JPH06508829A - サプレッサーｔ細胞ハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サプレッサーＴ細胞ハイブリドーマ 本出願は、１９９０年６月４日に出願された出願番号箱５３３．８８９号の一部 継続出願である第７０９．３７５号、１９９１年６月３日出願、の一部継続出願 である。

発明の分野 本発明は、抗原に特異的であって、その抗原に対するヒトの免疫応答を抑制する ために利用することのできる、ヒトグリコジル化阻害因子（Ｇ　Ｉ　Ｆ）に関す る。

技術的背景の説明 免疫応答は多くの場合有益であると考えられるが、場合によっては免疫応答の生 じた動物にとって抗原に対するその免疫応答が実は有害となることもある。免疫 応答が、それを受ける個体が深刻な病的続発症にかかりやすいような状態を作り 出す例としては、紅斑性狼癒のような自己免疫疾患がある。紅斑性狼癒の場合、 罹患者の甲状腺、赤血球、ＤＮＡ、および血小板の決定基に反応する抗体がしば しば存在する。

免疫応答の抑制が記述されるもう一つの例としては、アレルギーの治療がある。

アレルゲンに対するＩｇＥ抗体が枯草熱を引き起こし、外因性の喘息のような他 のアレルギー疾患に関係していることが、明確になっている。アレルギー疾患に おけるＩｇＥのきわめて重大な役割から、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体形成の 制御および抑制がアレルギー疾患の根本治療の一つである可能性が高まった。例 えば、ブタフサアレルゲンに対して感受性の枯草熱患者の血清中には、このアレ ルゲンに対するＩｇＥ抗体が常時検出される。ＩｇＥ抗体価は花粉のシーズン後 に上昇するが、その後それ以外の期間にはごくわずかしか低下しない。血清中の ＩｇＥの半減期はわずか２−３日であるから、ＩｇＥ抗体価の持続は、この抗体 がアレルゲンに暴露されることがないにもかかわらず患者のリンパ系細胞によっ て連続して合成され続けていることを示す。

過去２０年にわたって、実験動物で、ＩｇＥ抗体応答を制御するために、いくつ かの様々な試みが行なわれた。このような試みの一つは、古典的な免疫療法また は脱感作療法を改良することであった。この療法では、アレルギー患者はごく微 量のアレルゲンの注射を繰り返し受ける。脱感作療法によって一部の患者の臨床 的な症状が改善されることが示された。しかしながら、枯草熱患者の血清中のＩ ｇＥ抗体価は、治療後も減少しなかった。この療法の主な免疫学的効果は、Ｉｇ Ｇ抗体形成の増強と、花粉シーズン後のＩｇＥ抗体価上昇の抑制である。

脱感作療法または免疫抑制療法の限界は、副作用のため患者が大量のアレルゲン に耐えられないことである。この問題点を克服するために、例えば尿素−変性抗 原またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−結合抗原といった化学的に修飾さ れたアレルゲンを治療に用いる試みが行なわれた。修飾抗原は天然の抗原に対す る抗体とは結合しないので、比較的大量の修飾抗原をアレルギー症状を引き起こ すことなしに注射することが可能である。しかしながら、修飾抗原は抗原特異的 Ｔ細胞を刺激することができる。

修飾抗原をマウスに静脈注射することによって、天然抗原に対する一次ＩｇＥ抗 体応答を抑制する抗原特異的サブレ・ソサーＴ細胞の産生が引き起こされること が証明された。しかしながら、抗体価が最大に達した後に治療を始めた場合には 、この療法は継続中のＩｇＥ抗体産生に対して最低限の効果しか有していなかっ た。

（Ｔａｋａｔｓｕおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１１ ７．１２１１．１９７６）　？ウスでの観察と一致して、枯草熱患者でのポリエ チレングリコール結合抗原の臨床試験は、この治療がＩｇＥ抗体価を下げること ができないことを示した。修飾抗原を繰り返し注射することによって継続中のＩ ｇＥ抗体産生を抑制することができないのは、おそらくアレルギー患者に比較的 大量の抗原特異的ヘル／＜−Ｔ細胞が存在するためてあろう。修飾抗原は抗原特 異的サブレ・ンサーＴ細胞の産生を誘導するのみならず、ヘルパーＴ細胞数も増 加させるので、治療による後者の影響によってサブレ・ソサーＴ細胞の効果が打 ち消されたのであろう。この解釈は、免疫したマウスに抗原特異的サプレッサー Ｔ細胞を移植した結果、継続中のＩｇＥ抗体産生が抑制されたという事実によっ て支持される（Ｔａｋａｔｓｕおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、、　１１７．１２１１．１９７６）　ｏ以上の結果より、ヘルパーＴ細胞の数 を増加させることなしに抗原特異的サプレッサーＴ細胞を産生ずることが可能で あれば、枯草熱患者において持続するＩｇＥ抗体産生を抑制することが可能であ ることが示唆された。

１９８０年以来、本発明者らは、免疫グロブリンのイソタイプに特異的な様式で ＩｇＥ合成を選択的に制御する様々な方法を研究してきた。この研究の結果とし て、ＩｇＥに対して親和性を有し、ＩｇＥ合成を選択的に制御する二種類のＴ細 胞因子が発見された。

ＩｇＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）の一方は、ＩｇＥ応答を選択的に増強し、他方 のＩ　ｇＥ−ＢＦはその応答を選択的に抑制する。

このＩｇＥ増強因子とＩｇＥ抑制因子の主要な相違点は分子内の糖質部分である とおもわれる。ＩｇＥ増強因子はレンズ豆レクチンおよびコンカナバリンＡに結 合するが、ＩｇＥ抑制因子はこれらのレクチンに結合しない（Ｙｏｄｏｉ　ら、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２８．２８９゜１９８２　）。ＩｇＥ増強因子また はＩｇＥ抑制因子のいずれか一方を選択的に生産するための細胞メカニズムの分 析、ならびにこれらの因子の遺伝子クローニングによって、ＩｇＥ増強因子およ びＩｇＥ抑制因子は構造遺伝子を共有すること、およびこれらの因子の糖質部分 の性質および生物活性は翻訳後のグリコジル化過程で確立されることが示された （Ｍａｒｔｅｎｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、８４．８０９．１９８７　）。生理的条件下で、この グリコジル化過程は、この過程を促進または阻害する二つのＴ細胞因子によって 制御される。これらの因子をグリコジル化阻害因子（ＧＩＦ）およびグリコジル 化促進因子（Ｇ　Ｅ　Ｆ）と命名する。

ＧＩＦに特徴的な性質は、その生化学的活性である。このリンホカインはりポモ ジュリン（ホスホリパーゼ阻害タンパク質）に対する単クローン性抗体と結合し 、ホスホリパーゼ阻害タンパク質のリン酸化された誘導体であるとおもわれる（ Ｕｅｄａら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３０．８７８．１９８３　）　。ま た、ＧＩＦの主な供給源が抗原特異的サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）であることが 、マウスで明らかになった（Ｊａｄｉｅｕら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３ ３．３２６６、１９８４）　。オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的サプレッサーＴ 細胞ハイブリドーマに関するその後の実験から、抗原（ＯＶＡ）で刺激した同系 マクロファージでハイブリドーマ細胞を刺激すると、ＯＶＡに親和性を有するＧ ＩＦ　（抗原結合性ＧＩＦ）の産生が起こることが示された。しかしながら、同 じハイブリドーマがＯＶＡに親和性を示さないＧＩＦ（非特異的ＧＩＦ）を構成 的に分泌した。非特異的ＧＩＦとＯＶＡ結合性ＧＩＦとの関係に関する研究によ って、抗原結合性ＧＩＦは抗原結合性ポリペプチド鎖および非特異的ＧＩＦから なることが明らかになった（Ｊａｒｄｉｅｕおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｉｍｍ ｕｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｂｙ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　Ｐｏ１ｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、編、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉ ｎｃ、、　Ｎ、　Ｙ、、　５９５ページ、１９８７）　。抗原結合性ＧＩＦは他 の研究者によって報告された抗原特異的サプレッサーＴ細胞因子（ＴｓＦ）と共 通の抗原決定基を有し、抗原（担体）特異的な様式で抗体応答を抑制することも 明らかになった。さらに、抗原結合性ＧＩＦのみならず、他の研究者によって報 告された抗原特異的ＴｓＦも、単りローン性抗すポモジュリン（１４１−８７） と結合した免疫吸着剤に結合し、この免疫吸着剤を酸性ｐＨで溶出することによ って回収された。

アレルギー治療における脱感作療法の大きな限界にも関わらず、この技法は選り 抜きの方法であり続けている。結論として、抗原特異的ではあるが、現行の脱感 作療法てみられるような副作用を持たない技法がまさに必要とされている。

免疫応答の抑制は、宿主対移植片（ＨＶＧ）および移植片対宿主拒絶反応（ＧＶ Ｈ）を抑えるためにきわめて重要である。不幸にして、ＨＶＧやＧＶＨの場合だ けでなく自己免疫疾患の場合にも、免疫応答の抑制には、限られた効果しかなく 、特異的と言うよりはむしろ全身的に作用する毒性の高い薬剤を使用する。この ような療法の深刻な限界は、毒性は低いが特異性の高い免疫抑制剤の必要性を暗 示する。

ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を抑制するためのよりよい方法は、抗原に特 異的に結合できる、免疫抑制に有効な量のヒトＧＩＦを投与することであると考 えられる。こうすることによって、Ｔサプレッサー因子の濃度が特に優位になり 、その結果として抗原に対する免疫応答が減少する。このような結果を達成する ための方法を本発明は提供する。

発明の要約 本発明者は、同一抗原に対する免疫応答を抑制するヒト抗原特異的ＧＩＦを概ね 精製した。このヒト抗原特異的ＧＩＦを、必要に応じて、その抗原に対するヒト 免疫応答を抑制するための治療に利用することができる。

発明の詳細な説明 本発明は、望ましくない免疫応答に関わる抗原に対して特異性を有する、はぼ純 粋に精製されたヒト抗原特異的ＧＩＦに関する。このヒト抗原特異的ＧＩＦは、 望ましくない免疫応答を抗原特異的な様式で免疫抑制するために、きわめて有用 である。

本発明に於いては、アレルゲンに特異的に結合可能なヒト抗原特異的ＧＩＦが望 ましい。本発明の特に望ましい実施態様に於　・いて、ミツバチ毒の主要アレル ゲンであるホスホリパーゼＡ２　（ＰＬＡ、）のエピトープと結合するヒト抗原 特異的ＧＩＦを明らかに示す。この特異性によって、上記の抗原特異的ＧＩＦお よび同様の特異性を有する類似の抗原特異的ＧＩＦを、Ｐ　Ｌ　Ａ　２に対する ヒト免疫応答を抑制するために用いることができる。別の特に望ましい実施態様 に於いて、スギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｅｄａｒ）花粉のエピトープと結合する ヒト抗原特異的ＧＩＦを明らかにする。このＧＩＦをこの抗原に対するヒト免疫 応答を抑制するために利用することができる。

Ｐ　Ｌ　Ａ　２に対して抗原特異性を有するＧＩＦの生産に利用される知見を、 当業者は容易に他の抗原に拡大適用することができ、結果として余分な実験を行 なうことなしに他の抗原に対して抗原特異性を有する他のＧＩＦ分子を調製し精 製することができる。

結論として、広く新分野を拓くという本発明の特徴によって、自己免疫疾患やア レルギーといった免疫応答が介在する病気を抑えるために使用することができる 、他のアレルゲンに対するヒト抗原特異的ＧＩＦの調製が可能となる。はとんど のアレルギーや様々な自己免疫疾患の場合のように、望ましくない免疫応答の抗 原が公知である場合には、様々なヒト抗原特異的ＧＩＦの生産は特に容易である 。

本発明のヒトＰＬＡ２特異的ＧＩＦは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３を有す る細胞系統ＡＣ５から得られた抗原特異的ＧＩＦに由来し、または同一の性質を 有する。本発明のヒトスギ花粉特異的ＧＩＦは、細胞系統３１Ｅ９から得られた 抗原特異的ＧＩＦに由来し、または同一の性質を有する。

ハイブリドーマを作成し性質検討する方法ハイブリドーマを作成するために用い られる一般的方法はよく知られている（Ｋｃｈｌｅｒら、Ｅ！ｕｒｏｐｅａｎ　 Ｊ、１ｍｍ、、　６：　２９２．１９７６）。

簡単に述べると、ミツバチ毒に対してアレルギーであるヒトに由来する末梢血液 単核細胞（ＰＢＭＣ）を化学修飾したＰＬｌの存在下で培養した。非付着細胞を 回収し、次にＩＬ−２およびリボコルチン−１とともに培養した後、リンパ芽球 様細胞系統ＢＵＣと融合させた。ハイブリドーマをＰＬＡｚ特異的ヒトＧＩＦの 産生でスクリーニングした。

より一般的には、本発明はヒト抗原特異的ＧＩＦを産生ずる連続的継代ハイブリ ドーマ細胞系を作成するための方法に関するものであり、この方法は以下の段階 を含んでなる：（ａ）抗原に対して活性化され、ＩＬ−２およびホスホリパーゼ Ａ２阻害剤の存在下で培養したヒト抗原感作Ｔ細胞を得ること；さらに （ｂ）活性化Ｔ細胞を融合によって、融合相手の細胞系統と結合させ、ヒト抗原 特異的ＧＩＦを産生ずる能力を有するハイブリドーマを作成すること。

抗原感作Ｔ細胞は、末梢血液の単核細胞分画を含むあらゆる試料から得られる。

抗原感作Ｔ細胞は、感作に用いられた抗原の存在下で培養することによってさら に活性化され、次にその活性化Ｔ細胞をインターロイキン−２（ＩＬ−２）およ びホスホリパーゼＡ２阻害剤の存在下で増殖させる。このような目的に特に有用 なホスホリパーゼＡ２阻害剤はリポコルチンである。あるいはまた、２−（ｐ− アミルシンナモイル）−アミノ−４−クロロ安息香酸（ＯＮＯ−ＲＳ−０８２， ＯＮＯＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、　）といった、ＰＬＡ２阻害活性 を有する合成化合物を使用することができる。

−次抗原がＴ細胞に対して毒性を示す場合のような特定の条件下では、抗原を化 学修飾することが望ましい。このような修飾に有用な試薬は、塩酸グアニジンお よび臭化シアンを包含するが、当業者は余分な実験をすることなしに容易に同様 の試薬を捜し出すことができる。一般に、抗原の外部構造を破壊しない試薬を用 いることが望ましいが、これはこのような外部構造がサプレッサーＴ細胞の抗原 のエピトープ認識に重要であると考えられているためである。しかしながら、こ のような問題は例えば多くのアレルゲンのような細胞毒性のない大多数の抗原に とって重要でない。

結論としては、代表的なアレルゲンでは、Ｔ細胞を刺激するために天然の分子を 使用することができる。

本発明はヒト抗原特異的ＧＩＦを産生ずる抗原特異的ヒトＴ細胞およびＴ細胞ハ イブリドーマを作成するための方法に関する。

このようなＴ細胞およびハイブリドーマは、免疫抑制されるべき免疫応答に関わ る抗原に特異的な反応性を示す。

本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦと同じ抗原特異性を有するヒト抗原特異的ＧＩＦ を産生ずるＴ細胞ハイブリドーマを、対象とするヒト抗原特異的ＧＩＦの素反応 パターンを判定する型どおりのスクリーニング技法を用いて単離することができ る。したがって、ＰＬＡ２に特異的なヒトＧＩＦの場合、あるヒト抗原特異的Ｇ ＩＦ試料がＰＬＡ２に対してアレルギー反応を示す患者に由来する細胞の免疫応 答を抑制するならば、そのヒト抗原特異的ＧＩＦ試料と本発明のハイブリドーマ によって産生されるＰ　Ｌ　Ａ　２に特異的なヒトＧＩＦとは同等である。

あるヒト抗原特異的ＧＩＦが本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦの特異性を有してい るかどうかを判定するためのさらに別の方法は、本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦ をそれが通常反応する抗原（例えばハチ毒ＰＬＡ２　）とともにブレインキュベ ートし、ヒト抗原特異的ＧＩＦ試料がその抗原と結合する能力を阻害するがどう かを判定することである。もしヒト抗原特異的ＧＩＦ試料が阻害されたならば、 その試料は、十中へ九、本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦと同じエピトープ特異性 を有する。

本発明で用いられるように、「エピトープ」という用語は、当然、ヒト抗原特異 的ＧＩＦまたは本発明の単クローン性抗体と特異的な相互作用をすることができ る決定基を包含するものとする。エピトープの決定基は通常、化学的に活性な分 子の原子団、例えばアミノ酸または糖側鎖、からなり、特異的な三次元構造上の 特徴、並びに特異的な電荷の特徴を有するのが通例である。

さらに別の態様に於て、本発明はほぼ純粋に精製されたヒト抗原特異的ＧＩＦを 調製する方法に関するものであり、それは以下の段階を含んでなる： （ａ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生ずるようにヒト抗原特異的ＧＩＦを産生ずる 能力を有する連続的継代ハイブリドーマ細胞系統を培養すること；および、 （ｂ）培養物からほぼ純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離すること。

このように使用される連続的継代ハイブリドーマ細胞系統は、上記のように作成 される。さらに、培養時には、予め抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原、またはＣ Ｄ３やＴ細胞レセプターに対する抗体で刺激した同系のマクロファージにこのハ イブリドーマ細胞を暴露することによって、ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生ずるよ うハイブリドーマ細胞系統を刺激することが望ましい。

培養物からヒト抗原特異的ＧＩＦを単離し、またはほぼ精製するために様々な技 法を使用することができる。特に有用な技法は、抗原特異的ＧＩＦの結合する抗 原を用いたアフィニティー精製であり、例えばこの抗原は固相に結合している。

この技法の応用としては、二段階のアフィニティー吸着段階の利用があり、必要 ならば、ヒト抗原特異的ＧＩＦをほぼ精製する。このような過程に於て、はぼ純 粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階は以下を包含する； （ｉ）ヒトＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体とハイブリドーマ細胞系 統培養物を反応させること；（ｉｉ）単クローン性抗体からヒトＧＩＦを溶離す ること；（ｉｉｉ　）溶離したＧＩＦを、ヒト抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原 と反応させること； （ｉｖ）抗原からヒト抗原特異的ＧＩＦを溶離すること：および （ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。

あるいはまた、二つの吸着段階の順序を逆にするもともでき、その場合、はぼ純 粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階は以下を包含する； （ｊ）ハイブリドーマ細胞系培養物をヒト抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原と反 応させること； （ｉｉ）ヒトＧＩＦを抗原から溶離すること；（ｉｉｉ　）溶離したＧＩＦをヒ トＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体と反応させること； （ｉｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを単クローン性抗体から溶離すること；および （ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。

ハイブリドーマ細胞をＡＢＣのような無血清培地に適応させることによってヒト 抗原特異的ＧＩＦの精製が容易になる。サブクローンを抗−ＣＤ３で処理し、続 いてそのハイブリドーマ細胞をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａてコーティングした培養シャ ーレで培養した後、培養上清中の抗原結合ＧＩＦを上記のようにイオン交換クロ マトグラフィーによって精製することができる。このような条件のもとで、はぼ 純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離するための方法は以下の工程を包含する； （ｉ）ハイブリドーマ細胞系培養上清を陰イオン交換体と接触させること； （ｉｉ）その交換体からヒトＧＩＦを溶離すること：（ｉｉｉ　）溶離したＧＩ Ｆを、ヒトＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体と反応させるか、もしく はヒト抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原と反応させるか、またはその両者と反応 させること； （ｉｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを溶離すること：および（ｖ）ヒト抗原特異的Ｇ ＩＦを回収すること。

したがって、ヒト抗原特異的ＧＩＦを単離するために、例えば上記のように抗原 特異的ＧＩＦが結合する抗原を使用し、またはヒトＧＩＦと特異的に反応する抗 体を使用し、またはその両者を使用することによって、イオン交換クロマトグラ フィー精製はアフィニティー精製と組み合わせて用いられて、ヒト抗原特異的Ｇ ＩＦを単離する。

望ましい実施態様に於て、ＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅは、抗原特異的ヒトＧＩＦの精製に利用される交換体である。利用可能な他 のイオン交換体には、はとんどすべての市販の陰イオン交換アガロースおよびセ ルロース、例えばポリ硫酸化アガロース、を包含し、特にＱＡＥ　（第４級アミ ン）誘導体、ｅｃｔｅｏｌａ　（エビクロロヒドリントリエタノールアミン）、 ＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）誘導体、およびＡＥ（アミノエチル）セル ロースを包含するがそれらに限定されない。当業者はこれらの様々なイオン交換 体の結合および溶離に関する特異的なパラメーターを知ることができ、または余 分な実験を行なうことなしに容易に確認することができる。

ハイブリドーマ細胞系統培養上清を、約２０ｍＭ塩類、例えばＮａＣ１で平衡化 した陰イオン交換体に添加すると、ＧＩＦのほとんどがカラムを通過し、残りは 約６０ｍＭまでの塩濃度によって溶離される。ＤＥＡＥからの溶離に望ましいＮ ａＣＩ濃度は１０　ｍＭＴｒｉｓ中約２０−約６０ｍＭである。

ヒトＧＩＦのアフィニティー精製に特に有用である単クローン性抗体は、細胞系 統３８８Ｆによって産生される単クローン性抗体であり、または細胞系統３８８ Ｆ＋によって産生される単クローン性抗体と同じ特異性を有する単クローン性抗 体である。

ヒト抗原特異的ＧＩＦの治療への利用 「抑制する」という用語は、治療を受けるヒトに於いて望ましくない免疫応答の 有害な影響を減らすことを意味する。「免疫抑制に有効Ｊという用語は、使用し たヒト抗原特異的ＧＩＦの量が、望ましくない免疫応答に起因する疾病または症 状の原因を抑制するのに量的に十分であることを意味する。

本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦを投与するための用量の範囲は、免疫応答の症状 が一定の抑制を受けるような、望ましい効果を生じるに十分な量である。用量は 、例えば不必要な交差反応、アナフィラキシ−型反応などのような有害な副作用 を引き起こすほど多量であってはならない。一般に用量は、患者の年齢、健康状 態、性別および病気の程度によって変化すると考えられ、当業者はこれを決定す ることができる。医師は、なんらかの治療に逆行する徴候があればその用量を調 整することができる。−日または数日間、−日当り一回または二回以上の投与で 、用量は、約Ｏ０ＯＯ１ｍｇ／ｋ　ｇ／投与から約２ｍｇ／ｋｇ／投与まで変化 し得るが、約０．　ＯＯ１ｍｇ／ｋ　ｇ／投与から約０．２ｍｇ／ｋｇ／投与ま でが望ましい。

本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦは、注射によって、または長時間のゆっくりとし た潅流によって、非経口的に投与できる。本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦは、静 脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与可能である。

非経口投与の製剤は、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液を 包含する。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリ コール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能 な有機エステルがある。水性担体は水、含水アルコール溶液、乳濁液、または懸 濁液を包含し、塩類液および緩衝剤を包含する。非経口賦形剤は、食塩水、リン ゲルブドウ糖液、ブドウ糖および食塩、乳酸塩リンゲル液、または不揮発油（ｆ ｉｒｅｄ　ｏｉｌ）を包含する。静脈注射用賦形剤は、流動性栄養補充物、電解 質補充物（例えば、リンゲルブドウ糖液を基本とするもの）などを包含する。例 えば、抗生物質、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、防腐 剤および他の添加物が含まれていてもよい。

また本発明は、本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦを含んでなる薬剤または医薬組成 物を調製するための方法に関する。このような薬剤は、抗原に対する望ましくな い免疫応答の治療に用いられ、その抗原は本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦによっ て結合する能力を有する。

本発明はまた、単クローン性抗体およびこのような抗体を産生ずるＢ細胞ハイブ リドーマに関する。この抗体はヒトＧＩＦに特異的に反応する。

上記のように、ハイブリドーマを作成するための技法は当業者によく知られてい る。簡単に説明すると、本発明のＢ細胞ハイブリドーマは、アフィニティー精製 したヒトＧＩＦでＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫し、さらに後に追加免疫することに よって調製された。最終免疫から２週間後に、動物から肺細胞をとり、予め致死 量の放射線照射を行なった同系のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに移入した。移 入を受けた同系マウスは、精製ヒトＧＩＦで二回免疫され、最終免疫から二週間 後にその肺細胞を５Ｐ２１０−１４ＡＧ骨髄腫細胞系統と融合させた。ハイブリ ドーマをヒトＧＩＦに対する単クローン性抗体の生産でスクリーニングした。

対象となる単クローン性抗体の素反応パターンを判定する型どおりのスクリーニ ング技法を用いて、本発明の単クローン性抗体と同じ反応性のある単クローン性 抗体を産生ずるハイブリドーマを単離することができる。したがって、ある単ク ローン性抗体試料がヒトＧＩＦとは反応するがマウスＧＩＦとは反応しないなら ば、その抗体試料と本発明のハイブリドーマが産生ずる抗体とは同等である。

当業者は、抗イデイオタイプ抗体を生成することによって、単クローン性抗体３ ８８Ｆ、または他のすべての本発明の単クローン性抗体と同じ特異性を有する単 クローン性抗体を産生ずる他のハイブリドーマの単離を行なうことができる（Ｈ ｅｒｌｙｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２．１００１９８６）　、抗−イディオ タイプ抗体は、対象となるハイブリドーマによって生産された単クローン性抗体 上に存在する固有の決定基を認識する抗体である。このような決定基は、抗体の 超可変部に存在する。一定のエピトープに結合するのはこの領域であり、したが って抗体の特異性を担っている。対象とする単クローン性抗体で動物を免疫する ことによって、抗−イディオタイプ抗体を調製することができる。免疫された動 物は、このようなイディオタイプ決定基に対する抗体を生産することによって、 免疫した抗体のイディオタイプ決定基を認識しこれに応答する。

第２の動物によって生産された抗−イディオタイプ抗体は、単一のハイブリドー マによって生産され、第２の動物を免疫するために用いられた単クローン性抗体 に特異的であるので、この抗−イディオタイブ抗体を使用することによって、免 疫するために用いたハイブリドーマの抗体と同一のイディオタイプを持つ他のク ローンを同定することができる。またそれによって本発明の単クローン性抗体の 特異性を有する単クローン性抗体を産生ずる他のハイブリドーマを見いだすため に必要なスクリーニングの総量を少なく腰非常に簡易にすることができる。

二つのハイブリドーマの単クローン性抗体の間でイディオタイプが同一であるこ とは、それら二つの単クローン性抗体が同一のエピトープ決定基を認識するとい う点に関して同一であることを示す。したがって、単クローン性抗体上のエピト ープ決定基に対する抗体を使用することによって、同じエピトープ特異性を有す る単クローン性抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することができる。

あるいはまた、本発明の３８８Ｆ、が例えば通常３８８Ｆ＋が反応するヒトＧＩ Ｆといった特定の抗原と結合するのを、単クローン性抗体試料が妨げるかどうか を判定することによってその単クローン性抗体が本発明の３８８Ｆ＋　と同じ特 異性を有するかどうかを判定し、余分な実験なしに、その単クローン性抗体を評 価することができる。単クローン性抗体試料が３８８Ｆ、による結合の減少を示 して、３８８ＦＩと競合するならば、これら二つの単クローン性抗体は同じエピ トープと結合する可能性が高い。

単クローン性抗体が３８８Ｆ＋　と同じ特異性を有するかどうかを判定するため のさらに別の方法は、３８８Ｆ、が通常反応する例えばヒトＧＩＦのような抗原 と３８８Ｆ１をプレインキユベートシ、単クローン性抗体試料のその抗原を認識 する能力が阻害されるかどうかを判定することである。もし単クローン性抗体試 料が阻害されるのであれば、たぶん、その試料は本発明の単クローン性抗体と同 じエピトープ特異性を有する。

ある特定の条件のもとでは、診断や治療上の有効性の点から、あるイソタイプの 単クローン性抗体が他のものより望ましいことがある。単クローン性抗体の特定 のイソタイプは、直接、最初の融合から選択することによって、あるいは二次的 に異なるイソタイプの単クローン性抗体を産生ずる族ハイブリドーマからクラス スイッチ変異体を単離する血縁選択法を利用することによって、調製することが できる（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、８２．　８８８６５３ ．１９８５；　５ｐｉｒａ　ら、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　７４．３０７．１９８４　’）　Ｏしたがって、本発 明の単クローン性抗体は、ＡＴＣＣＨＢ１０４７２により産生された単クローン 性抗体３８８ＦＩと同じ特異性を有するクラススイッチ変異体を包含する。この 細胞系統は、１９９０年６月４日に先だって、Ｍａｒｙｌａｎｄ州Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）に３０年間寄託された。

本発明で使用される「抗体」という用語は、完全な分子だけでなく、例えばＦａ ｂおよびＦ（ａｂ　ｌ　）　２といった、エピトープ決定基と結合可能なそのフ ラグメントも包含することとする。

本発明の単クローン性抗体は、本明細書中で言及した様々なタイプのヒトＧＩＦ を精製するための免疫アフィニティークロマトグラフィーに使用することもでき る。このような免疫アフィニティークロマトグラフィーが利用可能であるような 一つの方法は、例えば本発明の単クローン性抗体のＣＮ　Ｂ　ｒ　−５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ−４ＢまたはＴｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）への結合を利用することによる。他のタンパク質混合物に由来するヒトＧ ＩＦを特異的に結合させて、その単離および精製を可能にするために、これらの 固相に結合した単クローン性抗体を用いることができる。当業者に公知の例えば カオトロピック試薬、低ｐ）（または尿素といった技法を用いて、結合したＩＦ Ｎ−ガンマをアフィニティークロマトグラフィー基材から溶出することができる 。

以上の開示は、本発明を概括的に記述する。実施例は説明のみを目的として本文 中に提示され、本発明の範囲を限定することを意図しないが、以下の明確な実施 例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。

実施例１ ヒト抗原特異的グリコジル化阻害因子（Ｇ　Ｉ　Ｆ）を産生ずるハイブリドーマ 細胞系統の調製および精製技法Ａ、抗原 ハチ毒由来の凍結乾燥ホスホリパーゼＡ２　（ＰＬＡ２）は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯより購入した。変性ＰＬ Ａ。

（Ｄ−ＰＬＡ２）および臭化シアン処理ＰＬＡ、は、Ｋｉｎｇら、Ａｒｃｈ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１７２；　６６１．１９７６に よって記載された方法によって調製した。Ｄ　ＰＬＡ２を調製するために、５ｍ ｇのＰ　Ｌ　Ａ　２を０゜ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ緩衝液ｐＨ８，６に溶解し 、５ｍｇ／ｍｌジチオスレイトール存在下６Ｍ塩酸グアニジン中で変性させた。

室温で１８時間後、スルフヒドリル基をヨード酢酸を用いてカルボキシメチル化 した。変性タンパク質を０．０２Ｍ酢酸に対して透析し、使用するまで一４０℃ に保った。Ｐ　Ｌ　Ａ　ｆ内のメチオニン結合を切断するために、１　ｏｍｇの ハチ毒ＰＬＡ。

を０．４ｍｌ蒸留水に溶解し、１００ｍｇＣＮＢｒを含有する１、２ｍ１ギ酸を 添加した。室温で２時間後、混合物を水で二倍に希釈し、５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ中 で凍結乾燥した。天然Ｐ　Ｌ　Ａ　２をＴｒｅｓｙｌ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ 　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に、製造業者の勧める方法にしたがって結合させた 。特に言及しない限り、１ｍｇタンパク質を１ｍ　ｌ　５ｅｐｈａｒｏｓｅに結 合させた。

Ｂ、抗体 精製ヒトＥ骨髄腫タンパク質ＰＳ１ハイブリドーマＨ−Ｉ　ＤＮＰ−Ｅ−２６由 来の単クローン性マウスＩｇＥ（Ｌｉｕら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２４、 ２７２８．１９８０）および単りローン性抗−ＣＤ３　（ＯＫＴ３）は既報の論 文に記載されたのと同様に調製した（Ｃａｒｉｎｆら、Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１ ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１２７；　２２１．１９９０　）　、単りローン性抗− 丁細胞レセプターαβ、ＷＴ　３１　Ｃ（Ｓｐｉｔｓ　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、、１３５；　１９２２、１９８５）を含有する腹水は、ＤＮＡＸ　Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｉｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡのＪ、　Ｄｅｃｒｉｅｓ博士の厚意により提 供を受けた。ウサギリポモジュリン１４１　Ｂ　９　（Ｉｗａｔａら、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、、　１３２；　１２８６．１９８４）に対するマウス単クローン性 抗体は既報の記載と同様に調製した（Ａｓｋａｓａｋｉら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、、　１３１；　３１７２．１９８６）。マウスＩｇＧに対する特異的に精製 されたヤギ抗体は、抗Ｈ（γ）鎖および抗り鎖の両方を含有するが、これはすで に報告されている（　Ｓｕｅｍｕｒａら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２５； 　１４８゜１９８０　＞。フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体は Ｃａｐｐｅｌから購入した。ヒトＩｇＧおよび抗−リポモジュリン抗体（１４１ Ｂ９）をＣＬ　”５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂに結合させた；約５　ｍ　ｇタン パク質を１　ｍ　ｌ　５ｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた。

Ｃ１細胞系 １０％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノー ルおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩＩ６４０培地で、ＲＰＭＩ８８６６リンバ 芽球様細胞を培養した（ＲＰＭ１１６４０培養基）。マウスＴ細胞ハイブリドー マ１２Ｈ５細胞（１ｗａｔａら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４０；　２５３４ ．１９８８）は、既報の論文（Ｈｕｆｆら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、１２９；　５０９．　１９８２　）に記載された高 濃度グルコースダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持された。ヒト リンパ芽球様細胞系統ＣＥＭ（ＢＵＣ）のヒポキサンチングアニンホスホリボシ ルトランスフェラーゼ−欠損変異株は、すでに報告されている（ｔ（ｕｆｆおよ びｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、 Ｓ、Ａｏ、８１；　１５１４．１９８４）。

Ｄ、細胞培養およびハイブリドーマの構築ミツバチ毒に対してアレルギーを示す 患者から末梢血液を採り、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で の遠心分離によって、この血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。抗原感作Ｔ細胞 を活性化するために、ＲＰＭ１１６４０培養基に３ｘｌＯ’有核細胞／ｍｌの濃 度でＰＢＭＣを懸濁し、１０　ｕ　ｇ／　ｍ　］　Ｄ　Ｐ　ＬＡ２またはＣＮＢ ｒ処理ＰＬＡ２の存在下で３日間培養した。非付着細胞を回収し、新培養基に再 呼濁しく２ｘｌＯ’細胞／ｍｌ）、次に３μｇ／ｍ１組換えヒトリポコルチン１ 　（ＢｉｏｇｅｎのＪ、　Ｂｒｏｗｎｉｎｇ博士およびＢ、　Ｐｅｐｉｎｓｋｙ 博士の厚意により提供された）の存在下、６゜ユニット／ｍｌ精製ＩＬ−２（ク ロマトグラフィーで精製されたヒトＩＬ−２、Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎ ｉｃｓ、　Ｓｉｌｖｅｒｓｐｒｉｎｇ、　ＭＤ）とともに４日間培養した。

Ｔ細胞ハイブリドーマを構築するために、予めＩＬ−２によって増殖させた１、 ２ｘｌＯ’Ｔ細胞を２倍の細胞数のＢＵＣ細胞と混合した。混合細胞をペレット 状にし、ポリエチレングリコール（１３００−１６００ＭＷＳＳｉｇｍａ　）を 用いて融合させた。

細胞融合に関する詳細な方法は、すでに報告された通りである（Ｈｕｆｆら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８１；　１５１４．　１ ９８４）。

ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）含有ＤＭＥＭに細胞を再 懸濁し、５ｘｌＯ’細胞を９６ウエルプレートの各ウェルに分注した。完全ＤＭ ＥＭ中で週２回継代培養してハイブリッドクローンを維持した。Ｔ細胞ハイブリ ドーマを刺激するために、８μｇ／ｍ１ＯＫＴ３を用いて、０℃で４０分間この 細胞を処理し、この抗体処理細胞（１ｘｌＯ＠／ｍｌ）を、予めＩＯμｇ／ｍｌ 抗−ＭＧＧでコーティングしたＬｉｍｂｒｏ組織培養ウェル（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ ｓ、　Ｍｃｌｅａｎ、　ＶＡ　）に分注した。２４時間培養後、培養上清を得た 。

Ｅ、ＣＤ３およびＴｃＲの検出 ５％ＦＣ３および１０　、ＣＺＭＮ　ａ　Ｎｓを添加したＲＰＭＩ　Ｉ　６４０ 培地中で、８　ｕ　ｇ／ｍ　ｌ　ＯＫＴ　３または１　：　１０００希釈抗−Ｔ ｃＲαβ（ＷＴ３１）含有腹水とともに、ハイブリドーマ細胞（１ｘｌＯ’／試 料）を、０℃で４０分間、インキュベートした。対照として、同じ細胞の一部を 同一濃度のマウスｔｇｃ２゜（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　イソタイ プ対照）で処理した。５％ＦＣ３含有ＰＢＳで細胞を二回洗浄し、次にフルオレ セイン標識した抗−マウスＩｇＧとともに４０分間インキュベートした。洗浄後 、細胞に付随する蛍光をＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣ３ｃａｎを 用いて分析した。

抗−マウスＩｇＧでコーティングされたウシ赤血球を用いたロゼツト形成によっ て、ＣＤ３＋ハイブリドーマ細胞を同定した。

Ｗｉ　ｌｈｅｌｍらの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　９０； 　８９．１９８６　）によって、この抗体を赤血球に結合させた。簡単に述べる と、０．５ｍｌのウシ赤血球沈渣を塩類液で４回洗浄し、０．７５ｍ１の０．５ μｇ　／　ｍ　Ｉ精製抗−ＭＧＧに懸濁した；この細胞懸濁液に２５μ１ＣｒＣ Ｉａ　（１６，５ｍｇＣｒＣ１＋を５　ｍ　ｌ塩類液に溶解する）をゆっくり混 合しながら添加し、得られた細胞懸濁液を３０℃で１時間インキュベートした。

抗−ＭＧＧ結合赤血球を塩類液で４回洗浄し、５ｍ１ＦＣ８（約１ｘｌＯ’赤血 球／ｍ１）に再懸濁した。ＣＤ３°細胞を検出するために、５％ＦＣ３および８ ．ｃｚｇ／ｍ１ＯＫＴ３を含有する８０μＩＤＰＢＳに１０６ハイブリドーマ細 胞のペレットを懸濁した。０℃で４５分後、細胞を２回洗浄し、８０μＩＤＰＢ Ｓ−５％ＦＣ８に再懸濁し、抗−Ｍ　Ｇ　Ｇでコーティングされた赤血球および クリスタルバイオレットの懸濁液２０μｌをこの細胞懸濁液に添加した。この混 合物を２００ｇで５分間遠心分離し、チューブを０℃で２時間インキュベートし た。ペレットを徐々に再懸濁し、顕微鏡下でロゼツト形成した細胞を検査した。

Ｆ、ＣＤ３＋細胞の濃縮 ８μｇ／ｍ１ＯＫＴ３　（１，５ｘｌＯ’細胞）で処理したハイブリドーマ細胞 を、抗−ＭＧＧが結合した赤血球（約４ｘｌＯ’赤血球）と混合して、上記の方 法によってロゼツトを形成した。

ペレットを再懸濁し、６０％および５０％パーコール層からなるパーコール勾配 の上端にのせた。チューブを１２０ＯＲＰＭ　（７００ｇ）で２０分間、室温で 遠心分離した。ペレット状の細胞を培養基で２回洗浄し、０．８３％ＮＨ，ＣＩ 緩衝液で、０℃１分間、処理することによって、赤血球を溶解させた。細胞をＤ ＭＥ培養基で洗浄し、これに再懸濁し、細胞数を増加させるために培養した。

ＣＤ３”細胞のさらなる富化は細胞選別によって行なわれた。

ハイブリドーマ細胞を０ＫＴ３で処理し、フルオレセイン標識した抗−ＭＧＧで 染色した。ＦＡＣ３ＴＡＲ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｆｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた細胞 選別によって、ポジティブに染色された細胞を選択した。

Ｇ、ＩｇＥ−ＢＦの精製および検出 Ｔ細胞ハイブリドーマの培養上清を、ＤｉａｆｌｏＹＭ　１００メンプラン（Ａ ｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ　）で濾過し、濾液を ＹＭ５メンプランで限外濾過して１０倍に濃縮した。既報の方法にしたがって（ ｌ５ｈｉｚａｋａおよびＳａｎｄｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６ ；　１６９２゜１９８１）　Ｉ　ｇＥ結合５ｅｐｈａｒｏｓｅを用いてこの濾液 中のＩｇＥ−ＢＦを精製した。培養濾液中またはＩ　ｇ　Ｅ　−５ｅｐｈａｒｏ ｓｅからの酸溶出画分中のＩｇＥ−ＢＦの存在は、既述の方法（Ｋｉｓａｋｉら 、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｌ、、　１３８：　３３４５．１９８７）にしたがって、 ＦＣεＲ”Ｂリンパ芽球様細胞系、ＲＰＭＩ８８６６細胞とヒトＩｇＥコーティ ングウシ赤血球（Ｅ−ＩｇＥ）とのロゼツト形成の阻害によって評価された。３ ００ＲＰＭ１８８６６細胞のうち、ロゼツト形成細胞（ＲＦＣ）の割合を二連で 測定し、平均値±ＳＤとして表示した。

１２Ｈ５細胞によって産生されるげつ歯頚Ｉ　ｇＥ−ＢＦを同じ方法によって検 出したが、ただし指示細胞としてはラットＩｇＥコーティングウシ赤血球を用い 、ＦｃεＲ”　Ｂ細胞の供給源としてはＮｉｐｐＯｒｔｒＯｎｎｇｙｌｕＳ　ｂ ｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓに感染したＬｅｗｉｓ系ラットの腸間膜リンパ節細胞を 用いた（Ｙｏｄｏｉおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２４；　１３２２．　１９８０　）　。

Ｈ，ＧＩＦの検出 Ｔ細胞バイブリド−７１２Ｈ５細胞（Ｉｗａｔａら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 　１４０．２５３４．１９８８）を用いて、ＧＩＦを検出した。ハイブリドーマ 細胞の懸濁液を等量の検査試料と混合し、その細胞懸濁液を１０μｇ／ｍｌマウ スＩｇＥとともに２４時間培養した。培養上清をＣＦ３０Ａメンプランで濾過し 、Ｉ　ｇＥ−ＢＦ含有濾液をレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｙｏｄｏ ｉ　ら、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、、　１２５；　１４３６、１９８０）で分画した 。非結合タンパク質（流出画分）および０゜２Ｍαメチルマンノシドで溶出され たタンパク質（溶出画分）の両者を、ＩｇＥ−ＢＦの存在について、ロゼツト阻 害技法で評価した。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥとのみ培養したときは、その細 胞によって産生されたすべてのＩ　ｇＥ−ＢＦは本質的にレンズ豆レクチン５ｅ ｐｈａｒｏｓｅに結合し、αメチルマンノシドで溶出することによって回収され た。したがって、流出／溶出画分のロゼツト阻害パーセントの比は、０．２より 小さい。十分量のＧＩＦがマウスＩｇＥとともにｌ　２Ｈ５細胞の培養に添加さ れた場合には、その細胞によって産生されたＩｇＥ−ＢＦの大部分は、レンズ豆 レクチンに対する親和性を欠いており、流出画分に回収された（Ｉｗａｔａおよ びｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４１；　３２７０．１９ ８８）　ｏしたがって、流出／溶出画分のロゼツト阻害パーセントの比が３゜０ またはそれより高いならば、ＧＩＦは（＋）として作用した。

１、ＧＩＦの分画 ハイブリドーマ由来のＧＩＦがハチ毒ＰＬｉに対して親和性を有するかどうかを 判定するために、ハイブリドーマ細胞の培養上清を抗原−結合５ｅｐｈａｒｏｓ ｅで分画した。ハイブリドーマ細胞を０ＫＴ３抗体（８μｇ／ｍｌ）で処理し、 この抗体処理細胞懸濁液または非処理細胞懸濁液（１，５ｘｌＯ’細胞／ｍ１） のうち８ｍｌを、抗−ＭＧＧでコーティングした組織培養フラスコで培養した。

培養上清を４倍に濃縮し、２ｍｌ試料を０．４ｍｌＩｇ　Ｅ　−５ｅｐｈａｒｏ ｓｅに吸着させた。流出画分を０　、　５　ｍ　Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ａ　ｔ−５ｅｐｈ ａｒｏｓｅと一晩混合し、免疫吸着剤を小カラムに詰めた。流出画分を回収した 後、カラムをＤＰＢＳで洗浄し、１．０ｍｌグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３，０ で溶出した。既述の方法（Ａｋａｓａｋｉら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３６ ；　３１７２．１９８７）によって、抗−リポモジュリ：／　（１４１Ｂ　９　 ）　５ｅｐｈａｒｏｓｅで、ＧＩＦを部分精製した。

Ｊ、ホスホリパーゼ阻害活性の測定 アフィニティー精製ＧＩＦをアルカリホスファターゼで既述のように処理した（ Ｕｅｄｅら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３９；　８９８．１９８３　）。

簡単に述べると、１ｍｌの標品をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８゜２に対して 透析し、■ユニットの不溶性アルカリホスファターゼ（子ウシ腸、Ｓｉｇｍａ　 ）と室温で２時間混合した。遠心分離後、上清を０．　１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩 衝液、ｐＨ８，０に対して透析した。

生合成過程で３Ｈ−オレイン酸により標識された大腸菌およびブタ膵臓ＰＬＡ２ 　（Ｓｉｇｍａ）を用いて、アルカリホスファターゼ処理試料のホスホリパーゼ Ａ２阻害活性を測定した（ＲＯｌｈｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１１７；　８７８．１９８３）　ｏ詳細な方 法は、Ｑｈｎｏら（Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１；　４２５．１ ９８９）に記載されている。簡単に述べると、ブタ膵臓ＰＬＡｚ　（１ｘ　１０ −５ユニツト）をＧＩＦと混合し、総容量１５０μＩとした。２５℃で５分後、 ３Ｈ標識大腸菌の懸濁液５０μＩ　（５０００ｃｐｍ）を添加し、その混合物を ２５℃で５分間インキュベートした。５０μｍの２ＭＨＣｌを添加して反応を止 め、５０μｌのｌ　ＯＯｍｇ／ｍ１ＢｓＡをこの混合物に添加した。この懸濁液 を５５００ｇで１分間遠心分離し、２５０μｌ上清中の放射能をシンチレーショ ン分光計で測定した。

Ｋ、イオン交換カラムクロマトグラフィー無血清培地中のＡＣ５細胞の培養上清 を、限外濾過によって２５から１００倍に濃縮した。１０，０００ｒｐｍで２０ 分間遠心分離した後、上清を蒸留水で８倍に希釈し、ＴｒｉｓでｐＨ８，０に調 整し、ただちにｌ０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ１緩衝液、ｐＨ８，０て平衡化したＤＥ ＡＥ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）カラム （３ｍ、　ｌ容）にかけた。流出（通り抜け）画分を回収した後、カラムを４カ ラム容の２０ｍＭＮａＣ１含有１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液て洗浄し、洗 液を通り抜は画分に合わせた。４カラム容の５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、 １５０ｍＭ、および２００ｍＭＮａｃＩ含有１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液 、ｐＨ８，０でカラムに結合したタンパク質を良好に溶出した。各溶出画分を濃 縮し、ダルベツコのリン酸緩衝塩類液（ＤＰＢＳ）に対して透析した。

Ｌ、ゲル濾過 ＤＢＰ５中の試料１ｍｌを５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム（１，６ｘ５０　ｃ　 ｍＳＰｈａｒｍａｃｉａ　）にかけ、ＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｓｙｓ ｔｅｍ　Ｇｏｌｄ）に接続した。流速１ｍｌ／分でＤＰＢＳによりこのカラムか らタンパク質を溶出し、適当な画分を集めた。ヒトＩｇＥ（ＰＳタンパク質、Ｍ Ｗ：　１８５，０００）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡＳＭＷ：　６７．０００ ）　、オボアルブミン（ＭＷ＋４３，０００）、大豆トリプシンインヒビター（ ＭＷ：２０，１００）、およびシトクロームＣ（ＭＷ：　１２，５００）を用い て、このカラムを分子量で標準化（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）　した。ＩｇＥを除く すべての標準タンパク質は、Ｓ　ｉ　ｇｍａから購入した。標準タンパク質の保 持時間はそれぞれ４１．９７，５２．０８，５５．１３５．６２．０９７、およ び７１．６７分であった。

Ｍ、ＧＩＦのアフィニティー精製 完全ＤＭＥ培地中のＣＬ３クローン培養上清を、限外濾過によって５倍に濃縮し 、１４１　Ｂ　９−３ｅｐｈａｒｏｓｅまたは抗−ＧＩＦＳｅｐｈａｒｏｓｅカ ラム（５ｒｎｔ容）を通して一晩再循環処理することによって、上清中のＧＩＦ をこの免疫吸着剤カラムに吸着させた（１ｗａｔａら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、　１４１：　３２７０．１９８８）　、この免疫吸着剤を２０カラム容のＤＰ ＢＳで洗浄し、ビーズに結合したタンパク質を０．１ＭグリシリンＣＩ緩衝液、 ｐＨ３，０で溶出することによって回収した。１４１　Ｂ　９−５ｅｐｈａｒｏ ｓｅを用いた同一の技法によって、２３１Ｆｌ細胞由来のマウスＧＩＦを精製し た。

無タンパク質培地中で培養したＡＣ５細胞培養上清中のＧＩＦを単離するために 、この上清を限外濾過によって５０から１００倍に濃縮した。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　 −５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られたこの上清の適当な両分を、５−６ｍ１ にまで濃縮し、４℃で一晩、単りローン性抗ＧＩＦ抗体と結合したＡｆｆｉｇｅ ｌ　１０−免疫吸着剤１゜０−１．５ｍｌと混合した。この懸濁液を小カラムに 充填し、免疫吸着剤を４０カラム容のＤＰＢＳで洗浄した。一部の実験では、免 疫吸着剤を４０カラム容のＤＰＢＳおよび２０カラム容の０゜５ＭＮａＣ１含有 ＰＢＳで洗浄した。０．１５ＭＮａｃｌ含有０．０５ＭグリシンＨＣＩ緩衝液、 ｐＨ３，０−３，２、で免疫吸着剤に結合したタンパク質を溶出した。

Ｎ、５ＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＩＦの検出アフィニティー精製ＧＩＦを脱イオン 水中の０．０１％ＳＤＳに対して透析し、５ｐｅｅｄ　ｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ 　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　ＨｉｃｋｓｖｉｌＩｅ、　ＮＹ）中で凍結乾燥し た。次に、Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、、 　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：　６８０．１９７０）を用いて、１５％ポリアクリ ルアミドスラブゲル中でのＳＤＳゲル電気泳動によって試料を分析した。ゲルを 固定し、タンパク質バンドを銀染色によって検出した（Ｏｃｈｓら、Ｅｌｅｃｔ ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　２：　３０４．１９８１　）　ｏ分子量標準は、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａから購入した。

０、ＥＬＩＳＡアッセイ 単りローン性抗−ＧＩＦ抗体を検出するために、５ｔｅｅｌｅらによって記載さ れた方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：　２２１３．１９８９）を多少 変更して用いた。簡単に述べると、０．１Ｍ炭酸コーティング緩衝液、ｐＨ９， ６で希釈した１００μｌアフイニテイー精製ＧＩＦで１ｍｍｕｌｏｎ　ｌプレー ト（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を−晩コーティングした。

以下の各操作段階の間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝塩類液（Ｐ 　Ｂ　Ｓ）で、プレートを３回洗浄した。ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで、６−９時間 、プレートをブロックした。次いで、各試験試料の１００μｌをウェルに添加し 、そのプレートを一晩４℃に保持した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マ ウスＩｇ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂ、　Ｓｏ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃ Ａ）およびアルカリホスファターゼ基’Ｉ　（Ｓｉｇｍａ　）を用いて、マウス Ｉｇのプレートへの結合を検出した。基質添加の３０分後に、マイクロプレート リーダーＭＲ５０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂ）において４１０ｎｍのフィ ルターでＥＬＩＳＡシグナルを読み取った。ＥＬＩＳＡアッセイでマウスｍＡｂ のためのイソタイプ判定キット（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂ　）を使用することによっ て、単クローン性抗体のイソタイプを決定した。

アフィニティー精製ＧＩＦ標品の画分のＧＩＦを検出するために、ビオチン−ア ビジンシステムおよび増幅法（Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ、　８３：　８９．１９８５　）を用いて、感度を高めた。

Ｍａｘｉ−３ｏｒｐ　フィクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、　Ｃｏｐｅｎｈａ ｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ　）を５０μｍの各画分てコーティングした。３７℃ で２時間インキュベートした後、プレートをＴｗｅｅｎ／Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄し、 ４°Ｃて一晩、２％ＢＳＡでブロックした。洗浄後、５０μｍのビオチン結合ｍ Ａｂｌ　４１−８９　（２００ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、そのプレート を３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０μｌの１：１５ ００希釈ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌ ａｂ　）を各ウェルに添加した。３７°Ｃて１時間インキュベートした後、ウェ ルに結合したアルカリホスファターゼの量を増幅システムによって測定した（Ｓ ｔａｎｌ＋Ｊ　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８３：　８９． 　１９８５　）　（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ　）　。

Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａシグナルを４９０ｎｍで測定した。

（本頁以下余白） 実施例２ 上記のように、ハチ毒に感受性の患者のＰＢＭＣを、ｌＯμｇ　／　ｍ　ｌ　Ｄ 　Ｐ　Ｌ　Ａ　２の存在下で３日間培養し、３μｌ／ｍ１組換えリポコルチン存 在下で４日間、活性化されたＴ細胞をＩＬ−２によって増殖させた。次に、Ｔ細 胞をＢＵＣ細胞と融合させてハイブリドーマを構築した。本実験に於て、４ハイ ブリドーマクローンが得られた。完全ＤＭＥＭで各ハイブリドーマクローンを培 養し、培養上清をＹＭ１００メンプランで濾過した。濾液を１０倍に濃縮し、１ ２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦの存在について評価した。表１に示された結果は、４ ハイブリドーマクローンのうち二つが構成的にＧＩＦを分泌することを示す。

（本頁以下余白） 表１ ＧＩＦ産生ハイブリドーマの選択 ＣＩ　Ｉ　Ｏ／２６（−）　ＮＤ ＣＩ　２　２／３３（−）　３９０±２７４ＣＩ　３　２９１０（＋）　２５７ ±２５３７ＣＩ　７　２７１５（＋）　３０３±１７２６対　照　０／３１１′ 　４０８±１５　−−ａ）各クローンの培養濾液を１０倍に濃縮した。−容量の 濾液を、同量の１２Ｈ５細胞懸濁液に添加し、１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥの存 在下でこの細胞を２４時間培養した。縦列の数字は、レンズ豆レクチン５ｅｐｈ ａｒｏｓｅからの流出／溶出画分によるロゼツト形成阻害パーセントを表す。Ｉ 　ｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は２４４土０．３　（ＳＤ）％ であった。

ｂ）＋２８５細胞を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥのみとともに培養し、培養濾液 中のｌ　ｇＥ−ＢＦをレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。

Ｃ）培養濾液を１４１　Ｂ　９−３ｅｐｈａｒｏｓｅで分画し、この免疫吸着剤 からの酸溶出物を、もとの培養上清のＩ／Ｉ　ＯＯ容となるまで濃縮した。この 試料をアルカリホスファターゼで処理し、脱リン酸化物質の膵臓ホスホリパーゼ Ａ２阻害能を評価した。

ハイブリドーマクローンＣＬａ上のＣＤ３決定基の存在を、フローサイトメトリ ーおよびロゼツト形成技法によって評価した。８μｇ／ｍｌの単クローン性抗体 ０ＫＴ３で細胞を処理し、次に、フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇで 染色した。全細胞の１０％足らずが染色された。また０ＫＴ３処理細胞のうちわ ずかに６−８％が抗−ＭＧＧ結合赤血球とロゼツト形成することが明らかになっ た。結論として、実施例１に記載されたロゼツト形成法を用いて、ＣＤ３＋細胞 は富化された。パーコール層での密度勾配遠心分離法によって、抗−ＭＧＧ結合 赤血球とロゼツト形成した細胞を、ロゼツト形成しない細胞から分離し、完全Ｄ ＭＥＭ中で培養することによって増殖させた。同様の手順を３回繰り返して、Ｃ Ｄ３”細胞集団を富化した。最終的な細胞標品を０ＫＴ３で処理した後、抗−Ｍ ＧＧ結合赤血球とともにインキュベートすることによって細胞集団の８０−９０ ％がロゼツトを形成することが明らかになった。フローサイトメトリーにおいて 、細胞の７５％が０ＫＴ３によって染色された。しかしながら、４代継代して２ 週間細胞を培養した結果、約５２％までＣＤ３＋細胞が減少した（フローサイト メトリーによる測定）場合には、ＣＤ３４細胞集団を細胞選別によってさらに富 化し、培養によって細胞を増殖させた。細胞選別を２回繰り返した後、安定的に ＣＤ３を発現するＣＬ３集団が得られた。０ＫＴ３およびＷＴ３１（抗−ＴｃＲ αβ）によるこの細胞集団の蛍光染色は、はぼ１００％の細胞がＣＤ３を表現し 、細胞の大部分がＴｃＲαβを表現することを示した。ＣＤ３＋細胞集団および ＣＤ３−細胞集団を培養し、１２Ｈ５細胞をもちいてＧＩＦの有無について培養 濾液を評価した。ＣＤ３”細胞の培養濾液にはＧＩＦ活性が検出されたが、ＣＤ ３−集団の培養濾液には検出されなかった。この結果は、ＧＩＦの起源がＣＤ３ ”細胞であることを示した。

マウスＧＩＦに特有の性質の一つは単りローン性抗−リボモジュリン（１４１Ｂ ９）がこのリンホカインと結合していることであるので、ＣＬ３細胞に由来する ヒトＧＩＦが１４１Ｂ９結合５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着されるかとうかを判定す ることとした。ＣＤ３”、ＣＬ３クローンを培養して、１リツトルの培養上清を 得た。７Ｍ１００メンプランで濾過した後、濾液を５　ｍ　ｌに濃縮し、１ｍ１ １４１−　Ｂ　９５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。流出画分を回収した後、免疫 吸着剤を１０カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、次に５カラム容のグリノン−ＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ３，０で溶出した。ＤＰＢＳに対して透析した後、１２Ｈ５細胞を 用いて、分画におけるＧＩＦ活性の分布を測定した。表２に示す結果は、この培 養濾液中のＧＩＦ活性のほとんどすべてが、ｌ　４１−　Ｂ　９５ｅｐｈａｒｏ ｓｅに結合し、酸性ｐＨての溶出によって回収されたことを示す。

（本貫以下余白） 表２ １４１Ｂ９−３ｅｐｈａｒｏｓｅｂＧ　Ｉ　Ｆ活性Ｃからの画分　希釈　流出／ 溶出 流　出　１：１０　０／３１（−） 洗浄　１：１０　０／３５（−） 溶　出　１：１０　４２１０（＋） １：４０　４５１０（＋　） １：８０　３９１０（＋　） 培地対照　０／３４ ａ）ＣＬ３クローンの培養上清を７Ｍ１００メンプランで濾過し、濾液を２００ 倍に濃縮した。濃縮した濾液の５ｍｌを１ｍｌの１４１　Ｂ　９−５ｅｐｈａｒ ｏｓｅで分画した。

ｂ）流出画分を回収した後、５カラム容のＤＰＢＳで免疫吸着剤を洗浄し、次に ５カラム容のグリシンＨＣＩ緩衝液、ｐＨ３，０で溶出した。

ｃ）１２Ｈ５細胞を用いて、表１に記載されたのと同様の方法によって、ＧＩＦ 活性を評価した。縦列の数字は、レンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流 出／溶出画分によるロゼツト形成阻害パーセントを表す。Ｉ　１ｚＥ−ＢＦ不存 在下でのＩ　ｇＥ−ＲＦＣの割合は、このアッセイでは２２．９±０．６　（Ｓ Ｄ）％であった。（＋）はＧＩＦの存在を示す。

以前の実験で、マウスＧＩＦがホスホリパーゼ阻害タンパク質のリン酸化誘導体 であるという証拠が示された（　Ｕｅｄｅら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．、１３９： 　８９８．１９８３　）　。したがって、ＣＬ３クローンの培養濾液中のＧＩＦ は、１４１　Ｂ　９−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製された。

他の三クローン、ＣＬＩ、ＣＬ２．およびＣＬ７、の培養濾液を、同様に１４１ 　Ｂ　９−８ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。この免疫吸着剤からの酸溶出物をア ルカリホスファターゼで処理し、膵臓ホスホリパーゼＡ２によって生合成過程で 標識された大腸菌からの３Ｈ−オレイン酸の放出を阻害する能力を調べた（Ｒｏ ｔｈｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、 、　１１７：　８７８．１９８３）　ｏ表１に示す結果は、ＣＬ３およびＣＬ７ 由来のアフィニティー精製ＧＩＦはホスホリパーゼ阻害活性を発揮するが、ＣＬ ＩおよびＣＬ２由来の同一画分はホスホリパーゼＡ２を阻害しなかったことを示 す。

前の実験で、リポコルチン存在下でＩＬ−２によって増殖させた抗原活性化Ｔ細 胞が、ハチ毒ＰＬＡ！に親和性を示さないＧＩＦを構成的に分泌することが示さ れているが、同じ細胞にＣＤ３が架橋結合することによって、Ｉ　ｇＥ−ＢＦと ともにこの抗原の結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅに親和性を有するＧＩＦの産生が 生じた。

このような発見から、ＣＬ３クローンが抗原結合ＧＩＦおよびＩｇＥ−ＢＦを産 生ずるかどうかを判定することとした。細胞を０℃でＯＫ’Ｔ３で処理し、この 抗体処理細胞（１，５ｘｌＯ’細胞／ｍｌ）を抗ＭＧＧでコーティングしたウェ ルで培養した。対照として、非処理のＣＬ３細胞を抗ＭＧＧでコーティングした ウェルで培養した。培養上清をＹＭ１００メンプランで濾過し、限外濾過で７倍 に濃縮した。濃縮した培養濾液を１　ｍ　Ｉ　Ｉ　ｇＥ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ に一一吸着させ、非結合タンパク質画分および２ｍｌ洗液を合わせた。このＩ　 ｇ　Ｅ−５ｅｐｈａｒｏｓｅを完全に洗浄し、グリシンＨＣＩ緩衝液で溶出した 。ＲＰＭＩ８８６６細胞をＦｃεＲ＋細胞の供給源として用いて、Ｉ　ｇ　Ｅ− ３ｅｐｈａｒｏｓｅからの溶出画分をＩｇＥ−ＢＦの存在について評価した。

（来貢以下余白） 表ユ （％） ＯＫＴ３　２３　３４１０（＋）　２１１０（＋）　Ｏ／２４（−）な　し　０ 　２８１０　（＋）　２２／１３（＋）　Ｏ／２６（−）ａ）ＣＤ３処理または 非処理細胞を抗−ＭＧＧでコーティングしたウェルで培養した。

ｂ）３０ｍｌ培養上清をＹＭｌｏｏで濾過し、濾液を４ｍｌに濃縮した。この試 料を１　、　０　ｍ　ｌ　Ｉ　ｇ　Ｅ−８ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着させた。

酸溶出画分を４．０ｍｌに調整し、ロゼツト形成阻害によってＩｇＥ−ＢＦにつ いて評価した。Ｉ　ｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＢＰの割合は、３７７±１ ．０％であった。

ｃ　）　Ｉ　ｇ　Ｅ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出画分の１．０ｍｌをＰＬ Ａ２−３ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。この流出、洗浄、および酸溶出画分を１ ３ｍ１に調整し、１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性について評価した。縦列の数 字はレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅがらの流出／溶出画分によるロゼツト 形成阻害パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣ（７）割 合は、２１．７＋０．６　（ＳＤ）０６であった。

表３に示した結果は、抗−ＣＤ３処理細胞はＩｇＥ−ＢＦを産生ずるが、非処理 細胞は検出可能な量のＩ　ｇＥ−ＢＦを産生しなかったことを示す。Ｉ　ｇ　Ｅ −３ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出画分を２倍に濃縮し、１ｍｌ試料を０．　２５ ｍ１ＰＬＡ２−５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。この流出画分、洗浄液、および 溶出画分を１．５ｍｌに調整し、それらの試料をＧＩＦ活性について評価した。

表３に示すように、非刺激細胞および抗−ＣＤ３処理細胞のどちらに由来するＧ ＩＦも、Ｐ　Ｌ　Ａ　２−８ｅｐｈａｒｏｓｅに結合しなかった。

抗−ＣＤ３処理ＣＬ３細胞由来のＧＩＦがＰＬＡ２と結合しないのは、Ｔ細胞の 活性化にＤ−ＰＬＡ２を用いたことと関係があると考えられた。この可能性を調 べるために、ハチ毒感受性の患者のＰＢＭＣからもっと多くのＴ細胞ハイブリド ーマを構築した。Ｔ細胞ハイブリドーマを構築する手順は上記と全く同様である が、但しＤ　−Ｐ　Ｌ　Ａ　２の代わりにＣＮＢｒ−処理ＰＬＡ、、１０μｇ／ ｍｌでＰＢＭＣを刺激した。この実験の結果として、２２のハイブリドーマクロ ーンが得られた。各クローンの培養濾液のＧＩＦアッセイは、２２クローンのう ち１０個が構成的にＧＩＦを産生ずることを示した（結果は示さない）。７個の ＧＩＦ分泌クローンを０ＫＴ３で処理し、抗−ＭＧＧでコーティングしたシャー レでこの抗体処理細胞を培養した。培養濾液を４倍に濃縮し、Ｉ　ｇ　Ｅ−５ｅ ｐｈａｒｏｓｅに吸着させた。

（来貢以下余白） 表４ 抗−ＣＤ３−処理ハイブリドーマ細胞“にょる抗原−結合ＧＩＦの産生 ＰＬＡｔ−９ｅｐｈａｒｏｓｅｃにおけるＧＩＦ活性クローン　１Ｌ胛５　流出 　溶出 （％） ＡＣ５２００／２１（−）　３１１０（＋）Ａ　Ｆ　１０　３６　１９１０　（ ＋）　Ｏ／２１　（−）ＢＡ６　８　２９１０（＋）　０／２４（−）Ｂ　Ｅ　 １２　６５　０／３１　（−）　２５１０　（＋）Ｂ　Ｆ　５　６５　０／２７ 　（−）　２０１０　（＋）ＣＢ　７　６４　０／２８　（−）　１７１０　（ ＋）ＣＥ　ｓ　５８　０／２８　（−）　３５１０　（＋）ａ）１．２ｘｌＯ’ 細胞を０ＫＴ３で処理した。細胞を８ｍｌの培養基に再懸濁し、抗−ＭＧＧでコ ーティングしたフラスコに分注した。培養上清を４倍に濃縮し、Ｉ　ｇ　Ｅ　− ５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着させた。Ｉ　ｇ　Ｅ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流 出液をさらにＰ　Ｌ　Ａ　２−３ｅｐｈａｒｏｓｅで分画し、その流出および溶 出画分のＧＩＦ活性を測定した。

ｂ　）　Ｉ　ｇＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅからの酸溶出画分をＩ　ｇＥ−ＢＦの有 無について評価した。Ｉ　ｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩ　ｇＥ−ＲＦＣの割合は２ ６３±０．６　（ＳＤ）％であった。

ｃ）１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性を測定した。数字はレンズ豆レクチン５ｅ ｐｈａｒｏｓｅからの流出／溶出画分によるロゼツト形成阻害パーセントを表す 。ｌ　ｇＥ−ＢＦ不存在下でのｌ　ｇＥ−ＲＦＣの割合は、２６０±０．７　（ ＳＤ）％であった。（＋）はＧＩＦの存在を示す。

表４に示すように、７クローンのうち６クローンのＩ　ｇ　Ｅ　−３ｅｐｈａｒ ｏｓｅからの酸溶出画分は検出可能な量のＩｇＥ−ＢＦを含有した。Ｐ　Ｌ　Ａ 　ｔ−３ｅｐｈａｒｏｓｅでＩ　ｇ　Ｅ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出画分 をさらに分画し、この免疫吸着剤からの流出および溶出画分のＧＩＦ活性を測定 した。表４に示す結果は、７クローンのうち５クローンに由来するＧＩＦの大部 分がＰ　Ｌ　Ａ　ｔ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅに結合し、酸性ｐＨでの溶出により 回収されることを示す。これらのクローンが抗原結合ＧＩＦを産生ずるためには ＣＤ３の架橋結合が必要であることを確認するために、これらの５クローンを、 抗−ＣＤ３で処理せずに、抗−ＭＧＧでコーティングしたウェルで培養した。予 想通り、培養上清はＩ　ｇＥ−ＢＦを含有せず、上清中のＧＩＦはＰ　Ｌ　Ａ　 ２−３ｅｐｈａｒｏｓｅに結合しなかった。

本発明は、ハチ毒Ｐ　Ｌ　Ａ　２に対してアレルギー反応を起こす患者のＰＢＭ Ｃに由来するＧＩＦ産生Ｔ細胞集団の発達を可能にし、このＴ細胞からＧＩＦ産 生ハイブリドーマを確立する技術を提供する。典型的なハイブリドーマはＣＤ３ 決定基およびＴＣＲαβを表現し、このことはこれらがＴ細胞ハイブリドーマで あることを意味する。さらに、ハイブリドーマ上のＴｃＲ複合体は機能している と思われる。親Ｔ細胞（Ｃａｒｉｎｉら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈａ ｄｓ、　１２７：　２２１．１９９０　）およびＧＩＦ産生ハイブリドーマ（表 ３．４）の大部分はいずれも、ＣＤ３の架橋結合によってＩ　ｇＥ−ＢＦを産生 じた。また、単クローン性抗体ＷＴ３１および抗−ＭＧＧによってＣｌ３および ＡＣ５クローンにＴｃＲαβが架橋結合した結果、Ｉ　ｇＥ−ＢＦが産生された （結果は示さない）。代表的なＣＤ３’ハイブリドーマをさらに調べた結果、Ｃ ｌ３．ＢＥ１２、、Ａｃ５およびＣＢ７クローンのすべてがＣＤ４およびＣＤ８ をともに表現した。ハイブリドーマ構築に用いられたＢＵＣ細胞はＣＤ４’　Ｃ Ｄ８−であるので（Ｊ、５ｔｏｂｏ博士からの私信）、ハイブリドーマの親Ｔ細 胞がＣＤ４およびＣＤ８をともに表現するかどうかは明かでない。

本実験はＴ細胞ハイブリドーマの一部がその細胞上のＣＤ３の架橋結合によって 抗原（ＰＬＡ２　）結合ＧＩＦを産生ずることを示した。この発見は、代表的な マウスＧＩＦ−産生ハイブリドーマが抗原刺激同系マクロファージによる刺激に よって、または細胞上のＣＤ３の架橋結合によって、抗原結合ＧＩＦを産生ずる という事実と一致しくＩｗａｔａおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、、　１４１：　３２７０．　＋９８８．　！ｗａｔａ　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、１４３：　３９１７．　１９８９）　、二つの種に由来する抗原結合 ＧＩＦ間の類似性を示唆した。マウスの系では、ハイブリドーマから得られた抗 原結合ＧＩＦはインビボ抗体応答を担体（抗原）−特異的に抑制した。ハイブリ ドーマ由来の抗原結合ＧＩＦが抗原結合ポリペプチド鎖と非特異的ＧＩＦからな ること（Ｊ、ａｒｄｉｅｕおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅｇｕｌ ａｔｉｏｎｂｙ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、　 Ｇ、　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他編、Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、５９５．１９８７　）およびその抗原結 合鎖はエフェクター型すプレッサーＴ細胞因子（ＴｓｅＦ）と共通の抗原決定基 １４−１２を共有すること（Ｉｗａｔａら、同上、１９８９）も明らかになった 。異なる実験から、単りローン性抗すポモジュリン抗体１４１−Ｂ９および抗− １−Ｊ抗体の両方が、ＧＩＦのみならず、ＴｓｅＦおよびＴＳＩＦの非抗原結合 鎖（１−Ｊ＋鎖）にも結合することが示されている（Ｊａｒｄｉｅｕら、Ｊ、ｌ ＋ｎｍｕｎｏ１．、１３８：　１４９４、１９８６．５ｔｅｅｌｅら、Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：　２２１３．１９８９）　、以上の知見を総合する と、抗原結合ＧＩＦがＴｓ　ｅＦと同一であることが示唆される。代表的なマウ スＴｓハイブリドーマ７１Ｂ４の親Ｔ細胞は、ＯＶＡ刺激牌細胞を同一抗原で刺 激し、次にＧＩＦの存在下で抗原活性化Ｔ細胞を増殖させることによって得られ た（Ｉｗａｔａおよびｌ５ｈｉｚａｋａ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４１ ：　３２７０．１９８８）　ｏ同じ方策を用いて、本実験ではヒトＴ細胞ハイブ リドーマの親細胞を得た。実際、ヒトハイブリドーマ由来の非特異的ＧＩＦとＰ 　Ｌ　Ａ　＊結合ＧＩＦはいずれも、以前の研究でマウスＴｓＦｓがやはり結合 することが明らかになっている１　４１　Ｂ　９−３ｅｐｈａｒｏｓｅに結合し た（Ｓｔｅｅｌｅら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：　２２１３．１９８ ９）　ｏヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のＰＬＡ２結合ＧＴＦがヒト抗原特異的 ＴｓｅＦに相当する可能性がある。しかしながら、抗原結合ＧＩＦがマウスＴｓ ｉＦと同等である可能性もまだある。発明者の研究室での最近の実験は、ホスホ リパーゼＡ２インヒビターの存在下で細胞を前培養した後、抗原（コンアルブミ ン）で刺激された抗原提示細胞で刺激した場合、典型的なマウスヘルパーＴ細胞 クローンＤ１０．Ｇ４．ｌは抗原結合ＧＩＦを産生ずることができることを示し ている（Ｏｈｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２：　２５７． １９９０）。この抗原結合ＧＩＦは単クローン性抗体１４−３０と結合し、これ は単クローン性抗体１４−１２よりむしろＴｓｉＦに特異的であることも明らか になった（ＦｅｒｇｕＳＯｎおよびＩｖｅｒｓｏｎ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 　１３６：　２８９６．１９８６）　ｏ　Ｇｒｅｅｎら（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ １ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

３：　９５．１９８７）は、ＵＶ照射抗原刺激マクロファージを用いた抗原刺激 によってＤＩＯ，Ｇ４．１クローンが抗原結合ＴｓＦを産生ずること、およびこ の因子が補助分子とともに、エフェクター型抗原特異的Ｔｓの産生を誘導するこ とも報告した。アレルギー患者由来のＰＢＭＣはヘルパーＴ細胞を含有するので 、ヒトハイブリドーマ由来の抗原結合ＧＩＦがＴｓｅＦではな（ＴｓｔＦに相当 する可能性がまだある。

Ｔａｋｅｕｃｈ　ｉら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４１：　３０１０．１９８ ８）は、ＫＬＨで刺激した個体、すなわち大量の同一抗原の注射を繰り返し受け た個体、のＰＢＭＣからＴｓｅクローンを確立した。また、Ｍｏｄｕｌｉｎら（ Ｎａｔｕｒｅ、　３２２：　４５９．１９８６）は、らい腫らい患者の病変から Ｔｓクローンを確立した。しかしながら、本発明以前には、ヒトＴｓ細胞由来の サプレッサー活性を仲介するエフェクター分子（ＴｓＦ）は同定されていない。

ヒトＧＩＦとマウスＧＩＦとの類似性は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のＰＬ Ａ２結合ＧＩＦがヒトサプレッサーＴ細胞に由来するＴｓＦに相当することを示 唆する。抗原結合ＧＩＦを産生ずるＴ細胞ハイブリドーマは、この分子の生化学 的性質を高めるであろう。ＴｓならびにＴｓＦ　（抗原結合ＧＩＦ）がＩｇＧ抗 体応答よりもインビボＩｇＥ抗体応答をより有効に抑制することがマウスでは繰 り返し示されている（Ｉｓｈｉｚａｋａら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１１４： 　１１０．１９７５　）　。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のアレルゲン結合Ｇ ＩＦが実際にＴｓＦに相当するならば、Ｔ細胞因子が親Ｔ細胞のドナーのＩｇＥ 抗体応答を抑制することは、当然予想される。

日本において、スギ花粉は主要なアレルゲンであり、人口のかなりの部分に季節 性のアレルギー性鼻炎および結膜炎を引き起こす。他の抗原に対する本発明の知 見の一般的な適用可能性を調べるために、抗原特異的ＧＩＦ産生Ｔ細胞およびＴ 細胞ハイブリドーマを調製するための方法（上記）をスギアレルゲンに対してア レルギー反応を起こす患者の末梢血液単核細胞に適用した。

スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）に含まれる主要なアレルゲ ンは、ｃｒｙｊ−１と命名された４０ｋＤａの糖タンパク質である（Ｙａｓｕｅ ｄａ　ら、Ｊ、　ＡＩｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　７ １：　７７、　１９８３　）　ｏ本研究のために、多少の改変を加えた上記方法 によってスギ花粉抽出物からアレルゲンを単離した。簡単に述べると、花粉をエ ーテルで脱脂し、０．１２５Ｍ炭酸水素アンモニウムで３回抽出した。

臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムによって抽出物中の炭水化物を除去し た。抽出物中のタンパク質を８０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱させ、その沈澱 を０．　０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，８に溶解した。このＴｒｉ ｓ−ＨＣＩ緩衝液で十分透析した後、タンパク質画分をＤＥＡＥセルロースカラ ム（ＤＥ　−５２，Ｗｈａｔｍａｎ　）にかけ、通り抜は画分を得た。この両分 を濃縮し、０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５，０に対して透析し、この緩衝液で平 衡化したＣＭセルロースカラム（ＣＭ−５２，Ｗｈａｔｍａｎ　）にかけた。

カラムをこの緩衝液で洗浄し、カラムに残留したタンパク質を０．３Ｍ塩化ナト リウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出した。５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ ＨＲカラムでのゲル濾過によってこの溶出液中のタンパク質をさらに分画し、ｃ ｒｙｊ−１を含有する主要タンパク質画分を得た。この両分の主なタンパク質は 、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって４２ｋＤａと測定され、こ のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はｃｒｙｊ−１と同一であった。このタンパ ク質を、１．５ｍｇ／ｍｌゲルの割合で、Ａｆｆｉｇｅｌ　１０に結合させた。

合成ホスホリパーゼＡ２阻害剤、２−（ｐ−アミルシンナモイル）−アミノ−４ −クロロ安息香酸（ＯＮＯ−Ｒ３−０８２゜ＯＮＯＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）を、組換えヒトリポコルチン■の代わりに用いた。以前の実験から 、０ＮＯ−Ｒ３−８２がホスホリパーゼＡ２の特異的阻害剤であり、マウス牌細 胞培養においてＧＩＦ産生細胞の発生を促進することが明らかになっていた（Ｏ ｈｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１：　４２ ５．１９８９）　。オボアルブミン感作マウスの肺細胞をオボアルブミンで刺激 し、２μＭの０ＮＯ−Ｒ３−０８２または３μｇ／ｍｌの組換えヒトリポコルチ ン■のいずれかの存在下で、ＩＬ−２によって抗原活性化Ｔ細胞を増殖させたと き、ＧＩＦを産生ずる抗原特異的Ｔ細胞が生じた。抗原刺激Ｔ細胞およびＴ細胞 ハイブリドーマの構築は、上記とほぼ同様に行なわれたが、ただし抗原として精 製ｃｒｙｊ−１を用い、ホスホリパーゼＡ２阻害剤として０ＮＯ−Ｒ３−０８２ を用いた。このようにして、スギ花粉に対してアレルギー反応を起こす患者の末 梢血液から単核細胞を得て、１０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含有するＲＰＭ １１６４０培地に懸濁した。Ｉ　Ｏμｇ／ｍ　ｌ　ｃｒｙｊ−１の存在下で、単 核細胞の懸濁液（３ｘｌＯ’細胞／ｍ１）を３日間培養した。非付着細胞を回収 し、ｌＯ％ＦＣ３を含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁しく３ｘｌＯ’細胞／ｍｌ） 、６０ユニット／ｍｌヒトＩＬ−２および２μＭの０ＮＯ−Ｒ８−０８２の存在 下で４日間培養した。次に、このようにして増殖させた細胞を回収し、ＢＵＣ細 胞と融合させてハイブリドーマを構築した。

ハイブリドーマを単りローン性抗−ＣＤ３抗体５ＰＢ−Ｔ３ｂ　（Ｓｐｉｔｓら 、Ｈｉｂｒｉｄｏｍａ　２：　４２３．１９８３）で処理し、細胞上のＣＤ３の 存在を免疫蛍光法によって調べた。ＣＤａ＋のハイブリドーマだけを限界希釈に よってサブクローニングした。

１０％ＦＣ３を含有する完全ＤＭＥ培地でＣＤａ＋ハイブリドーマクローンを維 持し、ｌ　２Ｈ５細胞を使用することによって各クローンの培養上清をＧＩＦの 存在について評価した。−患者に由来するハイブリドーマについて得られた結果 を表５に示す。

３ハイブリドーマ；３１Ｅ９．３１８７．および３２Ｂ４の培養上清中にＧＩＦ 活性を検出した。別の２ハイブリドーマ３１Ｈ６および３１Ｈ３の上清は、弱い ＧＩＦ活性を有すると思われる。

こうして得られたＧＴＦ産生ハイブリドーマを抗−ＣＤ３抗体で処理した後、抗 −マウス免疫グロブリンで処理し、その細胞を２４時間培養した。次に、培養上 清をｃｒｙｊ−１結合免疫吸着剤で分画した。この免疫吸着剤からの通り抜は画 分および酸溶出画分に存在するＧＩＦ活性を１２Ｈ５細胞を用いて評価した。そ の結果は表５に含まれるが、３１Ｅ９細胞由来のＧＩＦはｃｒｙｊ−１−Ａｆｆ ｉｇｅｌに結合し、酸性ｐＨでの溶出で回収されるが、３１Ｂ７細胞由来のＧＩ Ｆは抗原結合免疫吸着剤に結合しなかったことを示す。以上の結果は、抗−ＣＤ ３て刺激することによって３１Ｅ９細胞がｃｒｙｊ−１に親和性を有するＧＩＦ を産生ずることを示す。

表５ ハ（ブリドーマ　％０ゼブト形成阻害’　ｃｒ　ｊ−１ｓｅ　ｈａｒｏｓｅ’　 中のＧＩＦ活性’ｔｏ−ン（流出／溶出）　非結合　机倉無　０／２３　０／２ ９ ３１　Ｈ６２０／１３（±）　５／２０　（−）　１２／１０（±）３　１ＡＩ 　Ｉ　Ｏ／２５　（−）　ＮＯ３１Ｅ　９　２８１５　（＋）　Ｏ／２２　（− ）　２０１０　（＋）３１　Ｈ３２３／１２（±）Ｏ／３４　（−）　３８／１ ６（±）３１　Ｂ　７　３２１５　（＋）　２０１５　（＋）　４／２４　（− ）３１Ｆ７　０／２６（−）　ＮＯ ３２Ｂ　４　２２１０　（＋）　２２／１４（±）　３８／２２（±）ａ）この 表中のハイブリドーマは２回の異なる実験から誘導された。

ｂ）刺激を行なわなかったハイブリドーマの培養上清をＧＩＦの存在でスクリー ニングした。１２Ｈ５細胞の一定量を各ハイブリドーマの培養上溝とともにマウ スＩｇＥ存在下でインキュベートした。１２Ｈ５細胞の培養上清をＣＦ３０Ａで 濾過してＩｇＥを除去し、濾液をレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画し た。流出および溶出画分におけるＩｇＥ−ＢＦをロゼツト形成阻害によって評価 した。縦列の数字はレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出／溶出画分 によるロゼツト形成阻害パーセントを表す。（＋）　（−）の表示は、それぞれ ＧＩＦの存在および不存在を示す。

Ｃ）代表的なハイブリトーマを抗−ＣＤ３抗体で処理し、培養上清をＣｒＹｊ− １結合Ａｆｆｉｇｅｌで分画した。通り抜け（非結合）画分および酸溶出（結合 ）画分中のＧＩＦ活性の存在を１２Ｈ５細胞を用いて測定した。ｌ　２Ｈ５細胞 培養濾液をレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。数字はレンズ豆レ クチン５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出／溶出画分によるロゼツト形成阻害パーセ ントを表す。３１Ｅ９細胞由来のＧＩＦは、ｃｒｙｊ−１−Ａｆｆ　ｉｇｅｌに 結合し、酸性ｐＨでの溶出によって回収されるか、３１Ｂ７細胞由来のＧＩＦは ｃｒｙｊ−１−Ａｆｆｉｇｅｌカラムに保持されなかった。

実施例５ ヒトＧＩＦに特異的な単クローン性抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統の調 製および性質検討 Ａ、ハイブリドーマの構築およびスクリーニング抗−リポモジュリン（１４１− Ｂ　９　）　−８ｅｐｈａｒｏｓｅを用いて、Ｔ細胞ハイブリトーマＣＬ３の培 養上清中のヒトＧＩＦを精製した。アフィニティー精製ＧＩＦを完全フロインド アジュバントに混合し、２週間間隔で３回この抗原を腹腔内に注入して、ＢＡＬ Ｂ／ｃマウスを免疫した。最終免疫から２週間後、免疫したマウスの牌細胞を採 り、あらかじめ６２５Ｒγ線を照射した同系のＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに１ ｘｌＯ’ｌｐｌ細胞を移入した。移入を受けたマウスは細胞移入後ただちに、お よび２週間後に、不完全フロインドアジュバントに包含される精製ＧＩＦで免疫 された。追加免疫から１週間後、その牌細胞をＨＰＲＴ−欠失Ｂ細胞系統５Ｐ２ １０−１４ＡＧと融合させた。支持細胞層としてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマクロ ファージとともにＨＡＴ培地中でこの細胞を培養した。この培養で得られた１０ ２個のハイブリドーマクローンはマウス免疫グロブリンの産生によって選択され 、Ｉｇ−産生ハイブリドーマはＥＬＩＳＡアッセイおよび続いてｌ　２Ｈ５細胞 を用いたバイオアッセイにより抗−ＧＩＦ抗体産生によって選択された。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおいて、Ｉｎ＋ｍｕｌｏｎ　Ｉプレート（Ｄｙｎａｔ ｅｃｈ）をアフィニティー精製ＧＩＦでコーティングした。対照ウェルにはＤＰ ＢＳを容れた。ウェルを２％ＢＳＡでブロックした後、培養上清を各ウェルに分 注味マウスＩｇのウェルへの結合を、アルカリホスファターゼ結合抗−マウスＩ ｇ抗体を用いて判定した。表６に示すように、１１ハイブリドーマクローンの培 養上清が有意なＥＬＩＳＡシグナルを与えた。

（来貢以下余白） 表６ 抗−ＧＩＦ−産生ハイブリドーマ”の選択＋＋４１’ｌＦ−マ　ＥＬＩＳＡ　Ｇ 　Ｉ　Ｆ　活性Ｃ１ｇ　クローン　４’Ｊ９４１−　シグナル／　対照１　流出 ／溶出熱　０１０　２９／１　（＋） ３　３　４　Ｆ　ＩｇＭ　Ｏ，１９５１０，００３３３／ｌ　（＋）３　５　５ 　ＣＩｇＭ　０．３８８１０．０１２　２８１０　（＋）３　３　８　ＨＩｇＭ 　Ｏ，３１６１０，０５００／２９（−）３　１　８　ＨＩｇＭ　Ｏ，１４９１ ０，０４６０／３１（−）３　８　８　Ｆ　、　Ｉｇｃ２．　０．８９２１０． １００　０／２８（−）４　７　６　Ｂ　ＩｇＭ　Ｏ，１００１０，０２００／ ２０（−）４　８　９　Ｇ　ＩｇＭ　０．１７４１０．００　７／１５　（？） ４　８　１　Ｆ　ＩｇＭ　Ｏ，４６０１０，０９２１８１０（＋）３　３　５　 ＣＩｇＭ　Ｏ，２０３１０，０７３０／２７（−）４　１　９　Ａ　ＩｇＭ　０ ．５４２１０．１５　２７／ｌ　（＋）３　１　２　Ｆ　ＩｇＭ　Ｏ，５３３１ ０，０２９１４／８　（±）培地対照　０１０　０／３１ ａ）ＥＬＩＳＡアッセイで陽性であった培養上清を、ＣＬ３クローン由来のＧＩ Ｆと結合する能力について評価した。

ｂ）ＢＳＡコーティングウェルへのハイブリドーマ培養上清中のマウスＴｇの非 特異的結合と比較した、ＧＩＦコーティングウェルへの同上清中のＩｇの結合。

４１０ｍμでの光学濃度。

Ｃ）ハイブリドーマの培養上清と精製ＧＩＦの混合物をＹＭ１００メンプランで 濾過し、濾液のＧＩＦ活性を調べた。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥとともに、濾 液の存在下で培養した。細胞によって産生されたＩｇＥ−ＢＦをレンズ豆レクチ ン５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画し、レクチン結合５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出お よび溶出画分におけるＩ　ｇＥ−ＢＦをロゼツト形成阻害によって評価した。数 字は流出／溶出画分によるロゼツト形成阻害パーセントを表す。ＧＩＦは細胞に よって産生されるＩ　ｇＥ−ＢＧの性質を変換する（上欄対下欄）。（＋）はＧ ＩＦの存在を表す。

次に、ｌ　２Ｈ５細胞を用いて、１１ハイブリドーマクローンの培養上清中の抗 ＧＩＦの存在を判定した（Ｉｗａｔａら、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．、１４０：　 ２５３４．１９８８）　。５０％飽和硫酸アンモニウム沈澱によって、各クロー ンの培養上清のグロブリン画分を得た。リン酸緩衝塩類液に対して透析した後、 この両分をもとの培養上清の１１５容量に調整した。１４１　Ｂ　９５ｅｐｈａ ｒｏｓｅを用いて、一定量のアフィニティー精製ＧＩＦをＣＬ３クローンから調 製した。この試料の一部を等量の各クローン由来のグロブリン画分と混合腰その 混合物を４°Ｃで一部インキユベートした。次に、この混合物をＹＭ１００メン プランで濾過し濾液中のＧＩＦの存在を調べた。

次に、１２Ｈ５細胞懸濁液の一定量を等量の濾液と混合し、その細胞懸濁液をＩ Ｏμｇ／ｍｌマウスＩｇＥ存在下で２４時間培養した。培養上清をＣＦ３０Ａメ ンプランで濾過してＩｇＥを除去し、濾液中のＩｇＥ結合因子をレンズ豆レクチ ン５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。実験の結果は、表６に包含されるが、３３８ Ｈ，３１８Ｈ，３８８Ｆ、、４７６Ｂおよび３３５Ｃクローンの培養上清によっ てＧ’　Ｉ　Ｆが除去されることを示しており、このことはこれらのハイブリド ーマが抗−ＧＩＦを産生ずることを示す。

Ｂ、単りローン性抗−ＧＩＦによるヒトＧＩＦの精製ＧＩＦに対する単クローン 性抗体を産生ずる６ハイブリド−マクローンの中で、３８８Ｆ＋だけがＩｇＧ抗 体を産生じた。このハイブリドーマをサブクローニングし、５％ＦＣ３を添加し た高グルコースダルベツコ培地で培養した。培養上清を限外濾過て濃縮し、Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いて上清中のＩｇＧを回収した。次に この単クローン性抗体をＴｒｅｓｙｌ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅに結合させて免 疫吸着剤を調製した。この単クローン性抗体が抗−リポモンユリン（１４１Ｂ　 ９　）　５ｅｐｈａｒｏｓｅに結合するのと同じ分子に結合することができるか どうかを判定するために、培養上清中のＧＩＦを１４１　Ｂ　９５ｅｐｈａｒｏ ｓｅに吸着させ、酸性ｐＨでの溶出によって回収した。次に、このアフィニティ ー精製ＧＩＦ標品を抗−ＧＩＦ　（３８ｓＦ＋　）結合５ｅｐｈａｒｏｓｅで分 画した。流出画分を得た後、免疫吸着剤カラムを１０カラム容量のダルベツコリ ン酸緩衝塩類液（ＤＰＢＳ）で洗浄し、ついで、グリシンＭＣＩ緩衝液、ｐＨ３ ，０で溶出した。流出および溶出画分を連続的に希釈して、１２Ｈ５細胞を用い てＧＩＦ活性を測定した。表７に示す結果は、１４１　Ｂ　９−３ｅｐｈａｒｏ ｓｅからの酸溶出画分のＧＩＦが抗−Ｇ　Ｉ　Ｆ　（３８８Ｆ、　）−３ｅｐｈ ａｒｏｓｅと結合し、酸性ｐＨての溶出によって再び回収されることを示す。こ の結果は、抗−リポモジュリンおよび抗−ＧＩＦの両方がヒトＧＩＦに結合する ことを示す。

（来貢以下余白） 表ユ 抗−Ｇ　Ｉ　Ｆ　（３８８Ｆ　、）結合５ｅｐｈａｒｏｓｅ”での部分精製ヒト ＧＩＦの分画 ３８８Ｆ　＋−５ｅｐｈａｒＯ３ｅ　Ｇ　Ｉ　Ｆ活性５からの画分　希釈　流出 ／溶出 流　出　１・ｌｏ　Ｏ／３５（−） １・２０　０／２９（−） 溶　出　１：２０　３９１０（＋　） １：４０　２６１０（＋　） 分画せず　１：４０　２７１０（＋　）培地対照　Ｏ／２７ ａ）ＣＬ３クローン培養上清中のＧＩＦを抗−リボモジュリン５ｅｐｈａｒｏｓ ｅを用いて精製した。アフィニティー精製したＧＩＦ　（１５ｍｌ）を０．７５ ｍ１の３８８Ｆ、−結合５ｅｐｈａｒｏｓｅで分画した。流出画分を回収した後 、カラムをｌＯカラム容量のＤＰＢＳで洗浄し、次に、３カラム容量のグリシン ＨＣ１，ｐＨ３，０で溶出した。

ｂ）表４に記載されたのと同様の方法で１２Ｈ５細胞を用（ＡてＧＩＦ活性を評 価した。縦列の数字はレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓｅからの流出／溶出画 分によるロゼツト形成阻害／く−セントを表す。

（＋）はＧＩＦの存在を示す。

抗−ヒ１−ＧＩＦがマウスＧＩＦと結合可能かどうかを判定するために、Ｔｓハ イブリドーマ、２３１Ｆ＋細胞由来のマウスＧＩＦを１４１　Ｂ　９−３ｅｐｈ ａｒｏｓｅを用いて精製し、精製されたマウスＧＩＦの一部を１４１　Ｂ　９− ３ｅｐｈａｒｏｓｅまたは３８８　Ｆ　１−３ｅｐｈａｒｏｓｅのいずれかによ って分画した。流出画分を得た後、免疫吸着剤を３カラム容量のＤＰＢＳで洗浄 し、次に３カラム容量のグリシンＭＣＩ緩衝液、ｐＨ３，０で溶出した。予想さ れた通り、すべてのＧＩＦ活性が１４１　Ｂ　９５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着され 、酸性ｐＨでの溶出で回収された。流出画分および洗浄画分のいずれにも、ＧＩ Ｆ活性は存在しなかった。同じＧＩＦ標品を３８８　Ｆ　ｌ５ｅｐｈａｒｏｓｅ で分画した場合、弱いＧＩＦ活性が流出画分に検出された。

活性の大部分はＤＰＢＳによる洗浄で検出されたが、酸溶出画分は検出可能なＧ ＩＦ活性を含有しなかった。マウスＧＩＦは非常に低い親和性て抗−ヒトＧＩＦ と結合し、中性ｐＨでの洗浄によって免疫吸着剤から解離すると思われる。以上 の結果は、単クローン性抗体３８８Ｆ、がヒ１−ＧＩＦに特異的であることを示 す。

Ｃ，イオン交換クロマトグラフィーによるヒトＧＩＦの精製ＡＣ５細胞を限界希 釈によってサブクローニングし、ＣＤ３”クローンを得た。次に、この細胞を無 血清ＡＢＣ培地に順化させた。フローサイトメトリーによって、この培地で培養 したサブクローン上のＣＤ３の表現を確認した。ＣＤ３”サブクローンの培養上 清をＩ　Ｏ−３０倍に濃縮し、その標品を連続的に希釈してＧＩＦ活性を測定し た。このような結果に基づいて、サブクローン（ＡＣ５−２３）を選択したが、 これはこのサブクローンの１０倍濃縮上清の１＝３希釈物が、１２Ｈ５細胞をグ リコジル化１ｇＥ−ＢＦ産生から非グリコジル化１　ｇＥ−ＢＦ産生へと変換す ることができたためである。

ヒトＧＩＦをイオン交換クロマトグラフィーで精製することができるかどうかを 判定するために研究が行なわれた。ＡＢＣ培地中のＡＣ５サブクローンの培養上 清を２５倍に濃縮した。濃縮された培養上清のうち１０ｍ１を、ＴｒｉｓでｐＨ ８，０に調整し、蒸留水で８倍に希釈し、次にＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−３ｅｐｈａｒｏ ｓｅカラムにかけた。

濃度増加するＮａＣｌを含有する１　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液でカラムに結合 したタンパク質を溶出した（実施例１参照）。各画分を１０ｍ１に濃縮しＧＩＦ 活性を測定した。

（来貢以下余白） 表１ Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−８ｅ　ｈａｒｏｓｅ画分におけるＧＩＦ活性の分布Ｔｒｉｓ 　ＨＣＩ＋　タンパク質含量 ！ｉｉ　’Ａ　ＮａＣＩ　（ｍＭ）　’　」Ｌ「Ｌ−−Ｇ　Ｉ　Ｆ活性１１　２ ０　６５．５　２１１０　（＋）２　５０　３５．５　２０／６　（＋）３　７ ５　４２、５　７／２０（−） ４　１００　３８、５　３／１９（−）５　１５０　４１、５　０／２１（−） ６　２００　４２、　ＯＯ／２０（−）培地対照　０／２２（−） ａ）ＡＣ５細胞の濃縮された培養上清を蒸留水で８倍に希釈して、Ｄ　Ｅ　Ａ　 Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラムにがけた。画分ｌは２０ｍＭＮａＣ１含有１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ８，０による洗浄と合わせた、通り抜は画分を表す 。濃度増加するＮａＣ１を含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで、カラムを段階 的に溶出した。

ｂ）各両分をａ縮した後、全タンパク質を回収した。２００ｍＭＮｃ）１２Ｈ５ 細胞を用いてＧＩＦ活性を検出した。数字はレンズ豆レクチン５ｅｐｈａｒｏｓ ｅからの流出／溶出画分によるロゼツト形成阻害パーセントを表す。ＩｇＥ−Ｂ Ｆ不存在下でのＲＦＣの割合は、２２．６±０．７　（ＳＤ）％であった。（＋ ）　（−）の表示は、ＧＩＦの存在および不存在を示す。

表８に示すように、通り抜は画分および５０ｍＭＮａＣ１溶出画分にＧＩＦ活性 が検出されたが、他の画分には検出されなかった。

最初の二つの画分を連続的に希釈して力価検定することによって、通り抜は画分 が５０ｍＭ画分より高いＧＩＦ活性を有することが明らかになった。

個々の培養上清て繰り返し実験することによって、ＡＣ５細胞の培養上清を１０ ０倍に濃縮し、蒸留水で３倍に希釈した後、カラムを通過させた場合には、培養 上清中のＧＩＦの大部分をＤＥ　Ａ　Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラムから回収す ることができることを確認した。通り抜は画分および５０ｍＭＮａＣ］含有１０ 　ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液による洗浄液をあわせ、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−３ｅｐｈａｒ ｏｓｅにのせた元の試料の容量にまで濃縮した。濃縮された培養上清および通り 抜け（５０ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＩ　）画分を連続的に希釈してＧＩＦ活性を検定 した結果、両方の試料とも１．３０希釈物が、１２Ｈ５細胞をグリコノル化１　 ｇＥ−ＢＰ産生から非グリコジル化１ｇＥ−ＢＦ産生へと変換することができる ことが示された。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅを通すことによって、 培養上清中のタンパク質の７５−８０％を除去できることも明らかになった。

ＧＩＦの分子量を推定するために、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅからの 濃縮された通り抜は画分０．５ｍｌを５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムにかけ、１ ｍ１／分の流速でタンパク質を溶出した。この実験に於て、５ｍｌの両分を集め 、各画分のＧＩＦ活性を１２Ｈ５細胞を用いて測定した。ＧＩＦ活性は画分９で 検出されたが、これは７０から７５分の間に回収された。画分６および８も弱い 活性を有するので、画分６．８．９を連続的に希釈してそのＧＩＦ活性を測定し た。画分９の１＋１０希釈でＧＩＦが検出されたが、他の画分のｌ：２希釈では 検出されなかった。これらの結果は、ヒトＧＩＦの主要な分子種の分子量が、１ １から１８ＫＤａの範囲にあることを示唆した。ＧＩＦ分子の大きさをもっとよ く推定するために、１ｍｌまたは２．５ｍｌの両分を集めた以外は同じ方法で５ ｕｐｅｒｏｓｅ〜１２でのゲル濾過を繰り返し行なった。３回の異なる実験から 、ＧＩＦの大部分が６８から７２分の間に回収されることが示された。ゲル濾過 による推定によれば、ＧＩＦの分子量は１２−１８ＫＤａであると思われる。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥによってＧＩＦを同定する研究も行なった。

ＡＢＣ培地でのハイブリドーマ培養上清２リツトルを１００倍に濃縮し、Ｄ　Ｅ 　Ａ　Ｅ−８ｅｐｈａｒｏｓｅカラムで分画した。上記の実験に基ついて、濃縮 した上清を脱イオン水で３倍に濃縮し、ＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを通した 。通り抜は画分を濃縮し、ヒトＩｇＧ結合５ｅｐｈａｒｏｓｅに予め吸着させ、 その画分中の（、ＩＦを３８８Ｆ１−結合Ａｆｆｉｇｅｌてのアフィニティーク ロマトグラフィーによって精製した（実施例１参照）。一部の実験では、免疫吸 着剤からの酸溶出画分をｐＨ８，０に調整し、３８８Ｆ１−結合Ａｆｆｉｇｅｌ でのアフィニティー精製を繰り返し行なった。還元および非還元条件下のＳＤＳ 　ＰＡＧＥによってアフィニティー精製（、ＩＦ標品の分析を行なった。アフィ ニティー精製試料の主要バンドは、還元条件下で＋４ＫＤａの分子量を有し、非 還元条件下では１５ＫＤａであった。さらに、６７ＫＤａのバンドがたびたび観 察された。アフィニティー精製標品の一部をＤＰＢＳに対して透析し、その標品 中のＧＩＦ活性を検定した。透析および凍結乾燥に於てＧＩＦの回収率を１００ ％と仮定すると、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた試料は１：２５０のＧＩＦ力価を有 するべきである。

１４ＫＤａタンパク質とＧＩＦとの関係を判断するために実験を行なった。ＡＣ ５クローンの培養上清２リツトル中のＧＩＦをＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−３ｅｐｈａｒｏ ｓｅクロマトグラフイーと、それに続く３８８Ｆ　ｌ−Ａｆｆｉｇｅｌでのアフ ィニティー精製によって、精製した。免疫吸着剤からの酸溶出液をｐＨ８，０に 調整し、限外濾過によって１ｍｌに濃縮し、５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラムで分 画した。２．５ｍｌずつの溶出画分をｌ　２Ｈ５細胞を用いて活性測定した。こ の実験に於て、ＧＩＦ活性の大部分が、６７．５から７０分の間に溶出された画 分に検出された。その両分中のＧＩＦの存在をビオチン結合ｍＡｂ１４１−Ｂ９ を用いたＥＬＩＳＡによって確認した。

ＥＬＩ　ＳＡシグナルは弱かったが、ＧＩＦ含有画分のみがＥＬＩＳＡシグナル を与えた。ＧＩＦ含有画分の１ｍｌを凍結乾燥しＳＤＳ　ＰＡＧＥで分析した。

その結果は、ＧＩＦ含有画分中に１４ＫＤａペプチドが存在することを確認した 。

材料の寄託 以下の細胞系統を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ、　１３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　ＭＤ、　ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）に寄託した：細胞系統　ＡＴＣＣ受託番号 　寄託年月日３８８Ｆ、　ＨＢ１０４７２　１９９０年５月３１日ＡＣ５ＨＢ１ ０４７３　１９９０年５月３１日３１Ｅ９　）（Ｂ　Ｘ　１９９２年６月２日（ まだ利用できない） これらの寄託は、特許手続きの目的のために微生物の寄託の国際承認に関するブ ダペスト条約、およびそれらに基づく規則（ブダペスト条約）の規定にしたがっ て行なわれた。これは、寄託臼から３０年間の生育可能な培養の維持を保証する 。ＡＴＣＣによって、その生物はブダペスト条約の条件のもとて利用可能となる が、この条約は、関連する米国特許の発行に際して、またはあらゆる米国または 外国の特許出願の公衆への開示の際に、培養子孫の永続的かつ無制限の利用可能 性を社会に対して保証し、米国特許法第１２２条およびそれにしたがう長官規則 にしたがって資格を与えられた米国特許商標局長官によって決定されたものに対 して、その子孫の利用可能性を保証する（特に８８６００６３８に関する３７Ｃ ＦＲａ１．１４を包含する）。

本出願の譲受人は、その培養寄託物が適当な条件下で培養されたときに死滅また は消失または破壊された場合には、通告に基ついて、ただちに同一培養物の生育 可能な検体と交換することに同意した。寄託された系統の利用可能性は、あらゆ る政府の特許法に基づく権限のもとで付与される権利に違反して本発明を実施す る許可と解釈されるべきでない。

前述の明細書は、当業者に本発明を実施できるようにさせるために十分であると 考えられる。寄託された態様は本発明の一態様の単なる実例として意図され、機 能的に同等であるあらゆる細胞系統が本発明の範囲に含まれるので、本発明は寄 託された細胞系統によって範囲を限定されない。材料の寄託は、本文に含まれる 記述が最良の方法を含めて本発明のあらゆる態様の実施を可能にするには不十分 であることを認めるものではないし、また寄託物の対応する特定の実例に請求の 範囲を限定すると解釈されるべきでない。実際、本文に示し、記述したほかに、 本発明の様々な変更が前述の記載から当業者に明白となるであろうが、そうした 変更は添付の請求の範囲内にある。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｕ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１５１０６　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１ ０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｑ　８３１０ −２Ｊ３３１５７７　Ｂ　８３１０−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＳ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ほぼ純粋なヒト抗原特異的グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）。 ２．抗原がアレルゲンである、請求の範囲第１項記載のＧＩＦ。 ３．抗原が自己免疫抗原である、請求の範囲第１項記載のＧＩＦ。 ４．アレルゲンが毒である、請求の範囲第２項記載のＧＩＦ。 ５．毒がミツバチ毒である、請求の範囲第４項記載のＧＩＦ。 ６．ミツバチ毒アレルゲンがＰＬＡ２である、請求の範囲第５項記載のＧＩＦ。 ７．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３を有する細胞系統ＡＣ５によって産生され たヒト抗原特異的ＧＩＦの抗原結合特異性を有する、請求の範囲第６項記載のＧ ＩＦ。 ８．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３を有する細胞系統ＡＣ５によって産生され た、請求の範囲第６項記載のＧＩＦ。 ９．アレルゲンが花粉である、請求の範囲第２項記載のＧＩＦ。 １０．花粉が樹木の花粉である、請求の範囲第９項記載のＧＩＦ。 １１．樹木の花粉がスギ花粉である、請求の範囲第１０項記載のＧＩＦ。 １２．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞系統３１Ｅ９によって産生されたヒ ト抗原特異的ＧＩＦの抗原結合特異性を有する、請求の範囲第１１項記載のＧＩ Ｆ。 １３．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞系統３１Ｅ９によって産生された、 請求の範囲第１１項記載のＧＩＦ１４．ヒト抗原特異的グリコシル化阻害因子（ ＧＩＦ）を産生する能力を有する連続的継代ハイブリドーマ細胞系統。 １５．抗原がアレルゲンである、請求の範囲第１４項記載のハイブリドーマ。 １６．抗原が自己免疫抗原である、請求の範囲第１４項記載のハイブリドーマ。 １７．アレルゲンが毒である、請求の範囲第１５項記載のハイブリドーマ。 １８．毒がミツバチ毒である、請求の範囲第１７項記載のハイブリドーマ。 １９．ミツバチ毒アレルゲンがＰＬＡ２である、請求の範囲第１８項記載のハイ ブリドーマ。 ２０．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３を有する細胞系統ＡＣ５である、請求の 範囲第１９項記載のハイブリドーマ。 ２１．アレルゲンが花粉である、請求の範囲第１５項記載のハイブリドーマ。 ２２．花粉が樹木の花粉である、請求の範囲第２１項記載のハイブリドーマ。 ２３．樹木の花粉がスギ花粉である、請求の範囲第２２項記載のハイブリドーマ 。 ２４．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞系統３１Ｅ９である、請求の範囲第 ２３項記載のハイブリドーマ。 ２５．（ａ）抗原に対して活性化されたヒト抗原感作Ｔ細胞を得ること、および （ｂ）融合によって、活性化されたＴ細胞を融合相手の細胞系統と結合させて、 ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する能力を有するハイブリドーマを作成すること、 を含んでなる、ヒト抗原特異的グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）を産生する能力 を有する連続的継代ハイブリドーマ細胞系統を作成する方法。 ２６．（ｉ）ヒト抗原感作Ｔ細胞を含有する試料を得ること、（ｉｉ）Ｔ細胞を 感作した抗原の存在下でＴ細胞を培養することによってＴ細胞を活性化すること 、および（ｉｉｉ）活性化されたＴ細胞をＩＬ−２およびホスホリパーゼＡ２イ ンヒビターの存在下で培養すること によって、抗原に対して活性化された段階（ａ）のヒト抗原感作Ｔ細胞が産生さ れる、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．ホスホリパーゼＡ２インヒビターがリポコルチンである、請求の範囲第２ ６項記載の方法。 ２８．Ｔ細胞を感作した抗原が化学修飾された、請求の範囲第２６項記載の方法 。 ２９．抗原が塩酸グアニジンで化学修飾された、請求の範囲第２８項記載の方法 。 ３０．抗原が臭化シアンで化学修飾された、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３１．ヒト抗原感作Ｔ細胞が末梢血液単核細胞画分に由来する、請求の範囲第２ ５項記載の方法。 ３２．融合相手の細胞系統がヒトリンパ芽球様Ｔ細胞系統である、請求の範囲第 ２５項記載の方法。 ３３．リンパ芽球様細胞系統がＢＵＣである、請求の範囲第３２項記載の方法。 ３４．（ａ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生するように、ヒト抗原特異的ＧＩＦを 産生する能力を有する連続的継代ハイブリドーマ細胞系統を培養すること、およ び （ｂ）培養物からほぼ純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離すること、 を含んでなる、ほぼ純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを調製する方法。 ３５．連続的継代ハイブリドーマ細胞系統が請求の範囲第２５項記載の方法によ って作成される、請求の範囲第３４項記載の方法。 ３６．培養中に、ハイブリドーマ細胞系統を抗原感作同系マクロファージ、また はＣＤ３またはＴ細胞レセプターに対する抗体に暴露する、請求の範囲第３４項 記載の方法。 ３７．抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原を利用したアフィニティー精製によって 、ヒト抗原特異的ＧＩＦをほぼ精製する、請求の範囲第３４項記載の方法。 ３８．ほぼ純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階が、（ｉ）ヒトＧＩＦと 特異的に反応する単クローン性抗体とハイブリドーマ細胞系統培養物を反応させ ること、（ｉｉ）単クローン性抗体からヒトＧＩＦを溶離すること、（ｉｉｉ） 溶離されたＧＩＦをヒト抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原と反応させること （ｉｖ）抗原からヒト抗原特異的ＧＩＦを溶離すること、および（ｖ）ヒト抗原 特異的ＧＩＦを回収することを包含する、請求の範囲第３４項記載の方法。 ３９．ほぼ純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階が、（ｉ）ハイブリドー マ細胞系統培養物をヒト抗原特異的ＧｌＦが結合する抗原と反応させること （ｉｉ）抗原からヒトＧＩＦを溶離すること、（ｉｉｉ）溶離したＧＩＦをヒト ＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体と反応させること、 （ｉｖ）単クローン性抗体からヒト抗原特異的ＧＩＦを溶離すること、および （ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収することを包含する、請求の範囲第３４項記 載の方法。 ４０．ほぼ精製されたヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階が、（ｉ）ハイブリ ドーマ細胞系統培養物を陰イオン交換樹脂と接触させること、 （ｉｉ）交換体からヒトＧＩＦを溶離すること、（ｉｉｉ）溶離されたＧＩＦを ヒトＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体またはヒト抗原特異的ＧＩＦが 結合する抗原、またはその両者と反応させること （ｉｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを溶離すること、および（ｖ）ヒト抗原特異的Ｇ ＩＦを回収することを包含する、請求の範囲第３４項記載の方法。 ４１．樹脂に結合した陰イオン交換部分がＤＥＡＥである、請求の範囲第４０項 記載の方法。 ４２．約１０ｍＭから約１００ｍＭまでの塩濃度を利用してヒトＧＩＦを溶離す る、請求の範囲第４０項記載の方法。 ４３．塩がＮａＣｌである、請求の範囲第４０項記載の方法。 ４４．ハイブリドーマ細胞系統培養物を約２５倍から約１０００倍に濃縮し、次 に約３倍から約１０倍に希釈した後、陰イオン交換樹脂と接触させる、請求の範 囲第４０項記載の方法。 ４５．単クローン性抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７２を有する細胞系統 ３８８Ｆ１によって産生される単クローン性抗体の特異性を有する、請求の範囲 第３８または３９項のいずれかに記載の方法。 ４６．単クローン性抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７２を有する細胞系統３ ８８Ｆ１によって産生される、請求の範囲第３８または３９項のいずれかに記載 の方法。 ４７．免疫抑制に有効な量のヒトＧＩＦをヒトに投与することを含んでなる、こ こにおいてヒトＧＩＦが抗原に特異的に結合することができる、抗原に対するヒ ト免疫応答を抑制する方法。 ４８．抗原がアレルゲンである、請求の範囲第４７項記載の方法。 ４９．抗原が自己免疫抗原である、請求の範囲第４７項記載の方法。 ５０．アレルゲンが毒である、請求の範囲第４８項記載の方法。 ５１．毒がミツバチ毒である、請求の範囲第５０項記載の方法。 ５２．ミツバチ毒アレルゲンがＰＬＡ２である、請求の範囲第５１項記載の方法 。 ５３．ヒトＧＩＦがＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３を有する細胞系統ＡＣ５に よって産生されたヒト抗原特異的ＧＩＦの抗原結合特異性を有する、請求の範囲 第５２項記載の方法。 ５４．ヒトＧＩＦがＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３を有する細胞系統ＡＣ５に よって産生されたヒト抗原特異的ＧＩＦである、請求の範囲第５２項記載の方法 。 ５５．アレルゲンが花粉である、請求の範囲第４８項記載の方法。 ５６．花粉が樹木の花粉である、請求の範囲第５５項記載の方法。 ５７．樹木の花粉がスギ花粉である、請求の範囲第５６項記載の方法。 ５８．ヒトＧＩＦがＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞系統３１Ｅ９によって 産生されたヒト抗原特異的ＧＩＦの抗原結合特異性を有する、請求の範囲第５７ 項記載の方法。 ５９．ヒトＧＩＦがＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞系統３１Ｅ９によって 産生される、請求の範囲第５７項記載の方法。 ６０．投与が非経口的である、請求の範囲第４７項記載の方法。 ６１．非経口投与が皮下、筋肉内、腹腔内、腔内、経皮的、静脈内注入によって 行なわれる、請求の範囲第６０項記載の方法。 ６２．投与が約０．００１ｍｇ／ｋｇ／投与から約２ｍｇ／ｋｇ／投与の用量で 行なわれる、請求の範囲第４７項記載の方法。 ６３．投与が約０．００１ｍｇ／ｋｇ／投与から約０．２ｍｇ／ｋｇ／投与の用 量で行なわれる、請求の範囲第４７項記載の方法。 ６４．免疫抑制的な量のほぼ精製されたヒト抗原特異的ＧＩＦおよび製剤上不活 性な担体を含んでなる医薬組成物。 ６５．ほぼ精製されたヒト抗原特異的ＧＩＦがＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３ を有する細胞系統ＡＣ５によって、またはＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞 系統３１Ｅ９によって産生されたヒト抗原特異的ＧＩＦの抗原結合特異性を有す る、請求の範囲第６４項記載の医薬組成物。 ６６．ほぼ精製されたヒト抗原特異的ＧＩＦがＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３ を有する細胞系統ＡＣ５によって、またはＡＴＣＣ受託番号ＨＢＸを有する細胞 系統３１Ｅ９によって産生される、請求の範囲第６４項記載の医薬組成物。 ６７．ヒトＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体を分泌する能力を有する 連続的継代ハイブリドーマ細胞系統。 ６８．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７２を有する細胞系統３８８Ｆ１である、請 求の範囲第６７項記載のハイブリドーマ細胞系統。 ６９．ヒトＧＩＦと特異的に反応する単クローン性抗体。 ７０．単クローン性抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７２を有するハイブリ ドーマ細胞系統３８８Ｆ１によって産生される単クローン性抗体の特異性を有す る、請求の範囲第６９項記載の単クローン性抗体。 ７１．単クローン性抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７２を有するハイブリド ーマ細胞系統３８８Ｆ１によって産生される、請求の範囲第７０項記載の単クロ ーン性抗体。