FI117508B - Menetelmä CD40CR-reseptoriin sitoutuvan ligandin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä CD40CR-reseptoriin sitoutuvan ligandin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI117508B
FI117508B FI930605A FI930605A FI117508B FI 117508 B FI117508 B FI 117508B FI 930605 A FI930605 A FI 930605A FI 930605 A FI930605 A FI 930605A FI 117508 B FI117508 B FI 117508B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cell
protein
cells
activated
cd40cr
Prior art date
Application number
FI930605A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI930605A0 (fi
FI930605A (fi
Inventor
Jeffrey A Ledbetter
Randolph Noelle
Ivan Stamenkovic
Alejandro Aruffo
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
Dartmouth College
Gen Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25270498&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI117508(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Squibb Bristol Myers Co, Dartmouth College, Gen Hospital Corp filed Critical Squibb Bristol Myers Co
Publication of FI930605A0 publication Critical patent/FI930605A0/fi
Publication of FI930605A publication Critical patent/FI930605A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI117508B publication Critical patent/FI117508B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

• 1 ' ; 117508 .. .Λ
Menetelmä CD40CR-reseptoriin sitoutuvan ligandin valmistamiseksi 1. Johdanto 5 Tämä keksintö koskee menetelmää B-soluantigeenin CD40 vastareseptorin, joka on nimetty CD40CR:ksi, liu- j koisien ligandien, joihin kuuluvat sellaiset fuusiomole- ' kyylit, jotka käsittävät vähintään osan CD40-proteiinista, valmistamiseksi. Se perustuu ainakin osittain havaintoon, 10 että liukoinen CD40/immunoglobuliini-fuusioproteiini kykeni inhiboimaan auttaja-T-solujen välittämää B-solujen aktivaatiota sitoutumalla uuteen 39 kD:n proteiiniresepto-riin auttaja-T-solujen membraaneilla. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän olennaisesti puhdistetun, soluja 15 sisältämättömän ligandin valmistamiseksi, joka ligandi spesifisesti sitoutuu CD40CR-reseptoriin, 39 kDa:n T- * soluproteiiniin, joka sitoutuu CD40-B-soluantigeeniin ja f stimuloi solusyklin alkamista, jakatutumista ja erilaistumista, mikä voi olla erityisen hyödyllistä allergian tai
M
20 autoimmuunisairauden hoidossa.
2. Keksinnön tausta
Mitchisonin, Benacerrafin ja Raffin tutkimukset r: : ,·. antoivat ensimmäiseksi olettaa, että fyysiset vuorovaiku- • · · tukset Th~ ja B-solujen välillä olivat olennaisia humoraa- • · *** 25 lisen immuunivasteen kehittymiselle. Myöhemmät tutkimukset * * · esittivät, että Th muodosti fyysisiä konjugaatteja luokan ,-u * · *···* II pää-histokombatibiliteettikompleksin (MHC) kanssa yh- .
i t · J ·* teensopivien, antigeenin ilmaisevien B-solujen kanssa • · · ·.· · (Vittetta et ai., (1987) Immunol. Rev. 99: 193 - 239), ja 30 että juuri B-solut näissä konjugaateissa reagoivat Th- ϊ soluihin (Bartlett et ai., (1989) J. Immunol. 143: 1745 - *·# 1754). Havainnosta, että Th-johdannaislymfokiinit saivat • * · aikaan voimakkaan kasvu- ja erilaistumisvaikutuksen B- * · * **]·* soluihin, oletettiin, että aktivoituneiden Th-solujen lä- • · • · * · · • · • · · • · • · * · · • ·· • · 2 " 117508 helleen vapauttama liukoinen tekijä (tekijät) välitti vuorovaikutuksessa olevan B-solun aktivaatiota. Yksikään mo-lekulaarisesti kloonatuista lymfokiineistä ei kuitenkaan yksin tai yhdistelmänä osoittanut kykyä indusoida B-5 solusyklin alkamista. Toisin kuin liukoiset tekijät, plas-mamembraanifraktiot aktivoiduista Teista indusoivat B-solusyklin alkamista (Hodgkin et ai., (1990) J. Immunol.
145: 2025 - 2034; Noelle et ai., (1991) J. Immunol. 146: 1118 - 1124). Tutkimukset, joissa käytettiin puhdistettuja 10 plasmamembraanifraktioita aktivoiduista Th-soluista antoivat olettaa, että aktivoitujen Th-solujen membraanilla ekspressoituva proteiini sai aikaan humoraalisen immuniteetin alkamisen (Noelle et ai., (1991) J. Immunol. 146: 1118 - 1124; Bartlett et ai., (1990) J. Immunol. 145: 15 3956 - 3962).
Puhdistettuja plasmamembraaneja aktivoiduista ,,
Th:ista (PMAct) on käytetty tutkittaessa tämän efektoritoi- | minnon luonnetta (Hodgkin et ai. (1990) J. Immunol. 145: 2025 - 2034; Noelle et ai., (1991) J. Immunol. 146: 1118 -20 1124). PMAct aktivoituneista Th:ista, mutta ei lepotilassa olevista Th:ista (PMrest) ilmensivät aktiivisuutta, joka ..
indusoi B-solusyklin alkamista antigeenin suhteen epäspe- 1
- ..V
: .1, sifisellä luokan II rajoittamattomalla tavalla. Lisäksi ’ • · · osoitettiin, että PMAct:ien ilmentämä aktiivisuus edellytti • · *" 2 5 4 - 6 tunnin aktivaatiota, RNA-synteesiä de novo ja oli • 1 · luonteeltaan proteiini (Bartlett et ai., (1990) J. Immu- nol. 145: 3956 - 3962). 1 ·1 » • » t : .· Yhteenveto keksinnöstä
Mt : Tämä keksintö koskee menetelmää olennaisesti puh- 30 distetun, soluja sisältämättömän ligandin valmistamiseksi, • · · • · · ··· < • 1 ; • 1 • 1 1 f · .
• · · * · *·· • 1 • φ * 1 · · * · · ' .
• · · • 1 • · • · · * · · ' 3 117508 joka ligandi spesifisesti sitoutuu CD40CR-reseptoriin, 39 kDa:n T-solu-proteiiniin, joka sitoutuu CD40-B-soluanti-geeniin ja stimuloi B-solusyklin alkamista, jakautumista ja erilaistumista, jolloin mainittu ligandi: 5 a) käsittää ainakin osan CD40 proteiinin solunul- kopuolisesta domeenista, jolla on kuviossa 8Δ aminohapoilla 1-193 esitetty sekvenssi, kiinnittyneenä toiseen molekyyliin, jolloin mainittu toinen molekyyli on valittu peptideistä, proteiineista, hiilihydraateista ja lipideistä 10 koostuvasta ryhmästä ja jolloin fuusiokohdassa olevalla solunulkopuolisella domeenilla on aminohapposekvenssi Gly-Pro-Gln-Asp-Pro-Glu, ja jolloin mainittu ligandi b) kykenee sitoutumaan mainittuun CD40CR-proteii-niin aktivoidussa auttaja-T-solussa ja inhiboimaan akti-15 voidun T-solun vaikutuksesta tapahtuvaa lepäävän B-solun aktivoitumista, jolle on tunnusomaista, että käytetään rekombinantti-DNA- | tekniikkaa.
Keksintö perustuu vähintään osittain havaintoon, 20 että liukoinen CD40/immunoglobuliinifuusioproteiini kykeni inhiboimaan auttaja-T-solujen välittämää B-solujen akti- p vaatiota sitoutumalla uuteen 39 kD:n reseptoriproteiiniin ; 4·4 (nimetty "CD40CR", CD40-vastareseptori) autta j a-T-soluj en • · ♦ ‘II.* membraaneilla, ja havaintoon, että monoklonaalinen vasta- • · • · **' 25 aine, nimetty MRl:ksi, joka on suunnattu tätä 39 kD:n re- • · · ’···* septoria vastaan, kykeni inhiboimaan autta j a-T-soluj en vä- • · *·..* littämää B-solujen aktivaatioita.
• *.' Tämä keksintö tarjoaa myös käyttöön menetelmän • · * .
: olennaisesti puhdistetun, soluja sisältämättömän CD40/- 30 immunoglobuliinifuusioproteiinin valmistamiseksi, jo- . .*. ka fuusioproteiini spesifisesti sitoutuu hiiren CD40CR- ·«« • · · • « * · ··♦ · « · ♦ • · · « · • · * • · • · « • * • · * • · • · • · · # · · • * 4 1 1 7508 reseptoriin, 39 kDa:n hiiren T-soluproteiiniin, joka sitoutuu CD40-B-soluantigeeniin ja stimuloi B-solusyklin alkamista, jakautumista ja erilaistumista, jolloin mainittu fuusioproteiini käsittää ainakin osan CD40-proteiinin so-5 lunulkopuolisesta domeenista, jolla on kuviossa 8A aminohapoilla 1-193 esitetty sekvenssi, ja jossa fuusiokohdassa olevalla solunulkopuolisella domeenilla on aminohapposekvenssi Gly-Pro-Gln-Asp-Pro-Glu, jolle on tunnusomaista, että käytetään rekombinantti-DNA-tekniikkaa.
10 Yksi tämän keksinnön mukaisella menetelmällä val mistettavan ligandin eduista on, että se mahdollistaa puuttumisen immuunivasteeseen, joka ei ole antigeenis-pesifistä. Moniin nykyisin käytettyihin allergian hoitoihin liittyy herkkyyden vähentäminen tietyille antigeeneil-15 le, ja ne edellyttävät, että kukin potilas testataan, jotta tunnistetaan ne antigeenit, jotka liittyvät herkistymiseen. Käytännössä on kattava analyysi potilaan vasteesta joka ainoaan mahdolliseen allergeeniin tosiasiassa mahdotonta tehdä. Lisäksi useimmissa autoimmuunitiloissa niitä 20 aiheuttava antigeeni on yleensä tuntematon tai jopa yhdentekevä sairauden kululle. Tämä keksintö, joka koskee antigeenin suhteen epäspesifistä CD40/CD40CR vaikutusta, kier- ; .·, tää tarpeen karakterisoida antigeeni, joka liittyy aller- • · · *!!.’ giaan tai autoimmuniteettiin. Tämän vuoksi tämän keksinnön • f *" 25 mukaisella menetelmällä valmistettua ligandia voidaan * « · *j** käyttää erityisen edullisesti allergisten tilojen hoidos- • · *···' sa, jolloin immunogeeniä ei tunneta, tai joihin liittyy ·1 · : 1.1 useita tekijöitä, esimerkiksi heinänuhassa tai prokainami- * · · V· din indusoimassa lupuksessa. Se voi myös olla hyödyllinen 30 immuuniaktivaation akuutissa hoidossa, esimerkiksi anafy- : ;1· laksian hoidossa.
• · · ··· • « • · ·♦· • · • · · • · · · • · • 1 • 1 • · • · · • · · • · · • · · • ·· • · 5 117508 3.1. Lyhenteet
Ig Immunoglobuliini mab monoklonaalinen vasta-aine PMAct; plasmamembraanit, jotka on valmistettu aktivoi- 5 duista auttaja-T-soluista PMrest plasmamembraanit, jotka on valmistettu lepotilassa olevista auttaja-T-soluista PAGE polyakryyliamidigeelielektroforeesi rIL4 rekombinantti interleukiini 4 10 rIL5 rekombinantti interleukiini 5 SN supernatantti
Th auttaja-T-solu
Thl on peräisin D 1.6:sta, T-Ad-restriktoidusta, ka niinin immunoglobuliini-spesifisestä kloonista.
15 4. Kuvioiden sisältö 1
Kuvio 1. Monoklonaalisten vasta-aineiden ja CD40-Ig:n vaikutus B-solujen RNA-synteesin induktioon PMActilla. '
Osa A. Lepotilassa olevia B-soluja kasvatettiin Thl:sta peräisin olevien Pmrest:ien tai PMAct:ien kanssa.
20 25 pg/ml anti-CD4:ää, anti-LFA-1:tä tai anti-ICAM-1:tä tai 1 kunkin näistä yhdistelmää (kutakin 25 yg/ml) lisättiin kaivoihin, jotka sisälsivät PMÄct:ia, ja B-solujen RNA- j e e ' il: synteesi määritettiin liittämällä [3H]-uridiini. B-solujen 4 RNA-synteesi arvioitiin 42 ja 48 tunnin välillä viljelmän ··· . 25 aloituksesta. Esitetyt tulokset ovat aritmeettinen kes-
φ · J
• M
.···, kiarvo kolmesta verrokkiviljelmästä ± s.d., ja edustavat • · .Π viittä tällaista koetta. : • · ·
Osa B. Lepotilassa olevia B-soluja kasvatettiin , • · · *·1 1 Thl:stä (·, A) tai Th2: sta (□) peräisin olevien PMÄct:ien 30 kanssa. Thl PMÄct:eja sisältäviin viljelmiin (#,A) lisät- tiin kasvavat määrät CD40-Ig:ia (A) tai kontrolliproteii- . j ··· • 1 • · Ό * 1 1 • ! • · • 1 · • 1 · • 1 ·1· • · * 4 • · ♦ * · ··· .' • 1 · • 1 • · ... **··· • · 6 117508 nia CD7E-Ig (·)· Th2 PMÄct:eja sisältävään viljelmään (□) lisättiin kasvavat määrät CD40-Ig:ia. B-solujen RNA-synteesi arvioitiin 42 ja 48 tunnin välillä viljelmän aloituksesta. Esitetyt tulokset ovat aritmeettinen kes-5 kiarvo kolmesta verrokkiviljelmästä + s.d., ja ne edustavat kolmea tällaista koetta.
Osa C. Lepotilassa olevia B-soluja kasvatettiin LPS:n (50 pg/ml) tai PMAct:ien kanssa. Viljelmiin lisättiin CD40-Ig:ia (25 pg/ml; viivoitettu) tai CD7E-Ig:ia (25 10 pg/ml; väritetty). RNA-synteesi määritettiin kuten osassa A on esitetty. Esitetyt tulokset ovat aritmeettinen keskiarvo kolmesta verrokkiviljelmästä ± s.d., ja edustavat kolmea tällaista koetta.
Kuvio 2. CD40-Ig:llä inhiboitu B-solujen erilaistu-15 minen ja lisääntyminen.
Osa A. Lepotilassa olevia B-soluja kasvatettiin PMRct:ien, rIL4:n (10 ng/ml) ja rIL5:n (5 ng/ml) kanssa.
Joko viljelmää aloitettaessa tai päivinä 1, 2 tai 3 vil jelmän aloituksesta lisättiin CD40-Ig:ia tai CD7E-Ig:ia 20 (25 pg/ml). Kuudentena päivänä viljelmän aloituksesta ke rättiin SN yksittäisistä kaivoista ja kvantitoitiin IgM:n () ja IgGi-.n (·) suhteen käyttäen anti-isotyyppistä spe-; sifistä ELISA:a, kuten ovat kuvanneet Noelle et ai. 1991 • M « ·**'; (J. Immunol. 146: 1118 - 1124). PMAct:ien, IL4:n ja IL5:n • · · . 25 läsnäollessa (lisätyn CD40-Ig:n puuttuessa) IgM:n ja • · · .···, IgGi:n konsentraatiot olivat 4,6 pg/ml ja vastaavasti 126 » · .Γ1 ng/ml. Viljelmät, jotka saivat CD7E-Ig:ia (25 pg/ml) päi- *,.) vänä 0, tuottivat 2,4 pg/ml ja 89 ng/ml IgM:ää ja vastaa- • « t *** vasti IgGxitä. IL4:n ja IL5:n puuttuessa ei osoitettu 30 IgM:ää tai IgGirtä. Tulokset edustavat kolmea tällaista koetta.
* 1 · • · • · ,/, • · 1 • 1 • · · • 1 » • · • · · * · • 1 * « 1 · • · · • « · * 1 • « ·1·.
• ·» • · 7 117508
Osa B. Thl:iä pidettiin lepotilassa tai aktivoitiin anti-CD3:lla 16 tuntia, säteilytettiin ja viljeltiin (1 X lOVkaivo) lepotilassa olevien B-solujen kanssa (4 X lOVviljelmä) IL4:n läsnäollessa (10 ng/ml). Viljelmiin 5 lisättiin 0-25 pg/ml CD40-Ig:ia (A) tai CD7E-Ig:ia (·) .
66 - 72 tuntia viljelmän aloituksen jälkeen kaivoihin annettiin sykäyksenä 1,0 pCi:tä [3H]-tymidiiniä ja kerättiin kasvatukset talteen. Katkoviiva osoittaa B-solujen vastetta lepotilassa oleviin Teihin. Esitetyt tulokset ovat 10 aritmeettinen keskiarvo kolmesta verrokkiviljelmästä ± s.d,, ja edustavat kahta tällaista koetta.
Kuvio 3. CD40-Ig löysi molekyylin, joka ekspres-soitui aktivoiduissa, mutta ei lepotilassa olevissa Thiissa. Lepotilassa olevat ja aktivoidut Th:at kerättiin 15 ja niitä inkuboitiin fuusioproteiinien kanssa 20 minuuttia 4 °C:ssa, mitä seurasi FITC-konjugoitu vuohen anti-hlgG (25 yg/ml). Positiivisten solujen prosentuaalinen osuus ja MFI määritettiin analysoimalla vähintään 5 000 so- lua/näyte. Tulokset edustavat kuutta tällaista koetta.
20 CD40-Ig:n sitoutuminen on esitetty väritetyllä profiililla.
Kuvio 4. CD40-Ig immunosaosti 39 kD:n proteiinin ·,· · aktivoitujen Thl:ien lysaatista. Thl: t pidettiin lepoti- — lassa tai ne aktivoitiin liukenemattomaksi tehdyllä anti- • · · • ;1· 25 CD3:lla 16 tuntia. [35S]-leimatut proteiinit lepotilassa * 2 · .3. olevista tai aktivoiduista Th:ista immunosaostettiin puh- * · · distetuilla vasta-aineilla tai f uusioproteiineilla (1 - * · 10 μ). Geeliprofiili edustaa kolmea tällaista koetta.
• · «
Kuvio 5. Monoklonaalinen vasta-aine (mab), spesi-30 finen indusoidulle 39 Kd:n Th-membraaniproteiinille, inhi- • · · ‘•I·1 boi PM ct:ien aiheuttaman B-solujen RNA-synteesin. . Lepoti- * 1 · * · • 1 *** • · • 1 · ...
• · · • · • · · • · • · ·♦· * • · • 1 · ! • · 1 * # Φ * 1 1 2 ·♦· 3 * · '8 117508 lassa olevia B-soluja ja PMAct:eja viljeltiin 10 gg/ml kanssa kutakin seuraavista: anti-α/β, anti-CD3, CD40-Ig tai MR1. RNA-synteesi määritettiin, kuten kuvion 1 yhteydessä on esitetty. Esitetyt tulokset ovat aritmeettinen 5 keskiarvo kolmesta verrokkiviljelmästä ± s.d., ja ne edustavat kolmea tällaista koetta.
Kuvio 6. MRl ja CD40-Ig tunnisti saman molekyylin, joka ekspressoitui aktivoiduissa Th:issa.
Osa A. Aktivoidut Th:t fluoresenssi värjättiin 10 MRlrllä tai kontrolli Ig:llä. Sen arvioimiseksi, kilpaili-vatko CD40-Ig ja MRl sitoutumisesta aktivoituihin Th;ihin, , asteittain muuttuvat konsentraatiot MRl:tä tai kontrollina hamsterin Ig:tä (anti-α/β TCR) lisättiin yhdessä anti-CD40:n kanssa (20 pg/ml). Kun oli inkuboitu 20 minuuttia 15 4 °C:ssa, näytteet pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoidun ’ λ1 anti-ihmis-IgGi mab:in kanssa. Tulokset edustavat kolmea . tällaista koetta.
Osa B. Proteiinit [35S]-metioniinileimatusta, aktivoidusta Th:sta immunosaostettiin MRl:n kanssa (10 20 pg/näyte) tai CD40-Ig:n kanssa (10 pg/näyte) ja liuotettiin uudelleen PAGE:11a ja fluorografiällä. Esitetyt tulokset edustavat kahta tällaista koetta.
·,· · Kuvio 7. CD40-Ig:n sitoutuminen ihmisen solulin- :***; joihin. Erilaisia ihmisen T-solulinjoja altistettiin bio- . 25 tiinilla leimatulle CD40-Ig:lle ja sitoutuminen määritet- .***. tiin virtaussytometrialla. i
Kuvio 8.
« \··\ Osa A. CD40-cDNA:n nukleotidisekvenssi julkaisusta * Stamenkovic et ai., (1989) EMBO J. 8: 1403 - 1410. Trans-30 membraanialue on alleviivattu.
• ♦ 1 ···.
• · · .
• · · * · • ♦ • » · * • 1 • · · *·· ··· • · • · · • · • 1 · * · » • · • · • · · , 9 117508
Osa B. Kaavakuva plasmidista, jota voidaan käyttää ekspressoimaan CD40-Ig. Aminohapposekvenssi Δ CD40 -fuusiokohdassa on esitetty kaavamaisesti kuvatun CD40:n osan alapuolella.
5 5. Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän olennaisesti puhdistetun, soluja sisältämättömän ligandin valmistamiseksi, joka ligandi spesifisesti sitoutuu CD40CR-. reseptoriin, 39 kDa:n T-solu-proteiiniin, joka sitoutuu 10 CD4O-B-soluanti-geeniin ja stimuloi B-solusyklin alkamista, jakautumista ja erilaistumista, jolloin mainittu ligandi : a) käsittää ainakin osan CD40 proteiinin solunul-kopuolisesta domeenista, jolla on kuviossa 8A aminohapoil- 15 la 1-193 esitetty sekvenssi, kiinnittyneenä toiseen molekyyliin, jolloin mainittu toinen molekyyli on valittu peptideistä, proteiineista, hiilihydraateista ja lipideistä koostuvasta ryhmästä ja jolloin fuusiokohdassa olevalla solunulkopuolisella domeenilla on aminohapposekvenssi Gly-20 Pro-Gln-Asp-Pro-Glu, ja jolloin mainittu ligandi b) kykenee sitoutumaan mainittuun CD4OCR-proteii- niin aktivoidussa auttaja-T-solussa ja inhiboimaan akti- r • :1: voidun T-solun vaikutuksesta tapahtuvaa lepäävän B-solun ' ·2· · .3. aktivoitumista, • · r · · . 2 5 jolle on tunnusomaista, että käytetään rekombinantti-DNA- « « · tekniikkaa.
• · ,!1! Selityksen selkeyden vuoksi, mutta ei rajoittamaan • t • · millään tavalla, keksinnön yksityiskohtainen kuvaus on • · 1 *·1 1 jaettu seuraaviin alasektioihin: 30 (i) ligandit, jotka sitoutuvat CD40CR:ään, ; .
(ii) CD40CR:n karakterisoinnissa käytetyt menetel- • 1 · ϊ ί mät, • · · ,·[·. (iii) puhdistetun CD40CR:n valmistus, » · • · · • · • · *·· • · • · · • · · • · · ··♦ 2 ···' 3 • · 117508 ίο * (iv) CD40CR:ään sitoutuvien ligandien käytöt ja (v) CD40CR:n käytöt.
5.1. Ligandit, jotka sitoutuvat CD40CR:ään Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän CD40CR:n 5 liukoisten ligandien valmistamiseksi, joihin kuuluvat (i) fuusiomolekyylit, jotka käsittävät vähintään osan CD40-proteiinista ja (ii) vasta-aineet tai vasta-ainefrag-mentit.
Määritelmä "liukoinen" tarkoittaa tässä käytetty-10 nä, että keksinnön mukaisesti valmistettavat ligandit eivät ole pysyvästi liittyneet solun plasmamembraaniin. Keksinnön mukaisesti valmistettavat liukoiset ligandit voidaan kuitenkin kiinnittää ei-sellulaariseen kiinteään kantajaan, kuten esimerkiksi lipidi, proteiini tai hiilihyd-15 raattimolekyyli, helmi, vesikkeli, magneettinen partikkeli, kuitu, jne. tai ne voivat olla suljettuna siirrännäiseen tai vesikkeliin. ’ Tällaisen ligandin kyky sitoutua CD40CR:ään voidaan varmistaa osoittamalla, että ligandi sitoutuu samaan 20 proteiiniin kuin CD40-Ig (infra) tai MR1 (infra).
Keksinnön mukaisesti valmistettavat ligandit voi-vat sisältyä farmaseuttisiin koostumuksiin yhdessä sopivan • · : : : kantajan kanssa. . ' • ***j 5.1.1. Fuusiomolekyylit · · . 25 Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän liukois- • · · .···. ten fuusiomolekyylien, jotka ovat CD40CR:n ligandeja, vai- • · mistamiseksi. Tällaiset fuusiomolekyylit käsittävät vähin- * · *..* tään osan CD40-proteiinista kiinnitettynä toiseen molekyy- • · · liin. CD40:n osasta puuttuu mielellään CD40-transmem- 30 braanidomeeni. Sellainen CD40-proteiinin osa, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on määri-* * · .
ϊ„.ϊ telty miksi tahansa osaksi, joka kykenee sitoutumaan ä.· • :,ϊ .V, CD40CR:ään, tällaisen osan voidaan esimerkiksi osoittaa * · · I.. sitoutuvan samaan proteiiniin kuin MRl tai CD40-Ig.
• · *" 35 Toisiin molekyyleihin, joita voidaan käyttää, kuu- # * ·.·.* luvat peptidit ja proteiinit, lipidit ja hiilihydraatit, • * ϊ *.ί ja keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa se voi olla im- munoglobuliinimolekyyli tai sen osa (kuten Fv-, Fab-, 117508 : .f F(ab')2- tai Fab'-fragmentti) tai CD8 tai muu adheesiomolekyyli, kuten B7. Toinen molekyyli voidaan johtaa joko ei-ihmis- tai ihmislähteestä, tai se voi olla kimeerinen.
Toinen molekyyli voi olla myöskin entsyymi, toksiini, kas-5 vutekijä, lymfokiini, antiproliferatiivinen aine, alky- loiva aine, antimetaboliitti, antibiootti, vinca-alka- j loidi, platinakoordinoitu kompleksi, radioisotooppi tai fluoresoiva yhdiste.
Keksinnön mukaisella menetelmällä fuusiomolekyylit 10 voidaan valmistaa kemiallisella synteesillä tai edullisesti rekombinantti-DNA-tekniikoilla.
Nukleiinihapposekvenssi, joka koodaa vähintään osaa CD40-proteiinista, voidaan yhdistää nukleiinihappose-kvenssin kanssa, joka koodaa toista molekyyliä sopivassa 15 ekspressiovektorissa, ja ekspressoida sitten prokaryootti- , tai edullisesti eukaryoottiekspressiojärjestelmässä, kuten hiivassa, bakuloviruksessa tai nisäkkään ekspressiojärjes-telmässä, mukaanluettuna transgeeniset eläimet.
Vaihtoehtoisesti vähintään osa CD40-proteiinista 20 voidaan ekspressoida käyttämällä rekombinantti-DNA-teknii-koita, ja konjugoida sitten kemiallisesti toiseen molekyyliin .
: ί : CD40:n sisältävät fuusiomolekyylit voidaan puhdis- • · · * *- ·***; taa preparatiivisista seoksista käyttämällä elektrofo- • · · . 25 reesitekniikoita tai affiniteettikromatografiaa käyttäen · • · · .···, ligandia, joka sitoutuu joko CD40:een tai toiseen molekyy- u · .‘*I# liin. Ligandeihin, jotka sitoutuvat CD40:een, kuuluvat * · *..! mutta eivät rajoitu näihin, anti-CD40-vasta-aineet, kuten • * · *** * G28-5, tuotettu hybridoomalla, jonka numero on HB110, tal- 30 letettu talletuslaitokseen American Type Culture Collecti-on, ja CD40CR, kuvattu tarkemmin osissa 5.2 ja 5.3, infra.
• · ♦ ϊ.,.ϊ Jos toinen molekyyli on immunoglobuliini tai immunoglobu- liinifragmentti, voidaan käyttää af f initeettipylvästä, jo- » · · ka käsittää anti-immunoglobuliinivasta-aineen; jos toinen • · 35 molekyyli käsittää Fc-fragmentin, voidaan käyttää proteii- • · V/ ni A-pylvästä.
• ·
Edullisesti CD40:n osa voidaan tuottaa käyttämällä nukleiinihapposekvenssiä, joka koodaa CD40-proteiinia, jo- 12 117508 ka on typistetty ylävirtaan transmembraanidomeenistä. Tällainen nukleiinihapposekvenssi voidaan valmistaa pilkkomalla plasmidi, joka sisältää CD40-antigeeniä koodaavan cDNA:n, kuten julkaisussa Stamenkovic et ai. on esitetty 5 (1989), EMBO J. 8: 1403 - 1410, PstI (P) ja Sau 3 A (S3) : restriktioentsyymeillä. Saatu P/S3-fragmentti voidaan ala-kloonata samaan plasmidiin, joka on pilkottu P:llä ja Bam .
HI:llä (B), jotta saadaan lyhennetty CD40-geeni (katso kuvio 8) .
10 Ekspressiovektori, jota käytetään tuottamaan vä hintään osan CD40:stä sisältävät ligandit, samoin kuin im-munoglobuliinisekvenssi, voivat käsittää edullisesti vi-rusalkuperästä johdetun replikaation aloituskohdan, bak-teerialkuperää olevan replikaation aloituksen, bakteerial-15 kuperaa olevan valittavan merkin ja eukaryoottipromootto-rin ja tehostinsekvenssit, jotka erotetaan DNA-sek-vensseistä, jotka koodaavat immuniglobuliinin vakioista aluetta restriktioendonukleaasikohdilla, jotka tekevät mahdolliseksi sellaisten DNA-sekvenssien alakloonauksen, 20 jotka koodaavat vähintään osaa CD40:stä, ja jota seuraa polyadenylaation signaalisekvenssi (katso kuvio 8.b.).
Lyhennetty CD40-geeni voidaan alakloonata immuno- • ·'; globuliinifuusio-plasmidiin, kuten Aruffon et ai. 1990 ku- **· « .***. vaarna, Cell 61: 1303 - 1313, käyttäen Miu I- ja B- • · · . ,·. 25 pilkkomista, muodostamaan plasmidi pCD40-Ig, joka koodaa « · « fuusiomolekyyliä CD40-Ig (katso kuvio 8) . CD40-Ig- .1” fuusioproteiini voidaan sitten tuottaa transfektoimalla • · · ·..· pCD40-Ig-plasmidi COS-soluihin, muodostamaan tilapäinen * t · *·* ekspressio j är j estelmä. Tuotettu CD40-Ig voidaan kerätä 30 COS-solujen supernatantista ja puhdistaa proteiini-A- pylväskromatografialla, kuten ovat kuvanneet Aruffo et ai., 1990, Cell 161: 1303 - 1313.
··· rt . ' -:J, ·*· 5.1.2. Vasta-aineet • · · • · ♦ 1,1 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat · • · "* 35 liukoiset ligandit voivat käsittää vasta-ainemolekyylejä, • · *#ϊ#ϊ monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä tai näiden vasta- ainemolekyylien fragmentteja, jotka sisältävät antigeeniin liittyvän kohdan, joka sitoutuu CD40CR:ään. Tällaiset li- ' '13 " 117508 gandit voivat käsittää lisäksi toisen molekyylin, joka voi olla proteiini, lipidi, hiilihydraatti, entsyymi, toksiini, kasvutekijä, lymfokiini, antiproliferatiivinen aine, alkyloiva aine, antimetaboliitti, antibiootti, vinca-5 alkaloidi, platinakoordinoitu kompleksi, radioisotooppi tai fluoresoiva yhdiste, ja se voidaan liittää vasta-ainemolekyyliin tai fragmenttiin.
Kun ligandi on monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, monoklonaalinen vasta-aine voidaan valmistaa 10 CD40CR:ää vastaan käyttäen mitä tahansa tekniikkaa, joka tarjoaa mahdollisuuden valmistaa vasta-ainemolekyylejä jatkuvissa solulinjoissa viljelmissä. Esimerkiksi hybri-doomatekniikka, jonka kehittivät alunperin Kohler ja Mil- .
stein (1975, Nature 256: 495 - 497), samoin kuin muut tek-15 niikat, jotka ovat viime aikoina tulleet saataville, kuten ihmisen B-soluhybridoomatekniikka (Kozbar et ai., 1983,
Immunology Today 4: 72) ja EBV-hybridoomatekniikka, jolla tuotetaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita (Cole et ai., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan 20 R. Liss, Inc., s. 77 - 96) ynnä muut, kuuluvat tämän kek-sinnön piiriin.
Vasta-ainefragmentit, jotka sisältävät molekyylin ? ! .**: idiotyypin, voidaan luoda tunnetuilla tekniikoilla. Esi- -i ·1♦ · ·***· merkiksi tällaiset fragmentit sisältävät, mutta eivät ra- ··· . 25 joitu näihin, F (ab') 2-fragmentin, joka voidaan luoda kä- • · · ·'’· i
.···, sittelemällä vasta-ainemolekyyli pepsiinillä; Fab1- S
• fragmentit, jotka voidaan luoda pelkistämällä F(ab')2- 5 * · fragmentin disulfidisillat; F (ab' ) 2-fragmentti, joka voi- * · *· 1 daan luoda käsittelemällä vasta-ainemolekyyli papaiinilla 30 ja 2Fab- tai Fab-fragmentit, jotka voidaan luoda käsitte-lemällä vasta-ainemolekyyli papaiinilla ja pelkistävällä ··· ·...· aineella disulfidisiltojen pelkistämiseksi.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet- • · « • 4 .
.···, tavat ligandit ovat käyttökelpoisia valmistettaessa kimee- • · r 35 risia vasta-aineita, jotka on tuotettu alalla tunnetuilla • ♦ :.V tekniikoilla, kuten Morrisonin et ai. (1984) esittämät, !**·; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851 - 6855 tai EP- 14' 117508 patenttihakemus nro 85 305 604.2, julkaisunumero 0 173 494, Morrison et ai., julkaistu 5.3.1986.
Immunogeeni vasta-aineiden tuottamiseksi voi olla mikä tahansa lähde, joka sisältää CD40CR:ää. Esimerkiksi 5 aktivoitua Th:aa voidaan käyttää immunogeeninä.
: , Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää olennaisesti puhdistettua CD40CR:ää, valmistettu, kuten osassa 5.3 on esi- j tetty infra. Jos aktivoituja Th:ia käytetään immunogeeninä, antiseerumi voidaan testata reaktiivisuuden suhteen 10 aktivoituja, mutta ei lepotilassa olevia Th-soluja vastaan.
Edullisesti liukoinen ligandi on MR1 monoklonaali-nen vasta-aine. Seuraavaa menetelmää käytettiin tuottamaan MRl monoklonaalinen vasta-aine, ja sitä voidaan käyttää 1 15 luomaan muita CD40CR:ää vastaan suunnattuja vasta-aineita.
Hamsterit immunisoitiin intraperitoneaalisesti 5 -10e aktivoidulla Thl-solulla (Dl. 6) viikon välein kuuden viikon ajan. Kun seerumin tiitteri hiiren Thl:tä vastaan oli suurempi kuin noin 1:10 000, solufuusiot valmistettiin 20 polyetyleeniglykolilla käyttäen hamsterin immuunisple-nosyyttejä ja NSI:tä. SN kaivoista, jotka sisälsivät kasvavia hybridoomia, seulottiin virtaussytometrialla lepoti- • · ·.· j lassa olevista ja aktivoiduista Thl:sta. Yksi erityinen :***; hybridooma, joka tuotti mab:ia, joka tunnisti valikoivasti • * • ;*; 25 aktivoidut Th:t, testattiin edelleen ja alakloonattiin, • · « jotta saatiin MRl. MRl tuotettiin vesivatsoissa ja puhdis- ; ,··,·. tettiin ioninvaihto-HPLC: llä.
• · ’..t Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat • t 4 : • · · ligandit, jotka myös käsittävät monoklonaaliset vasta-30 aineet ja niiden fragmentit, jotka kykenevät inhiboimaan * · · *···* kompetitiivisesti MRl: n sitoutumisen sen kohdeantigeenei- ui *...· hin tai CD40-Ig:n sen reseptoriin.
• * jV. 5.2. CD40CR:n karakterisoinnissa käytetyt merietel- • · .···, mät • · m· 35 CD40CR voidaan karakterisoida (i) sen kyvyn mukaan * I · ***** sitoutua CD40:een, fuusiomolekyylien sisältäessä vähintään • * \**i osan CD40:stä, ja vasta-aineisiin, kuten MRl; (ii) sen toiminnallisen ominaisuuden mukaan kyetä stimuloimaan B- 1.5 117508 solusyklin alkamista, jakaantumista ja erilaistumista ja (iii) sen jakauman soluissa perusteella.
5.2.1. Kyky sitoa ligandeja CD40CR voidaan karakterisoida sen kyvyn perusteel-5 la sitoutua ligandeihin, kuten CD40:een, fuusiomolekyylei- hin, jotka käsittävät CD40:ää ja CD40CR:ää vastaan suun- 'f.
nattuihin vasta-aineisiin.
Kuten infra on esitetty ykstyiskohtaisemmin, useita tekniikoita käytettiin CD40CR:n karakterisoimiseksi.
10 Esimerkiksi CD40-Ig:n ja MRl:n osoitettiin tunnistavan saman 39 kD:n molekyylin. Sekä CD40-Ig:n että MR1:n havaittiin immunosaostavan 39 kD:n proteiinin radioleimatuista Th-lysaateista (kuvio 5b). Lisäksi 39 kD:n proteiinin im-munosaostus CD40-Ig:llä poisti MRl:n tunnistaman antigee-15 nin Th-lysaateista.
5.2.2. Kyky stimuloida B-soluja :ί i CD40CR voidaan myös karakterisoida kykynsä perusteella stimuloida B-solusyklin alkamista, jakaantumista ja erilaistumista.
20 Esimerkiksi plasmamembraanin (PM) aktivoiduista (PMAct) mutta ei lepotilassa olevista (PMrest) Th-soluista havaittiin indusoivan B-solujen RNA-synteesiä (kuvio la) ; : :*J tähän induktioon, joka osoittaa B-solujen aktivaatiota, . \ ·«* * ·*"; eivät vaikuttaneet vasta-aineet, kuten anti-LFA-1, anti- . .*, 25 CD4, anti-ICAM-1. CD40-Ig:n tai MRl:n havaittiin kuitenkin .···. kykenevän inhiboimaan PmAct:ien indusoimaa B-solujen akti- Λ * * ' •Γ! vaatiota, kuten kuvioissa Ib ja 6 on esitetty.
• *.,t B-solujen aktivaation induktio voidaan mitata tek- • e·,·.' *·* * nilkoilla, kuten [3H] -uridiinin liittämisellä RNA:han (kun 30 B-solut erilaistuvat, RNA-synteesi lisääntyy) tai [3H]-tymidiinin liittämisellä, jolla mitataan DNA-synteesiä, • · · joka liittyy solujen jakaantumiseen. CD4 0CR:n vaikutuksen > B-solujen jakaantumiseen optimaaliseksi määrittämiseksi • · · m*··' voidaan lisätä interleukiini-4: ää (IL-4) kasvatusalustaan • · *:* 35 konsentraationa noin 10 ng/ml.
4 · *,·,· Vaihtoehtoisesti B-solujen aktivaatiota voidaan • · i.’·; mitata immunoglobuliinin erityksen funktiona. Esimerkiksi CD40CR:ää, olennaisesti puhdistetussa muodossa tai 16 117508 PMrissä, tai muussa muodossa, voidaan lisätä lepotilassa oleviin B-soluihin yhdessä IL-4:n (10 ng/ml) ja IL-5:n (5 ng/ml) kanssa. Kolmen päivän viljelyn jälkeen voidaan lisätä lisämäärä kasvatusalustaa. Viljelyn kuudentena päi-5 vänä voidaan kerätä supernatantti (SN) yksittäisistä viljelmistä ja kvantitoida IgM:n ja IGi:n suhteen, kuten ovat kuvanneet Noelle et ai., (1991) J. Immunol. 146: 1118 - 1124.
5.2.3. solujakauma 10 CD40CR voidaan myös karakterisoida sen soluja- kauman perusteella. Esimerkiksi CD40-Ig:n havaittiin sitoutuvan aktivoituihin, mutta ei lepotilassa oleviin Thl:iin, määritettynä virtaussytometrialla (kuvio 3). Lisäksi CD40-Ig:n havaittiin sitoutuvan Jurkat-soluihin, 15 HSB2-soluihin ja aktivoituihin T-soluihin ihmisen perife-raalisesta verestä mutta se ei näyttänyt sitoutuvan olennaisesti CEM-soluihin, HPBALL-soluihin tai hiihen tymoo-masoluihin.
Esimerkiksi, mutta ei millään tavalla rajoittaen, 20 CD40CR:n läsnäolo erityisessä solutyypissä ("testisoluis-sa") voidaan arvioida virtaussytometrialla seuraavasti.
Testisolut voidaan testata samaan aikaan kuin lepotilassa J .*j olevat (negatiivinen kontrolli) ja aktivoidut (positiivi- ι·« · .···. nen kontrolli) Th-solut. Kaikkia soluja voidaan inkuboida • ·
* * * R
, ,·. 25 konsentraatioina noin 1 X 10 solua/50 μΐ ligandia (esim.
• · · \ \”t CD40-IGg:tä tai MR-l:tä) 20 minuuttia 4 °C:ssa, mitä seu- rasi FITC-konjugoitu anti-ligandi-vasta-aine. Proipidium- « « · • ·* jodidia voidaan lisätä kaikkiin näytteisiin lopulliseen * · · *.* * konsentraatioon 2 pg/ml. Sen jälkeen voidaan tehdä vir- 30 taussytometria-analyysi, esimerkiksi BD FACSCAN: ilia. So- ♦ ί#:#ϊ lujen positiivisen avainnuksen jälkeen verraten hajontaa :· eteenpäin ja sivulle, ja punanegatiivisuudella (propidium- • * · jodidiekskluusio) ja elinkykyisten solujen log vihreäfluo- * * * *.* resenssi voidaan varmistaa.
♦ ♦ *··** 35 5.3. Puhdistetun CD40CR:n valmistus
Olennaisesti puhdistettu CD40CR voidaan valmistaa • · .*·.· soluista, jotka sisältävät CD40CR:ää, kuten aktivoiduista • · 117508 π auttaja-T-soluista, Jurkat- ja HSB2-soluista, seuraavalla tavalla,
Plasmamembraanit voidaan valmistaa sopivista soluista, kuten aktivoiduista Thl-soluista, epäjatkuvalla 5 sakkaroosigradienttisedimentaatiolla, kuten ovat kuvanneet Noelle et ai., 1991, J. Immunol. 146: 1118 - 1124. CD40CR voidaan sitten eristää dissosioimalla raakamembraaniuute laimealla detergentillä ja sitten suorittamalla kokoeks-kluusiokromatografia jota seuraa joko affiniteettikromato-10 grafia käyttäen sopivia ligandeja (esim. MRl:tä tai CD40-Ig:tä) sidottuna kiinteään kantajaan, immunosaostusta (esim. CD40-Ig:llä tai MRl:llä) ja/tai geelielektroforee-sia.
Saadun proteiinin molekyylipainon voidaan olettaa : 15 olevan noin 39 kD.
Liukoinen CD40CR (se on soluvapaan) voi sisältyä farmaseuttiseen koostumukseen yhdessä sopivan kantajan ' ·.
kanssa. Se voi olla CD40CR:n, joka on liitetty toiseen molekyyliin, joka voi olla peptidi, proteiini, lipidi, hii-20 lihydraatti, entsyymi, toksiini, kasvutekijä, lymfokiini, antiproliferatiivinen aine, alkyloiva aine, antimetabo-liitti, antibiootti, vinca-alkaloidi, platinakoordinoitu i I kompleksi, radioisotooppi tai fluoresoiva yhdiste.
• · · · .···. Olennaisesti puhdistettu CD40CR on valmistettu ke- • · • · · . ,·. 25 maallisella synteesillä tai rekombinantti-DNA-tekniikalla.
· · !!! CD4 0CR-geeni voidaan esimerkiksi eristää liittämällä akti- j voiduista auttaja-T-soluista valmistettu cDNA λρϋΟ- * » * • ekspressiojärjestelmään ja seulomalla sitten MRl:n tai • * * ’·* * CD40-Ig:n sitoutuminen, jotta tunnistetaan CD40CR:ää eks- 30 pressoivat kloonit. Vaihtoehtoisesti aktivoiduista autta-ja-T-soluista valmistettu cDNA voidaan transfektoida COS-: ϊ soluihin, joiden supernatantit voidaan seuloa MRltllä tai CD40-Ig:llä, jotta tunnistetaan CD40CR-tuottajat. CD40CR:n ♦ · · geeniä voidaan sitten käyttää CD40CR:n ekspressoimiseen * * *"·* 35 käyttäen alalla tunnettuja ekspressiojärjestelmiä.
• · • · · • · · • · * · • * * • · ♦ * · 18 '·; 1 117508 5.4 CD40CR:ään sitoutuvien ligandien käyttö
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat CD40CR:ään sitoutuvat ligandit ovat käyttökelpoisia erityisesti inhiboitaessa B-solujen aktivaatiota, joka käsit-5 tää B-solujen ja Th-solujen seoksen altistamisen tehokkaalle konsentraatiolle ligandia, joka sitoutuu I
CD40CR:ään. Ligandit, joita voidaan käyttää, on kuvattu ; supra osassa 5.1. Menetelmää voidaan toteuttaa käytännössä in vitro tai in vivo. Tehokas konsentraatio tarkoittaa li-10 gandin konsentraatiota, joka inhiboi B-solujen aktivaatiota, määritettynä millä tahansa alalla tunnetulla tekniikalla (mukaanluettuna osassa 5.2 esitetyt, supra) vähintään 30 %:lla ja edullisesti noin 75 %:lla. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavaa CD40-Ig:tä voidaan 15 käyttää ligandina, jossa tapauksessa tehokas konsentraatio voi olla vähintään noin 10 pg/ml. Erityisesti voidaan käyttää monoklonaalista vasta-ainetta MR1, jossa tapauk- /; sessa tehokas konsentraatio voi olla vähintään 10 pg/ml.
Jos menetelmää toteutetaan in vivo, ligandin tehokas kon-20 sentraatio voi tarkoittaa ligandin konsentraatiota plas- ... ( massa tai paikallista konsentraatiota. Esimerkiksi voi oi- f la toivottavaa inhiboida B-solujen aktivaatiota paikalli- j ·*· sella alueella, jotta rajoitetaan vaikutusta immuunijär- • · « · .···. jestelmään kokonaisuudessaan.
• · • · · , ,·, 25 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat « · · III ligandit ovat käyttökelpoisia hoidettassa yksilöä, joka * * 0 .1" kärsii B-solujen aktivaatioon liittyvästä häiriöstä, joi- • · * • loin menetelmässä annetaan yksilölle terapeuttinen määrä * · · *·* * CD40CR:ään sitoutuvaa ligandia. Yksilö voi olla eläin tai 30 ihminen. ; !.·.! B-solujen aktivaatioon liittyviin häiriöihin kuulsi luvat, mutta eivät rajoitu tässä mainittuihin, allergia ""? (mukaanluettuna anafylaksia) , autoimmuunitilat, joihin • · · 1 I.I kuuluvat lääkkeen indusoima lupus, systeeminen lupus eryt- • ♦ *;* 35 hematosus, aikuisten nivelreuma, juveniili nivelreuma, * · :/./, skleroderma, Sjögrenin syndrooma jne,, ja virussairaudet, :**.· , joihin B-solut osallistuvat, mukaanluettuna Epstein-Barrin * * 19 117508 infektio ja retrovirusinfektiot, joihin kuuluu ihmisen im-muunikatovirusinfektio.
Koska on ehdotettu, että B-solujen aktivaatio liittyy ihmisen immuunikatoviruksen replikaatioon latenssista, 5 voi olla toivottavaa antaa keksinnön mukaisella memenetel- mällä valmistettavia ligandeja HIV-positiivisille yksi- i loille, joille ei vielä ole kehittynyt AIDS:ia tai ARC:ia. '
Ligandit voidaan antaa sopivassa farmaseuttisessa kantajassa, millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä, 10 joihin kuuluvat intravenaalinen, intraperitoneaalinen, subkutaaninen, intratrakeaalinen, intra-artikulaarinen tai intramuskulaarinen injektio, ja oraalinen, intranasaali-nen, intraokulaarinen ja rektaalinen anto, ja jotka voivat käsittää mikropallosia, liposomeja ja/tai pitkävaikuttei-15 siä siirrännäisiä.
Terapeuttinen määrä ligandia määritellään määräk- j si, joka vähentää huomattavasti B-solujen aktivaation haitallisia kliinisiä vaikutuksia, ja määrä voi vaihdella käytettyjen ligandien ja hoidettujen tilojen mukaan. Jos 20· käytetään CD40-Ig:tä, terapeuttinen konsentraatio voi olla noin 10 gg/ml joko systeemisesti (konsentraatio plasmassa) tai paikallisesti. Jos käytetään MRl:tä, terapeuttinen ,, | konsentraatio voi olla noin 10 gg/ml joko systeemisesti • * · · .···. (konsentraatio plasmassa) tai paikallisesti.
• · 25 Keksinnön mukaisesti valmistettavia ligandeja voi- • · · ΠΓ daan käyttää myös aktivoitujen T-solujen leimaamiseen, --¾ **·* tekniikkaa, joka voi olla hyödyllinen T-solujen häiriöiden .
* * * • ·* diagnoosissa. Tätä tarkoitusta varten ligandi, joka käsit- · · *.* * tää entsyymin, radioisotoopin, fluoresoivan yhdisteen tai 30 muun osoitettavan leiman, voidaan saattaa T-solujen yhtey- : : : teen in vitro tai in vivo ja sitoutumisen määrä voidaan * * · -* kvantitoida. . ' • · · • * * **· * * · • · • * • · · * • · # * * · ♦ · . ··· * «» • · : : 20 ; 117508
Keksinnön mukaisia ligandeja voidaan käyttää myös toimittamaan aineita, kuten esim. kasvutekijöitä, aktivoituihin T-soluihin.
5.5. CD40CR:n käytöt 5 CD40CR:ää voidaan käyttää myös CD40:ää ekspres- soivien B-solujen leimaamiseen, tekniikkaa, joka voi olla 1 hyödyllinen B-solujen häiriöiden diagnoosissa. Tätä tar- ; koitusta varten reseptori, joka on liitetty entsyymiin, radioisotooppiin, fluoresoivaan yhdisteeseen tai muuhun 10 osoitettavaan leimaan, voidaan saattaa B-solujen yhteyteen in vivo tai in vitro ja sitoutumisen määrä voidaan kvanti-toida.
CD40CR:ää voidaan käyttää myös siihen liitettyjen molekyylien viemiseen B~soluihin.
15 6. Esimerkki: uusi reseptori, CD40CR, aktivoiduis sa auttaja-T-soluissa sitoo CD40:ää ja muuntaa B-solujen '3 sisäisen aktivaation signaalin 6.1. Materiaalit ja menetelmät 6.1.1. Eläimet 20 Naaraspuolisia DBA/2J-hiiriä (Jackson Laborato ries, Bar Harbor, ME) käytettiin täyttösolujen valmistukseen, tukemaan Th-kloonien kasvua, ja lepotilassa olevien ί .1· B-solujen valmistukseen.
• · 1 1 .·1·. 6.1.2. Auttaja-T-solukloonit (Th) f · , 25 Dl. 6, I-Ad-restriktoitu, kaniinin Ig-spesifinen
Thl-klooni (Kurt-Jones et ai., (1987) J. Exp. Med. 166: 1774 - 1787) saatiin Dr. David Parkerilta, University of • · · • ·1 Mass., Worcester. D1.6:tta kutsutaan tässä Thl:ksi.
* · 1 *·1 1 6.1.3. Th: iden aktivaatio anti-CD3:lla 30 Thl-soluja kasvatettiin (8 X lOVkaivo) ryväs- :.i,: kaivoissa (6 kaivoa, Corning, NY), jotka oli päällystetty ϊ |ϊ 40 pg/4 ml PBS/kaivo, anti-CD3:n kanssa 16 tuntia, kuten .1. ovat kuvanneet Noelle et ai., 1991 (J. Immunol. 146: *;!:1 1118 - 1124) .
• 1 * 1 1 ' · *·· * · Φ · * · · • · 21 .'il 117508 6.1.4. Th-plasmamembraanien valmistus
Plasmamembraanit valmistettiin epäjatkuvalla sak-karoosigradienttisedimentaatiolla, kuten ovat kuvanneet Noelle et ai., 1991 (J. Immunol. 146: 1118 - 1124).
5 6.1.5. Lepotilassa olevien B-solujen valmistus
Lepotilassa olevia pernan B-soluja valmistettiin sedimentoimalla epäjatkuvissa Percoll-gradienteissa, kuten on kuvattu julkaisussa (Defranco et ai., (1982) J. Exp.
Med. 155: 1523). Solut, jotka erottuivat 70 - 75-%:n 10 (1,087 - 1,097) Percoll-rajalle, olivat tyypillisesti > 95-prosenttisesti mlg*, niillä oli yhtenäinen, matala-asteinen tai lähellä eteenpäinsuuntautunutta valon hajon- : ta, eivätkä olleet herkkiä Con A:lie.
6.1.6.Vasta-aineet 15 Seuraavat mab: it puhdistettiin ioninvaihto-HPLC: llä vesivatsanesteestä hiiriltä, jotka oli säteilytetty ja joiden luuydin oli uudelleenmuokkautunut: anti-CD3; 145 -2C11 (Leo et ai., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 1374 - 1378), anti-a,B:H57 - 597, anti~CD4: GK1.5 (Wilde 20 et ai., (1983) J. Immunol. 131: 2178 - 2183), anti-ICAM: YN1/1.7.4 (Prieto et ai., (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1551 - 1557), anti-LFA-1: FD441.8 (Sarmiento et ai, (1982) • Immunol. Rev. 68: 135) ja anti-rotta/hamsterin κ-ketju: RG-7 (Springer, (1982) Hybrid. 1: 257 - 273).
• · ,25 6.1.7. CD40-rekombinanttiglobuliinin valmistus (cD4o-ig) • · .1" CD40-fuusioproteiini valmistettiin pilkkomalla • * · CD40-antigeeniä koodaavan cDNA:n sisältävä plasmidi (Sta-*·’ ' menkovic ja Seed, (1989) EMBO J. 8: 1403 - 1410) restrik- 30 tioentsyymillä Pst I (P) ja Sau 3A (S3). Tämä P/S3-frag- ;i hi,5 mentti alakloonattiin samaan plasmidiin, joka oli pilkottu P:llä ja Bam Hl:llä (B). Tämä teki mahdolliseksi valmistaa CD40A:n, joka koodasi CD40-proteiinia, jota oli lyhennetty • Φ · ylävirtaan transmembraanidomeenista. CD40A:aa koodaava *1* 35 DNA-fragmentti alakloonattiin sitten immunoglobuliinifuu- · · • · « « · • ·· • · 22 117508 sioplasmidiin (Aruffo et ai. (1990), Cell 61: 1303 - 1313) käyttäen Mlul:tä ja B:tä pilkkomiseen. CD40-Ig-fuusiopro-teiini tuotettiin tilapäisellä transfektiolla COS-soluissa ja puhdistettiin proteiini-A-pylväässä, kuten on kuvattu 5 julkaisussa Aruffo et ai., (1990) Cell 61: 1303 - 1313).
6.1.8. Lymfokiinit
Interleukiini 4 (IL4): hiiren rekombinantti-iL4:n luovuttivat avuliaasti tohtorit C. Maliszewski ja K.
Grabstein, Immunex Corporation, Seattle, WA.
10 Interleukiini 5 (IL5): hiiren rekombinantti-IL5 ostettiin R&D Research'ista, Sarrento, CA.
6.1.9. B-solujen RNA-synteesin induktio aktivoitujen Th:iden plasmamembraaneilla 3 x 104 lepotilassa olevaa B-solua viljeltiin 15 50 pl:ssa cRPMI:ä A/2-mikrotiitterikaivoissa (Costar,
Cambridge, MA). Näihin kaivoihin lisättiin 0,5 pg Thl- tai Th2-membraaniproteiinia. Tunteina 42 - 48 kaivoihin annettiin 2,5 pCi 3H-uridiinia (New England Nuclear, Boston MA), kerättiin talteen ja radioaktiivisuus määritettiin nes-20 tetuikespektroskopialla. Tulokset ilmaistiin cpm/viljelmä ± s.d.
6.1.10. B-solujen immunoglobuliinin erityksen in- . . ' duktio aktivoiduilla Th-plasmamembraaneilla ja lymfokii- neillä ^ • « ··; 25 Lepotilassa olevia B-soluja kasvatettiin kuten • 1 · *"·1 edellä on esitetty. Kasvatuskaivoihin lisättiin 0,5 pg *..·1 Thl-rnembraaniproteiinia, IL4:ää (10 ng/ml) ja IL5:ttä M 1 ! V (5 ng/ml). Kolmantena viljelypäivänä lisättiin vielä 50 pl ί,ϊ 1 cRPMI:tä. Kuudentena viljelypäivänä SN yksittäisistä kai- 30 voista kerättiin talteen ja kvantitoitiin IgM:n ja IgG1:n : :2 suhteen, kuten on kuvattu julkaisussa Noelle et ai.,
Ml .···. (1991) J. Immunol. 146: 1118 - 1124).
* 1 1 - • I f • · # ··· I « ··· « • · · ··· · * · · .
• ·· 2 • · .
117508 23 6.1.11. B-solujen jakaantumisen induktio aktivoiduilla Th:illa ja IL4:llä 4 X 104 lepotilassa olevaa B-solua kasvatettiin 50 pl:ssa cRPMlrä A/2 mikrotiitterikaivoissa (Costar, Cam-5 bridge, MA). Näihin kaivoihin lisättiin 1 X 104 lepotilassa
olevaa tai aktivoitua, säteilytettyä (500 radia) Thl-solua I
ja lL4:ää (10 ng/ml). Kolmantena kasvatuspäivänä kaivoihin annettiin sykäyksenä 1 pCi 3H-tymidiiniä, kuten on kuvattu julkaisussa Noelle et ai., (1991) J. Immunol. 146: 1118 -10 1124).
6.1.12. Aktivoituihin Thl-soluihin indusoiduille membraaniproteiineille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen
Hamsterit immunisoitiin intraperitoneaalisesti 5 -15 10 X 106:lla aktivoidulla Thl:llä (Dl. 6) viikon välein kuu den viikon ajan. Kun seerumin tiitteri hiiren Thl:tä vastaan oli suurempi kuin 1:10 000, solufuusiot tehtiin poly-etyleeniglykolilla käyttäen hamsterin immuunisplenosyyt-tejä ja NSlrtä. SN kasvavia hybridoomia sisältävistä kai-20 voista seulottiin virtaussytometrialla lepotilassa olevis ta ja aktivoiduista Thl:stä. Yksi erityinen hybridooma joka tuotti selektiivisesti aktivoidut Th:t tunnistavaa mab:ia, . . testattiin edelleen, ja alakloonattiin, jotta saatiin MRl.
• · · *“/ MRl tuotettiin vesivatsoissa ja puhdistettiin ioninvaihto- '···: 25 HPLC: llä.
t · t *·ί·1 6.1.13. Th:iden ekspressoimien aktivaatiomolekyylien ··· :...· virtaussytofluorometrinen analyysi «» « • 1,· Lepotilassa olevat ja aktivoidut Th:t (16 tuntia
:]ί1: anti-CD3:lla) kerättiin talteen ja niitä inkuboitiin 1 X
30 105 solua/50 pl fuusioproteiinin kanssa 20 minuuttia • 4 eC:ssa, mitä seurasi FITC-konjugoitu vuohen anti-ihmis ··· .···. (h)lgG (25 pl/ml, Southern Biotechnology, Birmingham, AL).
" Kaikkiin näytteisiin lisättiin propidiumjodidia lopulli- i seen konsentraatioon 2 pg/ml. Virtaussytof luorometrinen *...· 35 analyysi tehtiin BD Facscanilla. Solujen positiivisen • · • · · ♦ · ♦ • · · ··· • ♦♦ » · 117508 24 avainnuksen jälkeen eteenpäin suuntautuvalla versus sivu-sironnalla, ja punanegatiivisuudella (propidiumjodidieksk-luusio), varmistettiin elinkykyisten solujen log vihreä-fluoresenssi· Vähintään 5 000 elinkykyistä solua analysoi-5 tiin positiivisten solujen ja MFl:n prosentuaalisen osuuden määrittämiseksi. MRl-värjäyksessä käytettiin FITC-kon-jugoitua RG7:ää, hiiren anti-rotta/hamsteri «"ketjun mab.
6.1.14. Biosynteettinen leimaus, immunosaostus, SDS-PAGE ja fluorografia 10 Thl:t pidettiin lepotilassa tai aktivoitiin liukene mattomaksi tehdyllä anti-CD3:lla 16 tuntia. Proteiinit lepotilassa olevista ja aktivoiduista Th:ista (20 X 106/ml) leimattiin 1 mCirllä [35S]-metioniini/kysteiiniä yhden tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kahdesti RPMI/10 % 15 FCS:llä ja solupelletti lyysattiin uuttopuskuriin, kuten ovat kuvanneet Noelle et ai., (1986) J. Immunol. 137: 1718 - 1726). Puhdistetut vasta-aineet tai fuusioproteii- f nit (1 - 10 pg) lisättiin 500 μΐ:aan lysaattia (5 X 106 so-luekvivalenttia) 4 °C:ssa 16 tuntia. Tämän ajan jälkeen 20 lysaatit siirrettiin koeputkiin, jotka sisälsivät 50 μΐ pakattua proteiini-A-Sepharosea. Pelletoitu proteiini-A-Sepharose suspendoitiin uudelleen ja putkia inkuboitiin |
j .1. 4 eC:ssa 1 tunti sekoittaen. Näytteet pestiin sitten 3 X
* 1 1 1 .··1, ankarien olosuhteiden pesupuskurilla. Pelletoitu proteii- , [·, 25 ni-A-Sepharose suspendoitiin uudelleen 30 pl:aan SDS-näy- * · · tepuskuria ja ajettiin 10-prosenttisella polyakryyli- ti amidigeelillä. Geelin ajon jälkeen geeli fiksoitiin ja • · · tehtiin fluorografia.
*·1 6.2. Tulokset 30 6.2.1. Monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutus B- ·.·.· solujen RNA-synteesin induktioon PMAct:eilla ! ϊ Niiden solun pintamolekyylien määrittämiseksi, jot- ,·)·, ka välittävät B-solusyklin alkamisen induktiota • · · I.I PMÄot:eilla, mab:t Th-membraaniproteiineille lisättiin PMAct • · "1 35 ja B-solujen viljelmiin. PMAct indusoi B-solujen RNA-syn- • · • · » * » · • · i • · • · · · 117508 25 teesiä kahdeksankertaisesti verrattuna PMReet:iin (kuvio la). Anti-LFA-1:n, anti-CD4:n, anti-ICAM-1:n lisääminen yksin tai yhdistelmänä ei inhiboinut B-solujen RNA-syntee-sin induktiota PMAct:illa.
5 6.2.2. CD40 inhiboi Th-indusoitua B-solusyklin al kamista, erilaistumista ja jakaantumista
Ihmisen järjestelmässä oli osoitettu, että anti-CD40-mab indusoi B-solujen jakaantumista (Clark ja Lane (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 97 - 127), antaen siten ym-10 märtää, että CD40 on tärkeä alkuunpaneva molekyyli B-soluille. Sen määrittämiseksi, osallistuiko CD40 B-solujen RNA-synteesin PMAct:ien aikaansaamaan induktioon, PMÄct- ja B-soluviljelmiin lisättiin ihmisen CD40:n solunulkopuolis-ten domeenien liukoinen fuusioproteiini ja ihmisen igGj 15 (CD40-Ig) Fc-domeeni. Thl:stä ja Th2:sta johdettu PMÄct val mistettiin ja sitä käytettiin stimuloimaan B-solujen RNA-synteesiä. CD40-Ig:n lisääminen viljelmään aiheutti B-so- i lujen Thl:stä ja Th2:sta saadun PMÄct:in indusoiman RNA-synteesin annoksesta riippuvaisen inhibition (kuvio Ib). Puo-20 let B-solun RNA-synteesin, jonka PMAct Thl:stä ja Th2:sta indusoi, inhibition maksimista, oli noin 5 pg/ml CD40Ig:a. CD7E-Ig fuusioproteiini (Damle ja Aruffo, (1991) . . Pro. Natl. Acad. Sei. USA 88: 6403 - 6407) oli ilman efek- • 1 1 **;,1 tiä, vaikka sitä käytettiin jopa 25 pg/ml. Sen selville * · **··1 25 ottamiseksi, inhiboiko CD40-Ig B-solujen aktivaaatiota T- • · 1 *·ϊ»1 riippumattomilla aktivaattoreilla, B-soluja viljeltiin LPS:n ja CD40-Ig:n läsnä ollessa. Toisena päivänä RNA-syn- ·· · • 1.· teesiä arvioitiin (kuvio le). CD40-Ig oli tehoton in- : hiboimaan LPS:n aiheuttamaa B-solujen aktivaatiota, kui- 30 tenkin se inhiboi B-solujen reaktion PMAct:eihin.
. .1. PMÄct:ien, IL4:n ja IL5:n läsnäollessa B-solut poly- /· • · » .···, klonaalisesti erilaistuivat tuottamaan Ig:a (Hodgkin et ai., (1990) J. Immunol. 145: 2025 - 2034; Noelle et ai., *·1.1 (1991) J. Immunol. 146: 1118 - 1124). Jotta voitaisiin · · · *...1 35 arvioida vaatimukset CD40-signaaliin tässä prosessissa, • · · • · · • · 1 • ·· • · 117508 26 CD40-lg:a lisättiin viljelmään alussa tai seuraavina kas- vatuspäivinä. CD40-Ig:n lisääminen viljelmän alussa (kuvio 2a) inhiboi yli 95 % polyklonaalisten igMrn ja IgG^n tuottamisen verrattuna kontrollitasoihin sen puuttuessa. Sitä 5 vastoin, CD40-Ig:n lisääminen viljelmän ensimmäisenä tai toisena päivänä osoitti vähän tai ei ollenkaan inhiboivaa efektiä IgM:n tai IgG^n tuotannossa. Nämä tiedot osoittivat, että 24 tunnin jälkeen signaalin anto CD40:n välityksellä ei ole enää oleellista B-solujen erilaistumiseen g 10 Ig:n eritykseen.
Tähänastiset tiedot osoittivat, että CD40 osallistui B-solujen aktivoimiseen PMÄctreillä. Tutkimuksia tehtiin, jotta varmsitettaisiin, että CD40 osallistui myös B-solujen aktivoimiseen intakteilla, elinkykyisillä Th:illa.
15 Thl aktivoitiin 16 tuntia liukenemattomalla anti-CD3:11a, kerättiin talteen ja säteilytettiin. Säteilytetty Thl viljeltiin B-solujen kanssa IL4:n läsnäollessa, ja B-solujen lisääntyminen määritettiin kolmantena viljelypäivänä.
IL4:n eksogeeninen lähde vaadittiin, jotta B-solut jakaan-20 tuisivat Thl:n kanssa, koska Thl ei tuota lL4:ää (Noelle et ai., (1989) J. Immunol. 143: 1807 - 1814). CD40-Ig inhiboi Th:n indusoiman B-solujen jakaantumisen annoksesta riip- . . puvaisella tavalla, samanlaisella kuin PMÄct reistä huomat- • · · ***/ tiin (kuvio 2b). Negatiivinen kontrolli CD7E-Ig ei osoit- • · *··** 25 tanut havaittavaa efektiä.
• · m *·ί·* 6.2.3. CD40-Ig havaitsi aktivoidun Th:n, mutta ei lepotilassa olevan Th:n ekspressoiman molekyylin ·· · » V Sen tutkimiseksi, ekspressoivatko aktivoidut Thl:t ϊ ί J CD40:tä sitovaa proteiinia, lepotilassa olevat ja aktivoi- 30 dut (16 tuntia) Thl:t värjättiin CD40-Ig:lla tai CD7E- ; ·*; Igrlla, jota seurasi FiTC-anti-HIgG. CD40-igrn sitoutumi- * » · .**·. nen arvioitiin virtaussytometrialla (kuvio 3). Thl:t, joi- ta aktivoitiin 16 tuntia anti-CD3:11a, mutta ei lepotilas- • · · *·*·' sa olevat Thl:t, värjäytyivät 56-prosenttisesti positiivi- !...» 35 sesti CD40-Ig:lla, mutta eivät CD7E-Ig kontrollilla. CD40- • * • · · * ♦ ♦ • · • · • ♦ ♦ ····.' • · 117508 27
Ig:n sitovan proteiinin tunnistamiseksi, Thl-proteiinit leimattiin biosynteettisesti [35S]-metioniinil-la/kysteiinillä ja proteiinit immunosaostettiin CD40-Ig:-llä tai CD7E-Ig:llä. Immunosaostetut proteiinit liuotet-5 tiin uudelleen SDS-PAGE:lla ja fluorografialla (kuvio 4). Huomattava vyöhyke, jonka arvioitu molekyylipaino oli 39 ; kD, immunosaostui annoksesta riippuvaisella tavalla 1 ja 10 pg:llä CD40:ää/näyte. Kontrolleina, anti-luokan I mab immunosaosti vyöhykkeet 55 kD:n kohdalle ja alhaisen mo-10 lekyylipainon omaavan vyöhykkeen, B2 mikroglobuliinin.
Mab:in poissaollessa ei näkynyt huomattavia vyöhykkeitä.
39 kD:n vyöhyke immunosaostui myös aktivoiduista Th:ista, jotka oli vektori leimattu 125I:llä, varmistaen, että 39 kD:n proteiini oli membraaniproteiini.
15 6.2.4. Monoklonaalinen vasta-aine MRl, spesifinen 39 kD:n Th-membraaniproteiinille, inhiboi PM^jin aikaansaamaa B-solujen RNA-synteesin induktiota
Aktivoiduissa, ja vertailun vuoksi lepotilassa olevissa Thrissa selektiivisesti ekspressoiduille antigeeneil-20 le spesifiset mab:it kehitettiin tunnistamaan Th-molekyylin (molekyylit), jotka olivat vastuussta Th:iden efektorifaa-siaktiivisuudesta. Yksi tällainen mab, MRl, tunnisti anti- ? . . geenin, joka ekspressoitui selektiivisesti aktivoiduissa '**.* Thl:ssä. Jotta tutkittaisiin, tunnistivatko MRl ja CD40-Ig *···* 25 saman molekyylin, suoritettiin virtaussytometria- ja esto- • · · *·ί·* kokeita. CD40-ig ja MRl värjäsivät noin 56 % ja vastaavas- ·»· ti 61 % aktivoiduista, mutta eivät lepotilassa olevista 'i ·· · • Th:ista (kuvio 5a). MRl, mutta ei toinen hamsterin anti-T-• · · i solu-mab, anti-a/B-TCR, esti aktivoitujen Thl:sien värjäy- 30 tymisen CD40lg:llä annoksesta riippuvaisella tavalla. Nämä • ·’· tulokset antavat olettaa, että CD40-Ig ja MRl tunnistivat ’’ • · ♦ ,···. päällekkäiset tai samat epitoopit 39 kD:n Th-proteiinista.
« · «
Jotta osoitettaisiin edelleen, että CD40-Ig ja MRl tunnis- • · · *·*·* tivat saman molekyylin, MRl reen sitoutuva antigeeni tun- 35 nistettiin proteiinien immunosaostuksella radioleimatuista • · · • f • · ♦ ····.· • ♦ 117508 28
Th-lysaateista. Sekä CD40-Ig että MR1 immunosaostivat 39 kD;n proteiinin (kuvio 5b). Lopulta, 39 kD:n proteiinin immunosaostus CD40-Ig:llä poisti MRl:n tunnistaman antigeenin aktivoitujen Th:iden radioleimatuista lysaateista, 5 tukien periaatetta, että MRl-antigeeni ja CD40:ää sitova
proteiini olivat identtiset. A
Toiminnalliset kokeet suoritettiin MRlrllä osoit- s; tamaan, neutraloiko tämä mab PMAct:ien ekspressoiman aktiivisuuden. PMÄct:eja ja B-soluja kasvatettiin yksin tai hams-10 terin mab:ien läsnä ollessa tai CD40-Ig:n läsnä ollessa.
Kaksi hamsterin mab:ia, anti-α/β TCR ja a-CD3, eivät inhiboineet lepotilassa olevien B-solujen aktivaatiota PMÄct:eilla. Sitä vastoin MRl tai CD40-Ig inhiboivat B-solujen aktivaation (kuvio 6).
15 6.3. Johtopäätökset
Tiedot osoittavat, että prominenttien Th pintamole-kyylien (LFA-1, CD4, ICAM-1, CD3, a, β, TCR) estäminen mab:eilla ei ehkäissyt aktivoidun Th:n kykyä indusoida B-solujen syklin alkamista. Sitä vastoin, CD40 sidospro-20 teiinille spesifinen CD40-Ig tai mab esti Th-riippuvaisen B-solujen aktivaation annoksesta riippuvalla tavalla. f i Edelleen, CD40 sidosproteiini identifioitiin 39 kD pro- -i . , teiiniksi, jota ekspressoituu selektiivisesti aktivoiduil- • · « la, mutta ei lepotilassa olevilla Th:n membraaneilla. Sekä « i *·1·1 25 CD40-Ig että 39 kD CD40 sidosproteiinille spesifinen mab *·!.1 esti B-solujen PMActreillä aiheutetun aktivaation.
• · · *...· Vaikka joukko membraaniproteiineja on vedetty esiin • · • 1,· Th-riippuvaisen B-solujen signaalinmuodostuksen yhteydessä, • : tässä esitetyt todisteet hylkäävät joidenkin molekyylien 30 myötävaikutuksen (LFA-1, CD4, CD3, α,β TCR, ICAM-1) ja • ·1· tuovat esiin CD40:n B-solureseptorina Th-solujen aikaan- « · · .1·1. saamalle sisäiselle signaalille. Tulokset osoittavat, että CD40-Ig ja CD40:ää sitovalle proteiinille spesifinen mab • · · *·1·1 inhiboi Th:ista riippuvaista B-solujen aktivaatiota.
• · · ^ • · m m ··« ··.'' « · 1 • · · * 1 · • · · • ·· • 1 : 29 117508
Ligandi CD40:lle on 39 kD:n proteiini, joka eks-pressoituu aktivoiduissa, mutta ei lepotilassa olevissa Th-soluissa. Biokemialliset tutkimukset antavat olettaa, että 39 kD:n proteiini on yksiketjuinen molekyyli, koska 5 pelkistävät aineet eivät vaikuttaneet elektroforeettiseen liikkumiseen. Tässä tutkimuksessa esitettyihin toiminnallisiin tutkimuksiin perustuen, sekä aktivoidut Thl:t että Th2:t ekspressoivat 39 kD:n CD40:ää sitovaa proteiinia.
Tämä on yhdenmukaista toiminnallisten tutkimusten kanssa, » 10 jotka osoittavat, että sekä Thl että Th2 indusoivat B-solu-syklin alkamista. Yrityksessä karakterisoida 39 kD:n proteiinia edelleen, CD-proteiineja MW-alueella 39 kD (CD 53, CD 27 ja CD 69) koodaava cDNA transfektoitiin lyhytaikaisesti COS-soluihin ja solut testattiin CD40-Ig:n sitomisen 15 suhteen. Yksikään transfektoiduista COS-soluista ei eks-pressoinut proteiineja, jotka sitoivat CD40-Ig:tä. Epäillään sen vuoksi, ettei 39 kD:n proteiini ole yksikään näistä CD-proteiineista.
Biokemiallinen perusta signaalitransduktiolle Th- ja 20 B-solujen välillä on ollut saavuttamaton. CD40:n tunnistaminen signaalia muuntavaksi molekyyliksi auttaja-T-so-luille kohdentaa huomion spesifisiin biokemiallisiin reit- • teihin, joiden tiedetään kytkeytyvän CD40-molekyyliin.
·♦· ♦ .***. CD40 on hermokasvutekijäreseptori (NGFR) -perheen jäsen « · · . .·. 25 sen ekstrasellulaarisella alueella sijaitsevien neljän • · · ,··1. runsaskysteiinisen alueen esiintymisen perusteella. Sig- • · naalin lähetykseen CD40:n välityksellä roabrin avulla on * · · *..I osoitettu (Uckun et ai., (1991) J. Biol. Chem. 266: • « « *·1 1 17478 - 17485) liittyvän tyrosiinikinaasien aktivaatio, 30 mikä johtaa inositolitrisfosfaatin lisääntyneeseen tuotan-toon ja vähintään neljän erillisen seriini/treoniinikinaa- • « 1 sin aktivaatioon. Perustuen tietoihin, joita on saatu sig- naalin lähetyksestä muiden NFG-reseptoriperheen jäsenten 1 .♦··. välityksellä, voidaan aavistaa, että aktivoitujen Th-solu- • · • · · ····' • a#'·· • · · • ♦ · ·♦···.
• · 117508 jen ja B-solujen välinen vuorovaikutus johtaa moniin samoista biokemiallisista prosesseista.
7. Esimerkki: CD40-lg:n sitoutuminen ihmisen T-so-lulinjoihin 5 Immunofluoresenssisitoutumistutkimuksia varten, CD40-Ig-fuusioproteiini konjugoitiin biotiiniin käyttäen biotiini-sukkinimidiä (Sigma). Virtaussytometria-analyysi tehtiin tow-step-merkkauksella käyttäen fykoerytriini-(PE) -streptavidiiniä (Bectin-Dickinson) Coulter Epics C 10 -välineen kanssa. Monien T-solulinjojen seulonnan tyypilliset tulokset on esitetty alla. Jurkat- ja HSB2-solulin-jojen havaittiin sitoutuvan spesifisesti, kun taas muut T-solulinjat, joihin kuuluivat CEM, HPBALL ja hiiren tymoo-ma, eivät sitoneet CD40-Ig-fuusioproteiinia (kuvio 7).
15 Tässä on viitattu useisiin julkaisuihin, jotka lii tetään täten tähän viitteiksi kokonaisuudessaan.
• · I · i * 1 · • · 1 · • 1 · • « • · • · · • ' • · · • · · • 1 · > , • · 1 • · • · • · · M I • 1 · • · • · 4 · Φ ··· 4 Φ 4 ' • · · 4 Φ Φ • · 4 • « 4
• « V
• · • 1 · • · -f • · Φ φ φ Φ * · • 4 Φ • 4 • · • · 1 « · * · · ' • · · • · · ♦ • · 1 * ·

Claims (8)

31 117508
1. Menetelmä olennaisesti puhdistetun, soluja si-sältamättömän ligandin valmistamiseksi, joka ligandi spe-5 sifisesti sitoutuu CD40CR-reseptoriin, 39 kDa:n T-solu-proteiiniin, joka sitoutuu CD40-B-soluantigeeniin ja stimuloi B-solusyklin alkamista, jakautumista ja erilaistumista, jolloin mainittu ligandi: a) käsittää ainakin osan CD40 proteiinin solunul-10 kopuolisesta domeenista, jolla on kuviossa 8A aminohapoilla 1-193 esitetty sekvenssi, kiinnittyneenä toiseen molekyyliin, jolloin mainittu toinen molekyyli on valittu peptideistä, proteiineista, hiilihydraateista ja lipideistä koostuvasta ryhmästä ja jolloin fuusiokohdassa olevalla 15 solunulkopuolisella domeenilla on aminohapposekvenssi Gly-Pro-Gln-Asp-Pro-Glu, ja jolloin mainittu ligandi b) kykenee sitoutumaan mainittuun CD40CR-proteii-niin aktivoidussa auttaja-T-solussa ja inhiboimaan aktivoidun T-solun vaikutuksesta tapahtuvaa lepäävän B-solun 20 aktivoitumista, tunnettu siitä, että käytetään rekombinantti-DNA-, tekniikkaa. t
: 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · · tunnettu siitä, että toinen molekyyli on vähintään : 25 osa immunoglobuliinimolekyylistä.
;***; 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, • « · tunnettu siitä, että osa immunoglobuliinif ragmen- Φ · tista käsittää Fc-fragmentin. Φ · ·
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, . 30 tunnettu siitä, että Fc-fragmentti käsittää sara- • · · *···' na-, CH2- ja CH3-alueen. tt ·* φ φ
*··** 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, φ ;*:*· tunnettu siitä, että ligandi on CD40-Ig, joka on • · tuotettu pCD40-Ig-plasmidilla, joka on kuvattu kuviossa *·’ 35 8B. ♦ * . • Φ · • # · • · Φ · Φ φ · • · · φ φ i * 117508 32
6. Menetelmä olennaisesti puhdistetun, soluja sisältämättömän CD40/immunoglobuliinifuusioproteiinin valmistamiseksi, joka fuusioproteiini spesifisesti sitoutuu hiiren CD4 OCR-reseptoriin, 39 kDa:n hiiren T-soluprote- 5 iiniin, joka sitoutuu CD40-B-soluantigeeniin ja stimuloi B-solusyklin alkamista, jakautumista ja erilaistumista, jolloin mainittu fuusioproteiini käsittää ainakin osan CD40-proteiinin solunulkopuolisesta domeenista, jolla on kuviossa 8A aminohapoilla 1-193 esitetty sekvenssi, ja 10 jossa fuusiokohdassa olevalla solunulkopuolisella do- meenilla on aminohapposekvenssi Gly-Pro-Gln-Asp-Pro-Glu, tunnettu siitä, että käytetään rekombinantti-DNA- ? tekniikkaa.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että fuusioproteiini erityisen kilpailukykyisesti inhiboi CD40-proteiinin sitoutumista hiiren CD4OCR-reseptoriin. 1
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioproteiini erityisen 20 kilpailukykyisesti inhiboi hybridoomalla, joka on talle- CC tettu American Type Culture Collection-talletus-laitokseen numerolla ATCC HB 11048, tuotetun monoklonaalisen vasta- - • · I • · · ϊ*ί I aineen sitoutumista kohdeantigeeniinsä. * · · • · • * • · * • · * ··· ··· ··· ' Φ # . · · F • · • Φ Φ • Φ « • · · • · - · • · • * · ♦·· Φ φ Φ ... Φ * Φ • · · * · · • • · * * * # • # • # · . -* · • * 1 1 · ., • · • · • · · • Φ · Φ Φ # • Φ Φ • · Φ · • · · Φ ·· • · 117508 33
FI930605A 1992-02-14 1993-02-11 Menetelmä CD40CR-reseptoriin sitoutuvan ligandin valmistamiseksi FI117508B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83579992A 1992-02-14 1992-02-14
US83579992 1992-02-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI930605A0 FI930605A0 (fi) 1993-02-11
FI930605A FI930605A (fi) 1993-08-15
FI117508B true FI117508B (fi) 2006-11-15

Family

ID=25270498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI930605A FI117508B (fi) 1992-02-14 1993-02-11 Menetelmä CD40CR-reseptoriin sitoutuvan ligandin valmistamiseksi

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6376459B1 (fi)
EP (2) EP0555880B1 (fi)
JP (2) JP4148537B2 (fi)
KR (1) KR100301146B1 (fi)
AT (1) ATE273998T1 (fi)
AU (2) AU3298893A (fi)
CA (1) CA2089229C (fi)
DE (1) DE69333591T2 (fi)
DK (1) DK0555880T3 (fi)
ES (1) ES2225820T3 (fi)
FI (1) FI117508B (fi)
IL (1) IL104684A0 (fi)
NO (1) NO316024B1 (fi)
NZ (1) NZ245898A (fi)
PT (1) PT555880E (fi)
ZA (1) ZA931013B (fi)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7405270B2 (en) 1991-10-25 2008-07-29 Immunex Corporation CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation
US5962406A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5961974A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Monoclonal antibodies to CD40 ligand, pharmaceutical composition comprising the same and hybridomas producing the same
DK0822199T3 (da) * 1991-10-25 2004-12-27 Amgen Inc N-terminalt monopegylerede polypeptider og fremgangsmåder til fremstilling heraf
US5981724A (en) 1991-10-25 1999-11-09 Immunex Corporation DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40
US7070777B1 (en) * 1991-11-15 2006-07-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
CA2089229C (en) 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) * 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
AU5098493A (en) * 1992-08-21 1994-03-15 Schering Corporation Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
US5869049A (en) * 1993-09-02 1999-02-09 Trustees Of Dartmouth College Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists
KR100398819B1 (ko) 1993-09-02 2004-02-05 트러스티스 오브 다트마우스 칼리지 gp39길항제를포함하는약제조성물
CN1137726C (zh) * 1993-09-02 2004-02-11 达特茅斯学院理事 延长体液免疫抑制的方法
ATE188487T1 (de) * 1993-09-02 2000-01-15 Dartmouth College Anti-gp39 antikoerper und deren verwendungen
AU1059095A (en) * 1993-11-24 1995-06-13 Australian National University, The Treatment of viral disease with cd40l peptide
US5683693A (en) * 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
MX9605088A (es) 1994-04-28 1997-08-30 Boehringer Ingelheim Pharma Metodos para proliferar y diferenciar celulas b y sus usos.
US5876950A (en) * 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US6372208B1 (en) 1999-09-28 2002-04-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant virus
US6251957B1 (en) 1995-02-24 2001-06-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant virus
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
US5872154A (en) * 1995-02-24 1999-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus
WO1996028568A1 (en) 1995-03-13 1996-09-19 The Regents Of The University Of Michigan Cd40 binding compositions and methods of using same
US7429646B1 (en) 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US7427492B1 (en) 1995-06-05 2008-09-23 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human tumor necrosis factor receptor-like2
US7175847B1 (en) 1995-06-07 2007-02-13 Biogen Idec Inc. Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4
US5833987A (en) * 1995-06-07 1998-11-10 Trustees Of Dartmouth College Treatment of T cell mediated autoimmune disorders
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US7153508B2 (en) 1995-06-07 2006-12-26 Biogen Idec Inc. Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4
CA2224812A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Biogen, Inc. Crystals of fragments of cd40 ligand and their use
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
IL125928A (en) * 1996-03-20 2002-11-10 Bristol Myers Squibb Co The use of soluble ligands that react with CTLA4, B7, CD40, gp39 and / or CD28 for the preparation of pharmaceutical preparations
EA004401B1 (ru) * 1996-07-08 2004-04-29 Дзе Трастиз Оф Колумбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк Терапевтическое применение т-вам(cd40l)-технологии для лечения заболеваний с участием клеток гладкой мускулатуры
JP2002507967A (ja) * 1997-06-20 2002-03-12 パンゲネチックス・ベー・ファウ 疾病治療のための抗ｃｄ４０ｌイムノトキシン
CA2223225A1 (en) * 1997-11-28 1999-05-28 Canadian Red Cross Society Method for inhibiting in vivo immune response
CN1173735C (zh) * 1998-04-03 2004-11-03 达特茅斯学院理事 抗-gp39抗体在狼疮及相关肾病的治疗和/或逆转中的应用
IL130989A0 (en) * 1999-07-20 2001-01-28 Compugen Ltd Variants of alternative splicing
AU2001251612A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Roles of jak/stat family members in tolerance induction
AU2001296507A1 (en) 2000-10-02 2002-04-15 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20020159996A1 (en) 2001-01-31 2002-10-31 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20040058445A1 (en) * 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
AU2003206045A1 (en) * 2002-02-22 2003-09-09 Compugen Ltd. CD40 splice variants, method of detection thereof, compositions comprising said variant(s) or nucleic acid encoding the same and use thereof
US20080199471A1 (en) * 2002-03-01 2008-08-21 Bernett Matthew J Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
US20030219436A1 (en) * 2002-03-15 2003-11-27 Ledbetter Jeffrey A. Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein
JP2005535572A (ja) 2002-04-12 2005-11-24 メディミューン，インコーポレーテッド 組換え抗インターロイキン−９抗体
US7425618B2 (en) 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
EP2316487B1 (en) 2003-04-11 2014-06-11 MedImmune, LLC Recombinant IL-9 antibodies & uses thereof
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
EP1670492A4 (en) 2003-09-29 2009-07-08 Warren Pharmaceuticals Inc FABRIC PROTECTION CYTOKINES FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF SEPTICEMIA AND THE FORMATION OF ADHESIONS
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
US7351739B2 (en) 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
KR20070047327A (ko) 2004-07-26 2007-05-04 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 항-ｃｄ154 항체
US20060121042A1 (en) 2004-10-27 2006-06-08 Medimmune, Inc. Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
US20060148080A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Paul Diamond Methods for supporting and producing human cells and tissues in non-human mammal hosts
SI1912675T1 (sl) * 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
CA2654317A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
US8697846B2 (en) * 2007-08-15 2014-04-15 Emory University Methods of making monoclonal antibodies using fusion-peptide epitope adoptive transfer (F-PEAT) technology
PT2132228E (pt) 2008-04-11 2011-10-11 Emergent Product Dev Seattle Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional
KR101721707B1 (ko) 2008-11-28 2017-03-30 에모리 유니버시티 감염 및 종양 치료 방법
MX354243B (es) 2011-04-21 2018-02-20 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos anticuerpos que antagonizan cd40.
WO2015134988A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
MA41459A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Als Therapy Development Inst Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
EP3592839B1 (en) * 2017-03-07 2023-07-05 Universität Basel Mr1 restricted t cell receptors for cancer immunotherapy
JP2020521745A (ja) 2017-05-24 2020-07-27 エイエルエス・セラピー・デベロップメント・インスティテュートＡＬＳ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 治療用抗ｃｄ４０リガンド抗体
TW201900213A (zh) * 2017-05-27 2019-01-01 美商免疫醫療公司 免疫球蛋白ａ陽性細胞的調節
WO2024211211A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving transplant survival using il-2 receptor gamma chain antibodies

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5672347A (en) * 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US5247069A (en) * 1986-06-13 1993-09-21 Oncogen Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
DE3815472A1 (de) * 1988-05-06 1989-11-16 Centre Regional De Transfusion Monoklonaler antikoerper und seine verwendung
DE122007000078I2 (de) * 1991-06-27 2011-01-13 Bristol Myers Squibb Co CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
CA2089229C (en) 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5833987A (en) * 1995-06-07 1998-11-10 Trustees Of Dartmouth College Treatment of T cell mediated autoimmune disorders
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
TR199902191T2 (xx) 1997-01-10 1999-12-21 Biogen, Inc. Anti-CD40L bile�ikleri ile lupus nefritis tedavisi
AU5623398A (en) 1997-03-07 1998-09-22 Biogen, Inc. Methods of therapeutic administration of anti-cd40l compounds
WO1999000143A1 (en) 1997-06-27 1999-01-07 Biogen, Inc. Cd154 blockade therapy for autoimmune diseases

Also Published As

Publication number Publication date
ES2225820T3 (es) 2005-03-16
PT555880E (pt) 2004-12-31
AU701306B2 (en) 1999-01-28
EP0555880A2 (en) 1993-08-18
EP1489099A2 (en) 2004-12-22
US6376459B1 (en) 2002-04-23
KR100301146B1 (ko) 2001-10-22
US7445781B2 (en) 2008-11-04
JP4148537B2 (ja) 2008-09-10
ZA931013B (en) 1993-09-20
AU7198096A (en) 1997-02-06
JP3984944B2 (ja) 2007-10-03
ATE273998T1 (de) 2004-09-15
JP2004115527A (ja) 2004-04-15
DK0555880T3 (da) 2004-12-06
DE69333591T2 (de) 2005-09-01
MX9300768A (es) 1997-09-30
EP1489099A3 (en) 2008-02-20
US20060008460A1 (en) 2006-01-12
CA2089229C (en) 2010-04-13
NO930521D0 (no) 1993-02-12
NO930521L (no) 1993-08-16
FI930605A0 (fi) 1993-02-11
AU3298893A (en) 1993-08-19
IL104684A0 (en) 1993-06-10
EP0555880A3 (en) 1994-05-11
NZ245898A (en) 1995-04-27
NO316024B1 (no) 2003-12-01
JPH06220096A (ja) 1994-08-09
DE69333591D1 (de) 2004-09-23
FI930605A (fi) 1993-08-15
EP0555880B1 (en) 2004-08-18
KR930017919A (ko) 1993-09-20
CA2089229A1 (en) 1993-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI117508B (fi) Menetelmä CD40CR-reseptoriin sitoutuvan ligandin valmistamiseksi
US10934353B2 (en) Single agent anti-PD-L1 and PD-L2 dual binding antibodies and methods of use
KR100895749B1 (ko) Ｎｋｇ２ｄ의 조절
EP0842948B1 (en) ANTIFas LIGAND ANTIBODIES AND ASSAY METHOD BY USING THE SAME
US5948893A (en) Murine hybridoma and antibody binding to CD28 receptor secreted by the hybridoma and method of using the antibody
BRPI0620141B1 (pt) Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, inibidor para a atividade de uma célula produtora de interferon, reagente para detecção de célula produtora de interferon, método de detecção de célula produtora de interferon, método in vitro de inibição da atividade de uma célula produtora de interferon, hibridoma, método de produção de um anticorpo monoclonal, polinucleotídeo isolado e vetor
US6472510B1 (en) CD40 receptor ligands
AU734853B2 (en) Methods of prolonged suppression of humoral immunity
JPH07242566A (ja) 免疫抑制剤
AU743824B2 (en) Use of anti-gp39 antibodies for treatment and/or reversal of lupus and associated kidney disease
Dehghanpisheh et al. Retrovirally induced mouse anti‐TCR monoclonals can synergize the in vitro proliferative T cell response to bacterial superantigens
US20020058037A1 (en) Use of anti-gp-39 antibodies for treatment and/or reversal of lupus and lupus associated kidney disease
Morita et al. Arsonate-specific murine T cell clones. III. Correlation between clonotype expression and fine specificity for analogs of L-tyrosine-p-azobenzenearsonate.
MXPA93000768A (en) Cd40cr receptor and ligands therefor
del Guercio et al. Inhibitory activity of interleukin B on the suppressor T cell hybrid T2D4.
Arendt Physical and functional interactions of the hematopoietic cell-specific protein-tyrosine phosphatase CD45

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 117508

Country of ref document: FI

MA Patent expired