NO316024B1 - Fusjonsprotein og antistoff som spesifikt binder til CD40CR - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en mot-reseptor betegnet CD40CR for CD40 B-celleantigenet og løselige ligander for denne reseptor inklusive fusjonsmolekyler som består av minst en del av CD40 protein. Den er i det minste delvis basert på oppdagelsen at et løselig CD40/immunglobulin. fusjonsprotein var istand til å hemme hjelpe-T-celle formidlet B-celle aktivering ved å binde til en ny 39kD proteinreseptor på hjelpe-T-cellemembraner. Den foreliggende oppfinnelsen omfatter en vesentlig renset CD40CR reseptor, løselig ligander for CD40CR, inklusive antistoffer såvel som fusjonsmolekyler som består av i det minste en del av CD40 protein; og fremgangsmåter for å kontrollere B-celleaktivering, hvilket kan være spesielt anvendbart ved behandling av allergi eller autoimmun sykdom.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et fusjonsprotein og antistoff som spesifikt binder til CD40CR-reseptoren for CD40 B-celleantigen Det er i det minste delvis basert på oppdagelsen at et løselig CD40/immunoglobuhn fusjonsprotein var i stand til å hemme hjelper T-celle formidlet B-celleaktivering ved binding til en ny 39 kD proteinreseptor på hjelper T-celle membraner Den foreliggende oppfinnelse omfatter et i det vesentlige renset cellefritt fusjonsprotein som består av i det minste en del av CD40-protem, og antistoffer eller fragment derav som spesifikt binder til mus-CD40CR, et 39 kD mus-T-celleprotein som binder til CD40 B-celleantigenet

Studier av Mitchison, Benacerraf og Raff antydet først at fysisk vekselvirkning mellom Th og B-celler var vesentlig i utviklingen av humorale immunreaksjoner Senere studier underbygget at Tn dannet fysiske konjugater med klasse II hovedvevsforlikhghetskompleks (MHC) forenlige, antigen-presenter-ende B-celler (Vitetta et al, (1987) Immunol Rev 99 193-239) og at det var B-cellene i disse konjugatene som svarte på Tn (Bartlett et al, (1989) J Immuno 143 1745-1754) Med oppdagelsen at Tn-avledede lymfokiner viste kraftig vekst og differensienngseffekter overfor B-celler, ble det foreslått at løselig(e) faktor(er) frigitt i nærheten av aktivert Th formidlet aktiveringen av den reagerende B-celle Imidlertid viste ingen av de molekylært klonede lymfokmene, alene eller i kombinasjon, evne til å stimulere B-syklusinngang Til forskjell fra løselige faktorer, stimulerte plasmamembranfraksjoner fra aktiverte Th B-cellesyklusinngang (Hodgkm etal, (1990) J Immunol 145 2025-2043. Noelle et al . (1991) J Immunol 146 1118-1124) Studier som benyttet rensete plasmamembranfraksjoner fra aktivert Th antydet at et protein som var uttrykt på membranen av aktivert Th var ansvarlig for igangsettingen av humoral immunitet (Noelle et al,

(1991) J Immunol 146 1118-1124, Bartlett etal, (1990) J Immunol 145 3956-3962)

Rensede membraner fra aktivert Th (PM^<ct>) har vært benyttet for å undersøke opphavet til denne effektorfunksjon (Hodgkm et al (1990) J Immunol 145 2025-2034, Noelle etal, (1991) J Immunol 146 1118-1124) PM<Act>fra aktivert Th, men ikke-hvilende Th (PM<rest>) uttrykte en aktivitet som stimulerte B-celle syklusinngang på en antigen, ikke-spesifikk, klasse II ikke-begrenset måte I tillegg ble det vist at aktiviteten som var uttrykt av PM^<ct> krever 4 - 6 timer for aktivenng, de novo RNA-syntese og var av natur lik protein (Bartlett et al, (1990) J Immunol 145 3956-3962)

Den foreliggende oppfinnelse vedrører løselige ligander for CD40CR-reseptoren, inklusive fusjonsproteiner som omfatter minst en del av CD40-protein Den er i det minste delvis basert på oppdagelsen at et løselig CD40/- immunglobulinfusjonsprotein var i stand til å hemme hjelpe-T-celle-formidlet B-celleaktivenng ved å binde til et nytt 39 kD reseptorprotein (betegnet "CD40CR" for CD40 mot-reseptor) på hjelpe-T-cellemembran, og på oppdagelsen at et monoklonalt antistoff betegnet MR1, rettet mot denne 39 kD reseptor, var i stand til å hemme T-celle formidlet aktivering av B-celler

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vesentlig renset cellefritt fusjonsprotein som spesifikt binder til CD40CR, som består av minst en del av CD40-protein inklusive antistoffer

B-celleaktivering hos en person kan bh hemmet ved å la hjelpe-T-celler fra personen komme i kontakt med effektive mengder av en løselig ligand for CD40CR Slik hemming av B-celleaktivering kan være spesielt nyttig i behandlingen av allergi eller autoimmun sykdom

En fordel med foreliggende oppfinnelse er at den tillater å gripe inn i et område av immunresponsen som ikke er antigenspesifikt Mange foreliggende behandlinger for allergi omfatter desensitivisenng overfor spesielle antigener, og krever at hver pasient kan undersøkes for å identifisere antigener som er forbundet med sensitivitet Som en praktisk erkjennelse, er utstrakt analyse av en pasients svar overfor alle mulige allergener ganske umulig Videre, i de fleste autoimmunsykdommer er det fremkallende antigen vanligvis ukjent eller endog irrelevant for sykdomsprosessen Den foreliggende oppfinnelse, som vedrører antigen ikke-spesifikk CD40/CD40CR-reaksjon, forbigår behovet for å karakterisere antigenet som er forbundet med allergi eller autoimmunitet Derfor kan den foreliggende oppfinnelse bh benyttet med spesiell fordel i behandlingen av allergiske tilstander hvor immunogene ikke er kjent eller har multiple bestanddeler, f eks i høysnue eller i procamamid forårsaket lupus Den kan også være nyttig i akutte behandling av immunaktivenng, f eks i behandling av anafylaksis

Forkortelser

Beskrivelse av figurene

Figur 1 Virkning av monoklonale antistoffer og CD40-lg på PM<A>c<t >stimulert B-celle RNA-syntese

Panel A Hvilende B-celler ble dyrket med PMrest eller PMAct fra jhl 25 //g/ml anti-CD4, anti-LFA-1 eller anti-ICAM-1 eller en kombinasjon av hver av disse (hver i 25 //g/ml) ble tilsatt brønner som inneholdt PM<Act>, og B-celle RNA-syntese ble målt ved inkorporering av [^H]-undin B-celle RNA-syntese ble målt fra 42 til 48 timer etter-kulturen Resultatene som er vist er de aritmetnske gjennomsnitt av tnplikate kulturer +/- s d , og er representative for 5 eksperimenter

Panel B Hvilende B-celler ble dyrket med PM<Ac*> fra Tn1 (•, <A>) eller Tn2 ;(□) Til Tn1-PM<Act> inneholdende kulturer (•/), ble økende mengder av CD40-lg (<A>) eller kontrollprotein CD7E-lg (•) tilsatt Til Tn2-PM<Act> inneholdende kultur (□), ;ble økende mengder CD40-lg tilsatt B-celle RNA-syntese ble målt fra 42 til 48 timer etter kulturen Resultatene som er vist er de antmetnske gjennomsnitt av tnplikate kulturer +/- s d , og er representative for 3 eksperimenter ;Panel C Hvilende B-celler ble dyrket med LPS (50 //g/ml) eller PM<Act> Til kulturene, ble CD40-lg (25 //g/ml, skravert) eller CD7E-lg (25 //g/ml, helfarget) tilsatt RNA-syntese ble bestemt som beskrevet i panel A Resultatene ble presentert som de antmetnske gjennomsnitt av tnplikate kulturer +/-s d , og er representative for 3 eksperimenter ;Figur 2 CD40-lg hemmet B-celle differensienng og vekst ;Panel A Hvilende B-celler ble dyrket med PM<Act>, rlL4 (10 ng/ml) og rlL5 (5 ng/ml) Enten ved starten av kulturen, eller på dagene 1, 2 eller 3 etter start-kulturen, ble CD40-lg eller CD7E-lg (25 //g/ml) tilsatt På dag seks av kulturen, ble SN fra individuelle brønner høstet og kvantitet for IgM(B) og IgG-j (•) ved bruk av anti-isotype spesifikke ELISA, som beskrevet i (Noelle et al, (1991) J Immunol 146 1118-1124) I nærvær av PM<Act>, var IL4 og IL5, (i fravær av tilsatt CD40-lg) konsentrasjonene av IgM og IgG^ henholdsvis 4,6//g/ml og 126 ng/ml Kulturene som mottok CD7E-lg (25 //g/ml) på dag 0 laget henholdsvis 2,4 //g/ml og 89 ng/ml og IgM og IgG-j I fraværet av IL4 og IL5, ble ikke noe IgM eller lgG-| påvist Resultatene er representative for 3 slike eksperimenter ;Panel B Tn1 ble hvilt eller aktivert med anti-CD3 116 timer, bestrålt og dyrket (1x10<4>/brønn) med hvilende B-celler (4x10<4>/kulturer) i nærvær av IL4 (10 ng/ml) Mellom 0 og 25 //g/ml av CD40-lg (<A>) eller CD7E-lg (•) ble tilsatt til kulturene Fra 66 - 72 timer etter-kulturen, ble brønnene pulsmerket med et 1,0 //Ci [<3 >H]-tymidin og høstet Den prikkete linjen viser svaret til B-celler overfor hvilende T n Resultatene som er vist er de antmetnske tnplikate kulturer +/- s d , og er representativt for to slike eksperimenter ;Figur 3 CD40-lg påviste et molekyl som var uttrykt på aktiverte, men ikke hvilende Tn Hvilende og aktiverte Tn ble høstet og inkubert med fusjonsproteiner i 20 minutter ved 4°C, etterfulgt av FITC-konjugert geite anti-hlgG (25 //g/ml) Prosent positive celler og MFI ble bestemt ved analyse av minst 5000 celle/prøver Resultatene er representative for 6 slike eksperimenter CD40-lg binding er vist med en utfylt profil Figur 4 CD40-lg immunpresipitert 39 kD protein fra lysat av aktiverte Tn1 T n1 ble hvilt eller aktivert med uløseliggjort anti-CD3 116 timer [<35>s]-merkete proteiner fra hvilende eller aktiverende Tn ble immunpresipitert med rensede antistoffer eller fusjonsproteiner (1 -10 //) Gelprofilen er representativ for 3 slike eksperimenter Figur 5 Et monoklonalt antistoff (mab), spesifikt for det stimulerte 39 kd Tn membranproteinet, hemmet induksjon av PM<Act> stimulert B-celler RNA-syntese Hvilende B-celler og PM<Act> ble dyrket med 10 //g/ml hver av anti-a/(it anti-CD3, CD40-lg eller MR1 RNA-syntese ble bestemt som beskrevet i figur 1 Resultatene som er vist er de aritmetiske gjennomsnitt og tnplikate kulturer +/- s d , og er representative for 3 slike eksperimenter Figur 6 MR1 og CD40-lg gjenkjente det samme molekylet som var uttrykt på aktiverte Th Panel A aktiverte Th ble farget fluorescert med MR1 eller kontroll-lg For å vurdere hvis CD40-lg og MR1 konkurrerte for binding av aktiverte Th, ble graderte konsentrasjoner av MR1 eller kontroll hamster-lg (anti-a/li TCR) tilsatt sammen med anti-CD40 (20 //g/ml) Etter inkubasjon i 20 minutter ved 4°C, ble prøvene vasket, og inkubert med FITC-konjugerte, mab anti-humant IgG-j Resultatene er representative for 3 slike eksperimenter Panel B Proteiner fra [<35>s]-metionin-merket, aktiverte Th ble immunpresipitert med MR1 (10 //g/prøve) eller CD40-lg (10 //g/prøve) og analysert ved hjelp av PAGE og fluorografi Resultatene som er presentert er representative for 2 slike eksperimenter Figur 7 Binding av CD40-lg til humane cellelinjer En rekke humane T-cellelinjer ble reagert med biotin-merket CD40-lg, og binding vurdert ved hjelp av flow cytometri Figur 8 Panel A Nukleotidsekvens til CD40-cDNA fra Stamenkovic et al, ;(1989) EMBO J 8 1403-1410 Transmembranområdet er understreket ;Panel B skjematisk tegning av et plasmid som kan benyttes for å uttrykke CD40-lg Aminosyresekvensene på fusjonsstedet til A CD40 er vist under den diagrammatiske delen av CD40 ;Den foreliggende oppfinnelse omfatter et vesentlig renset cellefritt fusjonsprotein som spesifikt binder til CD40CR reseptor, inklusive antistoffer som fusjonsmolekyler som består av CD40 ;Med formål å gi klarhet i beskrivelsen, og ikke med tanke på begrensning, er den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen delt inn i følgende underkapitler ;(i) ligander som binder CD40CR, ;(n) fremgangsmåter benyttet for å karakterisere CD40CR, ;(in) fremstilling av et renset CD40CR, ;(tv) anvendelser av ligander som binder til CD40CR, ;og ;(v) anvendelser av CD40CR ;(i) Ligander som binder til CD40CR ;Den foreliggende oppfinnelse omfatter løselige ligander som fusjonsproteiner og antistoff for CD40CR, inklusive (i) fusjonsmolekyler som består av minst en del av (u) antistoffer eller antistoff-fragmenter ;Betegnelsen "løselig", som benyttet hen, viser at ligandene i oppfinnelsen ikke er permanent bundet til en celleplasmamembran Løselige ligander i oppfinnelsen kan imidlertid, bli bundet til ikke-cellulært fast underlag, inklusive et lipid, protein eller karbohydratmolekyl, en kule, en vesikkel, en magnetisk partikkel, en fiber, osv eller kan innebygges i et implantat eller vesikkel ;Evnen til en slik ligand til å binde til CD40CR kan bekreftes ved å vise at liganden binder til det samme proteinet som CD40-lg (infra) eller MR1 ( infra) ;Ligandene i oppfinnelsen kan omfattes av farmasøytiske blandinger sammen med en passende bærer ;Fusjonsmolekyler ;Den foreliggende oppfinnelse omfatter løselige fusjonsproteinmolekyler som er ligander for CD40CR I ett aspekt av oppfinnelsen omfattes et vesentlig renset cellefritt fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det spesifikt binder til CD40CR, et 39 kD T-celleprotein som binder til CD40 B-celleantigen og stimulerer B-cellesyklusstart, proliferasjon og differensienng, nevnte fusjonsprotein ;(a) omfatter i det minste en ekstracellulær del av CD40-protein som har en sekvens som angitt i Fig 8A, knyttet til et andre molekyl hvor det nevnte ;andre molekylet er valgt fra gruppen bestående av peptider, proteiner, karbohydrater og lipider, og hvor nevnte andre molekyl er bundet til nevnte ;del på et sete som har aminosyresekvensen Gly-Pro-Gln-Asp, og ;(b) er i stand til å binde nevnte CD40CR-protein på en aktivert hjelpe-T-celle og inhibere aktivenngen av en hvilende B-celle av den aktiverte T-cellen ;Slike fusjonsmolekyler består av minst en del av CD40-protein bundet til et annet molekyl Delen av CD40 mangler fortrinnsvis CD40-transmembrane område En del av CD40-protein som kan benyttes ifølge oppfinnelsen defineres som enhver del som er i stand til å binde CD40CR, f eks en slik del kan bli vist å binde til samme proteinet som MR1 eller CD40-lg ;Andre molekyler som kan benyttes omfatter peptider og proteiner, lipider og karbohydrater, og, i foretrukne utførelsesformer i oppfinnelsen, kan være et immunglobulinmolekyl, eller en del av dette, (slik som et Fv, Fab, F(ab')2 eller Fab' fragment) eller CD8 eller et annet adhesjonsmolekyl slik som B7 Det andre molekylet kan stamme fra enten en ikke-human eller en human kilde eller kan være kimær Det andre molekylet kan også være et enzym, toksin, vekstfaktor, lymfokin, anti-vekstforbindelse, alkylerende forbindelse, antimetabolitt, antibiotika, vinca alkaloid, platinum koordinert kompleks, radioisotop eller en fluorescerende forbindelse ;Fusjonsmolekylene i oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av kjemisyntese eller fortrinnsvis, ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker F eks kan en nuklein-sekvens som koder for minst en del av CD40-protein kombineres med en nukleinsyresekvens som koder for et annet molekyl i en passende ekspresjonsvektor, og så uttrykkes i et prokaryot eller, fortrinnsvis eukaryot fusjonsprotein, slik som gjær baculovirus eller pattedyr ekspresjons-system, inklusive transgene dyr ;Alternativt, kan minst en del av CD40-proteinet uttrykkes ved bruk av rekombinante DNA-teknikker og kan så kjemisk konjugeres til et annet molekyl ;Fusjonsmolekylet som omfatter CD40 kan renses fra preprative blandinger ved bruk av elektroforetiske teknikker eller affinitetskromatografi ved bruk av ligander som binder til enten CD40 eller til det andre molekylet Ligander som binder til CD40 omfatter, men er ikke begrenset til, anti-CD40 antistoffer slik som G28-5, som fremstilt ved hjelp av hybndom, som har registreringsnummer HB9110 og deponert i American Type Culture Collection, og CD40CR, beskrevet mer fullstendig i seksjonene (n) og (ni) infra Hvis det andre molekylet er et immunglobulin, eller globulinfragment, kan en affmitetskolonne som består av anti-immunglobulin antistoff benyttes, hvis det andre molekylet omfatter et Fc-fragment, kan en protein A kolonne benyttes ;Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, kan en del av CD40 fremstilles ved bruk av en nukleinsyresekvens som koder for et CD40-protein som er forkortet oppstrøms fra transmembranområdet En slik nukleinsyresekvens kan fremstilles ved å spalte et plasmid som inneholder et cDNA som koder for CD40-antigen, slik som beskrevet i Stamenkovic et al, (1989), EMBO J 8 1403-1410, med Pstl (P) og Sau 3A (S3) restnksjonsenzymer Det resulterende P/S3 fragment kan subklones i det samme plasmidet spaltet med P og Barn Hl (B), for å fremstille et forkortet CD40-gen (se figur 8A) ;I spesielt, ikke-begrensende, utførelsesformer av oppfinnelsen, kan en ekspresjonsvektor som benyttes for å fremstille ligander som inneholder minst en del av CD40 så vel som immunglobulinsekvens omfatte fortrinnsvis en virus-basert replikasjons-start, en bakteriell rephkasjons-start, en bakteriell seleksjonsmarkør, og eukaryot promoter- og "enhancer" sekvenser adskilt fra DNA-sekvensene som koder for et immunglobulin konstant område ved hjelp av restriksjons endonukleaseseter som tillater subkloning av DNA sekvensene som koder for minst en del av CD40, etterfulgt av en polyadenylenng-signalsekvens (se figur 8B) ;I en spesiell utførelsesform ved oppfinnelsen, kan det forkortede CD40-genet bli subklonet i et immunglobulin fusjonsplasmid, slik som beskrevet i Aruffo et al, 1990, Cell 6_11303-1313, ved bruk av Mlu I og B spalting, slik at plasmid pCD40-lg, fremstilles, som koder for fusjonsmolekylet CD40-lg (se figur 8B) CD40-lg fusjonsprotein kan så fremstilles ved å transfektere pCD40-lg plasmidet i COS-celler for å lage et forbigående ekspresjonssystem Fremstilt CD40-lg kan samles fra COS-cellesupernatanten og renses ved hjelp av protein A kolonne-kromatografi som beskrevet i Aruffo et al, 1990. Cell 161 1303-1313 ;Antistoffer ;De løselige ligandene i oppfinnelsen kan omfatte antistoffmolekyler, monoklonale antistoffmolekyler eller fragmenter av disse antistoffmolekylene som inneholder et antigen kombinasjons-sete som bindes til CD40CR ;I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes et vesentlig renset antistoff eller fragment derav, kjennetegnet ved at det spesifikt binder til musCD40CR, et 39 kD musT-celleprotein som binder til CD40 B-celleantigenet og stimulerer B-cellesyklusstart, proliferasjon og differensienng, nevnte antistoff er i stand til å binde nevnte CD40CR-protein på en aktivert hjelpe-T-celle og inhibere aktiveringen av en hvilende B-celle av den aktiverte T-cellen ;Slike ligander kan videre omfatte et annet molekyl som kan være protein, lipid, karbohydrat, enzym, toksin, vekstfaktor, lymfokin, antivekstforbindelse, alkylerende forbindelse, antimetabolitt, antibiotika, vincaalkaloid, platinum-koordmert kompleks, radioisotop, eller en fluorescerende forbindelse og kan være bundet til antistoffmolekylet eller fragmentet ;Der liganden er et monoklonalt antistoff, eller et fragment av dette, kan det monoklonale antistoffet være fremstilt mot CD40CR ved bruk av enhver fremgangsmåte som gir antistoff-molekylproduksjon av kontinuerlig cellelinje i kultur F eks , hybndomteknikken som opprinnelig var utviklet av Kohler og Milstein (1975, Nature 256 495-497) så vel som andre teknikker som har mer nylig blitt tilgjengelige, slik som den humane B-celle hybndomteknikken (Kozbar et al, 1983, Immunology Today 4 72) og EBV-hybndomteknikken for å fremstille menneske monoklonale antistoffer (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc , sidene 77-96) og lignende er innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelsen ;Antistoff-fragmenter som inneholder idiotypen av molekylet kunne fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter F eks slike fragmenter omfatter, men er ikke begrenset til F(ab')2-fragmentet som kan fremstilles ved å behandle antistoffmolekylet med pepsin, Fab'-fragmentene som kan fremstilles ved å redusere disulfidbroene i F(ab')2-fragmentet, F(ab')2-fragmentet som kan fremstilles ved å behandle antistoffmolekylet med papain, og 2Fab eller Fab-fragmentet som kan dannes ved å behandle antistoffmolekylet med papain og en reduserende forbindelse for å redusere disulfidbroene ;Den foreliggende oppfinnelse omfatter også kimære antistoffer fremstilt ved hjelp av teknikkene kjent i feltet, slik som de beskrevet av Momson et al, (1984) Proe Nati Acad Sei USA 8J. 6851-6855 eller europeisk patentansøkning nr 85305604 2, publikasjonsnummer 0173494 av Momson et al, utlagt 5 mars 1986 ;Immunogen for fremstilling av antistoffer kan være enhver kilde som inneholder CD40CR F eks , aktiverte Tn kan benyttes som en immunogen ;Alternativt, kan i det vesentlige renset CD40CR, fremstilt som beskrevet i kapittel (in) infra. benyttes Hvis aktivert Tn benyttes som immunogen, kan antiserum undersøkes for reaktivitet mot aktiverte, men ikke hvilende Tn-celler ;I en foretrukket utførelsesform ved oppfinnelsen er den løselige ligand MR1 monoklonalt antisoff Den følgende fremgangsmåte ble benyttet for å fremstille MR1 monoklonalt antistoff, og kan benyttes for å fremstille andre antistoffer rettet mot CD40CR ;Hamster ble immunisert intrapentonealt med 5-10^ aktiverte Tn1-celler (D1 6) i ukentlige intervaller i 6 uker Når serumtiter mot gnager Tn1 var større enn 1 10,000, ble cellefusjoner utført med polyetylenglykol ved bruk av immun hamster splenocytter og NSI SN fra brønner som inneholdt voksne hybridomer ble undersøkt ved flowcytometn på hvilende og aktiverte Tn1 Et spesielt hybridom, som fremstilte et mab som selektivt gjenkjente aktiverte Tn, ble videre undersøkt og subklonet for å lage MR1 MR1 bie fremstilt i bukhulevæske (ascites) og renset ved ionebytte-HPLC ;Den foreliggende oppfinnelse gir også ligander som omfatter monoklonale antistoffer, og fragmenter av disse som er i stand til konkurrerende hemming av bindingen av MR1 til dets mål-antigen eller CD40-lg til sin reseptor ;(ii) Fremgangsmåter benyttet for å karakterisere CD40CR ;CD40CR kan karakteriseres ved (a) dens evne til å binde CD40, fusjonsmolekyler som omfatter minst en del av CD40, og antistoffer slik som MR1, (b) dens funksjonelle egenskap som går ut på å stimulere B-celle syklusinngang, vekst og differensiering, og (c) dens cellulære fordeling ;Evne til å binde ligander ;CD40CR kan karakteriseres ved dens evne til å binde til ligander slik som CD40, fusjonsmolekyler som består av CD40, og antistoffer rettet mot CD40CR ;Som diskutert i større detalj infra, flere fremgangsmåter ble benyttet for å karaktensere CD40CR F eks CD40-lg og MR1 ble valgt til å gjenkjenne det samme 39 kd molekylet Både CD40-lg og MR1 ble funnet å immunpresipitere et ;39 kD protein fra radioaktivt merkete Tn-lysater (figur 5b) Videre immunpresipitenng av 39 kD proteinet med CD40-lg fjernet antigenet som var gjenkjent av MR1 fra Tn-lysatene ;Evne ti! å stimulere B-celler ;CD40CR kan også karakteriseres ved dets evne til å stimulere B-celle syklusinngang, vekst og differensiering ;F eks , plasmamembran (PM) fra aktiverte (PM<Act>), men ikke-hvilende (PM<r>es<t>) Tn-celler ble funnet å stimulere B-celle RNA-syntese (Figur 1a), denne stimulering, som indikerer B-celleaktivering, ble ikke påvirket av antistoffer slik som anti-LFA-1, anti-CD4, anti-ICAM-1 CD40-lg eller MR1, ble imidlertid funnet å kunne hemme PM<Act->indusert B-celleaktivering, som vist i figur Ib og figur 6 ;Stimulering av B-celle-aktivenng kan måles ved hjelp av fremgangsmåter slik som [<3>|H]-undin innebygging i RNA (såsom B-celler differensierer, RNA-syntese øker), eller [<3>H]-tymidin innebygging, som måler DNA-syntese forbundet med cellevekst For optimal måling av effekten til CD40CR når det gjelder B-cellevekst, kan interleukin-4 (IL-4) tilsettes kulturmediet i en konsentrasjon på omtrent 10 ng/ml ;Alternativ, kan B-celle-aktivenng måles som en funksjon av immunglobulin-sekresjon F eks , kan CD40CR, i vesentlig ren form, eller som tilstede i PM, eller på annen måte, tilsettes hvilende B-celler sammen med IL-4 (10 ng/ml) og IL-5 (5 ng/ml) Etter tre dager med kultur, kan et ytterligere volum kulturmedium tilsettes På dag 6 i kulturen, kan supematant (SN) fra individuelle kulturer høstes og måles med hensyn på IgM og IGi beskrevet i Noelle et al, (1991) J Immunol 146 1118-1124 ;Cellulær fordeling ;CD40CR kan også karakteriseres ved dets cellulære fordeling F eks , ble CD40-lg observert å binde til aktiverte, men ikke hvilende Tn1, som bedømt ved flowcytometri (figur 3) Videre, CD40-lg ble observert ved å binde Jurkat celler, HSB2-celler og aktiverte T-celler fra human perifert blod, men bandt ikke tilsynelatende nevneverdig til CEM-celler, HPBALL celler eller gnager tymomceller ;F eks , og ikke tenkt som begrensende, kan tilstedeværelsen av CD40CR for spesiell celletype ("testceller") evalueres ved hjelp av flowcytometn som følge Testceller kan undersøkes parallelt med hvilende (negativ kontroll) og aktiverte (positiv kontroll) Tn-celler Alle celler kan inkuberes i en konsentrasjon på omtrent 1 x 10<5> celler/50 //I med ligand (f eks CD40-lg eller MR1) i 20 minutter 14°C, etterfulgt av FITC-konjugerte anti-ltgand antistoff Propidium iodid kan tilsettes alle prøvene til en endelig konsentrasjon på 2 //g/ml Flowcytometnsk analyse kan så utføres f eks på en BD FACSCAN Etter positiv analyse av cellene ved hjelp av forover mot sidespredning og ved rød negativitet (for propidium-iodid eksklusjon), kan log grønn fluorescensen til levedyktige celler bestemmes ;(in) Fremstilling av renset CD40CR ;Den foreliggende oppfinnelse gir et vesentlig renset CD40CR Slik CD40CR kan fremstilles fra celler som bærer CD40CR, slik som aktiverte hjelpe-T-celler, Jurkat, og HSB2-celler, ved hjelp av den følgende fremgangsmåten ;Plasmamembraner kan fremstilles fra passende celler, slik som aktiverte Tn1 -celler, ved hjelp av diskontinuerlig sukrosegradientsentrifugenng som beskrevet i Noelle etal, 1991, J Immunol 146 1118-1124 CD40CR kan så isoleres ved avspalting av det grove membranekstraktet med mild detergeny, og så utføre størrelseseksklusjonskromatografi etterfulgt av affinitetskromatografi ved bruk av passende ligander (f eks MR1 eller CD40-lg) bundet til et fast underlag, immunpresipitenng (f eks ved CD40-lg eller MR1), og/eller gelelektroforese ;Det resulterende proteinet kan forventes å ha en molekylvekt på 39 kD ;Det beskrives et løselig CD40CR (det vil si cellefritt) som kan omfattes i farmasøytiske blandinger sammen med en passende bærer Det gir videre CD40CR som er bundet til et annet molekyl som kan være et peptid, protein, lipid, karbohydrat, enzym, toksin, vekstfaktor, lymfokin, anti-vekstforbmdelser, alkylerende forbindelser, antimetabolitt, antibiotika, vincaalkaloid, platinum-koordingeringskompleks, radioisotop, eller en fluorescerende forbindelse ;Det beskrives et vesentlig renset CD40CR som er blitt fremstilt ved hjelp av kjemisk syntese eller genteknologi, f eks , genet for CD40CR kan isoleres ved å sette inn cDNA fremstilt fra aktiverte hjelpe T-celler i Xgt10 ekspresjons-system, og så undersøke med MR1 eller CD40-lg binding for å identifisere CD40CR-uttrykkende kloner Alternativt kan cDNA fremstilt fra aktiverte hjelpe-T-celler transfekteres inn i COS-celler, supernatantene av disse kan undersøkes med MR1 eller CD40-lg for å identifisere CD40CR-produsenter Genet for CD40CR kan så benyttes for å uttrykke CD40CR ved bruk av ekspresjonssystemer kjent i feltet ;(iv) Anvendelser for ligander som binder til CD40CR ;Det beskrives fremgangsmåter for å kontrollere B-celleaktivering som benytter ligander som binder til CD40CR Spesielt besknves en fremgangsmåte for å hemme B-celleaktivenng som omfatter å reagere en blanding av B-celler og Tn-celler med en effektiv konsentrasjon av ligand som binder CD40CR Ligander som kan benyttes er beskrevet supra i kapittel (i) Fremgangsmåten i kan utføres in vitro eller in vivo En effektiv konsentrasjon refererer seg til en konsentrasjon av en ligand som hemmer B-celleaktivenng målt ved enhver teknikk kjent i feltet inklusive de beskrevet i kapittel (n), supra) ved minst 30%, og fortrinnsvis ved ca 75% CD40-lg kan benyttes som ligand, i hvilket tilfelle kan en effektiv konsentrasjon være minst omtrent 10 //g/ml I en annen utførelse, kan det monoklonale antistoffet bli benyttet, i det tilfelle kan en effektiv konsentrasjon være minst 10//g/ml Hvis fremgangsmåten blir praktisert in vivo, kan en effektiv konsentrasjon av ligand refereres av plasmakonsentrasjon av ligand eller til en lokal konsentrasjon F eks , kan det være ønskelig å hemme B-celleaktivenng i et lokalisert område for å begrense effektene på immunsystemet som et hele ;En fremgangsmåte for å behandle en person som lider av en sykdom forbundet med B-celleaktivenng, kan omfatte tilførsel til personen av en terapeutisk mengde ligand som binder til CD40CR En person kan være et ikke-menneske, eller fortrinnsvis et menneske ;Sykdommer forbundet med B-celleaktivering omfatter, men er ikke begrenset til, allergi (omfattende anafylaksis), autoimmune tilstander som omfatter legemiddel utløst lupus, systemisk lupus erytematosus, voksen reumatoid artritt, juvenil reumatioid artritt, scleroderma, Sjøgrens syndrom, osv og virus-sykdommer som omfatter B-celler, inklusive Epstein-Barr infeksjon, og retrovirusinfeksjon som omfatter infeksjon med et humant immunsviktvirus ;Fordi det er antydet at B-celleaktivering er forbundet med stimuleringen av humant immunsviktvirus-formering fra latens (inaktivitet) kan det være ønskelig å tilføre ligandene i oppfinnelsen til HIV-positive individer som ennå ikke har utviklet AIDS eller ARC ;Ligander kan tilføres i en passende farmasøytisk bærer, ved enhver metode kjent i feltet, inklusive intravenøs, intrapentoneal, subkutan, intratekal, intraartikulært eller intramuskulær injeksjon, og oralt, intranasalt, intraokulært og rektal tilførsel, og kan omfattes i mikrokuler, hposomer og/eller forlenget fngjørings-implantater ;En terapeutisk mengde ligand defineres som en mengde som på en signifikant måte reduserer de alvorlige kliniske virkningene av B-celleaktivering, og kan vanere blant ligander som benyttes og tilstander som behandles Hvis CD40-lg benyttes, kan terapeutisk konsentrasjon være omtrent 10 //g/ml enten systemisk (plasmakonsentrasjon) eller lokal Hvis MR1 benyttes, kan en terapeutisk konsentrasjon være omtrent 10//g/ml enten systemisk (plasmakonsentrasjon) eller lokal ;De ovenfor nevnte fremgangsmåtene kan benytte en ligand som består av et toksin eller antimetabolitt slik at Tn-cellene drepes eller ødelegges og B-celleaktivenng reduseres som et resultat av Tn-celledestruksjon ;Ligandene i oppfinnelsen kan også benyttes for å merke aktiverte T-celler, en fremgangsmåte som kan være nyttig i diagnosen av T-cellesykdommer I denne forbindelse, kan ligand som omfatter et enzym, radioisotop, fluorescerende forbindelse eller annen påvisbar markør utsettes for T-celler in vitro eller in vivo og mengdebinding bestemmes ;Liganden i oppfinnelsen kan også benyttes for å avlevere forbindelser, ;f eks vekstfaktorer til aktiverte T-celler ;(v) Anvendelse for CD40CR ;Det beskrives fremgangsmåte for å kontrollere B-celleaktivenng som benyttes CD40CR eller et molekyl som består av CD40CR, fremstilt som beskrevet i seksjon (ni), supra Spesielt beskrives en fremgangsmåte for å stimulere B-celleaktivenng som omfatter å la B-celler reagere med en effektiv konsentrasjon CD40CR Fremgangsmåten kan praktiseres in vivo eller in vitro En effektiv konsentrasjon refererer seg til en konsentrasjon av reseptor som stimulerer B-celleaktivenng, må ved enhver teknikk kjent i feltet (inklusive de beskrevet i kapittel (in), supra) ved minst omtrent 30% I spesifikke, ikke-begrensende utførelsesformer av oppfinnelsen, kan konsentrasjonen av CD40CR være omtrent 10 //g/ml lokalt eller systemisk ;En person som lider av en immunsviktsykdom forbundet med nedsatt humoral immunitet kan behandles ved tilførsel til personen av en terapeutisk mengde CD40CR Et målsubjekt må ikke være et menneske, men er fortrinnsvis et menneske ;Immunsviktsykdommer forbundet med nedsatt humoral aktivitet omfatter ervervet immunsviktsyndrom, immunsvikt forbundet med ondartete sykdommer eller cacheksi, latrogen immunsvikt, forårsaket f eks av kjemoterapi eller stråle-behandling, så vel som genetiske sykdommer som omfatter humoral immunitet ;CD40CR kan tilføres, i en passende farmasøytisk bærer, ved hjelp av en hver kjent fremgangsmåte i feltet inklusive intravenøs, intrapentoneal, subkutan, mtratekal, intraartikulært eller intramuskulær injeksjon, og oralt, intranasal, intraokulær og rektal tilførsel og kan omfattes mikrokuler, hposomer, og/eller forlenget frigjønngs-implantater ;En terapeutisk mengde CD40CR for CD40 defineres som mengden som øker immunglobulinproduksjonen ved minst omtrent 30% ;CD40CR kan konjugeres til et toksin og tilføres en person under betingelser hvor det ville være ønskelig å ødelegge B-celler og uttrykke CD40 Eksempler på slike omstendigheter omfatter pasienter som mottar organtransplantanter eller lider av multippel myeloma eller andre B-celle ondartede sykdommer eller av autoimmun sykdommer ;CD40CR kan også benyttes til å merke B-celler som uttrykker CD40, en teknikk som kan være nyttig i diagnosen av B-cellesykdommer For å oppnå dette, kan reseptor bundet til et enzym, radioisotop, fluorescerende forbindelse eller annen påvisbar markør reageres med B-celler in vivo eller in vitro og mengde binding bestemmes ;CD40CR kan også benyttes til å avlevere bundne molekyler til B-celler ;Eksempel 1* en ny reseptor, CD40CR, på aktiverte hjelper T-celler binder CD40 og overfører signalet for gjenkjennelsesaktivenng av B-celler

1 1 Materialer og fremgangsmåter

1 1.1 Dyr

Hunn DBA/2J-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble benyttet for fremstillingen av "fyll"-celler for å understøtte veksten av Tn-kloner og i fremstillingen av hvilende B-celler

112 Hjelper T-celler kloner (Th)

D1 6, en 1-A^-begrenset kanin lg-spesifikk Tn1-klon (Kurt-Jones et al,

(1987) J Exp Med 166 1774-1787) ble oppnådd fra Dr David Parker, University of Mass , Worcester D1 6 vil hen henvises til som Tn1

113 Aktivering av Tn ved hjelp av anti-CD3

Th1 ble dyrket (8 x lO^/brønn) i brønner (6 brønner, Corning, NY) dekket med 40 //g/4 ml PBS/brønn med anti-CD3 116 timer, som beskrevet i (Noelle et al, (1991) J Immunol 146 1118-1124)

114 Fremstilling av Th-plasmamembraner

Plasmamembraner ble fremstilt ved diskontinuerlig sukrose gradient sentnfugering, som beskrevet i (Noelle et al, (1991) J Immunol 146 1118-1124)

115 Fremstilling av hvilende B-celler

Hvilende milde B-celler ble fremstilt ved sentnfugering på diskontinuerlig Percoll gradienter, som beskrevet i (Defranco et al, (1982) J Exp Med

155 1523) Celler isolert fra 70 - 75% (tetthet på 1,087 -1,097) Percoll mellomfase var typisk over 95% mlg<+>, hadde en jevn, lav grad av nær forover lys-spredning og svarte ikke på Con-A

1 1 6 Antistoffer

De følgende mabs ble renset ved lonebytter-HPLC fra bukhulevæske (ascites) fra mus som hadde blitt bestrålt og benmargen gjenoppbygget anti-

CD3 145-2C11 (Leo etal, (1987) Proe Nati Acad Sei USA 84 1374-1378), anti-o,(i H57-597, anti-CD4 GK1 5 (Wilde etal, (1983) J Immunol 131 2178-2183), anti-ICAM YN1/1 7 4 (Pneto et al, (1989) Eur J Immunol 19 1551-1557), anti-LFA-1 FD441 8 (Sarmiento et al, (1982) Immunol Rev 68 135), og anti-rat/hamster k chain RG-7 (Springer, (1982) Hybrid 1257-273)

1.1 7 Fremstilling av CD40 rekombinant-globulinet (CD40-lg)

CD40-fusjonsprotein ble fremstilt ved å spalte et plasmid som inneholdt et cDNA som kodet for CD40-antigenet (Stamenkovic og Seed, (1989) EMBO J

8 1493-1410) med restnksjonsenzymet PstJ (P) og Sau 3A (S3) Dette P/S3 fragment ble subklonet i det samme plasmidet spaltet med P og Barn H1 (B) Dette tillot fremstillingen av CD40A som kodet for et CD40-protein forkortet oppstrøms fra transmembranområdet DNA-fragmentet som kodet for et CD40A ble så subklonet i immunglobulinfusjonsplasmidet (Aruffo et al (1990), Cell 611303-1313) ved bruk av MJuJ og B-spalting CD40-lg-fusjonsproteinet ble fremstilt ved forbigående transfeksjon i COS-celler og renset på en protein A-søyle som beskrevet i (Aruffo et al, (1990) Cell 6_11303-1313)

118 Lymfokiner

lnterleukin-4 (IL4) rekombinant mus-IL4 ble generøst gitt av Drs C Maliszewski og K Grabstein, Immunex Corporation, Seattle, WA

lnterleukin-5 (IL5) rekombinant muse IL5 ble kjøpt fra RD Research, Sarrento, CA

119 Stimulering av B-celle RNA-syntese ved hjelp av aktiverte Th-plasmamembraner 3 x 10<4> hvilende B-celler ble dyrket i 50 //I cRPMI i A/2 mikroliters brønner (Costar, Cambridge, MA) Til disse brønnene, ble 0,5 //g Tn1 eller Tn2-membranprotein tilsatt Fra 42 til 48 timer, ble brønnene pulsmerket med 2,5 //Ci med <3>H-undin (New England Nuclear, Boston MA) høstet, og radioaktiviteten bestemt ved hjelp av væskescintillasjonspektroskopi Resultatene ble uttrykt som cpm/kultur +/sd 1 1.10 Stimulering av B-celleimmunglobulinsekresjon ved hjelp av aktiverte Tn-plasmamembraner og lymfokiner

Hvilende B-celler ble dyrket som beskrevet ovenfor Til kulturbrønner ble 0,5 jjg Tn1-membranprotein, IL4 (10 ng/ml) og IL5 (5 ng/ml) tilsatt På dag tre av kulturen, ble ytterligere 50 //I av cRPMI tilsatt På dag seks i dyrkningen, ble SN fra individuelle brønner høstet og målt med hensyn til IgM og lgG<|, som beskrevet i (Noelle et al, (1991) J Immunol 146 1118-1124)

1111 Stimulering av B-celledeling ved hjelp av aktivert Tn og IL4

4 x 10<4> hvilende B-celler ble dyrket i 50 //I cRPMI i A/2 mikroliter brønner (Costar, Cambridge, Ma) Til disse brønnene, ble 1 x 10<4> hvilende eller aktiverte, bestrålte (500 rads) Tn1 og IL4 (10 ng/ml) tilsatt På dag 3 av dyrkningen, ble brønnene pulsmerket med 1 //Ci ^H-tymidin, som beskrevet i (Noelle et al, (1991) J Immunol 146 1118-1124)

1.1.12 Fremstilling av monoklonale antistoffer spesifikke for membran proteiner stimulert på aktiverte Tn1

Hamstere ble immunisert intrapentonalt med 5-10 x 10^ aktiverte Tn1

(D1 6) i ukentlige intervaller i seks uker Når serumtitre mot gnager Tn1 var større enn 1 10 000, ble cellefusjonen utført med polyetylenglykol ved bruk av immun hamstersplenocytter og en NS1 SN fra brønner som inneholdt voksende hybndomer ble undersøkt ved flowcytometn på hvilende og aktiverte Tn1 Bare spesielle hybndomer som produserte en mab som selektivt gjenkjente aktiverte Tn ble undersøkt videre og subklonet for å oppnå MR1 MR1 ble fremstilt i ascites og renset med ionebytte-HPLC

1 1.13 Flowcytofluormetrisk analyse av aktiveringsmolekyler uttrykt på Tn Hvilende og aktiverte Tn (16 timer med anti-CD3) ble høstet og inkubert med 1 x 10^ celler/50//I med fusjonsprotein i 20 minutter ved 4°C, etterfulgt av FITC-konjugert geite anti-human (h)lgG (25 //g/ml, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) Til alle prøvene, ble propidiumiodid tilsatt i en endelig konsentrasjon på 2 //g/ml Flowcytofluormetrisk analyse ble utført på en BD FACSCAN Etter positiv atskillelse av cellene ved hjelp av forover mot sidespredning, og ved rød negativitet (for propidiumiodid eksklusjon), ble log grønn fluorescens av levende celler Minst 5 000 levende celler ble analysert for bestemmelsen av prosent positive celler og MF1 Farging med MR1 benyttet FITC-konjugert RG7, en mus anti-rotte/hamster k kjede mab

1.1 14Biosyntetisk merking, immunpresipitering, SDS-PAGE og fluorgrafi

Tn1 var ubehandlet eller aktivert med uløselig anti-CD3 116 timer Proteinet fra hvilende og aktiverte Tn(20 x 10<6>/ml) ble merket med 1 mCi [<35>s]-metionin/- cystein i en time, på den tid ble den vasket to ganger med RPMI/10%FCS og cellebunnfallet lysert i ekstraksjonsbuffer som beskrevet (Noelle et al, (1986) J Immunol 137 1718-1726) Rensede antistoffer eller fusjonsproteinet (1 -10 //g) ble tilsatt 500 / j\ lysat (5 x 10^ celle-ekvivalente) ved 4°C 116 timer, på den tid, ble lysatene overført til rør som inneholdt 50 /<y>l pakket protein A-Sepharose Den bunnfelte protein A-Sepharose ble suspendert og rørene ble inkubert ved 4°C 11 time med omristing Prøvene ble så vasket tre ganger med høy stringens vaskebuffer Den bunnfelte protein A-Sepharosen ble resuspendert i 30 fj\ SDS prøvebuffer og analysert på 10% polyakrylamidgel Etter elektroforese ble gelen fiksert og fluorgrafi ble utført

1 2 Resultater

12 1 Effekt av monoklonale antistoffer på stimuleringen av B-celle RNA-syntese av PMAct

For å definere celleoverflatemolekylene som formidlet stimuleringen av B-cellesyklusinngang av PM^rt ble mabs mot Tn-membranproteinet tilsatt kulturene av PM^ct og B-celler PM<A>c<t> stimulerte B-celle RNA-syntese åtte ganger over den som var observert med PM<rest>, (Figur 1a) Tilsetting av anti-LFA-1, anti-CD4, anti-ICAM-1, alene eller i kombinasjon, hemmet ikke stimuleringen av B-celle RNA-syntese med PMAct

12 2 CD40-lg hemmet T^-indusert B-celle- syklusinngang, differensiering og deling

I det humane systemet, har det vært vist at anti CD40 mab stimulerte B-celledeling (Clark and Lane, (1991) Ann Rev Immunol 9 97-127) hvilket impliserte CD40 som et viktig utløsningsmolekyl for B-celle For å bestemme hvis CD40 spilte en rolle i stimuleringen av B-celle RNA-syntese med PM^rt ble et løselig fusjonsprotein fra de ekstracellulære områdene i human CD40 og Fc til human-lgG-| (CD40-lg) tilsatt kulturer av PM<Act> og B-celler PM<A>c<t> som stammer fra Tn1 og Tn2 ble fremstilt og benyttet for å stimulere B-celle RNA-syntese Tilsetting av CD40-lg til kulturen forårsaket en dose-avhengig hemming av B-celle RNA-syntese som ble stimulert ved PM^<ct> fra jni 0g jn2 (figur 1 b) Halv maksimal hemming av B-celle RNA-syntese stimulert av PM<Act> fra jni 0g jh2 var omtrent 5 //g/ml CD40-lg Et CD7E-lg fusjonsprotein (Damle og Aruffo, (1991) Proe Nati Acad Sei USA 88 6403-6407) var uten virkning selv når brukt ved 25 //g/ml

For å undersøke hvorvidt CD40-lg hemmet aktiveringen av B-celler med T-uavhengig aktivatorer, ble B-celler dyrket i nærvær av LPS og CD40-lg På dag 2, ble RNA-syntese målt (figur 1c) CD40-lg var ineffektiv når det gjaldt å hemme B-celleaktivering av LPS, men hemmet svaret til B-celler overfor PM<Act>

I nærvær av PM^rt ||_4 0g il_5, differensierte B-celler polyklonalt og produserte lg (Hodgkm et al, (1990) J Immunol 145 2025-2034, Noelle et al,

(1991) J Immunol 146 1118-1124) For å vurdere kravene til CD40 signalering i denne prosess ble CD40-lg tilsatt ved start av kulturen eller på etterfølgende dager Tilsetting av CD40-lg (figur 2a) i starten av kulturen hemmet polyklonal IgM og lgG-|-produksjon sammenlignet med kontrollnivåene i dens fravær I motsetning, viste tilsetting av CD40-lg på dag en og to i kulturen liten, hvis noen, hemmende virkning på IgM og lgG<|-produksjonen Disse resultatene viste at etter 25 timer, er signalenng via CD40 ikke lenger vesentlig for differensiering en av B-celler til lg-sekresjon

Resultater så langt viste at CD40 spilte en rolle i aktiveringen av B-celler med PMAc<t> Studier ble også utført for å sikre at CD40 også var innblandet i aktiveringen av B-celler ved hjelp av intakt, levende, aktiverte Tn Tn1 ble aktivert i 16 timer med uløseliggjort anti-CD3, høstet og bestrålt De bestrålte Th1 ble dyrket med B-celler i nærvær av IL4 og B-celledeling ble bestemt på dag tre i dyrkningen En utenfra tilsetting av IL4 var nødvendig for å oppnå B-celledeling med Tn1, fordi Tn1 ikke produserer IL4 (Noelle et al, (1989) J Immunol 143 1807-1814) CD40-lg hemmet stimulenngen av B-celledeling ved hjelp av bestrålte Th på en doseavhengig måte, likt det som ble funnet med PM<Act> (figur 2b) Den negative kontrollen, CD7E-lg, viste ingen nevneverdig virkning

1 2 3 CD40-lg påviste et molekyl uttrykt på aktiverte, men ikke hvilende Th

For å undersøke hvorvidt aktiverte Th1 uttrykker et bindingsprotein CD40, ble hvilende og aktiverte (16 timer) Th1 farget med CD40-lg eller CD7E-lg, etterfulgt av FITC-anti-HIgG Binding av CD40-lg ble bedømt ved flowcytometri (fig 3) Th1 som ble aktivert i 16 timer med anti-CD3, men ikke hvilende Th1, farget 56% positivt med CD40-lg, men ikke med kontrollen CD7E-lg For å identifisere CD40-lg bindingsprotein, ble Th1 proteinet biosyntetisk merket med [<35>s]-metionin/cystein og proteiner immunbunnfelt med CD40-lg eller CD7E-lg De immunbunnfelte proteinene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og fluorgrafi (figur 4) Et fremtredende bånd med tilsynelatende molekylvekt på 39 kD immunpresipiterte på en doseavhengig måte med 1 og 10//g CD40/prøve Som kontroller, immunpresipiterte anti-klasse I mab-bånd ved 55 kD og et lavt molekylvektbånd, R>2 mikroglobulin I fravær av mab, var ingen sterke bånd synlig Et 39 kd bånd ble også immunpresipitert fra aktiverte Th som var vektorielt merket med <125>l, hvilket bekreftet at 39kD proteinet var et membranprotein

1 2.4 Monoklonalt antistoff MR1, spesifikt ovenfor 39Kd Tn-membranprotein, hemmet stimuleringen av B-celle RNA-syntese med PM<Act >"Mabs" spesifikke overfor antigener som selektivt var uttrykt på aktiverte, men ikke-hvilende Th ble utviklet for å identifisere Tn-molekyl(ene) ansvarlige for Tn-effektorfaseaktiviteten Et slikt mab, MR1, gjenkjente et antigen som var selektivt uttrykt på aktiverte Th1 For å undersøke hvorvidt MR1 og CD40-lg gjenkjente samme molekylet, ble flowcytometn og blokkerende studier utført CD40-lg og MR1 farget henholdsvis omtrent 56% og 61 %, av aktiverte, men ikke hvilende Tn (figur 5a) MR1, men ikke et annet hamster anti-T-celle mab, anti-a/fi TCR, blokkerte fargingen av aktiverte Tn1 med CD40-lg, på en doseavhengig måte Disse resultatene viste at CD40-lg og MR1 gjenkjente overlappende eller identiske epitoper på 39 kD Tn-proteiner For videre å demonstrere at CD40-lg og MR1 gjenkjente det samme molekylet, ble antigenet som bandt MR1 identifisert ved immunpresipitering av proteiner fra radioaktivt merkete Th-lysater Både CD40-lg og MR1 immunbunnfelte et 39 kD protein (figur 5) Endelig, immunpresipitering av 39 kD protein med CD40-lg fjernet antigenet som ble gjenkjent av MR1 fra radioaktivt merkete lysater av aktiverte Th, hvilket støtter hypotesen at MR1-antigenet og CD40-bindingsproteinene var identiske

Funksjonelle studier ble utført med MR1 for å undersøke hvorvidt MR1 nøytraliserte aktiviteten som ble uttrykt av PM<Act> pf^Act 0g B-celler ble dyrket alene, eller i nærvær av hamstere "mabs" eller CD40-lg To hamster "mabs", anti-a/li TCR og a-CD3 hemmet ikke aktivering av hvilende B-celler med PM<Act> | motsetning, hemmet MR1 eller CD40-lg B-celleaktivenng (figur 6)

1 3 Diskusjon

Resultatene viser at blokkering av fremtredende Th-overflatemolekyler (LFA-1, CD4, ICAM-1, CD3, a.li TCR) med mabs hindret ikke evnen til aktiverte Th å stimulere B-cellesyklusinngang I motsetning, blokkerte CD40-lg eller et mab spesifikt for CD40 bindingsproteinet, Tn-avhengig B-celleaktivenng på en doseavhengig måte Videre, ble CD40-bindingsproteinet identifisert som et 39 kD protein som er selektivt uttrykt på membranene til aktiverte, men ikke hvilende Th Både CD40-lg og et mab som er spesifikt for 39 kD CD40-bindingsproteinet blokkerte B-celleaktivenng av PMAct

Skjønt et antall membranproteiner har vært omtalt i Th- avhengig B-celle signalering, avkrefter beviset som er presentert her at visse molekyler (LFA-1, CD4, CD3, a, Q> TCR, ICAM-1) bidrar, og impliserer CD40 som B-cellereseptoren for gjenkjennelses-signalenng med Th Resultatene viser at CD40-lg og et mab som er spesifikt for CD40 bindingsproteinet hemmer Tn-avhengig B-celle-aktivenng

Liganden for CD40 er et 39Kd protein som uttrykkes på aktiverte, men ikke hvilende Tn Biokjemiske studier viser at 39 kD proteinet er et enkeltkjedet molekyl siden elektroforetisk vandring ikke var påvirket av reduserende forbindelser basert på de funksjonelle studiene presentert i denne undersøkelsen, uttrykker både aktivert Tn1 og Th2 39kD CD40-bmdingsproteinet Dette er overensstemmende med de funksjonelle studiene som viser at både Tn1 og Tn2 stimulerer B-cellesyklusinngang I et forsøk på å karaktensere videre 39kD proteinet, ble et cDNA som kodet for CD-proteiner i Mw-området av 39kD (CD53, CD27 og CD69) forbigående transfektert inn i COS-celler og cellene ble undersøkt med tanke på CD40-lg binding Ingen av de transfekterte COS-cellene uttrykte proteiner som bandt CD40-lg Det er derfor antatt at 39 kD proteinet ikke er et av disse CD-proteinene

Den biokjemiske basis for signaloverføring av Tn og B-celler har vært lite kjent Identifisenng av CD40 som det signaloverførende molekylet for T-celler er til hjelp for å rette oppmerksomheten mot spesifikke biokjemiske reaksjonsveier som er kjent for å bli koblet til CD40-molekylet CD40 er et medlem av nerve vekstfaktor-reseptoren (NGFR) familien i kraft av nærværet av fire cysteinnke områder i dens ekstracellulære region Signalering gjennom CD40 ved hjelp av mab har vært vist (Uckun etal, (1991) J Biol Chem 266 17478-17485) å omfatte aktiveringen av tyrosinkinase hvilket resulterer i den økende fremstilling av inositoltnsfosfat og aktivenngen av minst fire adskilte senn/treoninkinaser Basert på informasjon oppnådd ved signalering gjennom andre medlemmer av NGF-reseptorfamilien, blir det antatt at reaksjonen mellom aktivert Tn og B vil resultere i mange av de samme biokjemiske prosessene

Eksempel 2 binding av CD40-lg til humane T-cellelinjer

For immunfluorescensbindings-studier, ble CD40-lg fusjonsprotein konjugert med biotin ved bruk av biotin-succimmid (Sigma) Flowcytometrisk analyse ble så utført i en totrinns fargereaksjon ved bruk av fycoerytnn (PE)-strep-avidin (Bectin-Dickinson) med et Coulter Epics C instrument Representative resultater fra å undersøke mange T-cellelinjer er presentert nedenfor Jurkat og

HSB2-cellelinjene ble funnet å binde spesifikt, mens andre T-cellelmjer som omfatter CEM, HPBALL og gnagertymom ikke bandt CD40-lg fusjonsproteinet

(figur 7)

Forskjellige publikasjoner er sitert her og er herved inntatt som referanse i sin helhet

Claims (19)

1 Vesentlig renset cellefritt fusjonsprotein, karakterisert ved at det spesifikt binder til CD40CR, et 39 kD T-celleprotein som binder til CD40 B-celleantigen og stimulerer B-cellesyklusstart, prohferasjon og differensienng, nevnte fusjonsprotein (a) omfatter i det minste en ekstracellulær del av CD40-protein som har en sekvens som angitt i Fig 8A, knyttet til et andre molekyl hvor det nevnte andre molekylet er valgt fra gruppen bestående av peptider, proteiner, karbohydrater og lipider, og hvor nevnte andre molekyl er bundet til nevnte del på et sete som har aminosyresekvensen Gly-Pro-Gln-Asp, og (b) er i stand til å binde nevnte CD40CR-protein på en aktivert hjelpe-T-celle og inhibere aktivenngen av en hvilende B-celle av den aktiverte T-cellen

2 Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at det andre molekylet er i det minste en del av et immunoglobuhnmolekyl

3 Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er CD40-lg som fremstilt av plasmidet pCD40-lg som angitt i Figur 8B

4 Vesentlig renset cellefritt CD40/tmmunoglobulin-fusjonsprotein ifølge krav 2, karakterisert ved at det spesifikt binder til musCD40CR, et 39 kD musT-celleprotein som binder til CD40 B-celle-antigenet og stimulerer B-cellesyklusstart, prohferasjon og differensienng, nevnte fusjonsprotein omfatter i det minste en del av CD40-protein som har en sekvens som angitt i Figur 8A bundet til i det minste en del av et immunoglobulinmolekyl

5 Fusjonsprotein ifølge krav 4, karakterisert ved at det spesifikt konkurrerende inhiberer bindingen av CD40 til nevnte musCD40CR

6 Fusjonsprotein ifølge krav 4, karakterisert ved at det spesifikt konkurrerende inhiberer bindingen av et monoklonalt antistoff, fremstilt av hybridomen MR1, deponert i ATCC med tilgangsnummer HB11048 til dets mål-antigen

7 Vesentlig renset antistoff eller fragment derav, karakterisert ved at det spesifikt binder til musCD40CR, et 39 kD musT-celleprotein som binder til CD40 B-celleantigenet og stimulerer B-cellesyklusstart, prohferasjon og differensiering, nevnte antistoff er i stand til å binde nevnte CD40CR-protein på en aktivert hjelpe-T-celle og inhibere aktiveringen av en hvilende B-celle av den aktiverte T-cellen

8 Antistoff eller fragment derav ifølge krav 7, karakterisert ved at det spesifikt konkurrerende inhiberer bindingen av CD40 til nevnte musCD40CR

9 Antistoff eller fragment derav ifølge krav 7, karakterisert ved at det spesifikt konkurrerende inhiberer bindingen av et monoklonalt antistoff, som fremstilt av hybndomen MR1, deponert i American Type Culture Collection og tildelt tilgangsnummeret HB 11048, til dets målantigen

10 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er et antiprohferativt middel

11 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er et alkylerende middel

12 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er en antimetabohtt

13 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er et antibiotika

14 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er et vinca alkaloid

15 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er et enzym

16 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er et platina-koordinert kompleks

17 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er en rad io isotop

18 Antistoff eller fragment derav ifølge kravene 7, 8 eller 9, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre molekyl som er en fluorescerende forbindelse

19 Antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at det er monoklonalt og fremstilt av hybndomen MR1, deponert i Amencan Type Culture Collection og tildelt tilgangsnummeret HB11048, eller et fragment derav som binder til mus CD40CR, et 39 kD musT-celleprotein som binder til CD40 B-celleantigenet og stimulerer B-cellesyklusstart, prohferasjon og differensiering