KR100301146B1 - Cd4ob-세포항원에대한역-수용체및이에대한리간드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, CD40 B-세포 항원에 대한 역-수용체(CD40CR), 및 CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자를 포함한, CD40CR에 대한 가용성 리간드에 관한 것이다. 본 발명은 가용성 CD40/면역글로불린 용합 단백질이 조력 T-세포막상의 신규한 39kD 단백질 수용체와 결합함으로써 조력 T-세포 중재된 B-세포 활성화를 억제시킬 수 있었다는 발견을, 적어도 부분으로, 기초로 한다. 본 발명은 실질적으로 정제된 CD40CR 수용체; CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자 뿐만아니라 항체를 포함한, CD40CR의 가용성 리간드; 및 알레르기 또는 자가면역질환의 치료에 특히 유용할 수 있는 B-세포 활성화를 조절하는 방법을 제공한다.

Description

씨디 40 비-세포 항원에 대한 역-수용체 및 이에대한 리간드
제1도는 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도에 미치는 모노클로날 항체 및 CD40-Ig의 영향력을 보여주는 그래프이다.
제2도는 CD40-Ig가 B-세포의 분화 및 증식을 억제하였음을 보여주는 그래프이다.
제3도는 정지상태가 아닌 활성화된 Th상에 발현된 분자에 대한 CD40-Ig의 검색도이다.
제4도는 활성화된 Th1의 용해물로부터의 39kD단백질에 대한 CD40-Ig의 면역침강도이다.
제5도는 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도가 유도된 39kDTh막단백질에 특이적인 모노클로날 항체에 의해 억제된 결과를 보여주는 그래프이다.
제6도는 MR1 및 CD40-Ig이 활성화된 Th상에 발현된 동일분자를 인지하였음을 보여주는 데이타이다.
제7도는 사람의 세포주에 대한 CD40-Ig의 결합을 보여주는 그래프이다.
제8A도는 CD40 cDNA의 뉴클레오타이드서열을 도시한 것이다.
제8B도는 CD40-Ig의 발현용 플라스미드를 도시한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 CD40 B-세포항원에 대한 역-수용체(CD40CR이라 한다), 및 CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자를 포함한 상기 수용체에 대한 가용성 리간드에 관한 것이다. 본 발명은 가용성 CD40/면역글로불린 융합단백질이 조력 T-세포막상의 신규한 39kD단백질 수용체에 결합함으로써 조력 T-세포 중재된 B-세포 활성화를 억제시킬 수 있었다는 발견을, 적어도 부분적으로, 기초로 한다. 본 발명은 실질적으로 정제된 CD40CR수용체; CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자뿐만아니라 항체를 포함한, CD40CR의 가용성 리간드; 및 알레르기 또는 자가면역질환의 치료에 특히 유용할 수 있는 B-세포 활성화를 조절하는 방법을 제공한다.
미취슨(Mitchison), 베나세라프(Benacerraf) 및 라프(Raff)는 Th와 B-세포사이의 물리적 상호작용이 체액성 면역반응의 진전에 필수적이라는 연구결과를 처음으로 발표했다. 이후의 연구논문에 따르면 Th가 제2군의 주요조직 적합성 복합체(MHC) 적합성, 항원-제공성 B-세포와 물리적 결합체를 형성하였음이 보고되었고[Vitetta et al., (1987) Immunol. Rev. 99: 193-239], Th에 반응한 이들 결합체내에 B-세포가 존재하였음이 보고되었다[Bartlett et al., (1989) J. Immunol. 143: 1745-1754]. Th-유도된 림포킨이 B-세포에 성장력 및 분화효과를 제공한다는 발견과 더불어, 활성화된 Th에 의해 근접하여 분비된 가용성인자(들)이 상호작용하는 B-세포의 활성화를 중재하였음이 제시되었다. 그러나, 분자적으로 클로닝된 림포킨의 어떠한 것도, 단독으로 사용되거나 혼합하여 사용되어도, B-세포 주기 유입을 유도할 능력을 제공하지 못했다. 가용성 인자와는 달리, 활성화된 Th로부터의 원형질 막 분획은 B-세포 주기 유입을 유도했다[Hodgkin et al., (1990) J. Immunol. 145: 2025-2034; Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]. 활성화된 Th로 부터 정제된 원형질막 분획을 이용한 연구에서, 활성화된 Th의 막상에 발현된 단백질이 체액성 면역성을 개시하는 역할을 하였음이 제시되었다[Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124; Bartlett et al., (1990) J. Immunol. 145: 3956-3962].
활성화된 Th로부터 정제된 원형질막(PMAct)이 상기 작동물질 기능의 성질을 연구하는데 사용되어 왔다[Hodgkin et al., (1990) J. Immunol. 145: 2025-2034; Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]. 정지 Th로부터의 원형질막(PMrest)이 아닌, 활성화된 Th로부터의 원형질막 PMAct는 항원-비특이성, 제2군-비제한된 방식으로 B-세포 주기 유입을 유도한 활성을 나타냈다. 또한, PMAct에 의해 발현된 활성은 활성화(새로운 RNA합성)에 4 내지 6시간이 소모되었으며 본질적으로 단백질이었음이 제시되었다[Bartlett et al., (1990) J. Immunol. 145: 3956-3962].
본 발명은 CD40 B-세포항원에 대한 역-수용체(CD40CR이라 한다), 및 CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자를 포함한 상기 수용체에 대한 가용성 리간드에 관한 것이다. 본 발명은 가용성 CD40/면역글로불린 융합단백질이 조력 T-세포막상의 새로운 39kD수용체 단백질(CD40 역-수용체에 대한 "CD40CR"이라 한다)에 결합함으로써 조력 T-세포 중재된 B-세포 활성화를 억제할 수 있었다는 발견, 및 상기 39kD수용체에 대한 모노클로날항체(MR1이라 한다)가 B-세포의 조력 T-세포 중재된 활성화를 억제시킬 수 있었다는 발견을, 적어도 부분적으로, 기초로 한다.
본 발명은 실질적으로 정제된 CD40CR 수용체; CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자뿐만아니라 항체를 포함한, CD40CR의 가용성 리간드; 및 B-세포 활성화를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 양태로서, 대상자에서의 B-세포 활성화는 그 대상자의 조력 T-세포를 유효량의 CD40CR의 가용성 리간드와 접촉시켜 억제될 수 있다. B-세포 활성화의 그러한 억제는 알레르기 또는 자가면역질환의 치료에 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 한가지 이점은 항원특이성이 아닌 면역반응의 양상에서 개입을 가능하게 한다는 점이다. 현재의 많은 알레르기 치료법은 특정항원의 탈감작화를 포함하며 감수성과 연관된 항원을 동정하기위해 각 환자를 시험해야만 한다. 실제적인 문제로서, 각각의 잠재 알레르겐 및 모든 잠재 알레르겐에 대한 환자의 반응을 철저히 분석하는 것이 절대 불가능하다. 또한, 대부분의 자가면역상태에서, 원인성 항원은 일반적으로 알려져 있지 않거나 질병과정과 무관하기조차하다. 항원 비특이성 CD40/CD40CR상호작용에 관한 본 발명은 알레르기 또는 자가면역성과 연관된 항원을 성상확인할 필요성을 우회한다. 그러므로, 본 발명은 면역원이 밝혀져 있지 않거나 복수성분을 갖는 알레르기성증세, 예를 들면 고초열 또는 프로카인아미드 유도된 루푸스의 치료에 특히 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 면역활성화의 급성치료, 예를들면 과민증의 치료에 유용할 수 있다.
본원에 사용된 하기 약어들은 다음의 의미를 갖는다:
Ig - 면역글로블린
mab - 모노클로날항체
PMAct- 활성화된 조력 T-세포로부터 제조된 원형질막
PMrest- 정지 조력 T-세포로부터 제조된 원형질막
PAGE - 폴리아크릴아미드겔 전기영동법
rIL4 - 재조합 인터루킨4
rIL5 - 재조합 인터루킨5
SN - 상등물
Th- 조력 T-세포
Th1 - I-Ad-제한된 토끼 면역글로불린 특이성 클론 D1.6
제1도는 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도에 미치는 모노클로날 항체 및 CD40-Ig의 영향력을 보여준다.
판넬 A : 정지 B-세포를 Th1으로부터의 PMrest또는 PMAct와 배양하였다. 25㎍/ml의 항-CD4, 항-LFA-1 또는 항-ICAM-1 또는 이들의 혼합물(각각 25㎍/ml)을 PMAct가 함유된 웰에 첨가하고 [3H]-우리딘을 혼입시켜 B-세포 RNA합성을 측정하였다. B-세포 RNA합성은 배양후 42 내지 48시간 경과하여 평가하였다. 도시된 결과치는 3회 배양의 산술적 평균치 ±표준편차이며 5개의 실험을 나타낸다.
판넬 B : 정지 B-세포를 Th1(,) 또는 Th2()로부터의 PMAct와 배양하였다. Th1PMAct함유한 배양물(,)에 증가량의 CD40-Ig() 또는 대조단백질 CD7E-Ig()를 첨가하였다. Th2PMAct함유한 배양물()에 증가량의 CD40-Ig를 첨가하였다. 배양후 42 내지 48시간 경과하여 B-세포 RNA합성을 평가하였다. 도시된 결과치는 3회배양의 산술적 평균치 ±표준편차이며 3개의 실험을 나타낸다.
판넬 C : 정지 B-세포를 LPS(50㎍/ml) 또는 PMAct와 배양하였다. 배양물에 CD40-Ig(25㎍/ml; 빗금친막대) 또는 CD7E-Ig(25㎍/ml; 도색된 막대)를 첨가하였다. RNA합성을 판넬A에 기술된 바와같이 측정하였다. 도시된 결과치는 3회배양의 산술적 평균치 ±표준편차이며 3개의 실험을 나타낸다.
제2도는 CD40-Ig이 B-세포의 분화 및 증식을 억제하였음을 보여준다.
판넬 A : 정지 B-세포를 PMAct, rIL4(10ng/ml) 및 rIL5(5ng/ml)와 배양하였다. 배양의 개시점에서 또는 배양후 1, 2 또는 3일째에 CD40-Ig 또는 CD7E-Ig(25㎍/ml)를 첨가하였다. 배양 6일째, 각각의 웰로부터 SN을 수거하고 문헌[Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 항-복기준 특이성 ELISA를 이용하여 IgM() 및 IgG1()에 대해 정량하였다. PMAct, IL4 및 IL5의 존재하에(첨가된 CD40-Ig의 부재하에) IgM 및 IgG1의 농도는 각각 4.6㎍/ml 및 126ng/ml이었다. 0일에 CD7E-Ig(25㎍/ml)이 주입된 배양물은 2.4㎍/ml의 IgM과 89ng/ml의 IgG1을 생성하였다. IL4 와 IL5의 부재하에 IgM 또는 IgG1은 검출되지 않았다. 도식된 결과는 3개의 실험을 나타낸다.
판넬 B : Th1은 정지되었거나 항-CD3로 16시간동안 활성화되고, 조사된 다음 IL4(10ng/ml)의 존재하에 정지 B-세포(4 x 104/배양물)와 배양하였다(1 x 104/웰). 0 내지 25㎍/ml의 CD40-Ig () 또는 CD7E-Ig()를 배양물에 첨가하였다. 배양후 66 내지 72시간 경과하여, 웰을 12.0μCi의 [3H]-티미딘으로 펄스시키고 수거하였다. 점선은 정지 Th에 대한 B세포의 반응을 가리킨다. 도식된 결과치는 3회 배양의 산술적 평균치 ±표준편차이며 2개의 실험을 나타낸다.
제3도는 CD40-Ig이 정지상태가 아닌 활성화된 Th상에 발현된 분자를 검출하였음을 보여준다. 정지 Th및 활성화된 Th를 수거하고 4℃에서 20분동안 융합 단백질과 배양한 후 FITC-결합된 염소 항-hIgG(25㎍/ml)와 배양하였다. 적어도 5000개 세포/샘플을 분석하여 양성세포율 및 MF1 를 측정하였다. 도식된 결과는 6개 실험을 나타낸다. CD40-Ig 결합은 검게 도색된 프로파일로 나타낸다.
제4도는 CD40-Ig이 활성화된 Th1의 용해물로부터의 39kD단백질을 면역침강시켰음을 보여준다. Th1은 정지상태이거나 비용해된 항-CD3으로 16시간동안 활성화 되었다. 정지 Th또는 활성화된 Th로부터의 [35S]-표지된 단백질을 정제된 항체 또는 융합단백질(1-10μ)로 면역침강시켰다. 겔 프로파일은 3개 실험을 나타낸다.
제5도는 유도된 39Kd Th막단백질에 특이적인 모노클로날항체(mab)가 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도를 억제하였음을 보여준다. 정지 B-세포 및 PMAct를 각각 10㎍/ml의 항-α/β, 항-CD3, CD40-Ig 또는 MR1과 배양하였다. RNA합성을 제1도에 기술된 바와같이 측정하였다. 도식된 결과치는 3회배양의 산술적 평균치 ±표준편차이며 3개의 실험을 나타낸다.
제6도는 MR1 및 CD40-Ig가 활성화된 Th상에서 발현된 동일분자를 인지하였음을 보여준다.
판넬 A : 활성화된 Th를 MR1 또는 대조 Ig로 형광염색하였다. CD40-Ig와 MR1이 활성화된 Th와의 결합을 위해 경쟁하였는지를 평가하기위해, 농도별로 등급을 정한 MR1 또는 대조 햄스터 Ig(항-α/β TCR)을 항-CD40(20㎍/ml)와 함께 첨가하였다. 4℃에서 20분동안 배양한 후, 샘플을 세척하고, FITC-결합된 mab 항-사람 IgG1과 배양하였다. 도식된 결과는 3개 실험을 나타낸다.
판넬 B : [35S]-메티오닌-표지되고 활성화된 Th로부터의 단백질을 MR1(10㎍/샘플) 또는 CD40-Ig(10㎍/샘플)로 면역침강시키고 PAGE 및 형광사진으로 분석하였다. 도식된 결과는 2개실험을 나타낸다.
제7도는 CD40-Ig가 사람 세포주에 결합한 것을 보여준다. 여러가지의 사람 T-세포주가 바이오틴-표지된 CD40-Ig에 노출되었으며 결합은 유동 세포계수로 평가하였다.
제8도.
판넬 A : Stamenkovic et al., (1989) EMBO J. 8: 1403-1410으로부터의 CD40 cDNA의 뉴클레오타이드서열을 보여준다. 막전이영역은 점선으로 나타내었다.
판넬 B : CD40-Ig를 발현시키기위해 사용될 수 있는 플라스미드의 도해도이다.CD40의 융합부위에 있는 아미노산서열은 CD40의 다이아그램하단에 나타내었다.
본 발명은 실질적으로 정제된 CD40CR 수용체; CD40을 함유한 융합분자뿐만아니라 항체를 포함한 CD40CR의 가용성 리간드; 및 B-세포 활성화를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명을 한정하고자함이아니라 좀더 명료하게할 목적으로, 본 발명의 상세한 설명란을 다음의 소부로 나누고자 한다:
(ⅰ) CD40CR과 결합하는 리간드;
(ⅱ) CD40CR을 성상확인하기위해 사용된 방법;
(ⅲ) 정제된 CD40CR의 제조;
(ⅳ) CD40CR과 결합하는 리간드의 사용; 및
(ⅴ) CD40CR의 사용.
(ⅰ) CD40CR과 결합하는 리간드
본 발명은 (1) CD40단백질의 적어도 일부를 함유한 융합분자 및 (2) 항체 또는 항체 단편을 포함한 CD40CR의 가용성 리간드를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "가용성"은 본 발명의 리간드가 세포원형질막과 영구히 결합하지 않음을 가리킨다. 그러나, 본 발명의 가용성 리간드는 지질, 단백질 또는 탄수화물분자, 비드, 비히클, 자성입자, 섬유 등을 포함한 비-세포성 고체 지지체에 고착시키거나 이식체 또는 비히클로내로 봉입시킬 수 있다.
이러한 리간드가 CD40CR에 결합할 수 있는 능력은 리간드가 CD40-Ig(하기) 또는 MR1(하기)와 동일한 단백질과 결합함을 입증함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 리간드는 적합한 담체와 함께 약제 조성물내에 함유될 수 있다.
<융합분자>
본 발명은 CD40CR의 리간드인 가용성 융합분자를 제공한다. 이러한 융합분자는 제2분자에 부착된 CD40 단백질의 적어도 일부를 포함한다. CD40의 일부는 CD40막전이 도메인이 없는것이 바람직하다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 CD40단백질의 일부는 CD40CR과 결합할 수 있는 모든 일부로서 정의된다. 예를들면, 이러한 일부는 MR1 또는 CD40-Ig와 동일한 단백질과 결합하는 것으로 나타날 수 있다.
사용될 수 있는 제2분자로서는 펩타이드 및 단백질, 지질, 및 탄수화물이 포함되며, 본 발명의 바람직한 양태로서 면역글로불린분자 또는 이의 일부(예, Fv, Fab, F(ab')2또는 Fab'단편) 또는 CD8, 또는 다른 흡착분자(예, B7)일 수 있다. 제2분자는 사람이 아닌 공급원 또는 사람공급원으로부터 유도될 수 있으며, 또한 키메라성일 수 있다. 제2분자는, 또한, 효소, 독소, 성장인자, 림포킨, 증식억제제, 알킬화제, 항대사물질, 항생물질, 빈카알카로이드, 백금배위착염, 방사성동위원소, 또는 형광화합물일 수 있다.
본 발명의 융합분자는 화학적합성 또는, 바람직하게는 DNA 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다.
예를들면, CD40단백질의 적어도 일부를 암호화한 핵산서열을 적합한 발현 벡터내의 제2분자 암호화 헥산서열과 조합시킨다음 원핵성 발현 시스템, 바람직하게는 진핵성 발현시스템(예, 효모), 배큘로바이러스, 또는 트란스제노시스성동물을 포함한 포유동물 발현 시스템내에서 발현시킬 수 있다.
다른 방도로서, DNA재조합 기술을 이용하여 CD40단백질의 적어도 일부를 발현시킨다음 제2분자에 화학적으로 연결시킬 수 있다.
CD40을 함유한 융합분자는, CD40 또는 제2분자와 결합하는 리간드를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는 전기영동기술을 이용하여, 제조 혼합물로부터 정제시킬 수 있다. CD40과 결합하는 리간드에는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 수탁번호 HB9110호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 G28-5와 같은 항-CD40항체, 및 하기 (ⅱ) 및 (ⅲ)단락에서 상세히 기술된 CD40CR이 포함된다. 그러나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 만일 제2분자가 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편인경우, 항-면역글로불린 항체를 함유한 친화성 컬럼이 사용될 수 있다. 만일 제2분자가 Fc단편을 함유한 경우, 단백질 A컬럼이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라 CD40의 일부는 막전이 도메인으로부터 상부 절두된 CD40단백질의 암호화 핵산서열을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 핵산서열은 문헌[Stamenkovic et al., (1989) EMBO J. 8: 1403-1410]에 기술된 것과 같은 CD40항원 암호화 cDNA를 함유한 플라스미드 PstI (P) 및 Sau 3A (S3) 제한효소로 분해시켜 제조할 수 있다. 생성된 P/S3 단편을 Bam H1 (B)로 분해된 동일한 플라스미드내로 아클로닝시켜 절두된 CD40유전자를 제조할 수 있다.
본 발명의 특정한 양태로서, CD40의 적어도 일부뿐만아니라 면역글로불린 서열을 함유한 리간드를 제조하기위해 사용된 발현벡터는, 바람직하게는, 바이러스-유도된 복제원, 세균성 복제원, 세균성 선별마커, 및 CD40의 적어도 일부를 암호화한 DNA서열의 아클로닝을 허용하는 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 면역글로불린 불변영역의 암호화 DNA서열로부터 분리된 진핵성 프로모터 및 인핸서서열에 이어 폴리아데닐화 시그날서열을 함유할 수 있다(참조: 제 8.b도).
본 발명의 특정 양태로서, 절두된 CD40유전자를 문헌 [Aruffo et al., 1990, Cell 61: 1303-1313]에 기술된 것과같은 면역글로불린 융합 플라스미드내로 Mlu I 및 B분해를 이용하여 아클로닝시켜, 융합분자 CD40-Ig를 암호화한 플라스미드 pCD40-Ig를 형성할 수 있다(참조: 제8도). 그런다음, COS세포를 pCD40-Ig 플라스미드로 형질감염시켜 일시성 발현 시스템을 형성하여 CD40-Ig 융합단백질을 생성할 수 있다. 생성된 CD40-Ig는 COS세포 상등물로부터 수거하고 문헌[Aruffo et al., 1990, Cell 161: 1303-1313]에 기술된 바와같이 단백질 A 컬럼 크로마토그래피하여 정제할 수 있다.
<항체>
본 발명의 가용성 리간드는 CD40CR과 결합하는 항원 결합부위를 함유한 항체분자, 모노클로날항체분자 또는 이들 항체분자의 단편일 수 있다. 이러한 리간드는, 또한, 단백질, 지질, 탄수화물, 효소, 독소, 성장인자, 림포킨, 증식억제제, 알킬화제, 항대사물질, 항생물질, 빈카 알카로이드, 백금 배위착염, 방사성동위원소, 또는 형광 화합물일 수 있는 제2분자를 함유하고 항체분자 또는 단편에 연결될 수 있다.
리간드가 모노클로날 항체 또는 이의 단편인경우, 배양물에서 연속세포주에 의해 항체분자의 생성을 제공하는 기술을 사용하여 CD40CR에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 예를들면, 코흘러와 밀스타인에 의해 최초로 개발된 하이브리도마기술(Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495-497)뿐만아니라 최근에 이용되고 있는 기술, 예를들면 사람 B-세포 하이브리도마기술(Kozbar et al., 1983, Immunology Today 4: 72) 및 사람의 모노클로날항체를 제조하는 EBV-하이브리도마기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)등이 본 발명의 범위내에 속한다.
상기 모노클로날항체 분자의 인자형을 함유하는 항체분자는 공지 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를들면, 이러한 단편에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 항체 분자를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab')2단편; F(ab')2단편의 디설파이드 브릿지를 환원시켜 생성될 수 있는 Fab'단편; 항체분자를 파파인으로 처리하여 생성될 수 있는 F(ab')2단편; 및 항체분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 두개 Fab와 Fab단편이 포함된다.
또한, 본 발명은 문헌[Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855 또는 Morrison 등의 유럽특허원 제85305604.2호 (1986년 3월 5일자 공개된 공보 제0173494호)]에 기술된 것과 같은 본 분야의 공지기술에 의해 제조된 키메라성항체를 제공한다.
항체의 제조를 위한 면역원은 CD40CR을 함유한 모든 공급원일 수 있다. 예를들면, 활성화된 Th가 면역원으로서 사용될 수 있다. 또한, 상기된 바와같이 제조된 실질적으로 정제된 CD40CR이 사용될 수 있다. 만일 활성화된 Th가 면역원으로서 사용된 경우, 정지상태가 아닌 활성화된 Th세포에 대한 반응성에 대해 항혈청을 시험할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 가용성 리간드는 MR1 모노클로날항체이다. 하기 방법을 사용하여 MR1 모노클로날항체를 제조하였으며 이 방법은 CD40CR에 대한 다른 항체를 생성하기위해 사용될 수 있다.
햄스터를 일주간격으로 6주동안 5-106활성화된 Th1세포(D1.6)로 복강주사하여 면역화하였다. 쥐의 Th1에 대한 형청역가가 약 1:10,000이상일때, 면역 햄스터 비세포와 NSI를 이용한 세포융합을 폴리에틸렌글리콜로 수행하였다. 성장한 하이브리도마를 함유한 웰로부터의 SN을 유동세포 계수에 의해 정지 Th1 및 활성화된 Th1에 대해 스크리닝하였다. 활성화된 Th를 선별적으로 인지한 mab를 생성하는 한 특정 하이브리도마를 또한 시험하고 MR1을 유도하기위해 아클로닝시켰다. MR1은 복수중에 생성되었으며 이온교환 HPLC에 의해 정제되었다.
본 발명은, 또한, MR1이 이의 표적항원에 결합하거나 CD40-Ig가 이의 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제시킬 수 있는 모노클로날항체 및 이의 단편을 함유한 리간드를 제공한다.
(ⅱ) CD40CR을 성상확인하기위해 사용된 방법
CD40CR은, (1) CD40, CD40의 적어도 일부를 함유한 융합분자 및 MR1과 같은 항체와의 결합능력, (2) B-세포 주기유입, 증식 및 분화를 자극할 수 있는 작용특성, 및 (3) 세포의 분포에 의해 성상확인 될 수 있다.
<리간드와의 결합능력>
CD40CR은, CD40, CD40을 함유한 융합분자 및 CD40CR에 대한 항체와 같은 리간드와 결합할 수 있는 능력에 의해 성상확인될 수 있다.
이하에서 상세히 설명되는 바와같이 몇가지 기술을 사용하여 CD40CR을 성상확인하였다. 예를들면, CD40-Ig 및 MR1은 동일한 39kD분자를 인지하는 것으로 나타났다. CD40-Ig 및 MR1 둘다는 방사성 표지된 Th용해물로부터 39kD단백질형을 침강시키는 것으로 밝혀졌다(제5b도). 또한, CD40-Ig에 의한 39kD단백질의 침강결과 Th용해물로부터 MR1에 의해 인지된 항원이 제거되었다.
<B-세포의 자극능력>
CD40CR은, 또한, B-세포주기유입, 증식 및 분화를 자극하는 능력에 의해 성상확인될 수 있다.
예를들면, 정지 Th세포로부터의 원형질막(PMrest)이 아닌 활성화된 Th세포로부터의 원형질막(PMAct)은 B-세포 RNA합성을 유도하는 것으로 밝혀졌다(제1a도); B-세포 활성화를 가리키는 이러한 유도는 항-LFA-1, 항-CD4, 항-ICAM-1과 같은 항체에 의해 이루어지지 않았다. 그러나, CD40-Ig 또는 MR1은 제1b도 및 제6도에 도시된 바와같이 PMAct-유도된 B-세포 활성화를 억제시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
B-세포 활성화의 유도는 RNA내로 [3H]-우리딘을혼입시키는 것과 같은 기술 (B-세포가 분화함에 따라, RNA합성이 증가한다), 또는 [3H]-티미딘혼입(세포증식과 연관된 DNA합성을 측정한다)에 의해 측정할 수 있다. B-세포증식에 미치는 CD40CR의 영향력을 최적으로 측정하기 위해서는, 인터루킨-4(IL-4)를 약 10ng/ml의 농도로 배양배지에 첨가할 수 있다.
또한, B-세포 활성화는 면역글로불린 분비의 기능으로서 측정할 수 있다. 예를들면, 실질적으로 정제된 형태로서, PM에 존재하는 형태로서 또는 기타 다른 형태로서 CD40CR을 IL-4(10ng/ml) 및 IL-5(5ng/ml)와 함께 정지 B-세포에 첨가할 수 있다. 3일간의 배양후, 추가용량의 배양배지를 첨가할 수 있다. 배양 6일째, 각각의 배양물로부터의 상등물(SN)을 수거하고 문헌[Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 IgM 및 IG1에 대해 정량할 수 있다.
<세포분포>
CD40CR은, 또한, 이의 세포분포에 의해 성상확인할 수 있다. 예를들면, CD40-Ig는 유동 세포계수에 의해 평가된 바와같이 정지 Th1이 아닌 활성화된 Th1에 결합하는 것으로 관찰되었다(제3도). 또한, CD40-Ig는 쥬르켓 세포(Jurkat cells), HSB2세포, 및 사람 말초혈액으로부터의 활성화된 T-세포에 결합하는 것으로 관찰되었으나, CEM세포, HPBALL세포 또는 쥐의 흉선종세포와는 거의 결합하지 않는 것으로 나타났다.
이로써 한정되는 것은 아니지만 예를들면, 특정세포형("시험세포")상에 CD40CR의 존재는 유동세포 계수에 의해 다음과 같이 평가할 수 있다. 시험세포는 정지 Th세포(음성대조군) 및 활성화된 Th세포(양성대조군)와 병행하여 시험할 수 있다. 모든 세포는 리간드(예, CD40-Ig 또는 MR1)와 함께 약 1 x 105세포/50㎕의 농도로 배양한 후, FITC-연결된 항-리간드 항체와 배양할 수 있다. 프로피듐요오다이드를 모든 샘플에 2㎍/ml의 농도로 첨가할 수 있다. 이어서, 유동세포 계수 분석을, 예를들면, BD FACSCAN상에서 수행할 수 있다. 전방-대-측방 산란 및 적색음성(프로피듐요오다이드의 경우)에 의해 세포를 양성게이팅한 후, 가시세포의 로그녹색형광을 확인할 수 있다.
(ⅲ) 정제된 CD40CR의 제조
본 발명은 실질적으로 정제된 CD40CR을 제공한다. 이러한 CD40CR은 CD40CR 함유세포(예, 활성화된 조력 T-세포, 쥬르켓, 및 HSB2세포)로부터 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.
원형질막은 활성화된 Th1세포와 같은 적합한 세포로부터 문헌[Noelle et al., 1991, J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 불연속 자당구배 침강법에 의해 제조할 수 있다. 그런다음, 조 막추출물을 약한 세정제로 해리시킨 후 크기별 배제 크로마토그래피하고 고체 지지체에 결합된 적합한 리간드(예, MR1 또는 CD40-Ig)를 이용하여 친화성 크로마토그래피한 다음, 면역침강(예, CD40-Ig 또는 MR1을 이용)시키고/시키거나 겔 전기영동하여, 분리할 수 있다.
생성된 단백질은 약 39kD의 분자량을 갖는 것으로 기대될 수 있다.
본 발명은 적합한 담체와 함께 약제 조성물중에 함유될 수 있는 가용성 CD40CR(즉, 세포-유리된 상태)을 제공한다. 또한, 본 발명은 펩타이드, 단백질, 지질, 탄수화물, 효소, 독소, 성장인자, 림포킨, 증식억제제, 알킬화제, 항대사물질, 항생물질, 빈카알카로이드, 백금배위착염, 방사성동위원소 또는 형광화합물일 수 있는 제2분자에 연결된 CD40CR을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학합성 또는 DNA 재조합 기술에 의해 제조된 실질적으로 정제된 CD40CR을 제공한다. 예를들면, CD40CR의 암호 유전자는 활성화된 조력 T-세포로부터 제조된 cDNA를 λgt10 발현 시스템내로 삽입시킨다음 MR1 또는 CD40-Ig와의 결합여부로 선별하여 CD40CR-발현 클론을 동정함으로써 분리할 수 있다. 또한, 활성화된 조력 T-세포로부터 제조된 cDNA를 COS세포내로 형질감염시키고, 이의 상등물을 MR1 또는 CD40-Ig로 스크리닝하여 CD40CR 생성세포를 동정할 수 있다. 그런다음, CD40CR의 암호 유전자를 본 분야에 공지된 발현 시스템을 사용하여 CD40CR로 발현시킬 수 있다.
(ⅳ) CD40CR과 결합하는 리간드의 사용
본 발명은 CD40CR과 결합하는 리간드를 이용하여 B-세포 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 B-세포와 Th세포의 혼합물을 CD40CR과 결합하는 리간드 유효농도에 노출시켜, B-세포 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 사용될 수 있는 리간드는 상기 (ⅰ)단락에서 기술된 바와 같다. 본 발명의 리간드의 농도로서 본 분야에 공지된 기술 (상기 (ⅱ)단락에서 기술된 것을 포함함)에 의해 적어도 약 30%, 바람직하게는 약 75%로 측정된다. 본 발명의 바람직한 특정 양태로서, CD40-Ig가 리간드로서 사용될 수 있으며, 이경우에, 유효농도는 적어도 약 10㎍/ml일 수 있다. 본 발명의 다른 특정 양태로서, 모노클로날항체 MR1이 사용될 수 있으며, 이경우 유효농도는 적어도 약 10㎍/ml일 수 있다. 본 방법이 생체내에서 실행되는 경우, 리간드의 유효농도는 리간드의 혈장농도 또는 국부농도를 의미할 수 있다. 예를들면, 면역시스템에 대한 영향력을 대체로 한정시키기 위하여, 한정된 지역에서 B-세포 활성화를 억제시킬 필요가 있다.
특별한 양태로서, 본 발명은 B세포 활성화와 연관된 질환을 앓고 있는 환자에게 CD40CR과 결합하는 리간드 치료량을 투여하여, 그 환자의 치료하는 방법을 제공한다. 환자는 사람이 아닐 수 있으며, 바람직하게는 사람이다.
이들로 한정되는 것은 아니지만, B-세포 활성화와 연관된 질환에는 알레르기(과민증이 포함됨); 의약 유도된 루푸스, 전신성 루푸스 홍반, 성인 류마티스성관절염, 유년 류마티스성관절염, 공피증, 쇼그렌증후군등을 포함한 자가면역질환; 및 엡스타인-바르감염 및 레트로바이러스성 감염(사람면역결핍 바이러스에 의한 감염을 포함함)을 포함한, B-세포 관련 바이러스성 질환이 포함된다.
B-세포 활성화는 잠복성으로부터 사람면역결핍 바이러스복제의 유도와 연관된 것으로 시사되어왔기때문에, AIDS 또는 ARC가 발전되지않은 HIV양성자에게 본 발명의 리간드를 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
리간드는 정맥내, 복강내, 피하, 포막내, 동맥내, 또는 근육내주사 및 경구, 비내, 안내 및 직장투여를 포함한 본 분야에 공지된 방법에 의해 적합한 약제학적 담체내에서 투여할 수 있으며 미소구, 리포좀 및/또는 지방성 이식체내에 함유될 수 있다.
리간드의 치료량은 B-세포 활성화의 해로운 임상효과를 현저히 감소시키는 양으로서 정의되며 사용된 리간드의 종류 및 질병상태에 따라 다양할 수 있다. CD40-Ig가 사용되는 경우, 치료농도는 전신적으로(혈장 농도) 또는 국부적으로 약 10㎍/ml일 수 있다. MR1이 사용되는 경우, 치료농도는 전신적으로(혈장농도) 또는 국부적으로 약 10㎍/ml일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 방법은 Th세포가 치사되거나 상해되고 B-세포 활성화가 Th세포 파괴의 결과로서 감소되도록 독소 또는 항대사물질을 함유한 리간드를 사용할 수 있다.
본 발명의 리간드는, 또한, 활성화된 T세포를 표지시키기위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 T세포질환의 진단에 유용할 수 있다. 결국, 효소, 방사성동위원소, 형광화합물 또는 기타 검출가능한 라벨을 함유한 리간드를 시험관내 또는 생체내에서 T세포에 노출시킬 수 있으며 결합양을 정량할 수 있다.
또한, 본 발명의 리간드는 활성환된 T-세포에 성장인자와 같은 물질을 전달하기위해 사용될 수 있다.
(ⅴ) CD40CR의 사용.
본 발명은 상기한 (ⅲ)단락에서 기술한 바와같이 제조된 CD40CR을 함유한 분자 또는 CD40CR을 이용하여 B-세포 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 유효농도의 CD40CR에 B-세포를 노출시켜 B-세포 활성화를 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 발명 방법은 생체내 또는 시험관내에서 실행할 수 있다. 유효농도는 B-세포 활성화를 유도하는 수용체의 농도를 의미하는 것으로 본 분야에 공지된 기술(상기한 (ⅲ)단락에 기술된 것을 포함함)에 의해 적어도 약 30%로 측정된다. 본 발명의 특정 양태로서, CD40CR의 농도는 국부적으로 또는 전신적으로 약 10㎍/ml일 수 있다.
특별한 양태로서, 본 발명은 감소된 체액성 면역성을 앓고 있는 환자에게 치료양의 CD40CR을 투여하여, 그 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 그 환자는 사람이 아닐 수 있으며, 바람직하게는 사람이다.
감소된 체액성 면역성과 연관된 면역결핍질환에는 후천성 면역결핍 증후군, 악성종양 또는 악액증과 연관된 면역결핍증, 예를들어 화학요법 또는 방사선요법에 의해 발병된 의사원인면역결핍증, 및 체액성면역성 연관된 유전질환이 포함된다.
CD40CR은 정맥내, 복강내, 피하, 포막내, 동맥내, 또는 근육내주사 및 경구, 비내, 안내 및 직장투여를 포함한 본 분야에 공지된 방법에 의해 적합한 약제학적 담체내에서 투여할 수 있으며 미소구, 리포좀 및/또는 지방성 이식체내에 함유될 수 있다.
CD40에 대한 CD40CR의 치료량은 면역글로불린 생성을 적어도 약 30%까지 증가시키는 양으로서 정의된다.
또다른 양태로서, CD40CR은 독소에 연결시킨다음 CD40을 발현하는 B-세포를 파괴시키는 것이 바람직한 상황하의 대상자에게 투여할 수 있다. 이러한 상황의 예로서는 기관이식편을 제공받는 환자 또는 다발성 골수종 또는 다른 B-세포 악성종양, 또는 자가면역질환을 앓고 있는 환자가 포함된다.
CD40CR은, 또한, CD40을 발현하는 B-세포를 표지하기위해 사용될 수 있다. 이러한 기술운 B-세포질환의 진단에 유용할 수 있다. 결국, 효소, 방사성동위원소, 형광화합물 또는 다른 검출가능한 라벨에 연결된 수용체를 생체내에서 또는 시험관내에서 B-세포에 노출시킬 수 있으며 결합양을 정량할 수 있다.
CD40CR은, 또한, 이에 연결된 분자를 B-세포로 전달시키기 위해 사용될 수 있다.
<실시예; 활성화된 T-세포상의 신규 수용체 CD40CR은 CD40과 결합하고 B세포의 동종 활성화를 위한 시느날을 전도한다.>
재료 및 방법
(1) 동물
Th클론의 성장을 지지하는 부형세포의 제조 및 정지 B-세포의 제조를 위해 암컷 DBA/2J 마우스(ME 바르하보 소재의 잭슨 라보라토리즈로부터 입수)를 사용하였다.
(2) 조력 T-세포클론(Th)
보르세스터(Worcester)소재 매사츄세츠대학의 David Parker박사로부터 I-Ad-제한된, 토끼 Ig-특이성 Th1클론인 D1.6을 입수하였다. D1.6은 본원에서 Th1으로서 언급된다.
(3) 항-CD3에 의한 Th의 활성화
40㎍/ml의 PBS/웰로 피복된 다발웰(6웰, 뉴욕 소재 코닝사로부터 입수)에서 문헌[Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 16시간동안 Th1을 배양하였다(8 x 106/웰).
(4) Th원형질막의 제조
문헌[Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 불연속 자당구배 침강법으로 원형질막을 제조하였다.
(5)정지 B-세포의 제조
문헌[Defranco et al., (1982) J. Exp. Med. 155: 1523]에 기술된 바와같이 불연속 퍼콜구배상에 침강시켜 정지비장 B-세포를 제조하였다. 70-75%(1.087-1.097의 밀도) 퍼콜계면으로부터 분리된 세포는 전형적으로 95%이상의 mIg+이고, 균일하고 낮은 근전방 광산란도를 가지며 ConA에 반응하지 않았다.
(6) 항체
조사되고 골수가 재구성된 마우스의 복수액으로부터 이온교환 HPLC하여 다음의 mab를 정제하였다: 항-CD3: 145-2c11 (Leo et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84; 1374-1378); 항-α,β: H57-597; 항-CD4: GK1.5 (Wilde et al., (1983) J. Immunol. 131: 2178-2183); 항-ICAM:YN1/1.7.4 (Prieto et al,, (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1551-1557); 항-LFA-1: FD441.8 (Sarmiento et al., (1982) Immunol. Rev. 68: 135); 및 항-랫트/햄스터 k사슬: RG-7 (Springer, (1982) Hybrid. 1: 257-273).
(7) CD40 재조합 글로불린(CD40-Ig)의 제조
CD40항원의 암호화 cDNA를 함유한 플라스미드(Stamenkovic and Seed, (1989) EMBO J. 8: 1403-1410)를 제한효소 Pst I (P) 및 Sau 3A (S3)으로 분해시켜 CD40 융합 단백질을 제조하였다. 이 P/S3단편을 P 및 Bam H1 (B)으로 분해된 동일한 플라스미드내로 아클로닝시켰다. 이에따라, 막전이 도메인으로부터 상부절두된 CD40단백질을 암호화한 CD40이 제조되었다. 그런다음 CD40의 암호화 DNA단편을 MluI 및 B분해를 이용하여 면역글로불린 융합 플라스미드(Aruffo et al., (1990), Cell 61: 1303-1313)내로 아클로닝시켰다. COS세포내에 일시성 형질감염시켜 CD40-Ig 융합 단백질을 생성하고 문헌[Aruffo et al., (1990), Cell 61: 1303-1313]에 기술된 바와같이 단백질 A 컬럼상에서 정제하였다.
(8) 림포킨
인터루킨4(IL4): 재조합 마우스 IL4는 일반적으로 워싱턴 시애틀 소재의 이뮤넥스 코포레이션의 C. Maliszewski와 K. Grabstein박사로부터 제공받았다.
인터루킨5(IL5): 재조합 마우스 IL5는 캘리포니아 사렌토 소재의 알 앤드 디 리써치로부터 구매하였다.
(9) 활성화된 Th원형질막에 의한 B-세포 RNA합성의 유도
3 x 104정지 B-세포를 A/2미소역가 웰(매사츄세츠 캠브릿지 소재의 코스타르로부터 입수)내의 cRPMI 50㎕중에서 배양하였다. 이 웰에 0.5 ㎍의 Th1 또는 Th2막단백질을 첨가하였다. 42 내지 48시간후에, 웰을 2.5μci의 3H-우리딘(매사츄세츠 캠브릿지 소재의 뉴 잉글랜드 뉴클리어로부터 입수)로 펄스시키고, 수거한 다음, 방사성을 액체 신틸레이션 분광검사법으로 측정하였다. 이의 결과는 cpm/배양물 ±표준편차로서 나타내었다.
(10) 활성화된 Th원형질막 및 림포킨에 의한 B-세포 면역 글로불린 분비의 유도
정지 B-세포를 상술한 바와같이 배양하였다. 배양웰에 0.5㎍의 Th1막단백질, IL4(10ng/ml) 및 IL5(5ng/ml)를 첨가하였다. 배양 3일째, 50㎕의 cRPMI를 추가로 첨가하였다. 배양 6일째, 각각의 웰로부터 SN을 수거하고, 문헌[Neolle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 IgM 및 IgG1에 대해 정량하였다.
(11) 활성화된 Th및 IL4에 의한 B-세포 증식의 유도
4 x 104개의 정지 B-세포를 A/2미소역가 웰(매사츄세츠 캠브릿지 소재의 코스타르로부터 입수)내의 cRPMI 50㎕중에서 배양하였다. 이들 웰에, 1 x 104개의 정지 또는 활성화되고 조사된(500rads) Th1 및 IL4(10ng/ml)를 첨가하였다. 배양 3일째, 문헌[Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]에 기술된 바와같이 1μci의3H티미딘으로 펄스시켰다.
(12) 활성화된 Th1상에 유도된 막단백질에 특이적인 모노클로날항체의 제조
일주간격으로 6주동안 햄스터에 5-10 x 106개 활성화된 Th1(D1.6)를 복강주사하여 햄스터를 면역화하였다. 쥐의 Th1에 대한 혈청역가가 1:10,000이상일때, 면역 햄스터 비세포 및 NS1을 이용하여 폴리에틸렌글리콜로 세포융합을 수행하였다. 성장한 하이브리도마가 함유된 웰로부터의 SN을 유동세포 계수에 의해 정지 Th1 및 활성화된 Th1에 대해 스크리닝하였다. 활성화된 Th를 선별적으로 인지한 mab를 생성한 한 개의 특정 하이브리도마를 시험하고 아클로닝시켜 MR1을 유도하였다. MR1은 복수중에 생성되었고 이온교환 HPLC에 의해 정제되었다.
(13) Th상에 발현된 활성화분자의 유동세포 형광측정 분석
정지 및 활성화된 Th(항-CD3로 16시간)를 수거하고 융합 단백질과 1 x 105개세포/50㎕로 4℃에서 20분간 배양한 후, FITC-연결된 염소 항-사람(h) IgG(25㎍/ml; AL 버밍햄소재의 싸우썬 바이오테크놀러지로부터 입수)와 배양하였다. 모든 샘플에 프로피듐요오다이드를 2㎍/ml의 최종농도로 첨가하였다. 유동세포형광측정 분석을 BD FACSCAN상에서 수행하였다. 전방-대-측방 산란 및 적색음성(프로피듐요오다이드배제의 경우)에 의한 세포의 양성 게이팅후, 생존세포의 로그 녹색형광이 확인되었다. 양성세포율 및 MFI를 측정하기위해 적어도 5000개의 생존세포를 분석하였다. MR1으로의 염색에는 FITC-연결된 RG7, 즉 마우스 항-랫트/햄스터 k사슬 mab가 사용되었다.
(14) 생합성 표지화, 면역침강, SDS-PAGE 및 형광사진
Th1은 정지시키거나 비용해된 항-CD3로 16시간동안 활성화시켰다. 정지 및 활성화된 Th(20 x 106/ml)로부터의 단백질을 1mci [35S]-메티오닌/시스테인으로 1시간동안 표지시키고 이때 이들을 RPMI/10% FCS중에서 2회 세척한 다음, 세포 펠렛을 문헌[Noelle et al., (1986) J. Immunol. 137: 1718-1726]에 기술된 바와같이 용출 완충액중에 용해시켰다. 정제된 항체 또는 융합 단백질(1-10㎍)을 500㎕의 용해물( 5 x 106개 세포 균등물) 4℃하에서 16시간동안 첨가하였다. 이때에 용해물을 50㎕의 포장된 단백질 A-세파로즈가 함유된 튜브로 옮겼다. 펠렛화된 단백질 A-세파로즈를 재현탁시키고 튜브를 4℃에서 1시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 이어서, 샘플을 고농밀 세정 완충액으로 3회 세척하였다. 펠렛화된 단백질 A-세파로즈를 30㎕의 SDS 샘플 완충액중에 재현탁시키고 10% 폴리아크릴아미드겔 상에 시행하였다. 겔을 시행시킨 후, 겔을 고정시키고 형광사진을 촬영하였다.
결과
(1) PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도에 미치는 모노클로날항체의 영향력
PMAct에 의한 B-세포 주기 유입의 유도를 중재한 세포 표면 분자를 파악하기 위하여, Th막단백질에 대한 mab를 PMAct및 B-세포의 배양물에 첨가하였다. PMAct는 PMrest로 관찰된 것에 비하여 8배로 B-세포 RNA합성을 유도하였다(제1a도). 항-LFA-1, 항-CD4, 항-ICAM-1을 단독으로 또는 혼합하여 첨가한 결과 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도가 억제되지 않았다.
(2) CD40-Ig는 Th-유도된 B-세포 주기 유입, 분화 및 증식을 억제하였다.
사람 시스템에서, 항-CD40 mab는 B-세포 증식을 유도하는 것으로 제시되어 왔으며[Clark and Lane, (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:97-127], 그러므로써 CD40은 B-세포에 대한 중요한 유도분자로서 연루된다. CD40이 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도에 관련이 있는지를 측정하기 위하여, 사람 CD40의 세포의 도메인과 사람 IgG1(CD40-Ig)의 Fc도메인과의 가용성 융합 단백질을 PMAct와 B-세포의 배양물에 첨가하였다. Th1 및 Th2로부터 유도된 PMAct를 제조하고 B-세포 RNA합성을 자극하기 위해 사용하였다. CD40-Ig를 배양물에 첨가한 결과 Th1 및 Th2로부터 PMAct에 의해 유도된 B-세포 RNA합성이 용량-의존적으로 억제되었다(제1b도). Th1 및 Th2로부터 PMAct에 의해 유도된 B-세포 RNA합성의 반-최대억제는 약 5㎍/ml CD40-Ig에서 이루어졌다. CD7E-Ig 융합 단백질[Damle and Aruffo, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6403-6407]은 25㎍/ml으로 사용될때조차 어떠한 효과도 없었다.
CD40-Ig가 T-독립성 활성화제에 의한 B-세포의 활성화를 억제하였는지를 조사하기 위하여, B-세포를 LPS와 CD40-Ig의 존재하에 배양하였다. 2일째, RNA합성을 평가하였다(제1c도). CD40-Ig는 LPS에 의한 B-세포의 활성화를 억제시키는데 유효하지 않았으나, PMAct에 대한 B-세포의 반응을 억제시켰다.
PMAct, IL4 및 IL5의 존재하에서, B-세포는 폴리클로날적으로 분화하여 Ig를 생성하였다[Hodgkin et al., (1990) J. Immunol. 145: 2025-2034; Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124]. 이 과정에서의 CD40 신호화에 대한 요건을 평가하기위하여, CD40-Ig를 배양 개시시에 또는 배양후 수일간 연속적으로 첨가하였다. CD40-Ig의 첨가(제2a도)는 이를 첨가하지 않은 대조군의 수준과 비교하여 95%이상의 폴리클로날 IgM 및 IgG1 생성을 억제하였다. 대조적으로 배양 1일 및 2일째 CD40-Ig의 첨가는 IgM 및 IgG 생성에 대해 억제효과를 보여주지 않았다. 이러한 데이타는 24시간 후 CD40을 통한 신호화는 Ig분비로의 B-세포의 분화에 더이상 필수적이지 않음을 가리킨다.
지금까지의 데이타는 CD40이 PMAct에 의한 B-세포의 활성화에 연루되어 있음을 시사한다. 또한, CD40이 활성화된 완전한 생존 Th에 의한 B-세포의 활성화에 관련하고 있음을 확신하기 위하여 연구를 수행하였다. Th1을 비용해된 항-CD3으로 16시간동안 활성화시키고, 수거한 다음, 조사하였다. 조사된 Th1을 IL4의 존재하에 B-세포와 배양하고 B-세포 증식을 배양 3일째 측정하였다. Th1은 IL4를 생성하지 않기때문에[Noelle et al., (1989) J. Immunol. 143: 1807-1814], Th1으로 B-세포의 증식을 달성하는데 IL4의 외인성 공급원이 필요하였다. CD40-Ig는 PMAct으로 관찰된 것(제2b도)과 유사하게 용량-의존적 방식으로 조사된 Th에 의한 B-세포 증식의 유도를 억제하였다. 음성 대조군 CD7E-Ig는 평가할만한 효과를 나타내지 못했다.
(3) CD40-Ig는 정지상태가 아닌 활성화된 Th상에서 발현된 분자를 검출하였다.
활성화된 Th1이 CD40에 대한 결합 단백질을 발현하는지를 조사하기 위하여, 정지 Th1 및 활성화된(16시간) Th1을 CD40-Ig 또는 CD7E-Ig로 염색한 후 이어서 FITC-항-HIgG로 염색하였다. CD40-Ig의 결합을 유동세포 계수로 평가하였다(제3도). 정지 Th1이 아닌, 항-CD3으로 16시간동안 활성화된 Th1은 CD40-Ig로 56% 양성염색되었으나 대조 CD7E-Ig로는 염색되지 않았다. CD40-Ig 결합 단백질을 동정하기위하여, Th1단백질을 [35S]-메티오닌/시스테인으로 생합성적으로 표지시키고, 단백질을 CD40-Ig 또는 CD7E-Ig로 면역침강시켰다. 면역침강된 담백질을 SDS-PAGE 및 형광사진으로 분별하였다(제4도). 39KD의 가시분자량을 갖는 뚜렷한 밴드는 1 및 10㎍의 CD40/샘플과 함께 용량-의존성 방식으로 면역침강된것이다. 대조군으로서, 항-제1군 mab는 55kD밴드 및 저 분자량 β2 마이크로글로불린밴드에서 면역침강하였다. mab의 부재하에서는 뚜렷한 밴드가 보이지 않았다. 또한,125I로 표지된 활성화 Th로 부터 39kD밴드가 면역침강하였다. 이는 39kD단백질이었음을 입증한다.
(4) 39kD Th막단백질에 특이적인 모노클로날 항체 MR1은 PMAct에 의한 B-세포 RNA합성의 유도를 억제하였다.
Th작동물질의 단계별 활성을 유도하는 Th분자(들)을 동정하기위하여 활성화 Th-대-정지Th상에서 선별적으로 발현된 항원에 특이적인 mab를 개발하였다. 이러한 mab인 MR1은 활성화된 Th1상에서 선별적으로 발현된 항원을 인지하였다. MR1 및 CD40-Ig가 동일분자를 인지하였는가를 조사하기 위하여, 유동 세포계수 및 차단연구를 수행하였다. CD40-Ig 및 MR1은 각각 정지상태가 아닌 활성화된 Th를 56% 및 61% 염색하였다(제5a도). MR1은 CD40-Ig에 의한 활성화 Th1의 염색을 용량-의존성 방식으로 차단하였으나, 다른 햄스터 항-T세포 mab인 항-α/βTCR은 차단하지 못했다. 이러한 데이타는 CD40-Ig 및 MR1이 39kD Th단백질상의 중복되거나 동일한 에피토프를 인지하였음을 시사한다. 또한, CD40-Ig 및 MR1이 동일분자를 인지하였는지를 입증하기 위하여, MR1이 결합된 항원을 방사성 표지된 Th용해물로부터 단백질을 면역침강시켜 동정하였다. CD40-Ig 및 MR1 모두는 39kD단백질을 면역침강시켰다(제5b도). 마지막으로, CD40-Ig로 39kD단백질을 면역침강시킨 결과 활성화된 Th의 방사성 표지된 용해물로부터 MR1에 의해 인지된 항원이 제거되었다. 이것은 MR1항원 및 CD40 결합 단백질이 동일하다는 이론을 뒷받침한다.
이러한 mab가 PMAct에 의해 발현된 활성을 중화시켰는지를 설정하기 위하여 MR1으로 작용연구를 수행하였다. PMAct및 B-세포를 단독으로, 또는 햄스터 mab 또는 CD40-Ig의 존재하에 배양하였다. 두 햄스터 mab인 항-α/βTCR 및 α-CD3은 PMAct에 의한 정지 B-세포의 활성화를 억제하지 못했다. 대조적으로, MR1 또는 CD40-Ig는 B-세포 활성화를 억제하였다(제6도).
논의
상기 데이타는 뚜렷한 Th표면분자(LFA-1, CD4, ICAM-1, CD3, α,β TCR)를 mab로 차단했을때 B-세포 주기유입을 유도하는 활성화된 Th의 능력이 저지되지 않음을 보여준다. 대조적으로, CD40 결합 단백질에 특이적인 CD40-Ig 또는 mab는 용량-의존성 방식으로 Th-의존성 B-세포 활성화를 차단하였다. 또한, 정지 Th가 아닌 활성화된 Th의 막상에 선별적으로 발현된 39kD 단백질로서 CD40 결합 단백질이 동정되었다. 39kD CD40 결합 단백질에 특이적인 mab 및 CD40-Ig 둘다는 PMAct에 의한 B-세포 활성화를 차단하였다.
비록 많은 막단백질이 Th-의존성 B-세포 신호화에 연루되어 있을지라도, 본원에 제시된 증거는 몇몇분자(LFA-1, CD4, CD3, α,β TCR, ICAM-1)들의 역할을 실추시키고, Th에 의한 동질의 신호화를 위한 B-세포 수용체로서 CD40이 관련이 있음을 명백히 밝혀준다. 본원의 데이타는, 또한, CD40 결합 단백질에 특이적인 mab 및 CD40-Ig가 Th-의존성 B-세포 활성화를 억제함을 보여준다.
CD40에 대한 리간드는 정지 Th가 아닌 활성화된 Th상에서 발현되는 39kD 단백질이다. 생화학적연구는 39kD 단백질이 환원제에 의해 전기영동 이동이 영향을 받지 않기때문에 단일사슬 분자임을 나타낸다. 본원에 제시된 작용연구를 기초로하여볼때, 활성화된 Th1 및 Th2는 모두 39kD CD40 결합 단백질을 발현한다. 이것은 Th1 및 Th2 모두가 B-세포 주기유입을 유도함을 보여주는 작용연구와 일치한다. 39kD 단백질을 추가로 성상확인하기 위한 시도로서, MW가 39kD의 범위인 CD단백질(CD53, CD27 및 CD69)을 암호화한 cDNA를 COS세포내로 일시적으로 형질감염시키고 세포를 CD40-Ig 결합에 대해 시험하였다. 감염된 COS세포중 어떠한 것도 CD40-Ig가 결합된 단백질을 발현하지 못했다. 따라서, 39kD단백질은 이들 CD단백질중의 어느하나가 아니라 할것이다.
Th와 B-세포사이의 신호전도에 대한 생화학적 기초는 난해한 것으로 간주되어 왔다. CD40을 T세포에 대한 신호전도 분자로서 동정한 사실은 CD40분자와 연관되는 것으로 공지된 특정의 생화학적 경로에 관한 관심을 유도하기에 충분하다. CD40은 세포외영역내에 4개의 시스테인-풍부한 골격이 존재하기때문에 신경성장인자 수용체(NGFR) 부류의 일원이다. CD40을 통한 mab에 의한 신호화는 이노지톨 트리포스페이트의 생성을 증가시켜주는 티로신키나제의 활성화 및 적어도 4개의 뚜렷한 세린/트레오닌키나제의 활성화와 연관이 있는 것으로 제시되어 왔다[Uckun et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 17478-17485]. NGF 수용체 부류의 다른 일원을 통한 신호화로부터 얻은 정보를 기초로하여 볼때, 활성화된 Th와 B사이의 상호작용은 많은 동일한 생화학적 과정을 밟을 것으로 예상된다.
실시예: 사람 T-세포주에 CD40의 결합
면역형광 결합 연구를 위해 CD40-Ig 융합 단백질을 바이오틴-석신이미드(시그마제품)를 이용하여 바이오틴과 결합시켰다. 이어서, 코울터에픽스 C장치(Coulter Epics C instrument)를 이용하여 피코에리트린 (PE)-스트레파비딘(벡틴-디킨슨제품)으로 2단계 염색하여 유동 세포계수 분석을 수행하였다. 몇몇 T세포주를 스크리닝한 대표적인 결과는 제7도에 나타나 있다. 쥬르켓 세포주 및 HSB2 세포주는 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 반면에, CEM, HPBALL 및 쥐의 갑상선종을 포함한 다른 T세포주들은 CD40-Ig 융합 단백질과 결합하지 않았다(제7도).
본원에 인용된 여러가지 문헌들의 전 내용은 본원의 참조사항으로 원용된다.

Claims (12)

  1. CD40 B-세포 항원에 결합하는 39kD T-세포 단백질인 CD40CR에 특이적으로 결합되어 B-세포의 사이클 진입, 증식 및 분화를 자극하는 정제된 무세포 리간드로서, 상기 리간드가 (a) 면역글로불린(Ig)으로 이루어진 제 2 분자, 및 하기 서열의 CD40 단백질 또는 이것과 동일한 에피토프를 가지는 상기 CD40 단백질의 단편을 상기 제 2 분자에 부착되는 제 1 분자로서 포함하고, (b) 상기 CD40CR 단백질을 활성화된 헬퍼 T-세포에 결합시켜서, 휴지 상태의 B-세포가 활성화되는 것을 상기 활성화된 헬퍼 T-세포에 의해 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 정제된 무세포 리간드:
  2. 제 1항에 있어서, 트랜스멤브레인 도메인이 결실된 CD40 단백질 부분을 제 1 분자로서 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 무세포 리간드.
  3. 제 1항에 있어서, 하기의 플라스미드 pCD40-Ig에 의해 제조된 CD40-Ig인 것을 특징으로 하는 정제된 무세포 리간드:
  4. CD40 B-세포 항원에 결합하는 39kD 마우스 T-세포 단백질인 마우스 CD40CR에 특이적으로 결합되어 B-세포의 사이클 진입, 증식 및 분화를 자극하는 정제된 항체 또는 이것과 동일한 에피토프 특이성을 가지는 단편.
  5. 제 4항에 있어서, CD40이 상기 마우스 CD40CR에 결합되는 것을 경합에 의해 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체 또는 이것과 동일한 에피토프 특이성을 가지는 단편.
  6. 제 4항에 있어서, ATCC에 수탁번호 HB11048호로 기탁된 하이브리도마 MR1에 의해 제조된 모노클로날 항체가 자체의 표적 항원에 결합되는 것을 경합에 의해 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체 또는 이것과 동일한 에피토프 특이성을 가지는 단편.
  7. 제 4항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 형광성화합물인 2차 분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 항체 또는 이것과 동일한 에피토프 특이성을 가지는 단편.
  8. ATCC에 수탁번호 HB11048호로 기탁된 하이브리도마 MR1에 의해 제조된 모노클로날 항체 MR1, 또는 CD40 B-세포 항원에 결합하는 39kD 마우스 T-세포 단백질인 마우스 CD40CR에 결합되어 B-세포의 사이클 진입, 증식 및 분화를 자극하는 상기 모노클로날 항체 MR1 또는 이것과 동일한 에피토프 특이성을 가지는 단편.
  9. 하기의 플라스미드 pCD40-Ig에 의해 제조되는 정제된 CD40-Ig 단백질:
  10. CD40 B-세포 항원에 결합하는 39kD 마우스 T-세포 단백질인 마우스 CD40CR에 특이적으로 결합되어 B-세포의 사이클 진입, 증식 및 분화를 자극하는 정제된 무세포 CD40/면역글로불린 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질이 면역 글로불린 분자 또는 이것과 동일한 에피토프 특이성을 가지는 단편의 일부 이상에 결합된 하기 서열의 CD40 단백질 또는 이것과 동일한 에피토프를 가지는 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 무세포 CD40/면역글로불린 융합 단백질:
  11. 제 10항에 있어서, CD40이 상기 마우스 CD40CR에 결합되는 것을 경합에 의해 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 무세포 CD40/면역글로불린 용합 단백질.
  12. 제 10항에 있어서, ATCC에 수탁번호 HB11048호로 기탁된 하이브리도마 MR1에 의해 제조된 모노클로날 항체가 자체의 표적 항원에 결합되는 것을 경합에 의해 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 무세포 CD40/면역글로불린 용합 단백질.
KR1019930002045A 1992-02-14 1993-02-13 Cd4ob-세포항원에대한역-수용체및이에대한리간드 KR100301146B1 (ko)

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