JPH02196A - 白血球の溢出を制御する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫学の分野に属する。さらに詳しくは１本発
明は、リンパ球または白血球が内皮細胞に付着する機能
を妨害するような抗体を用いて。

体内の特定の部分に白血球が溢出するのを制御すること
に関する。

（従来の技術） はとんどの成熟リンパ球は１体内の種々のリンパ器官と
他の組織との間を連続的に循環しており。

リンパおよび血流を介して移動している。これらのリン
パ球は、血流からリンパ器官へと移動し次に、収集導出
性のリンパ系へ移動し、最終的には血流中へと戻り、そ
して、再びこのようなサイクルに入るため、再循環する
といわれている。再循環のベースは、リンパ球のクラス
および分化の段階の関数であるが、平均的なリンパ球は
、この再循環サイクルをおおよそ１〜２日ごとに完了し
。

新しいリンパ器官または組織に入る。この細胞移動（ｓ
ｈｕｆｆｌｉｎｇ）により、特殊な性質のリンパ球のす
べての種類が９体じゅうの免疫反応に利用可能となり、
おそらくまた、免疫反応の発生およびその制御に必要な
細胞−細胞間の相互作用が容易となる。

再循環というこのプロセスの重要な点は、移動するリン
パ球が適当な部位において、血液から去ることのできる
ことである。リンパ球は、リンパ器官および、炎症部分
の特殊な内皮細胞を認識し。

選択的に結合するという注目すべき能力を持っていて、
はじめに管腔表面に結合し、そして、血管の壁を通って
、まわりの組織へと移動する。肺臓の他においては、こ
のような移動のほとんどが。

リンパ節中およびバイエル板中の後毛細血管細静脈、お
よび慢性炎症のリンパ系以外の部分を通って起こってい
る。これらの血管は、独特の肥大した内皮細胞により特
徴づけられ、従って、“高内皮細静脈”またはＨＥＶと
呼ばれている。リンパ球と）ＩＥＶとのこの相互作用は
、リンパ球の移動の制御の中心的な重要な要素であり、
　ＳｔａｍｐｅｒおよびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９７６、
Ｊ、　　Ｅ２５３４　　Ｍｅｄ　　１４４：８２Ｂ−８
３３）により初めて開発されインビトロのモデルを用い
て。

広く研究されている。そのモデルにおいては、生存リン
パ球がネズミまたはヒト（ＪａｌｋａｎｅｎおよびＢｕ
ｔｃｈｅｒ　（１９８５）　　Ｂｌｏｏｄ　６６　：５
７７−５８２　）のリンパ節または、粘膜性リンパ器官
（Ｂｕｔｃｈｅｒ＋　Ｅ、Ｃ。

（１９８６）　　Ｃｕｒｒ　Ｔｏ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｌｍｍｕｎｏｌ　１２８：８５−１２２）の凍結切片
中のＲＥＶを認識し、それに結合する。

凍結切片におけるリンパ球集団のＲＥＶへのインビトロ
での結合は、生理的状態下でＲＥＶへ付着する能力を正
確に反映する（Ｂｕｔｃｈｅｒら、　（１９７９）　　
Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ　１２３　：　１９８６）。

リンパ球の移動の研究は、リンパ球のＲＥＶ認識に包含
される“ホーミングレセプター（ｈｏｓｉｎｇｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ　）”に関する研究で証明されるように。

リンパ球上の細胞表面抗原を同定するのを目的としてい
る。例えば、末梢リンパ節ＲＥＶにマウスのリンパ球が
結合するのを選択的にブロックするラットのモノクロー
ナル抗体、　ＭＥＬ−１４，により、末梢リンパ節のＲ
ＥＶの特異的な認識を媒介するリンパＬｉの表面レセプ
ターは、９０キロダルトン（ｋＤ）の糖タンパクである
と規定される（　Ｇａ１ｌａｔｉｎ　ら。

（１９８３）　　Ｎａｔｕｒｅ　　３０４　：　３０−
３４　）　、　Ｃｈｉｎら（（１９８６）Ｊ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ　　１３６：２５５６−２５６１　）は、ラット
リンパ球表面に存在する分子（８０ｋＤ）に対するラッ
トのモノクローナル抗体、　ＩＢ、２．について述べて
いる。

上記分子は、粘膜には結合するが、リンパ節ＲＥＶには
結合しないリンパ球に含まれる。Ｊａｌｋａｎｅｎら（
（１９８６）Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｎｏｌ　　１６　：　
１１９５−１２０２　）は、８５〜９５キロダルトン（
ｋＤ）のヒトリンパ球表面の糖タンパクを規定し、そし
てリンパ球がリンパ節１１１！Ｖに結合するのを間接的
にブロックするラットのモノクローナル抗体、　Ｈｅｒ
ｍｅｓ−１，について述べている。彼らはさらに（Ｊ　
Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、印刷中）＋Ｈｅｒｍｅｓ−１によ
り規定されるこの同じクラスの分子がリンパ球−内皮細
胞の相互作用およびリンパ球の粘膜性リンパ（虫垂、バ
イエル板）への移動・定着性およびリウマチ関節炎およ
びライム病関接炎におけるリンパ球の炎症滑膜組織への
移動・定着性を制御するメンバーを含んでいることも示
した。Ｈｅｒｍｅｓ−１は、リンパ節、粘膜、および滑
膜性のＨＥＶに結合し得、細胞上に存在する類縁の８５
〜９５ｋＤの糖タンパクを規定している。リンパ１ｆｆ
ＨＥＶのマウスリンパ球ホーミングレセプターに対する
Ｍｌｌ！Ｌ１４と呼ばれるモノクローナル抗体が、ヒト
リンパ球Ｈｅｒｍｅｓ−１８５〜９５ｋＤ抗体と交差反
応し、そして、リンパ節ＲＥＶにヒトリンパ球が結合す
るのを特異的にブロックする。しかし、粘膜または滑膜
性のＲＥＶはブロックしない。モノクローナル抗体Ｈｅ
ｒｍｅｓ−３（これは。

Ｈｅｒｍｅｓ−１抗原上のある異なるエピトープを規定
する）は、ヒトリンパ球が粘膜性（虫垂、バイエル板）
のリンパ性＋１ＥＶに結合するのを特異的にブロックす
る。最終的に、　Ｈｅｒｍｅｓ−１抗原に対するポリク
ローナル抗血清が、既知のすべての）ＩＥＶのクラス（
リンパ節、粘膜、滑膜および皮膚）にリンパ球が結合す
るのをブロックする（　Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｅ、Ｃ。

Ｃｕｒｒ　Ｔｏ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌｍｍｕｎｏｌ
　　、前出）。このように、リンパ球は密接に関係する
レセプターのファミリーを使用して、血液から２体の異
なるリンパ器官および組織へ濡出する。

リンパ節ＲＥＶおよび粘膜性ＲＥＶで述べられているリ
ンパ球認識系に加えて、　Ｊａｌｋａｎｅｎらは、炎症
関節組織へのリンパ球の移動を制御する異なるクラスの
内皮細胞が存在することを証明した（　（１９８６）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ　２３３　：　５６６−５７８）　、この
研究において、研究者らは、　ＭＥＬ−１４は、滑膜組
織にリンパ球が結合するのを阻害するであろうと予想し
た。なぜなら。

層膜中の免疫反応は、粘膜性の組織に相反する非粘膜性
組織の免疫反応に、より類似しているためである。しか
し、　ＭＥＬ−１４は、滑膜性ＲＥＶへのリンパ球への
結合を、ヒトのリンパ球およびマウスのリンパ球のいず
れにおいてもブロックしなかった。

その出版物には、炎症滑膜中へのリンパ球の移動を調節
するリンパ球−内皮細胞認識メカニズムについては述べ
られていなかった。

マウスのＭＥＬ１４　、およびヒトのＨｅｒｍｅｓ−１
およびＨｅｒｍｅｓ−３により規定される分子のこのフ
ァミリーが、リンパ球のみならず、好中球、単球、好酸
球。

顆粒性リンパ球、ナチュラルキラー細胞および他の白血
球によっても発現されることが最近示された。上記の白
血球の全ては、マウスのＭＥＬ−１４およびヒトのＨｅ
ｒｍｅｓ−１を強く染色する。好中球Ｍｆ！Ｌ−１４抗
原は、　ＭＥＬ−１４によって規定されるリンパ球ホー
ミングレセプターに類イ以している。これは、　５Ｏ５
−ＰＡＧＥ中で（マウスのリンパ細胞系列上のＭＥＬ−
１４抗原により示される分子量の範囲内で）約１００ｋ
Ｄの見かけ分子量の位置に移動し、酸性のｐｌ　４．２
を示す。これは、リンパ球の抗原のものと同一である。

さらに、好中球および単球は、これらの分子を用いて組
織特異的な内皮細胞決定因子に作用していることが示さ
れている（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎら、　（１９Ｂ？　’）
Ｊ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌ１３８　：　４３１３〜４３２１
）　、このように、リンパ球だけでなく、好中球、単球
およびおそらくすべての白血球が２組織特異的な内皮細
胞の決定因子のための関連または同一の表面認識要素を
採用している。このレセプターのファミリーは、血中か
ら　すべての白血球が組織および器官への接近するのを
許容するのに中心的な役割を果たしている。

さらに、これらの白血球のレセプターに対する抗体が、
インビトロのみならずインビボにおいても１組織特異的
内皮細胞と白血球との相互作用を阻害することもまた。

確認された。例えば、　ＭＥＬ１４は、リンパ球（Ｇａ
ｌｌａｔｉｎら、前出）および好中球（Ｌｅｗｉｎｓｏ
ｈｎら、前出）の両方が表面末梢リンパ節または炎症部
分の中へ入るのを阻害する。

炎症反応は、ヒトおよび動物の疾病の組織病理の共通な
原因である。これは、特に自己免疫疾患において明らか
であり、その自己免疫疾患では。

ヒトおよび動物の免疫系が２体内の１またはそれ以上の
器官または組織に不適当に応答する。しかし、炎症反応
は、また、多くの他の疾病の臨床的な問題を引き起こす
。正常な炎症および免疫反応は外部からの感染性の傷害
からの防御を与えるのに重要であるが、しばしば、有害
な病理効果を与える。その例としては、結核およびらい
病に対する免疫反応は、しばしば２本来の原因である細
菌の作用により直接誘導される損傷よりもひどい組織の
損傷をもたらすことが挙げられる。炎症、または免疫反
応の二次的な効果が臨床的に重大であり、生命を脅かし
かねない。上記二次的効果には。

例えば、免疫複合体の沈着；脈管炎；そしてグルテン過
敏性腸症での下痢または喘息アレルギーでの気管支炎の
ような局部的なアレルギー現象がある。免疫反応および
炎症はまた。器官を移植した患者の生命をも脅かしかね
ない。移植器官に対する宿主の正常な免疫反応は、移植
の失敗の最も一般的な原因である。

炎症反応および免疫プロセスを制御する能力は。

このように、広い範囲の疾病に対して中心的な役割を果
たす。体全体における免疫系を抑制または調節するのに
働く一般の免疫抑制剤（例えば、コルチコステロイド、
アスピリン）はこの目的で広く用いられており、臨床で
の患者の看護における免疫抑制のアプローチの重要性を
示す。外部炎症病（例えば皮膚における炎症）の局所的
な治療を除いて、これらの薬剤は、非経口的に投与され
。

それゆえ、標的となる疾病のプロセスに含まれない望ま
れる免疫反応の抑制を器官または組織において引き起こ
す。従って、特に、特定の器官または組織の病理により
臨床的に現れた炎症または自己免疫病の状況において、
より選択的で組織特異的な様式で免疫反応を抑制する手
段をもつのが好ましいであろう。

本発明の組織特異的な内皮細胞のリガンドおよび層膜特
異的な白血球の糖タンパクは１種々の炎症細胞の接近を
調節することにより１組織の炎症プロセスを制御するの
に、中心的な役割を果たす。

白血球および内皮細胞分子を操作し得るということ（例
えば、モノクローナル抗体でそれらの機能を妨害するこ
と）は１局部破壊的な免疫および炎症反応の臨床的な問
題に、新しいアプローチが提供されるということである
。

（以下余白） （発明の要旨） 光凱豊措底 本発明は、　ｉ、ｕ繊持異的な内皮細胞表面抗原を認識
する抗体を提供する。この抗体は内皮細胞への白血球の
結合を阻害することができ、それによりインビボでのそ
のような内皮細胞を介してのリンパ球の溢出を阻害する
。これらの抗体は、末梢リンパ節、粘膜リンパ球および
滑膜組繊を包含する生体の分化した組織から得られた内
皮細胞表面抗原を認識する。モノクローナル抗体を分泌
するハイプリドーマ細胞系も提供する。

白血球の滑膜への移動・定着をプロ・ンクしうる抗体も
提供され、この抗体は滑膜特異的白血球ホーミングレセ
プターに結合し、それによって白血球の滑膜細静脈との
相互作用を阻害する。

本発明の別の局面は、精製された内皮細胞表面タンパク
を開示する。このタンパクは。

ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（Ｓｎ２−ＰＡＧＥ）により測定すると。

分子量は還元型で約５８　、０００〜６９，０００ダル
トンであリ；そして ｂ）インビボで上述の抗体の最初のクラスと複合体を形
成することによりリンパ球の移動・定着をブロックしう
る組織特異的な抗原決定基を表示している。

本発明はさらに、白血球の滑膜脈管内皮の認識に関係の
ある精製された滑膜特異的白血球糖タンパクを提供する
。この糖タンパクはＳＯ３−ＰＡＧＥで測定すると還元
型で約９０．０００の分子量を有し、約４．２の酸性ｐ
ｉを有し、かつ上述の層膜特異的抗体によるこのような
レセプター活性の機能的な阻害により規定すると、滑膜
内皮細静脈に特異的なホーミングレセプター活性を示す
。

本発明のさらに他の局面は、白血球の溢出に関連した疾
病をコントロールするための患者の治療のための組成物
である。

本発明をまとめて示すと次のようである。

本発明の抗体は、内皮細胞への白血球の結合を阻害し得
る抗体であって、約５８．０００〜６９，０００ダルト
ンの組織特異的内皮細胞表面抗原に結合する性質を有す
る。この抗体は、滑膜に移動・定着性の白血球をブロッ
クし得る抗体であって、層膜特異的白血球ホーミングレ
セプターに結合し白血球の滑膜細静脈との相互作用を阻
害する。

上記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体であり得、このようなモノクローナル抗体を生産し
得る継続的細胞系列もまた１本発明に包含される。この
細胞系列は９次の（ａ）および（ｂ）の融合細胞で実質
的になる：（ａ）該抗体を生産する細胞；および（ｂ）
ハイブリットとしたときに均一な免疫グロブリンを生産
するミエローマ細胞。

本発明の精製内皮細胞表面タンパクは、（ａ）ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より決定すると、還元型で約５８，０００〜６９、００
０ダルトンの分子量を有し、そして、（ｂ）上記抗体と
複合体を形成することにより、インビボにおいてリンパ
球の移動・定着性をブロックし得る組織特異的抗体を発
現する。

本発明の滑膜特異的精製白血球糖タンパクは。

ヒトリンパ球またはリンパ細胞系列から単離され。

（ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により決定した分子量が、還元型で約８５
．０００〜９５．０００ダルトンであり、そして（ｂ）
上記抗体に結合することにより決定すると、滑膜の内皮
細静脈に特異的なホーミングレセプター活性を発現し、
そのことにより白血球が滑膜細静脈に結合するのを阻害
する。

本発明は、さらに白血球の溢出に関する疾病をコントロ
ールするために個体を治療するための組成物に関し、上
記抗体の活性成分としての有効量を、少なくとも一種の
薬学的に許容し得る賦型剤と混合して含有する。

日を　を乍　るための　工 本発明を実施するには、もし他に指示されていなければ
、当業者の範囲内である分子生物学、微生物学１組換え
ＤＮＡ、および免疫学の通常の技術を用いる。このよう
な技術は文献に十分に説明されている。例えば、　Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、　　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏ
ｏｋ、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　
Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ　　（１９８２）
　；　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　（
Ｒ，Ｋ。

Ｆｒｅｓｈｎｅｙ［、１９８６）　　；　　ｒｍｍｏｂ
ｉｌｉｚｅｄ　　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄＥｎＡｗμシ（Ｉ
ＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ＋　　１９８６）；　　Ｂ、　Ｐｅ
ｒｂａｌ。

Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ−ＩＶ（Ｄ、Ｍ、　Ｗｅｉｒおよび
Ｃ，Ｃ，ＢＩａｃｋｗｅｌｌＪＷ。

１９８６　、旧ａｃ？ｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｊｃ
　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照のこと。

本発明を記述するにあたり９次の用語を以下に示す定義
に従って用いることとする。

°゛抗体゛とは、抗原と特異的に結合しうる免疫グロブ
リンと呼ばれる一連のグリコジル化されたタンパクのメ
ンバーを意味する。この用語は、免疫グロブリンの全て
のクラス（ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　Ｉｇ八、　ＩｇＤまた
はＩｇＥ）および免疫グロブリン全体と同様に。

抗原結合フラグメント（例えば、　Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ
’）ｚ。

Ｐａｂ’、　Ｆν）を包含すると意図される。

パ抗原“とは、化学的な修飾なしで抗体形成を引き起こ
すタンパクまたは合成ペプチド化合物を意味する。ここ
で用いられるように、この用語は内皮細胞表面分子また
は滑膜特異的白血球糖タンバクを意味する。さらに詳細
には、この用語は約５８．０００〜６９．０００ダルト
ン（５８〜６９ｋＤ　）の内皮細胞表面タンパクまたは
滑膜内皮に対する約８５〜９５ｋＤのホーミングレセプ
ターを意味する。

′“誘導体″“とは、天然型５８〜６９ｋＤタンパクの
抗体結合または機能的な白血球結合活性を保持している
天然型または還元型の５８〜６９ｋＤタンパクのあらゆ
る修飾を包含すると意図される。あるいは。

還元された天然型の８５〜９５ｋＤタンパクの抗体結合
活性または機能的な内皮細胞認識特性を保持している８
５〜９０ｋＤタンパクのあらゆる修飾を包含すると意図
される。この用語は、タンパク、ポリペプチドまたは組
換えＤＮＡ技術によりつくられる融合タンパクのフラグ
メント、オリゴマー、または複合体を包含すると意図さ
れるが、これに限定されない。これらのアミノ酸配列は
、全体的または部分的にあるいは実質的に５８〜６９ｋ
Ｄタンパクかまたは８５〜９５ｋＤタンパクのいずれの
アミノ酸配列とも同じである（例えば、逆に、抗体結合
に影響を与えないように異なっている）。あるいは、こ
のタンパクの活性フラグメントのいずれか、または異な
る置換基をもつタンパク（例えば、グリコジル化の欠如
、その他のグリコジル化）、およびタンパクまたはこの
ようなフラグメント、オリゴマーポリペプチド、および
融合タンパクおよびキャリアタンパクの結合体を包含す
ると意図される。

”機能的類似物゛°とは、抗体ＭＥＣＡ−３６７または
ＭＥＣＡ−７９のそれぞれが認識するのと同じ抗原を認
識し、白血球−内皮細胞の相互作用をブロックする抗体
、または抗体１１ｅｒｍｅｓ−３が認識するのと同じ抗
原を認識し、層膜特異的な白血球内皮細胞結合をブロッ
クする抗体を意味する。これは、マウスまたはその他の
由来の同じまたは異なる免疫グロブリンクラスの抗体、
およびＭＥＣＡ−３６７、ＭＥＣ＾−７９゜１１ｅｒｍ
ｅｓ−３およびその他のそのような抗体の抗原結合断片
を包含すると意図される。

“ホーミングレセプター″″とは、リンパ節、粘膜器官
、滑膜または他の組織での組織特異的内皮細胞決定基の
認識に関係する白血球表面分子を意味する。このホーミ
ングレセプターの存在は、血液からこれらの組織への白
血球の浸入のために必要である。ホーミングレセプター
は滑膜特異的白血球上の約５８〜６９ｋＤ、および内皮
細胞上の約８５〜９５ｋＤ、ならびに好中球および単球
細胞系上のいくつかのより高分子１ｔ（１００〜１１５
ｋＤ）の種の酸性糖タンパククラスのメンバーである。

°“白血球”とは、顆粒状、単球、およびリンパ球を包
含するが、それに限定されない白血球細胞である。

本発明のある１つの局面に従うと、リンパ球および他の
白血球の特定の器官または生体組織、あるいは組織のあ
る状態を示している（例えば、炎症）組織部位の中への
溢出および移動・定着に関係する組織特異的な内皮細胞
表面分子を、同定および単離する抗体が提供される。こ
れらの抗体は。

移動しているリンパ球および他の白血球の認識を媒介す
る内皮細胞表面分子を同定する。さらに。

ここで記述する抗体は、生体の異なる器官２組織。

または組織の状態において内皮細胞を区別する。

このような器官特異的相互作用は、末梢リンパ節（例え
ば、頚部、液窩、上腕、鼠径、膝窩）、粘膜関連リンパ
組織（例えば、バイエル板、虫垂）。

炎症を起こした滑膜のＨＥＶの内皮細胞決定基を。

肺、脳、肝臓、腎臓、卵巣、子宮、膵臓、心臓。

皮膚、または特定の皮膚の部位、眼、などを包含する他
の器官に存在すると考えられている他の組織特異的内皮
細胞決定基を規定するのと同様に規定する。

本発明の別の実施態様では、滑膜ＨＥＶの認識を媒介す
る白血球細胞表面分子を同定する抗体が提供される。

ここに記述する方法論に従って、リンパ球および他の白
血球のＲＥＶへの溢出および移動・定着に関係する細胞
表面分子を認識し、かつ機能的に影響を及ぼす多くの種
々の抗体を構築し得る。

ハイブリドーマの技術によりモノクローナル抗体をつく
る一般的方法がよく知られている。内皮細胞表面レセプ
ターに対するモノクローナル抗体を、にｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、　Ｎａｔｕｒｅ　　
３５６：４９７；ならびにＬｅｖｙおよびＤｉｌｌｅｙ
　（１９７８）、　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ
ｉ　ＵＳＡ　、　Ｌｌ：４２１１によって記述されてい
るような方法により、抗体分泌ハイブリドーマから作製
し得る。簡単に述べると、これらの方法はミエローマ細
胞とリンパ球とを融合剤（典型的にはポリエチレングリ
コール）を用いて融合する工程を包含する。この工程に
使用され得るミエローマ細胞系は、公知でありかつ入手
可能であり。

例えば５Ｐ２１０．　ＭＳ−１およびｐ３／ｘ６３／八
ｇ８．６５３を包含する。典型的には肺臓細胞またはＢ
１１１胞のいずれかであるリンパ球は、特定の器官もし
くは組織または組織の状態（例えば、リンパ節間質、滑
膜間質５または他のあらゆるリンパ組織もしくは炎症性
組織の間質）やこのような組織から単離された内皮細胞
で免疫したマウスまたはラットから得られる。あるいは
Ｈｅｒｍｅｓ−１抗体またはＨｅｒｍｅｓ−３抗体カラ
ム（これらの抗体は層膜および他のホーミングレセプタ
ーにより共有される共通のエピトープを規定する）を用
いて精製されたアフィニティー単離ホーミングレセプタ
ーで免疫したマウスまたはラットから得られる。次いで
、融合細胞またはハイブリドーマを、ヒポキサンチン、
アミノプテリン、およびチミジンを含有する栄養培地（
ＨＡＴ　）に広げる。培養で生き残った細胞を所望の抗
体の生産について調べ、陽性の細胞を公知の方法により
選択し、クローン化する。ハイブリドーマの生産に続い
て、上清を関連抗体について選択する：１）免疫組織学
により、白血球の移動に関連する脈管上の組織特異的な
様式でリンパ球により表示される抗原決定基を規定する
抗体を捜す（例えば。

抗体は他の部位の１１Ｅνよりもより強く層膜のＨＥｖ
を染色する）；２）抗体の機能的インビトロ分析におい
て、白血球と陽性の組織特異的脈管との相互作用をブロ
ックする：そして、３）動物モデルにおいて、静脈内注
射された抗体の器官特異的リンパ球または白血球の溢出
を阻害する能力を試験することによる。このクローンに
より示されるモノクローナル抗体は、公知の方法により
回収し。

精製し得る。

外因性の抗体が本発明で用いられ得るが、抗体それ自身
が宿主からの免疫応答を誘導する可能性を減少させるた
めに、同種異系抗体またはハイブリッド抗体も使用し得
る。同種異系モノクローナル抗体は、宿主と同じ動物種
由来の融合細胞により作製されたハイブリドーマにより
示される抗体である。ハイブリッドモノクローナル抗体
は。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　
Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　　８１：６８５１−５に記
述されているように、ヒトの不変領域およびマウスもし
くはラットの可変領域を用いて遺伝学的に操作できる。

抗体は、特定の疾病および該疾病にかかった患者に依存
する。１つまたはそれ以上の免疫グロブリンクラス（Ｉ
ｇＭ、　ＩｇＧ、　ＩｇＡ。

ＩｇＤまたはＩｇＥ）由来であり得る。

ここに記述した内皮細胞表面分子は、移動するリンパ球
の認識を媒介する一連の抗原的および構造的に関連した
内皮細胞表面分子を構成すると考えられる。従来技術で
記述したように、異なる組織における内皮細胞のリンパ
球の認識は、一連の密接に関連しているが機能的に別個
のリンパ球表面レセプター（Ｈｅｒｍｅｓ−１により規
定されるｇｐ８５〜９５ｋＤ　’）と関係がある。この
レセプターは、相補的に一連の密接に関連した組織特異
的内皮細胞の位置マーカーまたは本発明のリガンド（Ｍ
ＥＣＡ　３６７／８９゜およびＭＥＣＡ−７９抗原が粘
膜および末梢リンパ節の原形を表現するような５８〜６
９ｋＤタンパク）と相互作用する。このように、他の内
皮細胞源に存在する組織特異的内皮細胞表面分子を規定
するこの免疫学的アプローチは、リンパ球細胞表面分子
の単離に関する研究における１つの推論を存する。滑膜
、皮膚、心臓および他の組織における組織特異的内皮リ
ガンドのような組織特異的内皮細胞の糖タンパクのさら
なる群のメンバーの同定は９本発明の開示および方法に
直接に基づくものである。

免疫系の機能を阻害する能力は　アレルギー慢性関節リ
ウマチおよび全身性エリテマトーデスを包含する自己免
疫疾患、ある種の腎臓病、特発性肺線維症および過敏性
肺炎のような炎症性の肺病、グレージス病または初期糖
尿病のような内分泌性疾患、およびリウマチ熱のような
ある種の心臓病のような疾病の治療に治療掌上有用であ
ることが知られている。免疫抑制もまた。ある種の白血
病または再生不能性貧血を治療するのに用し１られる器
官移植または骨髄細胞移植で起こる有害な免疫“拒絶゛
反応を防ぐのに治療掌上有用である。

本発明により、これらおよびその他の種類の疾病に対す
る組織特異的な免疫抑制の治療が提供される。これらの
疾患のいくつかを以下の表１に示す。

（以下余白） 表１＝疾病または免疫病の例 自己免疫疾患および関連病 全身性エリテマトーデス 慢性関節リウマチ ライム病関節炎 結節性多発関節炎 多筋炎および皮膚筋炎 進行性全身硬化症（成人皮膚硬化症） 糸球体腎炎 重症性筋無力症 ショーブレーン症候群 リンパ腫性甲状腺腫およびグレーヴス病副腎炎、上皮小
体機能減退症、および関連病態性貧血 糖尿病 多発性硬化症および関連の脱髄病 葡萄脱炎 天庖疹および新生児膿癲疹 肝硬変症および他の肝臓病 潰瘍性大腸炎 心筋炎 による　　　な　　の　　（など 本発明の別の局面は、特定の組織または器官への治療上
または診察上の薬剤の供給を目標とする。

この薬剤とは、放射線毒、可溶性の血液産生高分子薬剤
がＩｌｌ瘍周囲の組織へ接近するのを高める血管浸透性
促進薬剤、または放射線薬剤、該磁気共鳴薬剤もしくは
他の造影剤である。薬剤を、従来法を用いて２組織特異
的な内皮細胞リガンドまたは分子に対する抗体に共有結
合的に架橋させ、静脈内注射により標的器官または組織
中の血管系にそって局在させる。このような標的化は、
血管異常の診断または悪性の血管新生の評価における新
しい映像方法を提供する。例えば１組織特異的内皮リガ
ンドは転移細胞（例えば、乳腺組織は粘膜の内皮細胞リ
ガンドを局部的に誘導し、それゆえ転移乳癌は粘膜特異
的内皮細胞分子をまた。誘導し得る）によって局部的に
生産される因子により不適当に誘導され得るので、静脈
内注射された造影剤は転移乳癌の位置を容易に同定し得
る。局部的な血管系における内皮細胞表面の変化に基づ
いて、腫瘍の撮影を行なうこの試みにより、血管以外の
場所に高分子が運ばれるという問題が回避される。本発
明はまた２選択した組織または器官へ治療薬を、標的を
しぼって運ぶことを可能にする。

組織上における全ての炎症性反応および免疫反応には、
炎症部位に白血球が存在することが絶対的に必要である
。これらの白血球は、リンパ球および該リンパ球から派
生した単球、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキ
ラー細胞、および／または肥満細胞を包含する。このよ
うな白血球は全て骨髄内で生じ、血液を通って移動し、
そして該白血球が、血管の内皮細胞と接触したりその間
を移動したりすることによって免疫反応に関与し得るよ
うな組織部位にのみ移入する。特定の器官または組織へ
の白血球の血管外溢出を妨害する能力は、それゆえ、効
果的であるが組織選択的な免疫抑制の治療法を提供する
。本発明は、粘膜のリンパ系組織および炎症性の組織、
リンパ節、滑膜および皮膚、そしてさらに、脳、心臓、
腎臓、肺および肝臓のような他の独立器官へのリンパ球
および白血球の移入の的をしぼった阻害を可能にする。

従って９本発明の方法は、炎症性反応または免疫反応が
病状の一因となるような局在的な疾病に対する免疫抑制
性的治療の好ましい様式を提供する。

本発明の方法において用いられる抗体は１個体。

特に哺乳類に投与される。投与方法は、標的のリンパ球
または内皮細胞に到達し、それに結合し。

そしてそれによって循環するリンパ球の結合をブロック
する抗体の見込み量を最大にするような方法である。次
に、これは、特定の部位を通るリンパ球の循環を阻害ま
たは転換し、そして９表１に挙げたようなある種の新生
リンパ系の疾患または機能不全リンパ系の疾患の制御を
する。

異なった種の個体および異なった疾患に対する投薬量は
、治療されるべき疾患が示すそれらのパラメーターを減
少させてゆき、その抗体の効果を測定することにより決
定される。タンパクであるので、抗体は通常、非経口的
に、好ましくは静脈投与される。局所的な炎症疾患のネ
ズミのモデル（例えば、腸の過敏反応）では、２週間の
間、１週間あたり１匹につき０．５〜２■の割合でＭＥ
ＣＡ−３６７抗体を投与すると、その疾患の炎症を減少
させるのに十分である。炎症性の関節炎の提案されたヤ
ギのモデルにおいては、１週間の間、１週間あたり１匹
につき１００■の用量で抗体を投与すると。

その疾患の炎症を減少させるのに十分である。抗体の投
与は、疾患の状態によりくり返して行なわれなければな
らないであろう。さらに、多くの自己免疫性疾患の影響
は、不可逆的であると考えられる。例えば、類肉腫症に
おける膠原質化、または長期間にわたるリュウマチ様間
接炎における末期的な影響がある。つまり、病気にかか
りやすい個体に対する治療は、その疾患の末期症状が現
れる以前、そして、好ましくは、その疾患が発症する以
前に行なわれる。それはまた、急性の炎症に適切である
。疾患が十分に発現するか否かは、臨床的な徴候をモニ
ターすることによって決定することができ、そして、自
己免疫性疾患に関連した特異的抗体の存在も同様である
。

非経口的に投与されるときには、その抗体は。

薬学的に許容されうる非経口的薬剤の賦形剤とともに注
射され得る投薬型（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方され
る。そのような賦形剤は９本質的に非毒性であり治療効
果もない。そのような賦形剤の例としては、水、生理食
塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、そしてバン
ク溶液がある。不揮発性の油およびエチルオレエートの
ような非水性賦形剤もまた使用されうる。その賦形剤は
１等張性および化学安定性を増強する物質（例えば。

緩衝剤および保存剤）のような少量の添加物を含有し得
る。その抗体は、実質的に会合体および他のタンパクを
含有しない精製された形において。

約１〜５０■／　Ｉｎ１の濃度で処方される。

関節炎については２局部的な投与が特に効果的であり、
その投与には標的部分に近い位置に直接移植される皮下
の移植物、ステープルまたは徐放性処方物というような
手段が用いられる。徐放性処方物は、　Ｈｙｄｒｏｎ　
（Ｌａｎｇｅｒ、　Ｒら（１９７６）　　Ｎａｔｕｒｅ
２６３　：　７９７−７９９）またはＨｌｖａｘ　４０
Ｐ　（Ｄｕｐｏｎｔ）（Ｍｕｒｒａｙ。

Ｊ、Ｂ　ら、　　（１９８３）　Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ　
　旦：　７４３−７４７）のようなポリマー中に処方さ
れ得る。他の持続性のシステムは、　Ｈｓｉｅｈ、　Ｄ
、Ｓ、Ｔら（（１９８３）　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ。

７２　：　１７−２２　＞　　により提案されている。

適切な薬剤の賦形剤およびそれらを用いた処方物は、こ
こに参考文献として示されているＥ、Ｗ、Ｍａｒｔｉｎ
による“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。

さらに以下の実施例により２本発明を例示する。

これらの実施例は１本発明の範囲を制限するものではな
い。本発明の開示を考慮すると、特許請求の範囲に包含
される種々の実施態様が当業者に明らかである。

（以下余白） （実施例） １隻±よ 症隨勿起盈：リンパ球−内皮細胞のインビボおよびイン
ビトロでの相互作用の機能に関する研究から、リンパ節
ＲＥＶはリンパ球のホーミングレセプターに対して機能
的に規定された組織特異的リガンドの発現に特徴づけら
れることが示されている。さらに、腸隔膜のリンパ節の
ＲＥＶはリンパ節特異的および粘膜ＲＥＶ特異的細胞系
の両者に結合することが知られている。従って、末梢リ
ンパ節特異的および粘膜リンパ球特異的内皮細胞リガン
ドに対する抗体生産のために、末梢および腸間膜リンパ
節の高内皮細静脈を含む粗調製物を用いた。

ＢＡＬＢ　／ｃマウスの上腕、腋窩、足掻および腸間膜
のリンパ節をバンクの調製塩溶液（ＨＢＳＳ）中にプー
ルし、細断し、顕微鏡のスライドグラスの間にはさんで
穏やかに押しつけ、リンパ球を遊離させた。次いで、得
られた細胞懸濁液をニテックス（ｎｉｔｅｘ）の網（Ｓ
ｕｌｌｉｖａｎ’ｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　
ＣＡ）に通し１編上に残った間質成分を集めた。これら
の間質調製物を０．３２■コラゲナーゼ／ｄ（５−／マ
ウス）を含有するＩＩ　Ｂ　Ｓ　Ｓで１０分間処理し、
洗浄し。

再度二テックスに通した。ニテックスに残った間質細胞
を集め、　［（ＢＳＳに懸濁し、免疫に用いた。

免疫少プ旦上孟五：　ＦｉＥＣＡ−８９を生成する融合
のために、ウィスターラットにリンパ節間質（１回の注
射当たり３匹のマウスから調製）を沈澱硫酸アルミニウ
ムカリと３＝２の割合（アジュバント／キャリアー）で
混合し、最終容量１ｄを３回腹膜内（ｉ、ｐ、）に投与
した。これらの免疫を２〜３週問おきに行い、３回目の
投与の１７日後にＨＢＳＳ中の間質細胞（１０匹のマウ
スから得た）でラットを追加免疫した。

ＭＥＣＡ−３６７およびＭＥＣＡ−７９を生成する融合
には。

ＭＥＣＡ　−８９融合に用いた動物からの約ｌＸｌ０’
個の肺臓細胞を正常なウィスターラットに養子免疫細胞
移入した。細胞移入後、および２力月後に再びこの動物
を沈澱硫酸アルミニウムカリと混合したリンパ節間質（
注射あたり５匹のマウスから得た）で免疫した。この第
２回目の免疫の１週間後に。

このラットを）ＩＢｓｓ中の間質細胞調製物（１０匹の
マウスから得た）をｉ、ｐ、投与して追加免疫した。

ハイプリドーマの　　：最後の追加免疫の３日（ＭＥＣ
Ａ−８９融合）から４日（ＭＥＣＡ−３６７／ＭＥＣＡ
−７９融合）後に、ラットの肺臓細胞とマウスミエロー
マＳｐ２１０（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７８．Ｎａｔ
ｕｒｅ　　２７６：２６９）とを、リンパ球とミエロー
マの比を２対１で混合し、ガスクロマトグラフィー級の
ポリエチレングリコール４０００（ＥＭ　５ｃｉｅｎｃ
ｅ、Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて融合させた。

ハイブリッド細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリン
、およびチミジンを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地（
ＪＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中での生育能について選択
した（Ｋｏｈ　ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ、前出）。

モノクローナル　　の゛；モノクロナール抗体の選択を
以下のようにして行った。；１、　　　　　による−　
　　　　　　　　：ハイブリドーマの上清を、特にリン
パ組織および炎症部位の内皮細胞を認識するモノクロー
ナル抗体の存在について選択した。リンパ組織およびい
くつかの場合には外来リンパ組織をＴｉ５ｓｕｅ　Ｔｅ
ｋ　ＯＣＴ化合物（ｌａｂ−Ｔｅｋ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
）に包埋し、ドライアイスで凍結した。厚さ８〜１２μ
ｍの凍結切片を切り出し、冷アセトンに２〜１０分間浸
漬することにより固定し、そして風乾した。この切片を
５０〜１００ｔＩｆのハイブリドーマの上清でカバーシ
、１０分装置インキュベートし、そしてｌｌＢｓ５中に
５分間浸漬して洗浄した。次いで、スライドを、１：２
０希釈した２次抗体、５％正常マウス血清を含有するＨ
ＢＳＳ中のＦＴＴＣ結合ヤギ抗−ラットＩｇＧ　（Ｓｉ
ｇｍａ）を入れたコブリンジャー（Ｃｏｐｌｉｎ　ｊａ
ｒ）中で室温にて１０分間インキュベートした。

（以下余白） スライドをＨＢＳＳで洗浄し、螢光顕微鏡検査により調
べた。リンパ節の高内皮細静脈細胞および／またはバイ
エル板と反応し得る抗体を含有する上清を限界希釈法に
よりクローニングするために選択した。

免疫パーオキシダーゼによる染色によりさらに免疫組織
学的染色を行なった。種々のリンパおよびリンパ以外の
組織のアセトン固定凍結切片（厚み６〜１２μｍ）をリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で精製モノクローナル
抗体とともにインキュベートし、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合ウサギ抗−ラットＩｇＧ　　（ＯＡＫＯ，Ｃ
ｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ　　：　１　：
４０に希釈して使用）、５％正常マウス血清およびＰＢ
Ｓを含む溶液で処理した。西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合第２抗体は、ジアミノベンジジンおよび）１．０．
の溶液にさらした後検出され、そして染色は、０．５％
硫酸銅（生理食塩水中）でインキュベートすることによ
り増強された。切片をヘマトキシリンで軽く対比染色し
た。

ＨＥＶを組織選択的方法で染色するハイブリドーマ生産
抗体を限界希釈法でサブクローン化し、そして安定した
クローンを液体窒素中で貯蔵用に凍結した。これらは、
　ＭＥＣＡ−８９およびＭＥＣＡ−３６７、およびＭＥ
ＣＡ−７９を含む。ＭＥＣＡ−８９およびＭＥＣＡ−３
６７は粘膜関連組織のＲＥＶに特異的であり；そして、
　ＭＥＣＡ−７９は、リンパ節）ＩＥＶを優先的に染色
し、バイエル板■ＥＶを弱くまたは部分的にしか認識し
ない。

サブクローン化されたハイブリドーマの一部を増殖のた
めにを血清を含まないＨＢＩＯＩ培地（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に入れ、モノクローナル抗
体の大量生産を行なった。得られた培養物上清中の免疫
グロブリンを、５０％飽和硫酸アンモニウムを加えるこ
とにより沈澱させた。モノクローナル抗体の収量および
純度を、タンパクの測定（ＯＤｚｓ。）および５ＯＳ−
ＰＡＧＥ分析により決定した。

・・り　る　　の　　　　：リンパ球とＲＥＶとの間の
相互作用の、インビトロにおけるモデルは以前に開示さ
れている。（Ｂｕ　ｔｃｈｅｒら、　Ｊ　Ｉｍｎ＋ｕｎ
ｏｌ　（前出）、ならびにＪａｌｋａｎｅｎおよびＢｕ
ｔｃｈｅｒ、Ｂｌｏｏｄ（前出））。しかし１本研究に
おいては、　ＭＥＣＡ−８９。

ＭＥＣＡ−３６７、およびＭｌｌＩＣＡ−７９のブロッ
キング活性を評価し得るようにこのモデルを若干修正し
た。節単に述べると、粘膜リンパ系組織または末梢リン
パ系組繊のＲＥＶを決定する抗体を、リンパ節またはバ
イエル板の厚さ１２μｌの新たに切除した固定していな
い凍結切片と、７°Ｃで３０分間ブレインキュベートし
た。対照は、アイソタイプ−適合モノクローナル抗体お
よび培地のみを含有していた。

抗体は１００　ｕ　ｇ／ｍ１の濃度で用い、１００１Ｉ
ｆを各切片に添加した。このブレインキュベーションの
後。

実験に用いる切片および対照の切片の両方から培地を除
去し、リンパ球−ＨＥＶ結合分析を行った。

結合分析のために、マウス腸間膜節リンパ球または選択
されたリンパ系あるいはリンパ腫を、　２０ｍＭ１１Ｅ
Ｐ［Ｅｓおよび５％の新生児または胎児ウシ血清を含有
するＲＰＭＩ　１６４０中で試験した。

ａ、盪準負星分捉条住：細胞懸濁培地（２５ｍＭ／ＬＨ
ＥＰＥＳ　（ＰＨ７，３）および５．０％の胎児ウシ血
清を含有するＲＰＭＩ）　ｌｄ中に３Ｘ１０’個のリン
パ球を含む懸濁液１００μｌを、内径１．８ｃｍのワッ
クスペンサークル（ｗａｘ　ｐｅｎ　ｃｉｒｃｌｅ）（
Ｍａｒｔｅｘ、　Ｔｅｃｈ　Ｐｅｎ、５ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＋　月ｃＧｒａｗ　Ｐａｒｋ＋
　　ｍ）中で、ヒトリンパ節、粘膜リンパ垂、または層
膜の１２μｍの新鮮な凍結切片とインキュベートした。

溝膜組織は、炎症性関節炎（例えば、慢性関節リウマチ
またはライム関節炎）の患者から治療のため滑膜切除に
より得た。分析に先立ち、凝集塊を、細胞懸濁液をモノ
フィラメントのナイロンメツシュ（５ｕｌｌｉｖａｎｓ
＋　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ、）を通すこ
とによって試料群から除去した。切片は、　Ｔｅｋｐｒ
ｏ−ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ、　５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＣＡ　）シ
ェーカーで７°Ｃにて３０分間６０〜？Ｏｒｐｍで回転
させた（回転半径３７４インチ、水平運動）。試料細胞
の添加に先立ち、撹拌を開始することが重要である。イ
ンキュベーションの後、スライドの端部を吸水性のタオ
ルにそっと打ちつけることによって培地を除去した。次
いで、スライドを１％のグルタルアルデヒド（４９％原
液（ＭＣＢ＋　ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＣｈｅｍｉ
ｓｔｓ、　Ｃ１ｎｃｉｎｎａｔｉ、　０ｈｉｏ）から希
釈した）を含む冷ＰＢＳに立てて浸漬し、−晩装置して
付着性のリンパ球を切片に固定した。

ｂ、ＲＥＶ　　　　　ｌ　ンパ　の　　およびカウント
：インキュベーションおよび固定を行った後、非付着性
のリンパ球をＰＢＳを静かに流して洗浄除去し。

切片を１６倍の対物レンズを用いてＰＢＳの下方から暗
視野照明をあてることによって検査した。これらの条件
下では、特徴のある円を細長くした形を描く明確な黒っ
ぽい線（基底膜）によって、　ＨＥＶを周囲の副皮質か
らはっきりと識別することができる。付着性リンパ球は
、　＆１ｌＩａ片の面の上部に位置する明確な白っぽい
円として現れる。各１１ＥＶと結合したリンパ球の個数
を記録した。大部分の試験では、１つの試料につき６つ
の切片をコードし。

−重盲検でカウントした。かなりの非特異的結合がある
領域はカウントしなかった。

ｃ、ｆｆｉ二久処理：それぞれ印をつけたＲＥＶと結合
した細胞の平均数および平均値の標準誤差を。

各試料ごとに計算した。

表２に示すように、　ＭＥＣＡ−７９は、ｉ骨関連バイ
エル板でのＲＥＶとの結合に影響を与えることなく。

リンパ球と末梢リンパ節ＨＥｖとの結合を９５％阻害す
る。逆に、　ＭＥＣＡ−３６７はリンパ節）ＩＥＶへの
付着に影響を及ぼすことなく、バイエル板ＲＥＶとの結
合を９０％阻害する。対照抗体およびＭＥＣＡ−８９は
顕著な効果がなかった。ＭＥＣＡ−７９およびＭＥＣＡ
−３６７（、同じ特異性を有する）もまた、変化したリ
ンパ細胞系の結合をブロックする。このように、　ＭＥ
ＣＡ−７９およびＭＥＣＡ−３６７は、血液からそれぞ
れ末梢リンパ節または粘膜バイエル板への溢出するのに
必要な組織特異的リンパ球内皮細胞の相互作用を阻害す
る。

（以下余白） 表２．モノクローナル抗体ＭＥＣＡ−３６７およびＭＥ
ＣＡによるリンパ球−ＨＥＶ結合の器管特異的阻害バイ
エル板 培地対照 ＭＥＣＡ　３６７ ＭＥＣＡ−８９ ＩｇＧ２ａ対照 末梢リンパ節　培地対照 ＭＥＣＡ−３６７ ＭＥＣＡ−８９ ＩｇＧ２ａ対照 １．１４±０．０６ ０、Ｉｆ±０．０４ １．００±０．１７ １．０１±０．１２ １０本 １４．５±１．４ １５．９±１．４ １６．３±１．６ １４．０±１．７ ＭＥＣＡ−７９０，７７±０．２ １ｇＭ対照　　１３．８±１．５ に ＊Ｐ＜０．００１対他の処理 インビトロでの分析でリンパ球１１ＥＶ相互作用をブロ
ックしうる抗体を１次のインビボでの試験用に選択した
。さらに、内皮細胞の組織特異的または炎症特異的決定
基を、インビトロでの分析で阻害を示していようがいま
いが適切であると判断した場合には、インビボでの試験
に阻害を目的として選択した。（例えば、　ＭＥＣＡ−
８９はインビトロでリンパ球−ＨＥＶ相互作用を阻害し
ないが、インビボでリンパ球の粘膜バイエル板への移動
・定着を８０％ブロックする（以下を参照のこと）。こ
の抗体は、完全にブロック抗体であるＭＥＣＡ−３６７
によって規定される同じ粘膜内皮細胞を結合することが
示されている。） 勿橿爪：正常な腸間膜リンパ節のリンパ球を、細片化し
た節から回収した。これは、細片化した節を　金網に静
かに押しつけ、　ＨＢＳＳを用いて数回フラッシュしな
がら通すことにより行った。リンパ球を洗浄し、標準法
（ＢｕｔｃｈｅｒおよびＦｏｒｄ、　）ｌａｎｄｂｏｏ
ｋｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、第２巻、５７章。

ＷｅｉｒおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　ｋＨ（１９８６
）第４版、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ）の改良法を用いて、ｌＸｌ０’個の細胞／　ｍｌで
標識した。゛簡単に述べると、細胞を。

１００Ｃｉ／ｍのクロム酸ナトリウム（Ｎａｌｌ”Ｃｒ
Ｏ４＋Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂ
ｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）と３７゛Ｃで１０〜１５分毎に撹
拌しながら１時間、　２０ｍＭ　ＨＥＰＢＳおよび５％
ＦＣＳを追加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中でインキュ
ベートした。標識後、細胞をＦＣＳ層を通して遠心分離
し、動物への注射の前にＨＢＳＳで２度洗浄した。

ｂ、インビボにおける　　・　　：抗体ブロッキング活
性を評価するために、マウスにＨＢＳＳのみ。

ＭＥＣＡ−３６７、ＭＥＣＡ−８９、ＭＥＣＡ−７９、
またはＩｇＧ２ａ対照抗体Ｈｅｒｍｅｓ−１のいずれか
を連部静脈注射で投与した（１■を投与した）。いくつ
かの試験では。

マウスに２度抗体を注射投与した。第１回目は分析の１
日前に、そして第２回目は標識細胞の注射の４時間前に
注射した。大部分の試験では、標識細胞の投与の４時間
前に１度、マウスに抗体を注射投与した。３８５．００
０ｃｐｍの５ＩＣｒを担持した２ＸＩＯ？個の標識細胞
を連部静脈注射によってインビボ投与し、細胞の投与１
時間後に動物を安楽死させて種々の器官を採取した。種
々の組織へのリンパ球の局在は、パラカード（Ｐａｃｋ
ａｒｄ　）ガンマカウンタで各器官の５ＩＣｒを測定す
ることにより決定した。

結果を表３に示す、　ＭＵＣＡ−３６７およびＭＥＣＡ
−８９は粘膜のバイエル板へのリンパ球溢出を選択的に
阻害し、かつ肝ＣＡ−７９は末梢リンパ節へのリンパ球
の局在を阻害する。

（以下余白） 表３．インビボでの移動・定着のブロッキング器　　　
官 ＊腋窩、上腕、足掻 ネ＊＊局在（対照細胞の％として表わす）（以下余白） ４、　　　ＭＥＣＡ−３６７よびＭＥＣＡ　−８９によ
　て゛る　　　　−　のＭ：１０〜１２週齢のＢａ１ｂ
／ｃマウスから得た腸管膜部を細片にし、大部分のリン
パ球を金網の上からＨＢＳＳをフラッシュすることによ
って間質組織から分離した。粗間質請製物を３０ｄに懸
濁し、さらにリンパ球から間質を分離するために間質組
織を沈降させた。間質調製物をＨＢＳＳで一度洗浄し、
　２５０　Ｘｇで７分間遠心分離することにより沈澱さ
せた。粗間質単離物を溶解用トリス緩衝液（ＴＬＢ　ｉ
　２％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｓＭ
　　ＭｇＣ１ｔ　、　０．０２％ＮａＮ３．および１％
アプロチニン、１％ロイペプチン、１％ペプスタチン、
　　１ｍＭ　ＰＭＳＦ　、および２０ｍＭ　）リス−〇
ＣＩ（ｐ）１８．０））を１ＯＩＩ１１添加することに
よって溶解させ、水中で９０分間インキュベートした。

その後、溶解物を１００．０００×ｇで１５分間遠心分
離することによって上清を得た。

ＭｆＩＣＡ−３６７抗体または対照ラットＩｇＧ２ａ　
　（無関係な特異性を有するＨｅｒｓｅｓ−１）抗体を
、製造者の指示通りに１．５■抗体／ｄ充填ビーズでＣ
ＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ、　５ｉｖｅｄｅｎ）に結合させることによって
、アフィニティーカラムを作製した。次いで、透明にさ
せたリンパ節間質溶解物を、ｌｄの対照抗体カラムおよ
び１　ｍｌの特異的ＭＥＣＡ−３６７抗体カラムに室温
でｌｄ／分の流速で添加した。両力ラムとも洗浄緩衝液
（０，１％ＮＰ−４０、５００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍ
Ｍ　）リス−〇ＣＩ（ｐＨ７，４）、　　１％ロイペプ
チン、１％ペプスタチン、１％アプロチニン、および１
　ｍＭ　ＰＭＳＦ　）で充分に洗浄し、０．２Ｍ酢酸、
　５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ＮＰ−４０溶液
を用いて別々に溶出した。６００μｌの両分を集め。

標準ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、　ｐｕｓ、ｏの１Ｍト
リス−ＨＣｌを添加して各両分を中和した。画分２〜５
をプールし、　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０ミクロコンセ
ントレータ−（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて遠心分離により
２００μｊｌ！まで濃縮した。　ＭＥＣＡ−３６７抗体
カラムからの溶出液は。

免疫プロット分析によって示されるように粘膜特異的な
内皮の決定基を含有していたが、対照カラムからの溶出
液は含有していなかった。面単に述べると、２μｌの濃
縮した溶出液をニトロセルロース祇（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
Ｔｒａｎｓｐｌｏｔ）に添加し、乾燥させた。ニトロセ
ルロースを、１０％ウマ血１Ｔｎｓｒｌｌ（１０ｓＭ）
リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）、　１５０　ｍＭ　ＮａＣ
１、０，５％ツイーン２０）と共に３０分間室温でイン
キュベートすることによりブロックした。次いで、ニト
ロセルロースプロットを１００μｇ　／ｄ　ＭＢＣＡ−
３６７のＴＢＳＴ溶液と共に（あるいは対照抗体Ｈｅｒ
ｍｅｓ−１と共に）室温で３０分間インキュベートし、
室温で１０分間それぞれＴＢＳＴ中で３回洗浄した。そ
して、２次インジケーター抗体であるアルカリホスファ
ターゼ結合ヤギ抗−ラットＩｇＧ　　（Ｓｉｇｍａ　、
カタログ番号Ａ−９６４５）と、１：２００で室温にて
３０分間ゆるやかに振盪しながらインキュベートした。

プロットを上記のように３度洗浄し、　ＡＰ基質溶液（
１００ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ９，５）、　１００１
Ｍ塩化ナトリウム。

および５＋ｗＭ　ＭｇＣ１，、溶液５戚につき３３μ２
のＮＢＴにトロブルーテトラゾリウム、５０■／ｄ７０
％ジメチルホルムアミド）および１６，５μ２のＢＣＩ
Ｐ　（５−プロモー４−クロロ−３−インドリルホスフ
ェート、５０■／ｄジメチルホルムアミド）を含む）を
添加することによって発色させた。３０分後。

２０Ｉｌ１ＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，４）および５
　ｍＭ　　ＥＤＴＡを添加することによって反応を停止
させた。ＭＥＣＡ−３６７カラムの溶出液はＭＥＣＡ−
３６７と免疫反応性の物質を含有していたが、対照カラ
ムの溶出液は含有していなかった。この特異的溶出液は
ＭＥＣＡ−８９とも反応し。

ＭＥＣＡ−３６７抗原は、　ＭＥＣＡ−８９エピトープ
も有することを示した。対照抗体Ｈｅｒｍｅｓ−１は、
対照カラムまたは特異的抗体カラムの溶出液の免疫プロ
ット分析においていかなるシグナルも与えなかった。

ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）および免疫プロット分析を用
いたウェスタン分析を、　ＭＥＣＡ−３６７抗原の分子
量を同定するために行った。対照カラムまたは特異的抗
体カラムからの濃縮溶出液５０μｌを、同量のＬａｅｍ
ｍｌ　ｉ試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｔ、１９７０　、　
Ｎａｔｕｒｅ２２ヱ：　６８０）と混合して８％の５Ｏ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルに添加し。

還元条件下で電気泳動を行った。次いで、ゲルに含有さ
れる物質を電気泳動によってニトロセルロースに移動さ
せた。（製造者の指示通りにグリシン／メタノール緩衝
液の存在下でＢｉｏ−Ｒａｄのトランスプロット（Ｔｒ
ａｎｓｂｌｏｔ）装置を用いて電気プロットすることに
よる）。免疫プロット分析について上述したように、免
疫学的分析によって抗原を検出した＝１１次抗（ＭＥＣ
Ａ−３６７、または対照ゲル移動における）ｌｅｒｍｅ
ｓ　　１　）をニトロセルロースプロットと１００　ｐ
ｇ　／ｒｔｄｌの濃度で、　ＴＢＳＴ溶液２〇−中で室
温で３０分間インキュベートした。フィルターを洗浄し
、２次抗体に接触させてＡＰ基質溶液を添加することに
より発色させた（上記を参照のこと）。

この処理により、このような電気泳動の条件下では、　
ＭＥＣＡ−３６７抗原は約５６−６９ｋＤの見かけの分
子量を有する分子であることが示された。ＭＥＣ＾−８
９は同じバンドと反応し、　ＭＥＣＡ−８９およびＭＥ
ＣＡ−３６７エピトープが同じ粘膜特異的内皮細胞分子
上に存在することが確認された。

（以下余白） 実新ｌ」％ 坑体傅生意：同様の技術が、リンパ球の移動に関連する
ヒト内皮細胞に対する抗体の生産に適用され得る。２つ
の例がこの点を説明する。つまり。

第１に、上述のモノクローナル抗体ＭＥＣＡ−７９（リ
ンパ球結合についてマウスリンパ節高内皮分子ヲ規定す
るように初めから単離されている）は、ヒトＲＥＶと抗
原的および機能的に交叉反応する（リンパ節１１ＥＶに
結合すること、およびＨＥＶに結合するブロッキングリ
ンパ球による）ことが見い出されている。第２に、ヒト
ＩＩＥＶに特異的なモノクロナール抗体であるＨＥＣＡ
−４５２は、前述の実施例に記述したのと同様の方法を
用いて、ヒト扁桃の粗間質調製物で免疫したラットによ
り生産されている。

＋１ＥＶに冨むリンパ組繊源として、扁桃切除試料をス
タンフォード大学メディカルセンターの病理学科から入
手した。新鮮な、または貯蔵しておいた凍結組織を約０
．５ｃｍ３の細片に切断し、リンパ球を除去するために
ＰＲＭＩ　１６４０培地（Ｇｉｂｃｏから入手；　２０
ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，３）を含有する）を用い
て数回フラッシュしながら金網に押しつけた。金網の上
部に残った間質残遺物を集め、リンパ器官から細胞懸濁
液を調製するのに通常使用されるすりガラス製のホモジ
ナイザーを用いてＰＯＳ中でホモジナイズした。ホモジ
ネートを遠心分離しく２００×ｇ、４°Ｃにて１０分間
）、沈澱を１＝１の割合でフロインドアジュバントと充
分に混合しく最終容量１ｄ）、免疫に用いた。

３〜４力月齢のウィスターラットを、フロイント完全ア
ジュバント中の扁桃間質調製物１ｍ（０，５ｃｍ’／ラ
ット）で、腹腔内投与により免疫した。

約３〜４週間後、フロインド不完全アジバント中の扁桃
間質調製物を腹腔内投与することによりラットの追加免
疫を行った。

追加免疫から４日後、ラット肺臓細胞を上述のように５
ｐ２１０マウスミエローマ細胞と融合させた。

上清を、ヒト扁桃組織の凍結切片のＲＥＶとの反応性に
ついて、上述の免疫パーオキシダーゼ法により選択した
。ＨＥＣＡ−４５２抗体を産生ずるハイブリドーマを、
限界希釈によりサブクローン化した。

リンパ器官の切片の免疫パーオキシダーゼ染色において
、　ＨＥＣＡ−４５２抗体は扁桃、リンパ節、および臓
器関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）で観察される全てのＨＥ
Ｖを明瞭に染色した。この抗体は、　ｌｉｔ！Ｖの内皮
に対し高度に選択的であり、高内皮を強く染色した。は
とんどの研究において、他の脈管は全く染色されなかっ
た。しかしながら、しばしば肥厚性扁桃において、リン
パ系組織蓄積物の末梢の周囲の細静脈で弱い反応性が観
察された。この抗体は、リンパ組織内の毛細管、小動脈
、または大動脈の内皮に反応を示さず２機能性ＲＥＶを
欠いたリンパ器官である胸腺および肺臓、のいずれの脈
管も染色しなかった。

ＨＥＣＡ−４５２は、高内皮に加えて、リンパ器官にお
けるＴ細胞領域内で最初に分散する細胞の小集団および
肺臓の赤牌骨髄も染色した。これらの細胞はやや球形で
あり、偏心性の核をもつ単核であり。

多くのリンパ球よりも大きかった。切片を、　）ＩＥＣ
Ａ−４５２を用いて免疫組織学的に、および酸性ホスフ
ァターゼを用いて組織化学的に二重染色すると。

これらの細胞は弱い酸性ホスファターゼ陽性を示した。

これらのデータから、細胞は単球性の細胞糸に属するら
しい。

）ＩＥＣＡ−４５２＋脈管は、特にリンパ球である慢性
炎症細胞による密な浸潤の定着を除いては、多くの正常
な非リンパ組織試料切片には存在しなかった。

二ｍ■生主：ヒトリンパ球の粘膜ＨＥνへの結合をブロ
ックしうるモノクローナル抗体を生産するために、粘膜
特異的ヒト細胞系由来の推定される粘膜のホーミングレ
セプターをＨｅｒｍｅｓ　−１抗体カラムでのアフィニ
ティークロマトグラフィーにより単離した。

次いで、このレセプターを、モノクローナル抗体を生産
させるためにマウスを免疫するのに用いた。

抗体は、　　（ａ　）　Ｈｅｒａ＋ｅｓ　−１抗原との
反応性について；および（ｂ）リンパ球−ＲＥＶ結合を
ブロックする能力について選択した。

Ａ、　　　　　　　　ホーミングレセプ　−のＨｅｒｍ
ｅｓ　　１を、粘膜ＨＩＥＶ特異的ヒトＢリンパ芽球細
胞系であるＫＣＡ　　（Ｊａｌｋａｎｅｎら、　１９８
６．前出）からｇｐ８５−９５ホーミングレセプター糖
タンパクを単離するのに用いた。約７Ｘ１０１０個の）
［ＣＡ細胞を３．５１の溶解用緩衝液（２％トリトンＸ
−１ｏｏ、０．１５ＭＮａＣ１，０，０１Ｍ　）リス−
ＨＣＩ（ｐＨ７，４）　、　１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ。

１　ｍＭ　ＰＭＳＦ、　　および１％アプロチニン）中
で用い。

透明になった溶解物をＨＣＩでｐＨ５，８に調整し。

ＤＥＡＲ−セファロース６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）にかけた。結合した酸性タンパ
クを、　０．８　Ｍ　ＮａＣ１を用いてｐＨ５，２で溶
出した。溶出物を脱イオン水で等張となるまで希釈し、
　　ｐＨ７に調製し。

３種類のセファロース４Ｂカラムに順次かけた。これら
のセファロース４Ｂカラムは、それぞれ正常ラット血清
、無関係モノクロール抗体（Ｌ３Ｂ１２抗ヒトＴ２Ｏ０
）　、およびＨｅｒｍｅｓ　−１（５ｍｇ／ｒｎｌｌ、
　カラム容積３ｄ）で誘導したものである。Ｉｌｅｒｍ
ｅｓ　−１カラムに結合した物質は、５０ｍＭ）リエタ
ールアミンで溶出し、凍結乾燥した。このアフィニティ
ー結合およびそれに続く工程を２回繰り返した。

得られた抗原調製物はＨｅｒｍｅｓ　　１抗原を含んで
おり（ＳＯＳ−ＰＡＧＥで約８０％と評価された）、ア
フィニティーカラムからの少量の汚染抗原が混入してい
た。

Ｂ、モノクロ−ル　　の ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アフィニティー精製したＨｅｒ
ｍｅｓ−１抗原を含むフロイント完全アジュバント（Ｃ
ＦＡ。

×１）またはフロインド不完全アジュバント（ＩＦＡ。

その後）を用いて、６〜８週間にわたって３回腹腔内に
投与し、その後、最後に精製した抗原の生理食塩水溶液
を肺臓内に注射することにより免疫した。各免疫処置に
ついて、マウスは約２１のＫＣＡ細胞培養物から単離し
た抗体量（約１〜５μｇ）を投与された。最後の免疫処
置から３日後、　ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ
　（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６　：４９５　）の方
法に従って、肺臓細胞をマウスミエローマ細胞５ｐ２１
０　（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、　１９７Ｂ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ２５６　：　２９６）と融合させた。ハイブリッドク
ローンをヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン培
地で選択し。

上清（免疫螢光測定法でＰＢＬを染色する）をインビト
ロでのＨＨＶ分析（以下に記述する）でブロッキング活
性について分析することにより選択した。

得られたクローンの１つであるＩｌｅｒｍｅｓ　−３分
泌ハイブリッドを、限界希釈により２回サブクローン化
した。Ｈｅｒｍｅｓ　−３ハイブリドーマは、　１９８
７年７月１０日付でＡＴＣＣに受託番号１１８９４８０
で寄託されている。

リンパ球とＲＥＶとの間の相互作用のインビトロでのモ
デルは、以前に記述されている（Ｂｕ　ｔｃｈｅｒら、
　１９７９．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　　、１２３　　：
　１９９６　；ＪａｌｋａｎｅｎおよびＢｕｔｃｈｅｒ
、１９８５．　Ｂｌｏｏｄ、６６：５７７　）。しかし
。

抗−ホーミングレセプター抗体のブロッキング活性を評
価するために、少し修正を加えた。

簡単に述べると、ヒト末梢血リンパ球を、　Ｈｅｒｍｅ
ｓ　−３を含有するハイプリドーマ上清液約０．６威と
共に１時間ブレインキュベートするか、または３Ｘ１０
７個数のリンパ球あたり３０μｇのモノクローナル抗体
と共に測定用培地（２５ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ　（ｐＨ７
，３）および５％胎児ウシ血清を含有するＰＲＭ［）中
で４℃にて３０分間ブレインキュベートする。陰性の対
照のインキュベーション液は１通常、　Ｈｅｒｍｅｓ　
−１を含む上清液（Ｈｅｒｍｅｓ　　１はリンパ球のＩ
ＩＩ！Ｖ−結合能力を変えない）か、または既知の反応
性を持たないハイブリドーマ上滑液、および培地のみを
含有した。このブレインキュベーションに続いて、細胞
を標準のリンパ球−ＲＥＶ結合分析に供した。第１図に
示すように、　Ｈｅｒｍｅｓ　　３はリンパ球が粘膜１
１ＥＶに結合するのをブロックする。しかしながら、　
Ｈｅｒｍｅｓ　　３は溝膜ＨＥＶへの結合をブロックせ
ず、それゆえ、粘膜ＨＨＶ認識系からさらに関節ＲＥＶ
を認識することも示された。　標準測定法の条件、なら
びにＲＥＶ−付着リンパ球の同定およびカウントは、実
施例１に記述したようにして行った。

標準誤差とともに示されている相対付着比（ＲＡＲ）は
、３つの実験のプールされたデータを示し、いずれも類
似した結果である。対照処理されたリング球の結合は、
ｌ定のＩ？ＡＲを規定している（点線）。

Ｄ、−７’二又廼理 個々に評価したＨｆ１Ｖに結合した平均細胞数および平
均値の標準誤差を、各試料について計算した。

値は対照または参照群の値に基準化し、相対付着比（Ｒ
ＡＲ）として表した。これは、各試料群で観察される部
分的結合を、対照群の結合（その結合は１のＲＡＲを定
義する）と比較することにより行われる。

二皇生皮：　ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アフィニティー精
製したｌｌｅｒｍｅｓ　−１抗原（上述のようにＫＣＡ
または扁桃のリンパ球から単離し、　ＣＦＡに乳化した
）を腹腔的投与することにより免疫した。その後、２〜
５週間ごとにＩＦＡ中の抗原を用いて追加免疫した。

アフィニティー精製したＩｌｅｒｍｅｓ−３抗原の代わ
りに、　Ｈｅｒｍｅｓ　−１抗原をで置き換えることが
できる。

血清の力価はＰＢＬの免疫螢光染色に従って測定した（
第１段階は原液から１：２００に希釈した抗血清；洗浄
；第２段階はＰＩＴＣ抗マウスＩｇ　（Ｓｔｇｍａ　）
。

血液試料が１：ｌＯＯまたはそれ以上の希釈率で非常に
強く染色する血清を生じた時、実験動物から血液を採取
して血清を得た。マウスから毎週血液を採取しく約１ｒ
ｎ１血液／週）；血清をモニターし。

そしてもしも陽性ならば先に採取した血液と合わせてプ
ールした。力価が低下した場合には、動物を再びＩＦＡ
中の抗原で追加免疫した。

この方法で生産されるポリクローナル抗体血清は、疫沈
降分析で示されるように、ｇｐ８５−９５　Ｈｅｒｍｅ
ｓ　−１抗原に対する特異性が高かった。そして、この
抗体は、リンパ球の溝膜ＨＥＶを包含する全てのＨＥＶ
クラスへの結合をブロックし得た（第２図）。

簡単に述べると、試料あたり２Ｘ１０’個のＰＢＬを１
００μｌの抗−ｇｐ９０と共に１時間インキュベートし
た。この抗−ｇｐ９０は、希釈なしく白地のバー；Ｎ＝
２）または１：５の希釈（うずく影をつけたハ；　Ｎ　
＝２　＋　ただし、溝膜（７）ｌ（ｆ！ＶのＮ＝３は除
く）のいずれかであった。対照の処理をした細胞の結合
を、　ＲＡＲが１と定義した（点線）。

さらに対照として、ヒト白血球（ＡＬＳ　）に対して高
度に免疫したラット抗血清を、　Ｊａｌｋａｎｅｎら。

１９８６　（前出）に従ってヒト末梢全血および扁桃リ
ンパ球で・繰り返し免疫することにより生産した。

ＰＢＬのＲＥＶへの結合に対する９表面結合ポリクロー
ナル抗体の非特異的な効果を除くように意図した実験で
は（第２図）、　ｇｐ９０　Ｈｅｒｍｅｓ　−１クラス
と反応する抗体を除去するために、単離したＩｌｅｒｍ
ｅｓ−１抗原にＡＬＳを吸着させた。つまり、　　４０
０μｌの量を、約２×１０′１個の扁桃細胞の溶解物か
ら得たｇｐ９０（Ｈｅｒｍｅｓ　−１抗原）を吸収させ
た２００．ｃｌのｌｌｅｒｍｅｓ　−１結合セファロー
スビーズとともにインキュベートした。第２図の濃く影
をつけたバーは、抗−リンパ球血清（ＡＬＳ；　１　：
　８から１：２０の希釈、Ｎ＝４）で前もってコートし
たＰＢＬの結合の阻害を示す。

１１ｅｒｍｅｓ　−１抗原で吸着した後、血清はまだヒ
トリンパ球を非常に強く染色したが、　ｇｐ９ｏ吸着Ａ
ＬＳはもはや白血球のＲＥＶへの結合を阻害しなかった
（斜線を施したバー；１：８から１：２０の希釈、Ｎ＝
４）。ＡＬＳ試験に対する細胞の対照（点線）は。

未処理のＰＢＬの結合である。　興味深いことには。

このポリクロナール抗体抗−ｇｐ９０により認識される
抗原は、　Ｈｅｒｍｅｓ　−１またはＨｅｒｍｅｓ　−
３のいずれかと共に沈澱することにり完全に前もって浄
化される。このように、　Ｈｅｒｍｅｓ　−１、ｌｌｅ
ｒｍｅｓ　−３およびポリクロナール血清は全て、層膜
ＨＥｖの認識に関係する成分またはエピトープを生じる
類似の一連の白血球分子を規定する。

リンパ球のＲＥＶへの結合を効果的にブロックしうる特
異性の高い抗−ホーミングレセプター血清の生産が、こ
のプロトコルのもとで容易かつ再現性があるように実施
される。我々は、異なった材料源から単離されたＨｅｒ
ｔａｅｓ　−１抗原のいくつかの異なる調製物を用いて
、多数のマウスのこのようなポリクローナル血清を成功
裏に生産した。

（以下余白） １五〇１１ 上記にまとめた結果により次の事柄が証明される。つま
り、　ｌｌｅｒｍｅｓ−１抗原に対するポリクローナル
血清は、リンパ球と溝膜性ＲＥＶとの相互作用を阻害し
、従って、モノクローナル抗体のこの能力に関する生成
は、直接的であることが証明される。

Ｈｅｒｍｅｓ−３（ＲＥＶの粘膜クラスへの結合を選択
的にブロックする抗体）の調製法により、さらに、技術
的なモデルを提供される。このモデルは、リンパ節およ
び粘膜リンパ組織において溝膜性ＲＥＶの結合のブロッ
クのみならず、他の移動・定着性の相互作用を損なうこ
となくそのような働きを行ない得るモノクローナル抗体
を生成するのと全く同様な方法で適用され得る。

溝膜性ＲＥＶの認識を特異的にブロックし得る抗体を生
産するために、実施例３Ａの方法に従って。

次のような細胞からｌｌｅｒｍｅｓ−１／Ｈｅｒｍｅｓ
−３抗原が単離され、そして、実施例３Ｂの方法に従っ
てモノクローナル抗体を調製するために抗原が使用され
る。上記細胞としては９例えば、溝膜性ＨＥＶに対する
ホーミングレセプターの高機能レベルを発現するヒトＰ
ＢＬまたは扁桃腺リンパ球がある。Ｈｅｒｍｅｓ−３に
関して１次のような抗体を同定するために選択が行なわ
れる：（ａ）標準免疫螢光分析で滑膜性ＲＥＶ結合性細
胞（例えばＰＢＬ　）を染色し、そのため抗ホーミング
レセプターの働きを阻害しやすいような抗体；および［
有］）インビトロでの冷凍切片分析システムにおいて、
溝膜性８１！Ｖにリンパ球が結合するのを特異的にブロ
ックし得るような抗体。リンパ節または粘膜性１１Ｅν
とのブロッキング相互作用を起こすことなく溝膜性ＲＥ
Ｖに対するリンパ球の結合をブロックし得る抗体が、サ
ブクローニングおよび大スケールの抗体生産のために選
択される。

肚 本発明の用途は２体内の組織または器官における炎症お
よび免疫応答の制御である。特に１本発明の用途は、特
定の標的器官または組織において。

白血球が該特定の標的器官または組織へ入り込むことを
特異的に妨害することにより、炎症および免疫応答を選
択的に阻害する能力にある。本発明により、免疫抑制治
療により容易に引き起こされ。

非特異的に生じる免疫応答の抑制が回避される。

従って９本発明は、免疫および炎症性の反応が寄与する
よ・うな局所的疾患の治療のための好適な方法を提供す
る。

次の細胞系列は、アメリカンタイプ　カルチャーコレク
ション、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、
　２０８５２（ＡＴＣＣ）に寄託された。これらの寄託
は、特許手続およびその法令下における微生物の寄託の
国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）
の規定によりなされた。これにより生存し得る培養物が
寄託の日から３０年間にわたり保持されることが保証さ
れる。細胞系列は、ブダペスト条約により。

出願人およびＡＴＣＣ（対応する米国特許の発行により
該細胞系列の入手を制限なく保証する）の同意があれば
、入手可能となる。寄託された細胞の入手は、特許法に
より政府の権限により付与された権利に反して発明を実
施するための実施許諾であるとは解釈されない。

上記明細書の記載は、当業者がこの発明を実施するのに
充分であると考えら、れる。本発明は、寄託された細胞
系列の範囲に限定されない。なぜなら、寄託されたもの
は２本発明の一例と考えられるためである。そこに寄託
するということは、ここに開示された記載が本発明の局
面（それは、最も好適な態様を包含する）を実施するの
に不適当であることを許容するのではなく、また、それ
が示す特定の例に特許請求の範囲を限定するということ
を、寄託が意味するのではない。もちろん。

上記記載から当業者による本発明の種々の改変は好まし
いものであり、そしてそれは本発明の特許請求の範囲に
属する。

（発明の要約） 内皮細胞表面に存在する分子または層膜特異的白血球ホ
ーミングレセプターを認識し、白血球の溢出をブロック
する新規抗体が提供される。これらの抗体は１組織特異
的内皮細胞表面分子または滑膜特異的白血球細胞表面糖
タンパクを認識し。

リンパ球が血液から組織（例えば、粘膜リンパ器官１表
面リンパ節および滑膜）に移行するのをブロックする。

さらに、白血球の溢出に関係する新規内皮細胞表面タン
パク、および滑膜特異的白血球糖タンパクが開示されて
いる。上記内皮細胞表面タンパクはその分子量が約５８
．０００から６９，０００ダルトンであり１組織特異的
決定因子を発現し、そして上記滑膜特異的白血球糖タン
パクは、その分子量が約９０．０００ダルトンである。

この抗体は、白血球の溢出がその役割を果すような炎症
性疾病を有する患者を治療するための組成物に用いられ
る。

４、゛の１　な蕾゛日 第１図は、　１（ＥＶに結合する末梢血液リンパ球（Ｐ
ＢＣ）に対するＨｅｒｍｅｓ−３の効果を示す。

第２図は、ポリクローナル抗−ｇｐ９０により、リンパ
球−１（ＥＶの相互作用の３つのクラスが全て阻害され
ることを示す。

以上 図面の浄３（内容に１更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、内皮細胞への白血球の結合を阻害し得る抗体であっ
   て、約５８，０００〜６９，０００ダルトンの組織特異
   的内皮細胞表面抗原に結合する、抗体。 ２、前記内皮細胞が、粘膜リンパ組織またはリンパ節組
   織を包含する分化した組織に由来する、特許請求の範囲
   第１項に記載の抗体。 ３、滑膜に移動・定着性の白血球をブロックし得る抗体
   であって、滑膜特異的白血球ホーミングレセプターに結
   合し白血球の滑膜細静脈との相互作用を阻害する、抗体
   。 ４、前記ホーミングレセプターが、約８５，０００〜９
   ５，０００ダルトンの白血球細胞表面糖タンパクである
   、特許請求の範囲第３項に記載の抗体。 ５、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である特
   許請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の抗体
   。 ６、前記モノクローナル抗体が、ＭＥＣＡ−３６７およ
   びＭＥＣＡ−７９、またはその機能的同等物でなる群か
   ら選択される、特許請求の範囲第２項に記載の抗体。 ７、前記白血球が、リンパ球、単球および好中球でなる
   群から選択される、特許請求の範囲第５項に記載の抗体
   。 ８、特許請求の範囲第５項に記載のモノクローナル抗体
   を生産し得る継続的細胞系列であって、次の（ａ）およ
   び（ｂ）の融合細胞で実質的になる、細胞系列： （ａ）該抗体を生産する細胞；および （ｂ）ハイブリットとしたときに均一な免疫グロブリン
   を生産するミエローマ細胞。 ９、精製内皮細胞表面タンパクであって、 （ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法により決定すると、還元型で約５８，００
   ０〜６９，０００ダルトンの分子量を有し、そして、（
   ｂ）特許請求の範囲第１項に記載の抗体と複合体を形成
   することにより、インビボにおいてリンパ球の移動・定
   着性をブロックし得る組織特異的抗体を発現する。 精製内皮細胞表面タンパク。 １０、粘膜リンパ組織または表面リンパ節から単離され
   る、特許請求の範囲第９項に記載の精製内皮細胞表面タ
   ンパク。 １１、ヒトリンパ球またはリンパ細胞系列から単離され
   た滑膜特異的精製白血球糖タンパクであって、 （ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法により決定した分子量が、還元型で約８５
   ，０００〜９５，０００ダルトンであり、そして （ｂ）特許請求の範囲第３項または第４項の抗体に結合
   することにより決定すると、滑膜の内皮細静脈に特異的
   なホーミングレセプター活性を発現し、そのことにより
   白血球が滑膜細静脈に結合するのを阻害する、 滑膜特異的精製白血球糖タンパク。 １２、白血球の溢出に関する疾病をコントロールするた
   めに個体を治療するための組成物であって、特許請求の
   範囲第１項から第４項のいずれかに記載の抗体の活性成
   分としての有効量を、少なくとも一種の薬学的に許容し
   得る賦型剤と混合して含有する、組成物。 １３、Ｈｅｒｍｅｓ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９４８
   ０）であるハイブリドーマ細胞系列。