JPS61137824A - 新規な第８因子凝固ポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、新規な第■■因子（ファクターＶＭ）ポリ
ペプチド類、即ち、凝固活性を有するタンパク質に関す
るものである。さらに詳しくは、本発明は、古典的な血
友病の治療、並びにヒトおよび哨乳類の血液に対して望
ましい凝固挙動を示す様なポリペプチドまたはポリペプ
チド複合体のさらに進んだ研究、および確認を行なう上
で有用なものである。

従来技術 古くから、血漿中の第ｖｍ因子が血液の凝固に。

重要な役割を果していること、並びにトロンビンがこの
第■因子の凝固作用を活性化すること。

は知られていた。最近の第Ｖａｔ因子確認作業において
、第７ｍ因子は少なくとも２個のポリペプチド、即ち■
■■：ＣおよびＶＩＩＩ：Ｒとして知られているもの、
の複合体であるとの仮定がなされ、しかもこのｖｔｎ：
ｃ部分に凝固活性が存在することが見出された。第ＶＩ
ＩＩ：Ｃ因子に対するトロンビンの作用が研究され、ト
ロンビンは、該因子を数個の小ペプチドに分解すること
により活性化する、という結論が導き出された。しかし
ながら、これまでどの研究においても、ヒトにおけるト
ロンビン−誘発性第ＶＩＩＩ因子活性化作用を、ヒト第
側二Ｃ因子から形成された、定義されたポリペプチドの
いずれと関連づけることはできなかった。

例えば、ホイヤー（Ｈｏｙｅｒ）およびトラボルド（Ｔ
ｒａｂｏｌｄ）は、「ヒトノ第ｖｍ因子に対するトロン
ビン添加前（Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｒｏｍ
ｂｉｎ　ｏｎｈｕｍａｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＶＩｕ）Ｊ　
ジエイ・ラン書クリ７−メド（Ｊ、Ｌａｎ、Ｃｌ１ｎ、
Ｍｅｄ、）　９７　：　５０−６４　（１９，８１）、
において、ウサギ由来の第ＶＩＩＩ　：　Ｒ因子に対す
る多クローン性抗体を用いた免疫吸着クロマトグラフィ
ーにより、ヒトの第ＶＩＩＩ：Ｃ因子を精製している。

次いで、彼らは第ｖｍ　：　ｃ因子をｆｉｌヒトα−ト
ロンビンと共にインキュベートし、トロンビンは、少量
では第ＶＩＩＩ：Ｃ因子を活性化するが、大量の場合に
は該因子を殆んど。

または全く活性化しないと結論している。彼らはまた、
トロンビンの活性化作用はタンパク質のサイズの減少に
よる、と結論づけると共に、活性化された第■■：Ｃ因
子の分子量は約１１６，０００　であると提示した。し
かし最も重要なことは、彼らは第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性
および第ｖｉａ　：　ｃ因子抗原決定基を保持している
特定のポリペプチドを同定することができなかった、と
いう点である。

フルチャ（Ｆ　ｕ　ｌ　Ｃｈｅ　ｒ　）　＊　Ｃ、Ａ　
、およびツイマーマ７　（Ｚｉｒｒｍｅｒｍａｎ）、Ｔ
、５．　　は、「ヘテａａ−ガスな沈降抗体によるヒト
の第ｖｍ因子凝固促進性タンパクの確認（ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍｎｆａｃ
ｔｏｒ　ＶＩＩＩ　ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　ｗｉｔｈａ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐ
ｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）」゛プ
ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ
ー、１ブ・サイエフ　ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃ
ａｄ。

ｏｆ　ＳｃすＵＳＡ、　　７９：１６４８−１６５２（
１９８２）において、血！！濃縮物を第Ｖｌｌｌ　：　
Ｒ因子に対するモノクローナル抗体を倉荷するカラムに
通し、吸着されたＶＴＩ［：　Ｃ／ＶＩ［Ｉ　：　Ｒ複
合体（コンプレックス〕からＶＩＩＩ　：　Ｃを溶離し
、次いで第ｖｍ　：　ｃ因子を第２のカラムで濃縮する
ことにより、ヒト血漿濃縮物から精製度の高いヒト第Ｖ
ＩＩＩ：Ｃ因子を得た、と述べていｐ０次いで、この純
化第ＶＩＩＩ：Ｃ因子を、この純化物質にトロンビンを
加える前、および後に、ドデシル硫酸ナトリウム／ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（以下１’−５０５−ＰＡ
ＧＥ　Ｊと呼称〕により分析した。純化第ｖｍ　：　ｃ
因子は、トロンビン添加前には、分子量（Ｍｒ　）ｓ　
ｏ、ｏ　ｏ　ｏおよび７９，０００の位置に比較的強い
二重線（ダブレット）で示されるもの、並びにこれに加
えて稗約９２，０００の１個を含む、ざらに６個の、よ
り大きい隅　を有するポリペプチドなどを含めて、様々
な分子量のポリペプチドに対応する、広範なバンド配列
を５０５−ＰＡＧＥ上に示した。

純化第ＶＴＩＩ　：　Ｃ因子にトロンビンを加えると、
トロンビン添加前に認められたポリペプチド全てに、そ
の減少または消失が起きた。

血漿濃縮物の凝固活性はトロンビン添加に伴って上昇し
、トロンビン添加前の該物質に対し最高３倍に達した後
、減少した。純化第ｖ■：　ｃ因子の凝固活性もまた、
活性化前の物質の最高３倍に上昇した。このことは、ト
ロンビンがこれらの各場合において、本質的に同じ第Ｖ
ＩＩＩ：Ｃ因子活性を持っていたと報告されていること
から当該技術分野の人ならば、比活性のこの様な増加は
高度に達成された精製度に起因するもあと断定するであ
ろう。この論文には、賦活化された凝固活性を、トロン
ビンによる活性化前の純化第Ｖ■因子について観察され
たバンド中の特定の１、またはそれ以上のポリペプチド
に帰属する根拠となるものは一切含まれていない。

発明の構成および目的 本発明は以下の特徴を宵する第ＶＩＩＩ：Ｃ因子凝固ポ
リペプチドコンプレックスに関するものである： リ　該コンプレックスは、後述の実施例に記載した方法
Ａに従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけたとき、陽値約９２，０００；あ
るいはＭｒ値約９２，０００　、約ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ
および約７９，０００　：あるいは、Ｍｒ値約９２．０
００．約７２，０００および約７１，０００：あるいは
賭値約９２，０００．約ｓｏ、ｏｏｏ、約７９，０００
　Ｊ’１７２゜０００および約７１，０００　　に相当
する位置にバンドを示す１またはそれ以上のポリペプチ
ドを含有し；ｉ）該コンプレックスは、１８００単位／
■以上、好ましくは５４００単位／ｌｌｌ９Ｉ２Ｌ上の
凝固比活性を有し； 可読コンプレックスはりに示した活性を少くとも約１０
分間持続して現わし：そして、ｉｖ）　　該コンプレッ
クスはヒト第■　：Ｃ因子の抗体と結合する。

本発明はまた、該コンプレックスを含有する生物学的製
剤、並びに該コンプレックスまたはその製剤を投与する
ことにより、血友病における凝血異常を治療する方法に
関するものでもある。さら（こまだ本発明は、ヒトの第
ｖｎｉ　：　Ｃ因子をα−トロンビンで消化し、該消化
作用を前述のコンプレックスの存在中に中断し、次いで
このコンプレックスを濃縮することにより、コンプレッ
クス、あるいはその濃縮製剤を製造することに関する。

ざらに本発明は、第ｖｎｉ：ｃ因子に対するモノクロー
ナル抗体を含有している免疫吸着剤から、凝固活性を喪
失することな（ＶＩＩＩ　：　Ｃポリペプチド類を回収
する方法に関するものである。

既述した如く、本発明は第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の凝固活性
および第ｖｍ　：　Ｃ因子の免疫学的挙動、を示すと共
に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（以下「５Ｄｓ−ＰＡＧＥＪｐ法で分析した際
に特徴的なＭｒ値を示すポリペプチドコンプレックスを
包含するものである。

本明細書において、以後［ポリペプチドコンプレックス
」という語句は、物理的にはっきりと区別できる２また
はそれ以上のポリペプチドの組合わせのみならず、　Ｍ
ｒ　　９２，０００にバンドを示Ｔ１個の識別可能なポ
リペプチドだけを含有する製品をも意味するものとする
。

以下の記述はヒト第ｖｍ　二ｃ因子を用いた本発明の特
許請求に係るコンプレックスの製造方法を示すものであ
って、該第ＶＩＩＩ：Ｃ因子は新規な生成物の同定並び
に確認が、余分なポリペプチドの影響を受番）゛ない様
、高度に精製されている。

しかしながら、特に指示しない限り、本発明そのものは
、それ以前に出発物質がどの様に処理されたか。

を問題にしないということを強調しておく必要がある。

本発明に係る活性な第ｖｍ　：　Ｃ因子ポリペプチド群
は、後に非常に詳しく述べる如く、トロンビンによる消
化、あるいは、同様の作用を有するプロテアーゼ類、例
えばｉＸａ因子、第ＪＸａ因子、またはラッセルのマム
シ毒−Ｖなどによる消化によって調製されるばかりか、
ＤＮＡ組換え技術、即ち、当該技術分野で通常の知識を
有する人々にとっては自明の方法により、所望のポリペ
プチドを製造するための１または１以上の遺伝子を導入
された細菌、酵母またはその他の細胞によって所望のポ
リペプチドを製造する方法によっても調製することがで
きる。所望のコンプレックスを得るためのいずれの工程
においても、１または１以上の他のポリペプチド類を含
んだコンプレックスが生成されることが予測される。

ヒト第ｖＩＬ［：Ｃ因子を含有するあらゆる血漿または
血漿濃縮物を利用することができる。新規な凝固ポリペ
プチドコンプレックスは、本明細書中に引用したアメリ
カ特許第４，３６１，５０９号、１９８２年１１月３０
日発行、に記載されている方法に従って極めて高度に精
製された（超純化〕ヒト第Ｖｔｕ：Ｃ因子から調製する
ことができる。この方法においては、血漿または血漿濃
縮物の如き第ＶＬ［Ｉ：Ｃ因子源を、第ＶＩＩ［：　Ｒ
因子に対するモノクローナル抗体類を結合させた免疫吸
着剤カラムに通す。第ＶｉＬＩ：Ｒ因子／第ｖ■：　Ｃ
因子コンプレックスがカラムに吸着された後、第ｖ■：
　Ｃ因子を溶離し、これをアミンへキシルアガロースの
如き第２のカラムに通す。第２のカラムもまた、第ｖｕ
ｉ　：　Ｃ因子に対する抗体を含有する免疫吸着剤であ
ってもよい、ということは注目丁べきである。第ＶＩ［
Ｉ：Ｃ因子は、α−トロンビンおよび他のプロテアーゼ
類から分けておく必要がある。この第ｖｍ　：　ｃ因子
は、例えば０．３Ｍ塩化カルシウムを含有するｐＨ約６
．８〜約７，４の緩衝化食塩水中で都合良く保存するこ
とができる。

次いで、ヒト第ＶｎＩ：Ｃ因子を、後述するようなポリ
ペプチドコンプレックスの生成に有効な条件下でα−ト
ロンビンにより消化する。純化α−トロンビンは、フェ
ントン（Ｆｅｎｃｏｎ）　、　Ｊ　、Ｗ、■；ファスコ
（Ｆａｘ　ｃｏ）　、Ｍ、　Ｊ　、　；スタックロー（
Ｓｔａｃｋｒｏ％ｖ）。

Ａ、Ｂ、ニア０７７ン（Ａｒｏｎｓｏｎ　）　、Ｄ、Ｌ
、　；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、ＡｌＭ、：およびフイレ
イソ７　（Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ）、Ｊ、Ｓ。

Δ 著、「ヒトトロンビン、α−トロンビンの製造、評価、
並びに性質（Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｐｒｏｄ
ｕｃ−ｔｉｏｎ＋Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ａｎｄ　Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆα−Ｔｈ　ｒ　ｏｍｂ　ｉ　ｎ
月ジャーナル・バイオロジカルケミストリイ（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５２　：３５８７−３５９８（１
９７７）、に記載、されている方法によって得ることが
できる。

σ−トロンビンおよび第ＶＩＩＩ：Ｃ因子を水性の系、
好ましくはｐＨ約６．８〜約７．４に緩衝化された系に
おいて一緒にする。トロンビンは、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子
と反応させるに充分な様、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子に相当す
るだけの量であって、しかも所望の活性なポリペプチド
コンプレックスを回収し得るよりも以前に、該第ｖｔｎ
　：　ｃ因子が不活性なポリペプチドに分解されてしま
う程には多くない量、存在させる必要がある。例示の如
く、１＃Ｉｇ中に第■二〇因子２００−４００単位を含
む製品（０，２”９／　＃！ｅ　）は、α−トロンビン
約０．１〜約０．５単位／＃Ｅｌにより消化する必要が
ある。消化は室温で行うことができる：温度が高すぎる
とタンパクが変性し、低丁ぎると消化の進行が抑制され
る、所望のポリペプチドコンプレックスの生成に充分な
時間、消化する。適当な時間は、０．１〜約６０分、好
ましくは０．１〜３０分である。１〜１０分間が特に適
当であるＣとが見出された。しかしながら、至適時間は
、処理されている第ｖｍ　：ｃ因子出発物質の一部を用
いて最小の実験を行うことにより確認することができる
、ということは理解されるであろう。至適時間は、隨　
約９２，０００ヲ示すポリペプチドコンプレックスであ
って、該Ｍｒ９２，０００ポリペプチドを著しく分解す
ることなく、約７９，０００　　および約ｓｏ、ｏｏｏ
のＭｒ　ダブレットを示すタンパクコンプレックスを伴
なっているコンプレックスを最大量生成させる時間であ
る。このＭｒ　７９，０００　８０，０００ダブＬ／’
７トコンプレツクスは、Ｍｒ値７１，０００−７２，０
００にダブレットを示すコンプレックスに分解された後
、作用を現わ丁のかもしれない。しかし７１，０００−
７２．０００　　ダブレットは、単独では第ｖ■：　ｃ
因子活性を示さない。

次いで、反応混合物に有効量の（ｐ−アミジノフェニル
）メタンスルホニルフルオライド（Ｉ２Ｌ下「ｐ−ＡＰ
ＭＳＦ　Ｊと略す〕または他のトロンビン阻害剤を加え
ることにより消化を中断する。Ｐ−ＡＰＭＳＦはα−ト
ロンビンがさらに第■■：Ｃ因子タンパク類と反応する
ことを阻止するが、これらのタンパク質を分解するもの
ではない。ｐ　−ＡＰＭＳ　Ｆ添加量は、反応混合中に
当り存在していたα−トロンビン活性１単位につき、約
１．５〜約２゜５ミリモルであることか必要である。

ｐ　−ＡＰＭＳ　Ｆはカリフォルニアメデイシナルーケ
ミストリイ・カンパニー　（Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａ　
Ｍｅｄｉ　−ｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙ）、サンフランシスコ、カリフォルニアを通じ
て入手し得るが、その製造方法は、ラウラ（Ｌａｕｒり
艮、：ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　、Ｄ、Ｊ　、
　；およびピング（Ｂｉｎｇ）　、Ｄ、Ｈ１著ｒＣｐ−
アミノフェニル）メタンスルホニルフルオライド、セリ
ンプロテアーゼの不可逆性阻害剤（ａｎ　Ｉｒｒｅｖｅ
ｒｓｉｂｌｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　５ｅｒｉｎ
ｅＰｒｏｔｅａｓｅす」バイオケミストリイ（Ｂｉ　ｏ
ｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）（１９８０）１９．４８５
９−４８６４．４８６１頁に記載されている。

次にこの反応混合物を、本発明に係るポリペプチド複合
物を濃縮するための処理に何丁。ポリペプチドコンプレ
ックスは、純化型コンプレックスの有する非常に高い活
性を与えるコンプレックスを得るために、他の第■■因
子および第ＶＩＩＩ因子以外のタンパク様物質に関して
濃縮することが好ましい。精製法としては、例えば限界
濾過法、超遠心分離法、イオン交換法、ゲル透過クロマ
トグラフィー法、プレパラテイブ電気泳動法１等電点分
画電気泳動法、並びにゲルおよびアフィニティクロマト
グラフィー法などを挙げることができる。

所望のコンプレックスはまた、反応混合物（これは他の
方法で予め濃縮されていてもよい〕をコンプレックスの
ポリペプチド（類）と反応しうる抗−ヒトｖｎｉ　：　
ｃ抗体あるいはヒト以外の■■：Ｃに対する同等の抗体
を含有する免疫吸着剤カラムに通ずことにより、濃縮お
よび／または回収することができる。抗体類はアガａ−
スに結合している（実施例１の下欄参照）。コンプレッ
クスの濃縮および／またはその中のあるポリペプチドの
分離、に用いることのできる抗体類については後述する
。活性ＶＩＩＩ：Ｃコンプレックスは優先的にカラムに
吸着し、次にカルシウムイオンを含む溶液（例、ＣａＣ
１２）　（所望により非イオン性界面活性剤をも含有し
てよい〕によって溶離される。適当な非イオン性界面活
性剤には、アルキルフェニルポリオキソエチレン類、例
えばトリトン／Ｔｒｉ−ｔｏｎ）　−Ｘ　−１００、Ｎ
　　１０１　、または−Ｘ−４０５〔イーストマン・ケ
ミカルＧｏ、（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｅｍ−ｉｃａｌ　
ｃｏ、））トイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、−６０また
は−８０〔シグマ・ケミカル、Ｇｏ、　（Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅ　−ｍｉｃａｌ　ＣｏＪ：１；およびノニデット
（ＮｏｎｉｄｅすＰ−４０（シグマ・ケミカルＧｏ　）
などが含まれるが２これらは全て化学式のわかった周知
の商品である。

用いられるカルシウムイオンおよび界面活性剤の濃度は
ポリペプチドコンプレックスを脱着するに充分な濃度で
あるべきだが、溶離剤がポリペプチドを不活性化してし
まう程、高くないことを要する。カルシウムイオンの濃
度は約０．５Ｍまたは約１．０Ｍまで高めることができ
るか、０．２５Ｍが好ましい。界面活性剤濃度は、約１
重量％まで高めることができるが約０．１重量％が好ま
しい。溶離剤を免疫吸着剤カラムに約１〜約８床容蛍／
時、好ましくは約３〜約４床容量／時の速度で適用する
。流速が半丁ぎるとカラムが破壊され、ポリペプチドコ
ンプレックスの吸着が起こらない危険性がある。熟練し
た実施者ならば、これらの指示を固定床カラム以外の免
疫吸着法に容易に適応させることができるであろう。

ＶＩＩＩ　：　Ｃポリペプチドコンプレックスは、ｐＨ
約６．８〜７．４において適当な緩衝液中に回豚され、
この中には溶離溶液からのカルシウムイオン並びに界面
活性剤も含まれている。実施例１において用いる様に、
より低濃度のカルシウムイオンを含有するＶＩＩＩ：Ｃ
緩衝液１等の緩衝液に対して上記の溶液を透析すること
により、カルシウム並びに界面活性剤の濃度を下げ、好
ましくは界面活性剤を除去することができる。本発明の
コンプレックスはこの溶液中に、あるいは凍結−乾燥し
て保存することができる。このコンプレックスは血友病
性凝血異常の患者に対し、カルシウム濃度を生理学的に
許容し得る様に調節して投与することかでき、その滅菌
食塩水溶液を注射投与することができる。

次に示す如（５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、本発明の
コンプレックスは、Ｍｒ約９２，０００を示し、正常な
状態で約７９，０００および約ｓｏ、ｏｏｏのＭｒダブ
レットを示す物質（その内の幾分かは分解して約７１，
０００および約７２，０００のＭｒダブレットを示す）
を含む。その純化型においては、このバンドあるいはこ
れら一群のバンドが、本来、現われる唯一のバンドであ
る。しかしながら、本発明はまた、本発明に係るコンプ
レックスを含有することを示Ｔタンパク性物質を１００
％以下、即ち、９５チ、９０％、または８０％、７０チ
、６０チ、さらに少量の３０％、２０％、１０％、ある
いは１％、含有する生物学的製剤をも包含するものであ
ることを認識しておくことが必要である。本発明は従っ
て、その第ｖｎｉ：ｃ因子活性が本発明のコンプレック
スの存在に起因している様な製剤をも包含するものであ
る。

本発明に係るタンパク質コンプレックスは、精製したヒ
ト第ＶＩＩＩ　：　Ｃ因子、（例えば前述のアメリカ特
許第４，３６１，５０９号で開示され請求されている方
法で精製されたヒト第■■二Ｃ因子など〕よりも高いｖ
ｍ　：　ｃ凝固比活性（活性／総タンパク量　ｍｙ　）
を有する。実際、純化コンプレックスの活性は数倍であ
り、例えば、精製したヒト躯Ｉ：Ｃ因子の３〜５倍、さ
らに好都合には少なくとも１０倍、あるいは５０倍もの
活性を示す。同様に、本発明のコンプレックスと、１ま
たはそれ以上の他のタンパク類とを一含有し、従来知ら
れている凝血側製剤が与えるよりも高い比活性を示す生
物学的製剤を得ることができる。コンプレックス、並び
にそれを含有する生物学的製剤の比活性＋１１８００単
位／１ｎ１１以上、好都合には５，４００単位／キ、よ
り好都合な態様では７，５００．さらには１０，０００
単位／キ以上にも達する。本発明製剤の比活性が本発明
で用いた精製ヒト第ｖｎｔ　：　ｃ因子の３〜５倍、好
都合には少なくとも１０倍、５０倍、あるいは１００倍
にも達することが好ましい。

本発明に係るタンパク質コンプレックス、およびその生
物学的製剤は、上記の優れた活性が少なくとも約１０分
間、好ましくは少なくとも約３０分間、持続的に存在す
ることを特徴とする。勿論、活性は一般にもつと長期間
安定である。コンプレックスはまた、第ＶＩＩＩ：Ｃ因
子タンパク質の免疫学的特性、即ち、ヒト第ｖｍ二ｃ因
子に対する抗体と結合する性質、を有している。このこ
とは、例えば、以下に述べる様に第ｖｎｔ　：　ｃ因子
に対するモノクローナル抗体を増幅させ、この抗体をア
ガロースカラムに結合させ、このカラムにコンプレック
スの水溶液を通し、得られた溶液の第ｖ■■：Ｃ因子活
性を分析することにより確認することができる。

本発明は、　Ｍｒ＝９２，０００およびＭｒ　＝　７９
，０００−ｓｏ、ｏｏｏのポリペプチドが２タンパク分
解および破壊され易く、結果的に凝血剤活性を、喪失し
易いことで有名な、天然のヒト第ｖｔｎ　：　ｃ因子に
比べて安定である、という点においても望ましい寄与を
果すものである。

上記のポリペプチド、即ち、Ｍｒ９２，０００にバンド
を示し、高められたＶＩＩＩ：Ｃ活性を有するポリペプ
チドは、式 ％式％ （式中、ＸおよびＹはアミノ酸を表わ丁〕で示される活
性は、部分的タンパク質配列を有することが同定された
。

上記のアミノ酸配列において、ＸはＡＬＡ（アラニア）
であり、Ｙは５ＥＲ（セリン）であルコとが好ましい。

本明細書においては、許容されている略語を用いてアミ
ノ酸を表わした。その完全ＹＡ　’Ｊストを下記に示す
。

グリノン　　　ＧＬＹ　　　リシン　　　　　ＬＹＳア
ラニン　　　ＡＬＡ　　アルギニン　　ＡＲＧバリン　
　　　ＶＡＬ　　　アスパラギン　　ＡＳＮイソロイシ
ン　ＩＬＥ　　グルタミン　　　ＧＬＮロイノン　　　
ＬＥＵ　　　システィン　　　ＣＹＳセダン　　　　Ｓ
ＥＲメチオニン　　　ＭＥＴトレオニン　　ＴＨＲ）リ
プトファンＴＲＰプ、ａ）ン　　　Ｉ’ＲＯフェニルア
ラニン　ＰＨＥアスパラギン酸ＡＳＰ　　　チロシン　
　　　ＴＹＲグルタミン酸　ＧＬＵ　　　ヒスチジン　
　　ＨＩＳ分子量９２，０００のセグメントの内、部分
的なアミノ酸配列しか同定されていないが、凝固活性に
関する限り、この情報は、該分子の活性な部分を示すの
に光分なものである。実際、上記のアミノ酸配列を有す
るフラグメント化したポリペプチドタンパク質は、それ
自体が活性である。′活性“という語句は、それがプロ
凝固活性を有することを意味する。典型的には、その様
な活性は２９２゜０００　セグメントに７９，０００セ
グメントまたは７１．０００セグメントが随伴している
とき、あるいは、それらが組合わされている場合にみら
れる。

先に示した約７９，０００〜ｓｏ、ｏｏｏの範易り分子
Ｊｉを有するポリペプチドも凝固活性を有し、そのアミ
ノ酸配列は、式： Ｚ−Ａ−ＧＬＮ−ＬＹＳ　−ＬＹｓ−：丁ＨＲ−ＡＲＧ
−ＨＩＳ−ＴＹＲ−ＧＬＹ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−
ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−Ｂ−ＴＲＰ　−ＡＳＰ−ＴＹ
Ｒ−ＧＬＹ−ＭＥＴ−Ｃ−Ｄ−ＧＬＵ−Ｅ （式中、Ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥはアミノ酸を表わ
す） で示される、 このアミノ酸配列において、Ｚがセリン（ＳＥＲ）、Ｃ
がセリン（ＳＥＲ）、Ｄがセリン（Ｓ　ＥＲ）、そして
Ｅがフェニルア°ラニン（ＰＨＥ）であることが好まし
い。

その様なアミノ酸配列を宵するフラグメント化したポリ
ペプチドも同じく、それ自体で活性である。

分子量９２，０００および７９，０００〜ｓｏ、ｏｏｏ
の凝固活性ポリペプチド中に見出されたアミノ酸配列は
、当該技術分野で採用されている方法によって決定され
た。一般に、以下の方法で同定を行った： 標品を実施例１に記載した如くにしてトロンビンによる
タンパク分解に付し、Ｍｒ＝−９２，０００をＭｒ　＝
５４，０００とＭｒ＝４４，０００のフラグメントに開
裂し、７９，０００〜８０，０００　　フラグメントを
Ｍｒ　＝　７１．０００−７２，０００フラグメントに
切断した。これらのフラグメントを含有する混合物を実
施例１に示す如くポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、各フラグメントを他のフラグメントから分けた。次
いで、「アミノ酸配列分析のための、ポリアクリルアミ
ドゲルによる、μｙタンパク質の単離（Ｉｓｏｌａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ　Ｑｕａｎｔｉｔｉｅ
ｓｏＥ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｆｒｏｍ　Ｐｏｌｙａｃｒ
ｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅ１ｓｆｏｒ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１
ｄｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ月（：Ｍ、
Ｗ、　バンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌ　１ｅｒ）、Ｅ
、／Ｌ／ジャ７　（Ｌｕｊａｎ）　、　Ｆ、オＸトラン
プ（Ｏｓ　ｔ　ｒａｎｄｅ　）およびり、Ｅ、フッド（
Ｈｏｏｄ）、メソツズ・イン・エンザイモａシイ（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　＋Ｖｏ
ｌ　、９１゜１７章、１９８３１に記載の方法に従い、
Ｍｒ＝５４．０００　　フラグメントおよびＭｒ　＝　
７１，０００−７２．０００フラグメントを溶離した。

次いぞ、この様にして得られたペプチドのアミノ酸配列
ヲ、「気相−配列決定装置を用いた高感度配列決定（Ｈ
ｉｇｈ　−５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ　ｗｉｔｈ　ａＧａｓ　−Ｐｈａｓｅ　５ｅｑｕｅ
ｎａｔｏｒ）Ｊ　ｌ：　Ｍ、Ｗ＋ハフｆ２ピラー、１０
Ｍ、ヘライック（Ｈｅｗｉｃｋ）、Ｈ，Ｊ、ドレイヤ−
（Ｄｒｅｙｅｒ）およびり、Ｅ、７　ラド（Ｈｏｏｄ）
　、メソッズ・イン・エンザイモロジイ　Ｖｏｌ、９１
　、３６章、１９８３〕に記載の方法に従って決定した
。

実施例Ｉ 乙の実施例は、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の市販濃縮物からの
精製並びに精製α−トロンビンによる消化の方法に関す
るものである。第ｖｉａ　：　ｃ因子に対するモノクロ
ーナル抗体を製造し、ＶＩＩＩ　：　Ｃポリペプチドの
同定に用いた。消化過程において数回、消化混合物の一
部分に関してＶｌｌｌ　：　Ｃ（凝血）活性、並びに５
ＤＳ−ＰＡＧＥに基くタンパクのバンドを分析した。

ＶＩＩＩ：Ｃの精製 全工程は室温で行なった。化学薬品は全て試薬用であっ
た。市販の第ｖｎｉ因子濃縮物〔アーモアファーマシュ
ーテイカ／Ｌ／　（Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅ−
ｕ−ｔｉｃａり提供〕をＶＩＩＩ：Ｃ緩衝液（０，０２
Ｍイミダゾール７０．１５Ｍ塩化ナトリウム／　Ｑ、ｌ
　Ｍ　Ｌ　−リジンＨＣｌ１０．０２％ナトリウムアジ
ド、ｐＨ６，８）中に入れて復元した。合計１７，００
０単位のＶＩＩＩ：Ｃ活性を有するこの試料を床容量２
．５−３゜ＯＩ！の免疫吸着剤カラムに入れた。カラム
は臭化シアン−活性化アガロース（セファロース４Ｂ、
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉす、ビスカッタウェイ
（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ八ニューシャーシーへであり、
これにＶＩ［Ｉ　：　Ｒに対するモノクローナル抗体が
共有結合で結合している。前述のアメリカ特許第４，３
６１．５０９号に記載されている方法に従って抗体を調
製し、カラムに吸着させた。抗体は、５０％硫酸アンモ
ニウムで腹水から沈澱させ、さらに２回再沈澱させた後
、セファロースに対して密度２〜４η／　ｍｌでカラム
に吸着させた。免疫吸着剤を。

３Ｍチオシアン酸ナトリウムによって予め溶離処理し、
ＶＩＩＩ：Ｃ緩衝液（０，０２ＭイミダゾールＨＣ’　
　ＰＨ７，０，０，１５Ｍ　ＮａＣ１、Ｑ、ｌ　ＭＬ−
リジン−ＨＣｌ　、　０．０２％ナトリウムアジド〕で
洗浄し、２ｍＭジ−イソプロピルフルオロホスフェート
で２回処理した後、濃縮物を加えた。

カラトをＯ，１５Ｍ塩化ナトリウム含有ＶＩＩＩ：Ｃ緩
衝液２０１で洗浄し、０．３５Ｍ塩化カルシウムを含有
するＶＩＩＩ　：　Ｃ緩衝液でＶＩＩＩ　：　ＲからＶ
ＩＩＩ　：Ｃを溶離した。活性な両分を集め、ＹＭ−Ｉ
Ｑ膜を備えたアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）撹拌室内で、窒
素圧下１００倍に濃縮した。次いで、この濃縮物をＸに
Ｃ緩衝液で１＝１０に希釈し、０．０２５Ｍ塩化カルシ
ウム含有ＶＩＩＩ：Ｃ緩衝液で平衡させたアミンヘキシ
ル−セファロースの４ｍ／カラムに適用し、０．３Ｍ塩
化カルシウム含有ｖｍ　：　ｃ緩衝液で流速１０＃！ｇ
／時で溶離すると、ＶＩＩＩ　：　Ｃが高濃度で得られ
る。濃縮された免疫吸着剤プールを０．２５Ｍ塩化カル
シウムに調節し、モノクローナル抗−フイブリノーゲン
、抗−フィブロネクチンおよび抗−ＶＷＦ　抗体（これ
らは臭化シアン活性化セファロースに結合されている）
の混合物に対し１／１０（Ｖ／Ｖ）の割合で、１時間づ
つ、２回吸着させた。

モノクローナル抗体類は、アメリカ特許第４，３６１．
５０９号に記載されている如くにして、精製Ｖ［：Ｃを
抗原として製造した。抗体類をリンブロータイターチク
（Ｌｉｎｂｒｏ−Ｔｉ　ｔｅｒｔｅＪフローラボラトリ
イズ、イング／し＋７　’７ド（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏ−ｒ　ｉｅｓ　、Ｉｎｇｌ　ｅｗｏｏｄ　、　Ｃ
Ａ）プレート類、および、エングバール（Ｅｎｇｖａｌ
　ｌ　）　、Ｅ、およびパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ
）　、Ｐ、著「酵素結合免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）
、免疫グロブリンＧの定量分析」イムノケミストリイ（
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋）　８：　８７１−
８７４（１９７１）、に記載の検出系内において、共役
ペルオキソダーゼ抗体［ツイメド・ラボラトリイズ、バ
ーリンガム（２γｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｃ　−ｏｒｉｅ
ｓ　、　Ｂｕｒｌ　ｉｎｇａｍｅ　、　ＣＡ））を使用
し、固相分析法によって選別した。プレート類を、くぼ
みごとに精製ＶＩＩＩ：ＣＣ１００ｎで被覆した。この
研究に用いるために選別したクローンのＥＬＩＳＡ−陽
性培養上澄み液もまた血漿ｖｎｉ　：　ｃ活性を阻害し
た。

ｆｌｆＩｕヒトα−トロンビン（比活性２５３４φ〜、
最終濃度０．５　Ｕ／Ｌｌ）　ヲ、０−０４　Ｍ　Ｃａ
　Ｃ１２含有イミダゾ一ル生理食塩水緩衝液中に入れた
精製■Ｉ：Ｃ（最終濃度１６７μｆ／Ａｔ）に加えた。

対照部分には緩衝液のみを加えた。溶液を室温でインキ
ュベートシ、種々の時間間隔をあけて、ＶＩＬＩ　：　
Ｃ−トロンビン混合物試料を、トロンビンを迅速かつ非
可逆的に不活性化するためにρ−ＡＰＭＳＦ（カリフォ
ルニア・メディカル・ケミストリイＣ０９）の入った試
験管に採取した。ｐ−ＡＰＭＳＦの加水分解を最少限度
に止めるため、ストック溶液（１００ｍＭ／メタノール
溶液〕を、イミダゾール生理食塩水緩衝液によりＶＩＩ
Ｉ：Ｃ−トロンビン試料との反応の６０秒前に、１／１
０の比率で希釈した。最終的ｆｌｐＡＰＭＳＦ濃度は１
ｍＭであった。対照部分も、実験の初めにｐ　−ＡＰＭ
Ｓ　Ｆで同様に処理した。６０分間の時間的経過を終え
た時点で全てのＶｎＩ　：　Ｃ試料を文献記載の如く、
活性化部分的トロンボプラスチン時間分析法でｖ■：ｃ
活性に関して分析し、その後５ＤＳ−ＰＡＧＥの調製に
備えた。

５０５−ＰＡＧＡ　「方法Ａ」 不連続ｒｌ　ｓ　ｏ　ｓポリアクリルアミドスラブゲル
電気泳動法は、レムリイ（Ｌａｅｍｎｎ目）　、Ｕ、に
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２２ユ、６８０−６８
５．１９７０の方法に基いて行なった。「方法Ａ」を次
に示す：■、試料の調製 （１）タンパク試料（理想的にはタンパク５−６０μｆ
を含有するもの５０−１００μで）を試料緩衝液に対し
て一夜、室温で透析する、試料がカルシウムイオンを含
有する場合には、エチレンジアミン西酢酸（Ｅ　ＤＴＡ
　）　Ｉ　Ｑ　ｍＭを試料緩衝液中に含有させる。

（２）透析した試料を試験管に入れ、１／１０容量のｌ
Ｑ％ｓＤｓを加える。試験管をアルミニウム箔で被う。

試料を沸騰中の水浴中で１０分間加熱する。

（３）試料を水浴から出し、ｓｏｏｍＦｉ’ｌジチオト
レイットを１／１０容量、加える。これを５６℃で４時
間、インキュベートする。

（４）試料を室温まで放冷し、グリセリンストック溶液
およびブロムフェノールブルーストック染料溶液を最終
濃度がそれぞれ１０％および０．０５％になる櫟に加え
、ゲル上に重層するため調製する。

−馬ゲＪり鼠薦ヱ方風１−（脱イオン化した蒸留水使用
〕（１）グリセリンストック溶　：　５０％グリセリン
（２）フロムフェノールブルーストック染料ｒ゛　：０
．５％ブロムフェノールブルー （３１下層ゲルストック溶液ニドリス塩基１８．２ｆ、
１０％５０５４Ｒ１、最終容量を１００Ｉ１１１！にす
る。濃塩酸でｐ）ｌｓ、ｓに調節し、濾過する。

（４）上層ゲルストック溶液ニドリス塩基６．１ｙ、１
０チ５０５４　ａｔ、最終容量をＬＯＯｒｔｔｔにする
。

濃塩酸でｐＨを６．８に調節し、濾過する。

（５）区五１１１（二　Ｏ，ＯＩＭりん酸ナトリウム、
１．９％ＳＯ５、ｌＱｍＭニナトリウＡＥＤＴＡ。

最終容量を１１にする。水酸化ナトリウムまたはりん酸
を加えてｐＨを７．０に調節する。

（６）アクリルアミドストック　ｉ：　　アクリルアミ
ド３０ｆを水５０ｔｔｔｌに溶かし、ビスアクリルアミ
ドｏ、５１ｒＩＩｉを加えて溶）Ｗさせる。最終容量を
１００ｍ１に調製する。この溶液を濾過し、４℃で暗所
に貯蔵する。

（７）ストック用電極緩衝液：　トリス塩基３ｏ、３ｆ
、り＋）　シフ１４４．１　ｆ、最終容量を１ｅにする
。

（８）電極緩衝液：　ストック用電極緩衝液１００＃！
ｅ、水８９０ｄ、１０％５０５１０ｍＪ＊（９）ストッ
ク用りマシーブルー染料溶液：　１％クマシーブルーＲ
２５０を水中に入れたものを少なくとも約３０分間室温
で撹拌して溶解させ、濾過する。

チアンモニウムパーサルフエート、暗所に保管する。毎
週新らた（こ調製する。

■、ゲルの調製並びに操作ニアクリルアミドの最終濃度
＝７．５％ （１）下層ゲル溶液 下層ゲル、２０ｔｎｅ 下層ゲルストック溶液　　　　　　　　５．　Ｏａｌア
クリルアミドストック溶液５．　Ｏｒｔｔｌ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．Ｏａ／Ｎ、
Ｎ、Ｎ：Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）
　　０．００５ＩＬ１１０％アンモニウムパーサルフェ
ート０．１ｕｔｌ上層ゲ・し溶液 上層ゲル１０ｒｔｔｌ 上層ゲルストック溶液　　　　　　　　　２．５ｄアク
リルアミドストツク溶液　　　　　　１．　Ｏｙｔｌ水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．５
　ＩＩｄ！Ｎ、Ｎ、ｓ’、Ｎ’−テトラエチレンジアミ
ン（ＴＥＭＥＤ）０．０１ｘ１１０％アンモニウムパー
サルフェート０．０：Ｗ（３）方　法： ａ）１４．５　ＣＩＩＸ　９．ＯｃＩＩＸ　０．８ＩＩ
Ｅ＃ｌスラブゲルのためのスラブゲル装置を調製する。

この装置は標準的な電気泳動装置であって、例えば、ヘ
ラファー・サイエンティフィック・インストルメンツ（
Ｈ６ｅ−ｆｆｅｒ　５ｃｉｅｎｕｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ）す７７　ラフ　シスコ、カリフォルニア
から入手可能である。

ｂ）ＴＥＭＥＤおよびアンモニウムパーサルフェート以
外の下層ゲル成分を５０ｒｎｌの耐圧フラスコに入れ、
脱気する。次いでＴＥＭＥＤおよびアンモニウムパーサ
ルフェートを加えて静かに混合し、即座に下層ゲルを加
える。下層ゲルに水−飽和ブタノールを重層し少なくと
も１時間、好ましくは２〜６時間、そのままにして重合
させる。

リプタノール層を流し去り、下層ゲルの上面を完全な上
層ゲル混合物で洗浄する。（上層ゲル混合物は、上記の
下履ゲルと同様に、脱気し、ＴＥＭＥＤおよびアンモニ
ウムパーサルフェートを加えて調製する。〕 ｄ〕上層ゲルを注ぎ入れ、くしを上層ゲル内に、そのく
しの歯の底部と上層ゲル−下層ゲル界面との間隔が少く
とも１．０Ｇとなる深さまで入れる。

上層ゲル溶液で可能な限り一杯に満了。このゲルに通す
前、少なくとも１時間上層ゲルを重合させる。

ｅ）くシを取除くには、電極緩衝液を上層ゲルの上面に
ピペット注入した後、くシを静かに取去る。

、Ｌ層ゲル上面のくぼみを電型緩衝液を用いて数回洗浄
する。

ｒ〕作業のために装置を組立て、電極緩衝液を加える。

試料（類）を緩ＷＩ液層の下方の上層ゲルのくぼみに重
層して適用する。

、ｇ）乙のゲルを定電流で作動させる：試料が上層ゲル
にある間は８ミリアンペア、試料が下層ゲルにある間は
１５ミリアンペアである。

ブロムフェノールブルー染料の先端が下層ゲルの底面か
ら１．０ＣＩ＋１になった時点で電気泳動を止める。

■、ゲルの固定および染色 参考文献；フエアーバンクス（Ｆａｉｒｂａｎｋす、Ｇ
。

ステック（Ｓｔｅｃｋ）　、Ｔ、Ｌ、、およびウオール
アッハ（ＷａｌｌａｃＪ、Ｄ、Ｆ、Ｎ、、バイオヶミス
トリイ１０゜２６０６〜２６１７．１９７１゜ （１）ゲルを少なくとも１夜、密閉容器内で、２５チイ
ツプロバノール、１０％酢酸、１％クームシ−ブルース
トック溶液１０ｍ１を含有する最終容量を４００　ａｌ
に調節した溶液中で固定化する。

（２）次いで、ゲルを少なくとも１時間、１０％インプ
ロパツール、１０％酢酸および１％クームシ−ブルース
トック溶’４５．１．０　ａｇを含有する最終容量を４
００ｖｔｅに調節した液中に浸す。

（３）このゲルを変化が現われるか、あるいは完全に脱
染色されるまで約４時間、１０％酢酸中に浸漬する。

ｔ４１　コ（ｙ）脱染色ゲルを、対照を明確にするため
にゲル乾燥機を用いて戸紙上で乾燥させることができる
。

このゲルに５−２０９のタンパクを適用した。

ＶｎＩ　：　Ｃの陪値は還元フィブリノーゲン（Ｍｒ２
０ｏ、ｏ　ｏ　ｏ　）、ホスホリラーゼｂ（Ｍｒ９５，
０００）、ウシ血、ｆｆｌフルーｊ　ミ７　（Ｍｒ６８
，０００　）、ＩｇＧノＨｆｉ　（Ｍｒ　　５０，００
０　）およびオバルミン（Ｍｒ４３，０００）を標準と
し、移動距離に対して隆値を片対数表にプロットするこ
とによす、還元試料に関して算出した。

最終的なゲルの写真プリントによる走査並びに積分は、
ツアイネ（Ｚｅｉｎｅｈ）軟レーザースキャニング濃度
計を用いて行なった。

結果　純化ファクターＶＩＩ［：Ｃの比活性４認０００
単位／ｍｇであった。トロンビンによる純化■■：Ｃ活
性に対する賦活作用を６０分間のタイム・コースで分析
した。トロンビンを作用させる前の非処理ｖｎｉ　：　
ｃ試料ハ、Ｍｒ　＝　７９，０００−８０，０００にお
けるダブレット、ないしＭｒ　＝　１８８，０００　に
おけるバンドに至る特徴的なりｍ　：　ｃ型配列を示し
ていた。Ｍｒ　＝　１８８，０００　ＰＩ上の１個のバ
ンド、並びにＭｒ＝７９，０００以下の２個のバンドは
モノクローナル抗−ｖｉｎ　：　ｃ抗体免疫吸着剤と結
合しなかった。また、Ｍｒ＝７９，０００およびＭｒ＝
＝１８８．０００の間のバンドは抗−ｖｍ　：　ｃ抗体
と結合しなかった。

トロンビンによる賦活化タイム・コースの最初の５分間
で、這か９２，０００以上であるモノクローナル抗−Ｖ
ＩＩＩ：Ｃ抗体反応性バンドは、１個を除き全てが徐々
に消失し、５分後にｖｍ　：　ｃ活性が最高に達した時
点で検出されなくなった。

Ｍｒ　＝　１２２．０００　におけるバンドはいくつか
の実験においてのみトロンビン抵抗性を示したが、過剰
なトロンビン処理の後には、このバンドも、他のいかな
るバンドも固定化モノクローナル抗・ＶＩＩＩ：Ｃ抗体
とは反応しなかった。

Ｍｒ＝９２，０００におけるハントは、ＶＩＩＩ：Ｃ活
性が憎子につれて強くなった。Ｍｒ＝７９，０００およ
びｓｏ、ｏｏｏにおけるダブレットは　Ｍｒ　＝７１．
０００−７２，０００ダブレツトに変換されると思われ
、ｖｔｎ：ｃ活性の減少する５〜６０分の間では、後者
の形態が優勢であった。Ｍｒ＝５４，０００およびＭｒ
＝４４，０００の２個のバンドは５〜６０分の間に明確
に認め得る様になった。いくつかの実験では、Ｍｒ＝４
４，０００　バンドもまたダブレットのように見えた。

Ｍｒ＝７１，０００−７２，０００ダブレツト、Ｍｒ＝
５４，０００バンド並びにＭｒ　＝　４４．０００バン
ドは固定化モノクローナル抗−ＶＩＩＩ：Ｃ抗体によっ
ては有意な程度に除去されなかった。

上で議論したゲルの走査および積分の結果から、ポリペ
プチド濃度とＶｌｌｌ　：　Ｃ活性における変化との関
連性が考慮される。結果は表に示されている。

表かられかる様に、Ｍｒ＝９２，０００バンドはその濃
度が増加した後、ＶＩ［ｆ　：　Ｃ活性と並行して減少
した。このことは、Ｍｒ＝９２，０００バンドが、トロ
ンビンの賦活化作用でその濃度が増大された活外型ＶＩ
ＩＩ　：　Ｃに相当することを示唆している。陽＝５４
，０００およびＭｒ＝４４，０００バンドの濃度は、い
ずれも、１〜４０分の間、混合物の活性が減少した後で
さえも定常的に増加した。

Ｍｒ＝７９．０００　８０，０００ダブレツトの大部分
は、ＶＩＩにＧＣ活性ピークに達する最初の０．１〜１
０分間の間に失なわれ、他方、Ｍｒ＝＝７１，０００−
７２，０００　　ダブレットの大部分はこの期間に現わ
れ、ＶＩＩＩ：Ｃ活性か減少した際にも優勢であった。

これらのデーターは、〜Ｉｒ　＝　７１．０００−７２
゜０００ダブレツトがＭｒ＝７９，０００−８０，００
０ダブレツトから導かれたものであること、並びにＭｒ
＝　７１，０００−７２，０００　　ダブレット自身は
不活性であることを示唆するものである。また、この様
なデーターは、Ｍｒ＝７１，０００−７２，０００ダブ
レツトのＭｒ＝９２，０００ポリペプチドと複合体を形
成する能力が保持されている１、ということと矛盾しな
いものである：この複合体もまた活性を有するであろう
。

Ｍｒ＝９２，０００ポリペプチドがＭｒ＝７９，０００
−ｓｏ、ｏｏｏダブレットと複合体を形成していること
の直接的な証拠は、抗−ＶＩ［Ｉ　：　Ｃ：モノクロー
ナル免疫吸着剤を用いた実験から導かれる。モノクロー
ナル抗体はＭｒ＝９２，０００ポリペプチドでなく、Ｍ
ｒ＝７９，０００−８０，０００ダブレツトと優先的に
反応するということが初めて示された。即ち、このこと
は電気泳動転移実験において明らかにされた。次いで、
モノクローナル抗−免疫吸着剤は。

Ｍｒ　＝　７９，０００−８０，０００ダブレツトおよ
びＭｙ＝９２，０００ポリペプチドを共に溶液中から除
去することが示された。Ｍｒ＝９２，０００ポリペプチ
ドは、Ｍｒ＝７９，０００−８０，０００ダブレットヲ
結合させたままで、ｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　　ＥＤＴＡにより
抗−ｖｔｔｔ二Ｃ免疫吸着剤カラムから溶離することが
できた。

このダブレットは１．続いて３Ｍチオシアン酸ナトリウ
ムにより溶離された。以上の実験の結果は、Ｍｒ　＝９
２，０００ポリペプチドはＭｒ　＝　７９．０００−ｇ
ｏ、ｏｏｏダブレットと複合体を形成していたため実施
例■ 活性化蛋白質Ｃ（以下、［ＡＰｃＪというつで処理した
結果について記述する。ヒトの第Ｖｌ　：Ｃ因子を既述
した様にして純化した。ＡＰＣは、トロンビンからＡＰ
Ｃを分離するのにファルマシアのＦＰＬＣ系のモノＳカ
ラムを使用した以外はマー７−（Ｍａ　ｒ　ｌ　ａ　ｒ
）　＋　Ｒ−Ａ　、らの方法〔ブラッド（即匣）５９巻
、Ｌ０６７（１９８２）］、「トロンビン依年性抗凝固
酵素、ヒトの活性化蛋白質Ｃの作用機構」）に従って純
化した。

アッセイ 血友病Ａ血漿基質を用いた活性化部分的トロンボプラス
チン・タイムアッセイを使用して、前記の方法で試料の
ＶＬＩＩ：Ｃ活性を分析した。

電気泳動のための試料の調製 ＡＩ’Ｃ活性にはカルシウムイオ゛ンが必要であるノテ
、１０　ｔｔＭ　（７）　ＤＡＰＡ％含有シティる１０
０ｍＭＦ、ＤＴＡ　ノ１７ｔ　ｏ　容量　ヲ、ＶＩ［Ｉ
　：Ｃ十ＡＰＣ部分、対照■■二ＣおよびＡＰＣ部分に
加えることにより、種々の時間にＡＰＣを停止させた。

これらの部分標本に１／１０容」の１０％ドデシル硫酸
ナトリウムを添加した。次いで沸騰水浴中でそれらを５
分間加熱し、次いで前記した様に５ＤＳ−ＰＡＧＥで透
析した。

還元したＶＬＬＩ：Ｃの非連続ドデシル硫酸すｌ−Ｕウ
ム７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ　
Ｅ　）　−Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　　ブルーＲ２５０によ
る染色、ゲルの走査および積分は既述した様に行なった
。

試料調製 ０．３Ｍ塩化カルシウムを含有しているＶＩＩＩ：Ｃ緩
衝液０．３　ａｔ中のＶＩＩＩ：Ｃの試料３３９　ｔｔ
９を緩衝液（５０ｍＭトリス−クロリド、０．１５Ｍ塩
化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、０．０２％ナト
リウムアジド、ｐＨ７，４）に対して一夜透析した。こ
の透析したＶＩＩＩ　：　Ｃ試料に、緩衝液１．０９５
ｄ、ウサギ脳ケファリン９０μｌ（シグマ・ケミカルＣ
ｏ、、セントルイス、ＭＤ、製造業者の指示通り復元し
、貯蔵し、融解した）、および１ｍＭダンツルアルギニ
ンＮ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル〕アミド
（ＤＡＰＡ　）１５μｌを加え、最終１）Ａ　Ｐ　Ａ濃
度を１０μＭとした。１０μＭのＤＡＰＡ（ＩＡＰｃを
有意に阻害しないので、このＤＡＰＡＩ；！ＡＰＣに存
在する痕跡量のトロンビンを阻害するため番こ含ませた
。試料の最終容量は１．５に／？、最終Ｖｌｌｌ：Ｃ濃
度は２２６　ａ　ｆｊ／ＷＬｚであった。

コノ１．５　ａｔｌＯ’）Ｖｌｉｌ　：　Ｃ試料カラ４
００　ｔｉｅ　ヲＮ’）、対照とした（ｖｍ：　ｃと呼
ぶ〕。残りの１．１　ｄにＡＰＣ２０μｅ（１０μｙ）
を加え、最終ＡＰｃ　濃度を９μに窮とした（　Ｖｕｌ
　：　Ｃ＋ＡＰＣ：と呼ぶ）。

ｖａｔ　：　ｃを除いて全ての成分を同じ濃度で含有し
ている第２の対照試料を調製した（ＡＰＣと呼ぶ）。

ＶＩＩＩ：Ｃ単独、ｖｔｎ：ｃｇよびＡＰＣ（７）８合
物、ＡＰＣ単独を３７℃の水浴に入れ、一定のタイム・
ポイントで試料の一部を取り、５０５−ＰＡＧＥおよび
／またはｖｍ：Ｃ活性を分析した。また、長時間３７℃
でインキュベートした後１合成基質ｓ　−２２３８の加
水分解で活性を保持したＡｒｃを、対照において測定し
た。

結果 純化ｖｎｉ　：　ｃをＡＰＣで消化すると、対照のＶＩ
ＩＩ：Ｃ活性のほぼ８５％が失なわれた。、ｖｕｔ　：
　Ｃ活性のＡＰＣ非活性化により１μｌが９２，０００
−１８８゜０００の全てのＶＩＩＩ：Ｃポリペプチドが
減退し、陽＝４５，０００のポリペプチドが生成し、−
万Ｍｒ＝＝７９−８０，０００のダブレットはそのまま
残った。

ＡＰＣによる、純化ｖｔｕ　：　ｃの一定時間経過の非
活性化により、３６０分間に渡ってｖｍ：　Ｃ活性が減
少するに従って、特異ｒ、（ＶＩＩＩ：Ｃ：ポリペプチ
ドが次第に減少することかわかった。ゲルを走査および
積分することにより、Ｍｒ　＝　１８８．０００のポリ
ペプチドおよびＭｒ＝９２，０００のポリペプチドがＶ
Ｌ［Ｉ：Ｃ活性と平行して減少していくことがわかった
。

中間的な隣のもう１つのポリペプチドはＡＰＣにより開
裂されたか、ゲル走査により容易に定量されなかった。

この実験では、ＡＰＣによる消化らしクナク、Ｍｒ　＝
９２，０００−１８８，０００のある種のｖｎｉ　：　
ｃポリペプチドはＡＰＣ消化に抵抗した。

しかし、Ｍｌ−＝　７９−８０．０００のダブレットポ
リペプチドは、ＡＩ’Ｃよる消化の場合の様に、ＡＰＣ
により蛋白質分解を受けなかった。

Ｍｒ＝４５，０００のポリペプチドは、　Ｍｒ　＝　１
８８゜０００および９２，０００のポリペプチドの減少
につれてその濃度が増加する様であり、これは前者のポ
リペプチドが後者のポリペプチドの分解フラグメントで
あることを暗示している。クーマシーブルーの染色では
、その他の消化生成物は観察されなかった。

実施例■に示した禄に、ＶＩＩＩ　：　Ｃのトロンビン
活性化の間、Ｍｒ＝９２，０００のポリペプチドは、ｖ
ｎｉ　：　Ｃ活性と平行して増減した。Ｍｒ　＝　９２
，０００のポリペプチドの蛋白分解とＶｌｌｌ：Ｃ活性
の消失との間に直線関係が存在するかどうかを調べるた
めに、この時間経過による非活性化実験のデータｒ−，
，３１０’ｙトし、ＶｔＬにＧ活性チ対Ｍｒ　＝　９２
，０００のポリペブチトチを調べた。Ｖｌｌｌ：Ｃ活性
の量は、Ｍｒ＝９２，０００のポリペプチドの量に比例
している様であった。

本発明のもう１つの目的は、ファクター■■：Ｃと、α
−トロンビンの様なプロテアーゼとの反応によって形成
される各種のポリペプチドに対して、予想し得ないこと
であるが、特異なモノクローナル抗体を提供することに
ある。それぞれの抗体は、トロンビンまたは等価なプロ
テアーゼで活性化も消化もされていないヒトの第ｖｔｎ
　二ｃ因子と反応する。これらの抗体は、以下に述べる
様な個々の性質によって特徴づけられる。

＾）１つは、ここに記載したＭｒ＝９２，０００のポリ
ペプチド、Ｍｒ＝１０８，０００　およびそれ以上のポ
リペプチド、および終末−トロンビン消化物中に存在す
るＭｒ＝４４，０００のポリペプチドと反応する二それ
は、ここに記載したＭｒ　＝７９，０００−ｓｏ、ｏｏ
ｏのダブレットを示すポリペプチドとも、ここに記載し
たＭｒ＝７１，０００−７２，０００のダブレットを示
すポリペプチドとも反応しない。

（Ｂｌ　１−）は、ここに記載したＭｒ＝９２，０００
のポリペプチド、Ｍｒ　＝　１０８，０００　およびそ
れ以上のポリペプチド、および゛終末トロンビン消化物
中に存在するＭｒ＝５４，０００のポリペプチドと反応
する。それは、ここに記載したＭｒ＝７９，０００　−
ｓｏ、ｏｏｏのダブレットを示すポリペプチドとも、こ
こに記載したＭｒ　＝７１，０００−−７２，０００（
７）ダブレットを示すポリペプチドとも反応しない。

（Ｃ）１ツは、Ｍｒ＝７９，０００−８０，０００（７
）ダブレットおよびＭｒ　＝　１０８．０００およびそ
れ以上のポリペプチドと反応するが、Ｍｒ＝９２，００
０のポリペプチド、Ｍｒ−＝７１，０００−７２，００
０．Ｍｒ＝５４．０００　、Ｍｒ＝４４，０００のポリ
ペプチドとは反応しない。

１Ｄ）ｌ）は、Ｍｒ＝１０８，０００　およびそれ以上
のポリペプチドとのみ反応下る。

これらの抗体はそれぞれ、他のポリペプチドをも含んで
いる混合物から、前記のコンプレックスを濃縮するため
に使用することができる。この様な混合物の１つは、ヒ
ト第ｖｎｔ：ｃ因子をα−トロンビンまたは等価なプロ
テアーゼで部分的に消化することにより製造される。も
う１つのこの様な混合物は、組み換えＤＮＡ技術（この
場合、所望のポリペプチドまたは複合体（コンプレック
ス）は微生物によって発現され、混合物から他の蛋白質
様化合物と共に回収されなければならない〕によって製
造されるというわけではない。抗体四、ＩＢＩ、ｔｃｌ
またはｔＤ＋、あるいはこれらの２つ、３つまたは全て
を組み合せたものを実施例１に記載した様にして免疫吸
着剤に付着させることができ、コンプレックスを含んで
いるポリペプチドを含有している混合物の充填液をカラ
ムに通す。充填溶液中に存在するＭｒが９２，０００お
よび７９，０００−８０゜０００　であるポリペプチド
がカラムに吸着され。

このカラムから、もとの溶液をカラムから洗い流した後
、前記の様にしてこれらのポリペプチドを溶出させるこ
とができる。得られた溶出液は、所望の活性化Ｖｎｌ　
：　Ｃコンプレックスについて、充填液とくらべてａ縮
されている。

この新規な抗体は、ヒトＶＩＩＩ：Ｃとトロンビンまた
は他のプロテアーゼとの反応があったかどうかを検出す
るための、分析の目的にも有用である。

というのは、これらの抗体は、その反応の生成物と反応
する能力かあるからである。挙動ｔＢｌを持った抗体お
よび挙動ＩＣ）を持った抗体は、いづれかが第■Ｉ：Ｃ
因子と結合すると、ＶＩＩＩ　：　Ｃ凝固活性を中和す
ることかわかった。この性質は、血友病関連障害の診断
に有用である。

これらの抗体の発見により、ここに記載したポリペプチ
ド複合物の成分を更に特性化することかできる。即ち、
Ｍｒ＝９２，０００のバンドを示すポリペプチドは、ト
ロンビン消化によって破壊されず＋　Ｍｒ　＝　７９．
０００　８０，０００のダブレットを示すあるいはＭｒ
＝７１，０００−７２，０００のグブＬ／’７トを示す
ポリペプチドには存在しない（少なくとも）２つのエピ
トープ（即ち抗体結合部位）を含んでいる。これらのエ
ピトープの内の１つはＭｒ＝　４４，０００　のポリペ
プチドの上にも存在し、他方はＭｒ＝５４，０００のポ
リペプチドに存在するっ即ち、Ｍｒ　＝　５４．０００
およびＭｒ　＝　４４．００．０のポリペプチドはＭｒ
＝９２，０００のポリペプチドから誘導される。また、
Ｍｒ＝９２，０００およびｕｒ　＝７９，０００−８０
，０００　のポリペプチドは、共通の前駆体（群）から
誘導される。第ｖｎｉ　：　ｃ因子凝固活性を中和する
挙動（司およびＩｃ＋を示す抗体の発見は、Ｍｒ＝９２
，０００およびＭｒ　＝　７９．０００−ｇｏ、ｏｏｏ
のポリペプチドが凝固機能に重要であることを支持シテ
ィる。Ｍｒ　＝　７９．０００　８０．０００のダブレ
ットを示すポリペプチドは、トロンビン消化によって破
壊される。そしてＭｒ＝９２，０００のポリペプチドに
は存在しないエピトープを含んでいる。

これらのモノクローナル抗体は、ヒト第■：Ｃ因子の一
般的な精製工程によって製造することができる：即ち、
純化ＶｎＩ　：　Ｃに対するモノクローナル抗体を生成
させ、純化ｖｍ　：　ｃを部分的に消化、活性化して前
記のポリペプチド複合物を生成せしめ、特異なポリペプ
チドを同定し、抗−ＶＩＩＩ：Ｃ抗体を活性化生成物と
反応させ、それが反応したポリペプチド（群）を同定す
ることによりその抗体を特性化する。この一連の操作は
実施例■で詳細に述べる。あるいはまた１部分的トロン
ビン消化生成物から、所望の特定のポリペプチドを分離
することにより抗体を製造することもできる。

例えば、所望のポリペプチドと反応することが知られて
いるモノクローナル抗体をカップリングさせたアガロー
スを入れたカラムに免疫吸着させ、次いで溶出し、実施
例Ｉに記載の方法でそのペプチドに対するモノクローナ
ル抗体を高める。

実施例■ ヒト第Ｖ■【二〇因子に対するモノクローナル抗体は、
米国特許第４，３６１，５０９号に記載の方法によって
製造された高純化Ｖｌｎ：Ｃを用いて、以下の手法によ
って生成させた。

以下の方法に従って、高純化第ＶＩＩＩ：Ｃ因子をマウ
スに注射した。初日に、０．０５Ｍ１−リス、０．１５
Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、１ｍ
Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド、トラクロー
ル１０単位／ａｌｌを含んでいる−７．３の緩衝液０．
１　ｒｔｔｌにこの蛋白質１０μｆを溶解（または懸濁
）し、同容量のフロイントの完全アジュバントを加えて
振数することにより調製した組成物をマウスに腹腔内注
射した。１４日目に、フロイントの完全アジュバントの
代すにフロイントの不完全アジュバントを用いるほかは
上に記載したものと同じものを再びマウスに注射した。

２１日目には、１４日目の注射をもう１度行なった。

３８日目に、純化ＶＬＩＩ　：　Ｃだけを注射した。４
２日目に、マウスの胛臓を摘出し、Ｊ、Ｐ、ブラウン（
Ｂｒｏｗｎ）らの標準的手法（ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリイ、２２５巻、ＰＰ　　４９８
０−４９８３（１９８０）、「モノクローナル抗体によ
る免疫沈殿によって同定される正常および悪性のヒト細
胞の蛋白質抗原」）に従って融合した。この標準的手法
に於いて、５０％ポリエチレングリコールの代りに３５
チポリエチレングリコール１０００を用いたことが唯一
の変更点であった。

実施例Ｉの「ＶＩ［Ｉ：Ｃに対するモノクローナル抗体
の製造」の項に記載した分析法を使って抗体を選択した
。ただし、ｖＩＩＩ：Ｃ活性を中和しなかつた抗体もサ
ブクローンし、以下の如く処理した。

陽性であったクローンを２回サブクローンし、ＶＩｎ　
：　Ｃに対する抗体を産生する安定なりローンを、細胞
の注射を行なう少なくとも４日前）こプリスタン０．５
コを腹腔内に入れて予め処置したＢａ１ｂ／Ｃマウスの
腹膜腔に注射した。バイブリド−７細胞を、牛胎児血清
を含まないデルベツコ（Ｄｅｌｂｅｃｃｏ）の改良イー
グル培地０．５　ｒｒｔｌｆ中、マウス当たり約５×１
０６細胞の濃度で注射した。むくんできたらマウスを穿
刺し、腹水を約１０単位／　ａｅでヘパリン中に集めた
。複数のマウスからの腹水を合わせ、モノクローナルＩ
ｇＧの単離に都合の良い量とした。

５０％硫酸アンモニウムを使って腹水から抗体を沈殿さ
せ、更に２回再沈殿させた。この様にして生成せしめた
前記のｔＢｌ、ｔｅｌおよび１０１に相当する抗−ＶＩ
■：Ｃ抗体はアガロースビーズに結合され、溶液からの
純化Ｖｌｌｌ：（：と結合することか示された。

■Ｉ■：Ｃの別のバッチ、１つは非処理、１つはトロン
ビン蛋白分解にかけたものを実施例Ｉに記載した５ＤＳ
−ＰＡＧＥ工程で分析した。次いで各バンドを電気泳動
法的に（ウェスタン転移〕、ゲルからニトロセルロース
片に転移させた。使用した装置はバイオラッド（Ｂｉｏ
　−Ｒａｄ）　ｒ　）ランス−プロット（Ｔｒａｎｓ　
−ＢｌｏすＪ−４ｒル（ｃｅｌｌ）およびｌ＜イネ−ラ
ッドモデル１６０．１．６動力供給（バイオーラツドラ
ポラトリイズ、リッチモンド、カリフォルニア）であっ
た。転移緩衝液は、　ｐＨ８，３，２０多メタノ一ル番
こ加えたグリシンを含む２５ｍＭトリスであった。転移
は９０ボルト、１０ミリアンペアで１６−２４時間行な
った。

抗体のそれぞれと反応させた特定のポリペプチドは、Ｗ
、Ｍ、バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）の採用した方法
、［ウェスタン・プロッティング」〔アナリテイカル・
バイオケミストリイ（Ａｎａｌ　ｙｔ　ｉｃａｌＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１１２巻、１９５−２０３頁（
１９８１）、「ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲルから非改良ニトロセルロースへの電気泳動法に
よる蛋白質の転移および抗体並びに放射性沃素化蛋白質
Ａを用いたＸ線撮影」〕を用いて決定した。

「緩衝液１）」は１０ｍＭトリス・クロライド２０、１
５　Ｍ　ＮａＣｌ　、　ｏ、０２％アジ化ナトリウム、
ｐＨ７，４であった。

１、緩衝液０１００ｍｌ！と０．２５％ゼラチンを含ん
でいる皿に、転移した蛋白質を持ったニトロセルロース
シート（キ）を入れる。この皿を回転振盪器の」二に置
き、ゆっくりと３０分間振盪させる。

２、この皿にモノクローナル抗体を添加する（０６１〜
１チの腹水または純化１ｇＧ１”Ｐ）。１２０分間振盪
する。

３、ニトロセルロース片を次の様にして洗浄するｔａｌ
緩衝液Ｄ１００ＩＩＬｌで１０分間。

ｔｂｌ緩衝液Ｄ１００ＩＩＬｌ詔よび０．０５％のＮｏ
ｎ１ｄｅｔ−Ｐ−４０で３０分間、１０および２０分で
かえる。

ｔＣ１緩衝液Ｄ１００ＨＬｌで１０分、４ｏ緩衝液り十
０．２５％ゼラチンおよび１１２１ｉ標識純化ウサギ抗
−マウスＩｇＧ中にニトロセルロース片を３０分間浸す
。

５、ニトロセルロース片を次の様にして洗浄するｔａｌ
緩衝液Ｄ１００Ｒ１で１０分間。

ｔｂｌ緩衝緩衝液中０．１　Ｃ４Ｎｏｎ１ｄｅｔ　ｐ−
４０および０．５Ｍ　ＮａＣ１１００Ｒｅで１６−２４
時間。

ｔｃ）緩衝液Ｄ１００ｍｌで１０分間。

６、ニトロセルロース片を２枚の２紙にはさんで吸い取
り、このニトロセルロース片を密封プラスチック袋に入
れて保存する。

７、どの抗体とポリペプチド類が反応したかを調べるた
めに、 ｔａ）文献に記載されている既知の標準的手法により、
ニトロセルロース片のオートラジオグラフを調製する。

ｌｂｌこのオートラジオグラフを、ＶＩＩＩ　：　Ｃを
転移させたがモノクローナル抗体と反応させる代りに、
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ブルーＲ２５０で染色したニトロ
セルロース片と比較する。

これらの手順により、以下の個々の抗体か生成したこと
がわかった。

Ｍｒ＝９２，０００のポリペプチド、Ｍｒ＝１０８，０
００およびそれより大きいポリペプチド類、終末トロン
ビン消化物中に存在するＭｒ＝５４，０００または４４
．０００のポリペプチド類の一万または他方、と反応し
た４つの抗体、その他のポリペプチドはなし。このこと
は、後者の２つのポリペプチド類の起源は、Ｍｒ＝９２
，０００のポリペプチドのトロンビン開裂から来ている
ことを示している。これはまた、Ｍｒ＝９２，０００の
ポリペプチド上の２つのエピトープはその開裂に生き残
ったこと、およびこれらのエピトープはＭｒ　＝７９，
０００−８０，０００ダブレツト上に存在しないことを
示している。

５番目の抗体はＭｒ＝７９．０００　８０，０００のダ
ブレットおよびＭｒ＝１０８，０００　およびそれ以上
のポリペプチド類と反応したか、Ｍｒ＝９２，０００の
ポリペプチドおよび終末トロンビン消化物中に存在する
ポリペプチドのいずれとも反応しなかった。このことは
、Ｍｒ＝７９，０００−８０，０００のダブレットはＭ
ｒ＝９２，０００のポリペプチド上に存在しないエピト
ープを持っていること、およびそのエピトープはＭｒ　
＝　７９，０００−８０，０００のダブレットのトロン
ビン消化により破壊されることを示している。

これら５つの抗体の反応挙動は、Ｍｒ＝９２，０００お
よびＭｒ　＝　７９．０００　８０．０００のポリペプ
チドが、共通の前駆体（群）から導かれることを示して
いる。

第６番目の抗体は、Ｍｒ　＝　１０８．０００およびそ
れ以上のポリペプチド類とだけ反応した。

これらの抗体の１つまたはそれ以上の生物学的製剤を調
製または貯蔵するには、相当するモノクローナルＩｇＧ
を、ヘパリン化した収集腹水から、収集後直ちに分離し
てもよいし、あるいは、その貯蔵溶液の冷凍部分を融解
してもよい。新しい試料であるか冷凍した試料であるか
に関係なく、この溶液は４℃にして、同容量の燐酸緩衝
食塩溶液（ｐＢｓ）（ｐｕｓ　：１．６　ｆ燐酸ナトリ
ウム、−塩基一水和物：８．４ｇ燐酸すｌ−ＩＪウム、
二塩基無水物；６１．４ｙ塩化ナトリウム：水を加えて
７　ｌ！；　ＰＨ７，２）で処理する。この希釈した腹
水は、４℃で撹拌下に滴加することにより沈殿する。遠
心分離は、好ましくは１４．００Ｏｒｐｍで６０分間（
３０゜ｏｏＯｘ４）で行なう。腹水の上澄液を更にＳＡ
Ｓて２回沈殿させ、沈殿と上澄液の混合物を撹拌し。

第１回目のサイクルと同様にして遠心分離する、３回目
の沈殿から得たペレットを希釈した腹水と同じ口のＰＢ
Ｓに再懸濁し、ＰＢＳに対して徹底的に透析する。透析
袋中に現れた凝固物は２０℃で遠、心分離して除去する
。透析したＩｇＧを、室温で、５チ水酸化アルミニウム
水溶液と共に撹拌して吸着させ、吸着後２０℃で遠心分
離する。この吸着処理を、第１回目以降は２．５％水酸
化アルミニウム溶液を用いて少なくとも更に３回くり逗
子。この吸着させたＩｇＧを４℃にし、上記した様にＳ
ＡＳで１回再沈殿させる。この沈殿させたペレットは、
使用するまで一２０℃で貯蔵することができろうモノク
ローナル抗体類を精製し、それらを含有している生物学
的製剤を保持するための２つの好ましい方法がＰ、、Ｌ
、ＥＹ　ら（イムノケミストリイ、１５巻、４２９−４
３６頁、「蛋白質Ａ−セファロースを用いたマウス血清
からの純化１　ｇＧｌ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ免
疫グロブリン類の分離」およびＣ。

ブラック（Ｂｒｕｃｋ）ら〔ジャーナル・オブ・イムノ
ロシカ／Ｌ／−メソツズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｍｅｔｈ　−ｏｄす、５３巻、３１３−３１９頁
（１９８２）、［ＤＥＡＥアフイーゲル−ブ／ｌ／　−
（Ａｔ　ｆ　１−Ｇｅｌ　Ｂｌ　ｕｅ）クロマトグラフ
ィーによる腹水からのマウスモノクローナル抗体の一工
程精製法」〕によって記載されている。

本明細書に記載し、特許請求の範囲で定義した発明の思
想並びに範囲から離脱することなく、本発明に様々な修
飾を施丁ことができるということは、当業者ならば理解
し得ることであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量が約９２，０００であつて、式：【アミノ酸
   配列があります】 （式中、ＸおよびＹはアミノ酸を表わす） で示される部分的なタンパク質アミノ酸配列を有する、
   活性な第VIII：Ｃ因子凝固ポリペプチド。 ２、アミノ酸ＸおよびＹが、それぞれＡＬＡおよびＳＥ
   Ｒである特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ３、式： ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＴＹＲ−ＴＹＲ−Ｌ
   ＥＵ−ＧＬＹ−ＡＬＡＶＡＬ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＳＥＲ
   −ＴＲＰ−ＡＳＰ−ＴＹＲ−ＭＥＴ−ＧＬＮで示される
   活性な凝固ポリペプチド。 ４、分子量が約７９，０００〜８０，０００であつて、
   式： Ｚ−Ａ−ＧＩＮ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−Ｈ
   ＩＳ−ＴＹＲ−ＧＬＹ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＶＡ
   Ｌ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−Ｂ−ＴＲＰ−ＡＳＰ−ＴＹＲ−Ｇ
   ＬＹ−ＭＥＴ−Ｃ−Ｄ−ＧＬＵ−Ｅ （式中、Ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥはアミノ酸を表わ
   す） で示される活性な、部分的タンパク質アミノ酸配列を有
   する、活性な第VIII：Ｃ因子凝固ポリペプチド。 ５、Ｚ、Ｃ、ＤおよびＥがそれぞれＳＥＲ、ＳＥＲ、Ｓ
   ＥＲおよびＰＨＥである特許請求の範囲第４項に記載の
   ポリペプチド。 ６、式： ＳＥＲ−Ａ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＴＨＲ−ＡＲＧ
   −ＨＩＳ−ＴＹＲ−ＧＬＹ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−
   ＶＡＬ−ＧＬＶ−ＡＲＧ−Ｂ−ＴＲＰ−ＡＳＰ−ＴＹＲ
   −ＧＬＹ−ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＰＨＥ （式中、ＡおよびＢはアミノ酸を表わす） で示される活性な凝固ポリペプチド。 ７、特許請求の範囲第４項に記載のポリペプチドからト
   ロンビン−誘導され、分子量が約７１，０００〜７２，
   ０００の範囲内であり、実質的に上記第４項記載の部分
   的タンパク質アミノ酸配列を有する第VIII：Ｃ因子凝固
   ポリペプチド。 ８、特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチドからト
   ロンビン−誘導され、分子量が約４４，０００である第
   VIII：Ｃ因子凝固ポリペプチド。 ９、特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチドからト
   ロンビン−誘導され、分子量が約５４，０００である第
   VIII：Ｃ因子凝固ポリペプチド。 １０、実質的に特許請求の範囲第１項および第４項に記
   載のポリペプチドからなる、活性な第VIII：Ｃ因子凝固
   ポリペプチド組成物。 １１、実質的に特許請求の範囲第１項および第７項に記
   載のポリペプチドからなる、活性な第VIII：Ｃ因子凝固
   ポリペプチド組成物 １２、実質的に特許請求の範囲第１、第４および第７項
   に記載のポリペプチドからなる、活性な第VIII：Ｃ因子
   凝固ポリペプチド組成物。 １３、実質的に特許請求の範囲第２および第５項に記載
   のポリペプチドからなる、活性な第VIII：Ｃ因子凝固ポ
   リペプチド組成物。 １４、実質的に特許請求の範囲第３および第６項に記載
   のポリペプチドからなる、活性な凝固ポリペプチド組成
   物。 １５、特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチドと不
   活性な担体とを含む生物学的製剤。 １６、特許請求の範囲第４項に記載のポリペプチドと不
   活性な担体とを含む生物学的製剤。 １７、特許請求の範囲第１および第４項に記載のポリペ
   プチドと不活性な担体とを含む生物学的製剤。 １８、特許請求の範囲第１および第７項に記載のポリペ
   プチドと不活性な担体とを含む生物学的製剤。 １９、特許請求の範囲第１、第４および第７項に記載の
   ポリペプチドと不活性な担体とを含む生物学的製剤。 ２０、１８００単位／ｍｇ以上の凝固比活性を示す特許
   請求の範囲第１５項に記載の生物学的製剤。 ２１、特許請求の範囲第８項に記載のポリペプチドと不
   活性な担体とを含有する生物学的製剤。 ２２、特許請求の範囲第９項に記載のポリペプチドと不
   活性な担体とを含有する生物学的製剤。 ２３、１８００単位／ｍｇ以上の凝固比活性を示す特許
   請求の範囲第１６項に記載の生物学的製剤。 ２４、１８００単位／ｍｇ以上の凝固比活性を示す特許
   請求の範囲第１７項記載の生物学的製剤。 ２５、血友病に関連した凝固異常の治療に用いるための
   、特許請求の範囲第１３、１４、１５、１６または１７
   項に記載の生物学的製剤。 ２６、第VIII：Ｃ因子から特許請求の範囲第１、第４、
   第７、第８および第９項に記載の各凝固ポリペプチドを
   調製する方法であつて、 ａ）有効量のプロテアーゼを含有する消化混液中におい
   て、消化条件下、ヒト第VIII：Ｃ因子を消化することに
   より、各凝固ポリペプチドを形成させ； ｂ）各凝固ポリペプチドが消化混液中に存在している間
   にａ）工程の消化を中断し、そしてｃ）この様にして生
   産されたポリペプチドを分子量に従つて単離することか
   らなる方法。