JPH0638790A - ファクターｖｉｉｉ：ｃ凝固因子ポリペプチド類に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 高い比活性のファクターＶIII：Ｃ凝固因子
ポリペプチドに対するモノクローナル抗体に関する。 【構成】 新規なファクターＶIIIポリペプチド類、即
ち、凝固活性を有するタンパク類と反応する抗体に関す
るもので、古典的な血友病の治療、並びにヒトおよび哺
乳類の血液に対して望ましい凝固挙動を示す様なポリペ
プチドまたはポリペプチド複合物のさらに進んだ研究、
および確認を行なう。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体はファクターＶ
III：Ｃ凝固活性を中和できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明は、新規なファクターＶIIIポリ
ペプチド類、即ち、凝固活性を有するタンパク類と反応
する抗体に関する。さらに詳しくは、本発明は、古典的
な血友病の治療、並びにヒトおよび哺乳類の血液に対し
て望ましい凝固挙動を示す様なポリペプチドまたはポリ
ペプチド複合物のさらに進んだ研究、および確認を行な
う上で有用なものである。

【０００２】古くから、血漿ファクターＶIIIが血液の
凝固に重要な役割を果していること、並びにトロンビン
がこのファクターＶIIIの凝固作用を活性化すること、
は知られていた。最近のファクターＶIII確認作業にお
いて、ファクターＶIIIは少なくとも２個のポリペプチ
ド、即ちＶIII:ＣおよびＶIII:Ｒと称するもの、の複合
体であるとの仮定がなされ、しかもこのＶIII:Ｃ部分に
凝固活性が存在することが見出された。ファクターＶII
I:Ｃに対するトロンビンの作用が研究され、トロンビン
は該ファクターを数個の小ペプチドに分解することによ
り活性化する、という結論が導き出された。しかしなが
ら、これまでどの研究においても、ヒトにおけるトロン
ビン−誘発性ファクターＶIII活性化作用と、ヒトのフ
ァクターＶIII:Ｃから形成された、はっきりと決定され
たポリペプチドのいずれかとを関連づけることはできな
かった。

【０００３】例えば、ＨoyerおよびＴraboldは、「ヒト
のファクターＶIIIに対するトロンビンの影響」Ｊ.Ｌab.
Ｃlin.Ｍed．９７:５０−６４(１９８１)、において、
ウサギ由来のファクターＶIII:Ｒに対する多クローン性
抗体を用いた免疫吸着剤クロマトグラフィーにより、ヒ
トのファクターＶIII:Ｃを精製することを追求してい
る。次いで、彼らはファクターＶIII:Ｃを精製ヒトα−
トロンビンと共にインキュベートし、トロンビンは、少
量ではファクターＶIII:Ｃを活性化するが、大量の場合
には該ファクターを殆んど、または全く活性化しないと
結論している。彼らはまた、トロンビンの活性化作用は
タンパクサイズの減少による、と結論づけると共に、活
性化されたファクターＶIII:Ｃの分子量は約１１６,０
００であると提示した。しかし重要なことは、彼らはフ
ァクターＶIII:Ｃ活性を保持している特定のポリペプチ
ド類、およびＶIII:Ｃ抗原決定基を同定することができ
なかった、という点である。

【０００４】Ｆulcher,Ｃ.Ａ.およびＺimmerman,Ｔ.Ｓ.
は、「ヘテロローガスな沈降抗体によるヒトのファクタ
ーＶIII凝固促進性タンパクの確認」Ｐrpc.Ｎatl.Ａcad.
ofＳci.ＵＳＡ,７９:１６４８−１６５２(１９８２)に
おいて、血漿濃縮物をファクターＶIII:Ｒに対するモノ
クローナル抗体を含有するカラムに通し、吸着されたＶ
III:Ｃ／ＶIII:Ｒ複合体からＶIII:Ｃを溶離し、次いで
ファクターＶIII:Ｃを第２のカラムで濃縮することによ
り、ヒト血漿濃縮物から精製度の高いヒト、ファクター
ＶIII:Ｃを得た、と述べている。次いで、この純化ファ
クターＶIII:Ｃを、これにトロンビンを加える前、およ
び後に、ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と呼称)により分
析した。純化ファクターＶIII:Ｃは、トロンビン添加前
には、分子量(Ｍ_ｒ)８０,０００および７９,０００の位
置に比較的強い二重線(ダブレット)で示されるもの、並
びにこれに加えてＭ_ｒ約９２,０００の１個をはじめ、
少なくとも６個のより大きいＭ_ｒを有し僅かに染色され
るポリペプチドなどを含めて、様々な分子量のポリペプ
チドに対応する。広範なバンド配列をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上に示した。純化ファクターＶIII:Ｃにトロンビンを加
えると、トロンビン添加前に認められたポリペプチド全
てに、その減少または消失が起きた。

【０００５】血漿濃縮物の凝固活性はトロンビン添加に
伴って上昇し、トロンビン添加前の該物質に対し最高３
倍に達した後、減少した。純化ファクターＶIII:Ｃの凝
固活性もまた、活性化前の物質の最高３倍に上昇した。
このことは、トロンビンがこれらの各場合において、本
質的に同じファクターＶIII:Ｃ活性化作用を有すること
を意味する。この様に、純化ファクターＶIII:Ｃは出発
物質の約３２８０倍の比活性を持っていたと報告されて
いるので、当該技術分野の人ならば、比活性のこの様な
増加は高度に達成された精製度に起因するものと断定す
るであろう。この論文には、賦活化された凝固活性をト
ロンビンによる活性化前の純化ファクターＶIIIについ
て観察されたバンド中の特定の１、または１以上の数の
ポリペプチドに帰属する根拠となるものは一切含まれて
いない。

【０００６】本発明は、以下の特徴を有する。１または
１以上のポリペプチドを含有するファクターＶIII:Ｃ凝
固因子に関するものである:

【０００７】(i)１または１以上のポリペプチドは、Ｍ
_ｒ約９２,０００に相当する位置にバンドを示す;あるい
はＭ_ｒ値約９２,０００、約８０,０００、および約７
９,０００に相当する位置;あるいは約９２,０００、約
７２,０００、および約７１,０００に相当する位置;あ
るいは約９２,０００、約８０,０００、約７９,００
０、約７２,０００および約７１,０００に相当する位置
にバンドを示す(但し、Ｍ_ｒはドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定したもので
ある); (ii)該凝固因子は１８００単位／mg以上の凝固比活性を
示す; (iii)該凝固因子は少なくとも１０分間以上、持続した
期間中、第(ii)ステップの活性を示す;そして (iv)該凝固因子はヒト、ファクターＶIII:Ｃ抗体結合能
力を示す。

【０００８】本発明はまた、該凝固因子を含有する生物
学的製剤、並びに該凝固因子またはその製剤を投与する
ことにより、血友病における凝血異常を治療する方法に
関するものである。さらにまた本発明は、ヒトのファク
ターＶIII:Ｃをα−トロンビンで消化し、該消化作用を
前述の凝固因子の存在下に中断し、この凝固因子を回収
することにより凝固因子を調製する、あるいはその凝縮
製剤を製造することに関する。さらに進んで、本発明
は、ファクターＶIII:Ｃに対するモノクローナル抗体を
含有している免疫吸着剤から、凝固活性を喪失すること
なくＶIII:Ｃポリペプチド類を回収する方法に関するも
のである。

【０００９】加うるに、本発明はヒトのファクターＶII
I:Ｃで予め免疫化したマウスの脾臓細胞とマウスの骨髄
腫からの細胞を融合させることにより得られるハイブリ
ドーマによって調製されたＩgＧクラスのモノクローナ
ル抗体であって、ヒトのファクターＶIII:Ｃと反応し、
該ヒトのファクターＶIII:Ｃから導かれるポリペプチド
類との間で下記の反応挙動のうちのいずれか１つを示す
抗体を提供するものである:

【００１０】(Ａ)Ｍ_ｒ＝９２,０００;Ｍ_ｒ＝１８０,０
００およびそれ以上;並びに５４,０００の、その様に導
かれたポリペプチドとは反応し、他方Ｍ_ｒ＝４４,００
０;７１,０００;７２,０００;７９,０００;並びに８０,
０００の、その様に導かれたポリペプチドとは反応しな
い。

【００１１】(Ｂ)Ｍ_ｒ＝９２,０００;Ｍ_ｒ＝１０８,０
００およびそれ以上;並びに４４,０００の、その様に導
かれたポリペプチドとは反応し、他方Ｍ_ｒ＝５４,００
０;７１,０００;７２,０００;７９,０００;並びに８０,
０００の、その様に導かれたポリペプチドとは反応しな
い;

【００１２】(Ｃ)Ｍ_ｒ＝７９,０００および８０,００
０;並びにＭ_ｒ＝１０８,０００およびそれ以上の、その
様に導かれたポリペプチドとは反応し、他方Ｍ_ｒ＝４
４,０００;５４,０００;７１,０００;７２,０００;並び
に９２,０００の、その様に導かれたポリペプチドとは
反応しない。

【００１３】(Ｄ)Ｍ_ｒ＝１０８,０００およびそれ以上
の、その様に導かれたポリペプチドとは反応し、他方、
Ｍ_ｒ＝１０８,０００以下の、その様に導かれたポリペ
プチドとは反応しない(但し、ここで示したＭ_ｒ値はポ
リペプチド類をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけることにより得られた値であ
る)。

【００１４】既述した如く、本発明はファクターＶIII:
Ｃ凝固活性およびファクターＶIII:Ｃ免疫学的挙動、を
示すと共に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と呼称)法で
分析した際に特徴的なＭ_ｒ値を示すポリペプチド凝血因
子群を包含するものである。本明細書において、以後
「ポリペプチド複合物」という語句は、物理的にはっきり
と区別できるポリペプチド類の２またはそれ以上の組合
わせからなる凝固因子を意味するものとする、が、唯一
個の識別可能なポリペプチド、即ち、Ｍ_ｒ＝９２,００
０にバンドを示すポリペプチドだけを含有する製剤をも
意味するものとする。また、本明細書において使用して
いる「ファクターＶIII」なる用語は、天然に存在する
いわゆる第ＶIII因子を意味し、「ファクターＶIII：
Ｃ」および「ファクターＶIII：Ｒ」と称するものはこ
の第ＶIII因子の構成因子を意味する。他方、本発明の
目的とするポリペプチド類を表すためには、「ファクタ
ーＶIII：Ｃ凝固因子」または単に「凝固因子」なる用
語を使用しており、上記天然のファクターＶIII：Ｃと
は明確に区別している。

【００１５】以下の記述は、ヒト、ファクターＶIII:Ｃ
を用いた本発明の特許請求に係る凝固因子の製造方法を
示すものであって、該ファクターＶIII:Ｃは新規な生成
物の同定並びに確認を、余分なポリペプチドの影響を受
けることなく、行なうために高度に精製されている。し
かしながら、特に指示しない限り、本発明そのものは、
それ以前に出発物質がどの様に処理されたか、を問題に
しないということを強調しておく必要がある。本発明に
係る活性なファクターＶIII:Ｃポリペプチド群は、後に
非常に詳しく述べる如く、トロンビンによる消化、ある
いは、同様の作用を有するプロテアーゼ類、例えばファ
クターＸa、ファクターＩＸa、またはラッセルのマムシ
毒−Ｖなどによる消化によって製造される、のみなら
ず、ＤＮＡ組換え技術、即ち、当該技術分野で通常の知
識を有する人々にとっては自明の方法により、所望のポ
リペプチドを製造するための１または１以上の遺伝子を
導入された細菌、酵母またはその他の細胞によって所望
のポリペプチドを製造することによっても調製すること
ができる。所望の複合物を得るためのいずれの工程にお
いても、１または１以上の他のポリペプチド類を含んだ
複合物が生成されることが予測される。

【００１６】ヒトのファクターＶIII:Ｃを含有するあら
ゆる血漿または血漿濃縮物を利用することができる。新
規な凝固因子は、本明細書中に参考として引用したアメ
リカ特許第４,３６１,５０９号、１９８２年１１月３０
日発行、に記載されている方法に従って極めて高度に精
製されたヒトのファクターＶIII:Ｃから調製することが
できる。この方法においては、血漿または血漿濃縮物の
如きファクターＶIII:Ｃ源を、ファクターＶIII:Ｒに対
するモノクローナル抗体類の結合した免疫吸着剤カラム
に通している。ファクターＶIII:Ｒ／ＶIII:Ｃ複合体が
カラムに吸着され、次いでファクターＶIII:Ｃを溶離
し、これをアミノヘキシルアガロースの如き第２のカラ
ムに通す。第２のカラムもまた、ファクターＶIII:Ｃに
対する抗体を含有する免疫吸着剤であってもよい、とい
うことは注目すべきである。ファクターＶIII:Ｃは、α
−トロンビンおよび他のプロテアーゼ類を伴なうもので
あってはならない。このファクターＶIII:Ｃは、例えば
０.３Ｍ塩化カルシウムを含有するpＨ６.８〜約７.４の
緩衝化された食塩中で都合良く保存することができる。

【００１７】次いで、ヒトのファクターＶIII:Ｃを、後
述するようなポリペプチド複合体の生成に有効な条件下
でα−トロンビンにより消化する。純化α−トロンビン
は、Ｆenton,Ｊ.Ｗ.ＩＩ;Ｆasco,Ｍ.Ｊ.;Ｓtackrow,Ａ.
Ｂ.;Ａronson,Ｄ.Ｌ.;Ｙoung,Ａ.Ｍ.;およびＦinlayso
n,Ｊ.Ｓ.著、「ヒトトロンビン。α−トロンビンの製
造、評価、並びに性質。」Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５２:３５
８７−３５９８(１９７７)、に記載されている方法によ
って得ることができる。

【００１８】α−トロンビンおよびファクターＶIII:Ｃ
を水性の系、好ましくはpＨ約６.８〜約７.４に緩衝化
された系において一緒にする。トロンビンは、ファクタ
ーＶIII:Ｃと反応させるに充分な様、ファクターＶIII:
Ｃに相当するだけの量であって、しかも所望の活性なポ
リペプチド複合物を回収し得るよりも以前に、該ファク
ターＶIII:Ｃが不活性なポリペプチドに分解されてしま
う程には多くない量、存在させる必要がある。例示の如
く、１ml中にファクターＶIII:Ｃ２００−４００単位を
含む製剤(０.２mg／ml)は、α−トロンビン約０.１〜約
０.５単位／mlにより消化させる必要がある。消化は室
温で行うことができる;温度が高すぎるとタンパクが変
性し、低すぎると消化の進行が抑制される。

【００１９】所望のポリペプチド複合体の生成に充分な
長さの時間、消化させておく。適当な時間は、０.１〜
約６０分、好ましくは０.１〜３０分である。１〜１０
分の間の時間が特に適当であることが見出された。しか
しながら、至適時間は、処理されているファクターＶII
I:Ｃ出発物質の一部を用いて行う最小の実験により確認
することができる、ということは理解されるであろう。
至適時間は、Ｍ_ｒ約９２,０００を示すポリペプチドの
最大量、およびこれに付随して、該Ｍ_ｒ９２,０００ポ
リペプチドを著しく分解することなく、約７９,０００
および約８０,０００のＭ_ｒダブレットを示すタンパク
複合物、の各々を生成する時間である。このＭ_ｒ７９,
０００−８０,０００ダブレット複合物は、Ｍ_ｒ値７１,
０００−７２,０００にダブレットを示す複合物に分解
された後、作用を現わすのかもしれない。しかし７１,
０００−７２,０００ダブレットは、単独ではファクタ
ーＶIII:Ｃ活性を示さない。

【００２０】次いで、反応混合物に有効量の(p−アミノ
フェニル)メタンスルホニルフルオライド(以下「p−ＡＰ
ＭＳＦ」と略す)または他のトロンビン阻害剤を加えるこ
とにより消化を中断する。p−ＡＰＭＳＦはα−トロン
ビンがさらにファクターＶIII:Ｃタンパク類と反応する
ことを阻止するが、これらのタンパク類を分解するもの
ではない。p−ＡＰＭＳＦ添加量は、反応混合中に当初
存在していたα−トロンビン活性１単位につき、約１.
５〜約２.５ミリモルであることが必要である。

【００２１】p−ＡＰＭＳＦはＣalifornia Ｍedicinal
Ｃhemistry Ｃompany,Ｓan Ｆrancisco,Ｃalifornia を
通じて入手し得るがその製造方法は、Ｌaura,Ｒ.;Ｒobi
nson,Ｄ.Ｊ.;およびＢing,Ｄ.Ｈ.著「(p−アミノフェニ
ル)メタンスルホニルフルオライド、セリンプロテアー
ゼの不可逆性阻害剤」Ｂiochemistry(１９８０)１９,４
８５９−４８６４,４８６１頁に記載されている。

【００２２】次にこの反応混合物を、本発明に係るポリ
ペプチド複合物を濃縮するための処理に付すことができ
る。ポリペプチド複合物は、純化型複合体の有する非常
に高い活性を与える形で複合体を得るために、他のファ
クターＶIIIおよびファクターＶIII以外のタンパク様物
質に関して濃縮することが好ましい。精製法としては、
例えば限界濾過法、超遠心分離法、イオン交換法、ゲル
透過クロマトグラフィー法、プレパラティブ電気泳動
法、等電点分画電気泳動法、並びにゲルおよびアフィニ
ティクロマトグラフィー法などを挙げることができる。

【００２３】所望の複合物はまた、反応混合物(これは
他の方法で予め濃縮されていてもよい)を複合物のポリ
ペプチド(類)と反応しうる抗−ヒトＶIII:Ｃ抗体あるい
はヒト以外のＶIII:Ｃに対する同等の抗体を含有する免
疫吸着剤カラムに通すことにより濃縮および／または回
収することができる。抗体類はアガロースに結合してい
る(実施例１の下欄参照)。複合物の濃縮および／または
その中のあるポリペプチドの分離に用いることのできる
抗体類について後述する。活性ＶIII:Ｃ複合物は優先的
にカラムに吸着し、次にカルシウムイオンを含む溶液
(例、ＣaＣl₂)(所望により非イオン性界面活性剤をも含
有してよい)によって溶離される。適当な界面活性剤に
は、アルキルフェニルポリオキシエチレン類、例えばＴ
riton−Ｘ−１００、−Ｎ−１０１、または−Ｘ−４０
５(Ｅastman Ｃhemical Ｃo.);Ｔween−２０、−６０ま
たは−８０(Ｓigma Ｃhemical Ｃo.);およびＮonidet
Ｐ−４０(Ｓigma Ｃhemical Ｃo.)などが含まれるが、
これらは全て化学式のわかった周知の商品である。

【００２４】用いられるカルシウムイオンおよび界面活
性剤の濃度はポリペプチド複合物を脱着するに充分な濃
度であるべきだが、溶離剤がポリペプチドを不活性化し
てしまう程、高くないことを要する。カルシウムイオン
の濃度は約０.５Ｍまたは約１.０Ｍまで高めることがで
きるが、０.２５Ｍが好ましい。界面活性剤濃度は、約
１重量％まで高めることができるが０.１重量％が好ま
しい。溶離剤を免疫吸着剤カラムに約１〜８床容量／
時、好ましくは約３〜約４床容量／時の速度で適用す
る。流速が高すぎるとカラムが破壊され、ポリペプチド
複合物の吸着が起こらない危険性がある。熟練した実施
者ならば、これらの指示を固定床カラム以外の免疫吸着
工程に容易に適応させることができるであろう。

【００２５】ＶIII:Ｃポリペプチド複合物は、pＨ約６.
８〜７.４において適当な緩衝液中に回収され、この中
には溶離溶液からのカルシウムイオン並びに界面活性剤
も含まれている。実施例１において用いる様に、より低
濃度のカルシウムイオンを含有するＶIII:Ｃ緩衝液、等
の緩衝液に対して上記の溶液を透析することにより、カ
ルシウム並びに界面活性剤の濃度を下げ、好ましくは界
面活性剤を除去することができる。本発明の複合物はこ
の溶液中に、あるいは凍結乾燥して保存することができ
る。この複合物は血友病性凝血異常の患者に対し、カル
シウム濃度を生理学的に許容し得る様に調節して投与す
ることができ、その滅菌食塩水溶液を注射投与すること
ができる。

【００２６】次に示す如くＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する
と、本発明の凝固因子は、Ｍ_ｒ約９２,０００を示し、
正常な状態で約７９,０００および約８０,０００のＭ_ｒ
ダブレットを示す物質(その内の幾分かは分解して約７
１,０００および約７２,０００のＭ_ｒダブレットを示
す)を含むこともある。その純化型においては、このバ
ンドあるいはこれら一群のバンドが、本来、現われる唯
一のバンドである。しかしながら、本発明はまた、本発
明に係る凝固因子を含有することを示すタンパク性物質
を１００％以下、即ち、９５％、９０％、または８０
％、７０％、６０％、さらに少量の３０％、２０％、１
０％、あるいは１％、含有する生物学的製剤をも包含す
るものであることを認識しておくことが必要である。本
発明は従って、そのファクターＶIII:Ｃ活性が本発明の
凝固因子の存在に起因している様な製剤をも包含するも
のである。

【００２７】本発明に係るタンパク複合物は、精製した
ヒトのファクターＶIII:Ｃ、前述のアメリカ特許第４,
３６１,５０９号で開示され請求されている方法で精製
されたヒトのファクターＶIII:Ｃなど、よりも高いＶII
I:Ｃ凝固比活性(活性／総タンパク量、mg)を有する。実
際、純化複合物の活性は数倍であり、例えば、精製した
ヒトのファクターＶIII:Ｃの３〜５倍、さらに好都合に
は少なくとも１０倍、あるいは５０倍もの活性を示す。
同様に、本発明の複合物を、１または１以上の他のタン
パク類と一緒に含有した、従来知られている凝血剤製剤
が与えるより高い比活性を有する生物学的製剤を得るこ
とができる。複合物、並びにそれを含有する生物学的製
剤の比活性は、１８００単位／mg以上、好都合には５,
４００単位／mg、より好都合な態様では７,５００、さ
らには１０,０００単位／mg以上にも達する。好ましい
のは、本発明製剤の比活性が本発明で用いた精製したヒ
トのファクターＶIII:Ｃの３〜５倍、好都合には少なく
とも１０倍、５０倍、あるいは１００倍にも達すること
である。

【００２８】本発明に係るタンパク複合物、およびその
生物学的製剤は、上記の優れた活性が少なくとも約１０
分間、好ましくは少なくとも約３０分間、持続的に存在
することを特徴とする。勿論、活性は一般にもっと長期
間安定である。複合物はまた、ファクターＶIII:Ｃタン
パクの免疫学的特性、即ち、ヒトのファクターＶIII:Ｃ
に対する抗体と結合する性質、を有している。このこと
は、例えば、以下に述べる様にファクターＶIII:Ｃに対
するモノクローナル抗体を増大させ、この抗体をアガロ
ースカラムに結合させ、このカラムに複合物の水溶液を
通し、得られた溶液のファクターＶIII:Ｃ活性を分析す
ることにより確認することができる。

【００２９】本発明は、Ｍ_ｒ＝９２,０００およびＭ_ｒ
＝７９,０００−８０,０００のポリペプチドは、タンパ
ク分解および破壊され易く、結果的に凝血剤活性を喪失
し易いことで有名な、天然のヒトのファクターＶIII:Ｃ
に比べて安定である、という点においても望ましい寄与
を果すものである。この安定性はこの明細書で述べる処
理段階を経てもポリペプチドの活性が残存している、と
いうことで証明される。

【実施例】

【００３０】実施例１ この実施例は、ファクターＶIII:Ｃの市販濃縮物からの
精製並びに精製α−トロンビンによる消化の方法に関す
るものである。ファクターＶIII:Ｃに対するモノクロー
ナル抗体を製造し、ＶIII:Ｃポリペプチドの同定に用い
た。消化過程において数回、消化混合物の一部分に関し
てＶIII:Ｃ(凝血)活性、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥに基く
タンパクのバンドを分析した。

【００３１】ＶIII:Ｃの精製 全工程は室温で行なった。化学薬品は全て試薬用であっ
た。市販のファクターＶIII濃縮物(Ａrmour Ｐharmaceu
tical提供)をＶIII:Ｃ緩衝液(０.０２Ｍイミダゾール／
０.１５Ｍ塩化ナトリウム／０.１ＭＬ−リジンＨＣl／
０.０２％ナトリウムアジド、pＨ６.８)中に入れて復元
した。合計１７,０００単位のＶIII:Ｃ活性を有するこ
の試料を床容量２.５−３.０ l の免疫吸着剤カラムに
入れた。カラムは臭化シアン−活性化アガロース(セフ
ァロース４Ｂ、Ｐharmacia、Ｐiscataway、Ｎew Ｊerse
y)であり、これにＶIII:Ｒに対するモノクローナル抗体
が共有結合で結合している。前述のアメリカ特許第４,
３６１,５０９号に記載されている方法に従って抗体を
調製し、カラムに吸着させた。抗体は、５０％硫酸アン
モニウムで腹水から沈澱させ、さらに２回再沈澱させた
後、セファロースに対して密度２〜４mg／mlでカラムに
吸着させた。免疫吸着剤を、３Ｍチオシアン酸ナトリウ
ムによって予め溶離処理し、ＶIII:Ｃ緩衝液(０.０２Ｍ
イミダゾールＨＣl pＨ７.０、０.１５Ｍ ＮaＣl、０.
１ＭＬ−リジン−ＨＣl、０.０２％ナトリウムアジド)
で洗浄し、２mＭジ−イソプロピルフルオロホスフェー
トで２回処理した後、濃縮物を加えた。

【００３２】カラムを０.１５Ｍ塩化ナトリウム含有ＶI
II:Ｃ緩衝液２０ lで洗浄し、０.３５Ｍ塩化カルシウム
を含有するＶIII:Ｃ緩衝液でＶIII:ＲからＶIII:Ｃを溶
離した。活性な画分を集め、ＹＭ−１０膜を備えたＡmi
con攪拌室内で、窒素圧下１００倍に濃縮した。次い
で、この濃縮物をＶIII:Ｃ緩衝液で１:１０に希釈し、
０.０２５Ｍ塩化カルシウム含有ＶIII:Ｃ緩衝液で平衡
させたアミノヘキシル−セファロースの４mlカラムに適
用し、０.３Ｍ塩化カルシウム含有ＶIII:Ｃ緩衝液で流
速１０ml／時で溶離すると、ＶIII:Ｃが高濃度で得られ
る。濃縮された免疫吸着剤プールを０.２５Ｍ塩化カル
シウムに調節し、モノクローナル抗−フィブリノーゲ
ン、抗−フィブロネクチンおよび抗−ＶＷＦ抗体(これ
らは臭化シアン活性化セファロースに結合されている)
の混合物に対し１／１０(Ｖ／Ｖ)の割合で、１時間づ
つ、２回吸着させた。

【００３３】ＶIII:Ｃに対するモノクローナル抗体の製
造 モノクローナル抗体類は、アメリカ特許第４,３６１,５
０９号に記載されている如くにして、精製ＶIII:Ｃを抗
原として製造した。抗体類をＬinbro−Ｔitertek(Ｆlow
Ｌaboratories、Ｉnglewood、ＣＡ)プレート類、およ
び、Ｅngvall,Ｅ.およびＰerlmann,Ｐ.著「酵素結合免疫
吸着剤分析(ＥＬＩＳＡ)、免疫グロブリンＧの定量分
析」Ｉmmunochemistry８:８７１−８７４(１９７１)、に
記載の検出系内において、共役ペルオキシダーゼ抗体
(Ｚymed Ｌaboratories Ｂurlingme、ＣＡ)を使用し、
固相分析法によって選別した。プレート類を、くぼみご
とに精製ＶIII:Ｃ１００ngで被覆した。この研究に用い
るために選別したクローンのＥＬＩＳＡ−陽性培養上澄
み液もまた血漿ＶIII:Ｃ活性を阻害した。

【００３４】精製ＶIII:Ｃのトロンビン活性化経時分析 精製ヒトα−トロンビン(比活性２５３４Ｕ／mg、最終
濃度０.５Ｕ／ml)を、０.０４ＭＣ₂ＣＬ₂含有イミダゾ
ール生理食塩水緩衝液中に入れた精製ＶIII:Ｃ(最終濃
度１６７μg／ml)に加えた。対照部分には緩衝液のみを
加えた。溶液を室温でインキュベートし、種々の時間間
隔をあけて、ＶIII:Ｃ−トロンビン混合物試料を、トロ
ンビンを迅速かつ非可逆的に不活性化するためにp−Ａ
ＰＭＳＦ(Ｃalifornia Ｍedical Ｃhemistry Ｃo.)の入
った試験官に採取した。p−ＡＰＭＳＦの加水分解を最
少限度に止めるため、ストック溶液(１００mＭ／メタノ
ール溶液)を、イミダゾール生理食塩水緩衝液によりＶI
II:Ｃ−トロンビン試料との反応の６０秒前に、１／１
０の比率で希釈した。最終的なp−ＡＰＭＳＦ濃度は１m
Ｍであった。対照部分も、実験の初めにp−ＡＰＭＳＦ
で同様に処理した。６０分間の時間的経過を終えた時点
で全てのＶIII:Ｃ試料を文献記載の如く、活性化部分的
トロンボプラスチン時間分析法でＶIII:Ｃ活性に関して
分析し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥの調製に備えた。

【００３５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ「方法Ａ」 不連続なＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動
法は、Ｌaemmli,Ｕ.Ｋ.Ｎature２２７,６８０−６８５,
１９７０の方法に基いて行なった。「方法Ａ」を次に示
す:

【００３６】Ｉ．試料の調製 (１)タンパク試料(理想的にはタンパク５−６０μgを含
有するもの５０−１００μl)を試料緩衝液に対して一
夜、室温で透析する。試料がカルシウムイオンを含有す
る場合には、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)１０m
Ｍを試料緩衝液中に含有させる。 (２)透析した試料を試験管に入れ、１／１０容量の１０
％ＳＤＳを加える。試験管をアルミニウム箔で被う。試
料を沸騰中の水浴中で１０分間加熱する。 (３)試料を水浴から出し、５００mＭジチオトレイット
を１／１０容量、加える。これを５６℃で４時間、イン
キュベートする。 (４)試料を室温まで放冷し、グリセリンストック溶液お
よびブロムフェノールブルーストック染料溶液を最終濃
度がそれぞれ１０％および０.０５％になる様に加え、
ゲル上に重層するため調製する。

【００３７】ＩＩ．ゲル溶液の調製(脱イオン化した蒸
留水使用) (１)グリセリンストック溶液:５０％グリセリン (２)ブロムフェノールブルーストック染料溶液:０.５％
ブロムフェノールブルー (３)下層ゲルストック溶液:トリス塩基１８.２g、１０
％ＳＤＳ４ml、最終容量を１００mlにする。濃塩酸でp
Ｈ８.８に調節し、濾過する。 (４)上層ゲルストック溶液:トリス塩基６.１g、１０％
ＳＤＳ４ml、最終容量を１００mlにする。濃塩酸でpＨ
を６.８に調節し、濾過する。 (５)試料緩衝液:０.０１Ｍりん酸ナトリウム、１.０％
ＳＤＳ、１０mＭ二ナトリウムＥＤＴＡ、最終容量を１
lにする。水酸化ナトリウムまたはりん酸を加えてpＨを
７.０に調節する。

【００３８】(６)アクリルアミドストック溶液:アクリ
ルアミド３０gを水５０mlに溶かし、ビスアクリルアミ
ド０.８mgを加えて溶解させる。最終容量を１００mlに
調製する。この溶液を濾過し、４℃で暗所に貯蔵する。 (７)ストック用電極緩衝液:トリス塩基３０.３g、グリ
シン１４４.１g、最終容量を１ lにする。 (８)電極緩衝液:ストック用電極緩衝液１００ml、水８
９０ml、１０％ＳＤＳ１０ml。 (９)ストック用クマシーブルー染料溶液:１％クマシー
ブルーＲ２５０を水中に入れたものを少なくとも約３０
分間室温で攪拌して溶解させ、濾過する。 (１０)アンモニウムパーサルフェート溶液:１０％アン
モニウムパーサルフェート、暗所に保管する。毎週新ら
たに調製する。

【００３９】ＩＩＩ．ゲルの調製並びに操作:アクリル
アミドの最縮濃度＝７.５％ (１)下層ゲル溶液 下層ゲル、２０ml 下層ゲルストック溶液 ５.０ml アクリルアミドストック溶液 ５.０ml 水 １０.０ml Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレンジアミン(ＴＥＭＥＤ) ０.００５ml １０％アンモニウムパーサルフェート ０.１ml 上層ゲル溶液 上層ゲル１０ml 上層ゲルストック溶液 ２.５ml アクリルアミドストック溶液 １.０ml 水 ６.５ml N,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレンジアミン(ＴＥＭＥＤ) ０.０１ml １０％アンモニウムパーサルフェート ０.０３ml

【００４０】(２)方 法: a)１４.５cm×９.０cm×０.８mmスラブゲルのためのス
ラブゲル装置を調製する。この装置は標準的な電気泳動
装置であって、例えば、Ｈoeffer ＳcientificＩnstrum
ents,Ｓan Ｆrancisco,Ｃaliforniaから入手可能であ
る。 b)ＴＥＭＥＤおよびアンモニウムパーサルフェート以外
の下層ゲル成分を５０mlの耐圧フラスコに入れ、脱気す
る。次いでＴＥＭＥＤおよびアンモニウムパーサルフェ
ートを加えて静かに混合し、即座に下層ゲルを加える。
下層ゲルに水−飽和ブタノールを重層し少なくとも１時
間、好ましくは２〜６時間、そのままにして重合させ
る。 c)ブタノール層を流し去り、下層ゲルの上面を完全な上
層ゲル混合物で洗浄する。(上層ゲル混合物は、上記の
下層ゲルと同様に、脱気し、ＴＥＭＥＤおよびアンモニ
ウムパーサルフェートを加えて調製する。)

【００４１】d)上層ゲルを注ぎ入れ、くしを上層ゲル内
に、そのくしの歯の底部と上層ゲル−下層ゲル界面との
間隔が少くとも１.０cmとなる深さまで入れる。上層ゲ
ル溶液で可能な限り一杯に満す。このゲルに通す前、少
なくとも１時間上層ゲルを重合させる。 e)くしを取除くには、電極緩衝液を上層ゲルの上面にピ
ペット注入した後、くしを静かに取去る。上層ゲル上面
のくぼみを電極緩衝液を用いて数回洗浄する。 f)作業のために装置を組立て、電極緩衝液を加える。試
料(類)を緩衝液層の下方の上層ゲルのくぼみに重層して
適用する。 g)このゲルを定電流で作動させる:試料が上層ゲルにあ
る間は８ミリアンペア、試料が下層ゲルにある間は１５
ミリアンペアである。ブロムフェノールブルー染料の先
端が下層ゲルの底面から１.０cmになった時点で電気泳
動を止める。

【００４２】ＩＶ．ゲルの固定および染色 参考文献:Ｆairbanks,Ｇ.,Ｓteck,Ｔ.Ｌ.,およびＷalla
ch,Ｄ.Ｆ.Ｎ.Ｂiochemistry１０,２６０６〜２６１７,
１９７１。 (１)ゲルを少なくとも１夜、密閉容器内で、２５％イソ
プロパノール、１０％酢酸、１％クームシーブルースト
ック溶液１０mlを含有する最終容量を４００mlに調節し
た溶液中で固定化する。 (２)次いで、ゲルを少なくとも１時間、１０％イソプロ
パノール、１０％酢酸および１％クームシーブルースト
ック溶液１.０mlを含有する最終容量を４００mlに調節
した液中に浸す。 (３)このゲルを変化が現われるか、あるいは完全に脱染
色されるまで約４時間、１０％酢酸中に浸漬する。

【００４３】(４)この脱染色ゲルを、対照を明確にする
ためにゲル乾燥機を用いて濾紙上で乾燥させることがで
きる。このゲルに５−２０gのタンパクを適用した。Ｖ
ＩＩＩ:ＣのＭ_ｒ値は還元フィブリノーゲン(Ｍ_ｒ２０
０,０００)、ホスホリラーゼb(Ｍ_ｒ９５,０００)、ウシ
血清アルブミン(Ｍ_ｒ６８,０００)、ＩgＧのＨ鎖(Ｍ_ｒ
５０,０００)およびオバルミン(Ｍ_ｒ４３,０００)を標
準とし、移動距離に対してＭ_ｒ値を片対数表にプロット
することにより、還元試料に関して算出した。

【００４４】最終的なゲルの写真プリントによる走査並
びに積分は、Ｚeineh軟レーザースキャニング濃度計を
用いて行なった。

【００４５】結果 純化ファクターＶＩＩＩ:Ｃの比活
性は２０００単位／mgであった。トロンビンによる純化
ＶＩＩＩ:Ｃ活性に対する賦活作用を６０分間のタイム
・コースで分析した。トロンビンを作用させる前の非処
理ＶＩＩＩ:Ｃ試料は、Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,００
０におけるダブレット、ないしＭ_ｒ＝１８８,０００に
おけるバンドに至る特徴的なＶＩＩＩ:Ｃ型配列を示し
ていた。Ｍ_ｒ＝１８８，０００以上の１個のバンド、並
びにＭ_ｒ＝７９，０００以下の２個のバンドはモノクロ
ーナル抗−ＶＩＩＩ:Ｃ抗体免疫吸着剤と結合しなかっ
た。また、Ｍ_ｒ＝７９,０００およびＭ_ｒ＝１８８,００
０の間のバンドは抗−ＶＩＩＩ:Ｃ抗体と結合しなかっ
た。

【００４６】トロンビンによる賦活化タイム・コースの
最初の５分間で、Ｍ_ｒが９２,０００以上であるモノク
ローナル抗−ＶＩＩＩ:Ｃ抗体反応性バンドは、１個を
除き全てが徐々に消失し、５分後にＶＩＩＩ:Ｃ活性が
最高に達した時点で検出されなくなった。

【００４７】Ｍ_ｒ＝１２２,０００におけるバンドはい
くつかの実験においてのみトロンビン抵抗性を示した
が、過剰なトロンビン処理の後には、このバンドも、他
のいかなるバンドも固定化モノクローナル抗−ＶＩＩ
Ｉ:Ｃ抗体とは反応しなかった。

【００４８】Ｍ_ｒ＝９２,０００におけるバンドは、Ｖ
ＩＩＩ:Ｃ活性が増すにつれて強くなった。Ｍ_ｒ＝７９,
０００および８０,０００におけるダブレットは、Ｍ_ｒ
＝７１,０００−７２,０００ダブレットに変換されると
思われ、ＶＩＩＩ:Ｃ活性の減少する５〜６０分の間で
は、後者の形態が優勢であった。Ｍ_ｒ＝５４,０００お
よびＭ_ｒ＝４４,０００の２個のバンドは５〜６０分の
間に明確に認め得る様になった。いくつかの実験では、
Ｍ_ｒ＝４４,０００バンドもまたダブレットのように見
えた。Ｍ_ｒ＝７１,０００−７２,０００ダブレット、Ｍ
_ｒ＝５４,０００バンド並びにＭ_ｒ＝４４,０００バンド
は固定化モノクローナル抗−ＶＩＩＩ:Ｃ抗体によって
は、有意な程度に除去されなかった。

【００４９】上で議論したゲルの走査および積分の結果
から、ポリペプチド濃度とＶＩＩＩ:Ｃ活性における変
化との関連性が考慮される。結果は表に示されている。
表からわかる様に、Ｍ_ｒ＝９２,０００バンドはその濃
度が増加した後、ＶＩＩＩ:Ｃ活性と並行して減少し
た。このことは、Ｍ_ｒ＝９２,０００バンドがトロンビ
ンの賦活化作用でその濃度が増大された活性型ＶＩＩ
Ｉ:Ｃに相当することを示唆している。Ｍ_ｒ＝５４,００
０およびＭ_ｒ＝４４,０００バンドの濃度は、いずれ
も、１〜４０分の間、混合物の活性が減少した後でさえ
も定常的に増加した。

【００５０】Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,０００ダブレッ
トの大部分は、ＶＩＩＩ:Ｃ活性がピークに達する最初
の０.１〜１０分間の間に失なわれ、他方、Ｍ_ｒ＝７１,
０００−７２,０００ダブレットの大部分はこの期間に
現われ、ＶＩＩＩ:Ｃ活性が減少した際にも優勢であっ
た。これらのデーターは、Ｍ_ｒ＝７１,０００−７２,０
００ダブレットがＭ_ｒ＝７９,０００−８０,０００ダブ
レットから導かれものであること、並びにＭ_ｒ＝７１,
０００−７２,０００ダブレット自身は不活性であるこ
とを示唆するものである。また、この様なデーターは、
Ｍ_ｒ＝７１,０００−７２,０００ダブレットのＭ_ｒ＝９
２,０００ポリペプチドと複合体を形成する能力が保持
されている、ということと矛盾しないものである:この
複合体もまた活性を有するであろう。

【００５１】Ｍ_ｒ＝９２,０００ポリペプチドがＭ_ｒ＝
７９,０００−８０,０００ダブレットと複合体を形成し
ていることの直接的な証拠は、抗−ＶＩＩＩ:Ｃモノク
ローナル免疫吸着剤を用いた実験から導かれる。モノク
ローナル抗体はＭ_ｒ＝９２,０００ポリペプチドでな
く、Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,０００ダブレットと優先
的に反応するということが初めて示された。即ち、この
ことは電気泳動転移実験において明らかにされた。次い
で、モノクローナル抗−免疫吸着剤は、Ｍ_ｒ＝７９,０
００−８０,０００ダブレットおよびＭ_ｒ＝９２,０００
ポリペプチドを共に溶液中から除去することが示され
た。Ｍ_ｒ＝９２,０００ポリペプチドは、Ｍ_ｒ＝７９,０
００−８０,０００ダブレットを結合させたままで、１
０mＭ ＥＤＴＡにより抗−ＶＩＩＩ:Ｃ免疫吸着剤カラ
ムから溶離することができた。このダブレットは、続い
て３Ｍチオシアン酸ナトリウムにより溶離された。以上
の実験の結果は、Ｍ_ｒ＝９２,０００ポリペプチドはＭ
_ｒ＝７９,０００−８０,０００ダブレットと複合体を形
成していたために免疫吸着剤と結合したのであり、免疫
吸着剤と直接に結合していたのは、該ダブレットであっ
た、ということを証明している。

【表１】

【００５２】実施例ＩＩ この実施例では、純化したヒトのファクターＶＩＩＩ:
Ｃを、既知の抗凝固酵素である純化したヒトの活性化蛋
白質Ｃ(以下、「ＡＰＣ」という)で処理した結果について
記述する。ヒトのファクターＶＩＩＩ:Ｃを既述した様
にして純化した。ＡＰＣは、トロンビンからＡＰＣを分
離するのにファルマシア(Ｐharmacia)のＦＰＬＣ系のモ
ノＳカラムを使用した以外はＭarlar,Ｒ.Ａ.らの方法
(Ｂlood、５９巻、１０６７(１９８２)、「トロンビン依
存性抗凝固酵素、ヒトの活性化蛋白質Ｃの作用機構」)に
従って純化した。

【００５３】アッセイ 血友病Ａ血漿基質を用いた活性化部分的トロンボプラス
チン・タイムアッセイを使用して、前記の方法で試料の
ＶＩＩＩ:Ｃ活性を分析した。

【００５４】電気泳動のための試料の調製 ＡＰＣ活性にはカルシウムイオンが必要であるので、１
０μＭのＤＡＰＡを含有している１００mＭ ＥＤＴＡ
の１／１０容量を、ＶＩＩＩ:Ｃ＋ＡＰＣ部分、対照Ｖ
ＩＩＩ:ＣおよびＡＰＣ部分に加えることにより、種々
の時間にＡＰＣを停止させた。これらの部分標本に１／
１０容量の１０％ドデシル硫酸ナトリウムを添加した。
次いで沸騰水浴中でそれらを５分間加熱し、次いで前記
した様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで透析した。

【００５５】還元したＶＩＩＩ:Ｃの非連続ドデシル硫
酸ナトリウム７.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(ＰＡＧＥ)、ＣoomassieブルーＲ２５０による染色、ゲ
ルの走査および積分は既述した様に行なった。

【００５６】試料調製 ０.３Ｍ塩化カルシウムを含有しているＶＩＩＩ:Ｃ緩衝
液０.３ml中のＶＩＩＩ:Ｃの試料３３９μgを緩衝液(５
０mＭトリス−クロリド、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、５
mＭ塩化カルシウム、０.０２％ナトリウムアジド、pＨ
７.４)に対して一夜透析した。この透析したＶＩＩＩ:
Ｃ試料に、緩衝液１.０９５ml、ウサギ脳ケファリン９
０μl(Ｓigma Ｃhemical Ｃo.,Ｓt.Ｌouis,ＭＤ,製造業
者の指示通り復元し、貯蔵し、融解した)、および１mＭ
ダンシルアルギニンＮ−(３−エチル−１,５−ペンタン
ジイル)アミド(ＤＡＰＡ)１５μlを加え、最終ＤＡＰＡ
濃度を１０μＭとした。１０μＭのＤＡＰＡはＡＰＣを
有意に阻害しないので、このＤＡＰＡはＡＰＣに存在す
る痕跡量のトロンビンを阻害するために含ませた。試料
の最終容量は１.５ml、最終ＶＩＩＩ:Ｃ濃度は２２６μ
g／mlであった。この１.５mlのＶＩＩＩ:Ｃ試料から４
００μlを取り、対照とした(ＶＩＩＩ:Ｃと呼ぶ)。残り
の１.１mlにＡＰＣ２０μl(１０μg)を加え、最終ＡＰ
Ｃ濃度を９μg／mlとした(ＶＩＩＩ:Ｃ＋ＡＰＣと呼
ぶ)。ＶＩＩＩ:Ｃを除いて全ての成分を同じ濃度で含有
している第２の対照試料を調製した(ＡＰＣと呼ぶ)。

【００５７】タイム・ポイント ＶＩＩＩ:Ｃ単独、ＶＩＩＩ:ＣおよびＡＰＣの混合物、
ＡＰＣ単独を３７℃の水浴に入れ、一定のタイム・ポイ
ントで試料の一部を取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／ま
たはＶＩＩＩ:Ｃ活性を分析した。また、長時間３７℃
でインキュベートした後、合成基質Ｓ−２２３８の加水
分解で活性を保持したＡＰＣを、対照において測定し
た。

【００５８】結果 純化ＶＩＩＩ:ＣをＡＰＣを消化すると、対照のＶＩＩ
Ｉ:Ｃ活性のほぼ８５％が失なわれた。ＶＩＩＩ:Ｃ活性
のＡＰＣ非活性化により、Ｍ_ｒが９２,０００〜１８８,
０００の全てのＶＩＩＩ:Ｃポリペプチドが減退し、Ｍ
_ｒ＝４５,０００のポリペプチドが生成し、一方Ｍ_ｒ＝
７９−８０,０００のダブレットはそのまま残った。

【００５９】ＡＰＣによる、純化ＶＩＩＩ:Ｃの一定時
間経過の非活性化により、３６０分間に渡ってＶＩＩ
Ｉ:Ｃ活性が減少するに従って、特異なＶＩＩＩ:Ｃポリ
ペプチドが次第に減少することがわかった。ゲルを走査
および積分することにより、Ｍ_ｒ＝１８８,０００のポ
リペプチドおよびＭ_ｒ＝９２,０００のポリペプチドが
ＶＩＩＩ:Ｃ活性と平行して減少していくことがわかっ
た。

【００６０】中間的なＭ_ｒのもう１つのポリペプチドは
ＡＰＣにより開裂されたが、ゲル走査により容易に定量
されなかった。この実験では、ＡＰＣによる消化らしく
なく、Ｍ_ｒ＝９２,０００〜１８８,０００のある種のＶ
ＩＩＩ:ＣポリペプチドはＡＰＣ消化に抵抗した。しか
し、Ｍ_ｒ＝７９−８０,０００のダブレットポリペプチ
ドは、ＡＰＣによる消化の場合の様に、ＡＰＣにより蛋
白質分解を受けなかった。

【００６１】Ｍ_ｒ＝４５,０００ポリペプチドは、Ｍ_ｒ
＝１８８,０００および９２,０００のポリペプチドの減
少につれてその濃度が増加する様であり、これは前者の
ポリペプチドが後者のポリペプチドの分解フラグメント
であることを暗示している。Ｃoomassieブルーの染色で
は、その他の消化生成物は観察されなかった。

【００６２】実施例Ｉに示した様に、ＶＩＩＩ:Ｃのト
ロンビン活性化の間、Ｍ_ｒ＝９２,０００ポリペプチド
は、ＶＩＩＩ:Ｃ活性と平行して増減した。Ｍ_ｒ＝９２,
０００のポリペプチドの蛋白分解とＶＩＩＩ:Ｃの消失
との間に直線関係が存在するかどうかを調べるために、
この時間経過による非活性化実験のデータを再プロット
し、ＶＩＩＩ:Ｃ活性％対Ｍ_ｒ＝９２,０００のポリペプ
チド％を調べた。ＶＩＩＩ:Ｃ活性の量は、Ｍ_ｒ＝９２,
０００のポリペプチドの量に比例している様であった。

【００６３】本発明のもう１つの目的は、ファクターＶ
ＩＩＩ:Ｃと、α−トロンビンの様なプロテアーゼとの
反応によって形成される各種のポリペプチドに対して、
予想し得ないことであるが、特異なモノクローナル抗体
を提供することにある。それぞれの抗体は、トロンビン
または等価なプロテアーゼで活性化も消化もされていな
いヒトのファクターＶＩＩＩ:Ｃと反応する。これらの
抗体は、以下に述べる様な個々の性質によって特徴づけ
られる。

【００６４】(Ａ)１つは、ここに記載したＭ_ｒ＝９２,
０００のポリペプチド、Ｍ_ｒ＝１０８,０００およびそ
れ以上のポリペプチド、および終末−トロンビン消化物
中に存在するＭ_ｒ＝４４,０００のポリペプチドと反応
する。それは、ここに記載したＭ_ｒ＝７９,０００−８
０,０００のダブレットを示すポリペプチドとも、ここ
に記載Ｍ_ｒ＝７１,０００−７２,０００のダブレットを
示すポリペプチドとも反応しない。

【００６５】(Ｂ)１つは、ここに記載したＭ_ｒ＝９２,
０００のポリペプチド、Ｍ_ｒ＝１０８,０００およびそ
れ以上のポリペプチド、および終末トロンビン消化物中
に存在するＭ_ｒ＝５４,０００のポリペプチドと反応す
る。それは、ここに記載したＭ_ｒ＝７９,０００−８０,
０００のダブレットを示すポリペプチドとも、ここに記
載したＭ_ｒ＝７１,０００−７２,０００のダブレットを
示すポリペプチドとも反応しない。

【００６６】(Ｃ)１つは、Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,０
００のダブレットおよびＭ_ｒ＝１０８,０００およびそ
れ以上のポリペプチドと反応するが、Ｍ_ｒ＝９２,００
０のポリペプチド、Ｍ_ｒ＝７１,０００−７２,０００、
Ｍ_ｒ＝５４,０００、Ｍ_ｒ＝４４,０００のポリペプチド
とは反応しない。

【００６７】(Ｄ)１つは、Ｍ_ｒ＝１０８,０００および
それ以上のポリペプチドとのみ反応する。

【００６８】これらの抗体はそれぞれ、他のポリペプチ
ドをも含んでいる混合物から、前記の複合体を濃縮する
ために使用することができる。この様な混合物の１つ
は、ヒトのファクターＶＩＩＩ:Ｃのα−トロンビンま
たは等価なプロテアーゼで部分的に消化することにより
製造される。もう１つのこの様な混合物は、組み換えＤ
ＮＡ技術によって製造されるものであり、この場合、所
望のポリペプチドまたは複合体は微生物によって発現さ
れ、混合物から他の蛋白質様化合物で回収されなければ
ならない。抗体(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)または(Ｄ)、あるいは
これらの２つ、３つまたは全てを組み合せたものを実施
例１に記載した様にして免疫吸着剤に付着させることが
でき、複合物を含んでいるポリペプチドを含有している
混合物の充填液をカラムに通す。充填溶液中に存在する
Ｍ_ｒが９２,０００、７９,０００−８０,０００および
７１,０００−７２,０００であるポリペプチドがカラム
に吸着され、このカラムから、もとの溶液をカラムから
洗い流した後、前記した様にしてこれらのポリペプチド
を溶出させることができる。得られた溶出液は、所望の
活性化ＶＩＩＩ:Ｃ複合物について、充填液とくらべて
濃縮されている。

【００６９】この新規な抗体は、ヒトのＶＩＩＩ:Ｃと
トロンビンまたは他のプロテアーゼとの反応があったか
どうかを検出するための、分析の目的にも有用である。
というのは、これらの抗体は、その反応の生成物と反応
する能力があるからである。挙動(Ｂ)を持った抗体およ
び挙動(Ｃ)を持った抗体は、いづれかがファクターＶＩ
ＩＩ:Ｃと結合すると、ＶＩＩＩ:Ｃ凝固活性を中和する
ことがわかった。この性質は、血友病関連障害の診断に
有用である。

【００７０】これらの抗体の発見により、ここに記載し
たポリペプチド複合物の成分を更に特性化することがで
きる。即ち、Ｍ_ｒ＝９２,０００のバンドを示すがポリ
ペプチドは、トロンビン消化によって破壊されず、Ｍ_ｒ
＝７９,０００−８０,０００のダブレットを示すあるい
はＭ_ｒ＝７１,０００−７２,０００のダブレットを示す
ポリペプチドには存在しない(少なくとも)２つのエピト
ープ(即ち抗体結合部位)を含んでいる。これらのエピト
ープの内の１つはＭ_ｒ＝４４,０００のポリペプチドの
上にも存在し、他方はＭ_ｒ＝５４,０００のポリペプチ
ドに存在する。即ち、Ｍ_ｒ＝５４,０００およびＭ_ｒ＝
４４,０００のポリペプチドはＭ_ｒ＝９２,０００のポリ
ペプチドから誘導される。また、Ｍ_ｒ＝９２,０００お
よびＭ_ｒ＝７９,０００−８０,０００のポリペプチド
は、共通の前駆体(群)から誘導される。ファクターＶＩ
ＩＩ:Ｃ凝固活性を中和する挙動(Ｂ)および(Ｃ)を示す
抗体の発見は、Ｍ_ｒ＝９２,０００およびＭ_ｒ＝７９,０
００−８０,０００のポリペプチドが凝固機能に重要で
あることを支持している。Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,０
００のダブレットを示すポリペプチドは、トロンビン消
化によって破壊される。そしてＭ_ｒ＝９２,０００のポ
リペプチドには存在しないエピトープを含んでいる。

【００７１】これらのモノクローナル抗体は、ヒトのフ
ァクターＶＩＩＩ:Ｃの一般的な精製工程によって製造
することができる:即ち、純化ＶＩＩＩ:Ｃに対するモノ
クローナル抗体を生成させ、純化ＶＩＩＩ:Ｃを部分的
に消化、活性化して前記のポリペプチド複合物を生成せ
しめ、特異なポリペプチドを同定し、抗−ＶＩＩＩ:Ｃ
抗体を活性化生成物と反応させ、それが反応したポリペ
プチド(群)を同定することによりその抗体を特性化す
る。この一連の操作は実施例ＩＩＩで詳細に述べる。あ
るいはまた、部分的トロンビン消化生成物から、所望の
特定のポリペプチドを分離することにより抗体を製造す
ることもできる。例えば、所望のポリペプチドと反応す
ることが知られているモノクローナル抗体をカップリン
グさせたアガロースを入れたカラムに免疫吸着させ、次
いで溶出し、実施例ＩＩＩに記載の方法でそのペプチド
に対するモノクローナル抗体を高める。

【００７２】実施例ＩＩＩ ヒトのファクターＶＩＩＩ:Ｃに対するモノクローナル
抗体は、米国特許第４,３６１,５０９号に記載の方法に
よって製造された高純化ＶＩＩＩ:Ｃを用いて、以下の
手法によって生成させた。

【００７３】以下の方法に従って、高純化ファクターＶ
ＩＩＩ:Ｃをマウスに注射した。初日に、０.０５Ｍトリ
ス、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.０２％アジ化ナトリ
ウム、１mＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、
トラシロール１０単位／mlを含んでいるpＨ７.３の緩衝
液０.１mlにこの蛋白質１０μgを溶解(または懸濁)し、
同容量のフロインドの完全アジュバンドを加えて振盪す
ることにより調製した組成物をマウスに腹腔内注射し
た。１４日目に、フロインドの完全アジュバンドの代り
にフロインドの不完全アジュバンドを用いるほかは上に
記載したものと同じものを再びマウスに注射した。２１
日目には、１４日目の注射をもう１度行なった。３８日
目に、純化ＶＩＩＩ:Ｃだけを注射した。４２日目に、
マウスの脾臓を摘出し、Ｊ.Ｐ.Ｂrownらの標準的手法
(Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry、２２５巻、pp
４９８０−４９８３(１９８０)、「モノクローナル抗体
による免疫沈澱によって同定される正常および悪性のヒ
ト細胞の蛋白質抗原」)に従って融合した。この標準的手
法に於いて、５０％ポリエチレングリコールの代りに３
５％ポリエチレングリコール１０００を用いたことが唯
一の変更点であった。

【００７４】実施例Ｉの「ＶＩＩＩ:Ｃに対するモノクロ
ーナル抗体の製造」の項に記載した分析法を使って抗体
を選択した。ただし、ＶＩＩＩ:Ｃ活性を中和しなかっ
た抗体もサブクローンし、以下の如く処理した。

【００７５】陽性であったクローンを２回サブクローン
し、ＶＩＩＩ:Ｃに対する抗体を産生する安定なクロー
ンを、細胞の注射を行なう少なくとも４日前にプリスタ
ン０.５mlを腹腔内に入れて予め処置したＢalb／Ｃマウ
スの腹膜腔に注射した。ハイブリドーマ細胞を、牛胎児
血清を含まないＤelbeccoの改良イーグル培地０.５ml
中、マウス当たり約５×１０⁶細胞の濃度で注射した。
むくんできたらマウスを穿刺し、腹水を約１０単位／ml
でヘパリン中に集めた。複数のマウスからの腹水を合わ
せ、モノクローナルＩgＧの単離に都合の良い量とし
た。５０％硫酸アンモニウムを使って腹水から抗体を沈
澱させ、さらに２回再沈澱させた。この様にして生成せ
しめた前記の(Ｂ)、(Ｃ)および(Ｄ)に相当する抗−ＶＩ
ＩＩ:Ｃ抗体はアガロースビーズに結合され、溶液から
の純化ＶＩＩＩ:Ｃと結合することが示された。

【００７６】ＶＩＩＩ:Ｃの別のバッチ、１つは非処
理、１つはトロンビン蛋白分解にかけたものを実施例Ｉ
に記載したＤＳＤ−ＰＡＧＥ工程で分析した。次いで各
バンドを電気泳動法的に(ウエスタン転移)、ゲルからニ
トロセルロース片に転移させた。使用した装置はＢio−
Ｒad「Ｔrans−Ｂlot」cellおよびＢio−Ｒadモデル１６
０.１.６動力供給(Ｂio−Ｒad Ｌaboratories,Ｒichmon
d,Ｃalifornia)であった。転移緩衝液は、pＨ８.３、２
０％メタノールに加えたグリシンを含む２５mＭトリス
であった。転移は９０ボルト、１０ミリアンペアで１６
−２４時間行なった。

【００７７】抗体のそれぞれと反応させた特定のポリペ
プチドは、Ｗ.Ｍ.Ｂurnetteの採用した方法、「ウエスタ
ン・ブロッティング」(Ａnalytical Ｂiochemistry、１
１２巻、１９５−２０３頁(１９８１)、「ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲルから非改良ニトロセ
ルロースへの電気泳動法による蛋白質の転移および抗体
並びに放射性沃素化蛋白質Ａを用いたＸ線撮影」)を用い
て決定した。

【００７８】「緩衝液Ｄ」は１０mＭトリス・クロライ
ド、０.１５Ｍ ＮaＣl、０.０２％アジ化ナトリウム、p
Ｈ７.４であった。

【００７９】１．緩衝液Ｄ１００mlと０.２５％ゼラチ
ンを含んでいる皿に、転移した蛋白質を持ったニトロセ
ルロース片を入れる。この皿を回転振盪器の上に置き、
ゆっくりと３０分間振盪させる。 ２．この皿にモノクローナル抗体を添加する(０.１〜１
％の腹水または純化ＩgＧ１mg)。１２０分間振盪する。

【００８０】３．ニトロセルロース片を次の様にして洗
浄する (a)緩衝液Ｄ１００mlで１０分間。 (b)緩衝液Ｄ１００mlおよび０.０５％のＮonidet−Ｐ−
４０で３０分間、１０および２０分でかえる。 (c)緩衝液Ｄ１００mlで１０分。 ４．緩衝液Ｄ＋０.２５％ゼラチンおよびＩ¹²⁵標識純化
ウサギ抗−マウスＩgＧ中にニトロセルロース片を３０
分間浸す。

【００８１】５．ニトロセルロース片を次の様にして洗
浄する (a)緩衝液Ｄ１００mlで１０分間。 (b)緩衝液Ｄ＋０.１％ＮonidetＰ−４０および０.５Ｍ
ＮaＣl １００mlで１６−２４時間。 (c)緩衝液Ｄ１００mlで１０分間。

【００８２】６．ニトロセルロース片を２枚の濾紙には
さんで吸い取り、このニトロセルロース片を密封プラス
チック袋に入れて保存する。

【００８３】７．どの抗体とポリペプチド類が反応した
かを調べるために、 (a)文献に記載されている既知の標準的手法により、ニ
トロセルロース片のオートラジオグラフを調製する。 (b)このオートラジオグラフを、ＶＩＩＩ:Ｃを転移させ
たがモノクローナル抗体と反応させる代りに、Ｃoomass
ieブルーＲ２５０で染色したニトロセルロース片と比較
する。

【００８４】これらの手順により、以下の個々の抗体が
生成したことがわかった。Ｍ_ｒ＝９２,０００まポリペ
プチド、Ｍ_ｒ＝１０８,０００およびそれより大きいポ
リペプチド類、終末トロンビン消化物中に存在するＭ_ｒ
＝５４,０００または４４,０００のポリペプチド類の一
方または他方、と反応した４つの抗体、その他のポリペ
プチドはなし、このことは、後者の２つのポリペプチド
類の起源は、Ｍ_ｒ＝９２,０００のポリペプチドのトロ
ンビン開裂から来ていることを示している。これはま
た、Ｍ_ｒ＝９２,０００のポリペプチド上の２つのエピ
トープはその開裂に生き残ったこと、およびこれらのエ
ピトープはＭ_ｒ＝７９,０００−８０,０００ダブレット
上に存在しないことを示している。

【００８５】５番目の抗体はＭ_ｒ＝７９,０００−８０,
０００のダブレットおよびＭ_ｒ＝１０８,０００および
それ以上のポリペプチド類と反応したが、Ｍ_ｒ＝９２,
０００のポリペプチドおよび終末トロンビン消化物中に
存在するポリペプチドのいずれとも反応しなかった。こ
のことは、Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,０００のダブレッ
トはＭ_ｒ＝９２,０００のポリペプチド上に存在しない
エピトープを持っていること、およびそのエピトープは
Ｍ_ｒ＝７９,０００−８０,０００のダブレットのトロン
ビン消化により破壊されることを示している。

【００８６】これら５つの抗体の反応挙動は、Ｍ_ｒ＝９
２,０００およびＭ_ｒ＝７９,０００−８０,０００のポ
リペプチドが、共通の前駆体(群)から導かれることを示
している。

【００８７】第６番目の抗体は、Ｍ_ｒ＝１０８,０００
およびそれ以上のポリペプチド類とだけ反応した。これ
は、終末トロンビン消化物中に存在するいずれのポリペ
プチドとも反応しなかったので、それが反応したエピト
ープはトロンビン消化によって破壊されることがわか
る。

【００８８】これらの抗体の１つまたはそれ以上の生物
学的製剤を調製または貯蔵するには、相当するモノクロ
ーナルＩgＧを、ヘパリン化した収集腹水から、収集後
直ちに分離してもよいし、あるいは、その貯蔵溶液の冷
凍部分を融解してもよい。新しい試料であるか冷凍した
試料であるかに関係なく、この溶液は４℃にして、同容
量の燐酸緩衝食塩溶液(ＰＢＳ)(ＰＢＳ:１.６g燐酸ナト
リウム、−塩基−水和物;８.４g燐酸ナトリウム、二塩
基無水物;６１.４g塩化ナトリウム;水を加えて７ l;pＨ
７.２)で処理する。この希釈した腹水は、４℃で攪拌下
に滴加することにより沈澱する。遠心分離は、好ましく
は１４,０００rpmで６０分間(３０,０００×g)で行な
う。腹水の上澄液を更にＳＡＳで２回沈澱させ、沈澱と
上澄液の混合物を攪拌し、第１回目のサイクルと同様に
して遠心分離する。３回目の沈澱から得たペレットを希
釈した腹水と同じ量のＰＢＳに再懸濁し、ＰＢＳに対し
て徹底的に透析する。透析袋中に現れた凝固物は２０℃
で遠心分離して除去する。透析したＩgＧを、室温で、
５％水酸化アルミニウム水溶液と共に攪拌して吸着さ
せ、吸着後２０℃で遠心分離する。この吸着処理を、第
１回目以降は２.５％水酸化アルミニウム溶液を用いて
少なくとも更に３回くり返す。この吸着させたＩgＧを
４℃にし、上記した様にＳＡＳで１回再沈澱させる。こ
の沈澱させたペレットは使用するまで−２０℃で貯蔵す
ることができる。

【００８９】モノクローナル抗体類を精製し、それらを
含有している生物学的製剤を保持するための２つの好ま
しい方法がＰ.Ｌ.Ｅyら(Ｉmmunochemistry、１５巻、４
２９−４３６頁、「蛋白質Ａ−セファロースを用いたマ
ウス血清から純化ＩgＧ₁、ＩgＧ₂aおよびＩgＧ₂b免疫グ
ロブリン類の分離」およびＣ.Ｂruckら(Ｊ.Ｉmmunologic
al Ｍethods、５３巻、３１３−３１９頁(１９８２)、
「ＤＥＡＧ Ａffi−ＧelBlueクロマトグラフィーによる
腹水からのマウスモノクローナル抗体の一工程精製法」)
によって記載されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＹ Ｎ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 キャロル・エイ・フルチャー アメリカ合衆国カリフォルニア、ラ・ジョ ラ、ラ・ジョラ・ブールバード7543番

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の反応プロフィルを有する、ヒトフ
   ァクターＶIII：Ｃポリペプチドと反応するＩgＧクラス
   のモノクローナル抗体： (Ａ) Ｍr＝４４，０００；９２，０００；１０８，０
   ００のポリペプチド；及び未消化のファクターＶIII：
   Ｃと反応し、；Ｍr＝５４，０００；７１，０００；７
   ２，０００；７９，０００；又は８０，０００のポリペ
   プチドとは反応しない、 (Ｂ) Ｍr＝５４，０００；９２，０００；１０８，０
   ００のポリペプチド；及び未消化のファクターＶIII：
   Ｃと反応し、；Ｍr＝４４,０００；７１,０００；７２,
   ０００；７９,０００；又は８０,０００のポリペプチド
   とは反応しない、又は (Ｃ) Ｍr＝７９,０００及び８０,０００；１０８,００
   ０のポリペプチド；及び未消化のファクターＶIII：Ｃ
   と反応し、；Ｍr＝４４,０００；５４,０００；７１,０
   ００；７２,０００；又は９２,０００のポリペプチドと
   は反応しない。
2. 【請求項２】 反応プロフィルＢ又はＣを示す抗体を実
   質的に含んでいない、反応プロフィルＡを示す請求項１
   に記載の抗体を含有する生物学的製剤。
3. 【請求項３】 反応プロフィルＡ又はＣを示す抗体を実
   質的に含んでいない、反応プロフィルＢを示す請求項１
   に記載の抗体を含有する生物学的製剤。
4. 【請求項４】 反応プロフィルＡ又はＢを示す抗体を実
   質的に含んでいない、反応プロフィルＣを示す請求項１
   に記載の抗体を含有する生物学的製剤。
5. 【請求項５】 反応プロフィルＡ及びＢを示す抗体の混
   合物を含有する生物学的製剤であって、反応プロフィル
   Ｃを示す抗体を実質的に含んでいない製剤。
6. 【請求項６】 反応プロフィルＡ、Ｂ及びＣを示す請求
   項１に記載の抗体の混合物を含有する生物学的製剤。
7. 【請求項７】 ファクターＶIII：Ｃと結合させた場合
   にヒトファクターＶIII：Ｃを中和することを特徴とす
   る、反応プロフィルＢ又はＣを示す請求項１に記載のモ
   ノクローナル抗体。
8. 【請求項８】 請求項１のＡに記載のモノクローナル抗
   体を分泌するハイブリドーマ。
9. 【請求項９】 請求項１のＢに記載のモノクローナル抗
   体を分泌するハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】 請求項１のＣに記載のモノクローナル
    抗体を分泌するハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】 分子量９２，０００タンパク質が複合
    化した分子量８０，０００及び７９，０００のファクタ
    ーＶIII：Ｃタンパク質の二量体を有するファクターＶI
    II：Ｃタンパク質の生物活性を示すファクターＶIII：
    Ｃ組成物による免疫に応答して産生されるヒトファクタ
    ーＶIII：Ｃモノクローナル抗体であって、該組成物か
    ら誘導される少なくとも１つのポリペプチドと特異的に
    結合する抗体。
12. 【請求項１２】 ファクターＶIII：Ｃの生物活性を示
    す分子量９２，０００のタンパク質とカルシウム架橋し
    ている分子量８０，０００及び７９，０００タンパク質
    の複合物を含有し、他のタンパク質を実質的に含んでい
    ないタンパク質組成物からなる免疫原、に応答して産生
    されるモノクローナル抗体であって、該免疫原と特異的
    に結合する抗体。
13. 【請求項１３】 Ｍr＝１０８，０００のヒトファクタ
    ーＶIII：Ｃポリペプチド、及び未消化のファクターＶI
    II：Ｃと反応し、Ｍr＝１０８，０００以下のポリペプ
    チドとは反応しないＩgＧクラスのモノクローナル抗
    体。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の抗体を分泌するハ
    イブリドーマ。
15. 【請求項１５】 請求項１又は請求項１３に記載の抗体
    と結合している免疫学的に不活性な吸着物質からなる免
    疫吸着物質。
16. 【請求項１６】 吸着物質がアガロースである請求項１
    ５に記載の免疫吸着物質。
17. 【請求項１７】 ヒトファクターＶIII：Ｃをある供給
    源から精製するための方法であって、 (Ａ) ヒトファクターVIII：Ｃを含有する供給源を入手
    し、 (Ｂ) その供給源から得たファクターＶIII：Ｃを、少
    なくとも１つのファクターＶIII：Ｃのエピトープと反
    応するモノクローナル抗体を含有する免疫吸着剤に吸着
    させ、次いで、 (Ｃ) ファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱着させ
    るに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用いて該
    免疫吸着剤からファクターＶIII：Ｃを溶離させること
    を特徴とする方法。
18. 【請求項１８】 ヒトファクターＶIII：Ｃをある供給
    源から精製するための方法であって、 (Ａ) ヒトファクターＶIII：Ｃを含有する供給源を入
    手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの９２，０００分子量ポリ
    ペプチドにおける少なくとも１つのエピトープと反応す
    るモノクローナル抗体を含有する免疫吸着剤に、該供給
    源から得たファクターＶIII：Ｃを吸着させ、次いで、 (Ｃ) ファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱着させ
    るに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用いて該
    免疫吸着剤からファクターＶIII：Ｃを溶離させること
    を特徴とする方法。
19. 【請求項１９】 ヒトファクターＶIII：Ｃをある供給
    源から精製するための方法であって、 (Ａ) ヒトファクターＶIII：Ｃを含有する供給源を入
    手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの８０，０００又は７９，
    ０００分子量ポリペプチドにおける少なくとも１つのエ
    ピトープと反応するモノクローナル抗体を含有する免疫
    吸着剤に、該血漿供給源から得たファクターＶIII：Ｃ
    を吸着させ、次いで、 (Ｃ) ファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱着させ
    るに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用いて該
    免疫吸着剤からファクターＶIII：Ｃを溶離させること
    を特徴とする方法。
20. 【請求項２０】 血漿又は血漿濃縮物から誘導されるヒ
    トファクターＶIII：Ｃを精製するための方法であっ
    て、 (Ａ) ヒトファクターＶIII：Ｃを含有する血漿供給源
    を入手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの少なくとも１つのエピト
    ープと反応するモノクローナル抗体を含有する免疫吸着
    剤に、血漿供給源から得たファクターＶIII：Ｃを吸着
    させ、次いで、 (Ｃ) ファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱着させ
    るに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用いて該
    免疫吸着剤からファクターＶIII：Ｃを溶離させること
    を特徴とする方法。
21. 【請求項２１】 血漿又は血漿濃縮物から誘導されるヒ
    トファクターＶIII：Ｃを精製するための方法であっ
    て、 (Ａ) ヒトファクターＶIII：Ｃを含有する血漿供給源
    を入手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの９２，０００分子量ポリ
    ペプチドにおける少なくとも１つのエピトープと反応す
    るモノクローナル抗体を含有する免疫吸着剤に、該血漿
    供給源から得たファクターＶIII：Ｃを吸着させ、次い
    で、 (Ｃ) ファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱着させ
    るに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用いて該
    免疫吸着剤からファクターＶIII：Ｃを溶離させること
    を特徴とする方法。
22. 【請求項２２】 血漿又は血漿濃縮物から誘導されるヒ
    トファクターＶIII：Ｃを精製するための方法であっ
    て、 (Ａ) ヒトファクターＶIII：Ｃを含有する血漿供給源
    を入手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの８０，０００又は７９，
    ０００分子量ポリペプチドにおける少なくとも１つのエ
    ピトープと反応するモノクローナル抗体を含有する免疫
    吸着剤に、該血漿供給源から得たファクターＶIII：Ｃ
    を吸着させ、次いで、 (Ｃ) ファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱着させ
    るに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用いて該
    免疫吸着剤からファクターＶIII：Ｃを溶離させること
    を特徴とする方法。
23. 【請求項２３】 組換えファクターＶIII：Ｃを精製す
    るための方法であって、 (Ａ) 組換えファクターＶIII：Ｃを含有する供給源材
    料を入手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの少なくとも１つのエピト
    ープと反応するモノクローナル抗体を含有する免疫吸着
    剤に、該供給源材料から得た組換えファクターＶIII：
    Ｃを吸着させ、次いで、 (Ｃ) 組換えファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱
    着させるに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用
    いて該免疫吸着剤から組換えファクターＶIII：Ｃを溶
    離させることを特徴とする方法。
24. 【請求項２４】 組換えファクターＶIII：Ｃを精製す
    るための方法であって、 (Ａ) 組換えファクターＶIII：Ｃを含有する供給源材
    料を入手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの９２，０００分子量ポリ
    ペプチドにおける少なくとも１つのエピトープと反応す
    るモノクローナル抗体を含有する免疫吸着剤に、該供給
    源材料から得た組換えファクターＶIII：Ｃを吸着さ
    せ、次いで、 (Ｃ) 組換えファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱
    着させるに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用
    いて該免疫吸着剤から組換えファクターＶIII：Ｃを溶
    離させることを特徴とする方法。
25. 【請求項２５】 組換えファクターＶIII：Ｃを精製す
    るための方法であって、 (Ａ) 組換えファクターＶIII：Ｃを含有する供給源材
    料を入手し、 (Ｂ) ファクターＶIII：Ｃの８０，０００又は７９，
    ０００分子量ポリペプチドにおける少なくとも１つのエ
    ピトープと反応するモノクローナル抗体を含有する免疫
    吸着剤に、該供給源材料から得た組換えファクターＶII
    I：Ｃを吸着させ、次いで、 (Ｃ) 組換えファクターＶIII：Ｃを免疫吸着剤から脱
    着させるに有効な条件下、溶離物質を含有する溶液を用
    いて該免疫吸着剤から組換えファクターＶIII：Ｃを溶
    離させることを特徴とする方法。
26. 【請求項２６】 該溶液がカルシウムイオン及び非イオ
    ン性界面活性剤を含有している請求項１７から請求項２
    ５のいずれかに記載の方法。
27. 【請求項２７】 該溶液がＥＤＴＡを含有している請求
    項１７から請求項２５のいずれかに記載の方法。
28. 【請求項２８】 該溶液がナトリウム・チオシアネート
    を含有している請求項１７から請求項２５のいずれかに
    記載の方法。