DE3689734T2

DE3689734T2 - Gereinigter immunoglobulinbezüglicher Faktor, monoklonale Antikörper, Hybridoma-Zellinien, Verfahren und Verwendungen.

Info

Publication number: DE3689734T2
Application number: DE3689734T
Authority: DE
Inventors: Guy Prof Dr Delespesse
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1985-06-11
Filing date: 1986-06-05
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2006-06-06
Also published as: JPH08110338A; JPH1099074A; DE3689734D1; EP0205405A3; JP2852918B2; DK273186D0; EP0205405B1; IE61820B1; JPS61289100A; US4946788A; EP0205405A2; JP2764019B2; JPH07107079B2; IE861543L; DK273186A

Description

Die Erfindung betrifft neue gereinigte, menschliche Immunglobulin E-Bindungsfaktoren (IgE-BFs), deren einzelne ggf. glycosylierte Proteine und Fragmente davon, Verfahren zur Reinigung der IgE-BFs, neue monoclonale Antikörper gegen lymphocytäre zelluläre Rezeptoren für IgE (Fc&epsi;R), die mit den IgE-BFs eine Kreuzreaktion zeigen, Derivate davon, Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper und ihrer Derivate, Hybridomazellinien, diese die Antikörper produzieren, Verfahren zur Herstellung der Hybridomazelllinien, die Verwendung der monoclonalen Antikörper und ihrer Derivate zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgE-BFs, Testkits, die die monoclonalen Antikörper und/oder ihre Derivate enthalten, die Verwendung der monoclonalen Antikörper zur Reinigung von IgE-BFs, die Verwendung der gereinigten IgE-BFs, ihrer einzelnen, ggf. glycosylierten Proteine und/oder Fragmente davon zur Verhütung und/oder Behandlung von allergischen Erkrankungen, und sie enthaltende pharmazeutische Präparate.

Hintergrund der Erfindung

Allergische Erkrankungen sind immer noch ein Hauptgesundheitsproblem infolge ihrer hohen Häufigkeit (20 bis 30% der Bevölkerung) und infolge des Fehlens einer Heilbehandlung. Üblicherweise ist die Therapie auf die Verwendung von Antihistaminen oder auf mehr oder wenige wirksame Immunisierungsverfahren beschränkt. Die klassischen antiallergischen Arzneimittel besitzen bestimmte Nachteile, insbesondere da sie verschiedene Nebenwirkungen bei dem behandelten Patienten hervorrufen. Das Immunisierungsverfahren ist auf ein oder zwei Allergene beschränkt, wohingegen die meisten Patienten auf eine große Anzahl von Allergenen sensibel sind. Zusätzlich ist die Hyposensibilisierungsbehandlung weder eine Heilbehandlung noch eine Schutzbehandlung.
Die große Mehrheit der allergischen Erkrankungen wird durch Immunglobulin E (IgE)-Antikörper gegen eine Vielzahl von Luftallergenen, z. B. Pollen, Tierschuppen oder Hausstaubmilben etc., Lebensmittelantigene, pharmakologische Mittel, z. B. Penicilline, oder Hymenopteragift vermittelt. Die Mechanismen, die die Produktion von IgE regulieren, wurden an Labortieren ausgiebig untersucht [K. Ishizaka, Ann. Rev. Immunol. 2, 159 (1984)]. Diese Studien zeigten klar das Vorhandensein von nicht-antigenspezifischen, aber IgE-isotypspezifischen Mechanismen, die die Produktion von IgE in Tiermodellen kontrollieren. Die Effektormoleküle für diese regulatorischen Mechanismen wurden als IgE-Bindungsfaktoren (IgE-BFs) infolge ihrer Affinität für IgE bezeichnet. IgE-BFs können in IgE-Suppressorfaktoren (IgE-SFs) und IgE-Verstärkungsfaktoren (IgE-PFs) eingeteilt werden: Diese Moleküle unterscheiden sich nur durch ihren Kohlenhydratgehalt. IgE-SFs sind nicht glycosyliert oder weniger glycosyliert als die entsprechenden IgE-PFs. Die tatsächliche Produktion von IgE in Tiermodellen wird durch das Verhältnis zwischen diesen zwei Arten an IgE-BFs bestimmt.
Die gleichen Zellen können entweder IgE-SFs oder IgE-PFs in Abhängigkeit von dem Einfluß von entweder die Glycosylierung hemmenden oder verstärkenden Faktoren, die von getrennten regulatorischen T-Lymphocyten-Subpopulationen sezerniert werden, sezernieren.
M. Sarfati et al. [Immunology 53, 197, 207, 783 (1984)] dokumentierten das Vorhandensein von menschlichen B-Zell- Linien, die IgE-BFs, die mit den gleichen biologischen Aktivitäten wie die, die bei Nagern beschrieben wurden, ausgestattet sind, sezernieren. Andere Forscher beschrieben die Produktion von IgE-BFs durch die menschlichen T-Zellen [T.F. Huff und K. Ishizaka, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 1514 (1984)] und Ratte/Maus-T-Zellhybridome [Europäische Patentanmeldung 155 192]. Die Beziehungen zwischen den IgE-BFs aus T-Zellen und denjenigen aus B-Zellen sind nicht bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt nun IgE-BFs aus menschlichen B-Zellen in hochgereinigter Form bereit.
Es ist bereits bekannt, daß Stillen die Immunreaktivität des Neugeborenen ändern kann. Jüngste prospektive Studien zeigten weiter an, daß ausschließliches Stillen Kinder mit hohem Risiko vor allergischen Erkrankungen schützt. Mehrfache Mechanismen werden zur Erklärung dieser Beobachtungen herangezogen: (i) Eine verringerte Exposition gegenüber fremden Lebensmittel-Antigenen, (ii) der Schutz durch die blockierenden IgA-Antikörper aus der Milch, die für verschiedene Lebensmittel-Antigene und andere Umwelt- Antigene spezifisch sind, (iii) der Schutz gegen übliche virale Erkrankungen, die bekanntlich das Einsetzen allergischer Erkrankungen triggern, und schließlich (iv) das Vorhandensein von immunregulatorischen Faktoren mit der Fähigkeit, das unreife Immunsystem des Neugeborenen zu modulieren in der menschlichen Milch [5.5. Crago und J. Mestecky, Surv. Immunol. Res. 2, 164 (1983)]. Die gut dokumentierte Beobachtung zur Immunreaktivität gestillter Neugeborener könnte durch das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern oder Idiotypen, immunregulatorischen Faktoren oder regulatorischen Lymphocyten im menschlichen Colostrum erklärt werden. Es wird daher vorgeschlagen, daß Stillen Neugeborene schützen könnte, indem es sie mit entweder IgE- Suppressorfaktoren oder mit anderen Molekülen (wie einem Glycosylierungshemmfaktor) oder Zellen, die eine Wechselwirkung mit den kindlichen Lymphocyten, die an der Regulation der IgE-Antikörper-Produktion beteiligt sind, zeigen [S.A. Roberts und M.W. Turner, Immunlogy 48, 195 (1983); E. Jarrett und E. Hall, Nature 280, 145 (1979)], versorgt.
Bis jetzt wurden keine IgE-BFs mit IgE-SF-Aktivität im menschlichen Colostrum identifiziert, und die Isolierung daraus ist nirgendwo beschrieben. Überraschenderweise wurden solche IgE-BFs nun in hochgereinigter Form isoliert.
IgE spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung allerigischer Erkrankungen. Gereinige IgE-Bindungsfaktoren sind daher zur Diagnose und Therapie allergischer Erkrankungen und damit verbundener immunregulatorischer Erkrankungen wichtig. Insbesondere könnten IgE-BFs mit IgE- Suppressoraktivität zur Behandlung von allergischen Erkrankungen nützlich sein, wohingegen IgE-BFs mit IgE- potenzierender Aktivität die Infektionsresistenz, beispielsweise die Resistenz gegenüber parasitären Infektionen, erhöhen könnten.
Die bekannten Assays zum Nachweis von IgE-BFs beruhen auf einem Rosettenhemmtest, bei dem RPMI 8866-Zellen aus einer lymphoblastoiden B-Zell-Linie, die Rezeptoren für IgE (Fc&epsi;R) exprimiert, mit IgE-beschichteten Rindererythrocyten zur Rosettenbildung gebracht werden. Wenn die zuletzt genannten zuerst mit IgE-BFs vorinkubiert werden, sind sie nicht länger in der Lage, an RPMI 8866-Zellen zu binden, und der Anteil der rosettenbildenden Zellen ist folglich verringert. Dieser Assay ist nicht quantitativ, er ist infolge der Variabilität der Kopplung von IgE an Rindererythrocyten technisch problematisch, und er ist aufwendig, weil die Rosetten unter dem Mikroskop untersucht werden müssen, Zelllinien permanent verfügbar sein müssen, IgE-beschichtete Erythrocyten regelmäßig hergestellt werden müssen etc., so daß nur eine kleine Anzahl von Tests (20 bis 40) vernünftig von einer Person an einem Tag durchgeführt werden kann. Daher würde es äußerst zweckmäßig sein, über einen quantitativen, leicht durchzuführenden Assay zu verfügen, der auf eine große Anzahl von Proben angewendet werden kann, z. B. mehrere hundert pro Tag. Ein solcher Assay würde nicht nur die Forschung zur Pathophysiology von IgE-BFs erleichtern, sondern könnte auch zur Überwachung der Reinigung von IgE-BFs aus verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Kulturüberständen aus Zellinien, die IgE- BFs sezernieren, verwendet werden. Ferner könnte er zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von IgE-BFs im Serum zu diagnostischen Zwecken verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Lösung für die vorstehend erwähnten Probleme durch die Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen den Lymphocyten-Fc&epsi;R, der mit IgE-BFs Kreuzreaktion zeigt. Gleichzeitig erlauben diese monoclonalen Antikörper eine effiziente Reinigung von IgE- BFs mittels Affinitätschromatografie. Die bekannte Reinigung von IgE-BFs durch Affinitätschromatografie auf einer IgE-gekoppelten, festen Phase ist mit einer niedrigen Ausbeute verbunden, was weitere Studien an dem gereinigten Faktor infolge der geringen Affinität von IgE zu IgE-BFs gefährdet.

Aufgabe der Erfindung

Eine erste Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von IgE-Bindungsfaktoren (IgE-BFs) in gereinigter Form, deren einzelne, ggf. gereinigten Proteine, und Fragmente davon und ein Verfahren zu ihrer Isolierung.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung monoclonaler Antikörper, die zur qualitativen und quantitativen Bestimmung und zur Reinigung von IgE-BFs nützlich sind.
Eine dritte Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verhütung und/oder Behandlung einer Allergie durch Verabreichung der IgE-BFs, der einzelnen Proteine oder Fragmente gemäß der Erfindung, und die Bereitstellung pharmazeutischer Präparate, die sie enthalten.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft den gareinigten menschlichen Immunglobulin E-Bindungsfaktor (IgE-BF), dessen einzelne, ggf. glycosylierte Proteine und Fragmente davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden diese gereinigten IgE-BFs und dessen Bestandteile aus den Überständen menschlicher B-Zellen oder aus menschlichem Colostrum isoliert.
Beispielweise sind die erfindungsgemäßen gereinigten IgE-BFs wie folgt charakterisiert:
(1) Sie enthalten nur ggf. glycosylierte Proteine menschlichen Ursprungs, die von monoclonalen Antikörper gegen die Lymphocyten-Rezeptoren für IgE (Fc&epsi;R) erkannt und gebunden werden.
(2) Sie bestehen aus Molekülen mit einem offensichtlichen ungefähren Molekulargewicht von 25 bis 28 kD (Kilo- Dalton, kg/mol), bestimmt mittels SDs-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Silberfärbung und ggf. aus anderen Proteinen, die an monoclonale Antikörper, die für Fc&epsi;R spezifisch sind, binden, z. B. Dimere zu 45 bis 60 kD und/oder teilabgebaute Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht, d. h. 10 bis 20 kD.
(3) Sie binden reversibel an IgE, z. B. bestimmt durch ihre Adsorption an und mögliche Gewinnung aus einem Agarosegel mit gebundenem IgE.
(4) Sie blockieren die Bindung von IgE an Zellen, die Rezeptoren für IgE tragen (Fc&epsi;R&spplus;), z. B. bestimmt durch Hemmung der Bindung von IgE-beschichteten Latexteilchen an RPMI 8866-Zellen, die Fc&epsi;R exprimieren.
(5) Sie blockieren die Bindung von IgE an monoclonale Antikörper, die für IgE spezifisch sind, z. B. bestimmt mittels radioaktiv markiertem IgE und monoclonalen Antikörpern dagegen, die auf Mikrotiterplatten fixiert sind.
(6) Sie sind Bestandteile der Kulturüberstände der menschlichen B-Zellen, die IgE-Rezeptoren exprimieren (Fc&epsi;R&spplus;) oder des menschlichen Colostrum.
Die einzelnen IgE-BF-Proteine der vorstehenden IgE-BFs sind wie folgt gekennzeichnet:
(1) Sie sind Bestandteile eines IgE-BFs, wie vorstehend charakterisiert.
(2) Sie sind gemäß den üblichen Verfahren der Proteinanalyse, z. B. SDS-PAGE oder Gelfiltrations-Hochdruckflüssigkeitschromatografie, homogen.
(3) Sie sind ggf. glycosyliert.
(4) Sie besitzen ein offensichtliches Molekulargewicht von 25 bis 28 kD, bestimmt mittels SDS-PAGE.
(5) Sie besitzen die folgenden ungefähren Bereiche der Gesamtaminosäurezusammensetzung: Asparginsäure/Asparagin 19-23, Glutaminsäure/Glutamin 25-31, Serin 22-26, Threonin 8-10, Glycin 15-25, Alanin 16-20, Arginin 10-12, Prolin 13-16, Valin 10-12, Methionin 3-5, Isoleucin 7-9, Leucin 13-17, Tryptophan 0, Phenylalanin 6-9, Cystein 3-4, Lysin 8-10, Histidin 4-5 und Tyrosin 6-8.
Es ist zu verstehen, daß mit der SDS-PAGE nur ungefähre Molekulargewichte bestimmt werden können, und daß die tatsächlichen Molekulargewichte der erfindungsgemäßen Verbindungen im Bereich von 20 bis 35 kD liegen. Auf ähnliche Weise kann sich die tatsächliche Aminosäurezusammensetzung von dem vorstehend angegebenen Aminosäurebereich infolge von Unsicherheiten im Verfahren der Gesamtaminosäureanalyse unterscheiden.
Einige dieser individuellen IgE-BF-Proteine werden in einem signifikanten Ausmaß von dem monoclonalen Antikörper mit der Bezeichnung 208.25 A.4.3/135 gebunden, aber nicht von dem monoclonalen Antikörper mit der Bezeichnung 208.25 D.2/94 gebunden und umgekehrt.
Die einzelnen IgE-BF-Proteine können glycosyliert sein oder ohne Kohlenhydratreste sein. Typischerweise enthält ein glycosyliertes IgE-BF-Protein einen oder mehrere Kohlenhydratreste z. B. N-Acetylglucosamin oder ein Oligosaccharid, das N-Acetylglycosamin in N-glycosidischer Bindung an einen Asparaginrest enthält und/oder N-Acetylgylactoseamin oder ein Oligosaccharid, das N-Acetylgalactosamin in O-glycosidischer Bindung an einen Serin- oder Threoninrest enthält. Die Oligosaccharide können Sialinsäuren, wie N-Acetylneuraminat oder N-Glycolylneuraminat, enthalten.
Die Erfindung betrifft auch Fragmente der IgE-BFs, die dadurch gekennzeichnet sind, daß
(1) sie fakultative Bestandteile eines IgE-BFs, wie vorstehend charakterisiert, sind,
(2) sie gemäß den herkömmlichen Verfahren der Proteinanalyse, z. B. SDS-PAGE oder Gelfiltrations-Hochdruckflüssigkeitschromatografie, homogen sind,
(3) sie ein offensichtliches Molekulargewicht von 10 bis 20 kD, bevorzugt 14 bis 16 kD, bestimmt mittels SDS-PAGE, besitzen,
(4) sie durch enzymatischen Teilabbau der einzelnen vorstehend charakterisierten IgE-BF-Proteine erhältlich sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem IgE-BF, dessen einzelnen, ggf. glycosylierten Proteinen und Fragmenten davon, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine IgE-BF-haltige Lösung, beispielsweise ein Kulturüberstand, von IgE-BF-produzierenden Zellen, wie RPMI 8866-Zellen oder ein menschliches Colostrumpräparat, mit einem Trägermaterial, das für Fc&epsi;R spezifische monoclonale Antikörper trägt, in Kontakt gebracht wird, nichtgebundene Proteine und andere Fremdsubstanzen entfernt werden, der an die Antikörper auf dem Träger gebundene IgE-BF selektiv abgespalten wird und isoliert wird und ggf. der gereinigte IgE-BF in seine einzelnen, ggf. glycosylierten Proteine und/oder Fragmente aufgetrennt wird.
Die Zellkulturüberstände oder die Zellextrakte, die IgE-BF enthalten, werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt. Geeignete Zellen sind Lymphocyten menschlichen Ursprungs, insbesondere solche, die in vitro gezüchtet werden können, wie Lymphoblastomzellinien, insbesondere kontinuierliche menschliche B Zellinien, z. B. die menschliche B Zellinie RPMI 8866. Kulturüberstände solcher Zelllinien, die IgE-BF produzieren, können direkt, ggf. nach Konzentrierung, in das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren eingeführt werden oder können vorher einer Vorreinigung nach bekannten Verfahren, z. B. Ultrafiltration, Dialyse oder chromatografischen Reinigung, z. B. über DEAE-Cellulose oder vernetztes Dextrangel, wie Sephadex®, unterworfen werden.
Menschliche Colostrumpräparate, die IgE-BF enthalten, können wie folgt erhalten werden: Menschliches Colostrum vom gesunden Freiwilligen wird während der ersten zwei Tage nach der Geburt gewonnen, jedoch kann die später gesammelte Milch auch verwendet werden. Das Colostrum wird mit Proteaseinhibitoren, z . B. Phenylmethylsulfonylfluorid, Benzamidin, &epsi;-Aminocapronsäure und/oder EDTA behandelt, dann geklärt, z. B. durch Ultrazentifugation oder Filtration und angesäuert, z. B. mit Salzsäure, bis zu etwa pH-Wert 4, um das Casein auszufällen. Nach Entfernen des Caseins, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation, wird das geklärte Präparat mit einer Pufferlösung, z. B. mit 2 M Tris- Puffer neutralisiert und durch ein Filtersystem, bevorzugt stufenweise, geleitet, um die großen Moleküle über 50 kD zu entfernen. Beispielsweise können die Poren des ersten Filters einen Durchmesser von etwa 0,45 um besitzen, und das Filtrat davon kann dann durch einen Membranfilter, z. B. einen Amicon XM 50-Filter, mit dem gewünschten Ausschluß punkt von 50 kD geleitet werden. Nach der Filtration wird das Präparat gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Dieses Colostrumpräparat wird bevorzugt durch chromatografische Verfahren weiter gereinigt, um die Polypeptid mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 10 und 30 kD zu gewinnen. Jedes herkömmliche chromatografische Verfahren kann verwendet werden, beispielsweise Gelfiltrationschromatografie auf einem Agarosegel, z. B. auf Sephadex® G-75. Beispielsweise wird das Colostrumpräparat auf eine Agarosegelsäule in einer Pufferlösung, die eine grenzflächenaktive Komponente und andere Hilfsstoffe enthält, gegeben, und Molekulargewichtsfraktionen werden aufgefangen. Die Fraktionen, die IgE-BF enthalten, sind diejenigen, die Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 10 bis 30 kD enthalten. Sie werden vereinigt, ggf. eingeengt und dialysiert.
Die IgE-BFs werden von den anderen Proteinen und Fremdstoffen in den Lösungen auf der Grundlage der Bindungswechselwirkungen zwischen den für Fc&epsi;R spezifischen monoclonalen Antikörpern (mit Kreuzreaktion mit IgE-BF) und den antigenen Determinanten auf den Proteinen, die den IgE-BF bilden, abgetrennt. Zu diesem Zweck werden die Lösungen, die die IgE-BFs enthalten, in Kontakt mit einem Trägermaterial gebracht, an das die monoclonalen Antikörper gebunden sind, z. B. nach einem Verfahren, das als Immunaffinitätschromatografie bekannt ist. Zu diesem Zweck wird ein geeignetes Trägermaterial auf einer anorganischen oder organischen Basis, z. B. Silicate, vernetzte Agarose, Dextran oder Polyacrylamid, in geeigneter Weise funktionalisierter Form, ggf. nach Aktivierung, auf an sich bekannte Weise mit den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern oder ihren nachstehend beschriebenen Derivaten beladen. Beispielsweise wird ein Trägermaterial, das aktivierte Esterfunktionen, beispielsweise N-Hydroxysuccinimidestergruppen enthält, in einer wäßrigen Pufferlösung suspendiert und mit einer Lösung des monoclonalen Antikörpers vermischt, und dann werden die nichtgebundenen, monoclonalen Antikörper herausgewaschen und nichtbesetzte, reaktive Stellen des Trägermaterials werden blockiert, beispielsweise mit einem primären Amin, wie Ethanolamin. Das Trägermaterial wird in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel, beispielsweise einer Salzlösung, wie einer NaCl-Lösung oder einer Pufferlösung, wie einer phosphatgepufferten NaCl-Lösung, NaHCO&sub3;-Lösung oder 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurelösung, suspendiert und mit der Lösung, die den IgE-BF enthält, in Kontakt gebracht, beispielsweise in eine Chromatografiesäule gegossen, und die IgE-BF-haltige Lösung wird eingebracht, durch das Trägermaterial gepumpt, ggf. unter Druck, oder fließt durch die Schwerkraft hindurch. Nichtgebundene Proteine und andere Verunreinigungen werden mit wäßrigen Lösungen weggewaschen, beispielsweise mit Pufferlösungen in einem pH-Bereich von etwa pH 5 bis etwa pH 8 und/oder Salzlösungen, beispielsweise einer NaCl-Lösung, die ggf. grenzflächenaktive Mittel enthält, z. B. Polyethylensorbitanfettsäureester. Der an die Antikörper auf dem Trägermaterial gebundene IgE-BF wird mit geeigneten wäßrigen Lösungen, beispielsweise Pufferlösungen, in einem pH-Bereich von etwa pH 2 bis etwa pH 5, wie Glycinpuffer oder pH-Gradienten mit unterschiedlicher Zusammensetzung oder Salzlösungen, beispielsweise einer konzentrierten NH&sub4;SCN-Lösung, eluiert. Die so erhaltenen Lösungen, die den gereinigten IgE-BF enthalten, werden ggf. neutralisiert, und der gereinigte IgE-BF wird nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise durch Chromatografie über Sephadex®, Elektrodialyse, isoelektrische Fokussierung, elektrophoretische Konzentrierung und/oder Vakuumzentrifugation, daraus isoliert.
Die Wahl der bei der Immunaffinitätschromatografie zu verwendende monoclonalen Antikörper hängt von der Art und der Quelle der IgE-BFs, die gereinigt werden sollen, ab. Beispielsweise wird IgE-BF aus B-Zell-Überständen bevorzugt mit den monoclonalen Antikörper mit den Bezeichnungen 207.24 A.4.4/30 oder 207.25 A.4.4/45 gereinigt, wohingegen der IgE-BF aus Colostrum bevorzugt mit dem monoclonalen Antikörper mit der Bezeichnung 208.25 D.2/94 und/oder 207.25 A.4.4/30 gereinigt wird.
Es ist zu verstehen, daß jedes beliebige andere herkömmliche Verfahren zur Isolierung von IgE-BFs unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung fällt.
Ggf. wird der immunaffinitätschromatografisch erhaltene menschliche IgE-BF weiter gereinigt und in seine individuellen, ggf. glycosylierten Proteine, aufgetrennt, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatografie, Gelfiltrationschromatografie, präparative Umkehrphasen- oder hydrophobe Wechselwirkungs-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) oder verwandte chromatografische Verfahren, präparative Polyacrylamidgelelektrophorese und dgl. und Kombinationen dieser Reinigungs- und Trennstufen.
Inbesondere wird der immunaffinitätschromatografisch erhaltene, menschliche IgE-BF weiter durch Ionenaustauschchromatografie auf einem schwach basischen Anionenaustauscher, z. B. diethylaminoethyl-substituierter Cellulose (DEAE) oder Agarose, ggf. mit anschließender weiterer immunaffinitätschromatografischer Reinigung mit monoclonalen Antikörpern weitergereinigt. Das Ionenaustauschchromatografiematerial, das den schwach basischen Anionenaustauscher trägt, wird mit einer geeigneten wäßrigen Pufferlösung, z. B. einer Pufferlösung mit pH 6 bis pH 9, wie Tris- oder Phosphatpufferlösung, äquilibriert, dann mit dem menschlichen IgE-BF in Kontakt gebracht. Bevorzugt wird die Chromatografie auf einer Säule durchgeführt, und die Lösung des menschlichen IgE-BF wird durch das Ionenaustauschermaterial gepumpt. Nichtgebundene Proteine und Verunreinigungen werden mit einer Pufferlösung von der Säule gewaschen, und die gewünschten, ggf. glycosylierten Peptide werden durch eine zunehmende Salzkonzentration z. B. durch eine Tris-Pufferlösung, die ansteigende Mengen an Natriumchlorid enthält, eluiert. Es ist zu verstehen, daß die Ionenaustauschchromatografie auch auf einer HPLC-Säule durchgeführt werden kann.
Ebenso bevorzugt ist eine Reinigung des menschlichen IgE-BF mit präparativer Umkehrphasen-HPLC. Eine solche Reinigung und Trennung in die individuellen, ggf. glycosylierten Proteine wird auf einem Trägermaterial auf Kieselsäurebasis, das hydrophobe Gruppen trägt, z. B. Alkylgruppen mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Phenylgruppen, durchgeführt. Bevorzugt ist ein Trägermaterial auf Kieselsäurebasis, das Niedrigalkylgruppen, z. B. n-Butylgruppen, trägt. Die Lösung aus dem menschlichen IgE-BF wird auf die Umkehrphasen-HPLC-Säule injiziert und in einer wäßrigen sauren Lösung, z. B. einer wäßrigen Trifluoressigsäurelösung, die ansteigende Mengen eines polaren, mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittels, z. B. Acetonitril, niedrige Alkohole, z. B. Methanol, Ethanol oder Propanol, Tetrahydrofuran und dgl., bevorzugt Acetonitril, enthält, weiterverarbeitet.
Die einzelnen ggf. glycosylierten Proteine werden bevorzugt durch präparatives Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese erhalten. Eine Lösung des menschlichen IgE-BF in einem geeigneten Puffer, z. B. Tris- Puffer, der Glycerin und SDS enthält, wird hergestellt und auf ein Polyacrylamidgel, das 10 bis 15%, bevorzugt 12%, Acrylamid und bis zu 0,5%, z. B. um 0,3% Bisacrylamid enthält, aufgebracht. Die Gelelektrophorese wird auf die übliche Weise zusammen mit Molekulargewichtsmarkern laufen gelassen. Die Fraktionen mit homogenem Molekulargewicht werden von dem Gel eluiert und in reiner Form, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatografie, elektrophoretische Konzentrierung und/oder Vakuumzentrifugation isoliert.
Es ist zu verstehen, daß die üblichen Verfahren der Dialyse, des Auflösens und der Repräzipitierung in geeigneten Salz und/oder Pufferlösungen und Lösungsmittelgemischen in das Trennschema aufgenommen werden können. Der IgE-BF oder- die einzelnen glycosylierten Proteine können weiter durch teilweise oder vollständige Spaltung der Glycosidbindungen verarbeitet werden, wodurch andere weniger glycosylierte Proteine oder unglycosylierte Proteine gemäß der Erfindung entstehen. Beispielsweise werden die erfindungsgemäßen Proteine mit Enzymen, die glycosidische Bindungen spalten, z. B. N-Glycanase, Neuraminidase und/oder O-Glycosidase, in geeigneten Pufferlösungen, z. B. Phosphat- oder Tris-Puffer, die ggf. Hilfsmittel, wie Detergentien, z. B. Natriumdodecylsulfat, Tween oder NP-40, Komplexbildner, z. B. EDTA, Salze, z. B. Calciumsalze, Reduktionsmittel, z. B. β-Mercaptoethanol und dgl. enthalten, behandelt. Die so erhaltenen Reaktionsprodukte werden, wie für die einzelnen ggf. glycosylierten Proteine oder die IgE-BF-Fragmente vorstehend beschrieben, verarbeitet.
IgE-BF-Fragmente und Fragmente von den einzelnen ggf. glycosylierten Proteinen gemäß der Erfindung werden durch Proteasebehandlung von IgE-BF-haltigen Lösungen oder der einzelnen Proteine erhalten. Wenn beispielsweise keine Proteaseinhibitoren dem Colostrum oder den Zellüberständen, die IgE-BF enthalten, zugesetzt werden, spalten die inhärent in solchen Lösungen vorhandenen Proteasen den IgE-BF und seine einzelnen Proteine. Anderenfalls kann eine Protease, z. B. Papain oder Trypsin, gezielt den IgE-BF-haltigen Lösungen oder den Lösungen, die dessen einzelne Proteine enthalten, zugesetzt werden.
Die IgE-BF-Fragmente werden, wie vorstehend für IgE-BF und/oder die einzelnen ggf. glycosylierten Proteine beschrieben, isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Ultrafiltration, Gelfiltrationschromatografie, Immunaffinitätschromatografie, Ionenaustauschchromatografie, präparative Umkehrphasen-HPLC und/oder präparative SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Die die IgE-bindende und IgE-Synthese supprimierende Aktivität der isolierten IgE-BFs, seiner einzelnen Proteine und/oder Fragmente davon kann nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch den Rosettenhemmtest, die Blockierung der IgE-Bindung an Anti- IgE-Antikörper, affinitätschromatografische Versuche und dgl. Die Adsorptions- und Elutionsversuche an IgE- und IgG-gekoppelten Agarosegelen können als Spezifitätskontrollen genommen werden, die anzeigen, daß die Rosettenhemmaktivität und die Blockierung der IgE-Bindung an die Anti-IgE-Antikörper in der Tat auf Faktoren, die IgE binden, zurückzuführen ist.
Die Erfindung betrifft auch neue monoclonale Antikörper gegen die lymphocytären, zellulären Rezeptoren für IgE (Fc&epsi;R), die mit IgE-BF eine Kreuzreaktion zeigen, und Derivate davon.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper werden z. B. durch ihre Fähigkeit, die Bindung von IgE-beschichteten Latexteilchen an RPMI 8866-Zellen, die Fc&epsi;R exprimieren, zu hemmen, nachgewiesen. Das Ausmaß der Hemmung wird durch Zählen der Zellen, die Fluoreszenzmarker tragen, nach Inkubation mit einer Lösung, die monoclonale Antikörper enthält, und anschließend mit fluoreszierenden IgE- beschichteten Latexteilchen bestimmt. Die Hemmung der Bindung fluoreszierender IgE-beschichteter Latexteilchen an Fc&epsi;R zeigt sich auch bei anderen B-Zellinien, die bekanntlich Fc&epsi;R exprimieren.
Ferner können die monoclonalen Antikörper, beispielsweise durch ihre Fähigkeit, an Zellen, die Fc&epsi;R exprimieren, zu binden, nachgewiesen werden. Das Ausmaß der Bindung wird durch Zählen der Zellen, die Fluoreszenzmarker tragen, nach Inkubation mit einer Lösung, die monoclonale Antikörper enthält, und anschließend mit einer Lösung eines fluoresceinkonjugierten zweiten Antikörpers, der an den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper bindet, z. B. ein fluoresceinkonjugiertes Ziege-Anti-Maus-Immunglobulinreagens, bestimmt werden.
Die Spezifität der monoclonalen Antikörper gegen den Fc&epsi;R, der auf den Zellinien exprimiert wird, wird durch die folgenden Beobachtungen nachgewiesen:
(1) Die intakten monoclonalen Antikörpermoleküle und seine F(ab')&sub2;-Fragmente blockieren die Bindung von IgE an mehrere Fc&epsi;R-exprimierende Zellinien, die sich von denen, die für die anfängliche Immunisierung verwendet wurden, unterscheiden.
(2) Die monoclonalen Antikörper binden direkt an alle Fc&epsi;R-exprimierenden Zellinien, die getestet wurden, aber nicht an mehrere Fc&epsi;R-negative Zellinien.
(3) Die Bindung der monoclonalen Antikörper an Fc&epsi;R-exprimierende Zellinien wird durch IgE selektiv blockiert, aber nicht durch andere Immunglobulinklassen.
(4) Die monoclonalen Antikörper zeigen keine Wirkung auf die Bindung von IgG an IgG-Rezeptoren (FcγR) auf normalen menschlichen, mononuclearen, peripheren Blutzellen.
Daß die für Fc&epsi;R spezifischen monoclonalen Antikörper mit IgE-BF eine Kreuzreaktion zeigen, wird durch die Tatsache gezeigt, daß die IgE-BFs die Bindung der monoclonalen Antikörper an die IgE-Rezeptoren, z. B. auf den RPMI 8866-Zellen, blockieren.
Bevorzugt sind monoclonale Antikörper gegen Fc&epsi;R, die mit den IgE-BFs Kreuzreaktionen zeigen, und die von Maus/Maus-Hybridomazellen produziert werden. Beispiele für solche erfindungsgemäße, bevorzugte, monoclonale Antikörper sind die in Tabelle I aufgeführten monoclonalen Antikörper. Sie gehören dem Isotyp IgG1 oder IgG2b an. Besonders bevorzugt sind die monoclonalen Antikörper, die von den Clonen mit den Nrn. 208.25 A.4.3/135, 207.25 A.4.4/30, 207.25 A.4.4/45, 208.25 D.2.1/176 und 208.25 D.2/94 produziert werden. Tabelle I Monoclonal Antikörper gegen Fc&epsi;R und sie exprimierende Hybridoma-Zellinien Nummer des Clons Isotyp Leichte Ketten
Nachstehend werden die in der Tabelle I gezeigten erfindungsgemäßen monoclonal Antikörper als "MAk-(Nummer)" bezeichnet, wobei die Nummer der zweistelligen oder dreistelligen Nummer hinter dem schrägen Strich der Nummer des Clons entspricht.
Derivate der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper sind beispielsweise Fragmente, wie die Fab-, Fab'-, oder F(ab')&sub2;-Fragmente, die ihre Spezifität für die antigenen Determinanten von IgE-BF beibehalten, raktionaktiv markierte, monoclonale Antikörper, die beispielsweise mit radioaktivem Iod (¹²&sup5;I, ¹³¹I), Kohlenstoff (¹&sup4;C), Schwefel (³&sup5;S), Tritium (³H) oder dgl. markiert sind, monoclonale Antikörperkonjugate mit Biotin oder Avidin oder monoclonale Antikörperkonjugate mit Enzymen, wie Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glukose-Oxidase, Glucoamylase, Carbonsäureanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malat-Dehydrogenase oder Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase. Bevorzugte Derivate sind mit 1251 markierte monoclonal Antikörper, die Antikörperfragmente F(ab')&sub2; und Konjugate der monoclonalen Antikörper oder F(ab')&sub2;-Fragmente mit Biotin.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper und ihre Derivate werden nach an sich bekannten Verfahren erhalten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Hybridomazellen, die die monoclonalen Antikörper sezernieren, in einer geeigneten Umgebung vermehrt werden, und die monoclonalen Antikörper daraus isoliert werden und ggf. die so erhaltenen, monoclonalen Antikörper in ein Derivat davon umgewandelt werden. Insbesondere werden die Hybridomazellen in vitro gezüchtet, und die monoclonalen Antikörper werden aus dem Kulturüberstand isoliert oder in vivo in einem geeigneten Säugetier vermehrt, und die monoclonalen Antikörper werden aus den Körperflüssigkeiten des Säugetiers gewonnen und ggf. werden die so erhaltenen monoclonalen Antikörper in ein Derivat davon umgewandelt.
Geeignete Kulturmedien für die in vitro-Züchtung sind Standardkulturmedien, wie Dulbecco's modifiziertes Eagle- Medium oder RPMI 1640-Medium, das ggf. durch ein Säugerserum, z. B. fötales Kälberserum, oder andere das Wachstum erhaltende Supplemente, z. B. 2-Aminoethanol, Insulin, Transferrin, Lipoprotein mit niedriger Dichte, Ölsäure und dgl. und Spurenelementen angereichert ist. Die Isolierung der monoclonalen Antikörper wird durch Fällen mittels Ammoniumsulfat oder dgl. des in den ggf. eingeengten Kulturüberständen vorhandenen Proteins, anschließende Reinigung der Immunglobuline nach chromatografischen Standardverfahren, wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatografie, Chromatografie auf DEAE-Cellulose oder Immunaffinitätschromatografie, durchgeführt.
Die in vitro-Produktion erlaubt eine Vergrößerung des Maßstabs, wodurch große Mengen der gewünschten Antikörper erhalten werden. Techniken zur Hybridomazüchtung in großem Maßstab sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die homogene Suspensionskultur, z. B. in einem belüfteten Reaktor oder in einem kontinuierlich gerührten Reaktor, oder eine immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, z. B. in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarosemikrokugeln oder Keramikkartuschen.
Große Mengen der gewünschten monoclonalen Antikörper können auch durch Fortpflanzung der Hybridomazellen in vivo erhalten werden. Zellclone werden syngenen Säugetieren injiziert, welche das Wachstum antikörperproduzierender Tumore verursachen. Nach ein bis drei Wochen werden die gewünschten monoclonalen Antikörper aus den Körperflüssigkeiten des Säugetiers gewonnen. Als Beispiel werden Hybridomazellen von Balb/c-Mäusen Balb/c-Mäusen, die ggf. mit einem Kohlenwasserstoff wie Pristan vorbehandelt worden waren, intraperitoneal injiziert, und nach ein bis zwei Wochen werden die Ascitesflüssigkeiten dieser Mäuse gewonnen. Die gewünschten monoclonalen Antikörper werden aus den Körperflüssigkeiten nach an sich bekannten Verfahren isoliert, beispielsweise durch Präzipitieren der Proteine mit Ammoniumsulfat oder dgl., und anschließende Reinigung der Immunglobuline nach chromatografischen Standardverfahren, wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatografie, Chromatografie auf DEAE-Cellulose oder Immunaffinitätschromatografie.
Fagmente der monoclonalen Antikörper, beispielsweise Fab-, Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragmente, die ihre Spezifität gegenüber den antigenen Determinanten der IgE-BFs beibehalten, können von den monoclonalen Antikörpern, die durch in vitro- oder in vivo-Züchtung erhalten wurden, nach an sich bekannten Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch enzymatische Spaltung mit beispielsweise Pepsin oder Papain und/oder Spaltung der Disulfidbindungen durch chemische Reduktion.
Mit radioaktivem Iod, wie ¹²&sup5;I-markierte monoclonale Antikörper werden mittels auf dem Fachgebiet bekannter Iodierungsverfahren hergestellt, beispielsweise durch Markierung der monoclonalen Antikörper mit radioaktivem Natrium- oder Kaliumiodid und einem chemischen Oxidationsmittel, wie Natriumhypochlorit, Chloramin T oder dgl. oder einem enzymatischen Oxidationsmittel, wie Lactoperoxidase oder Glukoseoxidase und Glukose. Radioaktiv markierte, erfindungsgemäße, monoclonale Antikörper werden ebenfalls durch Zugabe von radioaktiv markierten Nährstoffen zu dem Kulturmedium der in vitro-Züchtung erhalten. Solche markierten Nährstoffe enthalten z. B. radioaktiven Kohlenstoff (¹&sup4;C), Tritium (³H), Schwefel (³&sup5;S) oder dgl. und sind beispielsweise L-(¹&sup4;C)-Leucin, L-(³H)-Leucin oder L-(³&sup5;S)-Methionin.
Enzymkonjugate der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Umsetzung eines monoclonalen Antikörpers oder eines Fragments davon, welche, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurden, mit dem gewünschten Enzym in Gegenwart eines Kopplungsmittels z. B. Glutaraldehyd, Periodat, N,N'-o-Phenylendimaleimid, N-(m-Maleimidobenzoyloxy)-succinimid, N-(3-(2'-Pyridyldithio)propionoxy)-succinimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid oder dgl. Konjugate der monoclonalen Antikörper mit Avidin werden auf ähnliche Weise erhalten. Konjugate mit Biotin werden z. B. durch Umsetzung der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper mit dem Biotin-N-hydroxysuccinimidylester erhalten.
Auf ähnliche Weise können Konjugate von monoclonalen Antikörperfragmenten, z. B. F(ab')&sub2;-Fragmenten, mit den erwähnten Enzymen oder mit Biotin hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ferner Hybridomazellinien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie monoclonale Antikörper gegen lymphocytäre zelluläre Rezeptoren für IgE (Fc&epsi;R), die mit IgE-BF Kreuzreaktionen zeigen, sezernieren.
Insbesondere betrifft die Erfindung Zellinien, die Hybride von Myelomazellen und B-Lymphocyten eines mit Lymphocyten, die Fc&epsi;R exprimieren, immunisierten Säugetiers sind. Bevorzugt sind diese Zellinien Hybride von Maus-Myelomazellen und B-Lymphocyten einer syngenen Maus, die mit Lymphoblastomzellen, die Fc&epsi;R exprimieren, immunisiert wurde.
Besonders bevorzugt sind die Hybridoma-Zellinien mit der Bezeichnung 208.25 A.4.3/135 und 208.25 D.2.1/176, die am 2. Februar 1985 bei der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, unter der Nummer I-425 bzw. I-420 hinterlegt wurden, die Hybridoma-Zelllinien mit den Bezeichnungen 207.25 A.4.4/30 und 207.25 A.4.4/45, die am 29. Mai 1985 bei der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, unter der Nummer I-451 bzw. I-452 hinterlegt wurden, und die Hybridoma-Zellinien mit der Bezeichnung 208.25 D.2/94, die am 1. Oktober 1985 bei der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, unter der Nummer I-486 hinterlegt wurde. Diese Hybridoma-Zellinien sind Hybride der Maus-Myeloma-Zellinie NSI/1 und der B- Lymphocyten der Milz von Balb/c-Mäusen, die mit lebensfähigen RPMI 8866-Zellen immunisiert wurden. Sie sind stabile Zellinien, die die monoclonalen Antikörper mit der Bezeichnung MAk-15, MAk-176, MAk-30, MAk-45 bzw. MAk-94 sezernieren. Die Zellinien können in tiefgefrorenen Kulturen gelagert werden und durch Auftauen und Reclonieren reaktiviert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion von Hybridoma-Zellinien, die monoclonale Antikörper sezernieren, die an Fc&epsi;R binden und mit IgE-BF Kreuzreaktion zeigen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein geeignetes Säugetier mit Lymphocyten, die Fc&epsi;R exprimieren, immunisiert wird, antikörperproduzierende Zellen dieses Säugetiers mit Myelomazellen fusioniert werden, die bei der Fusion erhaltenen Hybridzellen cloniert werden, und die Zellclone, die die gewünschten Antikörper sezernieren, ausgewählt werden.
Als Antigene können alle beliebigen Lymphocyten, die Fc&epsi;R exprimieren, auch Zelltrümmer oder Zellwandmaterial, das Fc&epsi;R enthält, oder die Rezeptoren selbst verwendet werden Die Lymphocyten, die Fc&epsi;R exprimieren, können B- oder auch T-Zellen, bevorzugt Lymphoblastomzellinien oder mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte Zellinien sein. Als Antigen am meisten bevorzugt sind die RPMI 8866-Zellen, die menschliche B-Zellen einer kontinuierlichen Zellinien sind. Ggf. werden die Zellen mit geeigneten Mitogenen, z. B. Concanavalin A oder mit die Glycoproteinsynthese regulierenden Verbindungen, z. B. Tunicamycin vor ihrer Verwendung als Antigen stimuliert.
Bevorzugte Säugetiere für die Immunisierung sind Mäuse, insbesondere Balb/c-Mäuse. Die Immunisierungen werden beispielsweise durch Injektion lebensfähiger RPMI 8866-Zellen drei bis achtmal parenteral, wie intraperitoneal und/oder subkutan, in Intervallen von drei bis fünf Wochen in einer Menge von etwa 10&sup7; bis zu etwa 10&sup8; Zellen durchgeführt.
Die antikörperproduzierenden Zellen der immunisierten Säugetiere, bevorzugt Milzzellen, die zwei bis fünf Tage nach der abschließenden Antigeninjektion entnommen wurden, werden mit Myelomazellen einer geeigneten Zellinie in Gegenwart eines Fusionspromotors fusioniert. Mehrere geeignete Myeloma-Zellinien sind auf dem Fachgebiet bekannt. Bevorzugt sind Myeloma-Zellinien, denen das Enzym Hypoxanthin- Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) oder das Enzym Thymidinkinase (TK) fehlt, die daher in einem selektiven Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) enthält, nicht überleben. Besonders bevorzugt sind Myelomazellen und davon abgeleitete Zellinien, die in HAT-Medium nicht überleben und die keine Immunglobuline oder deren Fragmente sezernieren, wie die Zellinien NSI/1-Ag4/1, X63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14. In Betracht gezogene Fusionspromotoren sind z. B. das Sendaivirus oder andere Paramyxoviren, ggf. in UV-inaktivierter Form, Calciumionen, grenzflächenaktive Lipide, wie Lysolecithin oder Polyethylenglykol. Bevorzugt werden die Myelomazellen mit einem drei- bis zehnfachen Überschuß der Milzzellen aus immunierten Säugetieren in einer Lösung, die etwa 30% bis etwa 60% Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000 enthält, und ggf. etwa 5% bis etwa 15% Dimethylsulfoxid enthält, fusioniert.
Nach der Fusion werden die Zellen in einem HAT- Selektivmedium resuspendiert und gezüchtet. Dabei überleben nur die Hybridomazellen, weil sie die von den Myelomazellen ererbte Fähigkeit, in vitro zu wachsen und replizieren, und die von den antikörperproduzierenden Milzzellen der immunisierten Säugetiere ererbten fehlenden HGPRT- oder TK-Gene, die für das Überleben in dem HAT-Medium essentiell sind, vereinigen.
Geeignete Kulturmedien zur Expansion der Hybridomazellen sind die Standardkulturmedien, wie Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium, Minimalnährmedium, RPMI 1640-Medium und dgl., die ggf. durch Serum, z. B. 10 bis 15% fötales Kälberserum, Aminosäuren und Antibiotika, z. B. Penicillin und/oder Streptomycin, angereichert wurden. Bevorzugt werden Feeder-Zellen zu Beginn des Zellwachstums zugesetzt, beispielsweise normale, peritoneale Exsudatzellen einer Maus, Milzzellen, Knochenmarksmakrophagen oder dgl. Die Kulturmedien werden mit dem selektiven HAT-Medium in regelmäßigen Intervallen supplementiert, um zu verhindern, daß normale Myelomazellen die Hybridomazellen überwachsen.
Die Hybridomazellkulturüberstände werden auf die gewünschten monoclonalen Antikörper abgesucht, bevorzugt mit einem Assay, bei dem die Hemmung der Bindung der IgE- beschichteten Latexteilchen an RPMI 8866-Zellen, die mit den Kulturüberständen vorbehandelt wurden, getestet wird. Positive Hybridomazellen werden cloniert, beispielsweise durch Grenzverdünnung, bevorzugt zweimal oder mehrmals. Die clonierten Zellinien können auf herkömmliche Weise eingefroren werden.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper und/oder ihre Derivate sind für die qualitative und quantitative Bestimmung und/oder die Reinigung von IgE-BF aus Lymphocyten oder Colostrum, von einzelnen, ggf. glycosylierten Proteinen und von Fragmenten davon nützlich.
Beispielsweise können die monoclonalen Antikörper oder die Derivate davon, wie Enzymkonjugate, Biotinkonjugate oder radioaktive Derivate, in jedem beliebigen der bekannten Immunoassays verwendet werden, der auf der Bindungswechselwirkung zwischen der antigenen Determinante, z. B. auf Fc&epsi;R oder IgE-BFs und den monoclonalen Antikörpern, beruht. Beispiele für solche Assays sind Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Immunfluoreszenz, Latexagglutination und Hämagglutination. IgE-BFs, die von Lymphocyten produziert wurden oder aus Colostrum isoliert wurden, können mittels Immunaffinitätschromatografie mit Hilfe der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper gereinigt werden.
Insbesondere betrifft die Erfindung Radioimmunoassays (RIA) zur Bestimmung der IgE-BFs mit Hilfe der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper und/oder radioaktiv markierte Derivate davon. Jede der bekannten Modifikationen eines RIAs kann verwendet werden, beispielsweise der RIA in homogener Phase, der Festphasen-RIA oder der heterogene RIA, der einfache RIA oder der doppelte (Sandwich) RIA mit direkter oder indirekter (kompetitiver) Bestimmung der IgE-BFs.
Bevorzugt ist ein RIA, bei dem ein geeigneter Träger, beispielsweise die Plastikoberfläche einer Mikrotiterplatte oder eines Reagensglases, beispielsweise aus Polystyrol, Polypropylen oder Polyvinylchlorid, Glas oder Plastikkugeln, Filterpapier oder Dextran, Celluloseacetat oder Nitrocelluloseschichten oder dgl., mit einem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper durch einfach Adsorption oder ggf. nach Aktivierung des Trägers, z. B. mit Glutaraldehyd oder Bromcyan, beschichtet wird, anschließend mit einer Test- oder Standardlösung, die IgE-BF enthält, und einer Lösung mit einem ¹²&sup5;I-markierten Derivat eines erfindungsgemäßen zweiten monoclonalen Antikörpers, der ein anderes Epitop auf dem IgE-BF erkennt, inkubiert wird. Es ist auch möglich, aber weniger wünschenswert, ein mit ¹²&sup5;I-markiertes Derivat des gleichen monoclonalen Antikörpers zu verwenden.
Die Erfindung betrifft auch Enzymimmunoassays zur Bestimmung von IgE-BFs mit Hilfe der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper und/oder Konjugate davon mit Enzymen oder mit Biotin, einschließlich Konjugate von monoclonalen Antikörperfragmenten mit Biotin. Beispielsweise wird ein, wie vorstehend für einen RIA beschriebener, Träger mit einem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper beschichtet, mit einer Test- oder Standardlösung, die IgE-BF enthält, und dann mit einer Lösung eines Konjugats eines anderen monoclonalen Antikörpers oder Antikörperfragments mit einem geeigneten Enzym und anschließend mit einer Lösung eines Enzymsubstrats, die die Menge des gebundenen enzymkonjugierten Antikörpers sichtbar macht, inkubiert. Anstelle eines enzymkonjugierten, monoclonalen Antikörpers kann ein biotinkonjugierter, monoclonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment zusammen mit einem Avidin-Enzym- Konjugat verwendet werden.
Bevorzugte Enzyme bei den erfindungsgemäßen Enzymimmunoassays sind Meerrettich-Peroxidase, die beispielsweise mit den Enzymsubstraten 5-Aminosalicylsäure, o-Phenylendiamin, 3,3'-Dimethoxybenzidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin- 6-sulfonsäure) oder dgl. und Wasserstoffperoxid entwickelt werden kann, und alkalische Phosphatase, die beispielsweise p-Nitrophenol aus dem Enzymsubstrat o-Nitrophenylphosphat freisetzt.
Besonders bevorzugt ist ein Enzymimmunoassay, bei dem ein geeigneter Träger, wie vorstehend für einen RIA beschrieben, mit einem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper beschichtet wird, dann mit einer Test- oder Standardlösung, die IgE-BF enthält, und einer Lösung eines Konjugats eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers oder eines Fragments davon mit Biotin und anschließend mit einer Lösung eines Avidin-Enzym-Konjugats, z. B. eines Avidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats, und einer Lösung eines Enzymsubstrats inkubiert wird.
Die erfindungsgemäße Verwendung der monoclonalen Antikörper gegen Fc&epsi;R und ihrer Derivate zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgE-BF umfassen auch andere, an sich bekannte Immunoassays, beispielsweise Immunfluoreszenztests, bei denen Antikörperkonjugate oder Antigenkonjugate mit fluoreszierenden Substanzen, Latexagglutination mit antikörperbeschichteten oder antigenbeschichteten Latexteilchen oder Hämagglutination mit antikörperbeschichteten oder antigenbeschichteten Erythrocyten oder dgl. verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch Testkits zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgE-BF, einzelner ggf. glycosylierter Proteine und Fragmente davon, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie monoclonale Antikörper gegen Fc&epsi;R, die mit IgE-BF eine Kreuzreaktion zeigen und/oder Derivate davon und ggf. Hilfsmittel enthalten.
Die erfindungsgemäßen Testkits für einen Radioimmunoassay enthalten z. B. einen geeigneten, wie vorstehend definierten Träger, ggf. gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers und eines ¹²&sup5;I-markierten gleichen oder verschiedenen, erfindungsgemäßen, monoclonalen Antikörpers, Standardlösungen von IgE-BF und/oder einzelne ggf. glycosylierte Proteine, Pufferlösungen, Detergentien, die die unspezifische Adsorption und die Aggregatbildung verhindern, Pipetten, Reaktionsgefäße, Kalibrationskurven und dgl.
Die erfindungsgemäßen Testkits für einen Enzymimmunoassay enthalten z. B. einen geeigneten, wie vorstehend definierten, Träger, ggf. gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers und eines Konjugats eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers oder Antikörperfragments mit einem Enzym oder mit Biotin und, wenn ein Biotinkonjugat verwendet wird, eines Avidin-Enzym-Konjugats, Standardlösungen aus IgE-BF und/oder einzelner, ggf. glycosylierter Proteine, Pufferlösungen, Enzymsubstrate in fester oder aufgelöster Form, Detergentien, die die unspezifische Adsorption und Aggregatbildung verhindern, Pipetten, Reaktionsgefäße, Kalibrationskurven und dgl.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von gereinigten IgE-BFs, einzelner, ggf. glycosylierter Proteine und Fragmente davon zur Behandlung oder Verhütung von allergischen Zuständen bei Patienten, die gegen alle Arten von Antigenen allergisch sind, beispielsweise gegen Pollen, Katzenhautschuppen, Hausstaubmilben und dgl. Besonders wichtig würde die Behandlung von Hochrisikopatienten während kritischer Perioden sein, einschließlich insbesondere Neugeborener mit hohem Risiko, die nicht gestillt werden. Die erfindungsgemäßen IgE-BFs werden enteral, beispielsweise nasal, rektal oder oral, oder parenteral, beispielsweise intramuskulär, subkutan oder intravenös, üblicherweise in Einheitsdosisformen, wie Tabletten, Dragees, Ampullen, Phiolen oder Suppositorien, verabreicht. Die zu verabreichende Menge der gereinigten IgE-BFs, seiner einzelnen, ggf. glycosylierten Proteine oder Fragmente davon hängt von dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Patienten, der Schwere der Erkrankung, dem Verabreichungsweg ab und muß auf dem Urteil des praktischen Arztes beruhen. Im allgemeinen kann eine Dosis zwischen etwa 100 ug und etwa 5000 ug pro kg Körpergewicht und Tag verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiter pharmazeutische Präparate, die IgE-BFs, seine einzelnen, ggf. glycosylierten Proteine oder Fragmente davon, in einer antiallergisch wirksamen Menge, ggf. zusammen mit herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Trägern, die für die orale, rektale, nasale oder parenterale, d. h. intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung geeignet sind und die mit den Wirkstoffen keine nachteilige Wechselwirkung zeigen, enthalten.
Geeignet sind Tabletten, Kapseln, Phiolen, die ein festes Pulver enthalten, Vernebelungsgeräte, Sprays, Phiolen, Ampullen und dgl., die Infusionslösungen, bevorzugt wäßrige Lösungen oder Suspensionen enthalten, wobei es möglich ist, diese vor Gebrauch herzustellen, beispielsweise aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirkstoff allein oder zusammen mit einem Träger wie Mannit, Lactose, Glukose, Albumin oder dgl. enthalten. Das pharmazeutische Präparat kann sterilisiert und ggf. mit Hilfsstoffen, beispielsweise Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermittlern, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks vermischt werden. Die Sterilisation kann durch Sterilfiltration durch Filter mit einer kleinen Porengröße (Durchmesser 0,45 um oder kleiner) durchgeführt werden, wonach das Präparat ggf. lyophilisiert werden kann. Antibiotika können auch zugesetzt werden, um den Erhalt der Stabilität zu unterstützen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate werden in Einheitsdosisformen, beispielweise Ampullen, umfassend 1 bis 2000 mg eines pharmazeutisch verträglichen Trägers pro Dosiseinheit und etwa 1 bis 100 mg, bevorzugt etwa 2 bis 50 mg, des Wirkstoffs, d. h. des gereinigten IgE-BF oder seiner einzelnen Proteine pro Dosiseinheit, abgegeben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das gereinigte IgE-BF, dessen einzelne ggf. glycosylierte Proteine oder Fragmente davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt werden.
Die pharmazeutischen Präparate werden auf eine an sich bekannte Weise, beispielsweise durch herkömmliches Vermischen, Auflösen, Lyophilisieren und ähnliche Verfahren, hergestellt und enthalten etwa 0,1% bis 100%, insbesondere etwa 1% bis 50% der Wirkstoffe.
Die Verwendung der neuen Proteine zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 zeigt Fluoreszenzhistogramme von RPMI 8866-Zellen, die mit entweder (A) IgE-beschichteten Latexteilchen oder (B) mit fötalem Kälberserum beschichteten Latexteilchen umgesetzt worden sind. Das Ausmaß der Markierung wird durch die Anzahl der Zellen pro Kanal als Funktion der Kanalnummer, die ihrerseits eine Funktion des Logarithmus der Fluoreszenzintensität ist, quantitativ bestimmt. Einzelheiten sind in Beispiel 3 angegeben.
Die Fig. 2 zeigt repräsentative Fluoreszenzhistogramme, die das Vorhandensein von Antikörpern gegen Fc&epsi;R in ausgewählten Hybridoma-Zellkulturüberständen zeigt. Einzelheiten sind in Beispiel 3 angegeben.
Die Fig. 3 zeigt Fluoreszenzhistogramme, die die Fähigkeit von IgE (bei Konzentrationen von 10 oder 100 ug/ml) die Bindung vier verschiedener monoclonaler Antikörper an RPMI 8866-Zellen zu hemmen, wohingegen IgG keine Wirkung besitzt. Einzelheiten sind in Beispiel 7 angegeben.
Die Fig. 4 zeigt das Analysenergebnis einer Umkehrphasen-HPLC von Reaktionsprodukten, die bei Papain- und Trypsinspaltung des radioaktiv markierten 25-28 KD-Proteins aus RPMI 8866-Zellen bzw. aus Colostrum erhalten wurden.
Dieser Versuch zeigt die Identität des verarbeiteten 25-28 KD-Proteins aus jeder Quelle.
Die Fig. 5 zeigt eine Standardkurve, die durch eine stufenweise, zweifache Verdünnung eines Referenzkulturüberstands aus RPMI 8866-Zellen, die IgE-BF enthalten, erhalten wurde; sie wurde mittels des in Beispiel 21 beschriebenen Radioimmunoassays bestimmt.
Die Fig. 6 zeigt Kurven, die durch eine stufenweise, zweifache Verdünnung verschiedener Proben, bestimmt mittels des in Beispiel 22 beschriebenen Radioimmunoassays, erhalten wurden. Die Figur zeigt die Selektivität des Assays für IgE- BFs im Colostrum und Serum, verglichen mit IgE-BF aus dem B- Zellüberstand oder mit Immunglobulinen unterschiedlicher Klassen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung genauer, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.
Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen besitzen die folgenden Bedeutungen:
BSA Rinderserumalbumin
cpm Counts pro min
EBV Epstein-Barr-Virus
F(ab')&sub2; Immunglobulinfragment (ab')&sub2;
Fc&epsi;R Rezeptor für IgE
FcγR Rezeptor für IgG
FCS Fötales Kälberserum
FCS-LP FCS-beschichtetes Latexteilchen
HAT Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin
HBSS Hanks' ausgeglichene Salzlösung
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatografie
HT Hypoxanthin/Thymidin
IgE Immunuglobulin E
IgE-BF IgE-Bindungsfaktor
IgE-LP IgE-beschichtetes Latexteilchen
IgE PS IgE-Myolomaprotein (isoliert aus dem Patienten PS)
IgG Immunglobulin G
MAk monoclonaler Antikörper (monoclonale Antikörper)
PEG Polyethylenglykol
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung
RIA Radioimmunoassay
SD Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophose
TFA Trifluoressigsäure
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Beispiel 1

Herstellung von Hybridomazellen

BALB/c-Mäuse werden durch drei intraperitoneale Injektionen von 5 · 10&sup7; lebensfähigen RPMI 8866-Zellen (erhalten von Dr.P.Ralph, Sloan-Kettering Research Institute, NY, USA), in PBS in 4-wöchigen Intervallen immunisiert. Die einzelnen Mausserumproben, die zwei Tage nach der letzten Injektion gewonnen wurden, werden auf Anti-Fc&epsi;R-Aktivität unter Verwendung des Verfahrens nach Beispiel 3 getestet. Milzzellen aus zwei Tieren, die den höchsten Titer zeigen, werden vereinigt und zur Fusion am nächsten Tag verwendet. Die Milzen werden zerlegt und für jede Fusion werden 1 · 10&sup8; gewaschene Milzzellen mit 25 · 10&sup6; NSI/1-Ag4/1 Mausmyelomazellen (erhalten von der American type tissue culture collection) 5 min bei 350 · g pelletiert. Das zelluläre Pellet wird 30 s lang in 2 ml Polyethylenglykollösung (PEG-1540, Baker) aus 20 g PEG, aufgelöst in 28 ml RPMI 1640-Medium (Gibco), enthaltend 15% (Vol/Vol) Dimethylsulfoxid, resuspendiert.
5 ml RPMI/c-Medium [RPMI 1640-Medium, supplementiert mit 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco), 1% L-Glutamin (Gibco) und 15% (Vol/Vol) FCS (Gibco)] wird tropfenweise im Verlauf von 90 s zugesetzt und anschließend werden rasch weitere 5 ml zugesetzt. Die zelluläre Suspension wird durch Umdrehen des Reagensglases vermischt, 2,5 min lang stehengelassen und 5 min lang bei 350 · g zentrifugiert. Das Pellet wird in 5 ml RPMI/c-Medium resuspendiert, und 50 ul Aliquote werden in jede Kavität von 4 Costar # 3596-Platten mit 24 Kavitäten, die auch 1 · 10&sup6; normale BALB/c-Milzzellen in 1 ml HAT-Medium (RPMI/c, supplementiert mit 40 uM 2-Mercapto-ethanol, 100 uM Hypoxanthin, 10 uM Aminopterin und 1 uM Thymidin) enthalten, gegeben. Alle Kulturen werden, sofern erforderlich, alternativ mit HAT-Medium alle paar Tage versetzt, oder das HAT-Medium wird alle paar Tage ausgetauscht, wobei am fünften Tag nach der Fusion begonnen wird. Nach 14 Tagen wird das HAT-Medium durch das HT-Medium ersetzt und nach 28 Tagen durch das RPMI/c-Medium. Die Überstände der einzelnen Kavitäten (192 Kulturen) werden auf Anti-Fc&epsi;R-Antikörper, wie in Beispiel 3 beschrieben, ein und zwei Wochen nach der Fusion abgesucht. 21 Kulturen, die die gewünschten Antikörper produzieren, werden durch Grenzverdünnung cloniert. Sie werden in RPMI/c auf eine Konzentration von 10 lebensfähigen Zellen/ml verdünnt, und 50 ul Aliquote dieser Suspensionen werden in die Kavitäten von Platten mit 96 Kavitäten (Linbro #76-003-05, Flow Labs), die 100 ul HT-Medium und 1 · 10&sup5; normale BALB/c-Milzzellen enthalten, gegeben. Die Kavitäten werden mikroskopisch untersucht, um zu gewährleisten, daß die wachsenden Kulturen monoclonal sind. Proben der Überstände, die davon entnommen wurden, werden auf Antikörperaktivität getestet. Positive Kulturen werden ausgewählt und in größeren Kulturgefäßen expandiert. 14 monoclonale Zell-Linien, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren, werden schließlich erhalten. Sie sind in Tabelle I aufgeführt.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung der monoclonalen Antikörper

Balb/c-Mäuse werden intraperitoneal mit 0,5 ml Pristan (Aldrich) vorbehandelt. Zwei Wochen später werden 5 · 10&sup6; clonierte Hybridomazellen intraperitoneal injiziert. Nach 8 bis 10 Tagen wird die Ascitesflüssigkeit gewonnen, bei 800 · g zentrifugiert und bei -20ºC gelagert. Die aufgetaute Ascitesflüssigkeit wird bei 50.000 · g 60 min lang zentrifugiert. Eine Fettschicht, die auf der Oberfläche schwimmt, wird sorgfältig entfernt, und die Proteinkonzentration wird auf eine Konzentration von 10 bis 12 mg/ml eingestellt. Das Rohimmunglobulin wird durch tropfenweise Zugabe von 0,9 Volumenäquivalenten von gesättigtem Ammoniumsulfat bei 0ºC präzipitiert, dann in 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Eine Immunglobulin G-Fraktion wird durch DEAE-D52-Cellulosechromatografie (Whatman) unter Verwendung eines Puffergradientensystems von 20 mM Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9, erhalten. Das Immunglobulin G wird erneut mit Ammoniumsulfat präzipiziert und in PBS in einer Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst.
Es ist auch möglich, monoclonale Antikörper durch in vitro-Vermehrung zu erhalten: Eine Vorkultur, die die Hybridomazellen enthält, wird bei einer physiologischen Temperatur (ca. 37ºC) in Kulturmedium (RPMI 1640, supplementiert mit 10% FCS) bis zu einer Zelldichte von 5 · 10&sup5;-10&sup6; Zellen/ml gezüchtet. Die vollständige Vorkultur wird in Bellco-Spinner-Flaschen, die auf ein Volumen von 3000 ml geeicht sind, überführt. Das Kulturmedium wird zugesetzt, wodurch ein Endvolumen von 1500 ml erhalten wird. Die Kultur wird zwei bis drei Tage lang bei 30 UpM in einer mit 5% CO&sub2; angereicherten Luftatmosphäre bei einer physiologischen Temperatur gerührt. Das Volumen der Kultur wird auf 3000 ul mit mehr Kulturmedium erhöht. Die Kultur wird weitere 7 bis 10 Tage unter Verwendung der vorstehenden Kulturbedingungen gezüchtet. Wenn 95% der Zellen tot sind, wird das Medium, das die Zellen enthält bei 1000 · g 20 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wird unter sterilen Bedingungen filtriert (Porengröße 0,2 um). Das Rohimmunglobulin wird durch Zugabe von gesättigtem Ammoniumsulfat erhalten und dann, wie vorstehend beschrieben, gereinigt.
Die gereinigten MAks werden routinemäßig durch SDS-PAGE und durch Ouchterlony-Analyse mit Schaf-Antiseren gegen Maus-Ig-Subklassen charakterisiert. Die Subklassen sind in Tabelle I aufgeführt.

Beispiel 3

Nachweis der Antikörper gegen Fc&epsi;R mittels Durchflußcytometrie

Antikörper gegen den Fc&epsi;R werden durch ihre Fähigkeit, die Bindung von IgE-beschichteten Latexteilchen (IgE-LP) an RPMI 8866-Zellen zu hemmen, nachgewiesen. Zum Absuchen werden Hybridomaüberstände (100 ul) in Mikrotiterkavitäten (96 Kavitäten V-Boden, Flow Labs #76-321-05), die 2 · 10&sup5; RPMI 8866-Zellen enthalten, gegeben und 30 min lang sanft bei 20ºC geschüttelt. Die Platten werden bei 300 · g 6 min lang zentrifugiert, und die Zellpellets werden resuspendiert und zweimal mit RPMI-Medium, das mit 10% FCS supplementiert ist und mit 10 mM HEPES, pH 7,2 gepuffert ist (H-RPMI), gewaschen. IgE-LP (100 ul/Kavität), das durch Beschichten von fluoereszierenden MX-Covaspheres 0,7 um (Covalent Technology Corp., Ann Arbor, USA) mit IgE PS und Blockieren der verbleibenden Bindungsstellen mit FCS, wie von M. Sarfati et al., Immunology 53, 783 (1984) beschrieben, hergestellt wurde, wird mit den Zellen vermischt, in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten und einem flachen Boden (Costar #3590) überführt und bei 300 · g 15 min lang bei 20ºC kosedimentiert. Die Platten läßt man dann ungestört 30 min lang bei 20ºC inkubieren, und nach dieser Zeit wird jede einlagige Zellschicht resuspendiert und auf 300 ul FCS, das in einem konischen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Fischer Scientific #5-407-6) enthalten ist, beschichtet. Die Röhrchen werden bei 125 · g 8 min lang zentrifugiert, und die Überstände, die nichtgebundenes IgE-LP enthalten, werden durch Absaugen entfernt. Die Zellpellets werden jeweils in etwa 300 ul H-RPMI suspendiert und bis zur Analyse auf Eis gelagert. Die Kontrollproben umfassen den Überstand aus den NSI/1-Zellen oder RPMI/c anstelle der Hybridomaüberstände (positive Kontrolle) oder FCS-beschichtete LP (FCS-LP) anstelle von IgE-LP (negative Kontrolle).
Die durchflußcytometrische Analyse wird auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsorter (EPICS VTM, Coulter Electronics) durchgeführt, wobei die Fluoreszenzbestimmungen sowohl an dem vorderen Winkel als auch an den Eigenschaften der 90-Grad-Lichtbrechung, wie von M. Sarfati et al., Immunology 53, 783 (1984) beschrieben, durchgeführt werden. Die Proben werden in 2-minütigen Intervallen analysiert, wobei jedes Fluoreszenzhistogramm auf 10.000 gemessenen Counts beruht.
Die Fig. 1 zeigt Fluoreszenzhistogramme mit positiver und negativer Kontrolle, was zeigt, daß 80 bis 90% der RPMI 8866-Zellen mit vier oder mehr Kugeln (Kanal 15 oder höher) unter Verwendung von IgE-LP im Vergleich zu einer 1 bis 3%igen Markierung unter Verwendung von FCS-LP markiert sind.
Die Fig. 2 erläutert das Absuchverfahren und zeigt
Fluoreszenzhistogramme mit einer positiven Kontrolle (029/POS CNTL) und die Hybridomaüberstände, die die Antikörper enthalten (030/#48 und 031/#72), was die Hemmung der Fluoreszenzmarkierung durch die Antikörper, die an Fc&epsi;R binden, zeigt. Die Prozentangaben in Klammern sind normalisierte Gesamtfluoreszenzwerte, die als Produkt der mittleren Kanalnummer der markierten Zellen mal die Anzahl der markierten Zellen definiert sind.

Beispiel 4

Nachweis von Antikörpern gegen Fc&epsi;R durch einen indirekten Immunfluoreszenzassay

2 · 10&sup5; RPMI 8866-Zellen werden mit Hybridomaüberständen oder einer anderen MAk-Lösung 30 min lang bei 4ºC in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml H-RPMI inkubiert. Nach zwei Waschungen mit H-RPMI werden 200 ul eines fluorescein-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Ig-Reagenzes (GAM-FITCTM, Coulter Immunology) zugesetzt und 30 min lang bei 4ºC umgesetzt. Nach weiteren zwei Waschungen mit H-RPMI werden die Zellen in 300 ul H-RPMI resuspendiert und durch Durchflußcytometrie, wie in Beispiel 3 beschrieben, analysiert.

Beispiel 5

Weitere Charakterisierung des MAks, der an Fc&epsi;R bindet

5.1 Hemmung der IgE-Bindung an EBV-transformierte B-Zellen:

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper, die Bindung von IgE an seinen Rezeptor zu hemmen, ist nicht auf die RPMI 8866-Zellinien beschränkt, sondern kann auch bei anderen B-Zellinien, von denen eine Fc&epsi;R-Expression bekannt ist, z. B. die durch das Epstein-Barr-Virus transformierten B-Zellinien EBV-RCA, EBV-JG und EBV-WL [M. Sarfati et al., Immunology 53, 207 (1984)] nachgewiesen werden. Die Versuche werden, wie in Beispiel 3 für RPMI 8866 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse für einen der monoclonalen Antikörper MAk-135 sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II Blockierung der IgE-Bindung an vier verschiedene Zelllinien, die Fc&epsi;R exprimieren durch MAk-135 a Zell-Linien b Zellen vorinkubiert mit Medium MAk-135 c Mouse-IgG d
a Prozentsatz der Zellen, die mit IgE-LP nach Vorinkubation mit entweder MAk-135, Maus-IgG oder Medium markiert wurden.
b Die Zellinien werden, wie von M. Sarfati et al.,
Immunology 53, 207 (1984) beschrieben, erhalten. Die Zelllinien werden in RPMI 1640, das mit 15% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco) und 1% L-Glutamin supplementiert ist, gezüchtet.
c Verwendet in einer Konzentration von 0,5 ug/ml (Endkonzentration).
d Verwendet in einer Konzentration von 100 ug/ml (Endkonzentration).
Die Ergebnisse der in Tabelle II gezeigten Versuche zeigen an, daß der monoclonale Antikörper die Bindung von IgE an jede B-Zellinie vollständig blockiert. Die Daten legen auch nahe, daß die Hemmung nicht durch dessen Fc- Region vermittelt wird, weil ein großer Überschuß an Maus- IgG die Hemmwirkung von MAk-135 nicht nachahmen kann. Ein direkterer Nachweis, daß der MAk mit Fc&epsi;R über dessen Fab- Region und nicht über dessen Fc-Bindung reagiert, wird in einem Versuch erhalten, bei dem die Aktivitäten von intaktem Mak-135 und dessen F(ab')&sub2;-Fragment (Beispiel 6) verglichen werden. Es wird beobachtet, daß der F(ab')&sub2;-Teil des MAk-135 ebenso wirksam wie der MAk-135 selbst bezüglich der Blockierung der Bindung von IgE-LP an RPMI 8866-Zellen ist: Die RPMI 8866-Zellen werden mit entweder Medium, intaktem MAk-135 (0,5 ug/ml) oder F(ab')&sub2;-Fragmenten von MAk-135 (0,5 ug/ml) vorinkubiert und anschließend mit IgE-LP umgesetzt. Die Prozentsätze der markierten Zellen betragen 89,3, 0,4 bzw. 0,4%. 0,5% der Zellen werden bei Reaktion mit FCS-LP anstelle von IgE-LP markiert (negative Kontrolle).

5.2 Bindung des MAks an Fc&epsi;R-positive und -negative Zellinien:

Die Spezifität beispielsweise von MAk-135 für Fc&epsi;R wird weiter durch Testen deiner direkten Bindung an verschiedene Zellinien, die zuvor auf ihre Fc&epsi;R-Expression getestet worden waren, bewertet (Tabelle III). Der MAk-135 wird in einer Konzentration verwendet, von der in anfänglichen Titrationsversuchen eine Markierung von mehr als 90% der RPMI 8866-Zellen bestimmt worden war. Drei Zellinien reagieren weder mit IgE-LP noch mit MAk-135, wohingegen die 181.21.2.20 AR-Zellen mit beiden reagieren. Maus-IgG, das als negative Kontrolle verwendet wurde, bindet an keine der Zellinien. So wird eine direkte Konkordanz zwischen IgE und der MAk-135-Bindung nachgewiesen. Tabelle III Bindung von MAk-135 an Zellinien, die Fc&epsi;R exprimieren % Positiv a Zellinien b IgE-LP MAk-135 FCS-LP c Maus-IgG c
a Die Zellen werden entweder mit IgE-LP (Beispiel 3) oder einem monoclonalen Antikörper und GAM-FITCTM (Beispiel 4) inkubiert und anschließend mittels Durchflußcytometrie analysiert.
b Die menschliche T-Zell-Linie MOLT 4 und die B-Zelllinien RPMI 8226 und CCL85 werden von der American type tissue culture collection erhalten. Die nicht-sezernierende menschliche B-Zellinie 181.21.2.20 AR wird durch Fusionieren von CCL 85-Zellen mit mononucleären, peripheren Blutzellen von einem Patienten mit monocytärer Leukämie [M. Sarfati et al., Immunoloy 53, 207 (1984)] hergestellt. Alle Zellinien werden, wie unter Tabelle II beschrieben, gezüchtet.
c FCS-LP und Maus-IgG dienen als Kontrollen für IgE-LP bzw. MAk-135.

5.2 Capping-Versuche:

Die RPMI 8866-Zellen werden unter Capping-Bedingungen mit MAk-135 oder jedem anderen MAk der Tabelle I inkubiert, anschließend gewaschen und schließlich mit IgE-LP umgesetzt. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37ºC in Gegenwart von 0,5 ug/ml MAk haben die Zellen vollständig ihre Fähigkeit, an GAM-FITCTM (Beispiel 4), aber auch an IgE-LP zu binden, verloren, was die Effizienz des Cappings anzeigt (Tabelle IV). In Kontrollversuchen wird gefunden, daß die Vorinkubation von RPMI 8866-Zellen unter Capping- Bedingungen mit den monoclonalen Antikörpern I2, B1 oder OKT9 (bezogen von Becton, Dickinson und Ortho), was handelsübliche Antikörper sind, die bekanntlich stark mit RPMI 8866 reagieren, keine Wirkung auf die anschließende Bindung von IgE-LP hat. Tabelle IV Capping von Fc&epsi;R durch MAk-135 RPMI 8866-Zellen vorinkubiert mit: Zellen, die Fc&epsi;R exprimieren Medium a Prozentsatz der Zellen, die mit IgE-LP reagieren, bezogen auf doppelte Histogramme von 20.000 Zellen. b Verwendet in einer Endkonzentration von 0,5 ug/ml.

Beispiel 6

Herstellung der Immunglobulinfragmente F(ab')&sub2;

MAks, die aus der Ascitesflüssigkeit isoliert wurden (Beispiel 2), werden mit dem Enzym Pepsin (5% Gewicht/Gewicht) 20 h lang bei 37ºC gespalten. Dieser Spaltansatz wird durch Gelfiltration (Sephadex® G-200, Pharmacia) fraktioniert, und die Fraktionen, die F(ab')&sub2;-Fragmente enthalten, werden weiter von verbleibendem, nichtgespaltenem IgG durch Absorption mit Sepharose gekoppelten Ziege-Antikörpern gegen Maus-IgG1 befreit. Der gereinigte Ig und dessen Fragmente werden durch SDS-PAGE getestet. Die Präparate werden mit Coomassie-Blau gefärbt.

Beispiel 7

Hemmung der Bindung des MAks an RPMI 8866-Zellen durch IgE

Die Vorinkubation von RPMI 8866-Zellen mit IgE sättigt den Fc&epsi;R und hemmt die anschließende Bindung des MAks an die Zellen, was die Spezifität der MAks für Fc&epsi;R zeigt. Diese Assays werden unter Verwendung der direkten Immunfluoreszenz (Beispiel 4) unter Verwendung von Grenzkonzentrationen an MAks (0,1 ug/ml), die 35 bis 70% der RPMI 8866-Zellen markieren, durchgeführt.
Die Fig. 3 zeigt, daß die Bindung von vier verschiedenen MAks (0,1 ug/ml) an RPMI 8866-Zellen dosisabhängig nach der Vorinkubation der Zellen mit entweder 10 oder 100 ug/ml IgE-PS (IgE 10, IgE 100) gehemmt wird. Andererseits ist keine Hemmung der Markierung nach Vorinkubation mit 100 ug/ml menschlichem IgG (IgG 100) offensichtlich. Jedes Histogramm beruht auf der Analyse von 20.000 Zellen.
In anderen ähnlichen Versuchen wird gefunden, daß IgA, IgM und IgD, die in Konzentrationen im Bereich von 100 bis 500 ug/ml verwendet werden, keine Wirkung auf die Bindung von MAk-135 an entweder RPMI 8866-Zellen oder an die EBV- Zellinien, die den Fc&epsi;R von Beispiel 5 exprimieren, besitzen (Tabelle II).

Beispiel 8

Einfluß des MAks auf die Bindung von IgG an FcγR

Bei diesen Assays werden mononukleare, periphere Blutzellen mit 10 ug/ml MAk-135 vorinkubiert und anschließend gewaschen und zur Rosettenbildung mit IgG-beschichteten Ochsen-Erythrocyten gebracht. In Abwesenheit von MAk bilden 11,4 ± 4,5% der Zellen Rosetten, verglichen mit 11,1 ± 3,4% in Gegenwart von 10 ug/ml MAk-135 (Mittelwert ± 1 Standardabweichung aus vier Versuchen).

Beispiel 9

Hemmung der Bindung des MAks an RPMI 8866-Zellen durch IgE-BF

Rindererythrocyten werden mit MAks, z. B. mit MAk-135, wie von S. Romagnani et al., J. Immunol. 124, 1620 (1980) beschrieben, beschichtet. 15 ul von 2%igen mit MAk-135 beschichteten Erythrocyten in Hanks' ausgeglichener Salzlösung, die 3% BSA enthält (HBSS-BSA), werden 60 min lang bei 4ºC mit 30 ul IgE-BF, das den zellfreien Überstand der RPMI 8866-Zellen in 10facher Konzentrierung enthält, oder mit HB101-Medium als negative Kontrolle unter intermittierendem Schütteln inkubiert. 15 ul RPMI 8866-Zellen (10&sup7; Zellen/ml in HBSS-BSA) werden zugesetzt, und nach 15 min bei 4ºC wird das Gemisch 5 min lang bei 4ºC bei 90 · g zentrifugiert und 2 h lang bei 0ºC gehalten. 200 ul HBSS-BSA, enthaltend Acridinorange, werden dem Pellet zugesetzt, und die Zellen werden sanft resuspendiert, bevor sie unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Der Hintergrund wird mit mit BSA beschichteten Erythrocyten bestimmt und zur Berechnung der Prozentsätze der Zellen, die Rosetten bilden, abgezogen. Die Rosetten werden an 500 bis 600 Zellen in doppelten oder dreifachen Präparaten gezählt. Tabelle V Einfluß des IgE-BF enthaltenden zellfreien Überstands auf die MAk-135-Bindung an RPMI 8866-Zellen Versuch Nr. % der Zellen, die Rosetten mit E-MAk-135 a bilden % Hemmung der Rosettenbildung E-MAk-134 vorinkubiert mit Medium E-MAk-134 vorinkubiert mit CFS b a E-MAk-135 bezeichnet Rindererythrocyten, die mit MAk-135 beschichtet sind. b CFS bezeichnet einen zellfreien Überstand, der IgE-BFs enthält.

Beispiel 10

Herstellung eines Immunoaffinitätsgels zur Reinigung von IgE-BFs

Affi-Gel®10 (Bio-Rad) wird nach den Angaben des Herstellers mit kaltem destilliertem Wasser und Kupplungspuffer (pH 8,0, 0,1 M NaHCO&sub3;-Lösung) gewaschen. Eine Suspension mit einer Stärke von 50% des Gels in Kopplungspuffer (2 ml) wird in ein Plastikreagenzglas gegeben und mit dem gleichen Volumen einer Lösung, die 10 mg MAk-30 enthält, vermischt, und das Gemisch wird 4 h lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Gel wird dann mit Kopplungspuffer gewaschen. Um die aktiven Stellen, die noch frei sind, zu blockieren, wird das Gel 2 h lang bei Raumtemperatur mit 0,1 ml 1 M Ethanolamin-HCI, pH 8,0, behandelt, dann mit PBS, das 10 mmol Natriumazid enthält, gewaschen und darin bei 4ºC aufgewahrt.
Ein Immunoaffinitätsgel, das MAk-45, MAk-94 oder MAk-135 enthält, wird auf ähnliche Weise hergestellt.

Beispiel 11

Reinigung von IgE-BF aus menschlichen B-Zellüberständen mittels Immunoaffinitätschromatografie

Der Kulturüberstand aus RPMI 8866-Zellen wird 100fach auf Amicon® YM5-Membranfiltern eingeengt. 70 ml dieser Lösung werden durch eine 2 ml Säule eines MAk-30- oder MAk-45-Affigels (Beispiel 10) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/h filtriert. Das Gel wird schrittweise mit 20 Volumina PBS, das mit 0,5 M NaCl und 0,05% Tween® 20 supplementiert ist, 5 Volumina PBS und 5 Volumina 9%iger NaCl-Lösung gewaschen. Der Proteingehalt des Durchflusses wird durch On- Line-Absorption bei 280 nm mittels eines Fotometers aufgezeichnet, um eine vollständige Entfernung der nichtgebundenen Proteine zu gewährleisten. Die Säule wird dann mit 8 ml 0,1 M Glycin-HCl/0,1 M NaCl, pH 2,6, eluiert, und die proteinhaltigen Fraktionen werden vereinigt, mit 1 M Tris neutralisiert und gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Die konzentrierten Lösungen aus gereinigten IgE-BF werden durch Behandlung mit einem elektrophoretischen ISCO-Konzentrator Modell 1750 (ISCO Inc.) und einer Membran (Spectrum Medical Industries) mit einem Ausschlußvolumen von 3,5 KD erhalten. Die Lösungen werden gegen 25 mM Ammoniumacetat, pH 8,3, dialysiert und dadurch auf ein Volumen von 0,2 ml eingeengt.
Dieser gereinigte IgE-BF wird wie folgt analysiert: Die Fraktionen werden mit Laemmli-Puffer, der 1% SDS und 5% 2-Mercaptoethanol enthält, inkubiert, anschließend in einzelne Proteine durch 12%ige SDS-PAGE und Silberfärbung, wie in dem BioRad-Handbuch beschrieben, aufgetrennt. Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 12, 16, 25 bis 28, 45 und 60 KD werden nachgewiesen. Sie werden dann elektrophoretisch (4 h bei 0,21A, Transferpuffer: 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM Glycin, 20% (Vol/Vol) Methanol) auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Die Membran wird mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 10% FCS enthält, blockiert. Streifen werden ausgeschnitten und einzeln mit MAk-30, 135 und 64, jeweils in einer Konzentration von 10 ug/ml umgesetzt. Nach 6-stündiger Inkubation werden die Streifen gewaschen und über Nacht mit Meerrettichperoxidase-Ziege-Anti-Maus-IgG umgesetzt. Die Streifen werden gewaschen und mit 4-Chlor-1- naphthol (Peroxidasesubstrat), wie in dem Anweisungshandbuch von BioRad ausgeführt, entwickelt. Der MAk-30, 135 und 64 reagiert jeweils mit der 25 bis 28 KD Proteinbande und unregelmäßig mit der 45 KD Proteinbande.

Beispiel 12

Weitere Reinigung des IgE-BF aus den B-Zellüberständen und Isolierung des 25 bis 28 KD Proteins

12.1 Ionenaustauschchromatografie und Immunaffinitätschromatografie:

Gereinigter IgE-BF aus Beispiel 11 in 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, wird auf eine TSK 545 DEAE-Säule (LKB) gegeben. Die Säule wird mit einem Überschuß an 0,05 M Tris- HCl gewaschen, und das Produkt wird mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert. Das 25 bis 28 KD Protein eluiert bei einer Konzentration von 0,15 M. Das erhaltene Produkt wird nochmals auf einer Säule aus einem MAk-30-Affigel gereinigt und mittels SDS-PAGE, wie in Beispiel 11 beschrieben, analysiert.

12.2. Umkehrphasen-HPLC:

Der gereinigte IgE-BF aus Beispiel 11 in 0,1% TFA/5% Acetonitril wird auf einer präparativen Hi-Pore®-RP-304-HPLC-Säule (Bio-Rad) mit einem Gradienten von 5 bis 75% Acetonitril in 0,1% TFA verarbeitet. Das 25 bis 28 KD Protein eluiert in einer Konzentration von 31%. Es ist bei Analyse mittels SDS-PAGE gemäß Beispiel 11 homogen.

12. 3. Präparative SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese:

Der gereinigte IgE-BF aus Beispiel 11 wird in Probenpuffer [U.K. Laemmli & M. Favre, J. Mol. Biol. 80, 575 (1973)] entwickelt. Die Stabgele (1,5 mm dick und 110 mm lang) werden, wie von Laemmli & Favre beschrieben, hergestellt. Das Trenngel enthält 12% Acrylamid und 0,32% Bisacrylamid. Am Ende der Elektrophorese werden Proteine durch Eintauchen des Gels in eine eiskalte 0,25 mM KCl-Lösung sichtbar gemacht. Das Gel enthält drei Banden mit einem engen Abstand im Molekulargewichtsbereich von 25 bis 28 KD. Das Gelstück, das die Mittelbande enthält, wird ausgeschnitten und extensiv gewaschen.
Ein ISCO-Probenkonzentrator (Modell 1750) wird verwendet, um gemäß A.J. Brown & J.C. Bennett [Methods in Enzymology 91, 450 (1983)] die Proteine von dem Gelstück zu eluieren. Das Protein wird dialysiert, um Glycin zu entfernen. Das SDS wird durch Ionenpaarextration, wie von W.H. Königsberg & L. Henderson [Methods in Enzymology 91, 254 (1983)] beschrieben, entfernt.

Beispiel 13

Bestimmung der Amiosäurezusammensetzung des 25 bis 28 KD Proteins

Das gemäß Beispiel 12.3 mittels SDS-PAGE gereinigte 25 bis 28 KD Protein (48 pmol, 1,2 ug) wird lyophilisiert, dann in 6 N HCl aufgelöst und bei 110ºC im Vakuum 24 h lang gekocht. Die Aminosäuren werden mit 4'-Dimethylaminoazobenzol-4-sulfonylchlorid in Natriumbicarbonatpuffer derivatisiert, und 5% des Gemisches (entsprechend 2,4 pmol pro Aminosäure) werden auf einer Merck Lichrosphere® 100 CH-18/2-HPLC-Säule unter Verwendung eines Waters-Geräts nach einem Verfahren von J.Y. Chang, R. Knecht & D.G. Braun [Methods of Enzymology, Band 91, 41-48 (1983)] analysiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Infolge eines Überschusses an freiem Glycin (1,2 nmol) in der Proteinprobe ist der korrigierte Wert für Gly in Tabelle VI weniger zuverlässig. Die Menge der Aminosäurereste wird auf der Basis einer Gesamtanzahl von 215 Aminosäuren, entsprechend einem Molekulargewicht von 25 KD, berechnet. Tabelle VI Aminosäurezusammensetzung des 25 bis 28 KD Proteins Aminosäure pmol gefunden Ungefähre Anzahl der Aminosäuren a) Tatsächlicher Bereich der Aminosäuren Asx (Asparaginsäure/Asgaragin) Glx (Glutaminsäure/Glutamin) Ser (Serin) Thr (Threonin) Gly (Glycin) Ala (Alanin) Arg (Arginin) Pro (Prolin) Val (Valin) Met (Methionin) Ile (Isoleucin) Leu (Leucin) Trp (Tryptophan) nicht nachgewiesen Phe (Phenylalanin) Cys (Cystein) Lys (Lysin) His (Histidin) Tyr (Tyrosin) a) Bezogen auf 215 Aminosäuren entsprechend einem Molekulargewicht von 25 KD b) Korrigierter Wert infolge von freiem Glycin in der Proteinprobe. Tatsächlicher Wert 109 pmol.

Beispiel 14

Herstellung von Fragmenten des 25 bis 28 KD Proteins

14.1 Durch einfache Lagerung:

Das gereinigte 25 bis 28 KD Protein wird ein paar Wochen bei 4ºC in Abwesenheit von Proteininhibitoren gehalten. Die Probe wird durch 12%ige SDS-PAGE, wie in Beispiel 11 beschrieben, aufgetrennt. Zusätzlich zu dem 25-28 KD Protein wird ein 14-16 KD Protein nachgewiesen. Beide Proteine reagieren bei Überführung auf Nitrocellulose mit MAk-30.

14.2 Durch Spaltung mit Papain:

0,1 ml immobilisiertes Papain (Pierce Chemicals, 7 BAEE-Einheiten pro ml abgesetztem Gel) werden mit einem Puffer aus 0,5 ml 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;/20 mM Cystein-HCl/10 mM EDTA, pH 6,2, vorgewaschen, dann dem gereinigten 25-28 KD Protein von Beispiel 12.2 in dem gleichen Puffer zugesetzt. Das Gemisch wird 16 h lang bei 37ºC unter Schütteln inkubiert, dann zentrifugiert und aufgetrennt, um die Reaktion zu stoppen. Der Überstand enthält reines 14-16 KD Protein (bestimmt mittels SDS-PAGE, Beispiel 11), das die Bildung von Rosetten der IgE-beschichteten Erythrocyten auf U937-Zellen (Beispiel 18 und Tabelle VII) hemmt.

14.3 Durch Spaltung mit Trypsin:

0,05 ml insolubilisiertes Trypsin (SIGMA, 86 BAEE-Einheiten pro ml) werden mit einem Phosphatpuffer mit pH 8 äquilibriert, dann dem gereinigten radioaktiv markierten 25-28 KD Protein (30.000 cpm) in Phosphatpuffer mit pH 8 zugesetzt. Das radioaktiv markierte 25-28 KD Protein wird durch Iodieren mit ¹²&sup5;I-Natriumiodid und Chloramin T, wie für den monoclonalen Antikörper in Beispiel 20 beschrieben, erhalten. Der Spaltansatz wird 16 h lang bei 30ºC unter Schütteln inkubiert, dann zentrifugiert, um die Reaktion zu stoppen. Der Überstand enthält das 14-16 KD Protein, das durch Autoradiografie unter Verwendung eines AR-5-Röntgenfilms (Kodak) nachgewiesen wird.
Die Spaltung mit Papa in unter Verwendung von radioaktiv markiertem 25-28 KD Protein wird auf ähnliche Weise durchgeführt.
Die Fig. 4 zeigt das Analysenergebnis einer Umkehrphasen-HPLC auf einer Hi-Pore® RP-304-Säule unter Verwendung eines Gradienten aus 5 bis 75% Acetonitril in 0,1% TFA, der Reaktionsprodukte, die bei Spaltung des radioaktiv markierten 25-28 KD Proteins des Beispiels 11 (RPMI 8866) bzw. des Beispiels 15 (Colostrum) mit Papain und Trypsin erhalten wurden. Die Counts pro min (cpm) sind als Funktion der Fraktionsnummer angegeben.

Beispiel 15

Reinigung von IgE-BF aus Colostrum

15.1 Colostrumpräparat:

Das Colostrum wird aus 15 nichtausgewählten gesunden Freiwilligen in den ersten zwei Tagen nach der Geburt gewonnen. Die Proben werden mit Proteaseinhibitoren (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mM Benzamidin, 50 mM &epsi;-Aminocapronsäure und 0,1% EDTA) behandelt und sofort auf -20ºC gefroren. Fünf Pools aus je drei Proben wurden parallel verarbeitet. Sie werden durch Ultrazentrifugation geklärt und dann mit Salzsäure auf pH 4,0 angesäuert, um das Casein auszufällen. Das Casein wird entfernt und die klaren Präparate werden mit 2 M Tris neutralisiert und durch einen 0,45 um Filter geleitet. Nach Filtration durch Amicon XM50-Membranen (Ausschlußmolekulargewicht 50 KD) werden die Proben gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.

15.2 Vorreinigung durch Gelchromatografie:

40 mg des lyophilisierten Colostrumpräparats (Beispiel 15.1) werden in 1,5 ml Puffer (40 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,05% Tween® 20, 10 mM &epsi;-Aminocapronsäure und 0,1% BSA), aufgelöst und auf eine kalibrierte Sephadex® G-75-Säule (2,5 · 90 cm) aufgebracht. Fraktionen entsprechend dem Molekulargewicht zwischen 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-45 und 45-60 KD werden vereinigt, auf 1,5 ml eingeengt und gegen Hanks' ausgeglichene Salzlösung (HBSS) dialysiert. Fraktionen mit Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von 25-30 KD enthalten den IgE-BF wie durch den IgE-Hemmtest in Beispiel 18 gezeigt wird. Wenn die Proteaseinhibitoren in Stufe 15.1 nicht zugesetzt werden, erscheinen aktive IgE-BF-Proteinfragmente in der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10-15 KD.

15.3 Reinigung auf MAk-94-Affigel mittels Immunaffinitätschromatografie:

Ein Colostrumpräparat (Beispiel 15.1) oder eine Lösung aus vorgereinigten IgE-BF (Beispiel 15.2), enthaltend 10 mg Protein pro ml, wird durch eine 2 ml Säule eines MAk-94-Affigels (Beispiel 10) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/h filtriert. Das Gel wird schrittweise mit 20 Volumina PBS, die mit 0,5 M NaCl und 0,05% Tween® 20 supplementiert sind, 5 Volumina PBS und 5 Volumina 0,9% NaCl gewaschen. Der Proteingehalt des Durchflusses wird durch On-Line-Absorption bei 280 nm mittels eines Uvicord®-Spektrofotometers überwacht, um eine vollständige Entfernung nichtgebundener Proteine zu gewährleisten. Die Säule wird dann mit 8 ml 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,6, eluiert, und die proteinhaltigen Fraktionen werden vereinigt.
Obwohl der durch dieses Verfahren erhaltene IgE-BF viele Eigenschaften mit dem IgE-BF aus dem Überstand der RPMI 8866-Zellen (Beispiel 11) teilt, unterscheidet er sich hinsichtlich der Bindung an den MAk-94 und den MAk-135, wie durch die in Beispiel 24 beschriebenen Radioimmunoassays gezeigt wird.

15.4 Behandlung mit MAk-30-Affigel:

Der gereinigte IgE-BF aus Beispiel 15.3 wird auf einer Säule aus MAk-30-Affigel (Beispiel 10), genau wie in Beispiel 15 beschrieben, verarbeitet.
Das eluierte Protein mit 25-28 KD unterscheidet sich nun nicht von dem aus dem Überstand der RPMI 8866-Zellen erhaltenen 25-28 KD Protein (Beispiel 12) in den folgenden Tests:
(1) Ionenaustausch-HPLC auf einer TSK 545-DEAE-Säule (LKB) unter Verwendung eines Gradienten aus 0 bis 0,5 M NaCl in 0,05 M Tris-HCl, wobei die Elution bei 0,17 M NaCl erfolgt.
(2) Umkehrphasen-HPLC auf einer Hi-Pore® RP-304-Säule (Bio-Rad) unter Verwendung eines Gradienten von 5 bis 75% Acetonitril in 0,1% TFA, wobei die Elution bei 31% Acetonitril erfolgt.
(3) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, wobei das Protein bei einem ungefähren Molekulargewicht von 25-28 KD wandert.
(4) Identisches Muster der Peptidfragmente, das auf der Umkehrphasen-HPLC auf einer Hi-Pore® RP-304-Säule unter Verwendung eines Gradienten von 5 bis 75% Acetonitril in 0,1% TFA einer mit Papa in oder mit Trypsin gespaltenen Probe beobachtet wird (Beispiel 14, Fig. 4).
(5) Hemmung der Rosettenbildung der U 937-Zellen durch IgE-beschichtete Rindererythrocyten unter Verwendung eines 25-28 KD Proteins oder eines 14-16 KD Proteins, erhalten durch Spaltung mit Papain (Beispiel 14).
(6) Identische Immunaffinitätseigenschaften, wie durch die Radioimmunoassays mit MAk-94 oder MAk-135 gezeigt wird (Beispiel 24).

Beispiel 16

Spaltung der Glycosidbindungen in dem 25-28 KD Protein

16.1 Mit N-Glycanase:

Das gemäß Beispiel 15 gereinigte 25-28 KD Protein (10 ul, 2,0 mg/ml) wird 3 min lang in Gegenwart von 0,5% SDS und 0,1 M β-Mercaptoethanol gekocht. Die Probe wird verdünnt, so daß eine Lösung aus 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,6), 5,0 mM EDTA und 1,25% NP-40 erhalten wird. N-Glycanase (aus Flavobacterium meningosepticum, Genzyme Corp., Bosten, MA) wird bis zu einer Endkonzentration von 10 Einheiten/ml zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die Reaktionsprobe wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, wie in Beispiel 11 beschrieben, analysiert. Das so erhaltene Protein erscheint bei einem geringfügig verringerten, offensichtlichen Mokekulargewicht von 24-26 KD.

16.2 Mit O-Glycosidase:

Natives 25-28 KD Protein (20 ug) oder radioaktiv markiertes 25-28 KD Protein (30.000 cpm, Beispiel 14.3) wird 60 min lang bei 37ºC in 50 ul eines Gemisches aus 0,001 M Calciumacetat, 10 mM D-Galactonsäure-γlacton, 0,02 M Tris-Maleatpuffer und 1 Einheit/ml Neuranminidase (SIGMA) inkubiert. 2 bis 4 Millieinheiten O-Glycosidase (aus Diplococcus peneumoniae, Genzyme Corp.) werden zugesetzt, und die Inkubation wird 4 h lang fortgesetzt. Die Reaktionsprobe wird mittels SDS-PAGE analysiert. Das so erhaltene Protein zeigt erneut ein offensichtliches Molekulargewicht von 24-26 KD.

Beispiel 17

Blockierung der IgE-Bindung an monoclonale Anti-IgE- Antikörper durch den gereinigten IgE-BF

Die Vertiefungen von Polyvinylchloridmikrotiterplatten werden über Nacht mit 200 ul PBS, enthaltend 1 ug/ml eines monoclonalen Antikörpers (Clon 175), der für menschliches IgE spezifisch ist, inkubiert. Die freie Bindungsfähigkeit der Oberfläche der Mikrotiterplatte wird mit PBS, das 10% FCS und 0,1% Natriumazid enthält, blockiert. 150 ul einer PBS-Lösung des gereinigten IgE-BFs aus Beispiel 11 des 100-fach konzentrierten Kulturüberstands aus RPMI 8866-Zellen, der IgE-BF enthält, oder aus RPMI 8226-Zellen, die als negative Kontrolle verwendet werden, werden über Nacht bei Raumtemperatur mit 50 ul PBS, enthaltend 6 · 10&sup4; cpm ¹²&sup5;I-markierten IgE (spezifische Aktivität 2,5 · 10&sup4; cpm/ng), vorinkubiert. 100 ul dieses Gemisches werden den anti-IgE- Antikörper-beschichteten Vertiefungen zugesetzt. Nach 5-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die Platten gewaschen, und die an die Vertiefungen gebundene Radioaktivität wird in einem Beckman-γ-Counter gemessen.
Der Zellüberstand aus den RPMI 8866-Zellen und der gereinigte IgE-BF aus Beispiel 11 hemmen die Bindung von radioaktiv markiertem IgE um 50 bzw. 75%, bestimmt in Bezug auf die negative Kontrolle (RPMI 8226-Zellüberstand) in mehreren Versuchen.
Der für menschliches IgE spezifische monoclonale Antikörper wird nach einem herkömmlichen Verfahren, das dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, produziert. Balb/c-Mäuse werden zweimal mit 50 ug IgE-PS in vollständigem Freundschem Adjuvans in zweiwöchigen Intervallen immunisiert. Drei Wochen nach der letzten Injektion erhalten sie eine zusätzliche Injektion von 50 ug IgE-PS in Kochsalzlösung. Drei Tage später werden die Milzzellen mit NSI/1- Ag4/1-Myelomazellen fusioniert. Die Clone werden auf der Basis von RIAs unter Verwendung von mit IgE und IgG beschichteten Polyvinylchloridmikrotiterplatten und markiertem Ziege-anti-Maus-IgG selektioniert. Der monoclonale Antikörper ist für eine Determinante innerhalb der hitzelabilen Region von IgE spezifisch.

Beispiel 18

Hemmung der Bindung von IgE an RPMI 8866- oder U 937-Zellen durch IgE-BF

Rindererythrocyten werden mit einer suboptimalen Konzentration an gereinigtem IgE-PS (von Dr. K. Ishizaka, John Hopkins University, Baltimore, MD) beschichtet. Die beschichteten Erythrocyten werden mit entweder Kontrollpuffer (HBSS-BSA) oder Testlösungen 60 min lang bei 4ºC vorinkubiert. Die RPMI 8866-Zellen oder die U 937-Zellen werden zugesetzt. Das Präparat wird bei 90 · g zentrifugiert und 2 h lang bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop nach Zugabe von Acridinorange, wie in Beispiel 9 beschrieben, untersucht.
Die Versuche mittels Affinitätschromatografie werden, wies in den Beispielen 11 oder 15 beschrieben, unter Verwendung von gereinigtem IgE-PS oder polyclonalem IgG in Kopplung an Sephadex® 4B bei einer Konzentration von 4 mg Protein pro ml Gel durchgeführt. Die Effluenten (Filtrate) und die Eluate werden auf das anfängliche Volumen der Probe eingeengt und sofort neutralisiert und gegen HBSS dialysiert. Tabelle VII Einfluß von IgE-BF auf die IgE-PS-Bindung an RPMI 8866- oder U 937-Zellen Probe % der Zellen, die mit E-IgE a eine Rosette bilden % der Hemmung der Rosetten Versuch Nr. 1: Verarbeitung von Colostrum Kontrollpuffer Colostrumpräparat IgE-Sepharose, Eluat c IgG-Separose, Eluat MAk-94-Affigel, Effluent MAk-94-Affigel, Eluat MAk-93 (30 ug/ml) Versuch Nr. 2: Vergleich von Colostrum und RPMI 8866-IgE-BF nach MAk-30-Affigelchromatografie Kontrollpuffer Colostrum IgE-BF RPMI 8866 IgE-BF Versuch Nr. 3: Vergleich von Colostrum IgE-BF nach MAk-94-Affigel- und nach MAk-30-Affigelchromatografie Kontrollpuffer MAk-94-Affigel, Eluat MAk-30-Affigel, Eluat Probe % der Zellen, die mit E-IgE a eine Rosette bilden % der Hemmung der Rosetten Versuch Nr. 4: Vergleich von Colostrum IgE-BF nach MAk-30-Affigelchromatografie und nach Spaltung mit Papain (Beispiel 14) Kontrollpuffer Colostrum IgE-BF Kontrollpuffer Papainspaltansatz
a E-IgE bezeichnet Rindererythrocyten, die mit IgE-PS beschichtet sind
b Mittelwert ± 1 Standardabweichung aus 4 Versuchen
c Die Effluenten und Eluate werden, wie in Beispiel 15 beschrieben, erhalten und werden in einer Verdünnung von 1/10 nach Dialyse gegen HBSS verwendet.
d Verdünnung

Beispiel 19

Herstellung eines Konjugats des F(ab')&sub2;-Fragments aus MAk-135 mit Biotin

Das gereinigte F(ab')&sub2;-Fragment des MAk-135 (Beispiel 6, 10 mg) wird in einer Konzentration von 1,0 mg/ml über Nacht gegen 1 M NaHCO&sub3; dialysiert. Der pH-Wert wird überprüft, und es wurde gefunden, daß er zwischen 8,2 und 8,6 liegt. Der Biotin-Succinimidester (Biosearch) wird in DMSO kurz vor Gebrauch in einer Konzentration von 1,0 mg/ml aufgelöst. 0,6 ml dieser Lösung werden der Antikörperfragmentlösung zugesetzt, sofort vermischt und 4 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird gegen PBS, die 10 mmol Natriumazid enthält, über Nacht dialysiert und dann in einem Kühlschrank gelagert.

Beispiel 20

Herstellung des ¹²&sup5;I-markierten Antikörpers MAk-135

40 ug MAk-135 werden mit 0,5 mCi ¹²&sup5;I Natriumiodid und Chloramin T nach dem allgemeinen Verfahren von F.C. Greenwood et al., Biochem J. 89, 114 (1963) iodiert. Das Reaktionsprodukt wird durch Chromatografie auf einem Ionenaustauscherharz Bio Rad AG 1 · 8® gereinigt und besitzt eine spezifische Aktivität von 20.000 cpm/ng.
Die ¹²&sup5;I-markierten Antikörper MAk-176 und MAk-94 werden auf ähnliche Weise hergestellt.

Beispiel 21

Radioimmunoassay zum Nachweis des IgE-BF in Zellüberständen und Serum

Die Vertiefungen von Polyvinylchloridmikrotiterplatten werden über Nacht bei Raumtemperatur mit 150 ul 0,01 M Carbonatpuffer, pH 9, enthaltend 15 ug/ml MAk-176, inkubiert. Die Platten werden dann gewaschen und 2 h lang bei Raumtemperatur mit 200 ul Hanks' ausgeglichener Salzlösung, die 10% fötales Kälberserum (HBSS-FCS) enthält, umgesetzt, erneut gewaschen und mit 100 ul einer Testprobe 4 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Leerwert wird unter Verwendung von HBSS-FCS bestimmt. Die Platten werden gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur mit ¹²&sup5;I-MAk-135 (2 bis 4 · 10&sup5; cpm in HBSS-FCS, Beispiel 20) inkubiert, dann gewaschen und in einem y-Counter ausgemessen. Alle Waschungen werden mit PBS (0,15 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2) durchgeführt.
Die von Fc&epsi;R tragenden Zellen abgeleiteten Kulturüberstände, die IgE-BFs enthalten, ergeben eine signifikante Bindung von ¹²&sup5;I-MAk-135 über dem Hintergrund (0,5%). Im Gegensatz dazu ergeben die Kulturüberstände, die keine IgE- BFs enthalten, negative Ergebnisse (Tabelle VIII). Das Vorhandensein oder Fehlen des IgE-BF in den Zellüberständen wird durch den Rosettenhemmtest, wie in Beispiel 18 beschrieben, bestätigt. Der RIA weist keine IgE-BFs aus menschlichem Colostrum nach, ausgenommen nach Immunoaffinitätschromatografie über MAk-30 (Beispiel 15.4). Tabelle VIII RIA-Nachweis der Sekretion der IgE-BFs durch verschiedene menschliche Zellinien
Zellinien a cpm b Netto-cpm c
a Die durch EBV transformierten Zellinien werden, wie von M. Sarfati et al., Immunology 53, 207 (1984) beschrieben, erhalten. Die menschliche RPMI 8226-B-Zellinie wird von der American type tissue culture collection erhalten. Die Zellinie U266 stammt von Dr. K. Nilssen, Uppsala, Schweden. RPMI 8866-F7 ist ein Subclon von RPMI 8866, erhalten durch Grenzverdünnung. Die Zellinien werden, wie unter Tabelle II beschrieben, gezüchtet.
b Zwei Replikate, nichtkonzentrierte Zellüberstände.
c Mittelwert, Nettowert (Leerwert = 150).
Die Fig. 5 zeigt eine Standardkurve, die durch stufenweise zweifache Verdünnung eines Referenzkulturüberstands aus RPMI 8866-Zellen, die den IgE-BF enthalten, erhalten wurde. Die Empfindlichkeit des Assays ist derart, daß er noch IgE-BFs in einer 1/50.000-fachen Verdünnung des Standards nachweisen kann. Die Standardkurve zeigt eine lineare Abhängigkeit der gebundenen Radioaktivität von der Konzentration an IgE-BF, die in der Testlösung in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 1000 enthalten ist.
Ein weiterer Beweis für die Spezifität des beschriebenen RIAs auf IgE-BF, wie er in den B-Zellüberständen gefunden wird, stammt aus Versuchen, bei denen die Zellüberstände aus RPMI 8866-Zellen, die bekanntlich den IgE-BF enthalten, mit IgE-Sepharose, IgG-Sepharose bzw. Ethanolamin- Sepharose vorbehandelt werden. Während eine klare Reduktion (zwischen 57 und 80% in vier verschiedenen Versuchen) der gebundenen radioaktiv markierten MAks in einem RIA des IgE- sepharose-behandelten Zellüberstands beobachtet wird, wird keine signifikante Verringerung bei mit IgG-Sepharose oder Ethanolamin-Sepharose behandelten Zellüberständen gefunden. Der an IgE-Sepharose gebundene IgE-BF kann durch Elution mit 0,1 M Glycinhydrochlorid, pH 2,8, gewonnen und durch den RIA nachgewiesen werden. Die Adsorption von IgE-BF an die IgE-Sepharose ist infolge der niedrigen Affinität des an einen festen Träger gekoppelten IgE nicht vollständig.

Beispiel 22

Radioimmunoassay zum Nachweis von IgE-BF in Colostrum und Serum

Die Vertiefungen von Polyvinylchloridmiktrotiterplatten werden über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 ul 0,01 M Carbonatpuffer, pH 9, enthaltend 15 ug/ml MAk-84, inkubiert. Die Platten werden dann gewaschen und 2 h lang bei Raumtemperatur mit 150 ul Hanks' ausgeglichener Salzlösung, enthaltend 10% fötales Kälberserum (HBSS-FCS) umgesetzt, dann erneut gewaschen und mit 100 ul einer Testprobe über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der Leerwert wird unter Verwendung von HBSS-FCS bestimmt. Die Platten werden gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 ul ¹²&sup5;I-MAk-94 in HBSS-FCS (3 · 10&sup5; cpm pro Vertiefung, Beispiel 20) inkubiert, dann gewaschen und in einem y-Counter ausgemessen. Alle Waschungen werden mit PBS (0,15 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2) durchgeführt.
Die Fig. 6 zeigt, daß der RIA unter Verwendung von MAk- 94 und ¹²&sup5;I-MAk-94 zum Nachweis von IgE-BF in Colostrum und in Serum nützlich ist, wobei eine lineare Abhängigkeit für Verdünnungen bis hinunter auf 1/32 erhalten wird. Der RIA wird durch bis zu 100 ug/ml von anderen Klassen von Immunglobulinen, z. B. IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, nicht beeinflußt. Der MAk-94 weist IgE-BF, wie er in dem Überstand von RPMI 8866-Zellen gefunden wird, oder IgE-BF aus Colostrum nach Immunaffinitätschromatografie über MAk-30 nicht nach (Beispiel 15.4).
Die Selektivität des beschriebenen RIAs wird weiter durch die Tatsache nachgewiesen, daß das Eluat aus einem Colostrumpräparat, das an eine IgE-Sepharose adsorbiert ist, leicht nachgewiesen wird, wohingegen ein Kontrolleluat aus einem Colostrumpräparat, das an IgG-Sepharose adsorbiert ist, nicht reagiert.

Beispiel 23

Testkit für einen RIA auf IgE-BF

Ein Testkit für den in Beispiel 21 oder 22 beschriebenen Radioimmunoassay enthält:
Polyvinylchloridmiktrotiterplatten
20 ml einer Lösung aus MAk-176 oder MAk-94 (10 ug/ml)
20 ml einer Lösung aus ¹²&sup5;I-markiertem MAk-135 oder MAk94 (spezifische Aktivität 6 · 10&sup6; cpm/ml)
20 ml 0,02 M Carbonatpuffer, pH 9
100 ml Hanks' ausgeglichene Salzlösung, enthaltend 10% FCS
200 ml PBS
2 ml Referenzzellüberstand aus RPMI 8877-Zellen oder eines Colostrumpräparats, das IgE-BF enthält Standardkurve.

Beispiel 24

Selektivität der MAks gegen IgE-BF aus verschiedenen Quellen und IgE-BF in verschiedenen Verarbeitungsstadien

Der Kulturüberstand aus RPMI 8866-Zellen wird 1 : 10 verdünnt, und es wird gefunden, daß er 7,5% des ¹²&sup5;I-MAk-135 in dem RIA von Beispiel 21, aber 0% des ¹²&sup5;I-MAk-94 in dem RIA von Beispiel 22 bindet. Die Probe wird durch eine Säule aus MAk-135-Affigel (Beispiel 10) filtriert. Das Filtrat bindet nicht die ¹²&sup5;I-MAk-135 (0%), wohingegen das Eluat (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,6) 8,5% des ¹²&sup5;I-MAk-135 bindet. Eine Probe gleicher Größe wird durch eine Säule aus MAk-94- Affigel filtriert. Das Filtrat bindet 6,9% ¹²&sup5;I-MAk-135, wohingegen das saure Eluat keinen IgE-BF enthält (0% Bindung). Während des Versuchs werden die Filtrate und Eluate auf das gleiche Volumen eingestellt, um einen Vergleich zu erlauben. Der gesamte Count-Wert beträgt etwa 3,5 · 10&sup5; cpm.
In dem entsprechenden Versuch wird gefunden, daß 1 : 5 verdünnter Colostrum 2,6% des ¹²&sup5;I-MAk-94 bindet, aber 0% des ¹²&sup5;I-MAk-135. Nach Adsorption auf MAk-94-Affigel wird 0% ¹²&sup5;I-MAk-94 in dem Filtrat gebunden, während 4,5% in dem sauren Eluat gebunden werden. Nach Adsorption auf Affigel in Kopplung an einen nicht verwandten MAk (z. B. der MAk gegen Prolactin) werden 1,07% ¹²&sup5;I-MAk-94 in dem Filtrat gebunden, wohingegen 0% in dem Eluat gebunden werden.
Wenn jedoch IgE-BF aus Colostrum nach Reinigung auf MAk-93-Affigel an MAk-30-Affigel (Beispiel 15.4) adsorbiert wird, bindet das Filtrat 0,2% ¹²&sup5;I-MAk-135 und 0,6% ¹²&sup5;I-MAk-94, und das Eluat nun 2,56% ¹²&sup5;I-MAk-l35, aber 0% ¹²&sup5;I-MAk-94. Ein anderes colostrumpräparat, das nicht auf
MAk-94-Affigel gereinigt wurde, ergibt 0% Bindung von ¹²&sup5;I-MAk-135 und 5,75% Bindung von ¹²&sup5;I-MAk-94. Nach Adsorption auf MAk-30-Affigel bindet das Filtrat 8% ¹²&sup5;I-MAk-135 und 1,95% ¹²&sup5;I-MAk-94, und das Eluat 6,4% ¹²&sup5;I-MAk-135 und 0,13% ¹²&sup5;I-MAk-94.

Beispiel 25

Enzymimmunoassay (ELISA) zum Nachweis von IgE-BF

Die Vertiefungen von Polyvinylchloridmikrotiterplatten werden mit MAk-176 beschichtet und mit HBSS-FCS, wie in Beispiel 21 beschrieben, blockiert. Die Platten werden mit 100 ul einer Testprobe 4 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann gewaschen und 4 h lang bei Raumtemperatur mit dem MAk-135-Fragment des Biotinkonjugats (10 ug/ml) von Beispiel 19 inkubiert. Die Platten werden mit PBS gewaschen, dann über Nacht bei Raumtemperatur mit einer 1/3000 Verdünnung eines Avidin-Meerrettichperoxidasekonjugats (0,3 ug/ml) von Sigma inkubiert. Die Menge des gebundenen Enzyms wird durch Entwicklung (30 min bei 37ºC) mit einer Lösung von 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)diammoniumsalz (ABTS, Boehringer Mannheim, 55 mg in 100 ml Citrat/Phosphatpuffer, 0,05 M Citrat/0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 4,0, enthaltend 16 ul 30% H&sub2;O&sub2;) und durch fotometrische Messung bei 405 nm bestimmt.
Auf ähnliche Weise kann der MAk-94 verwendet werden, um Platten zu beschichten, und ein MAk-94-Biotinkonjugat, um IgE-BF aus Colostrum nachzuweisen.

Beispiel 26

Testkit für einen ELISA auf IgE-BF

Ein Testkit für den in Beispiel 25 beschriebenen ELISA enthält:
Polyvinylchloridmikrotiterplatten
20 ml Lösung aus MAk-176 (10 ug/ml)
20 ml Lösung des MAk-135-Fragments in Konjugation an Biotin (10 ug/ml)
20 ml 0,02 M Carbonatpuffer, pH 9
100 ml Hanks' ausgeglichene Salzlösung, enthaltend 10% FCS
1 mg lyophilisiertes Avidin-Meerrettichperoxidasekonjugat
11 mg ABTS
20 ml citrat/Phosphatpuffer, 0,05 M Citrat/0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;
1 ml 30% H&sub2;O&sub2;
200 ml PBS
2 ml IgE-BF-haltige Referenzlösung

Beispiel 27

Pharmazeutisches Präparat (parenterale Verabreichung)

100 mg IgE-BF, welcher mittels Affinitätschromatografie gereinigt wurde (Beispiel 11 oder 15), werden in 600 ml 5 N Humanserumalbumin aufgelöst. Die so erhaltene Lösung wird durch einen bakteriologischen Filter geleitet, und die filtrierte Lösung wird unter aseptischen Bedingungen in 100 Phiolen, die jeweils 1 mg Wirkstoff enthalten, unterteilt. Die Phiolen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, werden bevorzugt in der Kälte, beispielsweise bei -20ºC gelagert.
Auf gleiche Weise können Phiolen, die 1 mg des 25-28 KD Proteins (Beispiel 11 oder Beispiel 15) enthalten, unter Verwendung von 100 mg lyophilisiertem 25-28 KD Protein hergestellt werden.

Claims

1. Gereinigter, menschliches Immunglobulin E-bindender Faktor (IgE-BF), erhältlich aus menschlichen B-Zellüberständen oder menschlichem Colostrum, dessen einzelne gegebenenfalls glycosylierte Proteine, und Fragmente davon, dadurch gekennzeichnet, daß der IgE-BF durch Immunaffinitätschromatografie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers gegen zelluläre Lymphocytenrezeptoren für IgE (Fc&epsi;R), die mit dem IgE-BF aus den menschlichen B-Zellen oder aus menschlichem Colostrum Kreuzreaktion zeigen, erhältlich ist.

2. Gereinigter IgE-BF nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er

(1) nur gegebenenfalls glycosylierte Proteine menschlichen Ursprungs enthält, die von monoclonalen Antikörpern gegen die Lymphocytenrezeptoren für IgE (Fc&epsi;R) erkannt und gebunden werden,

(2) aus Molekülen mit einem offensichtlichen, ungefähren Molekulargewicht von 25-28 KD (Kilo-Dalton, kg/mol), bestimmt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Silberfärbung und gegebenenfalls anderen Proteinen, die an für Fc&epsi;R spezifische monoclonale Antikörper binden, besteht,

(3) reversibel an IgE bindet, bestimmt mittels Adsorption an und mögliche Gewinnung aus einem Agarosegel mit gebundenem IgE,

(4) die Bindung von IgE an Zellen, die Rezeptoren für IgE tragen, blockiert, bestimmt durch Hemmung der Bindung von IgE-beschichteten Latexteilchen an RPMI 8866-Zellen, die Fc&epsi;R exprimieren,

(5) die Bindung von IgE an monoclonale Antikörper, die spezifisch für IgE sind, blockiert, bestimmt mittels radioaktiv markiertem IgE und monoclonalen Antikörpern dagegen, die an Mikrotiterplatten fixiert sind,

(6) ein Bestandteil von Kulturüberständen aus menschlichen B-Zellen, die Rezeptoren für IgE exprimieren (Fc&epsi;R&spplus;) oder von menschlichem Colostrum ist.

3. Gegebenenfalls glycosyliertes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es (1) von monoclonalen Antikörpern gegen die Lymphocytenrezeptoren für IgE (Fc&epsi;R) erkannt und gebunden wird,

(2) reversibel an IgE bindet, bestimmt durch dessen Adsorption an und mögliche Gewinnung aus einem Agarosegel mit gebundenem IgE,

(3) die Bindung von IgE an Zellen, die IgE-Rezeptoren tragen, blockiert, bestimmt durch Hemmung der Bindung von IgE-beschichteten Latexteilchen an RPMI 8866-Zellen, die Fc&epsi;R exprimieren,

(4) die Bindung von IgE an monoclonale Antikörper, die für IgE spezifisch sind, blockiert, bestimmt mittels radioaktiv markiertem IgE und monoclonalen Antikörpern dagegen, die an Mikrotiterplatten fixiert sind,

(5) nach den herkömmlichen Verfahren der Proteinanalyse z. B. SDS-PAGE oder Gelfiltrations-Hochdruckflüssigkeitschromatografie, homogen ist.

4. Gegebenenfalls glycosyliertes Protein nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein offensichtliches Molekulargewicht von 25-28 KD, bestimmt mittels SDS-PAGE, und den folgenden ungefähren Bereich der Gesamtaminosäurezusammensetzung besitzt: Asparginsäure/Asparagin 19-23, Glutaminsäure/Glutamin 25-31, Serin 22-26, Threonin 8-10, Glycin 15-25, Alanin 16-20, Arginin 10-12, Prolin 13-16, Valin 10-12, Methionin 3-5, Isoleucin 7-9, Leucin 13-17, Tryptophan 0, Phenylalanin 6-9, Cystein 3-4, Lysin 8-10, Histidin 4-5 und Tyrosin 6-8.

5. Gegebenenfalls glycosyliertes Protein nach Anspruch 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem signifikanten Ausmaß von dem monoclonalen Antikörper, der von der Hybridoma-Zellinie mit der Bezeichnung CNCM I-425 produziert wird, aber nicht von dem monoclonalen Antikörper, der von der Hybridoma-Zellinie mit der Bezeichnung CNCM I-486 produziert wird, gebunden wird.

6. Gegebenenfalls glycosyliertes Protein nach Anspruch 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem signifikanten Ausmaß von dem monoclonalen Antikörper, der von der Hybridoma-Zellinie mit der Bezeichnung CNCM I-486 produziert wird, aber nicht von dem monoclonalen Antikörper, der von der Hybridoma-Zellinie mit der Bezeichnung CNCM I-425 produziert wird, gebunden wird.

7. Protein nach Anspruch 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es keine Kohlenhydratreste besitzt.

8. IgE-BF-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es

(1) von monoclonalen Antikörpern gegen die Lymphocytenrezeptoren für IgE (Fc&epsi;R) erkannt und gebunden wird,

(5) nach den herkömmlichen Verfahren der Proteinanalyse z. B. SDS-PAGE oder Gelfiltrations-Hochdruckflüssigkeitschromatografie homogen ist,

(6) ein offensichtliches Molekulargewicht zwischen 10 und 20 KD, bestimmt mittels SDS-PAGE, besitzt.

9. IgE-BF-Fragment nach Anspruch 1 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es durch enzymatische Teilspaltung einzelner, gegebenenfalls glycosylierter IgE-BF-Proteine erhältlich ist.

10. IgE-BF-Fragment nach Anspruch 1, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein offensichtliches Molekulargewicht zwischen 14 und 18 KD, bestimmt mittels SDS-PAGE, besitzt.

11. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem IgE-BF, dessen einzelne , gegebenenfalls glycosylierte Proteine, und Fragmente davon, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung, die IgE-BF enthält, in Kontakt mit einem Trägermaterial, das für Fc&epsi;R spezifische monoclonale Antikörper trägt, gebracht wird, nichtgebundene Proteine und andere Fremdsubstanzen entfernt werden, der an die Antikörper auf dem Träger gebundene IgE-BF selektiv abgespalten und isoliert wird, und gegebenenfalls der gereinigte IgE-BF in dessen einzelne, gegebenenfalls glycosylierte Proteine und/oder Fragmente davon aufgetrennt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, die IgE-BF enthält, ein Kulturüberstand einer kontinuierlichen menschlichen B-Zellinie, die Rezeptoren für IgE exprimiert, ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, die IgE-BF enthält, ein Kulturüberstand der Zellinie RPMI 8866 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, die IgE-BF enthält, ein Colostrumpräparat ist.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, die IgE-BF enthält, von menschlichem Colostrum durch Behandlung mit einem Proteaseinhibitor, Klären, Ansäuern, Entfernen des ausgefällten Caseins, Neutralisieren, Entfernung von Molekülen mit einem Molekulargewicht über 50 KD, Dialyse, Lyophilisation und gegebenenfalls weitere Reinigungsstufen erhalten wird.

16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte IgE-BF weiter durch Ionenaustauschchromatografie gereinigt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte IgE-BF weiter durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte IgE-BF in seine einzelnen gegebenenfalls glycosylierten Proteine durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 11 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte IgE-BF oder die einzelnen, gegebenenfalls glycosylierten Proteine mit Enzymen, die Glycosidbindungen spalten, behandelt wird/werden.

20. Verfahren nach Anspruch 11 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte IgE-BF oder die einzelnen, gegebenenfalls glycosylierten Proteine mit einer Protease behandelt werden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease Papain oder Trypsin ist.

22. Monoclonale Antikörper gegen zelluläre Lymphocytenrezeptoren für IgE (Fc&epsi;R), die mit dem menschlichen Immunglobulin E-bindenden Faktor (IgE-BF) Kreuzreaktion zeigen, und Derivate davon.

23. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie von Maus/Maus-Hybridomazellen produziert werden.

24. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie von jeder der Hybridoma-Zellinien 208.25 D.2/94 C.N.C.M.I-486, 208.25 A.4.3/135 C.N.C.M.I-425, 207.25 A.4.4/30 C.N.C.M.I-451, 207.25 A.4.4/45 C.N.C.M.I-452, 208.25 D.2.1/176, C.N.C.M.I-420 sezerniert werden.

25. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie Immunglobuline der Klasse IgG sind.

26. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie von der Hybridoma-Zellinie 208.25 A.4.3/135 (C.N.C.M.I-425) sezerniert werden.

27. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie von der Hybridoma-Zellinie 207.25 A.4.4/30, (C.N.C.M.I-451) sezerniert werden.

28. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie von der Hybridoma-Zellinie 207.25 A.4.4/45 (C.N.C.M.I-452) sezerniert werden.

29. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie von der Hybridoma-Zellinie 208.25 D.2.1/176 (C.N.C.M.I-420) sezerniert werden.

30. Monoclonale Antikörper und Derivate davon nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie von der Hybridoma-Zellinie 208.25 D.2/94 (C.N.C.M.I-486) sezerniert werden.

31. Monoclonales Antikörperderivate nach Anspruch 26 oder 30, markiert mit ¹²&sup5;Iod.

32. Monoclonales Antikörperfragment F(ab')&sub2; nach Anspruch 26.

33. Monoclonales Antikörperderivat nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörperfragment F(ab')&sub2; an Biotin konjugiert ist.

34. Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern und Derivaten davon nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomazellen, die die monoclonalen Antikörper sezernieren, in einer geeigneten Umgebung vermehrt werden, und die monoclonalen Antikörper daraus isoliert werden, und gegebenenfalls die so erhaltenen monoclonalen Antikörper in ein Derivat davon umgewandelt werden.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomazellen in vitro gezüchtet werden, und die monoclonalen Antikörper aus dem Kulturüberstand isoliert werden, oder in vitro in einem geeigneten Säugetiert vermehrt werden, und die monoclonalen Antikörper aus den Körperflüssigkeiten des Säugetiers isoliert werden, und gegebenenfalls die so erhaltenen monoclonalen Antikörper in ein Derivat davon umgewandelt werden.

36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die von Balb/c-Mäusen abgeleiteten Hybridomazellen Balb/c-Mäusen, die gegebenenfalls mit einem Kohlenwasserstoff vorbehandelt wurden, injiziert werden, und nach ein bis zwei Wochen die Ascitesflüssigkeit dieser Mäuse gewonnen wird, und die Antikörper daraus durch Ammoniumsulfatfällung und chromatografische Reinigung isoliert werden.

37. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die von Balb/c-Mäusen abgeleiteten Hybridomazellen, die die gewünschten Antikörper sezernieren, in RPMI 1650-Medium, das mit FCS komplettiert ist, unter Rühren in einer mit CO&sub2; angereicherten Luftatmosphäre und bei einer physiologischen Temperatur vermehrt werden, und die monoclonalen Antikörper daraus durch Filtration und Ammoniumsulfatfällung und/oder durch chromatografische standardverfahren isoliert werden.

38. Hybridoma-Zellinien, dadurch gekennzeichnet, daß sie die monoclonalen Antikörper nach Anspruch 22 produzieren.

39. Hybridoma-Zellinien nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie Hybride von Mausmyelomzellen und B-Lymphocyten einer syngenen Maus sind.

40. Hybridoma-Zellinie nach Anspruch 38, ausgewählt aus den Hybridoma-Zellinien mit der Bezeichnung 208.25 D.2/94 C.N.C.M.I-486, 208.25 A.4.3/135 C.N.C.M.I-425, 207.25 A.4.4/30 C.N.C.M.I-451, 207.25 A.4.4/45 C.N.C.M.I-452, 208.25 D.2.1/176, C.N.C.M.I-420.

41. Hybridoma-Zellinie 208.25 A.4.3/135 nach Anspruch 40, hinterlegt bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-425.

42. Hybridoma-Zellinie 207.25 A.4.3/30 nach Anspruch 40, hinterlegt bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-451.

43. Hybridoma-Zellinie 207.25 A.4.4/45 nach Anspruch 40, hinterlegt bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-452.

44. Hybridoma-Zellinie 208.25 D.2.1/176 nach Anspruch 40, hinterlegt bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-420.

45. Hybridoma-Zellinie 208.25 D.2/94 nach Anspruch 40, hinterlegt bei der "Collection Nationale de Culture de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-486.

46. Verfahren zur Herstellung von Hybridomazellen nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß ein geeignetes Säugetier mit Lymphocyten, die Fc&epsi;R exprimieren, immunisiert wird, antikörperproduzierende Zellen dieses Säugetiers mit Myelomazellen fusioniert werden, die bei der Fusion erhaltenen Hybridzellen cloniert werden, und die die gewünschten Antikörper sezernierenden Zellclone ausgewählt werden.

47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß lebensfähige RPMI 8866-Zellen zur Immunisierung verwendet werden.

48. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die antikörperproduzierenden Zellen einer Balb/c-Maus mit den Myelomazellen der Zell- Linie NSI/1-Ag4/1 fusioniert werden.

49. Verwendung der monoclonalen Antikörper und Derivate nach Anspruch 22 zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgE-BF, einzelner, gegebenenfalls glycosylierter Proteine und Fragmente davon.

50. Verwendung der monoclonalen Antikörper und Derivate in einem Radioimmunoassay nach Anspruch 49.

51. Verwendung der monoclonalen Antikörper und Derivate in einem Enzymimmunoassay nach Anspruch 49.

52. Testkits zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgE-BF, einzelner gegebenenfalls glycosylierter Proteine und Fragmente davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die monoclonalen Antikörper und/oder Derivate davon nach Anspruch 22 und gegebenenfalls Hilfsmittel enthalten.

53. Verwendung der monoclonalen Antikörper und Derivate nach Anspruch 22 zur Reinigung von IgE-BF, einzelner gegebenenfalls glycosylierter Proteine und/oder der Fragmente davon.

54. Pharmazeutische Präparate, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an gereinigtem IgE-BF, an dessen einzelnen, gegebenenfalls glycosylierten Proteinen oder Fragmenten nach Anspruch 1 und eine signifikante Menge eines pharmazeutischen Hilfsmittels.