NO167533B

NO167533B - Fremgangsmaate ved fremstilling av faktor viii koagulerende polypeptider og monoklonale antistoffer overfor disse.

Info

Publication number: NO167533B
Application number: NO841277A
Authority: NO
Inventors: Theodore S Zimmermann; Carol A Fulcher
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1983-03-31
Filing date: 1984-03-30
Publication date: 1991-08-05
Also published as: ZA842418B; JPS59184130A; FI841281A; SG49675A1; IE840788L; DE3486453D1; IE960783L; ATE155490T1; NO167533C; AU2627284A; DK174984D0; CA1341506C; AU572128B2; NO841277L; EP0561427B1; EP0770396A2; DK172036B1; IE80858B1; ATE135400T1; EP0770396A3

Description

Foreliggende -oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en ny faktor VIII:C koagulant inneholdende ett eller flere polypeptider som utviser en koagulerende aktivitet og Mr-verdier på 92000, 80000, 79000, 54000 eller 44000 når de underkastes natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese. Oppfinnelsen har derfor anvendelighet ved den ytterligere studie og karakterisering av polypeptid eller polypeptidkomplekser som gir blodet i mennesker og andre pattedyr den ønskede klumpingsadferd.

Det har lenge vært kjent at plasmafaktor VIII spiller en avgjørende rolle ved blodkoagulering, og at trombin aktiverer den koagulerende effekt av faktor VIII. Nylige forsøk på å karakterisere faktor VIII har ført til

det postulat at faktor VIII er et kompleks av minst to polypeptider som er kjent som VIII:C og VIII:R, og det er funnet at den koagulerende aktivitet ligger i VIII:C-delen. Studier over effekten av trombin på faktor VIII:C har ført til den konklusjon at trombin aktiverer denne faktor ved å bryte den ned i flere mindre polypeptider. Imidlertid har ingen tidligere studier vært i stand til å knytte trombin-indusert faktor Vlll-aktivering i mennesker med noen definerte polypeptider dannet fra humanfaktor VIII:C.

Eksempelvis har Hoyer og Trabold, i "The effect of thrombin on human factor VIII", J. Lab. Clin. Med. 97:50-64

(1981) forsøkt å rense . humanfaktor VIII:C ved immunoadsor-bentkromatografi under anvendelse av et polyklonalt antistoff overfor faktor VIII:R dannet i kanin. De inkuberte deretter faktor VIII:C med renset humant a-trombin og fast-slo at små mengder av trombinet aktiverte faktor VIII:C mens store mengder aktiverte dette i mindre grad om enn i det hele tatt. De konkluderte også med at trombinaktivering ledsages av en nedsettelse i størrelsen av proteinet, og de foreslo en molekylvekt på ca. 116 000 for den aktiverte.faktor VIII:C. De kunne ikke identifisere spesifikke polypeptider som bibeholdt faktor VIII:C aktivitet og VIII:C anti-gendeterminanter. Fulcher, CA. og Zimmerman, T.S. i "Characteriza-tion of the human factor VIII procoagulant protein with a heterologous precipitating antibody", Proe. Nati. Acad. of Sei. USA, 79:1648-1652 (1982) oppnådde høyrenset humanfaktor VIII:C fra plasmakonsentrat ved å føre konsentratet gjennom en kolonne inneholdende et monoklonalt antistoff overfor faktor VIII:R, og eluere VIII:C fra adsorbert VIII:C/VIII:R-kompleks, og konsentrering av faktor VIII:C på en andre kolonne. Den rensede faktor VIII:C ble deretter analysert ved natriumdodecylsulfat/polyacrylamidgelelektroforese (heretter "SDS-PAGE"), både før og etter tilsetning av trombin til det rensede materiale. Den rensede faktor VIII:C før trombintilsetning utviste en bred rekke av bånd på SDS-PAGE svarende til polypeptider med forskjellige molekylvekter (Mr), innbefattende en relativt sterk dublett ved Mr på 80 000 og 79 000 og minst seks ytterligere svakt beisende polypeptider med større Mr, innbefattende én ved Mr rundt 92 000. Tilsetning av trombin til den rensede faktor VIII:C fremkalte en forsvinning av alle de polypeptider som fremkom før trombintilsetning . Den koagulerende aktivitet av plasmakonsentratet steg etter trombintilsetning til et maksimum på tre ganger verdien for materialet før trombintilsetning og avtok deretter. Den koagulerende aktivitet av renset faktor VIII:C steg også til et maksimum på tre ganger verdien for det pre-aktiverte materialet. Det vil si at trombin hadde hovedsakelig den samme aktiverende effekt på faktor VIII:C i hvert til-felle. Da således den rensede faktor VIII:C utviste en spesifikk aktivitet på 3 28 0 ganger aktiviteten av utgangsmateria-let ville fagmannen konkludere med at økningen i spesifikk aktivitet skyldes den høye oppnådde rensegrad. Det finnes ikke noe grunnlag i. denne artikkel for å tilskrive den aktiverte koagulantaktivitet noen spesifikke av det store antall av polypeptider som er forbundet med båndene observert i den rensede faktor VIII:C før aktivering med trombin. Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en ny faktor VIII:C-koagulant inneholdende én eller flere polypeptider kjennetegnet ved at: .(a) human faktor VIII:C oppsluttes i en oppslutningsbland-ing inneholdende en protease, fortrinnsvis ved romtemperatur og pH 6,8-7,4, (b) oppslutningen i trinn (a) avbrytes etter en tidsperiode fra 0,1 til 60 minutter ved tilsetning av en effektiv mengde av en proteaseinhibitor til oppslutningsblandingen inneholdende faktor VIII:C koagulanten; og (c) den resulterende koagulant gjenvinnes ved anvendelse av ultra-filtrering/sentrifugering, ionebytte-, gel- og affinitetskromatografi, isoelektrisk fokusering,preparativ elektroforese eller immunoadsorbsjon. I tillegg innbefatter oppfinnelsen monoklonale antistoffer av klasse IgG for anvendelse in-vitro til isolering og identifisering av F-VIII:C-koagulantene fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, dannet av hybridomer dannet ved sammensmelting av celler fra en musemyeloma og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med høyrenset humanfaktor VIII:C, kjennetegnet ved at de reagerer med humanfaktor VIII:C og utviser én av følgende reaksjonsprofiler med polypeptider avledet fra humanfaktor VIII:C; (A) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr=92 000; Mr=180 000 og større; og 54 000; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr=44 000; 71 000; 72.000; 79 000; eller 80 000; (B) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr=92 000; Mr=108 000 og større; og 44 000; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr=54 000; 71 000; 72 000; 79 000; eller 80 000; (C) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr = 79 000 og 80 000; og Mr=108 00.0. og større; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr=44 000; 54 000; 71 000; 72 000; eller 92 000; (D) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr=108 000 og høyere; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr mindre enn 108 00 0; hvori Mr~verdiene er bestemt ved å underkaste polypeptidene natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese, og hvori de monoklonale antistoffer med profil (B) eller (C) videre er kjennetegnet ved at de nøytraliserer den koakuler-ende aktivitet av humanfaktor VIII:C når angitte faktor VIII:C er bundet til antistoffene. Som angitt omfatter oppfinnelsen fremstilling av poly-peptidkoagulanter som utviser faktor VIII:C koagulantaktivitet og faktor VIII:C immunologisk adferd, og som utviser karakteristiske M^-verdier når de analyseres ved natriumdodecylsulfat/ polyacrylamidgelelektroforese (heretter "SDS-PAGE"). Med

"polypeptidkompleks" menes i det etterfølgende en koagulant omfattende kombinasjoner av to eller flere polypeptider kjent for å være fysiskalsk distinkte, men også preparater inneholdende bare ett skjelnbart polypeptid, dvs. det som utviser et bånd ved en M på 92 000.

r

Den etterfølgende beskrivelse som illustrerer fremstilling av foreliggende koagulant gjør bruk av humanfaktor VIII:C som er blitt høyrenset for at identifisering og karakterisering av det nye produkt ikke skal påvirkes av effektene av fremmede polypeptider. Det skal imidlertid bemerkes at oppfinnelsen i seg selv ikke er avhengig av hvordan utgangs-materialet på forhånd er blitt behandlet, unntatt hvor dette spesifikt er angitt. De aktive faktor VIII:C polypeptider kan fremstilles ikke bare ved oppslutning med trombin som beskrevet mer i detalj i det etterfølgende, eller med andre lignendevirkende proteaser slik som faktor Xa, faktor IXa eller Russels slangegift-V, men også ved rekombinante DNA-teknikker hvori polypeptidene av interesse produseres av bakterier, gjær eller andre celler i hvilke én eller flere gener for fremstilling av polypeptidene av interesse er inn-ført etter kjente teknikker innen faget. En hvilken som helst prosess for fremstilling av komplekset av interesse kan forventes å gi komplekset i en blanding med én eller flere andre polypeptider.

Ethvert plasma eller plasmakonsentrat inneholdende humanfaktor VIII:C kan anvendes med fordel. Den nye koagulant kan fremstilles fra humanfaktor VIII:C som er blitt ultra-renset i henhold til den fremgangsmåte som er beskrevet i US patentskrift 4 361 509. Ved denne fremgangsmåte føres en kilde for faktor VIII:C slik som plasma eller plasmakonsentrat gjennom en immunoadsorbentkolonne til hvilken monoklonale antistoffer overfor faktor VIII:R er blitt festet. Faktor VIII:R/VIII:C komplekset adsorberes på kolonnen, hvoretter faktor VIII:C elueres og føres gjennom en andre kolonne slik som aminohexylagarose. Det skal bemerkes at den andre kolonne også kan være en immunoadsorbent inneholdende antistoffer overfor faktor VIII:C. Faktor VIII:C må holdes fri for a-trombin og andre proteaser. Faktor VIII:C lagres hensiktsmessig i en buffret saltvannsløsning inneholdende for eksempel 0,3M calciumklorid, ved en pH på 6,8 til 7,4.

Humanfaktor VIII:C oppsluttes deretter med a-trombin under betingelser som er effektive for dannelse av polypeptidkomplekset som beskrevet i det etterfølgende. Det rensede a-trombin kan fremstilles ved den prosedyre som er beskrevet av Fenton, J.W. II; Fasco, M.J.; Stackrow, A.B.; Aronson, D.L.; Young, A.M.; og Finlayson, J.S. "Human Thrombin. Production, Evaluation, and Properties of a-Thrombin". J. Biol. Chem. 252: 3587-3598 (1977).

a-trombinet og faktor VIII:C kombineres i et vandig system, fortrinnsvis buffret til en pH på 6,8 til 7,4. Trombinet skal være tilstede i en mengde i forhold til faktor VIII:C som er tilstrekkelig til å tillate omsetning med

faktor VIII:C, men ikke så stor at faktor VIII:C nedbrytes til inaktive polypeptider før det ønskede aktive polypeptidkompleks kan gjenvinnes. Som en illustrasjon bør et preparat inneholdende 200-400 enheter (0,2 mg/ml) av faktor VIII:C pr. ml oppsluttes med 0,1 til 0,5 enheter/ml a-trombin. Oppslutningen kan forløpe ved romtemperatur idet for høy temperatur kan denaturere polypeptidene og for lav temperatur kan bremse oppslutningsforløpet.

Oppslutningen tillates å forløpe i et tidsrom tilstrekkelig til å muliggjøre dannelse av det ønskede polypeptidkompleks. Den optimale tid vil være fra 0,1 til 60 minutter, med tider fra 0,1 til 3 0 minutter som foretrukket.

Tider på fra 1 til 10 minutter er blitt funnet å være meget tilfredsstillende, selv om det vil forstås at optimale tider kan bestemmes med minimale forsøk under anvendelse av aliquoter av det faktor VIII:C utgangsmateriale som skal behandles. Et optimalt tidsrom er det som danner den maksimale mengde

av polypeptidkomplekset som utviser en Mr på ca. 9 2 0000,

ledsaget av dannelse av et proteinkompleks som utviser en M - dublett på 79 000 og 80 000, uten nedbrytning av Mr 92 000 polypeptidet. Mr 79 000-80 000 dubletten kan muligens fungere etter at det har gjennomgått en nedbrytning til et kompleks som utviser en dublett ved Mr~verdier på 71 000-72 000. 71 000-72 000 dubletten alene utviser ingen faktor VIII:C aktivitet.

Oppslutningen avbrytes deretter ved tilsetning til reaksjonsblandingen av en effektiv mengde av (p-amidinofenyl)-methansulfonylfluorid (heretter "p-APMSF") eller annen trombin-inhibitor. p-APMSF forhindrer a-trombin fra å reagere ytterligere med faktor VIII:C proteiner uten i seg selv å nedbryte disse proteiner. Mengden av p-APMSF som må tilsettes bør om-fatte 1,5 til 2,5 mmol pr. enhet a-trdmbinaktivitet som opp-rinnelig var tilstede i reaksjonsblandingen.

p-APMSF kan erholdes fra California Medicinal Chemistry Company, San Francisco, California, og dets fremstilling er beskrevet i Laura, R.; Robinson, D.J.; og Bing, D.H. "(p-Amidinophenyl)methanesulfonyl Fluoride, an Irrever-sible Inhibitor of Serine Proteases", Biochemistry (1980) 19, 4859-4864, ved 4861.

Reaksjonsblandingen kan deretter behandles for å konsentrere polypeptidkomplekset. Fortrinnsvis konsentreres polypeptidkomplekset med hensyn til annet faktor VIII og ikke-faktor VIII proteinaktig materiale, for å tilveiebringe komplekset i en form som gir den meget høye aktivitet som utvises av komplekset i renset form. Renseteknikker innbefatter for eksempel ultrafiltrering, ultråsentrifugering, ionebyt-ting, gelgjennomtrengningskromatografi, preparativ elektroforese, isoelektrisk fokusering, og gel- og affinitetskromatografi.

Det ønskede kompleks kan også konsentreres og/eller gjenvinnes ved å føre reaksjonsblandingen som allerede kan være blitt konsentrert ved andre teknikker, gjennom en immunoadsorbentkolonne inneholdende anti-human VIII:C antistoffer, eller ekvivalente antistoffer overfor VIII:C andre enn de humane, som reagerer med polypeptidene i komplekset. Antistoffene bindes til agarose (se eksempel I). Flere antistoffer som kan anvendes for å konsentrere komplekset og/eller isolere enkelte av polypeptidene derav er beskrevet i det etterfølgende. Det aktive VIII:C kompleks adsorberes fortrinnsvis til kolonnen, og elueres deretter fra kolonnen med en løsning av calciumioner (for eksempel CaCl2) som eventuelt også kan inneholde et ikke-ionisk overflateaktivt middel. Egnede ikke-ioniske overflateaktive midler innbefatter alkyl-f enylpolyoxyethylener, slik som Triton-X-1 00 -N-1 01", eller -X-405® (Eastman Chemical Co.); Tween-20<®>, -60®eller -80<®>(Sigma Chemical Co.); og Nonidet P-40<®>(Sigma Chemical Co.), hvor alle disse er velkjente produkter med kjente kjemiske formler.

Mengdene av calciumion og overflateaktivt middel som skal anvendes bør være store nok til å desorbere polypeptidkomplekset, men ikke så høye at elueringsmidlet inaktiverer polypeptidet. En calciumionkonsentrasjon på opp til 0,5M eller til og med opp til 1,OM er tilfredsstillende, og 0,25M foretrekkes. En konsentrasjon av det overflateaktive middel på opptil 1 vekt% er tilfredsstillende, og rundt 0,1 vekt% er foretrukket. Elueringsmidlet tilføres immunoadsorbentkolonnen med 1 til 8 sjiktvolumer pr. time, og fortrinnsvis 3 til 4 pr. time. En for høy strømningshastighet kan forårsake sammen-brudd av kolonnen og ikke-absorpsjon av polypeptidkomplekset. Fagmannen vil lett kunne tilpasse disse retningslinjer til immunoadsorbentprosesser forskjellig fra kolonner med stasjo-nære sjikt.

VTII:C polypeptidkomplekset gjenvinnes i en egnet buffer, ved en pH på 6,8 til 7,4, som også inneholder calciumion og overflateaktivt middel fra elueringsløsningen. Kon-sentrasjonen av calcium og overflateaktivt middel kan reduse-res, og det overflateaktive middel fjernes fortrinnsvis slik som ved dialysering av løsningen mot en buffer, slik som den VIII:C buffer som anvendes i eksempel 1, som inneholder en mindre mengde calciumion. Komplekset kan lagres i denne løs-ning eller lyofiliseres.

Analysert ved SDS-PAGE som vist i det etterfølgende utviser koagulanten en M^ på 92000, og kan normalt inneholde materiale som utviser en M^-dublett på 79 000 og 80 000,

hvor noe av dette kan ha gjennomgått nedbrytning for å ut-vise en M^-dublett på 71 000 og 72 000. I dets rensede form er dette bånd eller gruppen av disse bånd hovedsakelig

de eneste bånd som forekommer.

Proteinkomplekset fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utviser spesifikk VIII:C koagulerende aktivitet (dvs. aktivitet pr. mg av alt tilstedeværende protein) som er høyere enn hva som utvises av renset humanfaktor VIII:C, for eksempel humanfaktor VIII:C renset ved den fremgangsmåte som er beskrevet i US patentskrift 4 361 509. Aktiviteten av det rensede kompleks bør være flere ganger, for eksempel tre til fem ganger større enn aktiviteten av renset humanfaktor VIII:C, og er med fordel minst 10 ganger eller til og med 50 ganger så aktiv. Den spesifikke aktivitet av komplekset, er høyere enn 1 800 enheter/mg, fortrinnsvis høyere enn 5 400 enheter/mg og overskrider i særlig fordelaktige utførelsesformer 7 500 og til og med 10 000 enheter/mg.

Proteinkomplekset er kjennetegnet ved at den forøkede aktivitet vedvarer over et tidsrom på minst 10 minutter og fortrinnsvis minst 30 minutter. Selvsagt vil aktiviteten generelt være stabil betraktelig lenger. Komplekset utviser også de immunologiske karakteristika av et faktor VIII:C protein, dvs. det bindes til et antistoff overfor humanfaktor VIII:C. Dette kan fastslå ved å danne et monoklonalt antistoff overfor faktor VIII:C som beskrevet i det etterfølg-ende, feste antistoffet til en agarosekolonne, føre en vandig løsning av komplekset gjennom kolonnen og bestemme den resulterende løsning med hensyn til faktor VIII:C aktivitet .

Et ytterligere ønskelig trekk ved oppfinnelsen er at polypeptidene med Mr=92 000 og Mr=79 000-80 000 er stabile i forhold til naturlig humanfaktor VIII:C som notorisk er

ømfintlig overfor proteolyse, nedbrytning og med resulterende tap av koagulantaktivitet. Denne stabilitet demonstreres av polypeptidenes evne til å overleve de her beskrevne behand-lingstrinn.

Eksempel I

Dette eksempel viser'hvordan faktor VIII:C ble renset fra et kommersielt konsentrat og oppsluttet med renset a-trombin.

Et monoklonalt antistoff overfor faktor VIII:C

ble fremstilt og anvendt for å identifisere VIII:C polypeptider. Ved flere valgte punkter under oppslutningen ble deler av oppslutningsblandingen bestemt med hensyn til VIII:C (koagulant) aktivitet og med hensyn til proteinbånd under anvendelse av SDS-PAGE.

Rensning av VIII:C.

Alle trinn ble utført ved romtemperatur. Kjemika-liene var av reagenskvalitet. 40 flasker av kommersielt faktor VIII konsentrat (tilveiebragt av Armour Pharmaceutical) ble rekonstituert i 1000 ml VIII:C buffer (0,02M imidazol/ 0,15M natriumklorid/0,1M L-lysin HCl/0,02% natriumazid, pH 6,8). Denne prøve som inneholdt totalt 17 000 enheter av VIII:C aktivitet ble anbragt på en 2,5-3 liters sjiktvolum-immunadsorbentkolonne. Kolonnen bestod av cyanogenbromid-aktivert agarose (Sepharose 4B, Pharmacia, Piscataway, New Jersey), til hvilken monoklonale antistoffer overfor VIII:R var blitt kovalent bundet. Antistoffene ble dannet og festet til kolonnen som beskrevet i US patentskrift 4 361 509. Antistoffene ble utfelt fra ascitesvæske under anvendelse av 50% ammoniumsulfat, ble utfelt på nytt ytterligere to ganger og ble deretter festet til kolonnen i en tetthet på 2-4 mg/ml sefarose. Immunoadsorbenten ble pre-eluert med 3M natriumthiocyanat, ble vasket med. VIII:C buffer (0,02M imidazol HC1 pH 7,0, 0,15M NaCL, 0,1M L-lysin-HCl, 0,02% natriumazid), ble behandlet to ganger med 2mM di-isopropylfluorfosfat, hvoretter konsentratet ble tilsatt.

Kolonnen ble vasket med 20 liter VIII:C buffer inneholdende 0,15M natriumklorid, og VIII:C ble deretter eluert fra VIII:R med VIII:C buffer inneholdende 0,35M calciumklorid. Aktive fraksjoner ble oppsamlet og konsentrert til en hundredepart under nitrogentrykk i en Amicon-omrørt celle med en YM10 membran. Konsentratet ble deretter fortynnet 1:10 i VIII:C buffer og anbragt på en 4 ml's kolonne av amino-hexyl-sefarose (Pharmacia) ekvilibrert i VIII:C buffer inneholdende 0,025M calciumklorid, VIII:C ble eluert i høy konsentrasjon med VIII:C buffer inneholdende 0,3M calciumklorid i en strømningshastighet på 10 ml/time. Det konsentrerte opp-samlede materiale fra immunoadsorpsjonen ble justert til 0,25M calciumklorid og adsorbert to ganger, hver gang i én time med 1/10 vol/vol av en blanding av monoklonalt anti-fibrinogen, anti-fibronectin og anti-vWF antistoffer som var blitt koblet til cyanogenbromid-aktivert sefarose.

Dannelse av monoklonalt antistoff overfor VIII:C

Monoklonale antistoffer ble dannet som beskrevet

i US patentskrift 4 361 509 under anvendelse av renset VIII:C som immunogen. Antistoffene ble utvalgt ved en fastfase-bestemmelse i Linbro-Titertek (Flow Laboratories, Inglewood.,, CA) plater og et enzym-kjedet immunoadsorbent (ELISA)- påvis-ningssystem som beskrevet i Engvall, E. og Perlmann,,. F. "Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA), Quantitative assay of immunoglobulin G" Immunochemistry &:87i:-8'74 (1:971) ) under anvendelse av et peroxydase-antlstoffkonjugrat

(Zymed Laboratories, Buriingame, CA). Platene ble belagt med 100 ng renset VIII:C pr. brønn. ELISA-pos-itiv dyrknings-supernatant av klonen valgt for, anvendelse ved denne under-søkelse inhiberte også plasma VIII:C aktivitet.

Analyse av renset VIII:C under trombinaktiveringsforløpet

Renset human a-trombin (spesifikk aktivitet 2 534 U/mg, sluttkonsentrasjon 0,5 U/ml) ble tilsatt til det rensede VIII:C (sluttkonsentrasjon 167 yg/ml) i imidazol-saltvannsbuffer inneholdende 0,04M CaCl2. Buffer alene ble tilsatt til en kontrollaliquot. Løsningene ble inkubert ved romtemperatur og ved forskjellige tidsintervaller ble prøver av VIII:C-trombinblandingen tilsatt til rør inneholdende p-APMSF (California Medicinal Chemistry Co.) for å inaktivere trombinet hurtig og irreversibelt. For å nedsette hydrolysen av p-APMSF til et minimum ble dette fortynnet 1:10 fra en lagerløsning (100 mM i methanol) i imidazol-saltvannbuffer 60 sekunder før omsetning med VIII:C-trombinprøvene. Den sluttlige p-APMSF konsentrasjon var 1 mM. Kontrollaliquoten ble behandlet på lignende måte med p-APMSF ved starten av forsøket. Ved slutten av det 60 minutters lange tidsforløp ble alle VIII:C prøver bestemt med hensyn til VIII:C aktivitet under anvendelse av en aktivert partiell tromboplastin-tidsbestemmelse som beskrevet i litteraturen, og ble deretter preparert for SDS-PAGE.

SDS- PAGE " Prosedyre A":

Diskontinuerlig SDS polyacrylamid skrågelelektro-forese ble utført basert på prosedyren ifølge Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685, 1970. "Prosedyre A" er som følger:

I: Prøvepreparering

1. Dialyser proteinprøven (ideelt 50-100 mikroliter inneholdende 5-6 0 mikrogram protein) mot prøvebuffer over natten ved romtemperatur. Hvis prøven inneholder calciumion, innbefatt 10 millimolar ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i prøvebufferen. 2. Anbring den dialyserte prøve i et rør og tilsett 1:10 volum 10%-ig SDS. Dekk røret med aluminiumsfolie. Opp-varm prøven i et kokende vannbad i 10 minutter. 3. Fjern prøven fra vannbadet og tilsett til denne 1/10 volum på 500 millimolar dithiothreitol. Inkuber ved 56°C i fire timer. 4. Tillat prøven å avkjøles til romtemperatur og preparer denne for å legges på gelen ved tilsetning av glycerol-lagerløsning til 10% sluttkonsentrasjon, og bromfenol blå farge-lagerløsning til 0,05% sluttkonsentrasjon.

II. Fremstilling av gelløsninger (anvend avionisert, destil-lert vann)

1. Glyserol lag erløsning: 50% glycerol

2. Bromfenol blå lagerløsning: 0,5% bromfenol blå

3. Nedre gellagerløsning:

18,2 g trisbase

4 ml 10% SDS

sluttvolum 100 ml.

Juster pH til 8,8 med konsentrert saltsyre.

Filtrer.

4. Øvre gellagerløsning:

6,1 g trisbase

4 ml 10% SDS

sluttvolum 100 ml

Juster pH til 6,8 med konsentrert saltsyre.

Filtrer.

5. Prøvebuffer

0,01M natriumfosfat

1 ,0% SDS

10 millimolar dinatrium EDTA

sluttvolum 1 1

pH justert til 7,0 med natriumhydroxyd eller fos-for syre.

6. Acrylamidlagerløsning:

Oppløs; 30 g acrylamid i 50 ml vann og tilsett 0,8 g bisacrylamid og oppløs. Bring volumet til 100 ml. Filtrer løsningen og lagre denne i mørket ved

4°C.

7. Elektrodebufferlagerløsning 30,3 g trisbase

144,1 g glycin

sluttvolum 1 1

8. Elektrodebuffer 100 ml elektrodebufferlagerløsning

89 0 ml vann

10 ml 10% SDS

9. Coomassie blå lagerløsning:

1% Coomassie blå R 250 i vann Oppløs under omrøring i minst 30 minutter ved romtemperatur og filtrer.

10. Ammoniumpersulfatløsning 10% ammoniumpersulfat

Lagres i mørke ved 4°C og fremstilles fersk hver

uke.

III. Gelpreparering og forsøk: Sluttlig acrylamidkonsentra-sjon = 7, 5%

3. Prosedyre:

a. Preparer skrågelapparaturen for en 14,5 cm x 9,0

cm x 0,8 mm skrågel. Apparaturen er en standardgelelektro-foreseapparatur, tilgjengelig f.eks. fra Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, California.

b. Bland alle.nedre gelbestanddeler bortsett fra TEMED og ammoniumpersulfat i en 50 ml<1>s vakuumkolbe og utluft. Tilsett deretter TEMED og ammoniumpersulfat, bland forsiktig og hell i den nedre gel umiddelbart. Belegg den nedre gel med vann-mettet butanol og tillat den å polymerisere uforstyr-ret i minst én time, fortrinnsvis 2-6 timer. c. Hell av butanollaget og skyll toppen av den nedre gel med den fullstendige øvre gelblanding. (Den øvre gelblanding fremstilles, utluftes og TEMED og ammoniumpersulfat tilsettes som for den nedre gel.) d. Hell i den øvre gel og innsett kammen i den øvre gel og la det bli tilbake minst 1,0 cm mellom bunnen av kam-tennene og grenseflaten mellom øvre gel og nedre gel. Fyll opp med øvre gelløsning så fullt som mulig. Tillat øvre gel å polymerisere i minst én time før forsøket.

e. For å fjerne kammen, pipetter elektrodebuffer over toppen av den øvre gel og fjern forsiktig kammen. Skyll de øvre gelbrønner med elektrodebuffer flere ganger.

f. Monter apparaturen for forsøk og tilsett elektrode-buf f er. Tilfør prøvene ved å legge disse på de øvre gelbrøn-ner under bufferlaget.

g. Kjør gelen under anvendelse av konstant strøm:

8 mA mens prøver er i den øvre gel og 15 rtiA mens prøvene er i den nedre gel. Stopp elektroforesen når bromfenol blå fronten er 1,0 cm fra bunnen av nedre gel.

IV. Fiksering og beising av gelen

Referanse: Fairbanks, G., Steck, T.L., og Wallach, D.F.N., Biochemistry 10, 2606-2617, 1971. 1. Fikser gelen i det minste over natten i et forseglet kammer i en løsning inneholdende 25% isopropanol, 10% eddiksyre, 10 ml T% Coomassie blå lagerløsning, sluttvolum 400 ml. 2. Utbløt gelen i minst én time i 10% isopropanol,

10% eddiksyre og 1,0 ml 1% Coomassie blå lagerløsning, sluttvolum 4 00 ml.

3. Utbløt gelen i ca. 4 timer i 10% eddiksyre med

utbytninger eller inntil den er fullstendig avbeiset.

4. Den avbeisede gel kan tørkes på filterpapir under anvendelse av en geltørker for å øke kontrasten.

Ca. 5-20 g protein ble tilført til gelene. VIII:C Mr~verdiene ble beregnet for reduserte prøver med semilogarit-miske nedtegninger av Mr mot vandringsdistansen, under anven-. deise av redusert fibronectin (Mr 200 000) , fosforylase b

(Mr 95 000), okseserumalbumin (M 68 000) og IgG tung kjede (Mr 50 000) og ovalbumin (Mr 43 000) som standarder.

Scanning og integrering av et fotografisk trykk av den sluttlige gel ble foretatt under anvendelse av et Zeineh myk laserscanning densitometer.

Resultater

Den spesifikke aktivitet av den rensede faktor VIII:C var 2000 enheter/mg. Trombinaktivering av renset VIII:C aktivitet ble analysert over et 60 minutters forløp. Før trombineksponering utviste den ubehandlede VIII:C prøve det karakteristiske mønster av VIII:C former varierende fra en dublett ved Mr=79 000-80 000 til et bånd ved Mr=188 000. Et bånd over Mr=188 000 og to bånd under Mr=79 000 ble ikke bundet til den monoklonale anti-VIII:C antistoffimmunoadsor-bent. Båndene mellom Mr=79 000 og Mr=188 000 ble ikke bundet til anti-VIII:C antistoffet.

I løpet av de første fem minutter av trombinakti-veringsforløpet forsvant alle bortsett fra ett av de monoklonale anti-VIII:C antistoffreaktive bånd med en Mr større enn 9 2 000 gradvis, og ble upåvisbare når VIII:C aktiviteten nådde dens topp ved fem minutter.

Et bånd ved M- = 122 000 viste seg å være trombin-resistent bare i enkelte forsøk, men etter utstrakt trombin-behandling var hverken dette bånd eller noe annet bånd reak-tivt med det immobiliserte monoklonale anti-VIII:C antistoff.

Et bånd ved Mr=92 000 øket i intensitet ettersom VIII:C aktiviteten øket. En dublett ved Mr=79 000 og 80 000 syntes å bli omdannet til en dublett ved Mr=71 000-72 000, hvor den sistnevnte form dominerte i fra 5 til 60 minutter ettersom VIII:C aktiviteten avtok. To bånd, ved Mr=54 000 og Mr=44 000 ble klart synlige i fra 5 til 60 minutter. Mr=

44 000 båndet fremkom også som en dublett i enkelte forsøk. Mr=71 000-72 000 dubletten, Mr=54 000 båndet og Mr=44 000 båndet ble ikke fjernet i betydelig grad av det immobiliserte monoklonale anti-VIII:C antistoff. Scanning og integrering av gelen som ovenfor disku-tert :ittuliggjorde en korrelasjon mellom forandringer i polypep-tidkonsentrasjonen og forandringer i VIII:C aktivitet. Resultatene er vist i tabellen. Som vist øket Mr=92 000 båndet og avtok deretter i konsentrasjon parallelt med VIII:C aktiviteten. Dette antyder at Mr=9 2 000 båndet er en aktiv form av VIII:C hvis konsentrasjon øket med trombinaktivering. Mr= 54 000 og Mr=44 000 båndene øket jevnt i konsentrasjon mellom 1 og 4 0 minutter selv etterat aktiviteten av blandingen avtok. Mesteparten av Mr=79 000-80 000 dubletten gikk tapt i løpet av de første 0,1 til 10 minutter ettersom VIII:C aktiviteten nådde en topp, mens mesteparten av Mr=71 000-7 2 000 dubletten fremkom i løpet av dette tidsrom og var domi-nerende selv når VIII:C aktiviteten avtok. Disse data antyder at Mr=71 000-72 000 dubletten var avledet fra Mr=79 000-80 000 dubletten og at Mr=71 000-72 000 dubletten er inaktiv i seg selv. Disse data er i overensstemmelse med Mr=71 000-72 000 dublettens bibeholdelse av evne til å kompleksdanne med Mr= 92 000 polypeptidet, og dette kompleks vil også ha aktivitet. Direkte bevis for at Mr=92 000 polypeptidet kompleksdannes med Mr=79 000-80 000 dubletten utledes fra forsøk under anvendelse av den anti-VIII:C monoklonale immunoadsorbent. Det ble først vist at det monoklonale antistoff reagerer i overveiende grad med Mr=79 000-80 000 dubletten og ikke med Mr=92 000 polypeptidet. Dette ble vist ved elektro-foretiske overføringsforsøk. Deretter ble det vist at den monoklonale anti-immunoadsorbent fjernet både Mr=79 000-80 000 dubletten og Mr=92 000 polypeptidene fra løsningen.

Mr=92 000 polypeptidet kunne elueres fra anti-VIII:C immunoadsorbentkolonnen med 10 mM EDTA, mens M r=79 000-80 000 dubletten forble bundet. Dubletten kunne deretter elueres med 3M natriumthiocyanat. Disse forsøk viste at Mr=92 000 polypeptidet ble bundet til immunoadsorbenten fordi det var kompleksdannet med Mr=79 000-80 000 dubletten og at det var denne dublett som ble direkte bundet til immunoadsorbenten.

Eksempel II

Dette eksempel beskriver resultatene ved behandling av renset humanfaktor VIII:C med renset humanaktivert protein C (heretter "APC"), et kjent antikoagulerende enzym. Humanfaktor VIII:C ble renset som tidligere beskrevet. APC ble renset ved den prosedyre som er beskrevet i Marlar, R.A. et al., "Mechanism of action of human activated protein C, a thrombin-dependent anticoagulant enzyme." Blood, Vol. 59, 1067 (1982), med det unntak at en mono S kolonne av et Pharmacia FPLC system ble anvendt for å separere APC fra trombin. Bestemmelser;

Prøver ble analysert med hensyn til VIII:C aktivitet som ovenfor beskrevet, under anvendelse av en aktivert partiell tromboplastin-tidsbestemmelse med hemofilia A plasma-substrat.

Fremstilling av prøver for elektroforese:

Da calciumioner er nødvendig for APC aktivitet ble APC stoppet ved forskjellige tidspunkter ved tilsetning av 1:10 volum 100 mM EDTA inneholdende 10 u'M DAPA til VIII:C + APC aliquoter så vel som til VIII:C- og APC-kontrollaliquoter. Et 1/10 volum 10% natriumdodecylsulfat ble deretter tilsatt til disse aliquoter. De ble deretter oppvarmet i et kokende vannbad i fem minutter og ble deretter dialysert for SDS-PAGE som ovenfor beskrevet.

Diskontinuerlig natriumdodecylsulfat 7,5% polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) av redusert VIII:C, beising med Coomassie blått R250 og scanning og integrering av gelen ble foretatt som ovenfor beskrevet.

Prøvefremstilling:

En 339 yg prøve av VIII:C i 0,3 ml VIII:C buffer inneholdende 0,3M calciumklorid ble dialysert over natten mot buffer (50 mM tris-klorid, 0,15M natriumklorid, 5 mM calciumklorid, 0,02% natriumazid, pH 7,4). Til den dialyserte VIII:C prøve ble tilsatt 1,095 ml buffer, 90 ul kaninhjerne-cefalin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MD, rekonstituert, lagret og tinet i henhold til fabrikantens instruksjoner) og 15 yl 1 mM dansylarginin-N-(3-ethyl-1,5-pentandiyl)-amid (DAPA) til en DAPA sluttkonsentrasjon på 10 uM. DAPA ble inn-befattet for å inhibere enhver spormengde av tilstedeværende trombin i APC da 10 iiM DAPA ikke signifikant inhiberer APC. Det sluttlige volum av prøven var 1,5 ml og den sluttlige VIII:C konsentrasjon var 226 yg/ml. 400 yl av den 1,5 ml's store VTII:C prøve ble trukket ut og satt til side som en kontroll (angitt VIII:C). Til de gjenværende 1,1 ml ble tilsatt 20 yl (10 yg) APC som gav en APC sluttkonsentrasjon på 9 yg/ml (angitt som VIII:C + APC). En andre kontrollprøve ble fremstilt inneholdende alle komponenter ved like konsentrasjoner bortsett fra at VIII:C var utelatt (angitt APC). Tidspunkter: V/I.U;.C alene, blandingen av VIII:C og APC, og APC alene ble anbragt i et 37°C vannbad, og ved gitte -tidspunkter ble prøver tatt ut for SDS-PAGE og/eller VIII:C aktivitets-bestemmelser. Det ble også bestemt i kontrollen at APC forble aktiv ved hydrolysen av det syntetiske substrat S-2238 etter forlenget inkubering ved 37°C.

Resultater:

Oppslutning av renset VTII:C med APC var forbundet med tap på tilnærmet 85% av VIII:C kontrollaktiviteten. APC inaktivering av VIII:C aktiviteten resulterte i en reduksjon av alle VIII:C polypeptider med Mr mellom 92 000 og 188 000 og utvikling av et polypeptid med Mr=45 000, mens dubletten med Mr=79-80 000 forble intakt.

En inaktivering over tid av renset VIII:C av APC viste progressiv forsvinning av spesifikke VTII:C polypeptider ettersom VTII:C aktiviteten avtok over en 360 minutters tidsperiode. Scanning og integrering av gelen viste at polypeptidet med Mr=188 000 og polypeptidet med Mr=92 000 avtok parallelt med VIII:C aktiviteten.

Et annet polypeptid med en mellomliggende Mr~verdi ble splittet av APC, men denne var ikke lett å bestemme kvan-titativt ved gelscanning. Forskjellig fra oppslutning med APC var i dette forsøk enkelte VIII:C polypeptider med Mr= 9 2 000-188 000 resistente overfor APC oppslutning. Som ved oppslutningen med APC ble imidlertid dublettpolypeptidet med Mr=79-80 000 ikke proteolysert av APC.

Et polypeptid med Mr=45 000 syntes å øke i konsentrasjon ettersom polypeptidene med Mr=188 000 og 92 000 avtok, hvilket antyder at dette er et proteolytisk fragment avledet fra disse. Ingen andre oppslutningsprodukter ble synliggjort med Coomassie blått.

Som vist i eksempel I øket og avtok Mr=92 000 polypeptidet under trombinaktiveringen av VIII:C parallelt med VIII:C aktiviteten. For å bestemme hvorvidt et lineært forhold forelå mellom proteolyse av polypeptidet med Mr=92 000

og tapet av VIII:C aktivitet ble data fra dette tids-inakti-veringsforsøk nedtegnet på nytt for å undersøke prosentvis VIII:C aktivitet mot prosent polypeptid med Mr=92 000. Mengden av'VIII:C aktivitet syntes å være proporsjonal med mengden av polypeptid med Mr=9 2 000.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen omfatter monoklonale antistoffer som er spesifikke på en uforutsigelig måte overfor de forskjellige polypeptider som dannes ved omsetning av faktor VIII:C med en protease slik som a-trombin. Hvert antistoff reagerer med humanfaktor VIII:C som ikke er blitt aktivert eller oppsluttet med trombin eller ekvivalente proteaser. Antistoffene er ytterligere kjennetegnet ved:

(A) Ett reagerer med polypeptidet med Mr=9 2 000

som her beskrevet, med polypeptider med Mr=108 000 og større,

og med polypeptidet med Mr=44 000 som er tilstede i sluttlige trombinoppslutningsprodukter. Det reagerer ikke med polypeptidet som utviser en dublett med Mr=79 000-80 000, heller ikke med polypeptidet som utviser en dublett med Mr=71 000-72 000. (B) Ett reagerer med polypeptidet med Mr=9 2 000, med polypeptider med Mr=108 000 og større, og med polypeptidet

med Mr=54 000 som er tilstede i de endelige trombinoppslutningsprodukter. Det reagerer ikke med polypeptidet som utviser en dublett med Mr=79 000-80 000, heller ikke med polypeptidet som utviser en dublett med Mr=71 000-72 000.

(C) Ett reagerer med dubletten med Mr=79 000-

80 000 og polypeptider med Mr=108 000 og større, men reagerer

ikke med polypeptidet med Mr=9 2 000 eller med polypeptidene med Mr=71 000-72 000, Mr=54 000 eller Mr=44 000.

(D) Ett reagerer bare med polypeptider med Mr=

108 000 og større.

Hvert av disse antistoffer kan anvendes for å konsentrere det ovenfor beskrevne kompleks fra blandinger som også inneholder andre polypeptider. En slik blanding fremstilles ved en partiell oppslutning av humanfaktor VIII:C med a-trombin eller en ekvivalent protase. En annen slik blanding er den som produseres ved rekombinante DNA-teknikker hvori et ønsket polypeptid eller kompleks dannes av en mikroorganisme og må gjenvinnes fra en blanding med andre proteinaktige for-bindelser. Antistoff (A), (B), (C) eller (D) eller en kombi-nasjon av to, tre eller alle av disse, kan festes til en immunoadsorbentkolonne på den måte som er beskrevet i eksempel I, og en tilførselsløsning av blandingen inneholdende polypeptidene omfattende komplekset føres gjennom kolonnen. De polypeptider som har Mr på 92 000, 79 000-80 000 og 71 000-72 000 som er tilstede i tilførselsløsningen adsorberes på kolonnen, fra hvilken de kan elueres som tidligere beskrevet, etter at løsningen er blitt vasket gjennom kolonnen. Den resulterende eluerte løsning konsentreres derved med hensyn til det ønskede aktiverte VIII:C kompleks sammenlignet med tilførselsløsningen.

De nye antistoffer er også anvendbare for analytiske formål, for å påvise forekomsten av reaksjonen mellom humant VIII:C og trombin eller andre proteaser, på grunn av deres evne til å reagere med produkter ved denne reaksjon. Et antistoff med profil (B) og et antistoff med profil (C) er blitt funnet som nøytraliserer VIII:C koagulerende aktivitet når det ene eller det andre, er bundet til faktor VIII:C. Denne ytterligere egenskap kan være av verdi ved diagnose av hemofilia-beslektede forstyrrelser. Oppdagelsen av disse antistoffer muliggjør også ytterligere karakterisering av komponen-tene av det her beskrevne polypeptidkompleks. Således inneholder polypeptidet som utviser et bånd med Mr=9 2 000 minst to epitoper (dvs. antistoffbindende seter) som ikke ødelegges av trombinoppslutning og ikke er tilstede på polypeptidene som utviser dubletten med M =79 000-80 000 eller dubletten med

r

Mr=71 000-72 000. En av disse epitoper er også tilstede på polypeptidet med Mr=44 000, og det andre på polypeptidet med Mr=54 000. Således er Mr=54 000 og Mr=44 000 polypeptidene avledet fra Mr=92 000 polypeptidet. Også Mr=92 000 og Mr=

79 000-80 000 polypeptidene er avledet fra en felles forløper eller forløpere. Oppdagelsen av antistoffer som har profil (B) og profil (C) som hver nøytraliserer faktor VIII:C koagulerende aktivitet er en ytterligere understøttelse for at Mr= 92 000 og Mr=79 000-80 000 polypeptidene er viktige når det gjelder koagulantfunksjonen. Polypeptidene som utviser dubletten med Mr=79 000-80 000 inneholder en epitop som ødelegges av trombinoppslutning og som ikke er tilstede på polypeptidet

med M =92 000.

r

Disse monoklonale antistoffer kan fremstilles ved generelle trinn slik som rensning av humanfaktor VIII:C, dannelse av monoklonale antistoffer overfor det rensede VIII:C; partiell oppslutning og aktivering av renset VIII:C for å danne det ovenfor beskrevne polypeptidkompleks, innbefattende identifisering av de spesifikke polypeptider; omsetning av anti-VIII:C antistoffene med aktiveringsproduktene; og karakterisering av et antistoff ved identifisering av polypeptidene med hvilke det reagerer. Denne sekvens er mer detaljert beskrevet i eksempel III. Alternativt kan man fremstille et antistoff ved isolering av det bestemte polypeptid av interesse fra de partielle trombinoppslutningsprodukter, for eksempel ved immunoadsorpsjon på og deretter eluering fra en kolonne omfattende agarose til hvilket er koblet et monoklonalt antistoff som er kjent for å reagere med polypeptidet av interesse, og deretter dannelse av et monoklonalt antistoff mot dette polypeptid under anvendelse av den prosedyre som er beskrevet i eksempel III:

Eksempel III

Monoklonale antistoffer overfor humanfaktor VIII:C ble dannet under anvendelse av den etterfølgende prosedyre idet man startet fra høyrenset VIII:C som var blitt fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i US patentskrift 4 361 509.

Mus ble injisert med høyrenset faktor VIII:C etter den etterfølgende prosedyre. På dag null ble musene injisert intraperitonealt med en sammensetning fremstilt ved å oppløse (eller suspendere) 10 ug av proteinet i 0,1 ml buffer inneholdende 0,05M tris, 0,15M natriumklorid, 0,02% natriumazid,

1 mM fenylmethylsulfonylfluorid, trasylol 10 enheter/ml ved pH 7,3, og risting med et likt volum av Freund's fullstendige adjuvans. På dag 14 ble musene igjen injisert med samme materiale, bortsett fra at Freund's ufullstendige adjuvans ble anvendt i stedet for Freund's fullstendige adjuvans. På dag 21 ble den samme injeksjon som ble foretatt på dag 14 gjen-tatt. På dag 38 ble musene injisert bare med renset VIII:C.

På dag 4 2 ble milten i musene fjernet og sammensmeltet i henhold til en standardprosedyre av den type som er beskrevet av J.P. Brown et al., "Protein Antigens of Normal and Malignant Human Cells Identified by Immunoprocipitation with Monoclonal Antibodies", Journal of Biological Chemistry, Vol. 225, sidene 4980-4983 (1980). Standardteknikken ble variert bare i den grad at 35% polyethylenglycol 1000 ble anvendt i stedet for 50% polyethylenglycol.

Antistoffene ble utvalgt under anvendelse av den prøveprosedyre som er beskrevet i eksempel I, under avsnittet med overskriften "Produksjon av monoklonalt antistoff mot VIII:C", med det unntak at antistoffer som ikke nøytraliserer VIII:C aktivitet også ble subklonet og behandlet som beskrevet i det etterfølgende.

Klonene som var positive ble subklonet to ganger og stabelkloner som dannet antistoff overfor VIII:C ble deretter injisert i de peritoneale hulrom i Balb/C mus som på forhånd var blitt behandlet intraperitonealt med 0,5 ml pristan minst fire dager før injeksjon av celler. Hybridomaceller ble injisert i konsentrasjoner på 5 x 10 celler pr. mus i 0,5 ml Delbecco's modifiserte Eagle's medium uten oksefosterserum. Musene ble tappet når disse svulmet opp og ascitesvæske ble oppsamlet i heparin til tilnærmet 10 enheter/ml. Ascitesvæske fra flere mus ble oppsamlet for å tilveiebringe et hensiktsmessig volum for etterfølgende isolering av monoklonalt IgG. Antistoffene ble utfelt fra ascitesvæske under anvendelse av 50% ammoniumsulfat, og ble deretter utfelt på nytt to ganger. Anti-VIII:C antistoffene som således ble dannet svarende til (B), (C) og (D) ble bundet til agaroseperler og viste seg å binde renset VIII:C fra løsning.

Separate satser av VIII:C, én ubehandlet og én under-kastet trombinproteolyse ble deretter analysert ved SDS-PAGE trinnene som beskrevet i eksempel I. Deretter ble hvert bånd overført elektroforetisk (Western overføringsanordning) fra gelen på et nitrocelluloseark. Den anvendte apparatur var Bio-Rad "Trans-Blot"-celle og Bio-Rad Modell 160.1.6 kraft-tilførsel (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California). Over-føringsbufferen var 25 mM tris med glycin tilsatt til pH 8,3, 20% methanol. Overføringer ble foretatt i løpet av 16-24 timer ved 90 V og 100 mA.

De spesifikke polypeptider med hvilke hvert av antistoffene reagerte ble bestemt under anvendelse av en prosedyre tilpasset fra W.M. Burnette, "Western Blotting: Electrophore-tic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detec-tion with Antibodies and Radioiodinated Protein A", Analytical Biochemistry, Vol 112, sidene 195-203 (1981).

"Buffer D" var 10 nM tris-klorid, 0,15 M NaCl,

0,02% natriumazid, pH 7,4. Alle reaksjoner ble utført ved romtemperatur. 1. Anbring nitrocellulosearket med overførings-proteinet i et trau inneholdende 100 ml buffer D og 0,25% gelatin. Anbring trauet på en rotasjonsrister og rist lang-, somt i 3 0 minutter. 2. Tilsett deretter det monoklonale antistoff til trauet (enten 0,1%—1 % av ascitesvæske eller 1 mg av renset IgG) Rist i 120 minutter.

3. Vask nitrocellulosearket som følger:

(a) 10 minutter med 100 ml av buffer D.

(b) 30 minutter med 100 ml av buffer D og 0,05%

Nonidet-P-40, med utskiftninger ved 10 og 20 minutter.

(c) 10 minutter med 100 ml buffer D.

4. Bløtgjør nitrocellulosearket i buffer D pluss 0,25% gelatin og I 1 25-merket renset kanin anti-muse IgG i 30 minutter.

5. Vask nitrocellulosearket som følger:

(a) 10 minutter med 100 ml buffer D.

(b) 16-24 timer med 100 ml buffer D pluss .0,1%

Nonidet P-4 0 og 0,5M NaCl.

(c) 10 minutter med 100 ml av buffer D.

6. Tørk nitrocellulosearket mellom to ark av filterpapir og lagre deretter nitrocellulosearket i en forseglet

plastpose.

7. For å bestemme hvilke antistoffer og polypeptider som har reagert: (a) Preparer en autoradiograf av nitrocellulosearket under anvendelse av standardprosedyrer kjent innen litteratu-r ren. (b) Sammenligne autoradiografen med et nitrocelluloseark på hvilket VIII:C var overført, men som var blitt beiset med Coomassie blått R250 i stedet for å være omsatt med monoklonalt antistoff.

Disse trinn viste at følgende distinkte antistoffer var blitt dannet.

Fire antistoffer reagerte med polypeptidet med Mr=

92 000, Mr=108 000 og større polypeptider, det ene eller det andre av polypeptidene med Mr=54 000 eller 44 000 tilstedeværende i sluttlige trombinoppslutningsprodukter, og ingen andre polypeptider. Dette viser at opprinnelsen for disse to sistnevnte polypeptider er fra polypeptidet med Mr=9 2 000 som et resultat av trombin splitting. Det viser også at to epitoper på Mr=92 000 polypeptidet overlevet denne splitting, og at disse epitoper ikke er tilstede på Mr=79 000-80 000 dubletten.

Et femte antistoff reagerte med dubletten med Mr=

79 000-80 000, og med polypeptider med Mr=108 000 og større, men ikke med polypeptidet med Mr=92 000 og heller ikke med noen av de tilstedeværende polypeptider i sluttlige trombinoppslutningsprodukter. Dette viser at Mr=79 000-80 000 dubletten utviser en epitope som ikke er tilstede på Mr=9 2 000 polypeptidet, og at epitopen ødelegges ved trombinoppslutning av Mr=79 000-80 000 dubletten.

Reaksjonsprofilene av disse fem antistoffer indike-rer at Mr=92 000 og Mr=79 000-80 000 polypeptidene avledes fra en felles forløper eller forløpere.

Et sjette antistoff reagerte bare med polypeptider med Mr=108 000 og større. Da det ikke reagerte med noen av de tilstedeværende polypeptider i de sluttlige trombinoppslutningsprodukter var den epitope med hvilken den reagerte blitt ødelagt av trombinoppslutningen.

For å fremstille og lagre et biologisk preparat med én eller flere av disse antistoffer, kan det tilsvarende monoklonale IgG isoleres fra heparinisert oppsamlet ascitesvæske umiddelbart etter oppsamling eller en fryst del av den lagrede løsning kan tines. Uten hensyn til hvorvidt frisk eller fryst materiale anvendes, bringes løsningen til 4°C og behandles med et likt volum fosfatbuffret saltvannsoppløsning (PBS) (PBS: 1,6 g natriumfosfat, monobasisk monohydrat; 8,4 g natriumfosfat, dibasisk vannfri; 61,4 g natriumklorid; vann til 7 liter; pH=7,2). Den fortynnede ascites utfelles ved dråpevis tilsetning under omrøring ved 4°C. Sentrifugering utføres fortrinnsvis ved 14 000 opm i 6 0 minutter (30 000 x

g). Supernatantløsningen av ascites utfelles ytterligere to ganger med SAS og blandingen av bunnfall og supernatantvæske

omrøres og sentrifugeres på samme måte som i første syklus. De resulterende pellets fra den tredje utfelning resuspende-res i et volum av PBS lik volumet av den fortynnede ascitesvæske og dialyseres deretter grundig mot PBS. Klumper som kommer til syne i dialyseposene fjernes ved sentrifugering ved 20°C. Det dialyserte IgG adsorberes ved omrøring av dette med en 5%-ig vandig løsning av aluminiumhydroxyd ved romtemperatur og sentrifugering ved 20°C etter adsorpsjon. Adsorpsjonsbehandlingen gjentas minst ytterligere tre ganger under anvendelse av '2,5% aluminiumhydroxydløsning for hver behandling etter den første. Det adsorberte IgG bringes til 4°C og utfelles ytterligere én gang med SAS som beskrevet ovenfor. De utfelte pellets kan lagres ved -20°C inntil de skal anvendes.

To foretrukne prosedyrer for rensning av de monoklonale antistoffer og opprettholdelse av biologiske preparater inneholdende disse er beskrevet i P.L. Ey et Al., "Isola-tion of Pure IgG^ , I(?G2a og IgG2tj Immunoglobulins from Mouse Serum Usihg Protein A-Sepharose." Immunochemistry, Vol. 15, sidene 429-436; og i C. Bruck et al., "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid by DEAE Affi-Gel Blue Chromatography." J. Immunological Methods, Vol. 53, sidene 313-319 (1982).

Claims

1* Fremgangsmåte for fremstilling av en ny faktor VIII:C koagulant inneholdende ett eller flere polypeptider som utviser en koagulerende aktivitet og Mr-verdier på 92000, 80000, 79000, 71000, 54000 eller 44000 når de underkastes natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese, karakterisert ved at; (a) human faktor VIII:C oppsluttes i en oppslutningsbland-ing inneholdende en protease, fortrinnsvis ved romtemperatur og pH 6,8-7,4, (b) oppslutningen i trinn (a) avbrytes etter en tidsperiode fra 0,1 til 60 minutter ved tilsetning av en effektiv mengde av en proteaseinhibitor til oppslutningsblandingen inneholdende faktor VIII:C koagulanten; og (c) den resulterende koagulant gjenvinnes ved anvendelse av ultra-filtrering/sentrifugering, ionebytte-, gel- og affinitetskromatografi, isoelektrisk fokusering,preparativ elektroforese eller immunoadsorbsjon.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for gjenvinning av koagulanten karakterisert ved at koagulanten adsorberes i aktiv form til en immunoadsorbent inneholdende et flertall av monoklonale antistoffer overfor human faktor VIII:C epitoper, og at koagulanten elueres fra immunoadsorbenten med en vandig løsning inneholdende opptil 1,0 M kalsiumioner.

3. Monoklonale antistoffer av klasse IgG for anvendelse in-vitro til isolering og identifisering av F-VIII:C-koagulantene fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, dannet av hybridomer dannet ved sammensmelting av celler fra en musemyeloma og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med høyrenset humanfaktor VIII:C, karakterisert ved at de reagerer med humanfaktor VIII:C og utviser én av følgende reaksjonsprofiler med polypetider avledet fra humanfaktor VIII:C; (A) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr=92 000; Mr=180 000 og større; og 54 000; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr=44 000; 71 000; 72 000; 79 000; eller 80 000; (B) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr=92 000; Mr=108 000 og større; og 44 000; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr=54 000; 71 000; 72 000; 79 000; eller 80 000; (C) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr = 79 000 og 80 000; og M =10.8 0QQ. og større; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr=44 000; 54 000; 71 000; 72 000; eller 92 000; (D) reagerer med de polypeptider som er avledet fra Mr=108 000 og høyere; og reagerer ikke med de polypeptider som er avledet fra Mr mindre enn 108 00 0; hvori Mr-verdiene er bestemt ved å underkaste polypeptidene natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese? og hvori de monoklonale antistoffer med profil (B) eller (C) videre er kjennetegnet ved at de nøytraliserer den koagulerende aktivitet av humanfaktor VIII:C når angitte faktor VIII:C er bundet til antistoffene.

4. Biologisk preparat for anvendelse in-vitro til isolering og identifisering av F-VIII:C-koagulantene fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, karakterisert ved at det omfatter monoklonale antistoffer som utviser (a) reaksjonsprofil A ifølge krav 3 som er hovedsakelig fri for monoklonale antistoffer som utviser de andre tre angitte profiler, eller (b) reaksjonsprofil B ifølge krav 3 som er hovedsakelig fri for monoklonale antistoffer som utviser de andre tre angitte profiler, eller (c) reaksjonsprofil C ifølge krav 3 som er hovedsakelig fri for monoklonale antistoffer som utviser de andre tre angitte profiler, eller (d) reaksjonsprofil D ifølge krav 3 som er hovedsakelig fri for monoklonale antistoffer som utviser de andre tre- antitte profiler.

5. Biologisk preparat for anvendelse in-vitro til isolering og identifisering av F-VIII:C-koagulentene fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, karakterisert ved at det omfatter en blanding av monoklonale antistoffer ifølge krav 3 som utviser re-aksjonsprof il A og B, som er hovedsakelig fri for monoklonale antistoffer ifølge krav 3 som utviser reaksjonsprofil C og D.

6. Biologisk preparat for anvendelse in-vitro til isolering og identifisering av F-VIII:C-koagulentene fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 1, karakterisert ved at det omfatter en blanding av monoklonale antistoffer ifølge krav 3 som utviser re-aksjonsprof il A, B og C, som er hovedsakelig fri for monoklonale antistoffer ifølge krav 3 som utviser reaksjonsprofil D.