JP3048632B2

JP3048632B2 - 白血球付着レセプターβ鎖に対するモノクローナル抗体と、この抗体の製造方法と、その応用

Info

Publication number: JP3048632B2
Application number: JP2509217A
Authority: JP
Inventors: ヒルドレス，ジェイムズ，イー．
Original assignee: ザジョーンズホプキンズユニヴァーシティスクールオブメディスン
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 2000-06-05
Anticipated expiration: 2015-06-05
Also published as: AU5847190A; DE69028684D1; DE69028684T2; JPH04501365A; EP0432249A4; DK0432249T3; US6187308B1; WO1990015076A2; ATE143376T1; EP0432249B1; US6921533B2; CA2033347A1; AU666977B2; JP3288996B2; US7368109B2; EP0432249A1; ES2095876T3; US5888508A; US20050158315A1; JP2000136200A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、白血球付着レセプターβ鎖上のエピトープ
に特異なモノクローナル抗体に関するものであり、これ
は細胞間白血球付着を抑制するのに用いられる。

従来技術の説明ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、重大な免疫抑制、
感染症および神経障害を特徴とする死に到る疾患である
後天性免疫不全症候群（AIDS）の病因である。少量の循
環リンパ球がこのウイルスに感染するにすぎないが、こ
のウイルスの受容体（レセプター）CD4を保持するＴ細
胞が著しく失われる。CD4⁺−Ｔ細胞が失われることがAI
DSに特有な免疫抑制に大きく係わっていることは明らか
である。このHIVによって誘発される細胞融合の結果生
じる融合細胞（syncytium）形成がインビトロでのこの
ウイルスの主たる細胞変性作用（cytopathic effect）
であるということは知られており、インビボでのCD4⁺−
Ｔ細胞の減少を説明するものと考えられている。このCD
4はHIVエンベロープのグリコプロティインgp120との相
互作用を通じて融合細胞形成に重要な役割を果たしてい
る。

CD4受容体はAIDSの病因として大きな役割を果たして
いると考えられているが、CD4以外の未感染細胞表面上
の分子もHIVに起因する細胞融合に関連しているという
ことが報告されている。すなわち、先ず、HIV感染細胞
の未感染細胞への融合は未感染細胞表面のCD4密度とは
関係がない。さらに、非リンパ様ヒト細胞にCD4受容体
がトランスフェクションするとその細胞をHIV感染細胞
と融合させることが可能になるが、CD4をトランスフェ
クションしたマウス細胞では、このことは言えない。さ
らに、HIV粒子のCD4⁺細胞への結合に対するAIDS患者か
らの血清のブロック能と、CD4⁺未感染細胞に対するHIV
感染細胞の融合に対する同じ血清のブロック能には差が
ある。

CD4はクラスIIのMHC−制限（MHC−restricted）Ｔヘ
ルパー細胞応答においてクラスIIの主たる組織適合性錯
体（major histocompatiblility complex,MHC）分子に
直接作用する。この応答に白血球付着受容体（LAR）LFA
−１が関与するということは、抗LAF−１−モノクロー
ナル抗体（mAb）を用いて証明されている。gp120とクラ
スIIのMHCとは構造的に類似していることから、CD4への
gp120の結合はクラスIIのMHC分子とCD4との間の相互作
用を模倣しているということを示唆している。同様なア
ナロジーによって、HIVを媒介とする細胞融合におけるL
ARの役割を研究した。本発明では、ある種の抗LFA−1mA
bは未感染Ｔ細胞の芽細胞がHIVを媒介とするHIV感染細
胞への融合を完全に阻止するということを示している。
このことは、HIVで誘発される融合細胞形成においてLFA
−１がこのウイルスの主たる細胞変性機構に関係してい
ることを示している。

LFA−１分子はＴリンパ球およびＢリンパ球上の他、
マクロファージ、胸腺細胞（thymocyte）、顆粒球（gra
nulocyte）および骨髄細胞の亜集団上に発現し、175,00
0kd（α;CD 11a）と、95,000kd（β;CD 18）の非共役結
合した２つのポリペプチドによって構成されている。LF
A−１のβ鎖は他の２つの白血球抗原:Mac−１（α鎖、1
65,000kd、CD 11b）；タイプ３型の相補受容体と、LeuM
5（α鎖、150,000kd、CD 11c）；タイプ４型の相補受
容体活性に関連する可能性のある分子とに共通してい
る。これらの３つのαサブユニットは互いに寸法が異な
っているが、これら３つのサブユニット全てが単一遺伝
子または複製遺伝子によってコードされていることを示
す証拠がある。ヒトβ鎖をコードするcDNAは既にクロー
ン化されており、主構造の50％はインデグリン（integr
in）のβ鎖、ひよこ芽細胞（chick fibroblast）フィブ
ロネクチン受容体と同一であるということが分かってい
る。これらの研究等により、LFA−１グリコプロティン
類の分子は、より大きな類であるアルギニン−グリシン
−アスパラギン酸塩（RGD）アドヘッション類の一員で
あることが分かっている［インデグリン（integrins）
として知られている］。

リンホカイトの細胞間相互作用が疾患の原因となる。
AIDS等の治療に効果のある方法は現在では限られてい
る。これらの疾患に対して一般的に投与されている医薬
の使用に際しては厳しい禁忌事項が付けられている。従
って、AIDSやその他の免疫応答不全疾患におけるリンホ
カイトの細胞間相互作用を抑止できる治療薬が強く望ま
れている。

発明の要旨免疫応答不全を改善する１つの方法は、白血球付着受
容体と結合するモノクローナル抗体を用いて細胞間白血
球付着を抑止することである。細胞間白血球結合が抑止
されると、細胞から細胞への感染原の伝播が減り、免疫
応答活動が低下する。

本発明者達は、免疫応答不全疾患を改善する手段とし
て、白血球付着受容体上のエピトープに結合して白血球
が互いに付着する能力を抑止するモノクローナル抗体を
開発した。このモノクローナル抗体は治療薬または診断
薬として用いることができる。

図面の簡単な説明図1:mAbによる融合細胞形成抑制効果を示す図。

図2:H52 IgGによる融合細胞形成抑制効果の投与量に
よる変化を示す図。

図3:H52が8E5細胞ではなく、PHA芽細胞の位置で融合
細胞形成をブロックすることを示す図。

図4:mAbによるgp120のCEM細胞への結合抑制効果を示
す図。

発明の詳細な説明本発明は、白血球付着受容体β鎖に特異性を有するモ
ノクローナル抗体に関するものである。このモノクロー
ナル抗体はインビトロおよびインビボでこのβ鎖を有す
る抗原を免疫学的に検出するのに極めて有効であり、か
つ、このβ鎖を有する上記受容体を持つ細胞の免疫療法
に極めて有効である。

本発明の好ましい１実施態様で開示されたモノクロー
ナル抗体（H52）は白血球付着受容体β鎖（leukocyte a
dhesion recepter β−chain）上のエピトープに結合す
る。この特異性によってH52モノクローナル抗体および
このH52の特異性を有する類似のモノクローナル抗体は
細胞間付着を抑止するのに用いることができる。従っ
て、H52はAIDSのような免疫応答不全疾患、自己免疫疾
患および移植片拒絶反応、移植片とホストとの拒絶反応
の改善に有効である。このH52は1989年６月１日以前
に、メリーランド州ロックビルのアメリカタイプ
カルチャーコレクション（American Type Culture Co
llection,ATCC）に寄託番号HB10160で寄託された細胞株
（cell line）から得られた抗体から得られたものであ
り、この抗体の同定特性を有している。この細胞株は上
記ATCCに30年間寄託されている。

モノクローナル抗体の製造法とその特性決定法モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造
するのに用いられる方法は周知である［コーラー（Kohl
er）達、ヨーロッパ免疫学誌（European J.Immz）、第
６号、292頁、1976年］。その方法を簡単に説明する
と、BALB/cマウスをヒトに脾臓付着細胞（Splenic adhe
sion cell）で免役した後、同じタイプの細胞を補助注
射する。４日後にマウスを殺し、マウスのミエローマP3
X65 Ag8と融合した脾細胞を回収する。抗体は、ハイブ
リドーマをスクリーニングし、陽性クローンのヒトの脾
臓組織部分に対する反応性をテストして製造する。

本発明は白血球付着受容体β鎖に反応性のあるモノク
ローナル抗体と、それを製造するためのハイブリドーマ
を提供する。

本発明のモノクローナル抗体の反応性を有するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマの単離は、目的とする
モノクローナル抗体の基本反応パターンを決定する通常
のスクリーニング技術を用いて行うことができる。すな
わち、テストされたモノクローナル抗体が白血球付着受
容体β鎖と反応して細胞間付着を抑止した場合には、そ
のテストされた抗体と本発明のハイブリドーマによって
産生された抗体は同じである。

逆に、H52が特定の抗原、例えばLFA−１受容体（これ
とH52は通常反応性がある）に結合するのを被試験モノ
クローナル抗体が阻止するか否かを調べることによっ
て、不要な実験をしなくても、そのモノクローナル抗体
が本発明のモノクローナル抗体H52と同じ特異性を有す
るか否かを決定することで、モノクローナル抗体を評価
することもできる。テストしたモノクローナル抗体が、
H52による結合減少効果と同じような効果を示す場合の
ように、H52と競合する場合には、これら２つのモノク
ローナル抗体は同じエピトープと結合したと考えること
ができる。

あるモノクローナル抗体がH52の特異性を有するか否
かを調べる別の方法は、通常H52と反応性のある抗原
（例えばLFA−１受容体）と一緒にH52を予備培養し、テ
ストしたモノクローナル抗体が上記抗原と結合する能力
が阻害されるか否かを調べる方法である。テストしたモ
ノクローナル抗体が阻害された場合には、そのモノクロ
ーナル抗体は本発明のモノクローナル抗体と同一のエピ
トープ特性を有するといえる。

外来ドナー種からのモノクローナル抗体を別のホスト
受容種でインビボで用いることは一般に複雑なことでは
ないが、ドナー抗体上に存在する抗原決定基に対するホ
ストによる逆免疫反応が現れるという問題が起きる可能
性がある。場合によっては逆免疫反応が激しくなり、ホ
ストでドナー抗体をインビボで用いることができなくな
る。さらに、ホストの逆反応によってドナー抗体の細胞
間付着抑制効果を阻害することもある。ホストで起きる
逆免疫反応を無くす１つの方法はキメラ抗体を使用する
方法である［サン（Sun）達の「ハイブリドーマ（Hybri
doma）」５（supplement 1:S17、1986年；オイ（Oi）達
の「バイオテクニクス（Bio Techniques）」４（３）:2
14、1986年）］。

キメラ抗体は、抗体のヘビー（heavy）鎖およびライ
ト（right）鎖の各種領域が１つ以上の種からのDNAによ
ってコードされる抗体である。典型的なキメラ抗体は、
所望の抗原特異性の抗体を産生するドナー種に由来する
ヘビー鎖（V_H）およびライト鎖（V_L）の可変領域と、ホ
スト受容種に由来するベビー鎖（C_H）およびライト鎖
（C_L）の可変領域とで構成されている。ドナー抗体領域
の抗原決定基、特に、C_H領域の抗原決定基に対してホス
ト免疫系が曝される機会を少なくすることによって、受
容種で起きる逆免疫応答の可能性を小さくすることがで
きると考えられる。従って、例えば、上記ATCC HB 1016
0から単離したDNAによってコードされたマウスのV_H領域
およびV_L領域と、ヒトの白血球から単離されたDNAでコ
ードされたC_H領域およびC_L領域とによって構成されるキ
メラ抗体でヒトのインビボ診断薬を製造することもでき
る。

診断効果または治療効果の観点からは、１つのイソタ
イプのモノクローナル抗体が他のイソタイプのモノクロ
ーナル抗体よりも好ましい場合がある。例えば、抗体が
原因とする細胞溶解（antibody−mediated cytolysis）
の研究から、ターゲット細胞を溶解させるには、一般
に、イソタイプγ−2aおよびγ−３の未変成マウスのモ
ノクローナル抗体の方がイソタイプγ−１の抗体より効
果的であることが知られている。この効果の違いは、タ
ーゲット細胞の細胞溶解破壊に活性に寄与するイソタイ
プγ−2aおよびγ−３の能力に起因するものと考えられ
る。モノクローナル抗体の特定のイソタイプは初期融合
から選択することによって直接製造するか、クラス−ス
ィッチ変異細胞（class−switch variants）を単離する
シブ選択（sib selction）法を用いて、別のイソタイプ
のモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマから
二次的に製造することができる［ステプルースキィ（St
eplewski）達の「米国科学アカデミー予稿集（Proceedi
ngs of the National Academy of Science,U.S.
A.）」、82:8653、1985年；スピラ（Spira）達の「免疫
療法誌（Journal of Immunological Methods）」、74:3
07、1984年］。従って、本発明のモノクローナル抗体に
は、ATCC HB 10160を用いて製造されうるモノクローナ
ル抗体H52の特異性を有するクラス−スイッチ変異体を
含むものである。

本発明のモノクローナル抗体を断片、例えば、Fabお
よびＦ（ab′）₂の形で用いる場合、特に、これらの断
片を治療目的で用いる場合には、免疫応答不全の改善が
白血球付着受容体を有するこれらの細胞の補体を経由す
る白血球破壊に依存するものではないことから、任意の
イソタイプを用いることができる。

「免疫応答不全（immune response mediated disorde
r）」という用語は、ホストの免疫系が疾患状態に直接
または間接的に関与する不全を表す用語である。免疫応
答が関与する疾患の例としてはAIDS、自己免疫疾患およ
び移植片拒絶反応が挙げられる。ここで、移植片拒絶反
応という用語は、移植片に対するホストの拒絶反応と、
ホストに対する移植片の拒絶反応の両方を意味してい
る。

本発明のモノクローナル抗体はインビボおよびインビ
トロで免疫診断または免疫治療を行うのが望ましい全て
の動物に使用できる。ここで、「動物」という用語はヒ
トおよびヒト以外を含むものである。

本発明で用いる「抗体（antibody）」という用語は、
完全な分子や他に、エピトープ決定基を結合させること
が可能なその断片、例えばFabおよびＦ（ab′）₂を含む
ものである。

診断での使用本発明のモノクローナル抗体は、それらを液相で用い
るか固体担体に結合させて用いる免疫測定法（イムノア
ッセイ）で用いるのに適している。また、この免疫測定
法で用いるモノクローナル抗体は種々の方法で検出でき
るように標識化することができる。本発明のモノクロー
ナル抗体を使用可能な免疫測定法の例としては、直接ま
たは間接の競合アッセイまたは非競合アッセイが挙げら
れる。これらの免疫測定法の例はラジオイムノアッセ
イ（RIA）とサンドイッチ（イムノメトリック）アッセ
イである。本発明のモノクローナル抗体を用いて抗原を
検出する場合には、生理学的サンプルの免疫組織化学的
アッセイを含む免疫測定法フォーワード法、リバース法
または同時法で用いて行うことができる。

本発明のモノクローナル抗体は種々の担体に結合でき
る白血球付着因子の検出に使用できる。周知の担体とし
てはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチ
レン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然／変
性セルロース、ポリアクリルアミド、寒天およびマグネ
タイト等が挙げられる。担体は本発明の目的に応じて可
溶性でも不溶性でもよい。モノクローナル抗体を結合さ
せるのに適した他の担体は当業者に公知であり、また、
担体は通常の実験によって容易に見出すことができる。

種々の標識と標識化法が当業者に公知である。本発明
で使用可能な標識の例としては酵素、放射性同位体、蛍
光性化合物、化学的発光性化合物および生物学的発光性
化合物が挙げられる。モノクローナル抗体に結合させる
のに適した他の標識は当業者に公知であり、それらの標
識を見出すことは通常の実験で行うことができる。ま
た、これらの標識を本発明のモノクローナル抗体へ結合
する方法は当業者に公知の標準的な技術を用いて行うこ
とができる。

本発明のモノクローナル抗体によって検出される白血
球付着因子β鎖は、生物液や組織中に存在するであろ
う。本発明では検出可能な量の白血球付着因子β鎖を含
んだサンプルなら任意のサンプルを用いることができ
る。一般にはサンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血
清等の液体か、組織、排泄物等の固体または半固体であ
る。

感度がさらに高い別の検出方法としては、抗体を低分
子量ハプテンに結合させ、次いで、二次反応によってこ
のハプテンを特異的に検出する方法である。ハプテンと
しては、例えばアビジンと反応するバイオチンや、特定
の抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェニル、ピリド
キサルおよびフルオロレセインが一般に用いられる。

本発明で用いる「エピトープ」という用語は、本発明
のモノクローナル抗体と特異的に相互作用することがで
きる任意の決定基を含む用語である。エピトープの決定
基は一般にアミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活
性な表面基で構成され、一般には特定の３次元構造特性
と特定の電荷特性とを有している。

本発明のモノクローナル抗体をインビボで抗原の検出
に用いる場合には、検出可能な状態に標識されたモノク
ローナル抗体を診断に有効な量だけ投与する。「診断に
有効」という用語は検出可能な状態に標識されたモノク
ローナル抗体の量が、そのモノクローナル抗体に特異な
白血球付着受容体β鎖を有するサイトを検出することが
できるのに十分な量で投与されるということを意味して
いる。

投与された検出可能な状態に標識されたモノクローナ
ル抗体の濃度は、白血球付着受容体を有する細胞への結
合がバックグウウンド信号に対して十分に検出可能な量
でなければならない。また、最大のターゲット対バック
グウンド信号比を得るためには、検出可能な状態に標識
されたモノクローナル抗体を循環系から迅速に取り除く
のが望ましい。

インビボ診断用の検出可能な状態に標識されたモノク
ローナル抗体の投与量は固体の年齢、性別および疾患の
程度等の因子によって変わるが、この投与量は約0.01mg
/m²〜約20mg/m²の範囲、好ましくは約0.1mg/m²〜約10mg
/m²の範囲で変えることができる。

インビボ画像診断の場合には、使用可能な検出機器の
型式が放射性同位体を選択する上での主要なファクター
であり、所定の検出機器で検出可能な崩壊型を有する放
射性同位体を選択しなければならない。インビボ画像診
断の場合の放射性同位体の選択で重要な他のファクター
は、放射性同位体が、ターゲットによって最大摂取され
た時に検出可能な程度の長い半減期を有し、しかも、ホ
ストに対する有害な放射能の量が最小となるようにする
ことである。理想的には、インビボ画像診断で用いる放
射性同位体は粒子放出が無く、通常のγ線カメラで容易
に検出可能な140〜250keVの範囲のフォトンを多量に発
生させるものである。

インビボ診断用の放射性同位体は中間官能基を用いる
ことによって免疫グロブリンに直接または間接的に結合
させることができる。金属イオンとして存在する放射性
同位体を免疫グロブリンに結合されるのにしばしば用い
られる中間官能基は二官能性キレート化剤、例えばジエ
チレントリミンペンタ酢酸（DTPA）、エチレンジアミン
テトラ酢酸（EDTA）および類似の分子である。

本発明のモノクローナル抗体は磁気共鳴画像化（MR
I）または電子スピン共鳴（ESR）等のインビボ診断用の
常磁性同位体で標識することもできる。一般に、診断画
像を視覚化するための従来の任意の方法を使用できる。
カメラ画像用には通常γ線およびポジトロンを出す放射
性同位体が用いられ、MRI用には常磁性同位体が用いら
れる。

本発明のモノクローナル抗体は、個人の免疫応答不全
疾患の回復過程をモニターするために使用できる。すな
わち、白血球数の増減または各種体液中に流れる抗原の
濃度変化を測定することによって、免疫応答不全疾患の
改善を目的とする特定の治療法が有効か否かを決定する
ことができる。

治療での使用「改善する」という用語は、治療を受けた動物での免
疫応答不全疾患の悪影響が軽減するということを意味す
る。「治療に有効」という用語は、使用したモノクロー
ナル抗体の量が免疫応答に起因する疾患の原因を改善す
るのに十分な量であるということを意味する。

本発明のモノクローナル抗体は、本発明のモノクロー
ナル抗体に反応するエピトープで白血球付着受容体β鎖
を発現する白血球を原因とする免疫応答不全疾患を有す
る動物の免疫治療にも使用することができる。この治療
で使用する場合のモノクローナル抗体の投与量は約10mg
/m²〜約2000mg/m²の範囲で変えることができる。

免疫療法で使用する場合には、本発明のモノクローナ
ル抗体を標識しなくてもよく、あるいは治療剤によって
標識してもよい。これらの治療剤は本発明のモノクロー
ナル抗体に直接または間接的に結合することができる。
間接結合の１つの例は、スペーサ片を用いる方法であ
る。このスペーサ片は不溶性でも可溶性でもよく〔ディ
ーナー（Diener）達「サイエンス（Science）」231:14
8、1986年〕、ターゲットサイトでモノクローナル抗体
分子から医薬を放出させることができるように選択する
ことができる。免疫療法用に本発明のモノクローナル抗
体に結合できる治療剤の例としては医薬、放射性同位
体、レクチン、トクシン等がある。

本発明のモノクローナル抗体とコンジュゲート可能な
医薬には、医薬に分類的される化合物、例えばマイトマ
イシンＣ、ダウノルビシンおよびビンブラスチン等が含
まれる。

本発明のモノクローナル抗体を放射性同位体とコンジ
ュゲートして免疫療法で用いる場合には、特定のイソタ
イプが他のイソタイプより好ましいことがある。これは
白血球分布とイソタイプの安定性および放出特性等のフ
ァクターに依存する。必要な場合には、上記のインビボ
診断法によって白血球分布を調べることもできる。免疫
応答不全疾患によっては、あるエミッタが他のエミッタ
ーより好ましい場合がある。一般い、免疫療法ではα粒
子とβ粒子を放出する放射性同位体が好ましい。好まし
い放射性同位体は²¹²Bi等の飛程が短く、高エネルギー
のα線エミッタである。本発明のモノクローナル抗体と
結合される治療用放射性同位体の例としては、¹²⁵I、
¹³¹I、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹²Bi、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd
および¹⁸⁸Reが挙げられる。

レクチンは一般に特定の糖部分に結合する植物材料か
ら単離される蛋白質である。また、多くのレクチンは細
胞と癒着して、リンホカイトを刺激することができる。
しかし、リシンは免疫療法で使用されてきた毒性レクチ
ンである。これは、毒作用をサイト特異的に送るように
毒性を有するリシンのα−ペプチド鎖を抗体分子に結合
させて作られる。

トクシンは植物、動物または微生物によって作られる
有毒物質であり、量が多いと致死に到ることが多い。ジ
フテリアトキシンは治療で使用可能なコリネバクテリウ
ムジフテリア（Corynebacterium diphtheria）の作る
物質である。この毒性はαサブユニットとβサブユニッ
トからなり、適切な条件で単離することのできる。毒素
成分Ａを抗体と結合して、本発明のモノクローナル抗体
に特異的に有する白血球付着因子β鎖を発現させる白血
球ヘサイト特異的に運ぶのに使用することができる。

本発明のモノクローナル抗体に結合可能な他の治療医
薬は公知のものであるか、当業者が見出すことができ
る。

本発明のモノクローナル抗体の投与量範囲は免疫応答
不全疾患の症状が改善されて所望の効果がでるのに十分
な量である。しかし、この投与量は望ましくない副作
用、例えば交差反応、過敏性反応等を引き起こすような
量ではならない。一般に、投与量は患者の年齢、状態、
性別、疾患の程度によって変わり、当業者が適宜決定す
ることができる。投与量は個々の医師が調節することが
できる。投与量は約0.1mg/m²〜約2000mg/m²、好ましく
は１回当たり約0.1mg/m²〜約500mgの範囲で、一日一回
または数回、数日間投与することができる。

一般に、本発明のモノクローナル抗体を治療医薬とコ
ンジュゲートして投与した場合には、インビボ診断画像
用の場合に比べて、より少ない投与量で使用することが
できる。

本発明のモノクローナル抗体は、注射または時間をか
けてパーフュージョンによって非経口投与できる。ま
た、本発明のモノクローナル抗体は静脈内、腹膜組織
内、筋肉内、皮下、体腔内または経皮で投与することが
できる。

非経口投与用調製物は、無菌の水溶液または非水溶
液、サスペンジョン、エマルジョン等を含む。非水溶媒
の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブオイル等の植物油とオレイン酸エチル
等の注射可能な有機エステルが挙げられる。水溶性担体
には食塩水または緩衝媒を含む水、アルコール／水溶
液、エマルジョンまたはサスペンジョン等が含まれる。
非経口用賦形剤には塩化ナトリウム溶液、リンゲル（Ri
nger）デキストローズ、テキストローズと塩化ナトリウ
ム、乳酸化リンゲル液または固体オイル等が含まれる。
静脈内投与用賦形剤には流体／栄養分を運ぶ補給物、電
解質補給物（リンゲルデキストローズをベースとするも
の等）等が含まれる。防腐剤、その他の添加剤、例えば
抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガ
ス等を添加することもできる。

本発明はさらに本発明のモノクローナル抗体を含む医
薬または薬理組成物の調製方法を提供する。この医薬
は、本発明のモノクローナル抗体に反応する白血球付着
受容体β鎖を発現する白血球に起因する免疫応答不全疾
患の治療に用いられる。

以上、本発明を一般的に説明したが、本発明は以下の
実施例の説明からより明らかになろう。しかし、以下の
実施例は本発明を何ら限定するものではない。

実施例１抗付着モノクローナル因子抗体の調製雌のBalb/cマウス（６〜８週齢）に10⁷個のヒトの脾
臓付着細胞のリン酸緩衝液を入れた生理食塩水を腹腔内
注射した。この処置を14日後と21日後に再度繰り返し
た。最後の注射の４日後、免疫されたマウスの１匹から
脾臓を摘出して単細胞サスペンションを調製した。コー
ラー（Kohlre）とミルステイン（Milstein）の方法によ
って、50％ポリエチレングリコールを用いてこの脾細胞
をBalb/c由来のP3X 653 Ag 8ミエローマ細胞に融合させ
た［「ネーチャア（Nature）」、256:495、1976年］。
成長するハリブリドーマコロニーを形成した後、上記細
胞からの上澄液を凍結したヒト脾臓のクライオスタット
断面（４μ）上で、免疫組織化学法により、ヒト抗原に
対する抗体のテストした［ナイム（Naiem）達「免疫法
誌（J.Immun.Meth.）」、50、145,1982年］。H 52（H 5
2.Gl.2）をヒト細胞上での免疫組織化学およびラジオイ
ムノアッセイと、ヒト細胞からのラジオイムノ沈降法と
でスクリーニングして、クローニングおよび再クローニ
ングした。

実施例２モノクローナル抗体による融合細胞形成の抑止 PHA芽細胞（PHA−blast）への8E5細胞の融合に対する
mAbの効果を融合細胞形成アッセーで調べた。8E5とA3.0
1細胞株とを完全培地［10％ FBS（Hyクローン）と10mM
HEPESとを補給したPRMI−1640］中に保持した。8E5細胞
株はLAVに感染したA3.01細胞株の生存クローンである。
8E5細胞は全LAVゲノムの１つのコピーを有しているが、
逆トランスクリプターゼ遺伝子内での点突然変異によっ
て非感染ウイルス粒子を産生する。8E5細胞はHIVエンベ
ロープグリコプロテインを発現し、CD4−陽性PHA芽細胞
およびＴ細胞株と混合した場合、野生型ウイルスに感染
したＴ細胞の培養中に観察されるのと同じ細胞変性効果
を生じる。

完全培地中で、濃度0.25μg/mlのPHA（Wellcome Diag
nostics）の存在下で３日間、末梢血液の単核細胞を培
養することによってPHA芽細胞を産生した。この細胞をP
BSで３回洗浄し、濃度５×10⁶mlで完全培地中に再懸濁
させた。mAbは濃度25μg/mlの精製IgGの形態で用いた。
PHA芽細胞を同じ体積（30μｌ）のモノクローナル抗体
または片側面積96ウェルのプレート［コスター（Costa
r）］のウェル中で媒質と混合させ、30分間、25℃で培
養した。次に、8E5細胞30μｌを添加し、湿ったCO₂培養
器内で、37℃で10時間培養した。対照ウェルは、同じ数
の非感染A.301細胞で培養したPHA芽細胞で構成した。ア
ッセイでは、8E5細胞にPHA芽細胞およびCD4⁺T細胞株を
各々混合した後４〜10時間以内に10〜50個またはそれ以
上の融合した細胞からなる融合細胞または気球様細胞が
形成される。培養を続けると急速に融合細胞じ死滅する
ことが生体色素排除テストによって調べられる。

HIVを仲介とする細胞融合での効果を調べるために、
ヒト白血球抗原に対するmAbをPHA芽細胞と8E5細胞との
共培養に添加した。テストしたmAbはH 52、抗CD 18（LF
A−１β）;MHM.24、抗CD 11a（LFA−１α）;H5A4、抗CD
11b（Mac−１α）;H5A5、抗CD 45（白血球共通抗原）;
MHM.5、抗HLA−A,B,C）;Leu 3a、抗CD 4である。これら
の抗体は全てIgG 1、ｋイソタイプである。

図１に示すように、H52はLFA−１のβサブユニット
（CD−18）上のエピトープに対して融合細胞の形成を完
全に抑止した。また、細胞融合はmAb（MHM.24）によっ
てLFA−１のαサブユニット（CD 11a）に対して完全に
ブロックされた。しかし、極めて少量ながら細胞融合が
稀に観察されるので、mAb（MHM.24）は、mAb H 52より
効果が低い。LAR群の別の一員であるMac−１（補体受容
体、タイプ３、CD 11b）に対するmAb;H5ARは8E5細胞のP
HA芽細胞への融合には全く効果がない。また、mAbを認
識する互いに無関係な２つの細胞表面蛋白質、すなわち
MHM.5、抗−HLA−A,B,CおよびH5A4と抗白血球共通抗原
（CD 45）によっては融合は影響されない。これら２つ
の抗原はLARまたはPHA芽細胞と同じまたはより高い密度
で発現するので、これら２つの抗原が融合を阻止するこ
とができないということは、抗LAR抗体による阻害は非
特異性の立体構造効果によるものではないことを示して
いる。CD 4へのgp 120の結合を阻止することが示された
CD 4に対するmAbであるLeu 3aは、8E5のPHA芽細胞への
融合を完全に抑止した。Leu 3aによる融合抑止とPHA芽
細胞および非感染A.301細胞間融合がない（図１の対
照）ということから、融合にはHIVが介在しているとい
うことが確認された。市販の多くのmAbはgp 120に対し
て融合を阻止することができないことがアッセーで分か
っている。PHA芽細胞および8E5細胞は細胞融合アッセー
で１時間以内の混合で極めて大きな集合体を形成した。
これらの集合体は、H 52、MHM.24およびLeu 3aによって
完全に抑止されたが、他のmAbではされなかった。mAb H
52による融合細胞形成抑止効果は、PHA芽細胞を突然変
異ウイルスに感染させた8E5細胞または野生型のHIV（HT
LV−111B）に感染させたCEM−Ｔ細胞株と混合した場合
に観察された。

実施例３ H 52による融合細胞形成の抑止実施例１の記載で産生したPHA芽細胞を、精製したH 5
2またはPLM−2 IgGの濃度を種々変えて培養した後、8E5
細胞を添加した。PLM−２はLFA−１を仲介とする機能を
阻害しないCD 18に対するIgG,k,mAbである。アッセーは
実施例１と全く同様に行った。融合細胞をトリパンブル
ー（0.1％）を添加した後に低倍率対物レンズ（40×）
を用した逆相顕微鏡で数えた。図２に示したデータは、
複製ウェルの8E5細胞10⁶個当たりの平均融合細胞数であ
る。

H 52 mAbは、濃度３μg/ml以上で8E5−PHA芽細胞融合
を完全に抑止が観察され、その効果は投与量に依存法す
る（図２）。mAb H 52によるLFA−１媒介性リンパ球付
着機能の抑止も同じような投与量依存性を示す。LFA−
１付着機構に関与しないCD 18エピトープに対するmAbで
ある。PLM−２は全ての濃度で融合に影響しない（図
２）。

H 52で融合が抑止されるレベルを決定するための調査
も行った。PHA芽細胞と8E5細胞（2.5×10⁶）を完全培地
中のみまたは精製H 52またはPLM−2 IgGを25μg/ml含む
完全培地0.5ml中で氷上で１時間培養した。細胞をペレ
ット化した後、PBS 10mlで２回洗浄し、未結合のmAbを
除去した。次いで、抗体で被覆されたPHA芽細胞と8E5細
胞とを完全培地に再懸濁させ、被覆させていない8E5細
胞およびPHA芽細胞と各々混合した後、実施例１の方法
で、10時間、37℃で培養し、上記の方法で融合細胞形成
を観察した。

上記研究により、抗LFA−１抗体によるリンホカイト
の相互作用の抑止効果は、２つの細胞型がLFA−１を発
現した場合でも１方向性であるということが分かった。
融合細胞形成に対する抗LFA−1 mAbの作用が同じく一方
向性であるかどうかを調べるために、LFA−１の発現を
フローシトメトリー（flow cytometry）で解析した。
8E5上での発現はは芽細胞での発現よりかなり少ない
が、8E5細胞およびPHA芽細胞のいずれもLFA−１を発現
した。

各細胞型をmAb H 52または対照mAb PLM−２で予め被
覆し、洗浄して未結合のmAbを除去し、融合細胞形成を
アッセイした。H 52で予め被覆されたPHA芽細胞は融合
をほぼ完全に抑止したが、8E5細胞に同様な処理をして
も効果はなかった（図３）。この結果から、抗LFA−１
抗体は、PHA芽細胞のレベルでの融合は抑止するが、HIV
に感染した8E5細胞の融合はブロックしないことう示し
ている。このことは、CD4⁺細胞上のLARは8E5細胞に発現
したリガンドとを相互作用することを示唆している。

実施例４ H 52によるHIV gp120結合の抑止立体構造効果によってHIVエンベロープのグリコプロ
テインgp 120とCD 4との相互作用をブロックする硫酸デ
キストラン等の非特異剤がHIVを媒介とする細胞−細胞
融合を抑止するということは知られている。従って、CD
4⁺細胞表面上でのLFA−１へのmAb H 52の結合を調べ
て、H 52がgp 120のCD4への結合を阻止しているか否か
を調べた。

gp 120を精製するために、感染したPHA芽細胞の培養
上澄み液からHIVをペレット化（110,000×ｇ、1.5時
間）し、PBSで１回洗浄した。PBS中にウイルスを再懸濁
させ、激しく攪拌してgp 120を破断した後、110,000×
ｇで遠心分離した。生成した上澄み液を300,000ダルト
ンカットオフのセントリコン（Centricon）フィルタ
を用いて濃縮した。主としてgp 120とウシ血清アルブミ
ン（BSA、10〜30％）とからなる保持タンパク質を標準
的なクロロアミン−Ｔ方法を用いて放射沃素化した。標
識したタンパク質（２〜５μCi/g）をBSA濃度の高い
（２％）のBSA中に希釈して¹²⁵I−BSAの結合を無くし
た。CD4⁺−CEM細胞（５×10⁵）を完全培地中で、25g/ml
のLeu 3a、H 52、PLM−2 mAbと一緒に予備培養（実施例
１を参照）した後、放射沃素化したgp 120、50ngを添加
した。０℃で、１時間培養した後、細胞を２回洗浄し
て、結合された放射性標識を測定した。バックグラウン
ド結合は、標識されていないgp 120を200倍の過剰濃度
にして細胞を予備培養して測定した。前記の結果と同じ
く、Leu 3a mAb（抗−CD 4）で予め被覆された細胞はgp
120と結合しなかったが、mAb H 52または対照mAbのPLM
−２で予め被覆した細胞はgp 120への結合に対して抑止
効果を全く示さなかった。この結果から、gp 120のCD 4
に対する結合はこのmAbによってブロックされていない
ので、mAb H 52による融合細胞形成の抑止はHIV受容体
機能との干渉によるものではないということが分かっ
た。

上記、本発明を完全に説明したが、本発明の精神及び
範囲を逸脱しない限り、当業者が種々の変更および修正
が可能であるということは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 51/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＫＣ１２Ｐ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 Ａ６１Ｋ 43/00 (Ｃ１２Ｐ 21/08 49/02 ＡＣ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．17（1987）ｐ．1317−1322 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．61 （1987）ｐ．261−267 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ. 262［12］（1987）ｐ．5576−5580 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．158 （1983）ｐ．1785−1803 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】白血球付着受容体β鎖のエピトープに結合
して細胞間白血球付着を抑止するモノクローナル抗体を
産生するATCC寄託番号HB 10160の連続ハイブリドーマ細
胞株。
【請求項２】上記受容体がLFA−１、Mac−１およびLeu
M5からなる群の中から選択されるものである請求項１に
記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項３】上記ATCC寄託番号HB 10160細胞株がそのイ
ソタイプスイッチ変種を含む請求項１に記載のハイブリ
ドーマ細胞株。
【請求項４】ATCC寄託番号HB 10160のハイブリドーマ細
胞株によって産生される、白血球付着受容体と反応性
し、細胞間白血球付着を抑止するモノクローナル抗体。
【請求項５】上記受容体がLFA−１、Mac−１およびLeu
M5からなる群の中から選択されるものである請求項４に
記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】ATCC寄託番号HB 10160として寄託されたハ
イブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体お
よびそのイソタイプのスイッチ変種の特異性を有する検
出可能な状態に標識されたモノクローナル抗体またはそ
の断片を、診断上に有効な量だけ、病因を含むと思われ
る原因源と接触させ、この原因源に上記抗体が結合した
か否かを調べることからなるヒト以外の動物の白血球付
着受容体の検出方法。
【請求項７】検出をインビボで行う請求項６に記載の方
法。
【請求項８】上記の検出可能な標識が放射性同位体およ
び常磁性体からなる群の中から選択される請求項６また
は７に記載の方法。