ES2225820T3 - Receptor cd40cr y ligandos del mismo. - Google Patents
Receptor cd40cr y ligandos del mismo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN CONTRA-RECEPTOR, DENOMINADO CD40CR, PARA EL ANTIGENO DE LA CELULA B CD40 Y A LIGANTES SOLUBLES PARA ESTE RECEPTOR, INCLUYENDO MOLECULAS DE FUSION QUE COMPRENDEN POR LO MENOS UNA PARTE DE LA PROTEINA CD40. SE BASA, AL MENOS EN PARTE, EN EL DESCUBRIMIENTO DE QUE UNA PROTEINA DE FUSION SOLUBLE DE INMUNOGLOBULINA/CD40 ERA CAPAZ DE INHIBIR LA ACTIVACION DE LA CELULA B POR MEDIO DE LA CELULA T AUXILIAR, MEDIANTE AGLUTINACION A UN NUEVO RECEPTOR DE PROTEINAS 39 KD EN MEMBRANAS DE LA CELULA T AUXILIAR. LA PRESENTE INVENCION ESTA PREVISTA PARA UN RECEPTOR CD40CR SUSTANCIALMENTE PURIFICADO, PARA LIGANTES SOLUBLES DE CD40CR, INCLUYENDO ANTICUERPOS, ASI COMO MOLECULAS DE FUSION QUE COMPRENDEN AL MENOS UNA PARTE DE LA PROTEINA CD40, Y PARA METODOS DE CONTROL DE LA ACTIVACION DE LA CELULA B QUE PUEDEN SER ESPECIALMENTE UTILES EN EL TRATAMIENTO DE ALERGIAS O ENFERMEDADES AUTOINMUNES.
Description
Receptor CD40CR y ligandos del mismo.
La presente invención se refiere a ligandos
solubles para un contra-receptor, denominado
CD40CR, para el antígeno CD40 de las células B, incluyendo
anticuerpos así como moléculas de fusión, a las composiciones
farmacéuticas que comprenden dichos ligandos y al uso de dichos
ligandos. Se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que
una proteína de fusión soluble CD40/inmunoglobulina fue capaz de
inhibir la activación de las células B mediada por las células
auxiliares T mediante la unión a un receptor de la proteína
novedosa de 39 kD sobre las membranas de las células auxiliares T.
La presente invención describe un receptor CD40CR sustancialmente
purificado y se refiere al uso de CD40CR soluble. Se describen los
procedimientos de control de la activación de las células B que
pueden ser especialmente útiles en el tratamiento de alergia o
enfermedad autoinmune.
Los estudios de Mitchison, Benacerraf y Raff
primero sugirieron que las interacciones físicas entre las T_{h} y
las células B eran esenciales en el desarrollo de respuestas
inmunes humorales. Los estudios posteriores documentaron que las
T_{h} formaban conjugados físicos con el complejo principal de
histocompatibilidad de clase II (MHC) compatible, células B que
presentan antígenos (Vittera y col., (1987) Inmmunol.,
Rev. 99; 193-239) y que eran las células
B dentro de estos conjugados que respondían a las T_{h}
(Bartlett y col., (1989) J. Immunol. 143:
1745-1754). Con el descubrimiento de que las
linfocinas derivadas de las T_{h} ejercían un crecimiento potente
y efectos diferenciadores sobre las células B, se propuso que
el(los) factor(es) soluble(s) se
liberaba(n) en la proximidad mediante la activación mediada
por las T_{h} activadas de la interacción de las células B. Sin
embargo, ninguna de las linfocinas clonadas molecularmente, solas o
en combinación, manifestaban la capacidad de inducir la entrada en
el ciclo de las células B. Diferentes factores solubles,
fracciones de las membranas plasmáticas de las T_{h} activadas
inducían la entrada en el ciclo de las células B (Hodgkin y
col., (1990) J. Immunol. 145: 2025-2034;
Noelle y col., (1991) J. Immunol. 146:
1118-1124). Los estudios que usan fracciones de
las membranas plasmáticas purificadas de las T_{h} activadas
sugerían que una proteína expresada sobre la membrana de las T_{h}
activadas era responsable de la iniciación de la inmunidad humoral
(Noelle y col., (1991) J. Immunol. 146:
1118-1124; Bartlett y col., (1990) J. Immunol.
145: 3956-3962).
Las membranas plasmáticas purificadas de las
T_{h} activadas (PM ^{Act}) se han usado para investigar la
naturaleza de esta función efectora (Hodgkin y col., (1990) J.
Immunol. 145: 1118-1124; Noelle y col.,
(1991) J. Immunol. 146: 1118-1124). PM
^{Act} de las T_{h} activadas, pero no T_{h} en reposo (PM
^{Act}) expresaban una actividad que inducía la entrada en el
ciclo de las células B de una manera no restringida de la clase II,
no específica de antígenos. Además, se mostraba que la actividad
expresada por PM ^{Act} requería 4-6 horas de
activación, síntesis de RNA de novo y era de naturaleza
proteína (Bartlett y col., (1990) J. Immunol. 145:
3956-3962).
La molécula superficial asociada a las células B,
CD40, se expresa sobre todas las células B maduras. Un cDNA que
codifica la CD40 se aísla y la secuencia predicha reveló que la CD40
está relacionada con el receptor del factor de crecimiento nervioso
(abreviadamente en inglés NGF). Los diversos intentos para
identificar el ligando para la CD40 fallaron para revelar un factor
soluble que se comportaba como anticuerpos monoclonales para la CD40
(Clark E. A., Tissue Antigens 1990: 35: 33-66). Los
anticuerpos monoclonales para la CD40 se ha descrito que inducen la
proliferación de las células B (Kaisho I. S. y col., Eur. J.
Immunol. 1990: 20: 1747-1753). Por ejemplo, la
señal proporcionada por las células T CD4+ para inducir la síntesis
de IgE e IgG4 se puede reemplazar por anticuerpos monoclonales
anti-CD40 (Gascan H. J. Immunol. 1991: 147:
8-13). Sin embargo, el papel exacto jugado por la
CD40 en las respuestas de la IgE in vivo permanece estable
(Jabara H. H., y col., J. Exb. Med. 1990: 172:
1861-1864).
El documento WO 93/08207 describe una proteína de
fusión humana CD40/Fc que comprende la región extracelular de la
CD40 humana. Para construir dicha proteína de fusión los
aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg se insertan después del aminoácido
193 de la CD40. De acuerdo a lo anterior, dicha proteína de fusión
comprende una porción de la CD40 en la que los residuos de
aminoácidos 191 a 193 de la CD40 son arginina, leucina y arginina
respectivamente. Además, se dice en el documento WO 93/08207 que
los antagonistas de la interacción CD40/CD40-L
interferirían con el desarrollo de las respuestas de anticuerpos. Se
concluye que las proteínas de fusión CD40/Fc pueden ser útiles en
situaciones clínicas que incluyen alergia, lupus, artritis
reumatoide, diabetes mellitus insulinodependiente, y otras
enfermedades en las que los anticuerpos autoinmunes o los complejos
antígeno/anticuerpo son responsables de la patología clínica de la
enfermedad.
El documento WO 93/09812 describe el antígeno
5cB, también llamado T-BAM (molécula activadora de
las células B-células T). El documento WO 93/09812
también menciona la CD40-L que se dice que es
funcional distinta del T-BAM. Además, el documento
WO 93/09812 especula sobre otra CD40-L murina que
tiene un peso molecular considerablemente mayor que el de la
CD40-L. Su estructura precisa, o relación con el
T-BAM o CD40-L se dice que se
desconoce.
La presente invención se refiere a ligandos
solubles para un contra-receptor, denominado
CD40CR, para el antígeno CD40 de las células B. Se basa, al menos en
parte, en el descubrimiento de que una proteína de fusión soluble
CD40/inmunoglobulina fue capaz de inhibir la activación de las
células B mediada por las células auxiliares T mediante la unión a
una proteína receptora novedosa de 39 kD (denominada "CD40CR"
para el contra-receptor de la CD40) sobre las
membranas de las células auxiliares T, y en el descubrimiento de que
un anticuerpo monoclonal, denominado MR1, dirigida hacia este
receptor de 39 kD fue capaz de inhibir la activación de las células
B mediada por las células auxiliares T.
Según una realización de la presente invención,
dicho ligando soluble comprende al menos una parte de unión de una
molécula de inmunoglobulina, en la que la molécula de
inmunoglobulina es capaz de inhibir competitivamente la unión del
anticuerpo monoclonal MR1 según se produjo por una línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC y número de acceso asignado ATCC HB
11048, a la molécula del CD40CR, dicha molécula siendo obtenible de
la membrana plasmática de las células auxiliares T activadas y
teniendo un peso molecular de aproximadamente 39 kilodaltons según
se determinó mediante SDS-PAGE.
De acuerdo a una realización particular, la
presente invención se refiere al anticuerpo monoclonal MR1 producido
por una línea celular de hibridoma depositada en la ATCC y número de
acceso asignado HB 11048, o un fragmento de unión de la misma.
Según una realización adicional de la presente
invención, el ligando soluble comprende (i) un dominio extracelular
de la CD40 que se une al CD40CR y; condensado a él, (ii) un
fragmento F_{c} de una inmunoglobulina, en el que el dominio
extracelular en el sitio de fusión tiene la secuencia de aminoácidos
Gly-Pro-Gln-Asp-Pro-Glu.
Además, la presente invención se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden un ligando soluble como
se ha definido en esta memoria descriptiva en un vehículo
farmacéuticamente aceptable y el uso de dichos ligandos para
preparar una composición para inhibir la activación de las células B
o para tratar un sujeto que padece un trastorno asociado a la
activación de las células B tales como alergia o una enfermedad
autoinmune.
En las realizaciones particulares de la
invención, la activación de las células B en un sujeto se puede
inhibir poniendo en contacto las células auxiliares T del sujeto
con cantidades eficaces de un ligando soluble del CD40CR. Tal
inhibición de la activación de las células B puede ser especialmente
útil en el tratamiento de alergia o una enfermedad autoinmune.
La invención también se refiere a un
procedimiento de inhibición de la activación de las células B in
vitro que comprende la exposición de una mezcla de células B y
células auxiliares T a una concentración eficaz de un ligando
soluble como se define en esta memoria descriptiva.
La presente invención además describe un receptor
CD40CR purificado que es obtenible del la membrana plasmática de
las células auxiliares T activadas y tiene un peso molecular de
aproximadamente 39 kilodaltons según se determinó por
SDS-PAGE.
Basándose en esto, la presente invención además
se refiere al uso de un ligando soluble que se une a dicho CD40CR
para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento
agudo de anafilaxis.
También, la presente invención se refiere al uso
de un CD40CR soluble que se une a la CD40 para preparar una
composición farmacéutica para tratar un sujeto que padece un
trastorno de inmunodeficiencia asociado a una disminución de la
inmunidad humoral. Esta realización en particular se refiere al
tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida,
inmunodeficiencia asociada a la malignidad o caquexia,
inmunogenicidad iatrogénica, o trastornos genéticos que implican
inmunidad humoral.
Una ventaja de la presente invención es que
permite la intervención en un aspecto de la respuesta inmune que no
es específica del antígeno. Muchas terapias actuales para alergia
incluyen la desensibilización a antígenos particulares, y requieren
que cada paciente se ensaye con el fin de identificar antígenos
asociados a la sensibilidad. Como un asunto práctico, el análisis
exhaustivo de una respuesta del paciente a cada y todo alérgeno
potencial es virtualmente imposible. Además, en la mayoría de las
afecciones autoinmunes, el antígeno causante es, en general,
desconocido o incluso irrelevante, para el proceso de la enfermedad.
La presente invención, que se refiere a la interacción CD40/CD40CR
no específica del antígeno, evita la necesidad de caracterizar el
antígeno asociado a alergia o autoinmunidad. Por lo tanto, la
presente invención se puede usar con una ventaja particular en el
tratamiento de afecciones alérgicas en las que el inmunógeno no se
conoce, o tiene múltiples componentes, por ejemplo, en la fiebre
del heno o en lupus inducido por procainamida. También puede ser
útil en el tratamiento agudo de activación inmune, por ejemplo, en
la terapia para anafilaxis.
| Ig | inmunoglobulina |
| mab | anticuerpo monoclonal |
| PM^{Act} | membranas plasmáticas preparadas a partir células auxiliares T activadas |
| PM^{rep} | membranas plasmáticas preparadas a partir células auxiliares T en reposo |
| PAGE | electrofoersis sobre gel de poliacrilamida |
| rIL4 | interleucina 4 recombinante |
| rIL5 | interleucina 5 recombinante |
| SN | sobrenadante |
| T_{h} | célula auxiliar T |
| T_{h}1 | se refiere a D1.6, un clon específico de inmunoglobulina de conejo, I-A^{d}-restringida |
Panel A. Las células B es reposo se cultivaron
con PM^{rept} o PM^{Act} de las T_{h}1. 25 \mug/ml de
anti-CD4, anti-LFA-1
o anti-ICAM-1 o una combinación de
cada una de éstas (cada una a 25 \mug/ml) se añadió a pocillos
que contenían PM^{Act} y la síntesis de RNA de las células B se
midió mediante la incorporación de
[^{3}H]-uridina. La síntesis de RNA de las células
B se determinó después de 42 a 48 horas después del cultivo. Los
resultados presentados son las medias aritméticas de cultivos por
triplicado +/- la d. t., y son representativos de 5 de tales
experimentos.
Panel B. Las células B en reposo se cultivaron
con PM^{Act} de las T_{h}1 (\medbullet, \blacktriangle) o
T_{h}2 (\Box). A los cultivos que contenían PM^{Act} de las
T_{h}1 (\medbullet, \blacktriangle), se añadieron cantidades
crecientes de la CD40-Ig (\blacktriangle) o
proteína control CD7E-Ig (\medbullet). Al cultivo
que contenía PM^{Act} de las T_{h}2 (\Box), se añadieron
cantidades crecientes de la CD40-Ig. La síntesis de
RNA de las células B se determinó a partir de 42 a 48 horas después
del cultivo. Los resultados presentados son las medias aritméticas
de cultivos por triplicado +/- la d. t., y son representativos de 3
de tales experimentos.
Panel C. Las células B en reposo se cultivaron
con LPS (50 \mug/ml) o PM^{Act}. A los cultivos, se añadieron
CD40-Ig (25 \mug/ml; incubado) o
CD7E-Ig (25 \mug/ml; sólido). La síntesis de RNA
se determinó como se ha descrito en el panel A. Los resultados
presentados son las medias aritméticas de cultivos por triplicado
+/- la d. t., y son representativos de 3 de tales experimentos.
Panel A. Las células B es reposo se cultivaron
con PM^{Act}, rIL4 (10 ng/ml) y rIL5 (5 ng/ml). Bien al comienzo
del cultivo, o los días 1, 2 ó 3 después de la iniciación del
cultivo, se añadieron CD40-Ig o
CD7E-Ig (25 \mug/ml). El día seis del cultivo,
los SN de los pocillos individuales se recogieron y se
cuantificaron para evaluar IgM (\blacksquare) e IgG1
(\medbullet) usando un ELISA específico de
anti-isotipo, como se describe en (Noelle y
col., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124).
En presencia de PM^{Act}, IL4 e IL5, (en ausencia de la
CD40-Ig añadida) las concentraciones de IgM e
IgG_{1} eran 4,6 \mug/ml y 126 ng/ml, respectivamente. Los
cultivos que recibieron CD7E-Ig (25 \mug/ml) el
día 0 produjeron 2,4 \mug/ml y 89 ng/ml de IgM e IgG_{1},
respectivamente. En ausencia de IL4 e IL5, no se detectó IgM o
IgG_{1}. Los resultados son representativos de 3 de tales
experimentos.
Panel B. Las T_{h1} se dejaron en reposo o se
activaron con anti-CD3 durante 16 horas, se
irradiaron y se cultivaron (1 x 10^{4}/pocillo) con células B en
reposo (4 x 10^{4}/cultivo) en presencia de IL4 (10 ng/ml). Se
añadieron entre 0 y 25 \mug/ml de la CD40-Ig
(\blacktriangle) o la CD7E-Ig (\medbullet) a los
cultivos. Entre 66 y 72 horas después del cultivo, los pocillos se
pulsaron con 0,1 \muCi de [^{3}H]-timidina y se
recogieron. La línea de puntos indica la respuesta de las células B
a las T_{h} en reposo. Los resultados presentados son las medias
aritméticas de cultivos por triplicado +/- la d. t., y son
representativos de 2 de tales experimentos.
Figura 3. La CD40-Ig detectó una
molécula expresada sobre las T_{h} activadas, pero no en reposo.
Las T_{h} en reposo y activadas se recogieron y se incubaron con
proteínas de fusión durante 20 minutos a 4ºC, seguido de
anti-hIgG de cabra conjugado a FITC (25 \mug/ml).
Los porcentajes de células positivas y MFI se determinaron mediante
el análisis de al menos 5000 células/muestra. Los resultados son
representativos de 6 de tales experimentos. La unión de la
CD40-Ig se indica por un perfil rellenado.
Figura 4. La CD40-Ig
inmunoprecipitó una proteína de 39 kD de lisado de T_{h}1
activadas. Las T_{h}1 se dejaron en reposo o se activaron con
anti-CD3 insolubilizado durante 16 horas. Las
proteínas marcadas con [^{35}S] de T_{h} en descanso o
activadas se inmunoprecipitaron con anticuerpos precipitados o
proteínas de fusión (1-10 \mu). El perfil sobre
gel es representativo de 3 de tales experimentos.
Figura 5. Un anticuerpo monoclonal
(abreviadamente en inglés mab), específico para la proteína de
membranas de las T_{h} de 39 kD inducida, inhibió la inducción de
la síntesis de RNA de las células B mediante el PM^{Act}. Las
células B en reposo y el PM^{Act} se cultivaron con 10 \mug/ml
de cada anti-\alpha/\beta,
anti-CD3, CD40-Ig o MR1. La síntesis
de RNA se determinó como se ha descrito en la figura 1. Los
resultados presentados son las medias aritméticas de
cultivos triplicados +/- la d. t., y son representativos de 3 de tales experimentos.
cultivos triplicados +/- la d. t., y son representativos de 3 de tales experimentos.
Figura 6. El MR1 y la CD40-Ig
reconocieron la misma molécula expresada sobre las T_{h}
activadas.
Panel A: Las T_{h} activadas se tiñeron con
fluorescencia con MR1 o Ig control. Para evaluar si la
CD40-Ig y el MR1 competía para unirse a las T_{h}
activadas, se añadieron concentraciones graduadas del MR1 o la Ig de
hámster control (anti-TCR \alpha/\beta) junto
con anti-CD40 (20 \mug/ml). Después de incubación
durante 20 minutos a 4ºC, las muestras se lavaron y se incubaron
con FIT conjugada, mab de IgG_{1} anti-humana. Los
resultados son representativos de 3 de tales experimentos.
Panel B: Las proteínas de T_{h} marcadas con
[^{35}S]-metionina, activadas se
inmunoprecipitaron con MR1 (10 \mug/
muestra) y se resolvieron mediante PAGE y fluorografía. Los resultados presentados son representativos de 23 de tales experimentos.
muestra) y se resolvieron mediante PAGE y fluorografía. Los resultados presentados son representativos de 23 de tales experimentos.
Una diversidad de líneas de células T humanas se
expusieron a la CD40-Ig marcada con biotina, y la
unión se evaluó mediante citometría de flujo.
Panel A: Secuencia de nucleótidos de cDNA de la
CD40 a partir del documento de Stammenkovic y col., (1989) EMBO
J. 8: 1403-1410. La región transmembrana
está subrayada.
Panal B: Diagrama esquemático de un plásmido que
se puede usar para expresar la CD40-Ig. Las
secuencias de aminoácidos en el sitio de fusión de \Delta CD40
se muestran debajo de la porción del diagrama de CD40.
Como se ha definido anteriormente, la presente
invención proporciona sustancialmente el receptor CD40CR
purificado; para ligandos solubles del CD40CR, incluyendo
anticuerpos así como moléculas de fusión que comprenden el CD40; y
procedimientos de control de la activación de las células B.
Con los propósitos de claridad de la descripción,
y no como limitación, la descripción detallada de la invención se
divide en las siguientes subsecciones:
| (i) | ligandos que se unen al CD40CR; |
| (ii) | procedimientos usados para caracterizar el CD40CR; |
| (iii) | preparación del CD40CR purificado; |
| (iv) | usos de ligandos que se unen al CD40CR; y |
| (v) | usos del CD40CR. |
Según la presente invención, los ligandos
solubles del CD40CR son (i) moléculas que comprenden una parte de
la proteína de la CD40 o (ii) los anticuerpos o los fragmentos de
anticuerpos.
El término "soluble", como se usa en esta
memoria descriptiva, indica que los ligandos de la invención no
están permanentemente asociados a la membrana plasmática celular.
Sin embargo, los ligandos solubles de la invención pueden fijarse a
un soporte sólido no celular, que incluye un lípido, proteína, o
molécula de carbohidratos, una perla, una vesícula, una partícula
magnética, una fibra, etc., o pueden estar contenidos dentro de un
implante o vesícula.
La capacidad de tal ligando de unirse al CD40CR
se puede confirmar demostrando que el ligando se une a la misma
proteína que la CD40-Ig (más adelante) o el MR1
(más adelante).
Los ligandos de la invención pueden estar
comprendidos en composiciones farmacéuticas junto con un vehículo
adecuado.
Las moléculas de fusión solubles de la presente
invención son ligandos del CD40CR. Tales moléculas de fusión
comprenden al menos una porción, es decir, un dominio extracelular
de la proteína CD40 unida a una segunda molécula. La porción de la
CD40 preferiblemente carece del domino transmembrana de la CD40. Una
porción de la proteína CD40 que se puede usar según la invención se
define como cualquier porción que es capaz de unirse al CD40CR, por
ejemplo, tal porción se puede mostrar que se une a la misma proteína
que el MR1 o la CD40-Ig.
Las segundas moléculas que se pueden usar
incluyen péptidos y proteínas, lípidos, y carbohidratos, y, en las
realizaciones preferidas de la invención, pueden ser una molécula
de inmunoglobulina, o una parte de la misma (tal como un fragmento
Fv, Fab, F(ab')_{2}, o Fab') o CD8, u otra molécula de
adhesión, tal como B7. La segunda molécula se puede derivar de bien
una fuente no humana o humana, o puede ser quimérica. La segunda
molécula puede ser también una enzima, toxina, factor de
crecimiento, linfocina, agente antiproliferativo, agente alquilante,
antimetabolito, antibiótico, alcaloide de la vinca, complejo
coordinado de platino, radioisótopo, o un compuesto
fluorescente.
Las moléculas de fusión de la invención se pueden
producir mediante síntesis química, o preferiblemente, mediante
técnicas de DNA recombinante.
Por ejemplo, una secuencia de DNA que codifica un
dominio extracelular de la proteína CD40 se puede combinar con una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica una segunda molécula en
un vector de expresión adecuado, y después expresarse en un
procariótico o, preferiblemente en un sistema de expresión
eucariótico, tal como un sistema de expresión de levaduras, de
baculovirus, o de mamíferos.
Como alternativa, al menos una porción de la
proteína CD40 se puede expresar usando las técnicas de DNA
recombinante y después se pueden conjugar a una segunda
molécula.
Las moléculas de fusión que comprenden la CD40 se
pueden purificar a partir de mezclas preparativas que usan técnicas
electroforéticas o cromatografía de afinidad usando un ligando que
se une bien a la CD40 o a la segunda molécula. Los ligandos que se
unen a la CD40 incluyen, pero sin limitación, anticuerpos
anti-CD40 tales como G28-5, según se
producen mediante el hibridoma que tiene número de acceso HB9110 y
depositada en la colección americana de cultivos tipo, y CD40CR,
descrito más completamente en las secciones 5.2 y 5.3 más adelante.
Si la segunda molécula en una inmunoglobulina o fragmento de
inmunoinglobulina, se puede usar una columna de afinidad que
comprende un anticuerpo de anti-inmunoglobulina; si
la segunda molécula comprende un fragmento F_{c}, se puede usar
una columna de proteína A.
Según una realización preferida de la invención,
una porción de la CD40 se puede producir usando una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína CD40 que está truncada
cadena arriba del dominio transmembrana. Tal secuencia de ácido
nucleico se puede preparar mediante la digestión de un plásmido que
contiene un cDNA que codifica el antígeno de la CD40, tal como se
describe en el documento de Stamenkovis y col., (1989), EMBO J.
8: 1403-1410, con las enzimas de
restricción PstI (P) y Sau 3A (S3). El fragmento P/S3
resultante se puede subclonar en el mismo plásmido digerido con P y
Bam HI (B), para producir un gen de la CD40 truncado (véase
la figura 8).
En particular, la realizaciones (no limitantes)
de la invención, un vector de expresión usado para producir ligandos
que comprenden un dominio extracelular de la CD40 así como una
secuencia de inmunoglobulina puede comprender preferiblemente un
origen de replicación derivado viralmente, un origen de replicación
bacteriano, un marcador seleccionable bacteriano, y un promotor
eucariótico y secuencias potenciadoras separadas entre secuencias de
DNA que codifican una región constante de inmunoglobulina mediante
sitios de endonucleasa de restricción que permiten la subclonación
de secuencias de DNA que codifican un dominio extracelular de CD40,
seguido de una secuencia señal de poliadenilación (véase la figura
8.b.).
En una realización específica de la invención, el
gen de la CD40 truncado se puede subclonar en un plásmido de fusión
de inmunoglobulina, tal como se describe en el documento de
Aruffo y col., 1990, Cell 61:
1303-1313, usando una digestión con Mlu
I y B, para formar el plásmido pCD40-Ig, que
codifica la molécula de fusión CD40-Ig (véase la
figura 8). La proteína de fusión CD40-Ig se puede
después producir mediante la transfección de plásmido
pCD40-Ig en células COS para formar un sistema de
expresión transitorio. La CD40-Ig producida se
puede recoger del sobrenadante de las células COS y purificarse
mediante cromatografía en columna de la proteína A según se describe
en el documento de Aruffo y col., 1990, Cell 161:
1303-1313.
Los ligandos solubles de la invención pueden
comprender moléculas de anticuerpo, moléculas de anticuerpos
monoclonales, o fragmentos de estas moléculas de anticuerpos que
contienen un sitio de combinación de anticuerpos que se une al
CD40CR. Tales ligandos pueden además comprender una segunda molécula
que puede ser una proteína, lípido, carbohidrato, enzima, toxina,
factor de crecimiento, linfocina, agente antiproliferativo, agente
alquilante, antimetabolito, antibiótico, alcaloide de la vinca,
complejo coordinado de platino, radioisótopo, o un compuesto
fluorescente y se puede unir a la molécula o fragmento del
anticuerpo.
Cuando el ligando es un anticuerpo monoclonal, o
un fragmento del mismo, el anticuerpo monoclonal se puede preparar
contra el CD40CR usando cualquier técnica que facilita la
producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares
continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica de hibridomas
originalmente desarrollada por Kohles y Milstein (1975, Nature
256: 495-497) así como otras técnicas que más
recientemente han llegado a estar disponibles, tales como la
técnica de hibridomas de células B (Kozhar y col., 1983, Immunology
Today 4: 72) y la técnica de hibridomas del VEB para
producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.
77-96) y las similares están dentro del alcance de
la presente invención.
Los fragmentos de anticuerpos que contienen el
idiotipo de la molécula se podrían generar mediante técnicas
conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin
limitación: el fragmento F(ab')_{2} que se puede generar
tratando la molécula de anticuerpo con pepsina; los fragmentos Fab'
que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del
fragmento F(ab')_{2}; el fragmento F(ab')_{2} que
se puede generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína; y
los fragmentos 2Fab o Fab que se pueden generar tratando la
molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor para reducir
los puentes disulfuros.
La presente invención también proporciona
anticuerpos quiméricos producidos mediante técnicas conocidas en la
técnica, tales como las establecidas en el documento de Morrison
y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:
6851-6855 o la solicitud de patente europea
Nº 85305604.2, publicación nº 0173494 de Morrison y col.,
publicada en 5 de marzo de 1986.
El inmunógeno para la producción de anticuerpos
puede ser cualquier fuente que contiene el CD40CR. Por ejemplo, las
T_{h} activadas se pueden usar como un antígeno.
Como alternativa, el CD40CR purificado
sustancialmente, preparado como se establece en la sección 5.3, más
adelante. Si se usan las T_{h} activadas como inmunógeno, se puede
ensayar antisuero para evaluar la reactividad frente a las células
T_{h} activadas pero no en reposo.
En una realización preferida de la invención, el
ligando soluble es el anticuerpo monoclonal MR1. Se usó el
siguiente procedimiento para producir en anticuerpo monoclonal MR1,
y se puede usar para generar otros anticuerpos dirigidos hacia el
CD40CR.
Se inmunizaron por vía intraperitoneal hámsters
con 5 x 10^{6} células T_{h}1 activadas (D1.6) a intervalos
semanales durante seis semanas. Cuando el título del suero contra
las T_{h} murinas era mayor que aproximadamente 1:10.000, las
fusiones de células se realizaron con polietilenglicol usando
esplenocitos de hámster inmunes y NSI. El SN de pocillos que
contenían hibridomas en crecimiento se seleccionaron mediante
citometría de flujo sobre T_{h}1 en reposo y activadas. Un
hibridoma particular, que produjo un mab que reconocía
selectivamente T_{h} activadas, se ensayó posteriormente y se
subclonó para derivar el MR1. El MR1 se produjo en ascites y se
purificó mediante HPLC de intercambio iónico.
La presente invención también proporciona
ligandos que comprenden anticuerpos monoclonales, y fragmentos de
los mismos que son capaces de inhibir competitivamente la unión de
MR1 a su antígeno diana o CD40-Ig a su receptor.
Una línea celular de hibridoma que produce el
anticuerpo monoclonal MR1 se ha depositado en la ATCC y tiene el
número de acceso HB 11048.
El CD40CR se puede caracterizar mediante (i) su
capacidad para unirse a CD40, moléculas de fusión que comprenden al
menos una porción de CD40, y anticuerpos tales como MR1; (ii) su
característica funcional de ser capaz de estimular la entrada en el
ciclo de las células B, la proliferación y la diferenciación; y
(iii) su distribución celular.
El CD40CR se puede caracterizar por su capacidad
para unirse a ligandos tales como CD40, moléculas de fusión que
comprenden la CD40, y anticuerpos dirigidos hacia el CD40CR.
Como se describe en mayor detalle más adelante,
se usaron varias técnicas para caracterizar el CD40CR. Por ejemplo,
la CD40-Ig y el MR1 se mostró que reconocen la
misma molécula de 39 kD. Se encontró que tanto la
CD40-Ig como el MR1 que inmunopercipitaban una
proteína de 39 kD de lisados de T_{h} marcadas radiactivamente
(figura 5b). Además, la inmunoprecipitación de la proteína de 39 kD
con la CD40-Ig eliminó el antígeno reconocido por el
MR1 de lisados de T_{h}.
El CD40CR también se puede caracterizar por su
capacidad para estimular la entrada en el ciclo de las células B, la
proliferación, y la diferenciación.
Por ejemplo, la membrana plasmática (PM) de
células T_{h} activadas (PMT^{Act}) pero no en reposo
(abreviadamente en inglés PMT^{rep}) se encontró que inducen la
síntesis de RNA de las células B (Figura 1a); esta inducción,
indicadora de la activación de las células B, no estaba afectada por
anticuerpos tales como anti-LFA-1,
anti-CD4,
anti-ICAM-1. Sin embargo, la
CD40-Ig o el MR1, se encontró que son capaces de
inhibir la activación de las células B inducida por las
PMT^{Act}, como se muestra en la figura 1b y en la figura 6.
La inducción de la activación de las células B se
puede medir mediante técnicas tales como la incorporación de
[^{3}H]-uridina en RNA (como células B
diferenciadas, incrementos de la síntesis de RNA), o mediante la
incorporación de [^{3}H]-timidina que mide la
síntesis de DNA asociada a la proliferación celular. Para la
medición óptima del efecto del CE40CR sobre la proliferación de las
células B, se puede añadir interleunina-4
(IL-4) al medio de cultivo a una concentración de
aproximadamente 10 ng/ml.
Como alternativa, la activación de las células B
se puede medir como una función de la secreción de inmunoglobulina.
Por ejemplo, el CD40CR, en forma sustancialmente purificada, o como
está presente en las PM, o de otra manera, se puede añadir a células
B en reposos junto con la IL-4 (10 ng/ml) y la
IL-5 (5 ng/ml). Después de tres días de cultivo, se
puede añadir un volumen adicional de medio de cultivo. El día 6 de
cultivo, el sobrenadante (abreviadamente en inglés SN) de cultivos
individuales se puede recoger y cuantificar para evaluar la IgM y
la IG_{1} como se describe en el documento de Noelle y col.,
(1991) J. Inmunol. 146: 1118-1124.
El CD40CR también se puede caracterizar por su
distribución celular. Por ejemplo, la CD40-Ig se
observó que se unió a Th_{1} activadas, pero no en reposo, según
se determinó mediante citometría de flujo (figura 3). Además, la
CD40-Ig se observó que se unió a las células Jurkat,
células HSB2, y células T activadas de la sangre periférica humana,
pero no parecía unirse significativamente a las células CEM,
células HPBALL, o células de timoma de tipo murino.
Por ejemplo, y de ninguna manera como limitación,
la presencia del CD40CR sobre un tipo de célula particular
("células de ensayo") se puede evaluar mediante citometría de
flujo como sigue. Las células de ensayo se pueden ensayar en
paralelo con células T_{h} en reposo (control negativo) y
activadas (control positivo). Todas las células se pueden incubar a
una concentración de aproximadamente 1 x 10^{5}células /50 \mul
con ligando (por ejemplo, CD40-Ig o MR1) durante 20
minutos a 4ºC, seguido de anticuerpo anti-ligando
conjugado a FITC. Se puede añadir yoduro de propidio a todas las
muestras hasta una concentración final de 2 \mug/ml. Después se
puede realizar el análisis de citometría de flujo, por ejemplo
sobre un FACSCAN de BD. Después se puede determinar la activación
positiva de las células mediante el envío frente a la dispersión
secundaria, y mediante negatividad roja (para exclusión de yoduro de
propidio), y la fluorescencia verde logarítmica de células
viables.
La presente invención proporciona el CD40CR
sustancialmente purificado. Tal CD40CR se puede preparar a partir de
células que llevan el CD40CR, tales como células T auxiliares
activadas, células Jurkat y células HSB2, mediante el siguiente
procedimiento.
Las membranas plasmáticas se prepararon a partir
de células apropiadas, tales como células T_{h}1 activadas,
mediante gradiente discontinuo de sacarosa, como se describe en el
documento de Noelle y col., 1991, J, Immunol. 146:
1118-1124. Después el CD40CR se puede aislar
disociando el extracto de membrana bruto con detergente suave, y
después realizando cromatografía de exclusión por tamaño, seguido
de bien cromatografía de afinidad usando ligandos apropiados (por
ejemplo, el MR1 o la CD40-Ig) unidos a un soporte
sólido, inmunoprecipitación (por ejemplo, mediante la
CD40-Ig o el MR1), y/o electroforesis sobre
gel.
La proteína resultante se puede esperar que tenga
un peso molecular de aproximadamente 39 kD.
La presente invención proporciona un CD40CR
soluble (es decir, exento de células) que puede estar comprendido
en composiciones farmacéuticas junto con un vehículo adecuado.
Además se proporciona el CD40CR que se une a una segunda molécula
que puede ser un péptido, proteína, lípido, carbohidrato, enzima,
toxina, factor de crecimiento, linfocina, agente antiproliferativo,
agente alquilante, antimetabolito, antibiótico, alcaloide de la
vinca, complejo coordinado de platino, radioisótopo, o un compuesto
fluorescente.
La presente invención además proporciona un
CD40CR sustancialmente purificado que se ha preparado mediante
técnicas de síntesis química o de DNA recombinante. Por ejemplo, el
gen para el CD40CR se puede aislar mediante la inserción de cDNA
preparado a partir de células auxiliares T activadas en el sistema
de expresión \lambdaqt10, y después seleccionando con la unión
del MR1 o la CD40-Ig para identificar los clones de
expresión de CD40CR. Como alternativa, el cDNA preparado a partir
de las células auxiliares T activadas se pueden transfectar en
células COS, los sobrenadantes de las cuales se pueden seleccionar
con el MR1 o la CD40-Ig para identificar los
productores del CD40CR. El gen para el CD40CR se puede después usar
para expresar el CD40CR usando sistemas de expresión conocidos en
la técnica.
La presente invención proporciona procedimientos
de control de la activación de las células B que utilizan ligandos
que se unen al CD40CR. En particular, proporciona un procedimiento
de inhibición de la activación de las células B que comprende la
exposición de una mezcla de células B y células T_{h} a una
concentración eficaz de ligando que se une al CD40CR. Los ligandos
que se pueden usar se describen anteriormente en la sección 5.1. El
procedimiento de la invención se puede practicar in vitro o
in vivo. Una concentración eficaz se refiere a una
concentración de un ligando que inhibe la activación de las células
B, medida mediante cualquier técnica conocida en la técnica
(incluyendo los expuestos en la sección 5.2, anteriormente) mediante
al menos aproximadamente 30 por ciento, y preferiblemente mediante
aproximadamente 75 por ciento. Según una realización preferida,
específica, no limitante de la invención, la
CD40-Ig se puede usar como ligando, en cuyo caso una
concentración eficaz puede ser al menos aproximadamente
10 \mug/ml. En otra realización específica, no limitante de la invención, se puede usar el anticuerpo monoclonal MR1, en cuyo caso una concentración eficaz puede ser al menos aproximadamente 10 \mug/ml. Si el procedimiento se practica in vivo, una concentración eficaz de ligando se puede referir a la concentración de plasma del ligando o a una concentración local. Por ejemplo, puede ser deseable inhibir la activación de las células B en un área localizada con el fin de limitar los efectos de los sistemas inmunes en conjunto.
10 \mug/ml. En otra realización específica, no limitante de la invención, se puede usar el anticuerpo monoclonal MR1, en cuyo caso una concentración eficaz puede ser al menos aproximadamente 10 \mug/ml. Si el procedimiento se practica in vivo, una concentración eficaz de ligando se puede referir a la concentración de plasma del ligando o a una concentración local. Por ejemplo, puede ser deseable inhibir la activación de las células B en un área localizada con el fin de limitar los efectos de los sistemas inmunes en conjunto.
En las realizaciones particulares, la invención
se refiere al tratamiento de un sujeto que padece un trastorno
asociado a la activación de las células B, que comprende la
administración al sujeto de una cantidad terapéutica de ligando que
se une al CD40CR. Un sujeto puede ser un animal no humano, o
preferiblemente un ser humano.
Los trastornos asociados a la activación de las
células B incluyen, pero sin limitación, alergia, (incluyendo
anafilaxis); afecciones autoinmunes incluyendo lupus inducido por
fármacos, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide de
adultos, artritis reumatoide juvenil, escleroderma, síndrome de
Sjogren, etc.; y enfermedades virales que implican las células B,
incluyendo infección de Epstein Barr, e infección retroviral
incluyendo infección con virus de inmunodeficiencia humana.
Debido a que se ha sugerido que la activación de
las células B está asociada a la inducción de la replicación del
virus de inmunodeficiencia humana a partir del estado latente,
puede ser deseable administrar los ligandos de la invención a
individuos VIH positivos que todavía no han desarrollado SIDA o CRS
(complejo relacionado con SIDA).
Los ligandos se pueden administrar, en un
vehículo farmacéuticamente aceptable, mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica, incluyendo inyección
intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intratecal, intraarticular
o intramuscular, y administración oral, intranasal, intraocular y
rectal, y puede estar comprendido en microsesferas, liposomas, y/o
implantes de liberación sostenida.
Una cantidad terapéutica de ligando se define
como una cantidad que disminuye significativamente los efectos
clínicos perjudiciales de la activación de las células B, y puede
variar entre los ligandos usados y afecciones tratadas. Si se usa la
CD40-Ig, la concentración terapéutica puede ser
aproximadamente 10 \mug/ml bien sistémicamente (concentración en
plasma) o localmente. Si se usa el MR1, una concentración
terapéutica puede ser aproximadamente 10 \mug/ml bien
sistémicamente (concentración en plasma) o localmente.
En una realización adicional de la invención, los
procedimientos anteriores pueden utilizar un ligando que comprende
una toxina o antimetabolito de manera que las células T_{h} se
matan o se dañan y la activación de las células B disminuye como
resultado de la destrucción de las células T_{h}.
Los ligandos de la invención también se pueden
usar para marcar las células T activadas, una técnica que puede ser
útil en la diagnosis de los trastornos de las células T. Con este
fin, el ligando que comprende una enzima, radioisótopo, compuesto
fluorescente u otro marcador detectable se puede exponer a las
células T in vitro o in vivo y se puede cuantificar
la cantidad de unión.
Los ligandos de la invención también se pueden
usar para distribuir sustancias, por ejemplo, factores de
crecimiento, a células T activadas.
La presente invención proporciona procedimientos
de control de la activación de las células B que utilizan el CD40CR
o una molécula que comprende el CD40CR, preparado como se describe
en la sección 5.3 anteriormente. En particular, proporciona un
procedimiento para promover la activación de las células B que
comprende la exposición de las células B a una concentración eficaz
del CD40CR. El procedimiento se puede practicar in vivo o
in vitro. Una concentración eficaz se refiere a una
concentración del receptor que induce la activación de las células
B, medida mediante cualquier técnica conocida en la técnica
(incluyendo los expuestos en la sección 5.3, anteriormente) en al
menos aproximadamente 30 por ciento. En las realizaciones
específicas, no limitantes de la invención, la concentración del
CD40CR puede ser aproximadamente 10 \mug/ml localmente o
sistémicamente.
En las realizaciones particulares, la invención
se refiere al tratamiento de un sujeto que padece un trastorno de
inmunodeficiencia asociado a la disminución de inmunidad humoral,
que comprende la administración de una cantidad terapéutica del
CD40CR. Un sujeto puede ser un animal no humano o, preferiblemente,
un ser humano.
Los trastornos de inmunodeficiencia asociados a
la disminución de la inmunidad humoral incluyen síndrome de
inmunodeficiencia adquirida, inmunodeficiencia asociada a
malignidad o caquexia, inmunodeficiencia iatrogénica producida, por
ejemplo, por quimioterapia o terapia por radiación, así como
trastornos genéticos que implican inmunidad humoral.
El CD40CR se puede administrar, en un vehículo
farmacéutico adecuado, mediante cualquier procedimiento conocido en
la técnica, incluyendo inyección intravenosa, intraperitoneal,
subcutánea, intratecal, intraarticular o intramuscular, y
administración oral, intranasal, intraocular y rectal, y puede
estar comprendido en microsesferas, liposomas, y/o implantes de
liberación sostenida.
Una cantidad terapéutica del CD40CR para la CD40
se define como la cantidad que incrementa la producción de
inmunoglobulina en al menos aproximadamente 30 por ciento.
En una realización adicional, el CD40CR se puede
conjugar a una toxina, y después administrarse a un sujeto en
circunstancias en las que sería preferible destruir las células B
que expresan el CD40. Los ejemplos de tales circunstancias incluyen
pacientes que reciben transplantes de órganos o que padecen mieloma
múltiple u otra malignidad de las células B, o de enfermedad
autoinmune.
El CD40CR también se puede usar para marcar las
células B que expresan la CD40, una técnica que puede ser útil en
la diagnosis de los trastornos de las células B. Con este fin, el
receptor unido a una enzima, radioisótopo, compuesto fluorescente u
otro marcador detectable se puede exponer a las células B in
vivo o in vitro y se puede cuantificar la cantidad de
unión.
El CD40CR también se puede usar para distribuir
moléculas que están unidas a las células B.
6.
Ejemplo
Ratones hembras DBA/2J (Jackson Laboratories, Bar
Harbor, ME) se usaron para la preparación de células de carga que
soportan el crecimiento de clones T_{h} y en la preparación de
las células B en reposo.
D1. 6, un clon de T_{h}1 específico de Ig de
conejo, I-A^{j}-restringido
(Kurt-Jones y col., (1987) J Exp Med 166:
1774-1787) se obtuvo del Dr David Parker,
University of Mass. en Worcester. D.1 6 se denominó en esta
memoria descriptiva T_{h}1.
Se cultivaron células T_{h}1 (8 x
10^{6}/pocillo) en pocillos agrupados (pocillo 6, Corning, NY)
recubiertos con 40 \mug/4 ml de PBS/pocillo con
anti-CD3 durante 16 horas, como se describe en el
documento de (Noelle y col., (1991) J. Immunol. 146:
1118-1124).
Las membranas plasmáticas se prepararon mediante
sedimentación en gradiente discontinuo de sacarosa, como se
describe en el documento de (Noelle y col., (1991) J. Immunol.
146: 1118-1124).
Las células B esplénicas se prepararon mediante
sedimentación en gradientes discontinuos de Percoll, como se
describe en el documento de (Defranco y col., (1982) J. Exp.
Med. 155: 1523). Las células aisladas de la interfase de
Percoll de 70-75% (densidad de
1,087-1,097) eran típicamente > 95% de
mIg^{+}, tenían un grado uniforme, bajo grado de afinidad hacia la
dispersión luz hacia adelante próxima y fueron insensibles a Con
A.
Se purificaron los siguientes mabs mediante HPLC
de intercambio iónico a partir de fluido de ascites de ratones que
se habían irradiado y reconstituidos de médula ósea:
anti-CD3: 145-2C11 (Leo y col.,
(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
1374-1378);
anti-\alpha,\beta: H57-597;
anti-CD4: GK1.5 (Wilde y col., (1983) J.
Immunol. 131: 2178-2183);
anti-ICAM: YN1/1. 7. 4 (Prieto y col., (1989)
Eur. J. Immunol. 19: 1551-1557);
anti-LFA-1: FD441. 8
(Sarmiento y col., (1982) Immunol. Rev. 68:
135); y cadena \kappa de anti-rata/hámster:
RG-7(Springer, (1982) Hybrid. 1:
257- 273).
La proteína de fusión de CD40 se preparó
digiriendo un plásmido que contiene un cDNA que codifica el
antígeno CD40 (Stamenkovic and Seed, (1989) EMBO J. 8:
1403-1410) con la enzima de restricción Pst
I (P) y Sau 3A (S3). Este fragmento P/S3 se subclonó en
el mismo plásmido digerido con P y Bam H1 (B). Esto
permitió la preparación de la CD40\Delta que codificaba la
proteína truncada CD40 cadena arriba del dominio transmembrana. El
fragmento de DNA que codifica una CD40\Delta se subclonó en el
plásmido de fusión de inmunoglobulina (Aruffo y col., (1990),
Cell. 61: 1303-1313) usando una
digestión con MluI y B. La proteína de fusión
CD40-Ig se produjo mediante transfección
transitoria en las células COS y se purificó sobre una columna de
la proteína A como se describe en el documento (Aruffo y col.,
(1990), Cell. 61: 1330-1313).
La interleucina 4 (IL4): La IL4 de ratón
recombinante la proporcionaron generosamente los Drs. C.
Mallszewski y K. Grabstein, Immunex Corporation, Seattle, WA.
La interleucina 5 (IL5): La IL5 de ratón
recombinante se compró en R&D Research, Sarrento, CA.
Se cultivaron 3 X 10^{4} células B en reposo en
50 \mul de cRPMI en pocillos de microtitulación A/2 (Costar,
Cambridge, MA). A estos pocillos, se añadieron 0,5 \mug de
proteína de las membranas de T_{h}1 o T_{h}2. Después de
42-48 horas, se pulsaron los pocillos con 2,5
\muCi de ^{3}H-uridina (New England Nuclear,
Boston MA), se recogieron, y se determinó la radiactividad mediante
espectroscopia de centelleo líquido. Los resultados de expresaron
como cpm/cultivo +/- d. t.
Se cultivaron células B es reposo como se ha
descrito anteriormente. A los pocillos de cultivo, se añadieron 0,5
\mug de proteínas de membranas T_{h}1, IL4 (10 ng/ml) e IL5 (5
ng/ml). El día tres de cultivo, se añadieron 50 \mul adicionales
de cRPMI. El día seis de cultivo, se recogieron los SN de los
pocillos individuales y se cuantificaron para evaluar IgM e
IgG_{1}, como se describe en el documento de (Noelle y col.,
(1991) J. Immunol. 146: 1118-1124).
Se cultivaron 4 X 10^{4} células B en reposo en
50 \mul de cRPMI en pocillos de microtitulación A/2 (Costar,
Cambridge, MA). A estos pocillos, se añadieron 1 X 10^{4} células
T_{h}1 en reposo o activadas, irradiadas (500 rads) e IL4 (10
ng/ml). El día tres de cultivo, los pocillos de pulsaron con 1
\muCi de ^{3}H timidina como se describe en el documento de
(Noelle y col., (1991) J. Immunol. 146:
1118-1124).
Se inmunizaron hámster por vía intraperitoneal
con 5-10 X 10^{6} de T_{h}1 activadas (D.1 6) a
intervalos semanales durante seis semanas. Cuando el título del
suero contra las T_{h}1 de tipo murino fue mayor que 1:10.000, se
realizaron las fusiones celulares con polietilenglicol usando
esplenocitos de hámsters inmunes y NS1. Los SN de pocillos que
contenían hibridomas en crecimiento se seleccionaron mediante
citometría de flujo sobre T_{h}1 en reposo y activadas. Un
hibridoma particular, que produjo un mab que reconocía
selectivamente T_{h} activadas, se ensayó adicionalmente y se
subclonó para derivar el MR1. El MR1 se produjo en ascites y se
purificó mediante HPLC de intercambio iónico.
T_{h}1 activadas y en reposo (16 horas con
anti-CD3) se recogieron y se incubaron a 1 X
10^{5} células con proteína de fusión durante 20 minutos a 4ºC,
seguido de IgG anti-humana (h) de cabra conjugada
con FITC (25 \mug/ml; Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Se
añadió yoduro de propidio a todas las muestras a una concentración
final de 2 \mug/ml. El análisis de citometría de flujo se realizó
sobre un FACSCAN de BD. Después de activación positiva de las
células por dispersión de luz hacia adelante frente a lateral, y
mediante la negatividad roja (para evaluar la exclusión con yoduro
de propidio), se determinó la fluorescencia verde logarítmica de
las células viables. Al menos 5.000 células viables se analizaron
para la determinación del porcentaje de células positivas y MF1. La
tinción con MR1 empleó RG7 conjugado con FITC, un mab de cadena
\kappa de anti-rata de ratón/hámster.
T_{h}1 se dejaron en reposo o se activaron con
anti-CD3 insolubilizado durante 16 horas. Las
proteínas de T_{h} en reposo y activadas (20 x 10^{6}/ml) se
marcaron con 1 mCi de [^{3}H]-metionina/cisteína
durante una hora, momento en el que se lavaron dos veces en
RMPI/FCS al 10% y el sedimento celular se lisó en tampón de
extracción, como se describe en el documento de (Noelle y col.,
(1986) J. Immunol. 137: 1718-1726). Se
añadieron anticuerpos purificados o proteínas de fusión
(1-10 \mug) a 500 \mul de lisado (5 x 10^{6}
de equivalentes celulares) a 4ºC durante 16 horas. En ese momento
los lisados se transfirieron a tubos que contenían 50 \mul de
proteína A-sefarosa compactada. La proteína
A-sefarosa sedimentada se volvió a suspender y los
tubos se incubaron a 4ºC durante 1 hora con agitación. Después las
muestras se lavaron 3 veces con tampón de lavado de alta
rigurosidad. La proteína A-sefarosa sedimentada se
volvió a suspender en 30 \mul de tampón de muestra SDS y se
desarrolló sobre un gel de poliacrilamida al 10%. Después de la
separación en gel, se fijó el gel y se realizó la fluorografía.
Con el fin de definir las moléculas de las
superficie de las células que mediaban la inducción de la entrada en
el ciclo de las células B mediante PM^{Act}, se añadieron mabs
para las proteínas de la membrana de las T_{h} a cultivos de
PM^{Act} y células B. Las PM^{Act} inducían la síntesis de RNA
de las células B ocho veces la observada con PM^{rep} (figura
1a). La adición de anti-LFA-1,
anti-CD4,
anti-ICAM-1, solos, o en
combinación, no inhibieron la inducción de la síntesis de RNA de
las células B por PM^{Act}.
En el sistema humano, se ha mostrado que el mab
anti-CD40 inducía la proliferación de las células B
(Clark y Lane, (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:
97-127) por lo tanto implicando la CD40 como una
molécula de accionamiento importante de las células B. Para
determinar si la CD40 estaba implicada en la inducción de la
síntesis de RNA de las células B mediante las PM^{Act}, una
proteína de fusión soluble de los dominios extracelulares de la CD40
humana y el dominio F_{c} de la IgG1 humana
(CD40-Ig) se añadió a cultivos de PM^{Act} y
células B. Las PM^{Act} derivadas de las T_{h}1 y T_{h}2 se
prepararon y se usaron para estimular la síntesis de RNA de las
células B. La adición de la CD40-Ig a cultivo
produjo la inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de RNA
de las células B que se indujo por las PM^{Act} de T_{h}1 y
T_{h}2 (figura 1b). La inhibición semi máxima de la síntesis de
RNA de las células B inducida por las PM^{Act} de T_{h}1 y
T_{h}2 era a aproximadamente 5 \mug/ml de la
CD40-Ig. Una proteína de fusión
CD7E-Ig (Damle y Aruffo, (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 6403-6407) estaba sin
efecto incluso cuando se usaba a 25 \mug/ml.
Para investigar si la CD40-Ig
inhibía la activación de las células B mediante activadores
independientes de las células T, las células B se cultivaron en
presencia de LPS y la CD40-Ig. El día 2, se
determinó la síntesis de RNA (fig. 1c). La CD40-Ig
fue ineficaz para inhibir la activación de las células B por LPS,
no obstante inhibía la respuesta de las células B a las
PM^{Act}.
En presencia de las PM^{Act}, las IL4 e IL5,
las células B se diferenciaron policlonalmente para producir Ig
(Hodgkin y col., (1990) J. Immunol. 145:
2025-2034). Para evaluar los requerimientos para
la señalización de la CD40 en este procedimiento, se añadió la
CD40-Ig al comienzo del cultivo, o los días
posteriores de cultivo. La adición de la CD40-Ig
(figura 2a) al comienzo del cultivo inhibía más de un 95% de la
producción de IgM e IgG_{1} policlonales comparado con los
niveles control en su ausencia. En contraste, la adición de la
CD40-Ig el día 1 y 2 del cultivo mostró poco, si lo
hubo, efecto inhibitorio sobre la producción de IgM e IgG_{1}.
Estos datos indicaban que después de 24 horas, la señalización
mediante la CD40 ya no es esencial para la diferenciación de las
células B para la secreción de la Ig.
Los datos hasta aquí indicaban que la CD40 estaba
implicada en la activación de las células B por las PM^{Act}. Se
realizaron estudios con el fin de asegurar que la CD40 también
estaba implicada en la activación de las células B por las T_{h}
intactas, viables, activadas. Las T_{h}1 se activaron durante 16
horas con anti-CD3 insolubilizado, se recogieron y
se irradiaron. Las T_{h}1 irradiadas se cultivaron con células B
en presencia de IL4 y la proliferación de las células B se
determinó el día 3 del cultivo. Se requirió una fuente exógena de
IL4 para lograr la proliferación de las células B con T_{h}1, ya
que las T_{h}1 no producen IL4 (Noelle y col., (1989) J.
Immunol. 143: 1807-1814). La
CD40-Ig inhibía la inducción de la proliferación de
las células B por las T_{h} irradiadas de una manera dependiente
de las dosis, similar a la observada con las PM^{Act} (figura
2b). El control negativo, CD7E-Ig, no ejercía
efecto apreciable.
Para investigar si las T_{h}1 expresan una
proteína de fusión para el CD40, las T_{h}1 en reposo y activadas
(16 horas) se tiñeron con la CD40-Ig o la
CD7E-Ig, seguido de FITC-anti HIgG.
La unión de la CD-Ig se determinó mediante
citometría de flujo (figura 3). Las T_{h}1 que se activaron
durante 16 horas con anti-CD3, pero no las T_{h}1
en descanso, se tiñeron positivas el 56% con la
CD40-Ig, pero no con la CD40-Ig
control. Para identificar la unión a la CD40-Ig,
las proteínas de las T_{h}1 se marcaron biosintéticamente con
[^{35}S]-metionina/cisteína y las inmunoproteínas
se inmunoprecipitaron con la CD40-Ig o la
CD7E-Ig. Las proteínas inmunoprecipitadas se
resolvieron mediante SDS-PAGE y fluorografía (figura
4). Una banda prominente con un peso molecular aparente de 39 kD se
inmunoprecipitó de una manera dependiente de la dosis con 1 y 10
\mug de CD40/muestra. Como controles, mab de
anti-clase I inmunoprecipitó bandas a 55 kD y una
banda de bajo peso molecular, microglobulina \beta2. En ausencia
de mab, no fueron visibles bandas prominentes. Una banda de 39 kD
también se inmunoprecipitó a partir de las T_{h} activadas que se
marcaron vectorialmente con ^{125}I, confirmando que la proteína
de 39 kD era una proteína de las membranas.
Los mabs específicos de antígenos expresados
selectivamente sobre T_{h} activadas contra T_{h} en reposo se
desarrollaron para identificar la(s) molécula(s) de
las T_{h} responsables de la actividad de la fase efectora de
las T_{h}. Uno de tales mab, el MR1, reconoció un antígeno que se
expresó selectivamente sobre T_{h} 1 activadas. Para investigar
si el MR1 y la CD40-Ig reconocían la misma molécula,
se realizaron estudios de citometría de flujo y bloqueo. La
CD40-Ig y el MR1 tiñeron aproximadamente el 56% y
61%, respectivamente, de las T_{h} activadas pero no en descanso
(figura 5a). El MR1, pero no otro mab de células
anti-T de hámster, anti-TCR
\alpha/\beta, bloqueaban la tinción de las T_{h1} activadas
con la CD40-Ig, de una manera dependiente de la
dosis. Estos datos sugerían que la CD40-Ig y el MR1
reconocían el solapamiento de idénticos epítopos sobre la proteína
de las Th de 39 kD. Para demostrar además que la
CD40-Ig y el MR1 reconocían la misma molécula, el
antígeno que se unía al MR1 se identificó mediante
inmunoprecipitación de las proteínas de los lisados de las Th
marcadas radiactivamente. Tanto la CD40-Ig como el
MR1 inmunoprecipitaron una proteína de 39 kD (figura 5b).
Finalmente, la inmunoprecipitación de la proteína de 39 kD con la
CD40-Ig eliminaba el antígeno reconocido por el MR1
de lisados marcados radiactivamente de las T_{h} activadas que
soportan la tesis de que el antígeno MR1 y la proteína de unión a
CD40 eran idénticos.
Se realizaron estudios funcionales con el MR1
para saber si este mab neutralizaba la actividad expresada por
PM^{Act}. Las PM^{Act} y las células B se cultivaron solas, o
en presencia de mabs de hámster o la CD40-Ig. Dos
mabs de hámster, anti-TCR \alpha/\beta y
\alpha-CD3 no inhibían la activación de las
células B es reposo mediante las PM^{Act}. En contraste, el MR1 o
la CD40-Ig inhibían la activación de las células B
(figura 6).
Los datos muestran que el bloqueo de las
moléculas de la superficie de las T_{h} prominentes
(LFA-1, CD4, ICAM-1, CD3, TCR
\alpha,\beta) con los mabs no impedían la aptitud de las
T_{h} activadas para inducir la entrada en el ciclo de las
células B. En contraste, la CD40-Ig o un mab
específico para la proteína de unión a CD40, bloqueaba la
activación de las células B dependiente de las T_{h} de una
manera dependiente de la dosis. Además, la proteína de unión a la
CD40 se identificó como una proteína de 39 kD que se expresó
selectivamente sobre las membranas de las T_{h} activadas, pero no
en reposo. Tanto la CD40-Ig como un mab específico
para la proteína de unión a la CD40 de 39 kD bloqueaban la
activación de las células B por las PM^{Act}.
Aunque se ha implicado un número de proteínas de
membrana en la señalización de las células B dependientes de las
Th, la evidencia presentada en esta memoria descriptiva rechaza la
contribución de algunas moléculas (LFA-1, CD4, CD3,
TCR \alpha,\beta, ICAM-1) e implica a la CD40
como el receptor de las células B para la señalización afín
mediante las T_{h}. Los datos muestran que la
CD40-Ig y un mab específico para la proteína de
unión a la CD40 inhibe la activación de las células B dependiente
de las T_{h}.
El ligando para la CD40 es una proteína de 39 KD
que se expresa sobre las T_{h} activadas, pero no sobre en
reposo. Los estudios bioquímicos indican que la proteína de 39 kD es
una molécula de cadena única ya que la migración electroforética no
se influenciaba por los agentes reductores. Basándose en los
estudios funcionales presentados en este estudio, tanto las
T_{h}1 como las T_{h}2 expresan la proteína de unión de 39 kD.
Esto es consistente con los estudios funcionales que muestran que
tanto las T_{h}1 como las T_{h}2 inducen la entrada en el
ciclo de las células B. En un intento de caracterizar
adicionalmente la proteína de 39 kD, el cDNA que codifica las
proteínas CD en el intervalo de peso molecular de 39 kD (CD53, CD
27 y CD69) se transfectaron transitoriamente en células COS y las
células se ensayaron para evaluar la unión a la
CD40-Ig. Ninguna de las células COS transfectadas
expresaban proteínas que se unían a la CD40-Ig. Por
lo tanto se sospecha que la proteína de 39 kD no es una de estas
proteínas CD.
Las bases bioquímicas para la transducción de la
señal entre las T_{h}1 y las células B han sido difíciles de
encontrar. La identificación de la CD40 como la molécula de
trasducción de la señal para las células T ayuda a enfocar la
atención sobre la ruta bioquímica específica conocida para acoplarse
a la molécula de la CD40. La CD40 es un miembro de la familia de
los receptores de factor de crecimiento nervioso (abreviadamente en
inglés NGFR) en virtud de la presencia de cuatro motivos ricos en
cisteína en su región extracelular. La señalización de la CD40
mediante el mab (Uckun y col., (1991) J. Biol. Chem. 266:
17478-17485) ha mostrado la implicación de la
activación de las tirosina quinasas que da como resultado el
aumento de producción del trisfosfato de inositol y la activación
de al menos cuatro serina/treonina quinasas distintas. Basándose en
la información obtenida de la señalización mediante otros miembros
de la familia de los receptores del NGF, se anticipa que la
interacción entre las T_{h} activadas y las B darán como resultado
muchos de los mismos procedimientos bioquímicos.
7.
Ejemplo
Para estudios de unión por inmunofluoerscencia,
la proteína de fusión CD40-Ig se conjugó con la
biotina usando biotina-succinimida (Sigma). Después
se realizó el análisis de citometría de flujo mediante la tinción
en dos etapas usando ficoeritrina (abreviadamente en inglés
PE)-estrepavidina (Becton-Dickinson)
con un instrumento Coulter Epics C. Los resultados representativos
del análisis de las líneas celulares T se presentan más adelante.
Las líneas celulares Jurkat y HSB2 se encontró que se unen
específicamente, mientras que otras líneas celulares T que incluyen
CEM, HBBALL, y tioma murino no se unían a la proteína de fusión
CD40 Ig (figura 7).
Claims (15)
1. Un ligando soluble que comprende al menos una
parte de unión de una molécula de inmunoglobulina, en la que la
molécula de inmunoglobulina es capaz de inhibir competitivamente la
unión del anticuerpo monoclonal MR1 producido por una línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC y número de acceso asignado HB
11048, a la molécula CD40CR, dicha molécula siendo obtenible de la
membrana plasmática de las células auxiliares T y que tiene un peso
molecular de aproximadamente 39 kilodaltons como se determinó
mediante SDS-PAGE.
2. El ligando soluble según la reivindicación 1
que comprende además una segunda molécula que se selecciona entre
el grupo constituido por un agente antiproliferativo, un
antimetabolito, un antibiótico, un alcaloide de la vinca, una
enzima, un complejo coordinado de platino, un radioisótopo, un
compuesto fluorescente, una linfocina, un factor de crecimiento,
una toxina, un carbohidrato, un lípido o una proteína.
3. Un ligando soluble según la reivindicación 1 ó
2, que no está permanentemente asociado a una membrana plasmática
celular.
4. El anticuerpo monoclonal MR1 producido por una
línea celular de hibridoma depositada en la ATCC y número de acceso
asignado HB 11048, o un fragmento de unión del mismo.
5. Un ligando soluble que comprende (i) un
dominio extracelular de la CD40 que se une al CD40CR y, se condensa
a él, (ii) un Fragmento Fc de una inmunoglobulina, en el que el
dominio extracelular en el sitio de la proteína de fusión tiene la
secuencia de aminoácidos
Gly-Pro-Gln-Asp-Pro-Glu,
donde el fragmento Fc comprende una bisagra, una región CH2 y una
CH3.
6. Un procedimiento de inhibición de la
activación de las células B in vitro que comprende la
exposición de una mezcla de células B y células auxiliares T a una
concentración eficaz de ligando como se ha definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. El uso de un ligando como se ha definido en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que se une al CD40CR
para preparar una composición para inhibir la activación de las
células B.
8. El uso de un ligando como se ha definido en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para preparar una
composición farmacéutica para tratar un sujeto que padece un
trastorno asociado a la activación de las células B.
9. El uso de la reivindicación 8 en la que el
trastorno es alergia o una enfermedad autoinmune.
10. El uso de un ligando soluble que se une al
CD40CR, el CD40CR siendo obtenible de la membrana plasmática de
las células auxiliares T activadas, que tiene un peso molecular de
aproximadamente 39 kilodaltons como se determina mediante
SDS-PAGE y que se reconoce por el anticuerpo
monoclonal MR1 producido por una línea celular de hibridoma
depositada en la ATCC y número de acceso asignado HB 11048, para
preparar una composición farmacéutica para el tratamiento agudo de
anafilaxis.
11. Una composición farmacéutica que comprende un
ligando como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en un vehículo farmacéutico adecuado.
12. Una línea celular de hibridoma depositada en
la ATCC y número de acceso asignado HB 11048.
13. El uso de un CD40CR soluble que se une a la
CD40, el CD40CR siendo obtenible de la membrana plasmática de las
células auxiliares T activadas, que tiene un peso molecular de
aproximadamente 39 kilodaltons como se determina mediante
SDS-PAGE y que se reconoce por el anticuerpo
monoclonal MR1 como producido por una línea celular de hibridoma
depositada en la ATCC y número de acceso asignado HB 11048, para
preparar una composición farmacéutica para tratar un sujeto que
padece un trastorno de inmunodeficiencia asociado a una disminución
de la inmunidad humoral.
14. El uso de la reivindicación 13 para tratar
síndrome de inmunodeficiencia adquirida asociado a malignidad o
caquexia, inmunodeficiencia iatrogénica, o trastorno genético que
implica inmunidad humoral.
15. El uso según la reivindicación 13 ó 14, del
CD40CR que no está permanentemente asociado a una membrana
plasmática celular.
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