JPH1099074A - 免疫グロブリンｅのためのリセプターに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライン - Google Patents

免疫グロブリンｅのためのリセプターに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライン

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JPH1099074A
JPH1099074A JP9179661A JP17966197A JPH1099074A JP H1099074 A JPH1099074 A JP H1099074A JP 9179661 A JP9179661 A JP 9179661A JP 17966197 A JP17966197 A JP 17966197A JP H1099074 A JPH1099074 A JP H1099074A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＩｇＥのためのリンパ球細胞リセプター（Ｆ
ｃεＲ）に対する抗体を生産するハイブリドーマセルラ
インの提供。 【解決手段】 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抑制因子
（ＩｇＥ−ＳＦ）活性を有するヒト免疫グロブリンＥ結
合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）に対するモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマセルライン。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、新規な精製されたヒ
ト免疫グロブリンＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）、その個
々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質及び
それらの断片に対するモノクローナル抗体をコードする
ハイブリドーマセルラインに関する。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー性疾患は、その高い頻度（人
口の２０〜３０％）及び治療法の不存在のため、主要な
健康問題である。治療法は抗ヒスタミン剤の使用又は幾
分効果的な免疫法に限定されている。古典的な抗アレル
ギー剤は、特に治療された患者において深刻な副作用を
生じさせるため、幾つかの欠点を有する。免疫法は１〜
２のアレルゲンに限定されるが、ほとんどの患者は多数
のアレルゲンに対して感受性である。
【０００３】大部分のアレルギー性疾患が無数の空媒ア
レルゲン、例えば花粉、動物のフケ、又はイエダニ等、
食品抗原、医薬、例えばペニシリン、又は膜翅目昆虫の
毒に対して向けられた免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体
により介在される。ＩｇＥの生産を制御する機作は実験
室動物において広範囲に研究されている〔K.Ishizaka,
Ann.Rev.Immunol.2, 159 (1984) 〕。これらの研究は、
動物モデルにおいてＩｇＥの生産を調節する抗原特異的
ではないがＩｇＥアイソタイプ特異的機構の存在を明瞭
に示している。
【０００４】これらの制御機構のエフェクター分子は、
ＩｇＥに対するその親和性のためにＩｇＥ−結合因子
（ＩｇＥ−ＢＦ）と命名された。ＩｇＥ−ＢＦはＩｇＥ
抑圧因子（ＩｇＥ−ＳＦ）及びＩｇＥ−相乗因子（Ｉｇ
Ｅ−ＰＦ）に分けられ、これらの因子はその炭水化物含
量においてのみ異る。ＥｇＥ−ＳＦはグリコシル化され
ていないか、又はＩｇＥ−ＰＦより少なくグリコシル化
されている。動物モデルにおけるＩｇＥの実際の生産は
これら２つの種類のＩｇＥ−ＢＦ間の比率により決定さ
れる。
【０００５】異る制御Ｔリンパ球集団により分泌される
グリコシル化阻害因子又はグリコシル化増強因子のいず
れかの影響に依存して、同じ細胞がＩｇＥ−ＳＦ又はＩ
ｇＥ−ＰＦのいずれかを生産することができる。M.Sarf
ati 等〔 Immunology 53, 197, 207, 783 (1984)〕は、
囓歯動物において記載されているのと同じ生物学的活性
を有するＩｇＥ−ＢＦを分泌するヒトＢセルラインの存
在を記載している。他の研究者はヒトＴ細胞による〔T.
F.Huff及びK.Ishizaka, Proc.Natl Acad Sci.(USA)81,
1514 (1984) 〕及びラット／マウスＴ−細胞ハイブリド
ーマによる〔ヨーロッパ特許出願 No.１５５，１９２〕
ＩｇＥ−ＢＦの生産を記載している。ＴセルラインのＩ
ｇＥ−ＢＦとＢ細胞由来のそれとの関連は知られていな
い。この発明は今や、ヒトＢ細胞由来のＩｇＥ−ＢＦを
高度に精製された形で提供する。
【０００６】母乳供与が新生児の免疫反応性を変化せし
めることがすでに知られている。最近の予見的な研究は
さらに、排他的母乳供与が危険性の高い幼児をアレルギ
ー性疾患から保護することを示した。これらの観察を説
明するために多くの機構が用いられる。これらは、
（ｉ）外来性食品抗原への暴露が少ないこと、（ii）多
くの栄養抗原及び他の環境抗原に対して特異的な抗体を
ブロックするミルクＩｇＡによる保護、（iii)アレルギ
ー性疾患の開始を指令することが知られている一般的ウ
ィルス性疾患に対する保護、及び最後に（iv）新生児の
未成熟免疫系を調節することができる免疫制御因子のヒ
ト−ミルク中での存在〔S.S.Crago 及びJ.Mestecky, Su
rv.Immunol.Res. ２, 164 (1983)〕である。
【０００７】母乳供与新生児の免疫反応性についてのよ
く報告されている観察は、特異抗体もしくはイデオタイ
プ、免疫制御因子、又は制御リンパ球のヒト初乳中での
存在により説明されよう。従って、母乳供与は、新生児
にＩｇＥ−抑圧因子、又はＩｇＥ抗体生産の制御に関与
する小児リンパ球を妨害することができる他の分子（例
えばグリコシル化阻害因子）もしくは細胞を供与するこ
とにより該新生児を保護することができることが示唆さ
れる〔S.A.Roberts 及び M.W.Turner, Immunology 48,
195 (1983)；並びにJarrett 及び E.Hall, Nature 280
, 145 (1979)〕。
【０００８】今までＩｇＥ−ＳＦ活性を有するＩｇＥ−
ＢＦはヒト初乳中に固定されておらず、そしてその単離
はどこにも記載されていない。驚くべきことに、このよ
うなＩｇＥ−ＢＦが今や高度に精製された形で単離され
た。ＩｇＥはアレルギー性疾患の進行に重要な役割を示
す。従って、精製されたＩｇＥ−結合因子はアレルギー
性疾患及びそれと関連する免疫制御疾患の診断及び治療
のために重要である。特に、ＩｇＥ−抑圧活性を有する
ＩｇＥ−ＢＦはアレルギー性疾患の治療のために有用で
あり、他方ＩｇＥ−相乗活性を有するＩｇＥ−ＢＦは感
染に対する耐性、例えば寄生性感染に対する耐性を増加
するであろう。
【０００９】ＩｇＥ−ＢＦの検出のための既知のアッセ
イ法はロゼット阻害試験に基礎を置いており、この方法
においては、ＩｇＥのためのリセプター（ＦｃεＲ）を
発現するリンポブラストイドＢセルラインからのＲＰＭ
Ｉ８８６６細胞がＩｇＥ−コートされたウシ赤血球と共
にロゼット形成する。後者がまずＩｇＥ−ＢＦと前イン
キュベートされておれば、それらはもはやＲＰＭＩ８８
６６細胞に結合することができず、従ってロゼットを形
成する細胞の比率が低下する。
【００１０】このアッセイ法は定量的でなく、ウシ赤血
球へのＩｇＥのカップリングの可変性のために技術的に
微妙であり、そしてロゼットを顕微鏡下で観察しなけれ
ばならず、セルラインが永久的に入手可能でなければな
らず、ＩｇＥ−コート赤血球を規則的に調製しなければ
ならない等のために厄介であり、この結果１日に１人で
合理的に行うことができる試験の数は少数（２０〜４
０）である。従って、多数の、例えば１日当り数百のサ
ンプルに適用することができる定量的で実施が容易なア
ッセイ法を提供することが最も望ましいであろう。
【００１１】このような測定法は、ＩｇＥ−ＢＦの生理
病理学の研究を促進するのみならず、この測定法は種々
の生物学的液体、例えばＩｇＥ−ＢＦを分泌するセルラ
インからの培養上清からのＩｇＥ−ＢＦの精製をモニタ
ーするためにも使用されるであろう。さらに、これは診
断目的で血清中のＩｇＥ−ＢＦを検出しそして定量する
ために使用することができよう。
【００１２】この発明は、ＩｇＥ−ＢＦと交差反応する
リンパ球ＦｃεＲに対するモノクローナル抗体の調製に
より前記の問題点に対して解決を与える。同時に、これ
らのモノクローナル抗体はアフィニティークロマトグラ
フィーによるＩｇＥ−ＢＦの効果的な精製を可能にす
る。ＩｇＥ−コート固相上でのアフィニティークロマト
グラフィーによるＩｇＥ−ＢＦの既知の精製法は、Ｉｇ
Ｅ−ＢＦに対するＩｇＥの低い親和性のために低い収量
を伴い、精製された因子に対するさらに進んだ研究を困
難にしていた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、ＩｇＥ−
ＢＦの定性的及び定量的測定並びに精製のために有用な
モノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】この発明の抗体は精製さ
れたヒト免疫グロブリンＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）、
その個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白
質、及びその断片と交差反応する。この発明の好ましい
態様においては、この精製されたＩｇＥ−ＢＦ及びその
構成成分はヒトＢ細胞上清、又はヒト初乳から単離され
る。
【００１５】例えば、この発明の精製されたＩｇＥ−Ｂ
Ｆは次のように特徴付けられる。 （１）ＩｇＥのためのリンパ球リセプター（ＦｃεＲ）
に対するモノクローナル抗体により認識されそして結合
されるヒト由来の場合によってはグリコシル化されてい
る蛋白質を含む。 （２）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）及び銀染色により決定される場合に、２５
〜２８KD（キロダルトン、kg／mole）の見かけ上のおよ
その分子量を有する分子、及び場合によっては、Ｆｃε
Ｒに対して特異的なモノクローナル抗体に結合する他の
蛋白質、例えば４５〜６０KDのダイマー及び／又は一層
低分子量、すなわち１０〜２０KDの部分消化された蛋白
質から成る。
【００１６】（３）例えばアガロースゲルに結合したＩ
ｇＥへの吸着及びそれからの可能性ある回収により決定
される場合、ＩｇＥに可逆的に結合する。 （４）例えばＦｃεＲを発現するＲＰＭＩ８８６６細胞
へのＩｇＥ−コートラテックス粒子の結合の阻害によっ
て決定される場合、ＩｇＥのためのリセプターを担持す
る細胞へのＩｇＥの結合をブロックする。
【００１７】（５）例えば放射性ラベルされたＩｇＥ及
びミクロタイタープレート上に固定されたそれに対する
モノクローナル抗体を用いて決定される場合、ＩｇＥに
対して特異的なモノクローナル抗体へのＩｇＥの結合を
ブロックする。 （６）ＩｇＥのためのリセプター（ＦｃεＲ+ ）を発現
するヒトＢ細胞の上清又はヒト初乳の構成成分である。
【００１８】上記のＩｇＥ−ＢＦの個々のＩｇＥ−ＢＦ
蛋白質は次のように特徴付けられる。 （１）後で特徴付けられるように、ＩｇＥ−ＢＦの構成
成分である。 （２）例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はゲル濾過高圧液体ク
ロマトグラフィーのごとき常用の蛋白質分析法に従えば
均一である。
【００１９】（３）場合によってはグリコシル化されて
いる。 （４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、２５〜
２８KDの見かけ分子量を有する。 （５）次のようなおよその範囲の全アミノ酸組成：アス
パラギン酸／アスパラギン１９〜２３、グルタミン酸／
グルタミン２５〜３１、セリン２２〜２６、スレオニン
８〜１０、グリシン１５〜２５、アラニン１６〜２０、
アルギニン１０〜１２、プロリン１３〜１６、バリン１
０〜１２、メチオニン３〜５、イソロイシン７〜９、ロ
イシン１３〜１７、トリプトファン０、フェニルアラニ
ン６〜９、システイン３〜４、リジン８〜１０、ヒスチ
ジン４〜５、及びチロシン６〜８を有する。
【００２０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってはおよその分子
量が決定し得るのみであり、この発明の化合物の実際の
分子量は２０〜３５KDの範囲にあることを理解すべきで
ある。同様に、全アミノ酸分析法の不確実性のため、実
際のアミノ酸組成は上記のアミノ酸組成の範囲とは異る
かもしれない。これらの個々のモノクローナル抗体の幾
つかは、２０８．２５Ａ．４．３／１３５と称するモノ
クローナル抗体により結合されるがしかし２０８．２５
Ｄ．２／９４と称するモノクローナル抗体によっては有
意な程度には結合されず、この逆も成立する。
【００２１】個々のＩｇＥ−ＢＦ蛋白質はグリコシル化
されているか、又は炭水化物残基を欠いている。典型的
には、グリコシル化されたＩｇＥ−ＢＦ蛋白質は１又は
複数の炭水化物基、例えばＮ−アセチルグルコサミン、
もしくはアスパラギン残基にＮ−グリコシド化により連
結されたＮ−アセチルグルコサミンを含有するオリゴサ
ッカライド、及び／又はＮ−アセチルガラクトサミン、
もしくはセリンもしくはスレオニン残基にＯ−グリコシ
ド化により連結されたＮ−アセチルガラクトサミンを含
有するオリゴサッカライドを含む。オリゴサッカライド
はサリチル酸、例えばＮ−アセチルニューラミネート又
はＮ−グリコリルニューラミネートを含むことができ
る。
【００２２】この発明はまた次のように特徴付けられる
ＩｇＥ−ＢＦの断片に関する。 （１）場合によっては上に特徴付けられたＩｇＥ−ＢＦ
の構成成分である。 （２）通常の蛋白質分析法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又
はゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーに従えば均一で
ある。 （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、１０〜
２０KD、好ましくは１４〜１６KDの見かけ分子量を有す
る。
【００２３】（４）前に特徴付けられた個々のＩｇＥ−
ＢＦ蛋白質の部分的酵素消化により得られる。この発明
はまた、精製されたＩｇＥ−ＢＦ、その個々の場合によ
ってはグリコシル化されている蛋白質及びそれらの製造
方法に関し、この方法はＩｇＥ−ＢＦを含有する溶液、
例えばＲＰＭＩ８８６６細胞のごときＩｇＥ−ＢＦ産生
細胞の培養上清又はヒト初乳調製物をＦｃεＲに対して
特異的なモノクローナル抗体を担持する担体材料と接触
せしめ、未結合蛋白質及び他の外来性物質を除去し、前
記担体上の抗体に結合したＩｇＥ−ＢＦを選択的に切り
離し、そして単離し、そして所望により精製されたＩｇ
Ｅ−ＢＦをその個々の場合によってはグリコシル化され
ている蛋白質及び／又はそれらの断片に分離することを
特徴とする。
【００２４】ＩｇＥ−ＢＦを含有する細胞培養上清又は
細胞抽出物はそれ自体既知の方法に従って調製される。
適当な細胞はヒト由来のリンパ球、特にインビトロで培
養することができるリンパ球、例えばリンパブラストイ
ドセルライン、特に連続性のヒトＢ細胞系、例えばヒト
ＢセルラインＲＰＭＩ８８６６である。ＩｇＥ−ＢＦを
生産するこのようなセルラインの培養上清を直接に、場
合によっては濃縮した後にこの発明の精製工程に導く
か、あるいはあらかじめ既知方法による予備精製、例え
ば限外濾過、透析又はクロマトグラフィーによる精製、
例えばＤＥＡＥ−セルロースもしくは架橋デキストラン
ゲル、例えばセファデックスによる精製にかける。
【００２５】ＩｇＥ−ＢＦを含有するヒト初乳調製物は
次のようにして得られる。健康な志願者からのヒト初乳
を出産後最初の２日間に集める。但し、この後に集めた
乳も使用可能である。初乳をプロテアーゼ阻害剤、例え
ばフェニルメチルスルホニルフルオリド、ベンズアミジ
ン、ε−アミノカプロン酸及び／又はＥＤＴＡで処理
し、次に例えば超遠心分離又は濾過により澄明にし、そ
して例えば塩酸により約pH４に酸性化してカゼインを沈
澱せしめる。例えば濾過又は遠心分離によりカゼインを
除去した後、澄明な調製物を緩衝液、例えば２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ緩衝液により中和し、そして好ましくは段階的に濾
過系に通して５０KD以上の大分子を除去する。
【００２６】例えば、第１フィルターの孔は約０．４５
μｍの直径を有し、そしてその濾液をメンブランフィル
ター、例えば５０KDの好ましいカット−オフ点を有する
アミコンＸＭ５０フィルターに通す。濾過の後、調製物
を蒸留水に対して透析しそして凍結乾燥する。この初乳
調製物を好ましくはクロマトグラフ法によりさらに精製
して約１０〜３０KDの分子量を有するポリペプチドを集
める。
【００２７】任意の常用のクロマトグラフ法、例えばセ
ファデックスＧ−７５のごときアガロースゲル上でのゲ
ル濾過クロマトグラフィーを使用することができる。例
えば、初乳調製物を、界面活性剤及び他の添加剤を含有
する緩衝液中アガロースゲルカラムに適用し、そして分
子量画分を集める。ＩｇＥ−ＢＦを含有する画分は約１
０〜３０KDの分子量のポリペプチドを含有する画分であ
る。これらをプールし、場合によっては濃縮し、そして
透析する。
【００２８】ＦｃεＲに対して特異的な（そしてＩｇＥ
−ＢＦと交差反応する）モノクローナル抗体とＩｇＥ−
ＢＦを構成する蛋白質上の抗原決定基との間の結合相互
作用に基いて、ＩｇＥ−ＢＦを他の蛋白質及び外来性物
質から分離する。この目的のため、ＩｇＥ−ＢＦを含有
する溶液を前記モノクローナル抗体が結合されている担
体材料と、イムノアフィニティークロマトグラフィーと
して知られている方法により接触せしめる。この目的の
ため、無機又は有機の適当な担体材料、例えば珪酸塩、
架橋されたアガロース、デキストラン、又は適切に官能
化された形のポリアクリルアミドに、場合によってはこ
れらを活性化した後、それ自体既知の方法により後記す
るこの発明のモノクローナル抗体又はその誘導体を負荷
する。
【００２９】例えば、活性化されたエステル官能基、例
えばＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル基を含有す
る担体材料を水性緩衝液中に懸濁し、そして次に未結合
モノクローナル抗体を洗浄除去し、そして担体材料のカ
ップリングしていない反応性部位を例えばエタノールア
ミンのごとき第一アミンによりブロックする。担体材料
を適当な水性溶剤、例えば塩溶液、例えばＮａＣｌ溶
液、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝化ＮａＣｌ溶液、Ｎ
ａＨＣＯ3 溶液又は３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパン
スルホン酸溶液中に懸濁し、そしてＩｇＥ−ＢＦを含有
する溶液と接触せしめる。例えばクロマトグラフィーカ
ラムに注入し、そしてＩｇＥ−ＢＦを含有する溶液を所
望により加圧下でポンプにより導入し、あるいは重力に
より流過せしめる。
【００３０】未結合蛋白質及び他の不純物を、水性溶
液、例えばおよそpH５〜９の緩衝液及び／又は塩溶液、
例えばＮａＣｌ溶液（これらは場合によっては界面活性
剤、例えばポリエチレン−ソルビタン脂肪酸エステルを
含有する）により洗浄除去する。担体上の抗体に結合し
たＩｇＥ−ＢＦを適当な水性溶液、例えばおよそpH２〜
５の緩衝液、例えばグリシン緩衝液により、あるいは異
る組成又は塩溶液、例えば濃ＮＨ4 ＳＣＮ溶液のpHグラ
ジエントにより溶出する。得られる精製されたＩｇＥ−
ＢＦを含有する溶液を場合によっては中和し、そして精
製されたＩｇＥ−ＢＦを溶液からそれ自体既知の方法に
従って、例えばセファデックス上でのクロマトグラフィ
ー、電気透析、等電点フォーカシング、電気泳動濃縮及
び／又は真空濃縮により単離する。
【００３１】イムノアフィニティークロマトグラフィー
において使用すべきモノクローナル抗体の選択は精製す
べきＩｇＥ−ＢＦの種類及び由来に依存する。例えば、
Ｂ細胞上清からのＩｇＥ−ＢＦは好ましくは２０７．２
５Ａ．４．４／３０又は２０７．２５Ａ．４．４／４５
と称するモノクローナル抗体により精製し、他方初乳由
来のＩｇＥ−ＢＦは好ましくは２０８．２５Ｄ．２／９
４及び／又は、２０７．２５Ａ．４．４／３０と称する
モノクローナル抗体により精製する。
【００３２】ＩｇＥ−ＢＦを単離するための他の任意の
方法がこの発明に含まれることを理解すべきである。所
望により、イムノアフィニティークロマトグラフィーに
おいて得られるヒトＩｇＥ−ＢＦをさらに精製し、そし
て例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、調製用逆相もしくは疎水性相互作用高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は関連するク
ロマトグラフ法、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳
動等、あるいはこれらの精製及び分離段階の組合わせに
より、その個々の場合によってはグリコシル化されてい
る蛋白質に分離する。
【００３３】特に、イムノアフィニティークロマトグラ
フィーにより得られたヒトＩｇＥ−ＢＦを、弱塩基性イ
オン交換体、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
置換されたセルロース又はアガロース上でのイオン交換
クロマトグラフィーによりさらに精製し、場合によって
は次にモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティ
ークロマトグラフィーによりさらに精製する。
【００３４】弱塩基性陰イオン交換体を有するイオン交
換クロマトグラフィー材料を適当な水性緩衝液、例えば
pH６〜９の緩衝液、例えばＴｒｉｓ緩衝液又はリン酸緩
衝液中で平衡化し、次にヒトＩｇＥ−ＢＦと接触せしめ
る。好ましくは、クロマトグラフィーはカラム中で行
い、そしてヒトＩｇＥ−ＢＦの溶液をポンプによりイオ
ン交換材料中に通す。未結合蛋白質及び不純物を緩衝液
によりカラムから洗浄除去した後、目的とする場合によ
ってはグリコシル化されているペプチドを増加する塩濃
度により、例えば増加する量の塩化ナトリウムを含有す
るＴｒｉｓ緩衝液により溶出する。イオン交換クロマト
グラフィーはＨＰＬＣカラム上でも行うことができるこ
とを理解すべきである。
【００３５】同様に、ヒトＩｇＥ−ＢＦを調製用逆相Ｈ
ＰＬＣにより精製するのが好ましい。このような精製及
び個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質
への分離は、疎水性基、例えば炭素原子数２〜２０個の
アルキル基又はフェニル基を担支するシリカを基礎とす
る担体材料上で行う。低級アルキル基、例えばｎ−ブチ
ル基を担持するシリカを基礎とする担体材料が好まし
い。ヒトＩｇＥ−ＢＦの溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に
注入し、そして増加する量の極性水混和性有機溶剤、例
えばアセトニトリル、低級アルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はプロパノール、テトラヒドロフラン
等、好ましくはアセトニトリルを含有する水性酸性溶
液、例えばトリフルオロ酢酸水溶液中で処理する。
【００３６】個々の場合によってはグリコシル化されて
いる蛋白質は好ましくは調製用ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得
る。グリセリン及びＳＤＳを含有する適当な緩衝液、例
えばＴｒｉｓ緩衝液中ヒトＩｇＥ−ＢＦの溶液を調製
し、そして１０〜１５％、好ましくは１２％のアクリル
アミド及び０．５％まで、例えば約０．３％のビス−ア
クリルアミドを含有するポリアクリルアミドゲルに適用
する。ゲル電気泳動は通常の方法で分子量マーカーと共
に行う。均一な分子量画分をゲルから溶出し、そして例
えばイオン交換クロマトグラフィー、電気泳動濃縮及び
／又は真空濃縮により純粋な形で単離する。
【００３７】適当な塩及び／又は緩衝液及び溶剤混合物
中での透析、溶解及び再沈澱の通常の方法が分離法に含
まれる場合があることを理解すべきである。ＩｇＥ−Ｂ
Ｆ又は個々のグリコシル化されている蛋白質はさらに、
グリコシル結合の部分的又は全体的開裂により加工して
この発明のより少なくグリコシル化された蛋白質又はグ
リコシル化されていない蛋白質を生じさせることができ
る。
【００３８】例えば、この発明の蛋白質をグリコシド結
合を開裂せしめる酵素、例えばＮ−グリカナーゼ、ニュ
ーラミニダーゼ及び／又はＯ−グリコシダーゼにより、
適当な緩衝液、例えば場合によっては添加物、例えば活
剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、トウィーン又はＮ
Ｐ−４０、錯化剤、例えばＥＤＴＡ、塩、例えばカルシ
ウム塩、還元剤、例えばβ−メルカプトエタノール等を
含有するリン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液中で処理す
る。得られる反応生成物を個々の場合によってはグリコ
シル化されている蛋白質又はＩｇＥ−ＢＦ断片について
前に記載したのと同様にして処理する。
【００３９】この発明のＩｇＥ−ＢＦの断片及び個々の
場合によってはグリコシル化されている蛋白質の断片
は、ＩｇＥ−ＢＦ含有溶液の又は個々の蛋白質のプロテ
アーゼ処理により得られる。例えば、初乳又はＩｇＥ−
ＢＦ含有細胞上清にプロテアーゼ阻害剤を加えない場
合、これらの溶液中に本来的に存在するプロテアーゼが
ＩｇＥ−ＢＦ及びその個々の蛋白質を開裂せしめるであ
ろう。そうでなければ、ＩｇＥ−ＢＦを含有する溶液又
はその個々の蛋白質を含有する溶液にプロテアーゼ、例
えばパパイン又はトリプシンを意図的に添加することが
できる。
【００４０】ＩｇＥ−ＢＦ断片は、ＩｇＥ−ＢＦ及び／
又は個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白
質について前に記載したようにして、例えば限外濾過、
ゲル濾過クロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、調製用逆相ＨＰＬ
Ｃ、及び／又は調製用ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動により単離し又は精製する。
【００４１】単離されたＩｇＥ−ＢＦ、その個々の蛋白
質及び／又はその断片のＩｇＥ結合及びＩｇＥ合成抑制
活性は、それ自体既知の方法により、例えばロゼット阻
害アッセイ、抗−ＩｇＥ抗体へのＩｇＥの結合のブロッ
キング、アフィニティークロマトグラフィー実験等によ
り決定することができる。ＩｇＥ−及びＩｇＧ−がカッ
プリングされたアガロースゲル上での吸着及び溶出実験
は、ロゼット阻害活性及び抗−ＩｇＥ抗体へのＩｇＥの
結合のブロッキングが確かにＩｇＥを結合する因子に基
づくことを示す特異性対照として採用することができ
る。
【００４２】この発明はまた、ＩｇＥ−ＢＦと交差反応
する、ＩｇＥのためのリンパ球細胞リセプター（Ｆｃε
Ｒ）に対する新規なモノクローナル抗体に関する。この
発明のモノクローナル抗体は、例えばＦｃεＲを発現す
るＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩｇＥ−コートラテックス
粒子の結合を阻害するその能力により検出される。モノ
クローナル抗体を含有する溶液と共にインキュベート
し、次に蛍光ＩｇＥ−コートラテックス粒子と共にイン
キュベートした後に蛍光ラベルを担持する細胞を計数す
ることにより阻害の量が決定される。ＦｃεＲへの蛍光
ＩｇＥ−コートラテックス粒子の結合の阻害はまた、Ｆ
ｃεＲを発現することが知られている他のＢ細胞系を用
いても示される。
【００４３】さらに、モノクローナル抗体はＦｃεＲを
発現する細胞へ結合するその能力によっても検出するこ
とができる。モノクローナル抗体を含有する溶液と共に
インキュベートし、そして次にこの発明のモノクローナ
ル抗体と結合するフルオレッセインと接合した第２抗体
の溶液、例えばフルオレッセインと接合したヤギ抗−マ
ウス免疫グロブリン試薬の溶液と共にインキュベートし
た後に蛍光ラベルを担持する細胞を計数することによっ
て決定される。
【００４４】発現されるＦｃεＲに向けられたモノクロ
ーナル抗体のセルラインに対する特異性は次の観察によ
り証明される。 （１）無傷のモノクローナル抗体分子及びそのＦ（ａ
ｂ′）2 断片が最初の免疫感作のために用いられたもの
とは異る幾つかのＦｃεＲ発現セルラインへのＩｇＥの
結合をブロックする。
【００４５】（２）モノクローナル抗体が試験されたす
べてのＦｃεＲ発現セルラインに直接結合するが、しか
し幾つかのＦｃεＲ−ネガティブセルラインには結合し
ない。 （３）ＦｃεＲ発現細胞へのモノクローナル抗体の結合
がＥｇＥにより選択的にブロックされるが、しかし他の
クラスの免疫グロブリンによってはブロックされない。
【００４６】（４）モノクローナル抗体は、正常ヒト未
梢血単核細胞上のＩｇＧのリセプター（ＦｃγＲ）への
ＩｇＧの結合に影響を与えない。ＦｃεＲに対して特異
的なモノクローナル抗体がＩｇＥ−ＢＦと交差反応する
ことは、例えばＲＰＭＩ８８６６細胞上のＩｇＥリセプ
ターへのモノクローナル抗体の結合をＩｇＥ−ＢＦがブ
ロックする事実により示される。
【００４７】ＩｇＥ−ＢＦと交差反応しそしてマウス／
マウス−ハイブリドーマ細胞により生産される、Ｆｃε
Ｒに対するモノクローナル抗体が好ましい。この発明の
このような好ましいモノクローナル抗体の例を第１表に
挙げる。これらはアイソタイプＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｂ
に属する。クローン No.２０８．２５Ａ．４．３／１３
５、２０７．２５Ａ．４．４／３０、２０７．２５Ａ．
４．４／４５、２０８．２５Ｄ．２．１／１７６、及び
２０８．２５Ｄ．２／９４により生産されるモノクロー
ナル抗体が好ましい。
【００４８】
【表１】
【００４９】以下、第１表に示したこの発明のモノクロ
ーナル抗体を "Ｍａｂ−（番号）"として命名し、ここ
で番号はクローンNo. の斜線の後の２個又は３個の数字
に対応する。この発明のモノクローナル抗体の誘導体
は、例えば断片、例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ′）2 断片であって、ＩｇＦ−ＢＦの抗原決定基に対
してそれらの特異性を維持しているもの、例えば放射性
ヨウ素（ 125Ｉ， 131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄
（35Ｓ）、トリチウム（ 3Ｈ）等によりラベルされた放
射性ラベルモノクローナル抗体、ビオチン又はアビジン
とのモノクローナル抗体接合体、あるいは酵素とのモノ
クローナル抗体接合体、例えばホースラデイッシュ・パ
ーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナー
ゼ、又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼとの接合体である。
【００５０】好ましい誘導体は 125Ｉでラベルされたモ
ノクローナル抗体、抗体断片Ｆ（ａｂ′）2 、及びモノ
クローナル抗体又はＦ（ａｂ′）2 断片とビオチンとの
接合体である。この発明のモノクローナル抗体及びその
誘導体はそれ自体既知の方法により得られ、この方法
は、該モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細
胞を適当な環境中で増殖せしめ、そしてその環境からモ
ノクローナル抗体を単離し、そして所望により得られた
モノクローナル抗体をその誘導体に転換することを特徴
とする。特に、ハイブリドーマ細胞をインビトロ培養
し、そして培養上清からモノクローナル抗体を単離する
か、あるいはハイブリドーマ細胞を適当な哺乳類動物中
でインビボ増殖せしめ、そして該動物の体液からモノク
ローナル抗体を回収し、そして所望により得られたモノ
クローナル抗体をその誘導体に転換する。
【００５１】インビトロ培養のための適当な培地は標準
的な培地、例えばドルベコの改良イーグル培地又はＲＰ
ＭＩ１６４０培地であって、場合によっては哺乳動物血
清、例えばウシ胎児血清、又は他の増殖支持補充剤、例
えば２−アミノエタノール、インシュリン、トランスフ
ェリン、低密度リポ蛋白質、オレイン酸等、及び微量元
素を含有する。モノクローナル抗体の単離は、場合によ
っては濃縮された培養上清中に含有される蛋白質を硫酸
アンモニウム等によって沈澱せしめ、次に免疫グロブリ
ンを標準的クロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上でのク
ロマトグラフィー、又はイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより精製する。
【００５２】インビボ生産は目的の抗体を大量に得るた
めのスケールアップを可能にする。ハイブリドーマの大
規模培養のための技法は当業界において知られており、
そして均一懸濁培養、例えばエアーリフト反応器中もし
くは連続攪拌反応器中での培養、又は固定化されたもし
くは捕捉された細胞培養、例えば中空繊維中、マイクロ
カプセル中、アガロースミクロビーズ上もしくはセラミ
ックカートリッジ上での培養を含む。
【００５３】大量の目的とするモノクローナル抗体はま
たハイブリドーマ細胞のインビボでの増殖によっても得
ることができる。細胞クローンを同系哺乳類動物に注射
し、こうして抗体産生腫瘍を増殖せしめる。１〜３週間
後、該動物の体液から目的のモノクローナル抗体を回収
する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来する。ハイブ
リドーマ細胞を場合によってはプリスタンのごとき炭化
水素により処理されたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射
し、そして１〜２週間後にこれらのマウスの腹水を集め
る。
【００５４】目的とするモノクローナル抗体を体液から
それ自体既知の方法により、例えば硫酸アンモニウム等
によって蛋白質を沈澱せしめ、次に標準的クロマトグラ
フ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー、又
はイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精
製することにより単離する。
【００５５】ＩｇＥ−ＢＦ抗原決定基に対するそれらの
特異性を維持しているモノクローナル抗体の断片、例え
ばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2 は、インビボ又
はインビトロ培養により得られたモノクローナル抗体か
ら、それ自体既知の方法により、例えばペプシンもしく
はパパインのごとき酵素による消化及び／又は化学的還
元によるジスルフィド結合の開裂により得ることができ
る。
【００５６】放射性ヨウ素、例えば 125Ｉによりラベル
されたモノクローナル抗体はそれ自体既知の方法によ
り、放射性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウムと化学
的酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ
等又は酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダーゼも
しくはグルコースオキシダーゼ及びグルコースとを用い
てモノクローナル抗体をラベルすることにより調製され
る。放射性ラベルされたこの発明のモノクローナル抗体
はまた、インビトロ培養の培地に放射性ラベルされた栄
養を加えることにより調製される。このようなラベルさ
れた栄養は例えば放射性炭素（14Ｃ）、トリチウム（ 3
Ｈ）、硫黄（35Ｓ）等を含有し、そして例えばＬ−（14
Ｃ）−ロイシン、Ｌ−（ 3Ｈ）−ロイシン、又はＬ−（
35Ｓ）−メチオニンである。
【００５７】この発明のモノクローナル抗体の酵素接合
体は、当業界において知られている方法により、例えば
前記のようにして調製されたモノクローナル抗体又はそ
の断片を所望の酵素と、カップリング剤、例えばグルタ
ルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレ
ンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキ
シ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−（２′−ピリジルジ
チオ）−プロピオノキシ）−サクシンイミド、Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド等の存在下で反応せしめることにより調製され
る。モノクローナル抗体とアビジンとの接合体が同様に
して得られる。ビオチンとの接合体は、例えば、この発
明のモノクローナル抗体をビオチンＮ−ヒドロキシサク
シンイミジルエステルと反応せしめることにより得られ
る。
【００５８】同様にして、モノクローナル抗体断片、例
えばＦ（ａｂ′）2 断片と前記の酵素又はビオチンとの
接合体を調製することができる。この発明はさらに、Ｉ
ｇＥ−ＢＦと交差反応する、ＩｇＥのためのリンパ球細
胞リセプター（ＦｃεＲ）に対するモノクローナル抗体
を分離することを特徴とするハイブリドーマセルライン
に関する。
【００５９】特に、この発明は、骨髄腫細胞と、Ｆｃε
Ｒを発現するリンパ球により免疫感作された哺乳類動物
のＢリンパ球とのハイブリドであるセルラインに関す
る。好ましくは、これらのセルラインはマウス骨髄腫細
胞と、ＦｃεＲを発現するリンポブラストーマ細胞によ
り免疫感作された同系マウスのＢリンパ球とのハイブリ
ドである。
【００６０】１９８５年２月２日に、パスツール研究所
（パリ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ
ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｓにそれぞれNo．Ｉ−４２５及びＩ−４２０と
して寄託されている２０８．２５Ａ．４．３／１３５及
び２０８．２５Ｄ．２．１／１７６と称するハイブリド
ーマセルライン、１９８５年５月２９日に上記の寄託機
関にそれぞれNo．Ｉ−４５１及びＩ−４５２として寄託
されている２０７．２５Ａ．４．４／３０及び２０７．
２５Ａ．４．４／４５と称するハイブリドーマセルライ
ン、並びに１９８５年１０月１日に上記の寄託機関にN
o．Ｉ−４８６として寄託されている２０８．２５Ｄ．
２／９４と称するハイブリドーマセルラインが特に好ま
しい。これらのハイブリドーマセルラインは、マウス骨
髄腫セルラインＮＳＩ／１と、生存８８６６細胞により
免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓のＢリンパ球
とのハイブリドである。
【００６１】これらは安定なセルラインであり、そして
それぞれＭａｂ−１３５，Ｍａｂ−１７６，Ｍａｂ−３
０，Ｍａｂ−４５、及びＭａｂ−９４と称するモノクロ
ーナル抗体を分泌する。セルラインは深冷凍結培養物中
で維持することができ、そして解凍及び再クローニング
により再活性化することができる。この発明はまた、Ｆ
ｃεＲに結合しそしてＩｇＥ−ＢＦと交差反応するモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルラインの
製造方法に関し、この方法は、適当な哺乳動物をＦｃε
Ｒを発現するリンパ球により免疫感作し、この哺乳動物
の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、融合におい
て得られたハイブリド細胞をクローン化し、そして所望
の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴と
する。
【００６２】抗原として、ＦｃεＲを発現する任意のリ
ンパ球、さらには破壊された細胞又はＦｃεＲを含有す
る細胞壁材料又はリセプターそれ自体を使用することが
できる。ＦｃεＲを発現するリンパ球はＢ細胞又はさら
にＴ細胞であることができ、好ましくはエプスタイン−
バールウイルスにより形質転換されたセルライン又はリ
ンポブラストーマセルラインである。ヒトＢ細胞の連続
的セルラインであるＲＰＭＩ８８６６細胞が抗原として
最も好ましい。場合によっては細胞を適当なマイトジエ
ン、例えばコンカナバリンＡにより、又は糖蛋白質合成
調節化合物、例えばチュニカマイシンにより、抗原とし
て使用する前に刺激する。
【００６３】免疫感作のために好ましい哺乳動物はマウ
ス、特にＢａｌｂ／ｃマウスである。免疫感作は例え
ば、生存ＲＰＭＩ８８６６細胞を３〜８回、非経腸的
に、例えば腹腔内に及び／又は皮下に、３〜５週間の間
隔で、約１０7 〜約１０8 細胞の量で注射することによ
り行う。最終免疫注射の後２〜５日目に採取した、免疫
感作された哺乳動物の抗体産生細胞を、融合促進剤の存
在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞と融合せしめる。
幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業界において知ら
れている。酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は酵素チミジン
キナーゼ（ＴＫ）を欠き、従ってヒポキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ培
地）中で生存できないハイブリドーマセルラインが好ま
しい。ＨＡＴ培地中で生存せずそして免疫グロブリン又
はその断片を分泌しない骨髄腫細胞及び誘導されたセル
ライン、例えばセルラインＮＳＩ／１−Ａｇ４／１，Ｘ
６３−Ａｇ８．６５３、又はＳｐ２／０−Ａｇ１４が特
に好ましい。
【００６４】考慮される融合促進剤は例えばセンダイウ
イルスは他のパラミクソウイルスであって場合によって
はＵＶ−不活性化された形のもの、カルシウムイオン、
界面活性リピド、例えばリソレシチン、又はポリエチレ
ングリコールである。好ましくは、骨髄腫細胞を分子量
１０００〜４０００のポリエチレングリコール約３０〜
６０％及び場合によっては約５〜１５％のジメチルスル
ホキシドを含有する溶液中で、免疫感作された哺乳動物
由来の脾細胞３〜４倍過剰量と融合せしめる。
【００６５】融合の後、細胞を再懸濁しそして選択ＨＡ
Ｔ培地中で培養する。これによってハイブリドーマ細胞
のみが生存する。なぜなら、これらは骨髄腫細胞由来の
インビトロで生育しそして複製する能力と、免疫感作さ
れた哺乳動物の抗体産生脾臓細胞に由来する、ＨＡＴ培
地で生存するために必須のＨＧＰＲＴ又はＴＫ遺伝子の
欠失を併せ持つからである。
【００６６】ハイブリドーマ細胞の拡張のために適当な
培地は標準的培地、例えばダルベコの改良イーグル培
地、最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等であって、
これらには場合によっては血清、例えば１０〜１５％の
ウシ胎児血清、アミノ酸、及び抗生物質、例えばペニシ
リン及び／又はストレプトマイシンが補充されている。
好ましくは、フィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔浸
潤細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ等を細胞増殖の最
初に添加する。ハイブリドーマ細胞に対して正常な骨髄
腫細胞がオーバーグローするのを防止するため、選択Ｈ
ＡＴ培地を一定間隔で培地に補充する。
【００６７】ハイブリドーマ細胞培養上清を目的とする
モノクローナル抗体について、次のアッセイ法によりス
クリーニングする。このアッセイ法においては、培養上
清により前処理されたＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩｇＥ
−コートラテックス粒子の結合の阻害を測定する。陽性
のハイブリドーマ細胞を例えば限界稀釈法により好まし
くは２回以上クローニングする。クローン化されたセル
ラインを常法に従って凍結することができる。
【００６８】この発明のモノクローナル抗体及びその誘
導体は、リンパ球又は初乳由来のＩｇＥ−ＢＦ、個々の
場合によってはグリコシル化されている蛋白質及びそれ
らの断片の定性的及び定量的測定及び／又はリンパ球も
しくは初乳からのＩｇＥ−ＢＦの精製のために有用であ
る。例えば、モノクローナル抗体又はその誘導体、例え
ば酵素接合体、ビオチン接合体又は放射性誘導体は、例
えばＦｃεＲ又はＩｇＥ−ＢＦ上の抗原決定基とモノク
ローナル抗体との間の結合相互作用に基く既知の任意の
イムノアッセイにおいて用いることができる。これらの
アッセイ法の例として、ラジオイムノアッセイ、酵素イ
ムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、ラテックス凝
集及び血球凝集が挙げられる。リンパ球により生産され
又は初乳から単離されたＩｇＥ−ＢＦはこの発明のモノ
クローナル抗体の助けによりイムノアフィニティークロ
マトグラフィーにより精製することができる。
【００６９】この発明は特に、この発明のモノクローナ
ル抗体及び／又は放射性ラベルされたその誘導体を用い
る、ＩｇＥ−ＢＦの測定のためのラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）に関する。ＲＩＡの任意の既知の変法、例え
ば均一相でのＲＩＡ、固相ＲＩＡ又は不均一ＲＩＡ、ジ
ングルＲＩＡ又はダブル（サンドイッチ）ＲＩＡ〔Ｉｇ
Ｅ−ＢＦの直接又は間接（競争的）測定〕を用いること
ができる。
【００７０】適当な担体、例えばポリスチレン、ポリプ
ロピレンもしくはポリ塩化ビニルのタイタープレートも
しくは試験管のプラスチック表面、ガラスもしくはプラ
スチックビーズ、濾紙、又はデキストラン、ニトロセル
ロースもしくは酢酸セルロースのシート等をこの発明の
モノクローナル抗体を用いて単純吸着により、又は例え
ばグルタルアルデヒドもしくは臭化シアンによる担体の
活性化の後にコートし、次にＩｇＥ−ＢＦ含有試験溶液
又は標準溶液、及びＩｇＥ−ＢＦの異るエピトープを認
識するこの発明の第２モノクローナル抗体の 125Ｉラベ
ル化誘導体とインキュベートする。同じモノクローナル
抗体の 125Ｉラベル化誘導体を用いることは好ましくは
ないが可能である。
【００７１】この発明はさらに、この発明のモノクロー
ナル抗体及び／又はそれと酵素又はビオチンとの接合
体、例えばモノクローナル抗体断片とビオチンとの接合
体を用いる、ＩｇＥ−ＢＦの測定のための酵素イムノア
ッセイに関する。例えば、ＲＩＡについて上記した担体
をこの発明のモノクローナル抗体によりコートし、Ｉｇ
Ｅ−ＢＦを含有する試験溶液又は標準溶液と共にインキ
ュベートし、そして次に異るモノクローナル抗体又は抗
体断片と適当な酵素との接合体の溶液と共にインキュベ
ートし、次に結合した酵素接合抗体の量を可視化する酵
素基質の溶液と共にインキュベートする。酵素接合モノ
クローナル抗体の代りに、ビオチン接合モノクローナル
抗体又は抗体断片をアビジン酵素接合体と共に使用する
ことができる。
【００７２】この発明の酵素イムノアッセイにおける好
ましい酵素は、酵素基質例えば５−アミノサリチル酸、
ｏ−フェニレンジアミン、３，３′−ジメトキシベンジ
ジン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、
２，２′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）又はこれらに類似するものと過酸
化水素とにより発色し得るホースラデイッシュパーオキ
シダーゼ、及び例えば酵素基質ｐ−ニトロフェニルホス
フェートからｎ−ニトロフェノールを放出するアルカリ
性ホスファターゼである。
【００７３】ＲＩＡについて前記したような適切な担体
をこの発明のモノクローナル抗体でコートし、次にＩｇ
Ｅ−ＢＦを含有する試験溶液又は標準溶液、及びこの発
明のモノクローナル抗体又はその断片とビオチンとの接
合体の溶液と共にインキュベートし、次にアビジン−酵
素接合体、例えばアビジン−ホースラデイッシュパーオ
キシダーゼ接合体の溶液、及び酵素基質の溶液と共にイ
ンキュベートすることから成る酵素イムノアッセイが特
に好ましい。
【００７４】ＦｃεＲに対するモノクローナル抗体及び
その誘導体の、ＩｇＥ−ＢＦの定性的及び定量的測定の
ためのこの発明に従う使用はまた、それ自体既知の他の
イムノアッセイ、例えば、蛍光物質との抗体接合体又は
抗原接合体を用いるイムノフルオレッセンス試験、抗原
又は抗体がコートされたラテックス粒子を用いるラテッ
クス凝集、あるいは抗体又は抗原がコートされた赤血球
を用いる血球凝集試験等を包含する。
【００７５】この発明はさらに、ＩｇＥ−ＢＦ、個々の
場合によってはグリコシル化されている蛋白質及びその
断片の定性的及び定量的測定のための試験キットに関
し、このキットはＩｇＥ−ＢＦと交差反応するＦｃεＲ
に対するモノクローナル抗体及び／又はその誘導体、並
びに場合によっては付属物を含むことを特徴とする。ラ
ジオイムノアッセイのためのこの発明のキットは、例え
ば、前に定義したような適切な担体、この発明のモノク
ローナル抗体の場合によっては凍結乾燥された物又は濃
縮された溶液、この発明の 125Ｉラベルされた同一の又
は異るモノクローナル抗体の場合によっては凍結乾燥さ
れた物又は濃縮された溶液、ＩｇＥ−ＢＦ及び／又は個
々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質の標
準溶液、緩衝液、非特異的吸着及び凝集の形成を防止す
るための洗剤、ピペット、反応容器、換算曲線等を含
む。
【００７６】酵素イムノアッセイのためのこの発明の試
験キットは、例えば、前に定義したような適当な担体、
この発明のモノクローナル抗体の場合によっては凍結乾
燥されたもの又は濃縮された溶液、この発明のモノクロ
ーナル抗体又は抗体断片と酵素又はビオチンとの接合体
の場合によっては凍結乾燥された物又は濃縮された溶
液、ＩｇＥ−ＢＦ及び／又は個々の場合によってはグリ
コシル化されている蛋白質の標準溶液、緩衝液、固体又
は溶解した形の酵素基質、非特異的吸着及び凝集の形成
を防止するための洗剤、ピペット、反応容器、換算曲線
等を含む。
【００７７】この発明はさらに、あらゆる種類の抗原、
例えば花粉、ネコのフケ、イエダニ等に対してアレルギ
ーを有する患者におけるアレルギー状態の治療又は予防
のための、精製されたＩｇＥ−ＢＦ、個々の場合によっ
てはグリコシル化されている蛋白質及びそれらの断片の
使用に関する。母乳が供与されていない特に高い危険を
有する新生児を含む危険期における高い危険を有する患
者の治療が特に重要であろう。
【００７８】この発明のＩｇＥ−ＢＦは、経腸的に、例
えば鼻に、直腸に、又は経口的に、あるいは非経腸的
に、例えば筋肉内に、皮下に、又は静脈内に、通常単位
投与形として、例えば錠剤、糖依丸、アンプル、バイア
ル、又は坐薬の形で投与される。投与されるべき精製Ｉ
ｇＥ−ＢＦ、その個々の場合によってはグリコシル化さ
れている蛋白質又はその断片の量は患者の体重及び一般
的状態、投与の態様等に依存し、そして医師の判断に基
くべきである。一般に約１００μｇ〜約５０００μｇ／
kg体重／日が投与されよう。
【００７９】この発明はさらに、ＩｇＥ−ＢＦ、その個
々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質又は
それらの断片を抗アレルギー的に有効な量において、場
合によっては、経口、直腸、鼻内又は非経口的、例えば
筋肉内、皮下、又は腹腔内への投与のために適しそして
活性成分と不都合な相互作用をしない常用の医薬として
許容される担体と共に含んで成る医薬に関する。
【００８０】固体粉末を含有する錠剤、カプセル、バイ
アル、又は注入溶液、好ましくは水溶液もしくは懸濁液
を含有するネブライザー、スプレー、バイアル、アンプ
ル等が適当であり、これらの液剤は、例えば活性成分を
単独で又は担体、例えばマンニトール、ラクトース、ア
ルブミン等と共に含む凍結乾燥品から、使用の前に調製
することも可能である。
【００８１】医薬製剤は無菌化することができ、そして
所望により添加剤、例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、溶
解剤、緩衝剤及び／又は浸透圧調整剤を含有することが
できる。無菌化は小孔サイズ（直径０．４５μｍ以下）
のフィルターを通す無菌濾過により行うことができ、こ
の後で調製物を所望により凍結乾燥することができる。
無菌状態を維持するために抗生物質も添加することがで
きる。
【００８２】この発明の医薬製剤は単位投与形、例えば
単位投与当り１〜２０００mgの医薬として許容される担
体と、単位投与当り約１〜１００mg、好ましくは２〜５
０mgの活性成分、すなわち精製されたＩｇＥ−ＢＦ又は
その個々の蛋白質を含んで成るアンプルとして提供され
る。この発明はまた医薬製剤の製造方法に関し、この方
法は精製されたＩｇＥ−ＢＦ、その個々の場合によって
はグリコシル化されている蛋白質又はそれらの断片を医
薬として許容される担体と混合することを特徴とする。
【００８３】この医薬はそれ自体既知の方法により、例
えば常用の混合、溶解、凍結乾燥等により製造され、そ
して約０．１〜１００％、特に約１〜５０％の活性物質
を含有する。人体の予防的及び治療的処置のためのこの
新規な蛋白質の使用もまたこの発明の対象である。
【００８４】
【実施例】次に、この発明を例によりさらに具体的に説
明する。但し、これによりこの発明の範囲を限定するも
のではない。例において使用する略号は次の意味を有す
る。 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｃｐｍ １分当りカウント数 ＥＢＶ エプスタイン−バール・ウイルス Ｆ（ａｂ′）2 免疫グロブリン断片（ａｂ′）2 ＦｃεＲ ＩｇＥのためのリセプター ＦｃγＲ ＩｇＧのためのリセプター ＦＣＳ ウシ胎児血清 ＦＣＳ−ＬＰ ＦＣＳがコートされたラテックス粒子 ＨＡＴ ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン ＨＢＳＳ ハンクの平衡塩溶液 ＨＥＰＥＳ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２− エタンスルホン酸 ＨＰＬＣ 高圧液体クロマトグラフィー ＨＴ ヒポキサンチン／チミジン ＩｇＥ 免疫グロブリンＥ ＩｇＥ−ＢＦ ＩｇＥ結合因子 ＩｇＥ−ＬＰ ＩｇＥがコートされたラテックス粒子 ＩｇＥ ＰＳ ＩｇＥ骨髄腫蛋白質（患者ＰＳから単離されたもの） ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ Ｍａｂ モノクローナル抗体（１又は複数の抗体） ＰＥＧ ポリエチレングリコール ＰＢＳ リン酸緩衝化塩溶液 ＲＩＡ ラジオイムノアッセイ ＳＤ 標準偏差 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン例１ ．ハイブリドーマセルラインの調製 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ中５×１０7 個の生存Ｒ
ＰＭＩ８８６６細胞（Ｐ．Ｒａｌｐｈ博士、スローンケ
ッタリング研究所、ニューヨーク、米国より入手）を３
回４週間の間隔で免疫感作する。最後の注射の後２日目
に集めた個々のマウスの血清を、例３の方法を用いて抗
−ＦｃεＲ活性について試験する。最も高い力価を示す
２匹の動物からの脾細胞をプールし、そしてこれを用い
て次の日に融合を行う。
【００８５】脾臓をほぐし、そして各融合のために１×
１０8 個の洗浄された脾細胞を２５×１０6 個のＮＳＩ
／１−Ａｇ４／１マウス骨髄腫細胞（アメリカン・タイ
プ・ティシュ・カルチュア・コレクションから入手）と
共に３５０xgにて５分間ペレット化する。細胞ペレット
を、１５Ｖ／Ｖ％のジメチルスルホキシドを含有するＲ
ＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）２８ml中に溶解した２０
ｇのＰＥＧから成るポリエチレングリコール溶液（ＰＥ
Ｇ−１５４０；ベーカー）２ml中に３０秒間おだやかに
再懸濁する。
【００８６】５mlのＲＰＭＩ／ｃ培地〔１％のペニシリ
ン−ストレプトマイシン（ギブコ）、１％のＬ−グルタ
ミン（ギブコ）及び１５Ｖ／Ｖ％のＦＣＳ（ギブコ）を
補充したＲＰＭＩ１６４０培地〕を９０秒間にわたって
添加し、次に追加の５mlを急激に添加する。チューブを
逆転することによって細胞懸濁液を混合し、２．５分間
放置し、そして３５０xgにて５分間遠心分離する。ペレ
ットを５mlのＲＰＭＩ／ｃ培地に再懸濁し、そして５０
μｌのアリコートを４個のコスター＃３５９６２４−ウ
エルプレートの各ウエルに入れる。
【００８７】このプレートはさらに、１mlのＨＡＴ−培
地（４０μＭ２−メルカプトエタノール、１００μＭヒ
ポキサンチン、１０μＭアミノプテリン及び１μＭチミ
ジンを補充したＲＰＭＩ／ｃ）中１×１０6 個の正常Ｂ
ＡＬＢ／ｃ脾細胞を収容している。融合の５日後から始
めて、所望により数日ごとにＨＡＴ培地を添加又は交換
することによりすべての培養物を維持する。１４日後、
ＨＡＴをＨＴ培地で置換し、そして２８日後、ＲＰＭＩ
／ｃで置換する。各ウエルの上清（１９２個の培養物）
を、融合の１週間後及び２週間後に例３に記載するよう
にして抗−ＦｃεＲ抗体についてスクリーニングする。
【００８８】所望の抗体を生産する２１個の培養物を限
界稀釈法によりクローン化する。これらをＲＰＭＩ／ｃ
中に稀釈して１０生存細胞／mlの濃度とし、そしてこれ
らの懸濁液の５０μｌのアリコートを９６−ウエルプレ
ート（リンブロ＃７６−００３−０５，Ｆｌｏｗ Ｌａ
ｂｓ）のウエルに入れる。これらのウエルは、１００μ
ｌのＨＴ培地及び１×１０5 個の正常ＢＡＬＢ／ｃ脾細
胞を収容している。ウエルを顕微鏡観察して増殖する培
養物がモノクローナルであることを確認する。これらか
ら採取したサンプル上清を抗体活性について試験し、陽
性培養物を選択し、そして大形培養容器に拡張する。所
望の特異性を有する抗体を分泌する１４個のモノクロー
ナルセルラインを最終的に得る。これらを第１表に挙げ
る。
【００８９】例２．モノクローナル抗体の単離及び精製 Ｂａｌｂ／ｃマウスを０．５mlのプリスタン（アルドリ
ッチ）により腹腔内前処理する。２週間後、５×１０6
個のクローン化されたハイブリドーマ細胞を腹腔内注射
する。８〜１０日後、腹水を集め、８００xgで遠心し、
そして−２０℃にて貯蔵する。解凍した腹水を５０，０
００xgにて６０分間遠心する。表面に浮く脂肪層を注意
深く除去し、そして蛋白質濃度を１０〜１２mg／mlに調
整する。
【００９０】０℃にて０．９容量の飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を滴加することによって粗免疫グロブリンを沈澱
せしめ、次に２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０mM／Ｎａ
Ｃｌ（pH７．９）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して
透析する。２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２５〜４００mM
ＮａＣｌ（pH７．９）緩衝液グラジエント系を用いる
ＥＤＴＡ−Ｄ５２セルロース（ワットマン）クロマトグ
ラフィーにより免疫グロブリンＣ画分を得る。免疫グロ
ブリンＧを硫酸アンモニウムにより再度沈澱せしめ、そ
してＰＢＳ中に１０mg／mlの濃度で溶解する。
【００９１】インビトロ増殖によりモノクローナル抗体
を得ることも可能である。ハイブリド細胞を含有する前
培養物を生理的温度（約３７℃）にて、培地（１０％Ｆ
ＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で５×１０5 〜１
０6 細胞／mlの細胞濃度まで培養する。完了した前培養
物を３０００mlの容積に目盛を付したＢｅｌｌｃｏ−ス
ピンナーボトルに移す。培地を加えて１５００mlの最終
容量とする。この培養物を２〜３日間、５％ＣＯ2 に富
化された空気中、生理的温度にて３０rpm で攪拌する。
【００９２】さらに培地を加えて培養物の容量を３００
０mlにする。上記の培養条件を用いてさらに７〜１０日
間培養を行う。細胞の９５％が死滅したとき、細胞を含
有する培地を１０００xgにて２０分間、４℃で遠心す
る。上清を無菌条件下で濾過する（孔サイズ０．２μ
ｍ）。飽和硫酸アンモニウムを添加して粗免疫グロブリ
ンを得、そして前記のようにして精製する。
【００９３】精製されたＭａｂを日常的方法により、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより、及びマウスＩｇサブクラスに対
するヒツジ抗血清を用いるオークテルロニー分析により
特徴付ける。サブクラスを第１表に示す。例３ ．フローサイトメトリーによるＦｃεＲに対する抗
体の検出 ＦｃεＲに対する抗体を、ＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩ
ｇＥコートラテックス粒子（ＩｇＥ−ＬＰ）の結合を阻
害するそれらの能力により検出する。スクリーニングの
ため、ハイブリドーマ上清（１００μｌ）を、２×１０
5 個のＲＰＭＩ８８６６細胞を収容するミクロタイター
ウエル（９６−ウエルＶ−底、ＦｌｏｗＬａｂｓ ＃７
６−３２１−０５）に入れ、そして２０℃にて３０分間
おだやかに攪拌する。プレートを３００xgにて６分間遠
心し、そして細胞ペレットを再懸濁し、そして１０％の
ＦＣＳが補充されそして１０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．
２）により緩衝化されたＲＰＭＩ培地（Ｈ−ＲＰＭＩ）
により２回洗浄する。
【００９４】ＭＸ−コバスフェア（Ｃｏｖａｓｐｈｅｒ
ｅｓ）（０．７μｍ、コバレント・テクノロジー社、米
国）をＩｇＥ ＰＳによりコートしそして残留結合部位
をＦＣＳによりＭ．Ｓａｒｆａｔｉ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ ５３，７８３（１９８４）に記載されているよ
うにしてブロックすることにより調製したＩｇＥ−ＬＰ
（１００μｌ／ウエル）を細胞と混合し、平底９６−ウ
エルミクロタイタープレート（コスター＃３５９０）に
移し、そして３００xg，２０℃にて１５分間共沈せしめ
る。次にプレートを２０℃にて３０分間攪乱しないでイ
ンキュベートし、この後各細胞単層を再懸濁し、そして
円すい形０．５ml小遠心管（フィッシャーサイエンティ
フィック＃５−４０７−６）中に収容された３００μｌ
のＦＣＳ上に重層する。
【００９５】このチューブを１２５xgにて８分間遠心
し、そして付着していないＩｇＥ−ＬＰを含有する上清
を吸引除去する。細胞ペレットをそれぞれ約３００μｌ
のＨ−ＲＰＭＩに懸濁し、そして分析するまで氷上に貯
蔵する。対照サンプルは、ハイブリドーマ上清の代りに
ＩＳＩ／１細胞からの上清又はＲＰＭＩ／ｃ（陽性対
照）、又はＩｇＥ−ＬＰの代りにＦＣＳ−コートＬＰ
（ＦＣＳ−ＬＰ）（陰性対照）を含む。
【００９６】蛍光活性化セルソーター（ＥＰＩＣＳＶ
（商標）、コールター・エレクトロニクス）上でサイト
メトリー分析を行い、蛍光測定は、Ｍ．Ｓａｒｆａｔｉ
等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５３，７８３（１９８４）
に記載されているように、前方角及び９０度の光散乱特
性の両者において行う。サンプルを２分間の間隔で分析
し、各蛍光ヒストグラムは１０，０００ゲートカウント
に基く。
【００９７】図１は、陽性対照及び陰性対照を含む蛍光
ヒストグラムであって、ＩｇＥ−ＬＰを用いてＲＰＭＩ
８８６６細胞の８０〜９０％が４個以上のビーズにより
ラベルされ（チャンネル１５以上）、これに対してＦＣ
Ｓ−ＬＰを用いた場合ラベルされるのに１〜３％である
ことを示している。図２は、スクリーニング方法を説明
し、そして陽性対照（０２９／ＰＯＳ ＣＮＴＬ）及び
抗体を含有するハイブリドーマ上清（０３０／＃４８及
び０３１／＃７２）の蛍光ヒストグラムを示す。これ
は、ＦｃεＲに結合する抗体による蛍光ラベル化の阻害
を示している。カッコ内のパーセントは標準化された全
蛍光値であり、このものはラベルされた細胞の平均チャ
ンネル数とラベルされた細胞の数の積として定義され
る。
【００９８】例４．間接イムノフルオレッセンスアッセ
イによる、ＦｃεＲに対する抗体の検出 ２×１０5 個のＲＰＭＩ８８６６細胞をハイブリドーマ
上清又はＭａｂの他の溶液と４℃にて３０分間、０．２
mlのＨ−ＲＰＭＩの合計容量中でインキュベートする。
Ｈ−ＲＰＭＩにより２回洗浄した後、２００μｌのフル
オレッセイン接合ヤギ抗−マウスＩｇ試薬（ＧＡＭ−Ｆ
ＩＴＣ（商標）、コールター・イムノロジー）を加え、
そして４℃にて３０分間反応せしめる。Ｈ−ＲＰＭＩに
てさらに２回洗浄した後、細胞を３００μｌのＨ−ＲＰ
ＭＩ中に再懸濁し、そして例３に記載したようにしてフ
ローサイトメトリーにより分析する。
【００９９】例５．ＦｃεＲに結合するＭａｂの他の特
徴付け ５．１ ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞へのＩｇＥ
の結合の阻害 ＩｇＥのそのリセプターへの結合を阻害するこの発明の
モノクローナル抗体の能力はＲＰＭＩ８８６６セルライ
ンに限定されず、ＦｃεＲを発現することが知られてい
る他のＢセルライン、例えばエプスタイン−バールウイ
ルスで形質転換されたＢセルラインＥＢＶ−ＲＣＡ，Ｅ
ＢＶ−ＪＧ及びＥＢＶ−ＷＬを用いても示すことができ
る〔Ｍ．Ｓａｒｆａｔｉ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５
３，２０７（１９８４）〕。例３においてＲＰＭＩ８８
６６について記載したのと同様にして実験を行う。モノ
クローナル抗体の１つＭａｂ−１３３についての結果を
第２表に示す。
【０１００】
【表２】
【０１０１】第２表に示す実験の結果は、モノクローナ
ル抗体が、各ＢセルラインへのＩｇＥの結合を完全にブ
ロックすることを示している。このデータはさらに、阻
害がそのＦｃ領域により介在されないことを示す。なぜ
なら、大過剰のマウスＩｇＧがＭａｂ−１３５の阻害活
性を模倣することができないからである。ＭａｂがＦｃ
結合によってではなくそのＦａｂ領域を介してＦｃεＲ
と反応することの一層直接的な証明は、無傷のＭａｂ−
１３５とそのＦ（ａｂ′）2 断片（例６）の活性を比較
する実験により得られる。
【０１０２】ＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩｇＥ−ＬＰの
結合のブロッキングにおいて、Ｍａｂ−１３５のＦ（ａ
ｂ′）2 部分がＭａｂ−１３５自体と同様に効果的であ
ることが観察される。ＲＰＭＩ８８６６細胞を、培地、
無傷のＭａｂ−１３５（０．５μｇ／ml）又はＭａｂ−
１３５のＦ（ａｂ′）2 断片（０．５μｇ／ml）のいず
れかと前インキュベートし、そして次にＩｇＥ−ＬＰと
反応せしめる。ラベルされた細胞の％はそれぞれ８９．
３，０．４及び０．４％である。ＩｇＥ−ＬＰではなく
ＦＣＳ−ＬＰとの反応において細胞の０．５％がラベル
される（陰性対照）。
【０１０３】５．２ ＦｃεＲ陽性−及び陰性−セルラ
インへのＭａｂの場合 ＦｃεＲに対する例えばＭａｂ−１３５の特異性を、Ｆ
ｃεＲの発現についてあらかじめ試験された種々のセル
ラインへの直接結合を試験することにより評価する。最
初の力価検定実験において決定された、ＲＰＭＩ８８６
６細胞の９０％以上をラベルする濃度においてＭａｂ−
１３５を使用する。３つのセルラインはＩｇＥ−ＬＰ又
はＭａｂ−１３５と反応せず、他方１８１．２１．２．
２０ＡＲ細胞は両者と反応する。陰性対照として使用さ
れたマウスＩｇＧはいずれのセルラインとも結合しな
い。従って、ＩｇＥ及びＭａｂ−１３５結合の間の直接
的な一致が証明される。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】５．３ キャッピング実験 ＲＰＭＩ８８６６細胞をキャッピング条件下でＭａｂ−
１３５又は第１表中の他の任意のＭａｂと共にインキュ
ベートし、次に洗浄し、そして最後にＩｇＥ−ＬＰと反
応せしめる。０．５μｇ／mlのＭａｂの存在下、３７℃
にて６０分間インキュベートした後、細胞はＧＡＭ−Ｆ
ＩＴＣ（例４）に結合する能力を完全に失い、これによ
りキャッピングの効果が示され、さらにＩｇＥ−ＬＰへ
の結合能力を失う（第４表）。対照実験において、キャ
ッピング条件下でのＲＰＭＩ８８６６細胞のＩ２，Ｂ１
又はＯＫＴ９モノクローナル抗体（ベクトン、ディッキ
ンソン及びオルソから販売されている）（これらはＲＰ
ＭＩ８８６６と強く反応することが知られている）との
前インキュベーションはその後のＩｇＥ−ＬＰの結合に
影響を与えないことが見出された。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】例６．免疫グロブリン断片Ｆ（ａｂ′）2
の調製 腹水から単離されたＭａｂ（例２）を酵素ペプシン（５
Ｗ／Ｗ％）により３７℃にて２０時間消化する。この消
化物をゲル濾過（セファデックスＧ−２００、ファルマ
シア）により画分し、そしてＦ（ａｂ′）2 断片を含有
する画分を、セファロースにカップリングしたマウスＩ
ｇＧ１に対するヤギ抗体による吸着により残留未消化Ｉ
ｇＧを除去する。精製されたＩｇ及びその断片をＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより試験し、標品をクマーシーブルーによ
り染色する。
【０１０８】例７．ＲＰＭＩ８８６６細胞へのＭａｂの
結合のＩｇＥによる阻害 ＲＰＭＩ８８６６細胞とＩｇＥとの前インキュベーショ
ンによりＦｃεＲが飽和され、そしてその後の、細胞へ
のＭａｂの結合が阻害され、ＦｃεＲに対するＭａｂの
特異性が証明される。これらのアッセイは、ＲＰＭＩ８
８６６細胞の３５〜７０％をラベルする限定された濃度
のＭａｂ（０．１μｇ／ml）を用いることにより、間接
イムノフルオレッセンス（例４）を用いて行う。
【０１０９】図３は、ＲＰＭＩ８８６６細胞への４種類
の異るＭａｂ（０．１μｇ／ml）の結合が、細胞を１０
μｇ／ml又は１００μｇ／mlのＩｇＥＰＳ（ＩｇＥ１
０，ＩｇＥ１００）と共に前インキュベートした後に、
濃度依存的に阻害されることを示している。他方、１０
０μｇ／mlのヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１００）と共に前イン
キュベートした後、ラベル化の阻害は明瞭でない。各ヒ
ストグラムは２０，０００細胞の分析に基く。
【０１１０】他の同様の実験において、１００〜５００
μｇ／mlの範囲の濃度で用いたＩｇＡ，ＩｇＭ及びＩｇ
ＤがＲＰＭＩ８８６６細胞、又は例５（第２表）に示す
ＦｃεＲを発現するＥＢＶセルラインへのＭａｂ−１３
５の結合に影響を与えないことが見出される。例８ ．ＦｃεＲへのＩｇＧの結合に対するＭａｂの影響 これらのアッセイにおいては、末梢血単核細胞を１０μ
ｇ／mlのＭａｂ−１３５と前インキュベートし、そして
次に洗浄し、そしてＩｇＧでコートされたキツネの赤血
球を用いてロゼット形成せしめる。Ｍａｂの非存在下で
は細胞の１１．４±４．５％がロゼット形成し、他方１
０μｇ／mlのＭａｂ−１３５の存在下では１１．１±
３．４％がロゼット形成する（４実験の平均±標準偏
差）。
【０１１１】例９．ＲＰＭＩ８８６６細胞へのＭａｂの
結合のＩｇＥ−ＢＦによる阻害 Ｓ．Ｒｏｍａｇｎａｎｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
４，１６２０（１９８０）により記載されているように
して、ウシ赤血球をＭａｂ、例えばＭａｂ−１３５によ
りコートする。３％のＢＳＡを含有するハンク平衡塩溶
液（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ）中２％のＭａｂ−１３５コート
赤血球１５μｇを４℃にて６０分間、ＲＰＭＩ８８６６
細胞のＩｇＥ−ＢＦ含有無細胞上清を１０培濃縮したも
の３０μｌと、又は陰性対照としてのＨＢ１０１培地
と、間欠的に攪拌しながらインキュベートする。
【０１１２】１５μｌのＲＰＭＩ８８６６細胞（ＨＢＳ
Ｓ−ＢＳＡ中１０7 細胞／ml）を加え、そして４℃にて
１５分間の後、混合物を９０xg，４℃にて５分間遠心
し、そして０℃にて２時間保つ。アクリジンオレンジを
含有する２００μｌのＨＢＳＳ−ＢＳＡをペレットに加
え、そして細胞をおだやかに再懸濁した後蛍光顕微鏡の
もとで試験する。ＢＳＡをコートした赤血球によりバッ
クグラウンドを決定し、そしてロゼット形成細胞の％を
算出するためにそれを差引く。２連又は３連の調製物に
おいて５００〜６００細胞についてロゼットを計数す
る。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】例１０．ＩｇＥ−ＢＦを精製するためのイ
ムノアフィニティーゲルの調製 アフィ−ゲル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ）１０（ビオ−ラド）
を製造者の指示に従って冷蒸留水及びカップリング緩衝
液（pH８．０，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 溶液）により洗
浄する。カップリング緩衝液中５０％濃度のゲルをプラ
スチックチューブに導入し、そして１０mgのＭａｂ−３
０を含有する同容量の溶液と混合し、そしてこの混合物
を室温にて４時間回転せしめる。
【０１１５】次に、ゲルをカップリング溶液で洗浄す
る。なお遊離している活性部位をブロックするため、ゲ
ルを室温にて２時間０．１mlの１Ｍエタノールアミン−
ＨＣｌ（pH８．０）で処理し、そして１０mmolのナトリ
ウムアジドを含有するＰＢＳにより洗浄し、そして４℃
でその中に保持する。同様にして、Ｍａｂ−４５，Ｍａ
ｂ−９４又はＭａｂ−１３５を含有するイムノアフィニ
ティーゲルを調製する。
【０１１６】例１１．イムノアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いるヒトＢ細胞上清からのＩｇＥ−ＢＦの
精製 ＲＰＭＩ８８６６細胞の培養上清をアミコンＹＭ５メン
ブランフィルター上で１００倍に濃縮する。７０mlのこ
の溶液をＭａｂ−３０−又はＭａｂ−４５−アフィゲル
のカラム（例１０）２mlに５ml／時の流速で通す。この
ゲルを、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５％トウィーン
２０を補充された２０容量のＰＢＳ，５容量のＰＢＳ、
及び５容量の０．９％ ＮａＣｌにより次々と洗浄す
る。
【０１１７】流過液の蛋白質含量をユビコード（Ｕｖｉ
ｃｏｒｄ）分光光度計による２８０nmでのオン−ライン
吸収によりモニターして未吸着蛋白質の除去を確実にす
る。次に、カラムを８mlの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ／
０．１Ｍ ＮａＣｌ（pH２．６）により溶出し、そして
蛋白質含有画分を集め、１Ｍ Ｔｒｉｓにより中和し、
そして蒸留水に対して透析する。
【０１１８】ＩＳＣＯ電気泳動コンセントレーターモデ
ル１７５０（ＩＳＣＯ社）及び３．５KDのカットオフの
スペクトラポール（Ｓｐｃｃｔｒａｐｏｒ）膜（スペク
トラム・メディカル・インダストリー）で処理すること
により、精製されたＩｇＥ−ＢＦの濃縮溶液を得る。こ
の溶液を２５mM酢酸アンモニウム（pH８．６）に対して
透析し、そしてこうして０．２mlに濃縮する。
【０１１９】この精製されたＩｇＥ−ＢＦを次のように
して分析する。画分を１％のＳＤＳ及び５％の２−メル
カプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と共
にインキュベートし、次にビオラドのマニュアルに記載
されているようにして１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染
色により個々の蛋白質に分ける。およその分子量が１
２，１６，２５〜２８，４５、及び６０KDである蛋白質
が検出される。これらを電気泳動的にニトロセルロース
膜に移行せしめる（０．２１Ａにて４時間、移行緩衝
液：２５mM Ｔｒｉｓ，pH８．０，１９２mMグリシン，
２０Ｖ／Ｖ％メタノール）。
【０１２０】この膜を１０％のＦＣＳを含有するＴｒｉ
ｓ緩衝化塩溶液によりブロックする。ストリップを切り
取り、個々にＭａｂ−３０，−１３５、及び−６４とそ
れぞれ１０μｇ／mlで反応せしめる。６時間のインキュ
ベーションの後、ストリップを洗浄し、そしてホースラ
ディッシュ・パーオキシダーゼヤギ抗−マウスＩｇＧと
一夜反応せしめる。ストリップを洗浄し、そしてビオラ
ドの指示書に記載されているようにして４−クロロ−１
−ナフトール（パーオキシダーゼ基質）により発色せし
める。Ｍａｂ−３０，−１３５及び−６４はそれぞれ２
５〜２０KD蛋白質バンドと反応し、４５KD蛋白質バンド
と不規則に反応する。
【０１２１】例１２．Ｂ細胞上清からのＩｇＥ−ＢＦの
一層の精製及び２５〜２８KD蛋白質の単離 １２．１ イオン交換クロマトグラフィー及びイムノア
フィニティークロマトグラフィー ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）中例１１の
精製されたＩｇＥ−ＢＦをＴＳＫ５４５ＤＥＡＥカラム
（ＬＫＢ）に加える。カラムを過剰の０．０５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌで洗浄し、そして生成物を０〜０．５Ｍ
ＮａＣｌグラジエントにより溶出する。２５〜２８KDの
蛋白質は０．１５Ｍの濃度において溶出する。得られた
生成物をＭａｂ−３０−アフィゲルのカラムで再度精製
し、そして例１１に記載したようにしてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分析する。
【０１２２】１２．２ 逆相ＨＰＬＣ ０．１％ＴＦＡ／５％アセトニトリル中例１１の精製さ
れたＩｇＥ−ＢＦを、調製用ハイ−ポアＲＰ−３０４Ｈ
ＰＬＣカラム（ビオ−ラド）上で０．１％ＴＦＡ中５〜
７５％アセトニトリルのグラジエントにより処理する。
例１１に記載したようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析した場合、このものは均一である。
【０１２３】１２．３ 調製用ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動 例１１のＩｇＥ−ＢＦを同じ緩衝液（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍ
ｍｌｉ及びＭ．Ｆａｖｒｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
８０，５７５（１９７３）〕に溶解する。スラブゲル
（厚さ１．５cm、長さ１１０mm）をＬａｅｍｍｌｉ及び
Ｆａｖｒｅにより記載されたようにして調製する。分離
用ゲルは１２％のアクリルアミド及び０．３２％のビス
−アクリルアミドを含有する。電気泳動の終りにおい
て、ゲルを氷冷した０．２５mM ＫＣｌに浸漬すること
により蛋白質を可視化する。このゲルは２５〜２８KDの
分子量範囲の３個の近接したバンドを含む。中央のバン
ドを含むゲル片を切り出しそして十分に洗浄する。
【０１２４】Ａ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ及びＪ．Ｃ．Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
９１，４５０（１９８３）〕により記載されているよ
うにして、ＩＳＣＯサンプル濃縮器（モデル１７５０）
を用いてゲル片から蛋白質を溶出する。蛋白質を透析し
てグリシンを除去する。Ｗ．Ｈ．Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ
及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ９１，２５４（１９８３）〕により
記載されているようにしてイオン対抽出によりＳＤＳを
除去する。
【０１２５】例１３．２５〜２８KD蛋白質のアミノ酸組
成の決定 例１２．３に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製された
２５〜２８KD蛋白質（４８pmole ，１．２μｇ）を凍結
乾燥し、そして６Ｎ ＨＣｌに溶解し、そして真空下１
１０℃にて２４時間煮沸する。アミノ酸を炭酸水素ナト
リウム緩衝液中４′−ジメチルアミノ−アゾベンセン−
４−スルホニルクロリドにより誘導体にし、そして混合
物の５％（アミノ酸当り２．４pmole に相当する）を、
Ｊ．Ｙ．Ｃｈａｎｇ，Ｒ．Ｋｎｅｃｈｔ及びＤ．Ｇ．Ｂ
ｒａｕｎ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ ９１，４１−４８（１９８３）〕の方法に
従ってウオーターズの装置を用いてメルク・リクロスペ
ア１００ＣＨ−１８／２ＨＰＬＣカラム上で分析する。
【０１２６】結果を第６図に集約する。蛋白質サンプル
中に遊離グリシンが過剰に（１．２nmole ）存在するた
め、第６表中Ｇｌｙの補正された値は確かではない。ア
ミノ酸残基の数は２５KDの分子量に相当する合計２１５
個のアミノ酸に基いて計算されている。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】例１４．２５〜２８KD蛋白質の断片の調製 １４．１ 単なる貯蔵による 精製された２５〜２８KD蛋白質を４℃にて数週間、蛋白
質阻害剤の非存在下で保持する。例１１に記載したよう
にしてサンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離す
る。２５〜２８KD蛋白質のほかに１４〜１６KD蛋白質が
検出される。ニトロセルロースに移した場合、両蛋白質
はＭａｂ−３０と反応する。
【０１２９】１４．２ パパイン消化による ０．１mlの固定化されたパパイン（ピースケミカルス、
沈澱したゲルml当り７ＢＡＥＥユニット）を２０mM Ｎ
ａＨ2 ＰＯ4 ／２０mMシステイン−ＨＣｌ／１０mM Ｅ
ＤＴＡを含有する緩衝液（pH６．２）で前洗浄し、次に
同じ緩衝液中例１２．２の精製された２５〜２８KD蛋白
質に加える。混合物を３７℃にて１６時間揺動しながら
インキュベートし、そして遠心分離して反応を停止せし
める。上清は純粋な１４〜１６KD蛋白質（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより決定、例１１）を含有し、このものはＵ９３
７細胞上でのＩｇＥコート赤血球のロゼットの形成を阻
害する（例１８及び第７表）。
【０１３０】１４．３ トリプシン消化による ０．０５mlの不溶化されたトリプシン（シグマ、ml当り
８６ＢＡＥＥユニット）をリン酸緩衝液（pH８）により
平衡化し、次にリン酸緩衝液（pH８）中精製され放射性
ラベルされた２５〜２８KD蛋白質に加える。放射性ラベ
ルされた２５〜２８KD蛋白質は、例２０においてモノク
ローナル抗体について記載するように、125Ｉヨウ化ナ
トリウム及びクロラミンＴによりヨード化することによ
り得られる。消化混合物を３０℃にて１６時間揺動しな
がらインキュベートし、次に遠心分離して反応を停止す
る。上清は１４〜１６KD蛋白質を含有し、これはＸＡＲ
−５Ｘ線フィルム（コダック）を用いるオートラジオグ
ラフィーにより検出される。
【０１３１】同様にして、放射性ラベルされた２５〜２
８KD蛋白質を用いてパパインによる消化を行う。図４
は、例１１（ＲＰＭＩ８８６６）及び例１５（初乳）の
放射性ラベルされた２５〜２８KD蛋白質のパパイン及び
トリプシン消化により得られた反応生成物について、
０．１％ＴＦＡ中５〜７５％アセトニトリルのグラジエ
ントを用いるハイ−ポアＲＰ−３０４カラム上での逆相
ＨＰＬＣの分析結果を示す。画分No．の関数として１分
間当りのカウント（ cpm ）が示されている。
【０１３２】例１５．初乳からのＩｇＥ−ＢＦの精製 １５．１ 初乳調製物 １５人の選択されない健康な志願者から、産後最初の２
日間の間に初乳を集める。サンプルをプロテアーゼ阻害
剤（１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０mM
ベンズアミジン、５０mM ε−アミノカプロン酸及び
０．１％ＥＤＴＡ）により処理し、そしてすぐに−２０
℃で凍結する。
【０１３３】３個ずつのサンプルから成る５個のプール
を平行して処理する。これらを超遠心により澄明にし、
そして次に塩酸で酸性化（pH４．０）してカゼインを沈
澱せしめる。カゼインを除去し、そして透明な上清を２
Ｍ Ｔｒｉｓにより中和し、そして０．４５μｍのフィ
ルターを通す。アミコンＸＭ５０膜（分子量カットオフ
５０KD）により濾過した後、サンプルを蒸留水に対して
透析し、そして凍結乾燥する。
【０１３４】１５．２ ゲルクロマトグラフィーによる
前精製 ４０mgの凍結乾燥された初乳調製物（例１５．１）を
１．５mlの緩衝液〔４０mM ＮａＣｌ，１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０），０．０５％トウィーン２０，
１０mM ε−アミノカプロン酸及び０．１％ＢＳＡ〕中
に溶解し、そして目盛付セファデックスＧ−７５カラム
（２．５×９０cm）に適用する。
【０１３５】１０〜１５，１５〜２０，２０〜２５，２
５〜３０，３０〜４５，及び４５〜６０KDの分子量に相
当する画分をプールし、１．５mlに濃縮し、そしてハン
ス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に対して透析する。例１８の
ＩｇＥ阻害試験により示されるように２０〜３０KDの分
子量のポリペプチドの画分がＩｇＥ−ＢＦを含有する。
段階１５．１でプロテアーゼ阻害剤を省略した場合、活
性なＩｇＥ−ＢＦ蛋白質断片が１０〜１５KDの分子量の
画分に現われる。
【０１３６】１５．３ Ｍａｂ−９４−アフィゲル上で
のイムノファイニティークロマトグラフィーによる精製 初乳調製物（例１５．１）又は１０mg／mlの蛋白質を含
有する前精製したＩｇＥ−ＢＦ（例１５．２）の溶液
を、５ml／分の流速でＭａｂ−９４−アフィゲル（例１
０）のカラム２mlに通す。ゲルを、０．５Ｍ ＮａＣｌ
及び０．０５％トウィーン２０を補充した２０容量のＰ
ＢＳ，５容量のＰＢＳ、及び５容量の０．９％ＮａＣｌ
により次々に洗浄する。流化流の蛋白質含量をユビコー
ド分光光度計による２８０nmにおけるオン−ライン吸収
によってモニターして未結合蛋白質を完全に除去する。
次に、カラムを８mlの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（pH
２．６）により溶出し、そして蛋白質含有画分を一緒に
する。
【０１３７】この方法により得られたＩｇＥ−ＢＦは多
くの性質をＲＰＭＩ８８６６細胞上清からのＩｇＥ−Ｂ
Ｆ（例１１）と共有するが、例２４のラジオイムノアッ
セイにおいて明らかにされるようにＭａｂ−９４及びＭ
ａｂ−１３５への結合に関しては異る。１５．４ Ｍａｂ−３０−アフィゲルによる処理 例１５．３の精製されたＩｇＥ−ＢＦを、例１５．３に
記載したのと正確に同じ方法により、Ｍａｂ−３０−ア
フィゲル（例１０）のカラム上で処理する。
【０１３８】２５〜２８KDの溶出された蛋白質は今や次
の試験においてＲＰＭＩ８８６６細胞上清から得られた
２５〜２８KD蛋白質（例１２）と区別されない。 （１）０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０〜０．５Ｍ
ＮａＣｌのグラジエントを用いるＴＳＫ ５４５ＤＥＡ
Ｅカラム（ＬＫＢ）上でのイオン交換ＨＰＬＣにおい
て、０．１７Ｍ ＮａＣｌにて溶出する。
【０１３９】（２）０．１％ＴＦＡ中５〜７５％アセト
ニトリルのグラジエントを用いるハイ−ポアＲＰ−３０
４カラム（ビオ−ラド）上での逆相ＨＰＬＣにおいて３
１％アセトニトリルにおいて溶出する。 （３）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動；蛋白質
が約２５〜２８KDの分子量をもって移動する。
【０１４０】（４）パパイン又はトリプシンにより消化
されたサンプルについて、０．１％ＴＦＡ中５〜７５％
アセトニトリルのグラジエントを用いるハイ−ポアＲＰ
−３０４カラム上での逆相ＨＰＬＣ上で観察されるペプ
チド断片パターンが同一である（例１４、図４）。 （５）２５〜２８KD蛋白質、又はパパイン消化後に得ら
れる１４〜１６KD蛋白質を用いるＩｇＥコートウシ赤血
球によるＵ９３７細胞のロゼット形成の阻害（例１
４）。
【０１４１】（６）Ｍａｂ−９４又はＭａｂ−１３５を
用いるラジオイムノアッセイにより示されるようにイム
ノアフィニティー性質が同一である（例２４）。例１６ ．２５〜２８KD蛋白質におけるグリコシド結合の
開裂 １６．１ Ｎ−グルカナーゼによる 例１５に従って精製された２５〜２８KD蛋白質（１０μ
ｌ，２．０mg／ml）を０．５％ＳＤＳ及び０．１Ｍ β
−メルカプトエタノールの存在下で３分間煮沸する。サ
ンプルを稀釈して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH
８．６）、５．０mM ＥＤＴＡ及び１．２５％ＮＰ−４
０を得る。
【０１４２】Ｎ−グルカナーゼ〔フラボバクテリウム・
メニンゴセプティクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ゲンチム社（Ｇ
ｅｎｚｙｍｅ（ｏｒｐ．）、ボストン、ＭＡ〕を添加し
て最終濃度１０ユニット／mlとする。この混合物を３０
℃にて一夜インキュベートする。反応サンプルを例１１
に記載したようにしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析する。生ずる蛋白質は２４〜２６KDの
わずかに低下した見かけ分子量の位置に現われる。
【０１４３】１６．２ Ｏ−グリコシダーゼによる 天然２５〜２８KD蛋白質（２０μｇ）、又は放射性ラベ
ルされた２５〜２８KD蛋白質（３０，０００cpm 、例１
４．３）を、０．００１Ｍ酢酸カルシウム、１０mM Ｄ
−ガラクトン酸γ−ラクトン、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−
マレート緩衝液及び１ユニット／mlのニューラミニダー
ゼ（シグマ）を含有する混合物５０μｌ中で、３７℃に
て６０分間インキュベートする。
【０１４４】２〜４ミリユニットのＯ−グリコシダーゼ
〔ディプロコッカス・ニューモニア（Ｄｉｐｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ゼンチム社〕を加
え、そしてインキュベーションを４時間続ける。反応サ
ンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離する。生ずる蛋白
質はやはり２４〜２６KDの見かけ分子量を示す。例１７ ．モノクローナル抗−ＩｇＥ抗体へのＩｇＥの結
合の、精製されたＩｇＥ−ＢＦによるブロッキング ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを１μ
ｇ／mlのヒトＩｇＥに対して特異的なモノクローナル抗
体（クローン１７５）を含有するＰＢＳ ２００μｌと
共にインキュベートする。ミクロタイタープレート表面
の遊離結合能を、１０％ＦＣＳ及び０．１％ナトリウム
アジドを含有するＰＢＳによりブロックする。
【０１４５】例１１の精製されたＩｇＥ−ＢＦのＰＢＳ
溶液、ＩｇＥ−ＢＦを含有するＲＰＭＩ８８６６細胞由
来の１００倍濃縮された培養上清、又は陰性対照として
使用されるＲＰＭＩ８２２６細胞由来の溶液１５０μｌ
を、６×１０4 cpm の 125ＩラベルＩｇＥ（比活性２．
５×１０4 cpm ／ng）を含有する５０μｌのＰＢＳと、
室温において一夜前インキュベートする。１００μｌの
この混合物を抗−ＩｇＥ抗体がコートされているウエル
に加え、室温にて５時間インキュベートした後プレート
を洗浄し、そしてウエルに結合した放射能をベックマン
−ガンマ−カウンター中で測定する。
【０１４６】ＲＰＭＩ８８６６細胞からの細胞上清及び
例１１の精製されたＩｇＥ−ＢＦは、幾つかの実験にお
いて、陰性対照（ＲＰＭＩ８８６６細胞上清）と比較し
た場合、放射性ラベルされたＩｇＥの結合をそれぞれ５
０％及び７５％阻害する。ヒトＩｇＥに対して特異的な
モノクローナル抗体は例１に記載したのと同様の常法に
従って製造する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを完全フロインド
アジュバント中５０μｇのＩｇＥ ＰＳにより２週間の
間隔で２回免疫感作し、最後の注射から２週間後に、さ
らに塩溶液中５０μｇのＩｇＥを注射する。３日後に、
脾細胞をＮＳＩ／１−Ａｇ４／１骨髄腫細胞と融合せし
める。ＩｇＥ及びＩｇＧでコートされたポリ塩化ビニル
ミクロタイタープレート、及びラベルされたヤギ抗マウ
スＩｇＧを用いてＲＩＡによりクローンを選択する。モ
ノクローナル抗体はＩｇＥの熱感受性領域中の決定基に
特異的である。
【０１４７】例１８．ＲＰＭＩ８８６６細胞又はＵ９３
７細胞へのＩｇＥの結合のＩｇＥ−ＢＦによる阻害 ウシ赤血球を、最適濃度より低い濃度の精製されたＩｇ
Ｅ ＰＳ（Ｋ．Ｉｓｈｉｚａｋ博士、ジョン・ホプキン
ス大学、バルチモア、ＭＤより）によりコートする。コ
ートされた赤血球を対照緩衝液（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ）又
は試験溶液と共に４℃にて６０分間前インキュベートす
る。ＲＰＭＩ８８６６細胞又はＵ９３７細胞を加える。
この調製物を９０xgにて遠心し、そして４℃にて２時間
インキュベートする。例９に記載したように、アクリジ
ンオレンジを添加した後、細胞を蛍光顕微鏡下で観察す
る。
【０１４８】精製されたＩｇＥ ＰＳ、又はゲル１ml当
り４mg蛋白質でセファロース４Ｂにカップリングしたポ
リクローナルＩｇＧを用いて、例１１又は１５に記載し
たのと同様にしてアフィニティークロマトグラフィー実
験を行う。流出液（濾液）及び溶出液をサンプルの最初
の容量に濃縮しそしてただちに中和し、そしてＨＢＳＳ
に対して透析する。
【０１４９】
【表７】
【０１５０】
【表８】
【０１５１】例１９．Ｍａｂ−１３５のＦ（ａｂ′）2
断片とビオチンとの接合体の調製 Ｍａｂ−１３５の精製されたＦ（ａｂ′）2 断片を１．
０mg／mlにおいて１ＭＮａＨＣＯ3 に対して一夜透析す
る。pHをチェックし、そして８．２〜８．６の間である
ことが見出される。ビオチンサクシンイミドエステル
（ビオサーチ）を使用直前にＤＭＳＯに１．０mg／mlの
濃度で溶解する。この溶液０．６mlを抗体断片溶液に添
加し、すぐに混合し、そして室温に４時間置く。反応混
合物を１０mmole のナトリウムアジドを含有するＰＢＳ
に対して一夜透析し、次に凍蔵庫に貯蔵する。
【０１５２】例２０． 125Ｉラベル化抗体Ｍａｂ−１３
５の調製 ４０μｇのＭａｂ−１３５を、Ｆ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎｗｏ
ｏｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９，１１４（１９６
３）の一般的方法に従って０．５mCi の 125Ｉヨウ化ナ
トリウム及びクロラミンＴでヨード化する。反応生成物
をイオン交換樹脂ビオラドＡｇＩ×８上でのクロマトグ
ラフィーにより精製する。このものは２０，０００cpm
／ngの比活性を有する。
【０１５３】同様にして 125Ｉラベル抗体Ｍａｂ−１７
６及びＭａｂ−９４を調製する。例２１ ．細胞上清及び血清中のＩｇＥ−ＢＦの検出のた
めのラジオイムノアッセイ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを１５
μｇ／mlのＭａｂ−１７６を含有する０．０１Ｍ酢酸緩
衝液（pH９）１５０μｌと共に室温にて一夜インキュベ
ートする。次に、プレートを洗浄し、そして室温にて２
時間、１０％ウシ胎児血清を含有するハンクの平衡塩溶
液（ＨＢＳＳ−ＦＣＳ）２００μｌと反応せしめ、そし
て再度洗浄しそして１００μｌの試験サンプルと共に室
温にて４時間インキュベートする。
【０１５４】ＨＢＳＳ−ＦＣＳを用いてブランクを決定
する。プレートを洗浄し、そして 1 25Ｉ−Ｍａｂ−１３
５（ＨＢＳＳ−ＦＣＳ中２〜４×１０5 cpm 、例２０）
と共に室温にて一夜インキュベートし、次に洗浄しそし
てガンマーカウンターで計数する。すべての洗浄はＰＢ
Ｓ〔（０．１５Ｍリン酸緩衝化塩溶液（pH７．２）〕を
用いて行う。
【０１５５】ＩｇＥ−ＢＦを含有するＦｃεＲ担持細胞
由来の培養上清は、バックグラウンド（０．５％）を越
える 125Ｉ−Ｍａｂ−１３５の有意な結合をもたらす。
これに対して、ＩｇＥ−ＢＦを含有しない培養上清は陰
性結果をもたらす（第８表）。細胞上清中のＩｇＥ−Ｂ
Ｆの存在又は不存在は例１８において記載したロゼット
阻害アッセイにより確認される。ＲＩＡは、Ｍａｂ−３
０上でのイムノアフィニティークロマトグラフィー（例
１５．４）の後のほか、ヒト初乳からのＩｇＥ−ＢＦを
検出しない。
【０１５６】
【表９】
【０１５７】図５は、ＩｇＥ−ＢＦを含有するＲＰＭＩ
８８６６細胞由来の参照培養上清の一連の２倍稀釈によ
り得られる標準曲線である。アッセイの感度は、標準の
１／５０，０００稀釈においてなおＩｇＥ−ＢＦを検出
する程度である。この標準曲線は、結合した放射能が、
１〜１０００の濃度範囲において試験された溶液中に存
在するＩｇＥ−ＢＦの濃度に直線的に依存することを示
している。
【０１５８】Ｂ細胞上清中に見出されるようなＩｇＥ−
ＢＦについての前記のＲＩＡの特異性の他の証明は、Ｉ
ｇＥ−ＢＦを含有することが知られているＲＰＭＩ８８
６６細胞上清をそれぞれＩｇＥ−セファロース、ＩｇＧ
−セファロース又はエタノールアミン−セファロースで
前処理する実験から得られる。結合した放射性ラベルさ
れたＭａｂの明瞭な減少（４回の異る実験において５７
〜８０％）がＩｇＥ−セファロースで処理された細胞上
清のＲＩＡにおいて観察されるが、ＩｇＧ−セファロー
スにより又はエタノールアミン−セファロースにより処
理された細胞上清については有意な低下が見られない。
ＩｇＥ−セファロースに結合したＩｇＥ−ＢＦは０．１
Ｍグリシン−塩酸（pH２．６）を用いる溶出により回収
しそしてＲＩＡにより検出することができる。固体担体
にカップリングしたＩｇＥの親和性は低いため、ＩｇＥ
−セファロース上のＩｇＥ−ＢＦの吸着は完全ではな
い。
【０１５９】例２２．初乳及び血清中のＩｇＥ−ＢＦの
検出のためのラジオイムノアッセイ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを、１
５μｇ／mlのＭａｂ−９４を含有する０．０１Ｍ炭酸緩
衝液（pH９）１００μｌと共に室温にて一夜インキュベ
ートする。次に、プレートを洗浄し、そして室温にて２
時間、１０％ウシ胎児血清を含有するハンクの平衡塩溶
液（ＨＢＳＳ−ＦＣＳ）１５０μｌと反応せしめ、次に
再度洗浄し、そして１００μｌの試験サンプルと共に室
温にて一夜インキュベートする。
【０１６０】ＨＢＳＳ−ＦＣＳを用いてブランクを決定
する。プレートを洗浄し、そしてＨＢＳＳ−ＦＣＳ中
125Ｉ−Ｍａｂ−９４（３×１０5 cpm ／ウエル、例２
０）１００μｌと共に室温にて一夜インキュベートし、
次に洗浄し、そしてガンマーカウンターで計数する。す
べての洗浄はＰＢＳ（０．１５Ｍリン酸緩衝化塩溶液、
pH７．２）により行う。
【０１６１】図６は、Ｍａｂ−９４及び 125Ｉ−Ｍａｂ
−９４を用いるＲＩＡが初乳及び血清中のＩｇＥ−ＢＦ
の検出のために有用であり、１／３２までの稀釈につい
て直線的依存性を示すことを証明している。このＲＩＡ
は１００μｇ／mlまでの他のクラスの免疫グロブリン、
すなわちＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥ及びＩｇＤに
より影響を受けない。Ｍａｂ−９４は、Ｍａｂ−３０上
でのイムノアフィニティークロマトグラフィー（例１
５．４）後、ＲＰＭＩ８８６６細胞上清中に見出される
ようなＩｇＥ−ＢＦ及び初乳由来のＩｇＥ−ＢＦを検出
しない。
【０１６２】上記のＲＩＡの選択性は、ＩｇＥ−セファ
ロース上に吸着された初乳調製物からの溶出液が容易に
検出され、他方ＩｇＧ−セファロースに吸着した初乳調
製物からの対照溶出液が反応しない事実からも証明され
る。例２３ ．ＩｇＥ−ＢＦ用ＲＩＡのための試験キット 例２１又は２２に記載したラジオイムノアッセイ用試験
キットは次のものを含有する。
【０１６３】 ◎ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレート ◎ Ｍａｂ−１７６又はＭａｂ−９４の溶液（１０μｇ／ml） ２０ml ◎ 125Ｉラベル化Ｍａｂ−１３５又はＭａｂ−９４の溶液 （比活性６×１０6 cpm ／ml） ２０ml ◎ ０．０２Ｍ炭酸緩衝液（pH９） ２０ml ◎ １０％ＦＣＳを含有するハンクの平衡塩溶液 １００ml ◎ ＰＢＳ ２００ml ◎ ＩｇＥ−ＢＦを含有するＲＰＭＩ８８６６細胞の細胞上清 又は初乳調製物（参照溶液） ２ml ◎ 標準曲線。
【０１６４】例２４．由来を異にするＩｇＥ−ＢＦ及び
処理段階を異にするＩｇＥ−ＢＦに対するＭａｂの選択
性 ＲＰＭＩ８８６６細胞からの培養上清を１：１０で稀釈
する。このものは、例２１のＲＩＡにおいて 125Ｉ−Ｍ
ａｂ−１３５の７．５％を結合し、しかし例２２のＲＩ
Ａ中 125Ｉ−Ｍａｂ−９４の結合は０％であることが見
出される。サンプルをＭａｂ−１３５−アフィゲルを通
して濾過する（例１０）。濾液は 125Ｉ−Ｍａｂ−１３
５を結合しない（０％）が、溶出液（０．１Ｍグリシン
−ＨＣｌ，pH２．６）は８．５％の 125Ｉ−Ｍａｂ−１
３５を結合する。同じ量のサンプルをＭａｂ−９４−ア
フィゲルのカラムを通して濾過する。濾液は６．９％の
1 25Ｉ−Ｍａｂ−１３５を結合し、他方酸溶出液はＩｇ
Ｅ−ＢＦを含有しない（結合０％）。実験を通して、濾
液及び溶出液は同一容量に調製して比較を可能にする。
全カウントは約３．５×１０5 cpm である。
【０１６５】対応する実験において、１：５で稀釈され
た初乳は２．６％の 125Ｉ−Ｍａｂ−９４を結合する
が、しかし 125Ｉ−Ｍａｂ−１３５の結合は０％である
ことが見出される。Ｍａｂ−９４−アフィゲル上での吸
着の後、 125Ｉ−Ｍａｂ−９４の結合は濾液において０
％であり、他方４．５％が酸溶出液において結合され
る。無関係のＭａｂ（例えば、プロラクチンに対するＭ
ａｂ）にカップリングしたアフィゲル上での吸着の後、
１．０７％の 125Ｉ−Ｍａｂ−９４が濾液において結合
され、他方溶出液における結合は０％である。
【０１６６】しかしながら、Ｍａｂ−９４−アフィゲル
上で精製された初乳由来のＩｇＥ−ＢＦがＭａｂ−３０
−アフィゲル上に吸着される場合（例１５．４）、濾液
は０．２％の 125Ｉ−Ｍａｂ−１３５及び０．６％の
125Ｉ−Ｍａｂ−９４を結合し、そして今度は溶出液は
２．５６％の 125Ｉ−Ｍａｂ−１３５を結合するがしか
し 125Ｉ−Ｍａｂ−９４の結合は０％である。Ｍａｂ−
９４−アフィゲル上で精製されていない他の初乳調製物
は 125Ｉ−Ｍａｂ−１３５の０％の結合及び 125Ｉ−Ｍ
ａｂ−９４の５．７５％の結合をもたらす。Ｍａｂ−３
０−アフィゲルへの吸収後、濾液は８％の 125Ｉ−Ｍａ
ｂ−１３５及び１．９５％の 125Ｉ−Ｍａｂ−９４を結
合し、そして溶出液は６．４％の 125Ｉ−Ｍａｂ−１３
５及び０．１３％のＩ−Ｍａｂ−９４を結合する。
【０１６７】例２５．ＩｇＥ−ＢＦの検出のための酵素
イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ） ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを例２
１に記載したようにＭａｂ−１７６でコートしそしてＨ
ＢＳＳ−ＦＣＳによりブロックする。プレートを１００
μｌの試験サンプルと共に室温にて４時間インキュベー
トし、次に洗浄しそして例１９のＭａｂ−１３５断片ビ
オチン接合体（１０μｇ／ml）と共に室温にて４時間イ
ンキュベートする。プレートをＰＢＳで洗浄し、そして
アビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ接合体
（シグマ）の１／３０００稀釈物（０．３μｇ／ml）と
共に室温にて一夜インキュベートする。
【０１６８】結合した酵素の量を、２，２′−アジノ−
ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）ジアンモニウム塩〔ＡＢＴＳ：ベーリンガーマンハ
イム、１００mlのサイトレート／ホスフェート緩衝液
（０．０５Ｍサイトレート／０．１Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ
4 ，pH４．０）、１６μｌの３０％Ｈ2 Ｏ2 を含有中５
５mg〕による発色、及び４０５nmにおける光度測定によ
り決定する。
【０１６９】同様にして、Ｍａｂ−９４を用いてプレー
トをコートし、そしてＭａｂ−９４ビオチン接合体を用
いて初乳由来のＩｇＥ−ＢＦを検出することができる。例２６ ．ＩｇＥ−ＢＦ用ＥＬＩＳＡのための試験キット 例２５に記載したＥＬＩＳＡのための試験キットは次の
ものを含む。 ◎ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレート。
【０１７０】 ◎ Ｍａｂ−１７６の溶液（１０μｇ／ml） ２０ml ◎ Ｍａｂ−１３５断片ビオチン接合体の溶液（２０μｇ／ml） ２０ml ◎ ０．０２Ｍ炭酸緩衝液（pH９） ２０ml ◎ １０％ＦＣＳを含有するハンクの平衡塩溶液 １００ml ◎ 凍結乾燥されたアビジン−ホースラディッシュパー オキシダーゼ接合体 １mg ◎ ＡＢＴＳ １１mg ◎ サイトレート／ホスフェート緩衝液 （０．０５Ｍサイトレート／０．１Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ） ２０ml ◎ ３０％ Ｈ2 Ｏ2 １ml ◎ ＰＢＳ ２００ml ◎ ＩｇＥ−ＢＦを含有する参照溶液 ２ml。
【０１７１】例２７．医薬製剤（非経腸投与用） アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたＩ
ｇＥ−ＢＦ（例１１又は１５）１００mgを６００mlの５
Ｎヒト血清アルブミンに溶解する。生じた溶液を細菌学
的フィルターに通し、そして濾過された溶液を無菌条件
下で１００個のバイアルに分配して各バイアルが１mgの
活性成分を含むようにする。この非経腸的投与に適する
バイアルは、好ましくは冷所、例えば−２０℃において
貯蔵する。
【０１７２】同様にして、１００mgの凍結乾燥された２
５〜２８KD蛋白質を用いて、１mgの２５〜２８KD蛋白質
（例１１又は１５）を含むバイアルを調製することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（Ａ）ＩｇＥでコートされたラテック
ス粒子又は（Ｂ）ウシ胎児血清でコートされたラテック
ス粒子と反応するＲＰＭＩ８８６６細胞の蛍光ヒストグ
ラムである。ラベル化の程度はチャンネル数の関数とし
てチャンネル当りの細胞数として定量化され、それ自体
が蛍光強度の対数の関数である。詳細は例３に記載され
ている。
【図２】図２は、選択されたハイブリドーマ細胞培養上
清中のＦｃεＲに対する抗体の存在を示す代表的な蛍光
ヒストグラムである。詳細は例３に記載されている。
【図３】図３は、ＲＰＭＩ８８６６細胞への４種類の異
るモノクローナル抗体の結合を阻害するＩｇＥ（１０μ
ｇ／ml又は１００μｇ／mlの濃度における）の能力を示
す蛍光ヒストグラムである。ＩｇＧは効果を有しない。
詳細は例７に記載されている。
【図４】図４は、それぞれＲＰＭＩ８８６６細胞及び初
乳由来の放射性ラベルされた２５〜２８KD蛋白質のパパ
イン及びトリプシン消化の後に得られた反応生成物の逆
相ＨＰＬＣの分析結果を示す。この実験は、両由来の処
理された２５〜２８KD蛋白質の同一性を示している。
【図５】図５は、例２１に記載したラジオイムノアッセ
イにより測定した場合の、ＩｇＥ−ＢＦを含有するＲＰ
ＭＩ８８６６細胞由来参照培養上清の一連の２倍稀釈に
より得られる標準曲線を示す。
【図６】図６は、例２２に記載したラジオイムノアッセ
イにより測定した場合の、異るサンプルの一連の２倍稀
釈により得られた曲線を示す。この図は、Ｂ細胞上清か
らのＩｇＥ−ＢＦ又は異るクラスの免疫グロブリンと比
較した場合の、初乳及び血清中のＩｇＥ−ＢＦについて
のアッセイの選択性を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抑制因子
    （ＩｇＥ−ＳＦ）活性を有する実質的に純粋なヒト免疫
    グロブリンＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）であって、 （１）ＩｇＥのためのリンパ球リセプター（ＦｃεＲ）
    に対するモノクローナル抗体により認識されそして結合
    されるヒト由来の場合によってはグリコシル化されてい
    る蛋白質を含有し、 （２）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
    −ＰＡＧＥ）により測定する場合２５〜２８KD（キロ−
    ダルトン、kg／mole）の概略見かけ分子量を有する分
    子、及び場合によってはＦｃεＲに対して特異的なモノ
    クローナル抗体に結合する他の蛋白質から成り、 （３）アガロースゲル結合ＩｇＥへの吸着及びそこから
    の可能な回収により決定する場合、ＩｇＥに可逆的に結
    合し、 （４）ＦｃεＲを発現するＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩ
    ｇＥ被覆ラテックス粒子の結合の阻害により決定する場
    合、ＩｇＥのためのリセプターを担持する細胞へのＩｇ
    Ｅの結合をブロックし、 （５）放射能標識されたＩｇＥ及びそれに対するモノク
    ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
    定されたものを用いて決定する場合、ＩｇＥに対して特
    異的なモノクローナル抗体へのＩｇＥの結合をブロック
    し、そして （６）ＩｇＥのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞
    （ＥｃεＲ+ ）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、
    ことを特徴とする当該ＩｇＥ−ＢＦ；前記ＩｇＥ−ＢＦ
    の場合によってはグリコシル化されている個々の蛋白
    質；あるいは前記の場合によってはグリコシル化されて
    いる個々の蛋白質の断片であって、 （１）ＩｇＥのためのリンパ球リセプター（ＦｃεＲ）
    に対するモノクローナル抗体により認識されそして結合
    され、 （２）アガロースゲル結合ＩｇＥへの吸着及びそこから
    の可能な回収により決定する場合、ＩｇＥに可逆的に結
    合し、 （３）ＦｃεＲを発現するＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩ
    ｇＥ被覆ラテックス粒子の結合の阻害により決定する場
    合、ＩｇＥのためのリセプターを担持する細胞へのＩｇ
    Ｅの結合をブロックし、 （４）放射能標識されたＩｇＥ及びそれに対するモノク
    ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
    定されたものを用いて決定する場合、ＩｇＥに対して特
    異的なモノクローナル抗体へのＩｇＥの結合をブロック
    し、 （５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はゲル濾過高圧液体クロマト
    グラフィーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であ
    り、そして （６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する場合、１０〜２
    ０KDの見かけ分子量を有する、ことを特徴とする当該断
    片；と交差反応する、ＩｇＥのためのリンパ球リセプタ
    ー（ＦｃεＲ）に対するモノクローナル抗体を産生する
    ハイブリドーマセルライン。
  2. 【請求項２】 マウス骨髄腫細胞と同系マウスのＢリン
    パ球とのハイブリドであることを特徴とする請求項１に
    記載のハイブリドーマセルライン。
  3. 【請求項３】 次の標示：２０８．２５Ｄ．４／６３、
    ２０８．２５Ｄ．２／９４、２０８．２５Ｄ．４．３／
    ７９、２０８．２５Ａ．４．２／６４、２０８．２５
    Ａ．４．３／１３５、２０７．２５Ａ．４．４／３０、
    ２０７．２５Ａ．４．４／４５、２０７．２５Ａ．４．
    ４／１２３、２０７．２５Ａ．４．４／１３３、２０
    ８．２５Ｄ．２．１／１７６、２０８．２５Ｂ．１．５
    ／１４、２０８．２５Ａ．１．５／１６８、２０８．２
    ５Ａ．４．２／７３又は２０８．２５Ａ．４．２／７９
    で示されるハイブリドーマセルラインから選択される請
    求項１に記載のハイブリドーマセルライン。
  4. 【請求項４】 パスツール研究所（パリ）のCollection
    Nationale de Cultures de Microorganismes に No.Ｉ
    −４２５として寄託されているハイブリドーマセルライ
    ン２０８．２５Ａ．４．３／１３５である請求項１に記
    載のハイブリドーマセルライン。
  5. 【請求項５】 パスツール研究所（パリ）のCollection
    Nationale de Cultures de Microorganismes に No.Ｉ
    −４５１として寄託されているハイブリドーマセルライ
    ン２０７．２５Ａ．４．４／３０である請求項１に記載
    のハイブリドーマセルライン。
  6. 【請求項６】 パスツール研究所（パリ）のCollection
    Nationale de Cultures de Microorganismes に No.Ｉ
    −４５２として寄託されているハイブリドーマセルライ
    ン２０７．２５Ａ．４．４／４５である請求項１に記載
    のハイブリドーマセルライン。
  7. 【請求項７】 パスツール研究所（パリ）のCollection
    Nationale de Cultures de Microorganismes に No.Ｉ
    −４２０として寄託されているハイブリドーマセルライ
    ン２０８．２５Ｄ．２．１／１７６である請求項１に記
    載のハイブリドーマセルライン。
  8. 【請求項８】 パスツール研究所（パリ）のCollection
    Nationale de Cultures de Microorganismes に No.Ｉ
    −４８６として寄託されているハイブリドーマセルライ
    ン２０８．２５Ｄ．２／９４である請求項１に記載のハ
    イブリドーマセルライン。
  9. 【請求項９】 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抑制因子
    （ＩｇＥ−ＳＦ）活性を有する実質的に純粋なヒト免疫
    グロブリンＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）であって、 （１）ＩｇＥのためのリンパ球リセプター（ＦｃεＲ）
    に対するモノクローナル抗体により認識されそして結合
    されるヒト由来の場合によってはグリコシル化されてい
    る蛋白質を含有し、 （２）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
    −ＰＡＧＥ）により測定する場合２５〜２８KD（キロ−
    ダルトン、kg／mole）の概略見かけ分子量を有する分
    子、及び場合によってはＦｃεＲに対して特異的なモノ
    クローナル抗体に結合する他の蛋白質から成り、 （３）アガロースゲル結合ＩｇＥへの吸着及びそこから
    の可能な回収により決定する場合、ＩｇＥに可逆的に結
    合し、 （４）ＦｃεＲを発現するＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩ
    ｇＥ被覆ラテックス粒子の結合の阻害により決定する場
    合、ＩｇＥのためのリセプターを担持する細胞へのＩｇ
    Ｅの結合をブロックし、 （５）放射能標識されたＩｇＥ及びそれに対するモノク
    ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
    定されたものを用いて決定する場合、ＩｇＥに対して特
    異的なモノクローナル抗体へのＩｇＥの結合をブロック
    し、そして （６）ＩｇＥのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞
    （ＥｃεＲ+ ）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、
    ことを特徴とする当該ＩｇＥ−ＢＦ；前記ＩｇＥ−ＢＦ
    の場合によってはグリコシル化されている個々の蛋白
    質；あるいは前記の場合によってはグリコシル化されて
    いる個々の蛋白質の断片であって、 （１）ＩｇＥのためのリンパ球リセプター（ＦｃεＲ）
    に対するモノクローナル抗体により認識されそして結合
    され、 （２）アガロースゲル結合ＩｇＥへの吸着及びそこから
    の可能な回収により決定する場合、ＩｇＥに可逆的に結
    合し、 （３）ＦｃεＲを発現するＲＰＭＩ８８６６細胞へのＩ
    ｇＥ被覆ラテックス粒子の結合の阻害により決定する場
    合、ＩｇＥのためのリセプターを担持する細胞へのＩｇ
    Ｅの結合をブロックし、 （４）放射能標識されたＩｇＥ及びそれに対するモノク
    ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
    定されたものを用いて決定する場合、ＩｇＥに対して特
    異的なモノクローナル抗体へのＩｇＥの結合をブロック
    し、 （５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はゲル濾過高圧液体クロマト
    グラフィーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であ
    り、そして （６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する場合、１０〜２
    ０KDの見かけ分子量を有する、ことを特徴とする当該断
    片；と交差反応する、ＩｇＥのためのリンパ球細胞リセ
    プター（ＦｃεＲ）に対するモノクローナル抗体を生産
    するハイブリドーマセルラインの製造方法であって、適
    当な哺乳類動物をＦｃεＲを発現するリンパ球により免
    疫感作し、この動物の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
    せしめ、この融合において得られたハイブリド細胞をク
    ローン化し、そして所望の抗体を生産する細胞クローン
    を選択することを特徴とする方法。
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