JP4148537B2 - Ｃｄ４０ｃｒレセプター及びそれに対するリガンド - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、CD40CRと称される、 CD40 Ｂ細胞抗原に対するカウンターレセプター、及びCD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子を含む、このレセプターに対する可溶性リガンド類に関する。これは、少なくとも部分的には、可溶性のCD40／免疫グロブリン融合蛋白がヘルパーＴ細胞膜上の新規の39kD蛋白レセプターに結合することにより、ヘルパーＴ細胞仲介性Ｂ細胞活性化を阻害することができたという発見に基づいている。本発明は、実質的に精製されたCD40CRレセプター；CD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子と共に抗体も含む、CD40CRの可溶性リガンド；及びアレルギー又は自己免疫疾患の治療において特に有用となりうる、Ｂ細胞活性化の調節方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ミッチソン、ベナセラフ及びラフ（Mitchison, Benacerraf and Raff）による研究は初めて、 Th 及びＢ細胞の間の物理的相互作用が体液性の免疫応答に欠かせないものであることを示唆した。その後の研究は、 Th がクラスIIの主要組織適合遺伝子複合体(MHC) に適合性のある、抗原提示Ｂ細胞と物理的共役体を形成すること（ヴィテッタら（Vitetta et al.) 、イミュノロジカル・レビュー、99巻、第193-239 頁、1987年）及び Th に応答するのはこれらの共役体中のＢ細胞であること（バートレットら（Bartlett et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 143巻、第1745-1754 頁、1989年）を証明した。 Th 由来のリンフォカインがＢ細胞に対して強力な成長及び分化作用を及ぼすという発見に伴い、活性化 Th により近位放出された可溶性因子が相互作用性Ｂ細胞の活性化を媒介することが提唱された。しかしながら、分子クローン化されたリンフォカイン類のいずれも、単独又は組み合わせても、Ｂ細胞周期エントリーを誘導する能力は現さなかった。可溶性因子とは異なり、活性化 Th からの形質膜分画はＢ細胞周期エントリーを誘導した（ホジキンら（Hodgkin et al.) 、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第2025-2034 頁、1990年；ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年）。活性化 Th からの精製形質膜分画を用いた研究は、活性化 Th の膜上に発現された蛋白が体液性免疫の開始の原因となることを示唆した（ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年；バートレットら（Bartlett et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第3956-3962 頁、1990年）。
【０００３】
活性化 Th からの精製形質膜（PMAct ) はこの効果器の機能を調べるために用いられてきた（ホジキンら（Hodgkin et al.) 、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第2025-2034 頁、1990年；ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年）。活性化 Th からのPMAct は、抗原非特異的クラスII非制限様式でＢ細胞周期エントリーを誘導する活性を発現したが、休眠 Th からのもの(PM rest) はしなかった。さらに、PMAct により発現される活性は 4-6時間の活性化時間、すなわち新たな RNA合成を要し、天然の蛋白であることが示された（バートレットら（Bartlett et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第3956-3962 頁、1990年）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、CD40CRと称される、 CD40 Ｂ細胞抗原に対するカウンターレセプター、及びCD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子を含む、このレセプターに対する可溶性リガンド類に関する。これは、少なくとも部分的には、可溶性のCD40／免疫グロブリン融合蛋白がヘルパーＴ細胞膜上の新規の39kDレセプター蛋白（CD40カウンターレセプターとして“CD40CR" と称する）に結合することにより、ヘルパーＴ細胞仲介性Ｂ細胞活性化を阻害することができたという発見、及び、 MR1と称される、この39kDレセプターを指向するモノクローナル抗体がＢ細胞のヘルパーＴ細胞仲介性活性化を阻害することができたという発見に基づいている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、実質的に精製されたCD40CRレセプター；CD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子と共に抗体も含む、CD40CRの可溶性リガンド；及びＢ細胞活性化の調節方法を提供する。
本発明の特定の態様において、対象におけるＢ細胞活性化を、該対象のヘルパーＴ細胞をCD40CRの可溶性リガンドの有効量に接触させることにより阻害することができる。このようなＢ細胞活性化の阻害は、アレルギー又は自己免疫疾患の治療において特に有用となりうる。
【０００６】
本発明の一つの利点は、それが抗原特異性のない免疫応答の局面に介在しうることにある。アレルギーに対する現行の治療法の多くは特定の抗原類に対する脱感作を含み、感受性に関連した抗原を同定するために各患者を検査する必要がある。実際的な問題として、可能性のあるアレルゲンのそれぞれ及び全てに対する患者の反応を網羅的に分析することは事実上不可能である。さらに、殆どの自己免疫状態において原因となる抗原は一般に未知であるか、又は該疾患プロセスに無関係なことさえある。抗原非特異的 CD40/CD40CR相互作用に関する本発明は、アレルギー又は自己免疫に関連した抗原の特性付けの必要性がなくて済む。従って、本発明は例えば花粉症或いはプロカインアミド誘発性狼瘡においてのような免疫原が分かっていない、又は免疫原が複数の成分を有するアレルギー状態の治療において特に有利に使用することができる。本発明は、例えばアナフィラキシーの治療のような免疫活性化の急性治療においても有用となりうる。
【０００７】
本明細書中で用いる略号は以下の意味を有する。
Ig 免疫グロブリン
mab モノクローナル抗体
PM Act 活性化ヘルパーＴ細胞から調製した形質膜
PM rest 休眠ヘルパーＴ細胞から調製した形質膜
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
rIL4 組み換えインターロイキン 4
rIL5 組み換えインターロイキン 5
SN 上清
Th ヘルパーＴ細胞
Th 1 D 1.6 の I-Ad - 制限式ウサギ免疫グロブリン特異性クローンを起源とする。
【０００８】
添付の図は以下を示す。
図１．PMAct によるＢ細胞 RNA合成の誘導におけるモノクローナル抗体及びCD40-Ig の作用。
パネルＡ．休眠Ｂ細胞を Th 1 からのPM rest 又はPM Actと共に培養した。25μg/mlの抗-CD4、抗-LFA-1或いは抗-ICAM-1 、又はこれらのそれぞれの組合せ（各25μg/ml）をPM Actの入ったウェルに加え、Ｂ細胞 RNA合成を[3H]- ウリジンの取り込みによって測定した。Ｂ細胞 RNA合成は、培養開始後42時間から48時間までを評価した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような５実験を表している。
【０００９】
パネルＢ．休眠Ｂ細胞を Th 1(●、▲）又は Th 2(□) からのPM Actと共に培養した。 Th 1 PM Actを含む培養（●、▲）に、CD40-Ig （▲）又は対照蛋白であるCD7E-Ig(●）を量を増やしながら加えた。 Th 2 PM Actを含む培養（□) には、CD40-Ig を量を増やしながら加えた。Ｂ細胞 RNA合成は、培養開始後42時間から48時間までを評価した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような３実験を表している。
【００１０】
パネルＣ．休眠Ｂ細胞を LPS（50μg/ml）又はPM Actと共に培養した。培養に、CD40-Ig （25μg/ml；斜線）又はCD7E-Ig(25μg/ml；黒色）を加えた。 RNA合成は、パネルＡに述べたように測定した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような３実験を表している。
図２．CD40-Ig はＢ細胞分化及び増殖を阻害した。
【００１１】
パネルＡ．休眠Ｂ細胞をPM Act、rIL4 (10ng/ml)及びrIL5 (5ng/ml) と共に培養した。培養開始時、又は培養開始後１、２或いは３日目に、CD40-Ig 又はCD7E-Ig(25μg/ml）を加えた。培養６日目に、個々のウェルからSNを採収し、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、抗アイソタイプ特異性 ELISAを用いて IgM（■）及び IgG1(●）について定量した。PM Act、rIL4及びrIL5の存在下で（CD40-Ig は加えていない）、IgM 及び IgG1 の濃度はそれぞれ 4.6μg/ml及び 126 ng/mlであった。０日目にCD7E-Ig(25μg/ml）を加えた培養は、それぞれ 2.4μg/ml及び 89 ng/ml のIgM 及び IgG1 を生産した。rIL4及びrIL5の非存在下では、IgM 又は IgG1 は検出されなかった。結果は、そのような３実験を表している。
【００１２】
パネルＢ． Th 1 を抗-CD3と共に16時間休眠又は活性化させ、放射線を照射し、IL4 (10ng/ml) の存在下で休眠Ｂ細胞（４×104/培養）と共に培養した（１×104/ウェル）。０ないし25μg/mlのCD40-Ig(▲）又はCD7E-Ig(●）を培養に加えた。培養開始後66から72時間に、ウェルを 1.0μCiの[3H]- チミジンでパルスし、採収した。点線は、Ｂ細胞の休眠 Th に対する応答を示す。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような２実験を表している。
【００１３】
図３．CD40-Ig は活性化 Th 上に発現された分子を検出したが、休眠 Th 上には検出しなかった。休眠 Th 及び活性化 Th を採収し、融合蛋白と共に20分間、４℃でインキュベートした後、 FITC-共役化ヤギ抗-hIgG(25μg/ml）を加えてインキュベートした。陽性の細胞及び MFIのパーセントを、最低 5000 細胞／サンプルの分析により測定した。結果は、そのような６実験を表している。CD40-Ig 結合はグラフ中の黒い部分により示されている。
【００１４】
図４．CD40-Ig は活性化 Th 1 のライセートから 39 kD蛋白を免疫沈降させた。 Th 1 を不溶化された抗-CD3と共に16時間、休眠又は活性化させた。休眠又は活性化 Th からの[35S]-ラベル化蛋白を、精製抗体又は融合蛋白 (1-10μ）で免疫沈降させた。該ゲル結果はそのような３実験を表している。
図５．誘導された 39 kDの Th 膜蛋白に特異的なモノクローナル抗体 (mab)は、PMAct によるＢ細胞 RNA合成の誘導を阻害した。休眠Ｂ細胞及びPMAct を、10μg/mlの抗- α／β、抗-CD3、CD40-Ig 又は MR1のそれぞれと共に培養した。 RNA合成を図１で述べたように測定した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような３実験を表している。
【００１５】
図６． MR1及びCD40-Ig は活性化 Th 上に発現された同じ分子を認識した。
パネルＡ．活性化 Th を MR1又は対照 Ig で蛍光染色した。CD40-Ig 及び MR1が活性化 Th への結合において競合するのかどうかを評価するために、徐々に高濃度にしたMR1 又は対照となるハムスターIg（抗- α／β TCR) を抗-CD40 (20 μg/ml）と共に加えた。４℃で20分間インキュベートした後、該サンプルを洗浄し、 FITC-共役化mab 抗- ヒトIgG1と共にインキュベートした。結果は、そのような３実験を表している。
【００１６】
パネルＢ．[35S]-メチオニンラベル化活性化 Th からの蛋白をMR1 (10 μg/サンプル）又はCD40-Ig (10 μg/サンプル）と免疫沈降させ、PAGE及びフルオログラフィーにより分析した。結果は、そのような２実験を表している。
図７．CD40-Ig のヒト細胞株への結合。種々のヒトＴ細胞株にビオチンラベル化CD40-Ig を与え、流動血球計算法により結合を評価した。
【００１７】
図８及び図９．
スタメンコヴィックら（Stamenkovic et al.) 、EMBOジャーナル（EMBO J.)、８巻、第1403-1410 頁、1989年、による、CD40 cDNA のヌクレオチド配列。膜内外領域を下線で示す。
図10．
CD40-Ig を発現させるために用いることができるプラスミドの概略図。ΔCD40の融合部位のアミノ酸配列をCD40の図解部分の下に示す。
【００１８】
本発明は、実質的に精製されたCD40CRレセプター；CD40を含む融合分子と共に抗体も含む、CD40CRの可溶性リガンド；及びＢ細胞活性化の調節方法を提供する。
開示を明瞭にするために、本発明の詳細な説明を以下の章に分けて述べるが、限定するためではない：
（ｉ）CD40CRに結合するリガンド；
（ii）CD40CRの特性決定に用いる方法；
(iii）精製CD40CRの調製；
（iv）CD40CRに結合するリガンドの使用；及び
（ｖ）CD40CRの使用。
（１）CD40CRに結合するリガンド
本発明は、(i) CD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子、及び(ii)抗体又は抗体断片、を含むCD40CRの可溶性リガンドを提供する。
【００１９】
ここで用いる“可溶性”という用語は、本発明のリガンドが永久に細胞形質膜に結合しているわけではないことを示している。本発明の可溶性リガンドは、しかしながら、脂質、蛋白、或いは炭水化物分子を含む非細胞性固形支持体、ビーズ、小胞、磁気粒子、繊維等に付着させてもよく、又は移植体或いは小胞内に封入してもよい。
【００２０】
このようなリガンドのCD40CRに結合する能力は、該リガンドが CD40-Ig（以下参照）又は MR1（以下参照）と同じ蛋白に結合することを証明することにより確認できる。
本発明のリガンドは適当な担体とともに医薬用組成物中に含まれてもよい。
(1.1) 融合分子
本発明は、CD40CRのリガンドである可溶性の融合分子を提供する。このような融合分子は第二の分子に結合したCD40蛋白の少なくとも一部分を含む。CD40の該部分は、好ましくはCD40膜内外ドメインを欠く。本発明により用いてもよいCD40蛋白の部分は、CD40CRに結合できる、例えば、 MR1又は CD40-Igと同じ蛋白に結合することを示すことができる部分のような、いずれの部分でもよいと定義される。
【００２１】
使用してもよい第二の分子にはペプチド類及び蛋白類、脂質類、及び炭水化物類が含まれ、本発明の好ましい態様においては、免疫グロブリン分子或いはその部分（Fv、Fab 、F(ab′)2、又は Fab′断片等）或いは CD8、又は B7 のような他の付着分子でもよい。該第二分子は非ヒト或いはヒト原料のいずれから誘導してもよく、キメラ性でもよい。該第二分子はさらに、酵素、トキシン、成長因子、リンフォカイン、抗増殖剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生剤、ビンカアルカロイド、プラチナ配位化合物、放射性同位元素、又は蛍光化合物でもよい。
【００２２】
本発明の融合分子は、化学合成、又は好ましくは組み換えDNA 法によって製造してもよい。
例えば、CD40蛋白の少なくとも一部分をコード化している核酸配列は、適当な発現ベクター中で第二分子をコード化している核酸配列に結合していてもよく、その後、酵母、バキュロウィルス、又は交差遺伝動物を含む哺乳動物発現系のような、原核生物又は、好ましくは、真核生物発現系中に発現されてもよい。
【００２３】
或いは、CD40蛋白の少なくとも一部分を組み換えDNA 技術を用いて発現させ、その後第二分子に化学的に共役させてもよい。
CD40を含む融合分子は、準備された混合液から、電気泳動法又は、CD40或いは該第二分子のいずれかに結合するリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製してもよい。CD40に結合するリガンドには、HB9110の受入れ番号を持ち、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されているハイブリドーマによって製造されるようなG28-5 、及び CD40CR 等の抗-CD40 抗体類が含まれるが、それらに限定されるものではなく、以下の章（２）及び（３）でより十分に述べる。該第二分子が免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である場合は、抗−免疫グロブリン抗体を含むアフィニティーカラムを使用してもよい；該第二分子が Fc 断片を含む場合は、プロテインＡカラムを使用してもよい。
【００２４】
本発明の好ましい態様により、CD40の一部分を、膜内外ドメインより上流で切断されたCD40蛋白をコード化する核酸配列を用いて製造してもよい。そのような核酸配列は、スタメンコヴィックら（Stamenkovic et al.) 、EMBOジャーナル（EMBO J.)、８巻、第1403-1410 頁、1989年、に述べられているような、CD40抗原をコード化しているcDNAを含むプラスミドを、PstI (P)及びSau 3A (S3) 制限酵素で切断することにより製造してもよい。できた P/S3 断片を、P 及びBam HI（B)で切断した同じプラスミド中にサブクローニングして切断CD40遺伝子を製造してもよい（図８及び９参照）。
【００２５】
本発明の特定の非限定的な態様において、免疫グロブリン配列と共にCD40の少なくとも一部分を含むリガンドを製造するのに用いられる発現ベクターは、好ましくは、ウィルス由来の ori領域、細菌性 ori領域、細菌性選択可能マーカー及び、CD40の少なくとも一部分をコード化する DNA配列をサブクローニングさせる制限エンドヌクレアーゼ部位によって免疫グロブリン不変領域をコード化する DNA配列から分離されポリアデニル化シグナル配列が続く真核生物プロモーター及びエンハンサー配列を含んでもよい（図10参照）。
【００２６】
本発明の特定の態様において、切断された CD40 遺伝子は、Mlu I 及び B切断を用いて、アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年、に述べられているような免疫グロブリン融合プラスミド中にサブクローニングして、該融合分子 CD40-IgをコーディングするプラスミドpCD40-Igを形成してもよい（図８及び９参照）。その後 CD40-Ig融合蛋白を、pCD40-Igプラスミドを COS細胞中にトランスフェクションして一時的発現系を形成することにより製造してもよい。製造された CD40-Igは該 COS細胞上清から回収して、アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年、に述べられているように、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。
(1.2) 抗体
本発明の可溶性リガンドは、 CD40CR に結合する抗原結合部位を含む抗体分子、モノクローナル抗体分子、又はこれらの抗体分子の断片を含んでもよい。このようなリガンドはさらに、蛋白、脂質、炭水化物、酵素、トキシン、成長因子、リンフォカイン、抗増殖剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生剤、ビンカ・アルカロイド、プラチナ配位化合物、放射性同位元素、又は蛍光化合物であってもよく抗体分子又は断片に結合していてもよい第二分子を含んでもよい。
【００２７】
該リガンドがモノクローナル抗体、又はその断片である場合、該モノクローナル抗体は、連続的培養細胞株による抗体分子の製造を提供する何らかの技術を用いて CD40CR に対して製造してもよい。例えば、ケーラー及びミルステイン（Kohler and Milstein ；ネイチャー（Nature）、256 巻、第495-497 頁、1975年）により初めて開発されたハイブリドーマ技術は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズバーら（Kozbar et al.)、イミュノロジィ・トゥデイ（Immunology Today）、４巻、第72頁、1983年）及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのEBV-ハイブリドーマ技術（コールら（Cole et al.)、モノクローナル抗体と癌治療、アラン R. リス（Alan R. Liss）社、第77-96 頁）等のような、より最近になって利用できるようになった他の技術と同様に、本発明の範囲に入る。
【００２８】
該分子のイディオタイプを含む抗体断片は周知の技術により作り出すことができる。例えば、そのような断片には以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：該抗体分子をペプシンで処理することにより作り出すことができるF(ab′)2断片；該F(ab′)2断片のジスルフィド架橋を還元することにより作り出すことができるFab ′断片；該抗体分子をパパインで処理することにより作り出すことができるF(ab′)2断片；及び該抗体分子をパパイン及び還元剤で処理してジスルフィド架橋を還元することにより作り出すことができる2Fab又はFab 断片。
【００２９】
本発明はさらに、モリソンら（Morrison et al.)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス U.S.A. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、81巻、第6851-6855 頁、1984年、又はモリソンら（Morrison et al.)による欧州特許出願第85305604.2号（公開第0173494 号、1986年３月５日公開）に示されているような、当技術分野において周知の技術によって製造されるキメラ抗体を提供する。
【００３０】
抗体を製造するための免疫源は CD40CR を含むいずれの材料でもよい。例えば、活性化 Th を免疫源として用いてもよい。或いは、以下の（３）章で示すように製造した実質的に精製された CD40CR を使用してもよい。活性化 Th を免疫源として使用する場合、抗血清を活性化 Th 細胞に対する反応性について試験してもよいが、休眠 Th 細胞に対して試験してはならない。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、該可溶性リガンドは MR1モノクローナル抗体である。以下の方法を該 MR1モノクローナル抗体を製造するのに用いたが、これは CD40CR を指向する他の抗体を作り出すために用いてもよい。
ハムスターに5-10×106 活性化 Th 1 細胞(D1.6)を腹腔内に一週間おきに６週間投与して免疫化した。ネズミ Th 1 に対する血清滴定が約1:10,000よりも大きくなった時点で、免疫ハムスター脾臓細胞及び NSIを用いてポリエチレングリコールで細胞融合を行った。成長過程のハイブリドーマを含むウェルからのSNを、休眠 Th 1 及び活性化 Th 1 について流動血球計算法によりスクリーニングした。活性化 Th を選択的に認識する mabを製造する特定の一ハイブリドーマをさらに試験して、MR1 を誘導するためにサブクローニングした。MR1 は腹水中で生産され、イオン交換 HPLC により精製した。ハイブリドーマMR1 はHB11048 の受託番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。
【００３２】
本発明は、MR1 がその標的抗原に、又は CD40-Igがそのレセプターに結合するのを拮抗阻害することができるモノクローナル抗体及びその断片を含むリガンドも提供する。
（２） CD40CR の特性決定に用いる方法
CD40CR は（i) CD40 、CD40の少なくとも一部を含む融合細胞類、及びMR1 のような抗体類に結合できること；(ii)Ｂ細胞周期エントリー、増殖、及び分化を刺激することができる機能的特性；及び(iii) 細胞内分布、によって特徴付けることができる。
(2.1) リガンド結合能
CD40CR は、 CD40 、CD40を含む融合細胞類、及び CD40CR を指向する抗体類のようなリガンド類に結合できることによって特徴付けることができる。
【００３３】
以下でより詳しく考察するように、幾つかの技術が CD40CR の特性決定に使用された。例えば、 CD40-Ig及びMR1 は同じ39kD分子を認識することが示された。 CD40-Ig及びMR1 は両方とも、放射性同位元素でラベルされた Th ライセートからの39kD蛋白を免疫沈降することが見出された（図 5b)。さらに、 CD40-Igによる39kD蛋白の免疫沈降は、MR1 によって認識される抗原を Th ライセートから除去した。
(2.2) Ｂ細胞活性化能
CD40CR は又、Ｂ細胞周期エントリー、増殖、及び分化を刺激することができることによって特徴付けることができる。
【００３４】
例えば、活性化 Th 細胞からの形質膜（PM Act）はＢ細胞 RNA合成を誘導するが、休眠 Th 細胞からの形質膜（PM rest ）は誘導しないことが見出された（図 1a)；Ｂ細胞活性化を示すものである、この誘導は抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1 のような抗体による影響を受けなかった。 CD40-Ig又はMR1 は、しかしながら、図 1b 及び図６に示されるように、PM Act誘導性Ｂ細胞活性化を阻害できることが見出された。
【００３５】
Ｂ細胞活性化の誘導は、[3H]- ウリジンの RNAへの取り込み（Ｂ細胞が分化すると、RNA 合成が増加する）又は細胞増殖に伴う DNA合成を測定する[3H]- チミジンの取り込み等の技術により、測定してもよい。Ｂ細胞増殖に対する CD40CR の効果を最適に測定するために、インターロイキン-4（IL-4）を約10 ng/mlの濃度で培地に加えてもよい。
【００３６】
或いは、Ｂ細胞活性化を免疫グロブリン分泌の関数として測定してもよい。例えば、実質的に精製された形態、又は PM 中に存在するかそれ以外の形態の CD40CR をIL-4(10 ng/ml)及びIL-5（5 ng/ml)と共に休眠Ｂ細胞に加えてもよい。３日間培養した後、さらに培地を加えてもよい。培養６日目に、個々の培養からの上清（SN) を採収し、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように IgM及び IG1を定量してもよい。
(2.3) 細胞内分布
CD40CR は又、その細胞内分布によって特徴付けることができる。例えば、 CD40-Igは流動血球計算法により評価すると、活性化 Th には結合するが休眠 Th 1 には結合しないことが観察された（図３）。さらに CD40-Igは、ジャーカット細胞、HSB2細胞、及びヒト末梢血液からの活性化Ｔ細胞に結合することが観察されたが、CEM 細胞、HPBALL細胞、又はネズミ胸腺腫細胞には有意の結合を示さなかった。
【００３７】
例えば、限定するものではないが、特定の細胞型(“試験細胞")上の CD40CR の存在は次のように流動血球計算法により評価してもよい。試験細胞は休眠 Th 細胞（マイナス対照）及び活性化 Th 細胞（プラス対照）と平行して試験してもよい。全細胞は約１×105 細胞／50μl の濃度でリガンド（例： CD40-Ig又はMR1 ）と共に４℃で20分間インキュベートした後、FITC共役化抗リガンド抗体で処理してもよい。ヨウ化プロピヂウムを全サンプルに２μg/mlの最終濃度になるように加えてもよい。流動血球計算分析をその後、例えば BD FACSCAN 上で行ってもよい。前方散乱対側面散乱、及び赤色陰性（ヨウ化プロピヂウム排除のため）により細胞の陽性ゲート処理した後、生育可能な細胞の対数緑色蛍光を確認してもよい。
（３）精製 CD40CR の製造
本発明は実質的に精製された CD40CR を提供する。そのような CD40CR は、以下の方法により、活性化ヘルパーＴ細胞、ジャーカット、及び HSB2 細胞のような CD40CR を持つ細胞から製造してもよい。
【００３８】
形質膜は、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、活性化 Th 1 細胞のような適当な細胞から不連続性ショ糖勾配沈降により調製してもよい。 CD40CR はその後、弱い洗剤により粗膜抽出物を分離し、さらに分子篩いクロマトグラフィーに続いて、固体支持体に結合した適当なリガンド（例：MR1 又は CD40-Ig）を用いるアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降（例： CD40-Ig又はMR1 による）、且つ／又はゲル電気泳動のいずれかを行うことにより単離してもよい。
【００３９】
得られた蛋白は約39kDの分子量を持つと考えてもよい。
本発明は適当な担体と共に医薬用組成物の中に含まれていてもよい可溶性 CD40CR （すなわち、無細胞）を提供する。それはさらに、ペプチド、蛋白、脂質、炭水化物、酵素、トキシン、成長因子、リンフォカイン、抗増殖剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、ビンカアルカロイド、プラチナ配位化合物、放射性同位元素、又は蛍光化合物であってもよい第二分子に結合している CD40CR を提供する。
【００４０】
本発明はさらに、化学合成又は組み換え DNA技術により製造されている実質的に精製された CD40CR を提供する。例えば、 CD40CR に対する遺伝子は、活性化ヘルパーＴ細胞から調製されたcDNAをλgt10発現系中に挿入した後、MR1 又は CD40-Igの結合によりスクリーニングして CD40CR 発現クローンを同定することにより単離してもよい。或いは、活性化ヘルパーＴ細胞から調製されたcDNAを COS細胞中にトランスフェクションしてもよく、その上清をMR1 又は CD40-Igでスクリーニングして CD40CR 生産者を同定してもよい。 CD40CR に対する遺伝子をその後、当技術分野において周知の発現系を用いて CD40CR を発現させるのに用いてもよい。
（４） CD40CR に結合するリガンドの使用
本発明は CD40CR に結合するリガンドを利用するＢ細胞活性化を調節する方法を提供する。特にそれは、 CD40CR に結合する有効濃度のリガンドにＢ細胞及び Th 細胞の混合物をさらすことを含む、Ｂ細胞活性化を阻害する方法を提供する。使用してもよいリガンドは上記の（１）章に述べられている。本発明の方法はインビトロ又はインビボで実行してもよい。有効濃度とは、当技術分野において周知の何らかの技術（上記の（２）章に示されたものを含む）により測定して、最低約30％、好ましくは約75％、Ｂ細胞活性化を阻害するリガンド濃度を言う。本発明の好ましく、特定の、非限定的な態様によると、 CD40-Igをリガンドとして使用してもよく、その場合、有効濃度は最低約10μg/mlでもよい。別の特定の、非限定的な態様では、モノクローナル抗体 MR1を使用してもよく、その場合、有効濃度は最低約10μg/mlでもよい。該方法をインビボで実行する場合、リガンドの有効濃度とはリガンドのプラズマ濃度又は局所濃度のことであってもよい。例えば、全体としての免疫系への影響を制限するためには局所的な領域中でＢ細胞活性化を阻害することが望ましい。
【００４１】
特定の態様において、本発明はＢ細胞活性化が関連する疾病を患う対象を治療する方法で、該対象に治療用量の、 CD40CR に結合するリガンドを投与することを含む方法を提供する。対象はヒトでなくてもよいが、好ましくはヒトでもよい。
Ｂ細胞活性化が関連する疾病には、アレルギー（アナフィラキシーを含む）；薬物誘導狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、成人慢性関節リューマチ、若年性関節リューマチ、強皮症、シェーグレン症候群などを含む自己免疫状態；エプスタイン−バー感染、及びヒト免疫不全ウィルスの感染を含むレトロウィルス感染を含む、Ｂ細胞を伴うウィルス性疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
Ｂ細胞活性化はヒト免疫不全ウィルス複製の潜伏期からの誘導に関連することが示唆されているため、本発明のリガンドを AIDS 又は ARCがまだ発症していない HIV陽性者に投与することが望ましいであろう。
リガンドは、適当な医薬用担体中にあって、静脈内、腹腔内、皮下、鞘内、関節内、或いは筋肉内注射、及び経口、鼻腔内、眼内及び直腸投与を含む、当技術分野において周知の何らかの方法により投与してもよく、ミクロスフェア、リポゾーム、且つ／又は徐放移植体中に含まれてもよい。
【００４３】
治療用量のリガンドとは、Ｂ細胞活性化の有害な臨床作用を有意に減少させる量と定義され、使用するリガンド及び治療する状態により変えてもよい。 CD40-Igを使用する場合、治療濃度は全身（プラズマ濃度）又は局所のいずれにおいても約10μg/mlでもよい。 MR1を使用する場合、治療濃度は全身（プラズマ濃度）又は局所のいずれにおいても約10μg/mlでもよい。
【００４４】
本発明のさらに別の態様において、上記の方法は、 Th 細胞が殺生されるか又は障害を受け、 Th 細胞の破壊の結果としてＢ細胞活性化が減少するように、トキシン又は代謝拮抗物質を含むリガンドを利用してもよい。
本発明のリガンドは活性化Ｔ細胞をラベルするのに用いてもよく、これはＴ細胞障害の診断において有用となりうる技術である。この目的で、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物又は他の検出可能ラベルを含むリガンドをインビトロ又はインビボでＴ細胞にさらしてもよく、結合量を定量してもよい。
【００４５】
本発明のリガンドは又、例えば成長因子等の物質を活性化Ｔ細胞に届けるのに用いてもよい。
（５） CD40CR の使用
本発明は、上記の（３）章に述べられたように調製された CD40CR 又は CD40CR を含む分子を利用するＢ細胞活性化の調節方法を提供する。特に、Ｂ細胞を有効濃度の CD40CR にさらすことを含む、Ｂ細胞活性化を促進する方法を提供する。該方法はインビボ又はインビトロで実行してもよい。有効濃度とは、当技術分野において周知の何らかの技術（上記の（３）章に示されたものを含む）により測定して、最低約30％、Ｂ細胞活性化を誘導するレセプター濃度を言う。本発明の特定の、非限定的な態様によると、 CD40CR の濃度は局所又は全身において約10μg/mlでもよい。
【００４６】
特定の態様において、本発明は体液性免疫の減退が関連する免疫不全疾患を患う対象を治療する方法で、該対象に治療用量の CD40CR を投与することを含む方法を提供する。対象はヒトでなくてもよいが、好ましくはヒトでもよい。
体液性免疫の減退が関連する免疫不全疾患には、体液性免疫が関わる遺伝疾患と同様に、後天的免疫不全症候群、悪性腫瘍又は悪液質が関連する免疫不全症、例えば化学療法又は放射線照射療法によって起きる医原性免疫不全症が含まれる。
【００４７】
CD40CR は、適当な医薬用担体中にあって、静脈内、腹腔内、皮下、鞘内、関節内、或いは筋肉内注射、及び経口、鼻腔内、眼内及び直腸投与を含む、当技術分野において周知の何らかの方法により投与してもよく、ミクロスフェア、リポゾーム、且つ／又は徐放移植体中に含まれてもよい。
CD40に対する CD40CR の治療用量は、免疫グロブリン産生を少なくとも約30％増加させる量と定義される。
【００４８】
さらに別の態様において、 CD40CR をトキシンに共役させた後に、CD40を発現するＢ細胞を破壊するのが好ましいと思われる状況下で対象に投与してもよい。そのような状況の例には、臓器移植を受けた患者、多発性骨髄腫或いは他のＢ細胞悪性腫瘍の患者、又は自己免疫疾患の患者が含まれる。
CD40CR はCD40を発現するＢ細胞をラベルするのに用いてもよく、これはＢ細胞障害の診断において有用となりうる技術である。この目的で、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物又は他の検出可能ラベルに結合したレセプターをインビボ又はインビトロでＢ細胞にさらしてもよく、結合量を定量してもよい。
【００４９】
CD40CR は又、それに結合している分子をＢ細胞に届けるのに用いてもよい。
【００５０】
【実施例】
実施例１
材料と方法
メスの DBA/2J マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社、バー・ハーバー、ME）を Th クローンの成長を支える充填細胞の調製のために、及び休眠Ｂ細胞の調製で用いた。
【００５１】
D 1.6 、 I-Ad - 制限式ウサギ Ig 特異性 Th クローン（カートジョーンズら、（Kurt-Jones et al.)、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J. Exp. Med.)、166 巻、第1774-1787 頁、1987年）をウスターのマサチューセッツ大学のディビット・パーカー博士（Dr. David Parker）から入手した。D 1.6 をここでは Th 1 と呼ぶことにする。
【００５２】
Th 1 を、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、40μg/4ml の PBS／ウェルでコーティングされたクラスターウェル（６ウェル、コーニング社、NY）中で抗-CD3と共に16時間培養した（８×106/ウェル）。
形質膜を、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、不連続性ショ糖勾配沈降により調製した。
【００５３】
休眠脾臓Ｂ細胞を、デフランコら（Defranco et al.)、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J. Exp. Med.)、155 巻、第1523頁、1982年、に述べられているように、不連続性パーコール勾配沈降により調製した。70-75 ％（密度：1.087-1.097)パーコール界面から単離された細胞は典型的には＞95％ mIg+ であり、均質の、低い近前方光線散乱を有し、Con A に反応しなかった。
【００５４】
以下の mabを、放射線照射され骨髄再形成されたマウスの腹水からイオン交換 HPLC により精製した：抗-CD3:145-2C11 （レオら（Leo et al.) 、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス U.S.A. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、84巻、第1374-1378 頁、1987年）；抗- α，β:H57-597；抗-CD4:GK1.5（ワイルドら（Wilde et al.）、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 131巻、第2178-2183 頁、1983年）；抗-ICAM:YN1/1.7.4 （プリエトら（Prieto et al.)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（Eur. J. Immunol.）、19巻、第1551-1557 頁、1989年）；抗-LFA-1:FD441.8（サルミエントら（Sarmiento et al.）、イミュノロジカル・レビュー（Immunol. Rev.)、68巻、第135 頁、1982年）；及び抗- ラット／ハムスターκ鎖:RG-7 （スプリンガー（Springer）、ハイブリドーマ（Hybrid.)、１巻、第257-273 頁、1982年）。
【００５５】
CD40融合蛋白は、CD40抗原をコード化しているcDNAを含むプラスミド（スタメンコヴィック及びシード（Stamenkovic and Seed) 、EMBOジャーナル（EMBO J.)、８巻、第1403-1410 頁、1989年）を、制限酵素PstI (P)及びSau 3A (S3) で切断することにより製造した。この P/S3 断片を、P 及びBam HI（B)で切断した同じプラスミド中にサブクローニングした。これにより、膜内外ドメインより上流で切断されたCD40蛋白をコード化するCD40Δが製造された。CD40Δをコード化する DNA断片をその後、Mlu I 及び B切断を用いて、免疫グロブリン融合プラスミド中にサブクローニングした（アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年）。 CD40-Ig融合蛋白を、 COS細胞中に一時的にトランスフェクションして製造し、アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年、に述べられているように、プロテインＡカラム上で精製した。
【００５６】
インターロイキン 4 (IL4)：組み換えマウスIL4 は、C.マリツェヴスキィ博士及びK.グラブステイン博士（Drs. C. Maliszewski and K. Grabstein）、イムネックス社、シアトル、WA、の御好意により入手した。
インターロイキン 5 (IL5)：組み換えマウスIL5 は、R&D リサーチ社、サレント、CA、から購入した。
【００５７】
３×104 休眠Ｂ細胞を A/2微量滴定ウェル（コスター社、ケンブリッジ、MA）中の50μl cRPMI 中で培養した。これらのウェルに 0.5μg の Th 1 又は Th 2 膜蛋白を加えた。42から48時間の間に、ウェルを2.5 μCiの 3H-ウリジン（ニューイングランドヌクレア社、ボストン、MA）でパルス処理し、採収して、放射能を液体シンチレーション分光測定により測定した。結果を cpm／培養 +/-s.d.で表した。
【００５８】
休眠Ｂ細胞を上に述べたように培養した。培養ウェルに 0.5μg の Th 1 膜蛋白、IL4 （10 ng/ml）及びIL5 （５ ng/ml）を加えた。培養３日目に、さらに50μl の cRPMIを加えた。培養６日目に、個々のウェルからの SN を採収し、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、IgM 及び IgG1 を定量した。
【００５９】
４×104 休眠Ｂ細胞を A/2微量滴定ウェル（コスター社、ケンブリッジ、MA）中の50μl cRPMI 中で培養した。これらのウェルに、１×104 休眠又は活性化された、放射線照射（500 ラド）された Th 1 及びIL4 （10 ng/ml）を加えた。培養３日目に、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、ウェルを１μCiの 3H-チミジンでパルス処理した。
【００６０】
ハムスターに5-10×106 活性化 Th 1 細胞(D1.6)を腹腔内に一週間おきに６週間投与して免疫化した。ネズミ Th 1 に対する血清滴定が約1:10,000よりも大きくなった時点で、免疫ハムスター脾臓細胞及び NSIを用いてポリエチレングリコールで細胞融合を行った。成長過程のハイブリドーマを含むウェルからのSNを、休眠 Th 1 及び活性化 Th 1 について流動血球計算法によりスクリーニングした。活性化 Th を選択的に認識する mabを製造する特定の一ハイブリドーマをさらに試験して、MR1 を誘導するためにサブクローニングした。MR1 は腹水中で生産され、イオン交換 HPLC により精製した。
【００６１】
休眠 Th 及び活性化 Th （抗-CD3で16時間）を採収し、１×105 細胞／50μl で、融合蛋白と共に20分間、４℃でインキュベートした後、 FITC-共役化ヤギ抗- ヒト(h)IgG(25 μg/ml；サザン・バイオテクノロジィ社、バーミンガム、AL）を加えてインキュベートした。全サンプルに、ヨウ化プロピヂウムを２μg/mlの最終濃度になるように加えた。流動血球計算分析を、 BD FACSCAN 上で行った。前方散乱対側面散乱、及び赤色陰性（ヨウ化プロピヂウム排除のため）により、細胞の陽性ゲート処理を行った後、生育可能な細胞の対数緑色蛍光を確認した。陽性の細胞及び MFIのパーセントを測定するために、最低 5000 個の生育可能な細胞を分析した。MR1 での染色は、FITC- 共役化 RG7、マウス抗- ラット／ハムスターκ鎖 mabを使用した。
【００６２】
Th 1 を不溶化した抗-CD3と共に16時間、休眠又は活性化させた。休眠及び活性化 Th （20×106/ml）からの蛋白を 1 mCiの[35S]-メチオニン／システインで１時間ラベルした時点で、RPMI/10%FCS 中で２回洗浄し、細胞ペレットをノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 137巻、第1718-1726 頁、1986年、に述べられているように、抽出バッファー中で溶解した。精製抗体又は融合蛋白(1-10 μg)をライセート 500μl (5×106 細胞当量）に加え、４℃で16時間処理した。その時点で、該ライセートを50μl の圧縮プロテインＡ−セファロースの入った試験管に移した。ペレット状の該プロテインＡ−セファロースを再懸濁し、試験管を攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした。該サンプルをその後、高ストリンジェンシー洗浄バッファーで３回洗浄した。ペレット状の該プロテインＡ−セファロースを30μl の SDSサンプルバッファーに再懸濁し、10％ポリアクリルアミドゲル上を泳動させた。ゲル泳動の後、該ゲルを固定し蛍光間接撮影を行った。
結果
PM ActによるＢ細胞周期エントリーの誘導を媒介する細胞表面分子を明らかにするために、 Th 膜蛋白に対するmab をPM Act及びＢ細胞の培養液に加えた。PM ActはＢ細胞の RNA合成をPM rest について観察されたものより８倍誘導した（図1a）。抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1 を単独で、又は組み合わせて加えても、PM ActによるＢ細胞 RNA合成の誘導を阻害しなかった。
【００６３】
ヒトの系では、抗-CD40 mab がＢ細胞増殖を誘導し（クラーク及びレーン（Clark and Lane）、アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジィ（Ann. Rev. Immunol.) 、９巻、第97-127頁、1991年）、それによりCD40をＢ細胞に対する重要な引き金分子として関わらせることが示されていた。CD40がPM ActによるＢ細胞 RNA合成の誘導に関わっているのかどうかを測定するために、ヒトCD40の細胞外ドメインの可溶性融合蛋白及びヒト IgG1 (CD40-Ig) の Fc ドメインをPM Act及びＢ細胞の培養液に加えた。 Th 1 及び Th 2 に由来するPM Actを調製し、Ｂ細胞 RNA合成を刺激するために用いた。CD40-Ig を培養液に加えることにより、PM Actによって Th 1 及び Th 2 から誘導されるＢ細胞 RNA合成の用量比例的阻害が起きた（図1b）。PM Actによって Th 1 及び Th 2 から誘導されるＢ細胞 RNA合成の 1/2最大阻害は約５μg/ml CD40-Igであった。CD7E-Ig 融合蛋白（ダムル及びアルフォ（Damle and Aruffo）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス U.S.A. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、88巻、第6403-6407 頁、1991年）は25μg/mlを用いた時でさえも効果を示さなかった。
【００６４】
CD40-IgがＴ−非依存性活性剤によるＢ細胞活性化を阻害するかどうかを調べるために、LPS 及び CD40-Igの存在下でＢ細胞を培養した。２日目に、 RNA合成を評価した（図1c）。 CD40-IgはLPS によるＢ細胞活性化の阻害においては効果を示さなかったが、Ｂ細胞のPM Actに対する応答は阻害した。
PM Act、IL4 及び IL5の存在下では、Ｂ細胞は多クローン的に分化してIgを生産した（ホジキンら（Hodgkin et al.) 、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第2025-2034 頁、1990年；ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年）。この過程における CD40 シグナルに必要な条件を評価するために、 CD40-Igを培養開始時、又はその後の培養中の日に加えた。培養開始時に CD40-Igを加えると（図2a）、その非存在下における対照レベルに比較してポリクローナル IgM及び IgG1 の生産を95％より多く阻害した。対照的に、 CD40-Igを培養１日目及び２日目に加えると IgM及び IgG1 生産に対して、あったとしても、極わずかな阻害効果しか示さなかった。これらのデータは、24時間後にはもはやCD40によるシグナルはＢ細胞のIg分泌への分化に対する必須条件ではないことを示している。
【００６５】
ここまでのデータはCD40がPM ActによるＢ細胞活性化に関係していることを示した。無傷の生きた活性化 Th によるＢ細胞活性化にもCD40が関係することを確認するために実験を行った。 Th 1 を不溶化抗-CD3と共に16時間活性化して、採収し、放射線照射した。放射線照射した該 Th 1 をIL4 の存在下でＢ細胞と共に培養し、Ｂ細胞増殖を培養３日目に測定した。 Th 1 がIL4 を生産しないために、 Th 1 とのＢ細胞増殖を達成するのに外からのIL4 源が必要であった（ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 143巻、第1807-1814 頁、1989年）。 CD40-Igは、PM Actについて観察されたのと同様に、放射線照射された Th によるＢ細胞増殖の誘導を用量比例的に阻害した（図2b）。マイナス対照であるCD7E-Ig は、測定できるような効果は表さなかった。
【００６６】
活性化 Th 1 がCD40に対する結合蛋白を発現するかどうかを調べるために、休眠及び活性化（16時間) Th 1 を CD40-Ig又はCD7E-Ig で染色した後、FITC- 抗-HIgG で処理した。 CD40-Igの結合を流動血球計算により評価した（図３）。抗-CD3で16時間活性化した Th 1 は、休眠 Th 1 とは異なり、 CD40-Igで56％が染色プラスを示したが、対照CD7E-Ig では染まらなかった。 CD40-Ig結合蛋白を同定するために、 Th 1 蛋白を[35S]-メチオニン／システインで生合成的にラベルし、 CD40-Ig又はCD7E-Ig で蛋白を免疫沈降させた。該免疫沈降蛋白を SDS-PAGE 及び蛍光間接撮影法により解析した（図４）。39kDの見かけの分子量を持つ顕著なバンドが、１及び10μg のCD40／サンプルで用量比例的に免疫沈降した。対照として、抗- クラス I mabは 55kD のバンド及び低分子量バンド、β2 ミクログロブリンを免疫沈降した。 mabの非存在下では、顕著なバンドは見られなかった。39kDバンドは、125Iでベクターによりラベルされた活性化 Th からも免疫沈降され、このことは39kD蛋白が膜蛋白であることを確証付けた。
【００６７】
休眠 Th に対して活性化 Th 上に選択的に発現される抗原に特異的な mab類を、 Th 奏効器の相の活性を左右する Th 分子（類）を同定するために開発した。そのようなmab の一つである MR1は、活性化 Th 1 上に選択的に発現される抗原を認識した。 MR1及び CD40-Igが同じ分子を認識するかどうかを調べるために、流動血球計算及び遮蔽実験を行った。 CD40-Ig及び MR1は活性化 Th を、それぞれ、およそ56％及び61％染色したが、休眠 Th は染色しなかった（図5a）。 MR1は CD40-Igでの活性化 Th の染色を用量比例的に遮蔽したが、他のハムスター抗Ｔ細胞 mabである抗- α／β TCRは遮蔽しなかった。これらのデータは CD40-Ig及び MR1が、39kD Th 蛋白上の部分的に重複するか又は同一のエピトープを認識することを示唆した。 CD40-Ig及び MR1が同じ分子を認識することをさらに証明するために、 MR1を結合する抗原を、放射性同位元素でラベルした Th ライセートからの蛋白を免疫沈降することによって同定した。 CD40-Ig及び MR1は両方とも39kD蛋白を免疫沈降した（図5b）。最後に、39kD蛋白の CD40-Igとの免疫沈降は、活性化 Th の放射性同位元素でラベルしたライセートから MR1によって認識される抗原を除去し、このことは MR1抗原及びCD40結合蛋白が同一であるという教義を支持した。
【００６８】
この mabがPM Actによって発現される活性を無効にするかどうかを扱うために、作用試験を MR1について行った。PM Act及びＢ細胞を単独で、又はハムスター mab類或いは CD40-Igの存在下で培養した。二種のハムスター mab、抗- α／β TCR及びα-CD3はPM Actによる休眠Ｂ細胞の活性化を阻害しなかった。対照的に、 MR1又は CD40-IgはＢ細胞活性化を阻害した（図６）。
考察
データは、突出した Th 表面分子（LFA-1 、CD4 、ICAM-1、CD3 、α／β TCR）の mabによる遮蔽は活性化 Th のＢ細胞周期エントリーを誘導する能力を妨げなかったことを示している。対照的に、 CD40-Ig又はCD40結合蛋白に特異的な mabは Th 依存性Ｂ細胞活性化を用量比例的に遮蔽した。さらに、該CD40結合蛋白は、休眠 Th ではなく、活性化 Th の膜上に選択的に発現される39kD蛋白と同定された。 CD40-Ig及び 39kD CD40結合蛋白に特異的な mabはPM ActによるＢ細胞活性化を遮蔽した。
【００６９】
数多くの膜蛋白が Th 依存性Ｂ細胞シグナル化との関係を取り沙汰されてきたが、ここに表した証拠はいくつかの分子（LFA-1 、CD4 、CD3 、α／β TCR、ICAM-1）の寄与を無いものとし、CD40を Th による同種のシグナル化に対するＢ細胞レセプターとして関与させる。データは、 CD40-Ig及びCD40結合蛋白に特異的な mabは Th 依存性Ｂ細胞活性化を阻害することを示している。
【００７０】
CD40に対するリガンドは、活性化 Th 上には発現されるが休眠 Th 上には発現されない 39kD 蛋白である。生化学実験は、電気泳動時の移動が還元剤によって影響を受けなかったことから、該 39kD 蛋白が一本鎖分子であることを示している。この実験中になされた作用試験に基づくと、活性化 Th 1 及び Th 2 は両方とも 39kD CD40結合蛋白を発現する。これは、 Th 1 及び Th 2 は両方ともＢ細胞周期エントリーを誘導することを示す作用試験に合致する。該 39kD 蛋白をさらに特徴付けする企図で、 39kD の MW 範囲内のcDNAコード化 CD 蛋白（CD53、CD27及びCD69）を COS細胞中に一時的にトランスフェクションし、該細胞を CD40-Ig結合について試験した。トランスフェクションされた COS細胞のいずれも、 CD40-Igを結合する蛋白を発現しなかった。それゆえに、 39kD 蛋白はこれらの CD 蛋白の一種ではないことが推測される。
【００７１】
Th 及びＢ細胞の間のシグナル形質導入に対する生化学的論拠は分かりにくかった。Ｔ細胞援助のためのシグナル形質導入分子としてのCD40の同定は、該CD40分子に連合することが知られている特定の生化学経路に注意を集中させる。CD40は、その細胞外領域中の４個のシステインリッチモチーフの存在によって、神経成長因子レセプター（NGFR）族の一員である。 mabによるCD40を通じてのシグナル化は、チロシンキナーゼの活性化を含み、その結果、トリスリン酸イノシトールの産生を増加させ、最低４個の別個のセリン／スレオニンキナーゼを活性化させることが示されている（ユークンら（Uckun et al.) 、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（J. Biol. Chem.）、266 巻、第17478-17485 頁、1991年）。該 NGFレセプター族の他のメンバーを通じてのシグナル化から得られ情報に基づくと、活性化 Th 及びＢ細胞の間の相互作用は同じ生化学過程のうちの多くを結果としてもたらすことが予想される。
実施例２
免疫蛍光法結合試験のために、CD40 Ig 融合蛋白をビオチン−スクシニミド（シグマ社）を用いてビオチンと共役化させた。流動血球計算分析をその後、コールターエピックスＣ装置によりフィコエリスリン（PE）−ストレパビジン（ベクチン−ディキンソン社）を用いた二段階染色によって行った。複数のＴ細胞株をスクリーニングした代表的な結果を以下に表す。ジャーカット及びHSB2細胞株は特異的に結合することが見出されたが、CEM 、HPBALL、及びネズミ胸腺腫を含む他のＴ細胞株はCD40 Ig 融合蛋白を結合しなかった（図７）。
【００７２】
種々の出版物をここに引用したが、それらはことごとく参考文献としてこれに組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 PMAct によるＢ細胞 RNA合成の誘導におけるモノクローナル抗体及びCD40-Ig の作用を表した図である。
【図２】 CD40-Ig によるＢ細胞分化及び増殖の阻害を表した図である。
【図３】 CD40-Ig の Th への結合を表した図である。
【図４】 Th からの[35S]-ラベル化蛋白の免疫沈降の結果を表した図である。
【図５】 Ig又は融合蛋白のＢ細胞 RNA合成に対する作用を表した図である。
【図６】 MR1及びCD40-Ig の分子の認識を比較した実験の結果を表した図である。
【図７】 CD40-Ig のヒト細胞株への結合を表した図である。
【図８】 CD40 cDNA のヌクレオチド配列を表す図である。
【図９】 CD40 cDNA のヌクレオチド配列を表す図である。
【図１０】 CD40-Ig を発現させるために用いることができるプラスミドの概略図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、CD40CRと称される、 CD40 Ｂ細胞抗原に対するカウンターレセプター、及びCD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子を含む、このレセプターに対する可溶性リガンド類に関する。これは、少なくとも部分的には、可溶性のCD40／免疫グロブリン融合蛋白がヘルパーＴ細胞膜上の新規の39kD蛋白レセプターに結合することにより、ヘルパーＴ細胞仲介性Ｂ細胞活性化を阻害することができたという発見に基づいている。本発明は、実質的に精製されたCD40CRレセプター；CD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子と共に抗体も含む、CD40CRの可溶性リガンド；及びアレルギー又は自己免疫疾患の治療において特に有用となりうる、Ｂ細胞活性化の調節方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ミッチソン、ベナセラフ及びラフ（Mitchison, Benacerraf and Raff）による研究は初めて、 Th 及びＢ細胞の間の物理的相互作用が体液性の免疫応答に欠かせないものであることを示唆した。その後の研究は、 Th がクラスIIの主要組織適合遺伝子複合体(MHC) に適合性のある、抗原提示Ｂ細胞と物理的共役体を形成すること（ヴィテッタら（Vitetta et al.) 、イミュノロジカル・レビュー、99巻、第193-239 頁、1987年）及び Th に応答するのはこれらの共役体中のＢ細胞であること（バートレットら（Bartlett et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 143巻、第1745-1754 頁、1989年）を証明した。 Th 由来のリンフォカインがＢ細胞に対して強力な成長及び分化作用を及ぼすという発見に伴い、活性化 Th により近位放出された可溶性因子が相互作用性Ｂ細胞の活性化を媒介することが提唱された。しかしながら、分子クローン化されたリンフォカイン類のいずれも、単独又は組み合わせても、Ｂ細胞周期エントリーを誘導する能力は現さなかった。可溶性因子とは異なり、活性化 Th からの形質膜分画はＢ細胞周期エントリーを誘導した（ホジキンら（Hodgkin et al.) 、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第2025-2034 頁、1990年；ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年）。活性化 Th からの精製形質膜分画を用いた研究は、活性化 Th の膜上に発現された蛋白が体液性免疫の開始の原因となることを示唆した（ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年；バートレットら（Bartlett et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第3956-3962 頁、1990年）。
【０００３】
活性化 Th からの精製形質膜（PMAct ) はこの効果器の機能を調べるために用いられてきた（ホジキンら（Hodgkin et al.) 、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第2025-2034 頁、1990年；ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年）。活性化 Th からのPMAct は、抗原非特異的クラスII非制限様式でＢ細胞周期エントリーを誘導する活性を発現したが、休眠 Th からのもの(PM rest) はしなかった。さらに、PMAct により発現される活性は 4-6時間の活性化時間、すなわち新たな RNA合成を要し、天然の蛋白であることが示された（バートレットら（Bartlett et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第3956-3962 頁、1990年）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、CD40CRと称される、 CD40 Ｂ細胞抗原に対するカウンターレセプター、及びCD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子を含む、このレセプターに対する可溶性リガンド類に関する。これは、少なくとも部分的には、可溶性のCD40／免疫グロブリン融合蛋白がヘルパーＴ細胞膜上の新規の39kDレセプター蛋白（CD40カウンターレセプターとして“CD40CR" と称する）に結合することにより、ヘルパーＴ細胞仲介性Ｂ細胞活性化を阻害することができたという発見、及び、 MR1と称される、この39kDレセプターを指向するモノクローナル抗体がＢ細胞のヘルパーＴ細胞仲介性活性化を阻害することができたという発見に基づいている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、実質的に精製されたCD40CRレセプター；CD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子と共に抗体も含む、CD40CRの可溶性リガンド；及びＢ細胞活性化の調節方法を提供する。
本発明の特定の態様において、対象におけるＢ細胞活性化を、該対象のヘルパーＴ細胞をCD40CRの可溶性リガンドの有効量に接触させることにより阻害することができる。このようなＢ細胞活性化の阻害は、アレルギー又は自己免疫疾患の治療において特に有用となりうる。
【０００６】
本発明の一つの利点は、それが抗原特異性のない免疫応答の局面に介在しうることにある。アレルギーに対する現行の治療法の多くは特定の抗原類に対する脱感作を含み、感受性に関連した抗原を同定するために各患者を検査する必要がある。実際的な問題として、可能性のあるアレルゲンのそれぞれ及び全てに対する患者の反応を網羅的に分析することは事実上不可能である。さらに、殆どの自己免疫状態において原因となる抗原は一般に未知であるか、又は該疾患プロセスに無関係なことさえある。抗原非特異的 CD40/CD40CR相互作用に関する本発明は、アレルギー又は自己免疫に関連した抗原の特性付けの必要性がなくて済む。従って、本発明は例えば花粉症或いはプロカインアミド誘発性狼瘡においてのような免疫原が分かっていない、又は免疫原が複数の成分を有するアレルギー状態の治療において特に有利に使用することができる。本発明は、例えばアナフィラキシーの治療のような免疫活性化の急性治療においても有用となりうる。
【０００７】
本明細書中で用いる略号は以下の意味を有する。
Ig 免疫グロブリン
mab モノクローナル抗体
PM Act 活性化ヘルパーＴ細胞から調製した形質膜
PM rest 休眠ヘルパーＴ細胞から調製した形質膜
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
rIL4 組み換えインターロイキン 4
rIL5 組み換えインターロイキン 5
SN 上清
Th ヘルパーＴ細胞
Th 1 D 1.6 の I-Ad - 制限式ウサギ免疫グロブリン特異性クローンを起源とする。
【０００８】
添付の図は以下を示す。
図１．PMAct によるＢ細胞 RNA合成の誘導におけるモノクローナル抗体及びCD40-Ig の作用。
パネルＡ．休眠Ｂ細胞を Th 1 からのPM rest 又はPM Actと共に培養した。25μg/mlの抗-CD4、抗-LFA-1或いは抗-ICAM-1 、又はこれらのそれぞれの組合せ（各25μg/ml）をPM Actの入ったウェルに加え、Ｂ細胞 RNA合成を[3H]- ウリジンの取り込みによって測定した。Ｂ細胞 RNA合成は、培養開始後42時間から48時間までを評価した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような５実験を表している。
【０００９】
パネルＢ．休眠Ｂ細胞を Th 1(●、▲）又は Th 2(□) からのPM Actと共に培養した。 Th 1 PM Actを含む培養（●、▲）に、CD40-Ig （▲）又は対照蛋白であるCD7E-Ig(●）を量を増やしながら加えた。 Th 2 PM Actを含む培養（□) には、CD40-Ig を量を増やしながら加えた。Ｂ細胞 RNA合成は、培養開始後42時間から48時間までを評価した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような３実験を表している。
【００１０】
パネルＣ．休眠Ｂ細胞を LPS（50μg/ml）又はPM Actと共に培養した。培養に、CD40-Ig （25μg/ml；斜線）又はCD7E-Ig(25μg/ml；黒色）を加えた。 RNA合成は、パネルＡに述べたように測定した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような３実験を表している。
図２．CD40-Ig はＢ細胞分化及び増殖を阻害した。
【００１１】
パネルＡ．休眠Ｂ細胞をPM Act、rIL4 (10ng/ml)及びrIL5 (5ng/ml) と共に培養した。培養開始時、又は培養開始後１、２或いは３日目に、CD40-Ig 又はCD7E-Ig(25μg/ml）を加えた。培養６日目に、個々のウェルからSNを採収し、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、抗アイソタイプ特異性 ELISAを用いて IgM（■）及び IgG1(●）について定量した。PM Act、rIL4及びrIL5の存在下で（CD40-Ig は加えていない）、IgM 及び IgG1 の濃度はそれぞれ 4.6μg/ml及び 126 ng/mlであった。０日目にCD7E-Ig(25μg/ml）を加えた培養は、それぞれ 2.4μg/ml及び 89 ng/ml のIgM 及び IgG1 を生産した。rIL4及びrIL5の非存在下では、IgM 又は IgG1 は検出されなかった。結果は、そのような３実験を表している。
【００１２】
パネルＢ． Th 1 を抗-CD3と共に16時間休眠又は活性化させ、放射線を照射し、IL4 (10ng/ml) の存在下で休眠Ｂ細胞（４×104/培養）と共に培養した（１×104/ウェル）。０ないし25μg/mlのCD40-Ig(▲）又はCD7E-Ig(●）を培養に加えた。培養開始後66から72時間に、ウェルを 1.0μCiの[3H]- チミジンでパルスし、採収した。点線は、Ｂ細胞の休眠 Th に対する応答を示す。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような２実験を表している。
【００１３】
図３．CD40-Ig は活性化 Th 上に発現された分子を検出したが、休眠 Th 上には検出しなかった。休眠 Th 及び活性化 Th を採収し、融合蛋白と共に20分間、４℃でインキュベートした後、 FITC-共役化ヤギ抗-hIgG(25μg/ml）を加えてインキュベートした。陽性の細胞及び MFIのパーセントを、最低 5000 細胞／サンプルの分析により測定した。結果は、そのような６実験を表している。CD40-Ig 結合はグラフ中の黒い部分により示されている。
【００１４】
図４．CD40-Ig は活性化 Th 1 のライセートから 39 kD蛋白を免疫沈降させた。 Th 1 を不溶化された抗-CD3と共に16時間、休眠又は活性化させた。休眠又は活性化 Th からの[35S]-ラベル化蛋白を、精製抗体又は融合蛋白 (1-10μ）で免疫沈降させた。該ゲル結果はそのような３実験を表している。
図５．誘導された 39 kDの Th 膜蛋白に特異的なモノクローナル抗体 (mab)は、PMAct によるＢ細胞 RNA合成の誘導を阻害した。休眠Ｂ細胞及びPMAct を、10μg/mlの抗- α／β、抗-CD3、CD40-Ig 又は MR1のそれぞれと共に培養した。 RNA合成を図１で述べたように測定した。表示した結果は３培養の算術平均 +/- s.d. であり、そのような３実験を表している。
【００１５】
図６． MR1及びCD40-Ig は活性化 Th 上に発現された同じ分子を認識した。
パネルＡ．活性化 Th を MR1又は対照 Ig で蛍光染色した。CD40-Ig 及び MR1が活性化 Th への結合において競合するのかどうかを評価するために、徐々に高濃度にしたMR1 又は対照となるハムスターIg（抗- α／β TCR) を抗-CD40 (20 μg/ml）と共に加えた。４℃で20分間インキュベートした後、該サンプルを洗浄し、 FITC-共役化mab 抗- ヒトIgG1と共にインキュベートした。結果は、そのような３実験を表している。
【００１６】
パネルＢ．[35S]-メチオニンラベル化活性化 Th からの蛋白をMR1 (10 μg/サンプル）又はCD40-Ig (10 μg/サンプル）と免疫沈降させ、PAGE及びフルオログラフィーにより分析した。結果は、そのような２実験を表している。
図７．CD40-Ig のヒト細胞株への結合。種々のヒトＴ細胞株にビオチンラベル化CD40-Ig を与え、流動血球計算法により結合を評価した。
【００１７】
図８及び図９．
スタメンコヴィックら（Stamenkovic et al.) 、EMBOジャーナル（EMBO J.)、８巻、第1403-1410 頁、1989年、による、CD40 cDNA のヌクレオチド配列。膜内外領域を下線で示す。
図10．
CD40-Ig を発現させるために用いることができるプラスミドの概略図。ΔCD40の融合部位のアミノ酸配列をCD40の図解部分の下に示す。
【００１８】
本発明は、実質的に精製されたCD40CRレセプター；CD40を含む融合分子と共に抗体も含む、CD40CRの可溶性リガンド；及びＢ細胞活性化の調節方法を提供する。
開示を明瞭にするために、本発明の詳細な説明を以下の章に分けて述べるが、限定するためではない：
（ｉ）CD40CRに結合するリガンド；
（ii）CD40CRの特性決定に用いる方法；
(iii）精製CD40CRの調製；
（iv）CD40CRに結合するリガンドの使用；及び
（ｖ）CD40CRの使用。
（１）CD40CRに結合するリガンド
本発明は、(i) CD40蛋白の少なくとも一部分を含む融合分子、及び(ii)抗体又は抗体断片、を含むCD40CRの可溶性リガンドを提供する。
【００１９】
ここで用いる“可溶性”という用語は、本発明のリガンドが永久に細胞形質膜に結合しているわけではないことを示している。本発明の可溶性リガンドは、しかしながら、脂質、蛋白、或いは炭水化物分子を含む非細胞性固形支持体、ビーズ、小胞、磁気粒子、繊維等に付着させてもよく、又は移植体或いは小胞内に封入してもよい。
【００２０】
このようなリガンドのCD40CRに結合する能力は、該リガンドが CD40-Ig（以下参照）又は MR1（以下参照）と同じ蛋白に結合することを証明することにより確認できる。
本発明のリガンドは適当な担体とともに医薬用組成物中に含まれてもよい。
(1.1) 融合分子
本発明は、CD40CRのリガンドである可溶性の融合分子を提供する。このような融合分子は第二の分子に結合したCD40蛋白の少なくとも一部分を含む。CD40の該部分は、好ましくはCD40膜内外ドメインを欠く。本発明により用いてもよいCD40蛋白の部分は、CD40CRに結合できる、例えば、 MR1又は CD40-Igと同じ蛋白に結合することを示すことができる部分のような、いずれの部分でもよいと定義される。
【００２１】
使用してもよい第二の分子にはペプチド類及び蛋白類、脂質類、及び炭水化物類が含まれ、本発明の好ましい態様においては、免疫グロブリン分子或いはその部分（Fv、Fab 、F(ab′)2、又は Fab′断片等）或いは CD8、又は B7 のような他の付着分子でもよい。該第二分子は非ヒト或いはヒト原料のいずれから誘導してもよく、キメラ性でもよい。該第二分子はさらに、酵素、トキシン、成長因子、リンフォカイン、抗増殖剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生剤、ビンカアルカロイド、プラチナ配位化合物、放射性同位元素、又は蛍光化合物でもよい。
【００２２】
本発明の融合分子は、化学合成、又は好ましくは組み換えDNA 法によって製造してもよい。
例えば、CD40蛋白の少なくとも一部分をコード化している核酸配列は、適当な発現ベクター中で第二分子をコード化している核酸配列に結合していてもよく、その後、酵母、バキュロウィルス、又は交差遺伝動物を含む哺乳動物発現系のような、原核生物又は、好ましくは、真核生物発現系中に発現されてもよい。
【００２３】
或いは、CD40蛋白の少なくとも一部分を組み換えDNA 技術を用いて発現させ、その後第二分子に化学的に共役させてもよい。
CD40を含む融合分子は、準備された混合液から、電気泳動法又は、CD40或いは該第二分子のいずれかに結合するリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製してもよい。CD40に結合するリガンドには、HB9110の受入れ番号を持ち、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されているハイブリドーマによって製造されるようなG28-5 、及び CD40CR 等の抗-CD40 抗体類が含まれるが、それらに限定されるものではなく、以下の章（２）及び（３）でより十分に述べる。該第二分子が免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である場合は、抗−免疫グロブリン抗体を含むアフィニティーカラムを使用してもよい；該第二分子が Fc 断片を含む場合は、プロテインＡカラムを使用してもよい。
【００２４】
本発明の好ましい態様により、CD40の一部分を、膜内外ドメインより上流で切断されたCD40蛋白をコード化する核酸配列を用いて製造してもよい。そのような核酸配列は、スタメンコヴィックら（Stamenkovic et al.) 、EMBOジャーナル（EMBO J.)、８巻、第1403-1410 頁、1989年、に述べられているような、CD40抗原をコード化しているcDNAを含むプラスミドを、PstI (P)及びSau 3A (S3) 制限酵素で切断することにより製造してもよい。できた P/S3 断片を、P 及びBam HI（B)で切断した同じプラスミド中にサブクローニングして切断CD40遺伝子を製造してもよい（図８及び９参照）。
【００２５】
本発明の特定の非限定的な態様において、免疫グロブリン配列と共にCD40の少なくとも一部分を含むリガンドを製造するのに用いられる発現ベクターは、好ましくは、ウィルス由来の ori領域、細菌性 ori領域、細菌性選択可能マーカー及び、CD40の少なくとも一部分をコード化する DNA配列をサブクローニングさせる制限エンドヌクレアーゼ部位によって免疫グロブリン不変領域をコード化する DNA配列から分離されポリアデニル化シグナル配列が続く真核生物プロモーター及びエンハンサー配列を含んでもよい（図10参照）。
【００２６】
本発明の特定の態様において、切断された CD40 遺伝子は、Mlu I 及び B切断を用いて、アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年、に述べられているような免疫グロブリン融合プラスミド中にサブクローニングして、該融合分子 CD40-IgをコーディングするプラスミドpCD40-Igを形成してもよい（図８及び９参照）。その後 CD40-Ig融合蛋白を、pCD40-Igプラスミドを COS細胞中にトランスフェクションして一時的発現系を形成することにより製造してもよい。製造された CD40-Igは該 COS細胞上清から回収して、アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年、に述べられているように、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。
(1.2) 抗体
本発明の可溶性リガンドは、 CD40CR に結合する抗原結合部位を含む抗体分子、モノクローナル抗体分子、又はこれらの抗体分子の断片を含んでもよい。このようなリガンドはさらに、蛋白、脂質、炭水化物、酵素、トキシン、成長因子、リンフォカイン、抗増殖剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生剤、ビンカ・アルカロイド、プラチナ配位化合物、放射性同位元素、又は蛍光化合物であってもよく抗体分子又は断片に結合していてもよい第二分子を含んでもよい。
【００２７】
該リガンドがモノクローナル抗体、又はその断片である場合、該モノクローナル抗体は、連続的培養細胞株による抗体分子の製造を提供する何らかの技術を用いて CD40CR に対して製造してもよい。例えば、ケーラー及びミルステイン（Kohler and Milstein ；ネイチャー（Nature）、256 巻、第495-497 頁、1975年）により初めて開発されたハイブリドーマ技術は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズバーら（Kozbar et al.)、イミュノロジィ・トゥデイ（Immunology Today）、４巻、第72頁、1983年）及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのEBV-ハイブリドーマ技術（コールら（Cole et al.)、モノクローナル抗体と癌治療、アラン R. リス（Alan R. Liss）社、第77-96 頁）等のような、より最近になって利用できるようになった他の技術と同様に、本発明の範囲に入る。
【００２８】
該分子のイディオタイプを含む抗体断片は周知の技術により作り出すことができる。例えば、そのような断片には以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：該抗体分子をペプシンで処理することにより作り出すことができるF(ab′)2断片；該F(ab′)2断片のジスルフィド架橋を還元することにより作り出すことができるFab ′断片；該抗体分子をパパインで処理することにより作り出すことができるF(ab′)2断片；及び該抗体分子をパパイン及び還元剤で処理してジスルフィド架橋を還元することにより作り出すことができる2Fab又はFab 断片。
【００２９】
本発明はさらに、モリソンら（Morrison et al.)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス U.S.A. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、81巻、第6851-6855 頁、1984年、又はモリソンら（Morrison et al.)による欧州特許出願第85305604.2号（公開第0173494 号、1986年３月５日公開）に示されているような、当技術分野において周知の技術によって製造されるキメラ抗体を提供する。
【００３０】
抗体を製造するための免疫源は CD40CR を含むいずれの材料でもよい。例えば、活性化 Th を免疫源として用いてもよい。或いは、以下の（３）章で示すように製造した実質的に精製された CD40CR を使用してもよい。活性化 Th を免疫源として使用する場合、抗血清を活性化 Th 細胞に対する反応性について試験してもよいが、休眠 Th 細胞に対して試験してはならない。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、該可溶性リガンドは MR1モノクローナル抗体である。以下の方法を該 MR1モノクローナル抗体を製造するのに用いたが、これは CD40CR を指向する他の抗体を作り出すために用いてもよい。
ハムスターに5-10×106 活性化 Th 1 細胞(D1.6)を腹腔内に一週間おきに６週間投与して免疫化した。ネズミ Th 1 に対する血清滴定が約1:10,000よりも大きくなった時点で、免疫ハムスター脾臓細胞及び NSIを用いてポリエチレングリコールで細胞融合を行った。成長過程のハイブリドーマを含むウェルからのSNを、休眠 Th 1 及び活性化 Th 1 について流動血球計算法によりスクリーニングした。活性化 Th を選択的に認識する mabを製造する特定の一ハイブリドーマをさらに試験して、MR1 を誘導するためにサブクローニングした。MR1 は腹水中で生産され、イオン交換 HPLC により精製した。ハイブリドーマMR1 はHB11048 の受託番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。
【００３２】
本発明は、MR1 がその標的抗原に、又は CD40-Igがそのレセプターに結合するのを拮抗阻害することができるモノクローナル抗体及びその断片を含むリガンドも提供する。
（２） CD40CR の特性決定に用いる方法
CD40CR は（i) CD40 、CD40の少なくとも一部を含む融合細胞類、及びMR1 のような抗体類に結合できること；(ii)Ｂ細胞周期エントリー、増殖、及び分化を刺激することができる機能的特性；及び(iii) 細胞内分布、によって特徴付けることができる。
(2.1) リガンド結合能
CD40CR は、 CD40 、CD40を含む融合細胞類、及び CD40CR を指向する抗体類のようなリガンド類に結合できることによって特徴付けることができる。
【００３３】
以下でより詳しく考察するように、幾つかの技術が CD40CR の特性決定に使用された。例えば、 CD40-Ig及びMR1 は同じ39kD分子を認識することが示された。 CD40-Ig及びMR1 は両方とも、放射性同位元素でラベルされた Th ライセートからの39kD蛋白を免疫沈降することが見出された（図 5b)。さらに、 CD40-Igによる39kD蛋白の免疫沈降は、MR1 によって認識される抗原を Th ライセートから除去した。
(2.2) Ｂ細胞活性化能
CD40CR は又、Ｂ細胞周期エントリー、増殖、及び分化を刺激することができることによって特徴付けることができる。
【００３４】
例えば、活性化 Th 細胞からの形質膜（PM Act）はＢ細胞 RNA合成を誘導するが、休眠 Th 細胞からの形質膜（PM rest ）は誘導しないことが見出された（図 1a)；Ｂ細胞活性化を示すものである、この誘導は抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1 のような抗体による影響を受けなかった。 CD40-Ig又はMR1 は、しかしながら、図 1b 及び図６に示されるように、PM Act誘導性Ｂ細胞活性化を阻害できることが見出された。
【００３５】
Ｂ細胞活性化の誘導は、[3H]- ウリジンの RNAへの取り込み（Ｂ細胞が分化すると、RNA 合成が増加する）又は細胞増殖に伴う DNA合成を測定する[3H]- チミジンの取り込み等の技術により、測定してもよい。Ｂ細胞増殖に対する CD40CR の効果を最適に測定するために、インターロイキン-4（IL-4）を約10 ng/mlの濃度で培地に加えてもよい。
【００３６】
或いは、Ｂ細胞活性化を免疫グロブリン分泌の関数として測定してもよい。例えば、実質的に精製された形態、又は PM 中に存在するかそれ以外の形態の CD40CR をIL-4(10 ng/ml)及びIL-5（5 ng/ml)と共に休眠Ｂ細胞に加えてもよい。３日間培養した後、さらに培地を加えてもよい。培養６日目に、個々の培養からの上清（SN) を採収し、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように IgM及び IG1を定量してもよい。
(2.3) 細胞内分布
CD40CR は又、その細胞内分布によって特徴付けることができる。例えば、 CD40-Igは流動血球計算法により評価すると、活性化 Th には結合するが休眠 Th 1 には結合しないことが観察された（図３）。さらに CD40-Igは、ジャーカット細胞、HSB2細胞、及びヒト末梢血液からの活性化Ｔ細胞に結合することが観察されたが、CEM 細胞、HPBALL細胞、又はネズミ胸腺腫細胞には有意の結合を示さなかった。
【００３７】
例えば、限定するものではないが、特定の細胞型(“試験細胞")上の CD40CR の存在は次のように流動血球計算法により評価してもよい。試験細胞は休眠 Th 細胞（マイナス対照）及び活性化 Th 細胞（プラス対照）と平行して試験してもよい。全細胞は約１×105 細胞／50μl の濃度でリガンド（例： CD40-Ig又はMR1 ）と共に４℃で20分間インキュベートした後、FITC共役化抗リガンド抗体で処理してもよい。ヨウ化プロピヂウムを全サンプルに２μg/mlの最終濃度になるように加えてもよい。流動血球計算分析をその後、例えば BD FACSCAN 上で行ってもよい。前方散乱対側面散乱、及び赤色陰性（ヨウ化プロピヂウム排除のため）により細胞の陽性ゲート処理した後、生育可能な細胞の対数緑色蛍光を確認してもよい。
（３）精製 CD40CR の製造
本発明は実質的に精製された CD40CR を提供する。そのような CD40CR は、以下の方法により、活性化ヘルパーＴ細胞、ジャーカット、及び HSB2 細胞のような CD40CR を持つ細胞から製造してもよい。
【００３８】
形質膜は、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、活性化 Th 1 細胞のような適当な細胞から不連続性ショ糖勾配沈降により調製してもよい。 CD40CR はその後、弱い洗剤により粗膜抽出物を分離し、さらに分子篩いクロマトグラフィーに続いて、固体支持体に結合した適当なリガンド（例：MR1 又は CD40-Ig）を用いるアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降（例： CD40-Ig又はMR1 による）、且つ／又はゲル電気泳動のいずれかを行うことにより単離してもよい。
【００３９】
得られた蛋白は約39kDの分子量を持つと考えてもよい。
本発明は適当な担体と共に医薬用組成物の中に含まれていてもよい可溶性 CD40CR （すなわち、無細胞）を提供する。それはさらに、ペプチド、蛋白、脂質、炭水化物、酵素、トキシン、成長因子、リンフォカイン、抗増殖剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、ビンカアルカロイド、プラチナ配位化合物、放射性同位元素、又は蛍光化合物であってもよい第二分子に結合している CD40CR を提供する。
【００４０】
本発明はさらに、化学合成又は組み換え DNA技術により製造されている実質的に精製された CD40CR を提供する。例えば、 CD40CR に対する遺伝子は、活性化ヘルパーＴ細胞から調製されたcDNAをλgt10発現系中に挿入した後、MR1 又は CD40-Igの結合によりスクリーニングして CD40CR 発現クローンを同定することにより単離してもよい。或いは、活性化ヘルパーＴ細胞から調製されたcDNAを COS細胞中にトランスフェクションしてもよく、その上清をMR1 又は CD40-Igでスクリーニングして CD40CR 生産者を同定してもよい。 CD40CR に対する遺伝子をその後、当技術分野において周知の発現系を用いて CD40CR を発現させるのに用いてもよい。
（４） CD40CR に結合するリガンドの使用
本発明は CD40CR に結合するリガンドを利用するＢ細胞活性化を調節する方法を提供する。特にそれは、 CD40CR に結合する有効濃度のリガンドにＢ細胞及び Th 細胞の混合物をさらすことを含む、Ｂ細胞活性化を阻害する方法を提供する。使用してもよいリガンドは上記の（１）章に述べられている。本発明の方法はインビトロ又はインビボで実行してもよい。有効濃度とは、当技術分野において周知の何らかの技術（上記の（２）章に示されたものを含む）により測定して、最低約30％、好ましくは約75％、Ｂ細胞活性化を阻害するリガンド濃度を言う。本発明の好ましく、特定の、非限定的な態様によると、 CD40-Igをリガンドとして使用してもよく、その場合、有効濃度は最低約10μg/mlでもよい。別の特定の、非限定的な態様では、モノクローナル抗体 MR1を使用してもよく、その場合、有効濃度は最低約10μg/mlでもよい。該方法をインビボで実行する場合、リガンドの有効濃度とはリガンドのプラズマ濃度又は局所濃度のことであってもよい。例えば、全体としての免疫系への影響を制限するためには局所的な領域中でＢ細胞活性化を阻害することが望ましい。
【００４１】
特定の態様において、本発明はＢ細胞活性化が関連する疾病を患う対象を治療する方法で、該対象に治療用量の、 CD40CR に結合するリガンドを投与することを含む方法を提供する。対象はヒトでなくてもよいが、好ましくはヒトでもよい。
Ｂ細胞活性化が関連する疾病には、アレルギー（アナフィラキシーを含む）；薬物誘導狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、成人慢性関節リューマチ、若年性関節リューマチ、強皮症、シェーグレン症候群などを含む自己免疫状態；エプスタイン−バー感染、及びヒト免疫不全ウィルスの感染を含むレトロウィルス感染を含む、Ｂ細胞を伴うウィルス性疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
Ｂ細胞活性化はヒト免疫不全ウィルス複製の潜伏期からの誘導に関連することが示唆されているため、本発明のリガンドを AIDS 又は ARCがまだ発症していない HIV陽性者に投与することが望ましいであろう。
リガンドは、適当な医薬用担体中にあって、静脈内、腹腔内、皮下、鞘内、関節内、或いは筋肉内注射、及び経口、鼻腔内、眼内及び直腸投与を含む、当技術分野において周知の何らかの方法により投与してもよく、ミクロスフェア、リポゾーム、且つ／又は徐放移植体中に含まれてもよい。
【００４３】
治療用量のリガンドとは、Ｂ細胞活性化の有害な臨床作用を有意に減少させる量と定義され、使用するリガンド及び治療する状態により変えてもよい。 CD40-Igを使用する場合、治療濃度は全身（プラズマ濃度）又は局所のいずれにおいても約10μg/mlでもよい。 MR1を使用する場合、治療濃度は全身（プラズマ濃度）又は局所のいずれにおいても約10μg/mlでもよい。
【００４４】
本発明のさらに別の態様において、上記の方法は、 Th 細胞が殺生されるか又は障害を受け、 Th 細胞の破壊の結果としてＢ細胞活性化が減少するように、トキシン又は代謝拮抗物質を含むリガンドを利用してもよい。
本発明のリガンドは活性化Ｔ細胞をラベルするのに用いてもよく、これはＴ細胞障害の診断において有用となりうる技術である。この目的で、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物又は他の検出可能ラベルを含むリガンドをインビトロ又はインビボでＴ細胞にさらしてもよく、結合量を定量してもよい。
【００４５】
本発明のリガンドは又、例えば成長因子等の物質を活性化Ｔ細胞に届けるのに用いてもよい。
（５） CD40CR の使用
本発明は、上記の（３）章に述べられたように調製された CD40CR 又は CD40CR を含む分子を利用するＢ細胞活性化の調節方法を提供する。特に、Ｂ細胞を有効濃度の CD40CR にさらすことを含む、Ｂ細胞活性化を促進する方法を提供する。該方法はインビボ又はインビトロで実行してもよい。有効濃度とは、当技術分野において周知の何らかの技術（上記の（３）章に示されたものを含む）により測定して、最低約30％、Ｂ細胞活性化を誘導するレセプター濃度を言う。本発明の特定の、非限定的な態様によると、 CD40CR の濃度は局所又は全身において約10μg/mlでもよい。
【００４６】
特定の態様において、本発明は体液性免疫の減退が関連する免疫不全疾患を患う対象を治療する方法で、該対象に治療用量の CD40CR を投与することを含む方法を提供する。対象はヒトでなくてもよいが、好ましくはヒトでもよい。
体液性免疫の減退が関連する免疫不全疾患には、体液性免疫が関わる遺伝疾患と同様に、後天的免疫不全症候群、悪性腫瘍又は悪液質が関連する免疫不全症、例えば化学療法又は放射線照射療法によって起きる医原性免疫不全症が含まれる。
【００４７】
CD40CR は、適当な医薬用担体中にあって、静脈内、腹腔内、皮下、鞘内、関節内、或いは筋肉内注射、及び経口、鼻腔内、眼内及び直腸投与を含む、当技術分野において周知の何らかの方法により投与してもよく、ミクロスフェア、リポゾーム、且つ／又は徐放移植体中に含まれてもよい。
CD40に対する CD40CR の治療用量は、免疫グロブリン産生を少なくとも約30％増加させる量と定義される。
【００４８】
さらに別の態様において、 CD40CR をトキシンに共役させた後に、CD40を発現するＢ細胞を破壊するのが好ましいと思われる状況下で対象に投与してもよい。そのような状況の例には、臓器移植を受けた患者、多発性骨髄腫或いは他のＢ細胞悪性腫瘍の患者、又は自己免疫疾患の患者が含まれる。
CD40CR はCD40を発現するＢ細胞をラベルするのに用いてもよく、これはＢ細胞障害の診断において有用となりうる技術である。この目的で、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物又は他の検出可能ラベルに結合したレセプターをインビボ又はインビトロでＢ細胞にさらしてもよく、結合量を定量してもよい。
【００４９】
CD40CR は又、それに結合している分子をＢ細胞に届けるのに用いてもよい。
【００５０】
【実施例】
実施例１
材料と方法
メスの DBA/2J マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社、バー・ハーバー、ME）を Th クローンの成長を支える充填細胞の調製のために、及び休眠Ｂ細胞の調製で用いた。
【００５１】
D 1.6 、 I-Ad - 制限式ウサギ Ig 特異性 Th クローン（カートジョーンズら、（Kurt-Jones et al.)、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J. Exp. Med.)、166 巻、第1774-1787 頁、1987年）をウスターのマサチューセッツ大学のディビット・パーカー博士（Dr. David Parker）から入手した。D 1.6 をここでは Th 1 と呼ぶことにする。
【００５２】
Th 1 を、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、40μg/4ml の PBS／ウェルでコーティングされたクラスターウェル（６ウェル、コーニング社、NY）中で抗-CD3と共に16時間培養した（８×106/ウェル）。
形質膜を、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、不連続性ショ糖勾配沈降により調製した。
【００５３】
休眠脾臓Ｂ細胞を、デフランコら（Defranco et al.)、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J. Exp. Med.)、155 巻、第1523頁、1982年、に述べられているように、不連続性パーコール勾配沈降により調製した。70-75 ％（密度：1.087-1.097)パーコール界面から単離された細胞は典型的には＞95％ mIg+ であり、均質の、低い近前方光線散乱を有し、Con A に反応しなかった。
【００５４】
以下の mabを、放射線照射され骨髄再形成されたマウスの腹水からイオン交換 HPLC により精製した：抗-CD3:145-2C11 （レオら（Leo et al.) 、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス U.S.A. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、84巻、第1374-1378 頁、1987年）；抗- α，β:H57-597；抗-CD4:GK1.5（ワイルドら（Wilde et al.）、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 131巻、第2178-2183 頁、1983年）；抗-ICAM:YN1/1.7.4 （プリエトら（Prieto et al.)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（Eur. J. Immunol.）、19巻、第1551-1557 頁、1989年）；抗-LFA-1:FD441.8（サルミエントら（Sarmiento et al.）、イミュノロジカル・レビュー（Immunol. Rev.)、68巻、第135 頁、1982年）；及び抗- ラット／ハムスターκ鎖:RG-7 （スプリンガー（Springer）、ハイブリドーマ（Hybrid.)、１巻、第257-273 頁、1982年）。
【００５５】
CD40融合蛋白は、CD40抗原をコード化しているcDNAを含むプラスミド（スタメンコヴィック及びシード（Stamenkovic and Seed) 、EMBOジャーナル（EMBO J.)、８巻、第1403-1410 頁、1989年）を、制限酵素PstI (P)及びSau 3A (S3) で切断することにより製造した。この P/S3 断片を、P 及びBam HI（B)で切断した同じプラスミド中にサブクローニングした。これにより、膜内外ドメインより上流で切断されたCD40蛋白をコード化するCD40Δが製造された。CD40Δをコード化する DNA断片をその後、Mlu I 及び B切断を用いて、免疫グロブリン融合プラスミド中にサブクローニングした（アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年）。 CD40-Ig融合蛋白を、 COS細胞中に一時的にトランスフェクションして製造し、アルフォら（Aruffo et al.)、セル（Cell）、61巻、第1303-1313 頁、1990年、に述べられているように、プロテインＡカラム上で精製した。
【００５６】
インターロイキン 4 (IL4)：組み換えマウスIL4 は、C.マリツェヴスキィ博士及びK.グラブステイン博士（Drs. C. Maliszewski and K. Grabstein）、イムネックス社、シアトル、WA、の御好意により入手した。
インターロイキン 5 (IL5)：組み換えマウスIL5 は、R&D リサーチ社、サレント、CA、から購入した。
【００５７】
３×104 休眠Ｂ細胞を A/2微量滴定ウェル（コスター社、ケンブリッジ、MA）中の50μl cRPMI 中で培養した。これらのウェルに 0.5μg の Th 1 又は Th 2 膜蛋白を加えた。42から48時間の間に、ウェルを2.5 μCiの 3H-ウリジン（ニューイングランドヌクレア社、ボストン、MA）でパルス処理し、採収して、放射能を液体シンチレーション分光測定により測定した。結果を cpm／培養 +/-s.d.で表した。
【００５８】
休眠Ｂ細胞を上に述べたように培養した。培養ウェルに 0.5μg の Th 1 膜蛋白、IL4 （10 ng/ml）及びIL5 （５ ng/ml）を加えた。培養３日目に、さらに50μl の cRPMIを加えた。培養６日目に、個々のウェルからの SN を採収し、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、IgM 及び IgG1 を定量した。
【００５９】
４×104 休眠Ｂ細胞を A/2微量滴定ウェル（コスター社、ケンブリッジ、MA）中の50μl cRPMI 中で培養した。これらのウェルに、１×104 休眠又は活性化された、放射線照射（500 ラド）された Th 1 及びIL4 （10 ng/ml）を加えた。培養３日目に、ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年、に述べられているように、ウェルを１μCiの 3H-チミジンでパルス処理した。
【００６０】
ハムスターに5-10×106 活性化 Th 1 細胞(D1.6)を腹腔内に一週間おきに６週間投与して免疫化した。ネズミ Th 1 に対する血清滴定が約1:10,000よりも大きくなった時点で、免疫ハムスター脾臓細胞及び NSIを用いてポリエチレングリコールで細胞融合を行った。成長過程のハイブリドーマを含むウェルからのSNを、休眠 Th 1 及び活性化 Th 1 について流動血球計算法によりスクリーニングした。活性化 Th を選択的に認識する mabを製造する特定の一ハイブリドーマをさらに試験して、MR1 を誘導するためにサブクローニングした。MR1 は腹水中で生産され、イオン交換 HPLC により精製した。
【００６１】
休眠 Th 及び活性化 Th （抗-CD3で16時間）を採収し、１×105 細胞／50μl で、融合蛋白と共に20分間、４℃でインキュベートした後、 FITC-共役化ヤギ抗- ヒト(h)IgG(25 μg/ml；サザン・バイオテクノロジィ社、バーミンガム、AL）を加えてインキュベートした。全サンプルに、ヨウ化プロピヂウムを２μg/mlの最終濃度になるように加えた。流動血球計算分析を、 BD FACSCAN 上で行った。前方散乱対側面散乱、及び赤色陰性（ヨウ化プロピヂウム排除のため）により、細胞の陽性ゲート処理を行った後、生育可能な細胞の対数緑色蛍光を確認した。陽性の細胞及び MFIのパーセントを測定するために、最低 5000 個の生育可能な細胞を分析した。MR1 での染色は、FITC- 共役化 RG7、マウス抗- ラット／ハムスターκ鎖 mabを使用した。
【００６２】
Th 1 を不溶化した抗-CD3と共に16時間、休眠又は活性化させた。休眠及び活性化 Th （20×106/ml）からの蛋白を 1 mCiの[35S]-メチオニン／システインで１時間ラベルした時点で、RPMI/10%FCS 中で２回洗浄し、細胞ペレットをノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 137巻、第1718-1726 頁、1986年、に述べられているように、抽出バッファー中で溶解した。精製抗体又は融合蛋白(1-10 μg)をライセート 500μl (5×106 細胞当量）に加え、４℃で16時間処理した。その時点で、該ライセートを50μl の圧縮プロテインＡ−セファロースの入った試験管に移した。ペレット状の該プロテインＡ−セファロースを再懸濁し、試験管を攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした。該サンプルをその後、高ストリンジェンシー洗浄バッファーで３回洗浄した。ペレット状の該プロテインＡ−セファロースを30μl の SDSサンプルバッファーに再懸濁し、10％ポリアクリルアミドゲル上を泳動させた。ゲル泳動の後、該ゲルを固定し蛍光間接撮影を行った。
結果
PM ActによるＢ細胞周期エントリーの誘導を媒介する細胞表面分子を明らかにするために、 Th 膜蛋白に対するmab をPM Act及びＢ細胞の培養液に加えた。PM ActはＢ細胞の RNA合成をPM rest について観察されたものより８倍誘導した（図1a）。抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1 を単独で、又は組み合わせて加えても、PM ActによるＢ細胞 RNA合成の誘導を阻害しなかった。
【００６３】
ヒトの系では、抗-CD40 mab がＢ細胞増殖を誘導し（クラーク及びレーン（Clark and Lane）、アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジィ（Ann. Rev. Immunol.) 、９巻、第97-127頁、1991年）、それによりCD40をＢ細胞に対する重要な引き金分子として関わらせることが示されていた。CD40がPM ActによるＢ細胞 RNA合成の誘導に関わっているのかどうかを測定するために、ヒトCD40の細胞外ドメインの可溶性融合蛋白及びヒト IgG1 (CD40-Ig) の Fc ドメインをPM Act及びＢ細胞の培養液に加えた。 Th 1 及び Th 2 に由来するPM Actを調製し、Ｂ細胞 RNA合成を刺激するために用いた。CD40-Ig を培養液に加えることにより、PM Actによって Th 1 及び Th 2 から誘導されるＢ細胞 RNA合成の用量比例的阻害が起きた（図1b）。PM Actによって Th 1 及び Th 2 から誘導されるＢ細胞 RNA合成の 1/2最大阻害は約５μg/ml CD40-Igであった。CD7E-Ig 融合蛋白（ダムル及びアルフォ（Damle and Aruffo）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス U.S.A. （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、88巻、第6403-6407 頁、1991年）は25μg/mlを用いた時でさえも効果を示さなかった。
【００６４】
CD40-IgがＴ−非依存性活性剤によるＢ細胞活性化を阻害するかどうかを調べるために、LPS 及び CD40-Igの存在下でＢ細胞を培養した。２日目に、 RNA合成を評価した（図1c）。 CD40-IgはLPS によるＢ細胞活性化の阻害においては効果を示さなかったが、Ｂ細胞のPM Actに対する応答は阻害した。
PM Act、IL4 及び IL5の存在下では、Ｂ細胞は多クローン的に分化してIgを生産した（ホジキンら（Hodgkin et al.) 、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 145巻、第2025-2034 頁、1990年；ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 146巻、第1118-1124 頁、1991年）。この過程における CD40 シグナルに必要な条件を評価するために、 CD40-Igを培養開始時、又はその後の培養中の日に加えた。培養開始時に CD40-Igを加えると（図2a）、その非存在下における対照レベルに比較してポリクローナル IgM及び IgG1 の生産を95％より多く阻害した。対照的に、 CD40-Igを培養１日目及び２日目に加えると IgM及び IgG1 生産に対して、あったとしても、極わずかな阻害効果しか示さなかった。これらのデータは、24時間後にはもはやCD40によるシグナルはＢ細胞のIg分泌への分化に対する必須条件ではないことを示している。
【００６５】
ここまでのデータはCD40がPM ActによるＢ細胞活性化に関係していることを示した。無傷の生きた活性化 Th によるＢ細胞活性化にもCD40が関係することを確認するために実験を行った。 Th 1 を不溶化抗-CD3と共に16時間活性化して、採収し、放射線照射した。放射線照射した該 Th 1 をIL4 の存在下でＢ細胞と共に培養し、Ｂ細胞増殖を培養３日目に測定した。 Th 1 がIL4 を生産しないために、 Th 1 とのＢ細胞増殖を達成するのに外からのIL4 源が必要であった（ノエルら（Noelle et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジィ（J. Immunol.)、 143巻、第1807-1814 頁、1989年）。 CD40-Igは、PM Actについて観察されたのと同様に、放射線照射された Th によるＢ細胞増殖の誘導を用量比例的に阻害した（図2b）。マイナス対照であるCD7E-Ig は、測定できるような効果は表さなかった。
【００６６】
活性化 Th 1 がCD40に対する結合蛋白を発現するかどうかを調べるために、休眠及び活性化（16時間) Th 1 を CD40-Ig又はCD7E-Ig で染色した後、FITC- 抗-HIgG で処理した。 CD40-Igの結合を流動血球計算により評価した（図３）。抗-CD3で16時間活性化した Th 1 は、休眠 Th 1 とは異なり、 CD40-Igで56％が染色プラスを示したが、対照CD7E-Ig では染まらなかった。 CD40-Ig結合蛋白を同定するために、 Th 1 蛋白を[35S]-メチオニン／システインで生合成的にラベルし、 CD40-Ig又はCD7E-Ig で蛋白を免疫沈降させた。該免疫沈降蛋白を SDS-PAGE 及び蛍光間接撮影法により解析した（図４）。39kDの見かけの分子量を持つ顕著なバンドが、１及び10μg のCD40／サンプルで用量比例的に免疫沈降した。対照として、抗- クラス I mabは 55kD のバンド及び低分子量バンド、β2 ミクログロブリンを免疫沈降した。 mabの非存在下では、顕著なバンドは見られなかった。39kDバンドは、125Iでベクターによりラベルされた活性化 Th からも免疫沈降され、このことは39kD蛋白が膜蛋白であることを確証付けた。
【００６７】
休眠 Th に対して活性化 Th 上に選択的に発現される抗原に特異的な mab類を、 Th 奏効器の相の活性を左右する Th 分子（類）を同定するために開発した。そのようなmab の一つである MR1は、活性化 Th 1 上に選択的に発現される抗原を認識した。 MR1及び CD40-Igが同じ分子を認識するかどうかを調べるために、流動血球計算及び遮蔽実験を行った。 CD40-Ig及び MR1は活性化 Th を、それぞれ、およそ56％及び61％染色したが、休眠 Th は染色しなかった（図5a）。 MR1は CD40-Igでの活性化 Th の染色を用量比例的に遮蔽したが、他のハムスター抗Ｔ細胞 mabである抗- α／β TCRは遮蔽しなかった。これらのデータは CD40-Ig及び MR1が、39kD Th 蛋白上の部分的に重複するか又は同一のエピトープを認識することを示唆した。 CD40-Ig及び MR1が同じ分子を認識することをさらに証明するために、 MR1を結合する抗原を、放射性同位元素でラベルした Th ライセートからの蛋白を免疫沈降することによって同定した。 CD40-Ig及び MR1は両方とも39kD蛋白を免疫沈降した（図5b）。最後に、39kD蛋白の CD40-Igとの免疫沈降は、活性化 Th の放射性同位元素でラベルしたライセートから MR1によって認識される抗原を除去し、このことは MR1抗原及びCD40結合蛋白が同一であるという教義を支持した。
【００６８】
この mabがPM Actによって発現される活性を無効にするかどうかを扱うために、作用試験を MR1について行った。PM Act及びＢ細胞を単独で、又はハムスター mab類或いは CD40-Igの存在下で培養した。二種のハムスター mab、抗- α／β TCR及びα-CD3はPM Actによる休眠Ｂ細胞の活性化を阻害しなかった。対照的に、 MR1又は CD40-IgはＢ細胞活性化を阻害した（図６）。
考察
データは、突出した Th 表面分子（LFA-1 、CD4 、ICAM-1、CD3 、α／β TCR）の mabによる遮蔽は活性化 Th のＢ細胞周期エントリーを誘導する能力を妨げなかったことを示している。対照的に、 CD40-Ig又はCD40結合蛋白に特異的な mabは Th 依存性Ｂ細胞活性化を用量比例的に遮蔽した。さらに、該CD40結合蛋白は、休眠 Th ではなく、活性化 Th の膜上に選択的に発現される39kD蛋白と同定された。 CD40-Ig及び 39kD CD40結合蛋白に特異的な mabはPM ActによるＢ細胞活性化を遮蔽した。
【００６９】
数多くの膜蛋白が Th 依存性Ｂ細胞シグナル化との関係を取り沙汰されてきたが、ここに表した証拠はいくつかの分子（LFA-1 、CD4 、CD3 、α／β TCR、ICAM-1）の寄与を無いものとし、CD40を Th による同種のシグナル化に対するＢ細胞レセプターとして関与させる。データは、 CD40-Ig及びCD40結合蛋白に特異的な mabは Th 依存性Ｂ細胞活性化を阻害することを示している。
【００７０】
CD40に対するリガンドは、活性化 Th 上には発現されるが休眠 Th 上には発現されない 39kD 蛋白である。生化学実験は、電気泳動時の移動が還元剤によって影響を受けなかったことから、該 39kD 蛋白が一本鎖分子であることを示している。この実験中になされた作用試験に基づくと、活性化 Th 1 及び Th 2 は両方とも 39kD CD40結合蛋白を発現する。これは、 Th 1 及び Th 2 は両方ともＢ細胞周期エントリーを誘導することを示す作用試験に合致する。該 39kD 蛋白をさらに特徴付けする企図で、 39kD の MW 範囲内のcDNAコード化 CD 蛋白（CD53、CD27及びCD69）を COS細胞中に一時的にトランスフェクションし、該細胞を CD40-Ig結合について試験した。トランスフェクションされた COS細胞のいずれも、 CD40-Igを結合する蛋白を発現しなかった。それゆえに、 39kD 蛋白はこれらの CD 蛋白の一種ではないことが推測される。
【００７１】
Th 及びＢ細胞の間のシグナル形質導入に対する生化学的論拠は分かりにくかった。Ｔ細胞援助のためのシグナル形質導入分子としてのCD40の同定は、該CD40分子に連合することが知られている特定の生化学経路に注意を集中させる。CD40は、その細胞外領域中の４個のシステインリッチモチーフの存在によって、神経成長因子レセプター（NGFR）族の一員である。 mabによるCD40を通じてのシグナル化は、チロシンキナーゼの活性化を含み、その結果、トリスリン酸イノシトールの産生を増加させ、最低４個の別個のセリン／スレオニンキナーゼを活性化させることが示されている（ユークンら（Uckun et al.) 、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（J. Biol. Chem.）、266 巻、第17478-17485 頁、1991年）。該 NGFレセプター族の他のメンバーを通じてのシグナル化から得られ情報に基づくと、活性化 Th 及びＢ細胞の間の相互作用は同じ生化学過程のうちの多くを結果としてもたらすことが予想される。
実施例２
免疫蛍光法結合試験のために、CD40 Ig 融合蛋白をビオチン−スクシニミド（シグマ社）を用いてビオチンと共役化させた。流動血球計算分析をその後、コールターエピックスＣ装置によりフィコエリスリン（PE）−ストレパビジン（ベクチン−ディキンソン社）を用いた二段階染色によって行った。複数のＴ細胞株をスクリーニングした代表的な結果を以下に表す。ジャーカット及びHSB2細胞株は特異的に結合することが見出されたが、CEM 、HPBALL、及びネズミ胸腺腫を含む他のＴ細胞株はCD40 Ig 融合蛋白を結合しなかった（図７）。
【００７２】
種々の出版物をここに引用したが、それらはことごとく参考文献としてこれに組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 PMAct によるＢ細胞 RNA合成の誘導におけるモノクローナル抗体及びCD40-Ig の作用を表した図である。
【図２】 CD40-Ig によるＢ細胞分化及び増殖の阻害を表した図である。
【図３】 CD40-Ig の Th への結合を表した図である。
【図４】 Th からの[35S]-ラベル化蛋白の免疫沈降の結果を表した図である。
【図５】 Ig又は融合蛋白のＢ細胞 RNA合成に対する作用を表した図である。
【図６】 MR1及びCD40-Ig の分子の認識を比較した実験の結果を表した図である。
【図７】 CD40-Ig のヒト細胞株への結合を表した図である。
【図８】 CD40 cDNA のヌクレオチド配列を表す図である。
【図９】 CD40 cDNA のヌクレオチド配列を表す図である。
【図１０】 CD40-Ig を発現させるために用いることができるプラスミドの概略図である。
Claims (2)
- ＣＤ４０ Ｂ細胞抗原に結合し、かつ、Ｂ細胞周期エントリー、増殖及び分化を刺激する３９ｋＤのＴ細胞タンパク質であるＣＤ４０ＣＲに結合する有効濃度の、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１１０４８により産生される、ＣＤ４０ＣＲに対するモノクローナル抗体ＭＲ１にＢ細胞及びヘルパーＴ細胞の混合物をインビトロでさらすことを含む、インビトロでＢ細胞活性化を阻害する方法。
- 適当な医薬用担体の中に、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１１０４８により産生される、ＣＤ４０ Ｂ細胞抗原に結合し、かつ、Ｂ細胞周期エントリー、増殖及び分化を刺激する３９ｋＤのＴ細胞タンパク質であるＣＤ４０ＣＲに対するモノクローナル抗体ＭＲ１又はＣＤ４０ＣＲに結合するその断片を含む、Ｂ細胞活性化を阻害するための医薬用組成物。
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