ球菌V8プロ
テアーゼによるvWFの限定消化は、主としてvWF内に単一
の裂開を起こして、２個の主要なフラグメントを得るこ
とが報告されている。SPフラグメントIIは、vWF分子の
カルボキシ末端部分（残基1366−2050）を含む、110kDa
ホモ−ダイマーであり、SPフラグメントIIIは、vWF分子
のアミノ末端部分を含む170−kDaホモ−ダイマーであ
る。この170−kDaポリペプチド・フラグメントは、チタ
ニらのバイオケミストリー第25巻、3171−3184頁（1986
年）に発表されたアミノ酸配列にしたがって、アミノ末
端アミノ酸残基1Serではじまり、カルボキシ末端アミノ
酸残基がアミノ酸残基1365−Gluよりさきに伸びないア
ミノ酸配列を有する。この二つノフラグメントは、vWF
サブユニットの分子塊の100％を表す。複合体の生成
は、FVIIIとアミノ末端SPフラグメントIIIとの間に示さ
れたが、カルボキシ末端SPフラグメントIIでは示されな
かった。このことは、アミノ末端SPフラグメントIII
が、そのホモ−ダイマー型において、全vWFのそれと定
性的に類似した方法で、FVIIIとの相互作用の能力を保
持することを示している。カルボキシ末端SPフラグメン
トIIは、そのホモ−ダイマー型において、このFVIII結
合能力を示さない。
モノクローナル抗vWF抗体C3は、試料ウエルに入れた
とき、FVIIIとvWFの間の複合体の生成を、著しく阻害し
たが、80種の他のモノクローナル抗vWF抗体（それぞれ
５種をプールして試験）は、効果がなかった。C3も、こ
の系内で、FVIIIとSPフラグメントIIIの間の複合体の生
成を阻害した。C3のSPフラグメントIIIとの直接の反応
性は、精製SPフラグメントIIIを含む試料ウエルに125I
−標識のC3を添加することによって示した。交差免疫電
気泳動ゲルのオートラジオグラフは、放射能で標識づけ
した抗体とSPフラグメントIIIの共沈を示した。同様の
実験で、SPフラグメントIIとの共沈は起こらなかった。
FVIIIのvWFへの結合を、よりよく特徴づけるために、
拮抗阻害試験を展開した。この試験では、精製したvWF
またはSPフラグメントIIIを、ポリスチレン・ビーズの
表面に吸着させた。つぎに、ビーズを精製FVIIIといっ
しょに培養した。精製FVIIIは、ポリスチレン・ビーズ
の表面に固定された未還元vWFおよび未還元SPフラグメ
ントIIIの両方に結合した。これは、vWFとFVIIIで順番
に培養したポリスチレン・ビーズへの125I−標識のモノ
クローナル抗FVIII抗体の結合によって示された。
FVIIIのvWFへの結合および125I−標識のモノクローナ
ル抗FVIII抗体のFVIIIへの結合は、いずれも、つぎの実
験で示されるように、この系に特異的なものであった。
まず、FVIIIの結合は、ポリスチレン・ビーズの表面に
吸着されたvWFの存在に依存することが示された。ポリ
スチレン・ビーズを、ヒト血清アルブミンでコートし、
つぎに、FVIIIと、つづいて、125I−標識のモノクロー
ナル抗FVIII抗体と一緒に培養すると、毎分カウントの
測定値は、vWFに結合したFVIIIでコートしたポリスチレ
ン・ビーズにみらえるそれの僅か２％に過ぎなかった。
第二に、vWFでコートしたポリスチレン・ビーズをFVIII
と一緒に培養しなかった場合は、ビーズに付随する毎分
カウントは、FVIII培養を含めない場合のそれの僅か１
％であった。
FVIIIの固定vWFへの結合の可逆性も、示すことができ
た。vWF−FVIII複合体からのFVIIIの解離は、クーパー
らのジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーシ
ョン、第54巻、1093−1094頁（1974年）によれば、0.25
M CaCl2の存在で、トランらのThromb.Haemostas.第50
巻、547−551頁（1983年）によれば、10−20mMEDTAの存
在で、あるいは、ワイスらのThromb.Diath.Haemorrh.第
27巻、212−219頁（1972年）によれば、１−1.5M NaCl
の存在でおこることが、わかっている。ポリスチレン・
ビーズ系においては、ポリスチレン・ビーズを、0.25M
CaCl2を含むイミダゾールで緩衝した食塩水で、37℃で
５回洗うと、vWFからのFVIIIの70±４％の解離をもたら
す。同様に、20mMのEDTAを含むイミダゾールで緩衝した
食塩水で５回洗うと、66±５％の解離をもたらし、1.5M
のNaClを含むイミダゾール緩衝液では、vWFからのFVIII
の86±１％の解離をもたらす。3mMのCaCl2を含む同じ緩
衝食塩水で５回洗った場合は、ポリスチレン・ビーズに
吸着したvWFからのFVIIIの解離は起こらなかった。
ポリスチレン・ビーズの表面に固定したvWFへの液相
のFVIIIの結合の特異性は、液相中の全未還元vWFの、こ
の結合を完全に阻害する能力によっても示される。還元
されアルキル化されたvWFは、FVIII結合に対する阻害効
果を有しない。還元されアルキル化されたvWFおよび還
元されアルキル化されたSPフラグメントIIIは、やは
り、交差免疫電気泳動系において、FVIIIを結合するこ
とはできなかった。これらの発見は、ブロムバックらの
Thrmb.Res.第12巻、1177−1194頁（1978年）の論文に記
載された穏和な還元条件ではFVIIIは解離できるという
所見と一致する。
SPフラグメントIIIは、50μg/mlの濃度で90％の阻害
というFVIIIの投与量依存性の阻害を示した。vWF分子の
中央部（チタニらのバイオケミストリー、第25巻、3171
−3184頁（1986年）に記載された残基911−1365）を含
むSPフラグメントIIIの黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼ
消化の生成物であるSPフラグメントＩは、100μg/mlま
での濃度で、わずか15％の阻害しかもたらさなかった。
これらのデータは、vWFのアミノ末端部分への主なFVIII
結合ドメインを局在化した。SPフラグメントIIは、50μ
g/mlの濃度で、FVIIIの結合を29％阻害した。濃度を倍
にしても、阻害の有意な増加はなかった。
vWFの全2050個のアミノ酸配列は、チタニらのバイオ
ケミストリー、第25巻、3171−3184頁（1986年）に記載
された蛋白質配列分析法によって測定した。そのような
情報によって、29kDaおよび170kDaポリペプチド・フラ
グメントおよびFVIIIへのvWFの結合を阻害するポリペプ
チド・フラグメントの配列サブセットの表現のために、
ノクレオチド配列を、適当なベクトルに挿入することが
できる。vWFフラグメントのクローニングのための組換
えDNA法の説明については、ギンスバーグらのサイエン
ス、第228巻、1401−1406頁（1985年）およびサドラー
らのプロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズUSA、第82巻、6394−6398頁
（1985年）を参照されたい。
29kDaポリペプチド・フラグメントのアミノ末端領域
から始まる少なくとも３個のアミノ酸残基の長さのポリ
ペプチドを、ホートンらのプロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA、
第82巻、5135頁（1985年）に記載された方法で合成し
た。
ペプチドの固相合成の既知の方法では、所望のペプチ
ドは、ベンツヒドリル・アミンまたはクロルメチル化樹
脂（架橋ポリスチレンから誘導され化学薬品会社から入
手できる）のような不溶性支持体から出発して組み立て
られる。アルファ・アミノ窒素および他のどれかの反応
部位に保護基を有する所望のポリペプチドのカルボキシ
末端にあるアミノ酸は、公知のペプチド結合法を用い
て、溶液から樹脂に接続される。アルファ・アミノ基上
の保護基は、（他の保護基がもしあれば、それはもとの
まま残して）除去し、（適当な保護基をもつ）所望の配
列の次のアミノ酸を接続させ、これを繰り返す。所望の
ポリペプチドが出来あがったら、樹脂支持体から脱離さ
せ、すべての保護基を除去し、ポリペプチドを回収す
る。適当な保護基の例は、アルファ・アミノ基には、ア
ルファ−tert−ブチルオキシカルボニル；システインの
チオール基、アスパラギン酸のベータ−カルボン酸基、
グルタミン酸のガンマ−カルボン酸基、セリン、スレオ
ニンおよびチロシンのヒドロキシル基には、ベンジル、
４−メトキシベンジル、または４−メチルベンジル；ヒ
スチジンおよびトリプトファンの環内窒素およびリシン
のイプシロン−アミノ基には、ベンジルオキシカルボニ
ルまたはその２−クロル−または3,4−ジメトキシ−誘
導体；アスパラギンおよびグルタミンのアミド窒素に
は、ｐ−ニトロフェニル；そしてアルギニンのグアニジ
ン基には、ニトロまたはトシルである。
この開示の目的のために、認められているアミノ酸の
省略記号が使用された。完全な表示を下記に示す。
一字および三字のアミノ酸略記法 Ａ Ala アラニン Ｃ Cys システイン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｅ Glu グルタミン酸 Ｆ Phe フェニルアラニン Ｇ Gly グリシン Ｈ His ヒスチジン Ｉ Ile イソロイシン Ｋ Lys リシン Ｌ Leu ロイシン Ｍ Met メチオニン Ｎ Asn アスパラギン Ｐ Pro プロリン Ｑ Glu グルタミン Ｒ Arg アルギニン Ｓ Ser セリン Ｔ Thr スレオニン Ｖ Val バリン Ｗ Trp トリプトファン Ｙ Tyr チロシン Ｂ Asx AspまたはAsn、識別せず Ｚ Glx GluまたはGln、識別せず Ｘ X 未決定または非定型アミノ酸 本発明のペプチドの一種以上を、治療、診断またはそ
の他の用途のための医薬製剤に配合することができる。
それらを静脈内投与のために調製するためには、組成物
を、塩化ナトリウム（例えば0.35−2.0M）、グリシンな
どのような生理学的に適合する物質を含み、生理学的条
件に適合する緩衝されたpHを有する水に溶かす。血栓症
の予防のための投与量は、患者の血栓症のひどさに依存
するが、特定の患者について、容易に決定できる。
下記の実施例は、本発明の例示のために提示される。
本発明は、この実施例にだけ限定されるものではない。
実施例１ ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体C3の調
製 モノクローナル抗vWF抗体C3を産生するハイブリドー
マ細胞系の製造法において、BALB/c系のマウス（スクリ
ップス・クリニック研究所）を、不純物としてのそれと
一緒に精製した少量のFVIIIを含む精製FVIII免疫原で、
腹膜内免疫感作した。FVIIIは、ファルチャーらのプロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズUSA第79巻、1648−1652頁（1982年）
に記載された方法で調製した。マウスは、完全フロイン
ト・アジュバント中１μｇの免疫原で、腹膜内免疫感作
した。７日後に、マウスは、不完全フロイント・アジュ
バント中10μｇの免疫原で、腹膜内免疫感作した。この
二回目の注射の後７日目に、不完全フロイント・アジュ
バント中50μｇの免疫原で、腹膜内免疫感作した。この
三回目の注射の８日あとに、可溶性免疫原100μｇで腹
膜内免疫感作した。３日後に、脾臓を摘出し、脾臓細胞
をP3×63−AG8.653（マウス骨髄腫細胞系）と融合し
た。
P3×63−AG8.653は、90％ダルベッコの改良イーグル
培地（グルコース分多い）および10％ウシ胎児血清（FB
S）から成る培地中に、対数増殖状態に（融合の前に）
保持した。上記の培地475mlに、下記の推薦補剤を加え
た：グルタミン（100×）5ml、ピルビン酸ナトリウム
（100×）5ml、非必須アミノ酸（100×）5ml、ペン−ス
トレップ−フンギゾン（100×）5mlおよび８−アザグア
ニン6.6×10-3M（50×）10ml。脾臓および骨髄腫細胞
は、融合の前に、ダルベッコの改良イーグル培地中で、
FBSなしで完全に洗浄した。細胞を、1mlの40％PEG1500
と、１分間融合した。つぎに、細胞を増殖培地で1:2に
１分間希釈した。細胞は、さらに、増殖培地で1:5に２
分間希釈した。つぎに、細胞は、10分間900RPMで攪拌培
養した。上澄液を除き、細胞をHAT培地に懸濁させ、96
ウエルのプレートに入れて選択した。HAT培地は、90％
のダルベッコの改良イーグル培地、10％のFBSおよびこ
の二成分405mlに加えた下記の推薦補剤を含んだ：グル
タミン（100×）5ml、NCTC109 50ml、ピルビン酸ナト
リウム（100×）5ml、非必須アミノ酸（100×）5ml、ベ
ン−ストレップ−フンギゾン（100×）5ml、（ハイポキ
サンチン10-2M＋チミジン1.6×10-3M）（100×）5ml、
ウシ・インシュリン（20I.U./ml）（100×）5ml、オキ
ザロアセテート（10-1M）（100×）5mlおよびアミノプ
テリン（２×10-5M）（50×）10ml。選択のあと、４週
間の間、細胞を増殖培地−HT（選択培地からアミノプテ
リンを除く）中に保持した。限定希釈によって、サブク
ローニングを達成した。増殖ウエルは、ELISA法で試験
した。試験プレートは、100ng/ウエルの免疫原、または
ヒト・フィブリノーゲンまたはヒト・フィブロネクチン
またはヒトvWFでコートした。これらの蛋白質は、それ
ぞれ免疫原の潜在的な不純物である。50μｌの培養液上
澄液を試験した。上澄液がvWF陽性である細胞を含むウ
エルを、10％CO2中で37℃で増殖させた。
腹水の産生のために、細胞注射の少なくとも４日前
に、0.5mlのプリスティンをマウスに与えた。細胞は、F
BSを含まない培地0.5mlにいれて腹膜内注射（５×106／
マウス）した。マウスが鼓腸したとき、腹水を採取し
た。マウス腹水に含まれるモノクローナル抗vWF抗体C3
は、IgG−１型である。
マウス腹水からのモノクローナル抗vWF抗体C3の下記
の蛋白質Ａセファロースによる精製は、エイらのイミュ
ノケミストリー、第15巻、429−436頁（1978年）に開示
された方法の改良法である。使用量は、約25−30mgのIg
G−１を結合するが、非IgG蛋白質から約50mgのIgG−１
を分離できる1cm×15cmのカラムに合うものである。カ
ラムは、また、50mgのIgG2aを結合できる。IgG2bも、カ
ラムに結合するが、IgM、IgAおよびIgEは結合しない。
４−6mlの腹水を、30,000rpmで45分間、遠心分離した。
脂質は、頂部で除去した。腹水に二十％重量／カラムの
しょ糖を加えると、脂質の除去の助けとなった。腹水
を、0.02％NaN3を含むpH8の140mMリン酸ナトリウム緩衝
液で25−30mlまで希釈した。腹水の希釈は、塩素イオン
がIgGの結合を阻害するのを防ぐためである。約2gの蛋
白質Ａセファロース（シグマ）を0.02％NaN3を含む10mM
燐酸塩緩衝食塩水で膨潤させ、1cm径のカラムに充填し
た。カラムは、0.02％NaN3を含む140mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液で平衡化した。カラムに、希釈した腹水を、0.
06−0.08ml/分以下の速度で供給した。供給のあと、カ
ラムを４℃で一晩放置して、IgGの結合を増加させた。
カラムを、下記の順序で、0.6−0.8ml/分で、緩衝液で
洗浄した。
１）140mMリン酸ナトリウム、pH8.0;2）0.1Mクエン酸ナ
トリウム−クエン酸pH6.0（IgG−１溶出）;3）0.1Mクエ
ン酸ナトリウム−クエン酸pH5.0（IgG−2a溶出、少量の
IgG−１残存）;4） 0.1Mクエン酸ナトリウム−クエン
酸pH4.0（少量の残存IgG−2a溶出）；および５）0.1Mク
エン酸ナトリウム−クエン酸pH3.0（IgG−2b溶出）。カ
ラムをpH3.0の緩衝液で洗浄したあと、ただちに、0.02
％NaN3を含む140mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）
で、流出液のpHが8.0になるまで洗浄する。カラムを、
４℃で貯蔵する。カラムの洗浄の間に、約5mlの画分が
捕集された。pH5.0の画分には、1mlの1MトリスHClを加
えた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ 21/08 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (72)発明者 キャロル エイ、フルチャー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92037、ラ ジョラ、フェイ アベニュ ー 7418

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】フォン・ビルブラント因子ポリペプチドで
    あって、SDS−PAGEによって測定された分子量が29kDaで
    あり、しかも、下記の配列： （上記の配列にて、ＸはThr又はAlaであり、上記ポリペ
    プチドのアミノ末端アミノ酸が、3Serから44Glyの範囲
    にあり、上記ポリペプチドのカルボキシ末端アミノ酸
    が、244Leuから285Asnの範囲にある）の配列サブセット
    である配列を有し、上記ポリペプチドが、VIII因子への
    フォン・ビルブラント因子の結合を阻害可能であること
    を特徴とするフォン・ビルブラント因子ポリペプチド。
  2. 【請求項２】上記ポリペプチドが、アミノ末端アミノ酸
    残基3Serで始まり、ほぼカルボキシ末端アミノ酸残基24
    4Leuで終わるアミノ末端配列を有することを特徴とする
    請求項（１）記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】上記ポリペプチドが、アミノ末端アミノ酸
    残基24Gluで始まり、ほぼカルボキシ末端アミノ酸残基2
    65Serで終わるアミノ末端配列を有することを特徴とす
    る請求項（１）記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】上記ポリペプチドが、アミノ末端アミノ酸
    残基44Glyで始まり、ほぼカルボキシ末端アミノ酸残基2
    85Asnで終わるアミノ末端配列を有することを特徴とす
    る請求項（１）記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】下記のアミノ酸配列： を有し、VIII因子へのフォン・ビルブラント因子の結合
    を阻害可能であることを特徴とするフォン・ビルブラン
    ト因子ポリペプチド。
  6. 【請求項６】（ａ）産生された組換え体、プラズマ又は
    市販の濃厚原液からのVIII因子に、請求項（１）〜
    （５）のいずれか１項に記載のポリペプチドを添加し
    て、ポリペプチド/VIII因子複合体を形成し、 （ｂ）上記複合体を精製工程に付し、 （ｃ）高度に精製された複合体を回収し、 （ｄ）上記ポリペプチドからVIII因子を分離する ことを特徴とするVIII因子の製造法。
  7. 【請求項７】（ａ）産生された組換え体、プラズマ又は
    市販の濃厚原液からのVIII因子を、請求項（１）〜
    （５）のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合した
    粒子に吸着させ、 （ｂ）VIII因子を溶出させ、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたVIII因子を別の吸着剤に吸
    着させて、濃縮し、かつ精製し、 （ｄ）吸着されたVIII因子を溶出させ、 （ｅ）高度に精製され濃縮されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子の製造法。
  8. 【請求項８】組換え体DNA法又は合成ペプチド法によ
    る、請求項（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリ
    ペプチドの製造法。
  9. 【請求項９】請求項（１）〜（５）のいずれか１項に記
    載のポリペプチドを少なくとも一種含むことを特徴とす
    る、血栓症の予防用又は、VIII因子へのフォン・ビルブ
    ラント因子の結合阻害用医薬組成物。
  10. 【請求項１０】請求項（１）〜（５）に記載のポリペプ
    チドに結合可能な、モノクローナル抗フォン・ビルブラ
    ント因子抗体。
  11. 【請求項１１】請求項（10）に記載のモノクローナル抗
    フォン・ビルブラント因子抗体を産生するハイブリドー
    マ細胞系。
  12. 【請求項１２】VIII因子へのフォン・ビルブラント因子
    の結合を阻害する方法であって、上記方法が、有効量の
    請求項（１）〜（５）に記載のポリペプチドの１種以上
    をVIII因子に結合させることを含み、上記の量が、VIII
    因子へのフォン・ビルブラント因子の結合を阻害するの
    に充分なものであることを特徴とする、VIII因子へのフ
    ォン・ビルブラント因子の結合の阻害方法。
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