HU220192B - Gyógyszerkészítmények a humorális immunitás gátlására - Google Patents

Abstract

A találmány oldható tímuszfuggő (TD) antigén és egy gp39-antagonista alkalmazására vonatkozik gyógyszerkészítmények előállítására. Az így előállított gyógyszerek egy sejtfelületen ki nem fejeződő TD antigénre adott in vivő humorális im- munválasz gátlására, egy TD antigénnek kitett egyedben a TD antigénre adott antigénspecifikus IgE válasz gátlására vagy a TD antigénnel in vivő kiváltott aktivált Th sejtfunkció immunszuppresszálására szolgálnak. HU 220 192 B A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 13 lap ábra)

Description

A találmány tárgya oldható TD antigén és egy gp39antagonista alkalmazása gyógyszerkészítmény előállítására.

Az immunrendszer kétféle antigénspecifikus választ tud adni idegen antigénre. A celluláris immunitás kifejezés az immunrendszer T-limfociták által közvetített effektor funkcióira használatos. A humorális immunitás kifejezés a B-limfociták által termelt antigénspecifikus antitestek vonatkozásában használatos. Már régen felfedezték, hogy a legtöbb antigénnel szembeni humorális immunitás kifejlődéséhez nemcsak antitesttermelő B-limfocitákra van szükség, hanem segítő Tsejtek (helper T, továbbiakban Th sejtek) bevonására is [Mitchison, Eur. J. Immunoi. 1, 18-25 (1971); Claman and Chaperon, Transplant Rév. 1, 92-119 (1969); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2624-2629 (1973); Raff et al., Natúré 226, 1257-1260 (1970)]. A tímuszfüggő (thymus dependent, továbbiakban TD) antigének stimulációjára adott válasznál bizonyos szignálokat vagy „segítséget” a Th sejtek nyújtanak. Mialatt néhány B-limfocita segítséget a Th sejtek által kiválasztott oldható molekulák (például limfokinek, mint az IL-4 és IL-5) közvetítenek, a B-sejtek aktiválásához szükség van a B- és Th sejtek közötti érintkezésfüggő kölcsönhatásra is [Hirohata et al., J. Immunoi. 140, 3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunoi. 143, 1745-1754 (1989)]. Ez azt jelenti, hogy a B-sejt -aktiválás magában foglal egy kötelező kölcsönhatást a B-sejtek és Th sejtek sejtfelszíni molekulái között. Egy ilyen kölcsönhatás létét alátámasztja továbbá az a megfigyelés, hogy aktivált T-sejtek izolált plazmamembránjai olyan segítőfunkciót tölthetnek be, amely nélkülözhetetlen a B-sejtek aktiválásához [Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunoi. 145, 2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunoi. 146, 1118-1124(1991)].

Egy sejtfelszíni molekulát, a CD40-et azonosították éretlen és érett B-limfocitákon, amely ha antitestekkel keresztköt, elindítja B-sejtek osztódását [Valié et al., Eur. J. Immunoi. 19, 1463-1467 (1989); Gordon et al.,

J. Immunoi. 140, 1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunoi. 142, 4144-4152 (1989)]. A CD40-et molekulárisán klónozták és jellemezték [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403-1410 (1989)]. Egy CD40 ligandumot, a gp39-et (CD40 ligandum vagy CD40L néven is) szintén molekulárisán klónozták és jellemezték [Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)]. A gp39 fehérje aktivált, de nem pihenő CD4+ Th sejteken fejeződik ki [Spriggs et al., J. Exp. Med. 176, 1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunoi. 22, 2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immunoi. 151, 1-14 (1993)]. A gp39 génnel transzformált és felületükön gp39 fehérjét kifejező sejtek kirobbanthatják B-sejtek osztódását, és más stimulálószignálokkal együtt antitesttermelést idézhetnek elő [Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)].

Miközben a humorális immunválasz kiváltása a gazdaszervezetnek egy fontos védekezési mechanizmusa, bizonyos esetekben kedvező lenne elnyomni az antitesttermelődést az adott antigénnel szemben. Például a humorális válasz elnyomása egy allergénnel szemben megelőzhetné vagy csökkenthetné az egyén allergiás reakcióját. Ezenkívül, ha terápiás céllal adunk be antitestet, az antitesttel szembeni humorális válasz elnyomása meghosszabbíthatná az antitest terápiás hatékonyságát.

A humorális immunitás elnyomásának egy megközelítése a B-sejtek aktiválódásának gátlása. A találmány tárgyát TD antigénre in vivő adott humorális immunválasz gátlására szolgáló eljárások képezik, amelyek gátolják a Th sejt B-sejtet stimuláló képességét, ezáltal megakadályozzák a B-sejt aktiválódását és antitesttermelését. A találmány - legalábbis részben - azon a szükségszerűségen alapul, hogy egy Th sejten levő gp39 és egy B-sejten levő CD40 in vivő kölcsönhatásának kell megelőznie a B-sejt bekövetkező aktiválódását. Az alanynak a gp39 és CD40 közötti kölcsönhatást in vivő hatásosan gátló gp39-antagonistákat adunk be egy TD antigénnel együtt, hogy elnyomjuk a TD antigénnel szembeni humorális immunitást. A beadott gp39-antagonista lehet egy gp39 ellen irányuló antitest. Egy előnyben részesített megvalósítási módban a gp39-antagonista egy monoklonális antitest, úgymint egy antihumán gp39 antitest vagy egy antiegér-gp39 antitest (például MR1). Kiméra antitestek, humanizált antitestek és antitestffagmentumok szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Egy másik lehetőség szerint a gp39-antagonista lehet a CD40 gp39 ligandum oldható formája. A CD40 oldható fúziós fehérjéire szintén kiterjed a találmány.

A találmány szerinti eljárásokkal gátolt humorális immunválasz lehet egy antigén iniciálóhatásának kitett esetben fellépő elsődleges humorális immunválasz, vagy egy antigénnel történt előző találkozást követő ismételt hatás esetében másodlagos humorális immunválasz. Például az itt leírt módszerek felhasználhatók antigénspecifikus IgM antitestek, IgG antitestek, IgD antitestek és/vagy IgE antitestek termelődésének gátlására. Ezenkívül a módszerek gondoskodnak a humorális immunválaszok in vivő elnyomásának meghosszabbításáról.

A találmány tárgyát egy vonatkozásban TD antigénekre adott humorális immunválaszok gátlására szolgáló eljárások képezik. A találmány által felölelt antigének közé olyan antigének tartoznak, amelyekre specifikus antitestképzéshez szükség van a gp39 és egy, a B-sejtek felületén levő ligandum (például CD40) közötti kölcsönhatásra. A TD antigének általában fehérje jellegű antigéneket foglalnak magukban. A találmány előnyben részesített megvalósítási módjaiban az antigén terápiás antitest, drog, allergén vagy idegen sejt. A találmány módszerei oly módon is hatásosak TD antigénre adott humorális immunválasz gátlására, hogy eközben megőrzik a II. típusú tímusztól független (thymus independent type II, továbbiakban TI-2) antigénekre adott humorális immunválaszt.

A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban olyan módszerek képezik, amelyek in vivő specifikusan gátol2

HU 220 192 Β ják az aktivált Th sejtek segítőfunkcióját, gp39-antagonista beadása révén megakadályozva a gp39 és a B sejtek egy felületi ligandumja (például a CD40) közötti kölcsönhatást. E módszer szerint in vivő inaktiváljuk a Th sejtek segítőfunkcióját anélkül, hogy megsemmisítenénk vagy energizálnánk a Th sejteket.

A találmány tárgyát továbbá olyan módszerek képezik, amelyek egy gp39-antagonista és egy másik immunszuppresszív ágens kombinált beadásával in vivő gátolják a humorális immunválaszt. Más immunszuppresszív ágensek - amelyeket egy gp39-antagonistához kapcsolva készíthetünk el - citokininhibitorokat, a CD28/CTLA4 T-sejt együtt stimuláló útvonalának inhibitorait, vagy immunszuppresszív drogokat foglalnak magukban.

A találmány tárgyát még további vonatkozásban annak meghatározására szolgáló eljárás képezi, vajon egy antigén TD vagy TI-2 antigén. Ez úgy határozható meg, hogy az antigénre adott humorális immunválasz in vivő gátolható-e vagy sem gp39-antagonista beadásával.

Az 1A. ábra elsődleges anti-SRBC-IgM antitesttermelődés in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott szuppresszióját mutató oszlopdiagram.

Az IB. ábra elsődleges anti-SRBC-IgM antitesttermelődés rövid ideig tartó in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott meghosszabbított szuppresszióját mutató diagram.

A 2A. ábra másodlagos anti-KLH antitesttermelődés (különböző izotípusok) in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott szuppresszióját mutató oszlopdiagram. Az antitesttitert az antigénnel történt behatás után 7 nappal mértük.

A 2B. ábra másodlagos anti-KLH antitesttermelődés (különböző izotípusok) in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott szuppresszióját mutató oszlopdiagram. Az antitesttitert az antigénnel történt behatás után 14 nappal mértük.

A 3. ábra két oszlopdiagram, amelyek az elsődleges anti-ChiL6-IgM antitesttermelődés (3A. ábra, fent) és a másodlagos anti-ChiL6-IgGl antitesttermelődés (3B. ábra, lent) in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott szuppresszióját mutatják.

A 4A. ábra elsődleges anti-TNP-IgM antitesttermelődés TNP-SRBC immunizálással és in vivő antigp39-kezeléssel kiváltott szuppresszióját mutató oszlopdiagram.

A 4B. ábra elsődleges anti-TNP-IgM antitesttermelődés TNP-Ficoll immunizálást és in vivő anti-gp39kezelést követő szuppressziójának hiányát mutató oszlopdiagram.

Az 5. ábra oszlopdiagram, amely előzőleg in vivő anti-gp39-kezelésnek kitett T-sejtek érintetlen segítőaktivitását mutatja kezeletlen befogadó egerekbe történő átvitel révén, bizonyítva, hogy az anti-gp39-beadás nem semmisíti meg a Th sejteket.

A 6A. ábra egy Westem-blot, amely anti-gp39 antitest jelenlétét mutatja a szérumban 7, 14 és 21 nappal az in vivő beadás után.

A 6B. ábra az in vivő beadást 7, 14 és 21 nappal követően a szérumban maradt anti-gp39 antitest százalékát mutató diagram.

A 7A., 7B. és 7C. ábrák folyamatos citometriás profilok, amelyek 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfociták CD40Ig-vel (A), mAb 4D9-8-cal (B) vagy mAb 4D9-9-cel (C) való festődését mutatják.

A 8A., 8B. és 8C. ábrák folyamatos citometriás profilok, amelyek cikloporin A jelenlétében tenyésztett 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfociták mAb 4D9-8-cal (A), mAb 4D9-9-cel (B) vagy CD40Ig-vel (C) való festődését mutatják.

A 9A. és 9B. ábrák folyamatos citometriás profilok, amelyek 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfociták CD40Ig-vel való festődését mutatják jelöletlen mAb 4D9-8 (A) vagy jelöletlen mAb 4D9-9 (B) jelenlétében.

A 10. ábra grafikus ábrázolása az oldható gp39 és IL-4 indukálta humán B-sejt-osztódás gátlásának, ha a sejteket antihumán gp39 mAb 4D9-8,4D9-9,24-31, 24-43, 89-76, vagy 89-79 jelenlétében tenyésztjük.

All. ábra grafikus ábrázolása egy allospecifikus kevert limfocitaválasz gátlásának, ha a sejteket antihumán gp39 mAb 24-31 vagy 89-79 jelenlétében tenyésztjük.

A tímuszfüggő (TD) antigénekre létrejövő humorális immunitás nemcsak egy antigénnel szemben specifikus antitesteket termelni képes B-limfocitákat igényel, hanem Th sejtek közreműködését is, amely nélkülözhetetlen a B-limfociták aktiválásához. Jóllehet a Tsegítősejt-funkció magában foglalja B-limfociták által felhasznált citokinek termelését, a B-sejtek aktiválásának Th sejt függősége nem szüntethető meg a B-sejtek exogén citokinekkel történő ellátásával. Inkább az érintkezésfüggő, a B- és Th sejtek közötti sejtmembrán közvetítette kölcsönhatás lényeges a humorális válaszok kiváltásában. Ebben a kölcsönhatásban részt vevő receptor-ligandum párt - CD40 és gp39 - azonosítottak. A CD40 jelen van a B-sejtek felületén és rendelkezik a kötődés képességével gp39-hez, amely Th sejtek felületén aktiválás révén keletkezik és a B-sejtek stimulációjához és végül specifikus antitestek termelődéséhez vezet. A CD40-gp39 kölcsönhatás megszakítása eszközként kínálkozik specifikus humorális immunválasz létrejöttének megakadályozására.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát a TD antigénnel szembeni in vivő humorális immunválasz gátlására szolgáló eljárások képezik. A humorális immunválaszt a Th sejt felületén levő, érintkezésfüggő, segítőeffektor-funkciót közvetítő molekula és a B-limfocita felszínén található ligandumja közötti kölcsönhatás megakadályozásával gátoljuk. Egy előnyben részesített megvalósítási módban úgy gátoljuk meg a humorális immunválaszt, hogy a T-sejt felületén levő gp39 és a TD antigénnek kitett B-sejt felületén található CD40 közötti kölcsönhatást az alanynak beadott gp39-antagonistával akadályozzuk meg in vivő. Egy megvalósítási módban a B-sejtet oly módon tesszük ki a TD antigén hatásának, hogy az antigént in vivő a gp39-antagonistával együtt adjuk be. Ez a TD antigén előnyösen egy terápiás szer, például egy terápiás antitest vagy drog, amelyet terápiás kezelés céljából adunk be a betegnek, és amely ellen a humorális immunválasz gátlása a szer te3

HU 220 192 Β rápiás hatékonyságának meghosszabbítását eredményezheti. Egy másik megvalósítási módban a TD antigén egy környezeti antigén, amelynek ki van téve az alany, például egy allergén, amelynél a humorális immunválasz káros az alanyra nézve, például allergiás reakciót vált ki. Ebben az esetben a humorális immunválasz gátlása terápiásán kedvező az alanynak.

I. gp39-antagonisták

A találmány eljárásai szerint egy gp39-antagonistát adunk be az alanynak, hogy megakadályozzuk a T-sejtek felületén levő gp39 és a B-sejtek felületén található gp39 ligandum kölcsönhatását. A gp39-antagonista definíció szerint az a molekula, amely megakadályozza ezt a kölcsönhatást. A gp39-antagonista lehet egy gp39 ellen irányuló antitest (például egy gp39 elleni monoklonális antitest), egy gp39 ellen irányuló antitest fragmentumai vagy származékai [például Fab vagy F(ab)’2 fragmentumok, kiméra antitestek vagy humanizált antitestek], egy gp39 ligandum oldható formái (például oldható CD40), egy gp39 ligandum fúziós fehérjéjének oldható formái (például oldható CD40Ig) vagy olyan gyógyászati hatóanyagok, amelyek megszakítják a gp39-CD40 kölcsönhatást.

A) Antitestek

Egy emlős (például egy egér, hörcsög vagy nyúl) immunizálható a gp39 fehéije vagy fehéijeffagmentum (például peptidfragmentum) immunogén formájával, amely az emlősben antitestválaszt vált ki. A felületén gp39-et kiválasztó sejt is használható immunogénként. Más immunogének tisztított gp39 fehéijét vagy fehérjefragmentumokat foglalnak magukban. A gp39 megtisztítható egy gp39-et kiválasztó sejttől standard tisztítási technikákkal; a gp39-cDNS [Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)] kifejezhető egy gazdasejtben, például baktérium- vagy emlőssejtvonalban, és a gp39 fehérje megtisztítható. gp39 peptidek szintetizálhatok a gp39 aminosavszekvenciájára alapozva [Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)]. A fehérje immunogénné tételének technikái, beleértve a hordozókhoz történő konjugálást vagy más technikákat, jól ismertek szakmai körökben. Például a fehérje beadható adjuváns jelenlétében. Az immunizáció előrehaladása a plazma vagy a szérum antitesttiterének meghatározásával követhető. Standard ELISA vagy más immunassay használható az immunogénnel, mint antigénnel az antitestek szintjének becslésére.

Az immunizáció követésével antiszérumokat kaphatunk, és ha szükséges, poliklonális antitesteket izolálhatunk a szérumokból. Monoklonális antitestek előállítására antitestet termelő sejteket (limfocitákat) nyerhetünk ki az immunizált állatból és fuzionáltathatjuk mielomasejtekkel standard szomatikus sejtfúziós eljárásokkal, ilyenformán halhatatlanná téve ezeket a sejteket és hibridóma sejteket nyerve. Ilyen technikák jól ismertek a szakmában. Például a hibridóma technika, amelyet eredetileg Kohler és Milstein [Natúré 256, 495-497 (1975)] fejlesztettek ki, és más technikák is, úgymint a humán B-sejt-hibridóma technika [Kozbar et al., Immunoi. Today 4, 72 (1983)], az EBV-hibridóma technika humán monoklonális antitestek előállítására [Colé et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy, Allén R. Bliss Inc., 77-96 (1985)] és kombinatorikus antitestkönyvtárak screenelésére [Huse et al., Science 246, 1275 (1989)]. A hibridóma sejteket immunkémiai módszerrel screenelhetjük olyan antitestek termelésére, amelyek specifikusan reaktívak a fehérjével vagy a peptiddel, és izolálhatjuk a monoklonális antitesteket.

Antitest kifejezés alatt, ahogyan itt használjuk beleértjük annak olyan fragmentumait, amelyek szintén specifikusan reaktívak a gp39 fehérjével vagy annak peptidjével vagy a gp39 fúziós fehérjével. Az antitesteket fragmentálhatjuk hagyományos technikák alkalmazásával, és a fragmentumok felhasználhatóságát screenelhetjük a teljes antitestekre fent leírtakkal azonos módon. Például F(ab)’2 fragmentumokat létrehozhatunk az antitest pepszines kezelésével. Az eredményül kapott F(ab)’2 fragmentumot kezelhetjük a diszulfidhidak redukálásával, hogy Fab’ fragmentumokat nyerjünk. A találmányban foglalt antitest továbbá felöleli az olyan bispecifikus és kiméra molekulákat, amelyek anti-gp39 résszel rendelkeznek.

Ha nem humán alanyban termelt antitesteket alkalmazunk terápiásán embereknél, azokat különböző mértékben idegenként ismeri fel a szervezet, és immunválasz keletkezhet a betegben. E probléma minimumra csökkentésének vagy megszüntetésének egy megközelítése - amely előnyösebb, mint az általános immunszuppresszió - kiméra antitestszármazékok, azaz nem humán állati variábilis régiót és humán konstans régiót kombináló antitestmolekulák előállítása. Kiméra antitestmolekulák magukban foglalhatják például egy egér, patkány vagy más fajból származó antitestből az antigénkötő domént humán konstans régiókkal. Kiméra antitestek előállítására változatos lehetőségeket írtak már le, és ezek felhasználhatók olyan kiméra antitestek elkészítéséhez, amelyek tartalmazzák a gp39-et felismerő immunglobulin variábilis régiót. Lásd például az alábbi hivatkozásokat [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1985); Takeda et al., Natúré 314, 452 (1985); Cabilly et al., US Patent No. 4,816,567; Boss et al., US Patent No. 4,815,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP 171496; European Patent Publication 0173494; United Kingdom Patent GB 2177096B]. Várható, hogy az ilyen kiméra antitestek kevésbé lennének immunogének a humán szervezetben, mint a megfelelő nem kiméra antitest.

Humán terápiás célra a gp39 fehérjével vagy pepiiddel specifikusan reaktív monoklonális vagy kiméra antitesteket tovább humanizálhatjuk olyan humán konstans régióval rendelkező kimérák előállításával, amelyekben a variábilis régiók részei, különösen az antigénkötő dómén konzervált keretrégiói humán eredetűek, és csak a hipervariábilis régiók nem humán eredetűek. Ilyen megváltoztatott immunglobulin-molekulákat a szakmában ismert különböző technikák bármelyi4

HU 220 192 Β kével előállíthatunk [például Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol. 92, 3-16 (1982)] és előnyösen a PCT nemzetközi szabadalmi együttműködés keretében közzétett WO92/06193 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, vagy az EP 0239400 európai szabadalmi leírás tanításai szerint állítjuk elő. Humanizált antitesteket előállíthatnak kereskedelmi céllal, például a Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain.

Egy másik módszer a gp39 fehérjével vagy peptiddel reaktív specifikus antitestek vagy antitestfragmentumok létrehozására az immunglobulint kódoló gének vagy azok részei által kódolt, baktériumokban gp39 fehérjével vagy peptiddel kifejezett, expressziós könyvtárak screenelése. Például komplett Fab fragmentumokat, VH régiókat és Fv régiókat fejezhetünk ki baktériumokban fág expressziós könyvtárak felhasználásával. Lásd például a következő hivatkozásokat [Ward et al., Natúré 341, 544-546 (1989); Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989) és McCafferty et al., Natúré 348, 552-554 (1990)]. Ilyen könyvtárak screenelése, például gp39 peptiddel, azonosíthatja a gp39cel reaktív immunglobulin-fragmentumot. Egy másik lehetőségként a Genpharm által kifejlesztett SCID-hu egér használható antitestek vagy azok fragmentumainak előállítására.

B) Oldható gp39 ligandumok

A humorális immunitás elnyomására beadható más gp39-antagonisták a gp39 ligandum oldható formái. A gp39 monovalens oldható liganduma kötődni tud a gp39-hez, ezáltal gátolva a gp39 és a B-sejteken levő CD40 közötti kölcsönhatást. Az oldható kifejezés azt jelenti, hogy a ligandum nincs állandóan a sejtmembránhoz kötve. Oldható gp39 ligandumot készíthetünk kémiai szintézissel vagy előnyösen rekombináns DNStechnikákkal. Előnyben részesített oldható gp39 ligandum az oldható CD40. Egy másik lehetőség oldható gp39 ligandumra lehet egy fúziós fehérje. Egy ilyen fúziós fehérje magában foglalja a gp39 ligandumnak legalább egy részét egy második molekulához hozzákötve. Például a CD40 kifejezhető fúziós fehérjeként immunglobulinnal (CD40Ig). Egy megvalósítási módban fúziós fehérjét állítunk elő, amely a CD40 egy extracelluláris dómén részének aminosavmaradékait tartalmazza, a Cyl CH₂ és CH₃ régióinak kapcsolásához megfelelő szekvencia aminosavmaradékaihoz csatlakoztatva, CD40Ig fúziós fehérje létrehozására [lásd például Linsley et al., J. Exp. Med. 1783, 721-730 (1991); Capon et al., Natúré 337, 525-531 (1989) és Capon US 5,116,964]. A fúziós fehérje előállítható kémiai szintézissel vagy előnyösen a CD40 cDNS-én alapuló rekombináns DNS-technikákkal [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403-1410 (1989)].

II. Antigének, melyekkel szemben elnyomjuk a humorális immunitást

A találmány olyan antigénekkel szembeni humorális immunitás elnyomására irányul, amelyek Th sejtek által közvetített érintkezésfüggő segítő szerepet igényelnek. A klasszikusan tímuszfüggő (TD) antigénként leírt antigéneket magában foglalja a találmány. A Th sejtek nyújtotta érintkezésfüggő „segítség” szükségessége adódhat a T-sejtek felületén levő gp39 és a B-sejtek felületén levő CD40 kölcsönhatásának szükségességéből. Ahogyan azt a jelen találmányban definiáltuk, a „TD antigén” kifejezés olyan antigének felölelésére irányul, amelyeknek az antigénnel szembeni humorális immunválasz kiváltásához szükségük van a T- és B-sejtek közötti gp39 és CD40 kölcsönhatásra. Általában a fehérjeantigének TD antigének. A találmány által felölelt TD antigének másik formája olyan molekula, amelyre fehérjéhez kötött hapténként hivatkozunk. Ebben az esetben a fehérje hordozóként működik, T-sejtes segítséget indukálva annak érdekében, hogy kiváltsa a hapténnel szembeni humorális immunválaszt.

A találmány szerinti TD antigén beadható az alanynak oldható formában, például oldható fehéije injektálásával vagy a TD antigén elhelyezkedhet a sejt felszínén, például lehet sejtfelszíni fehérje. A TD antigén beadható az alanynak gp39-antagonistával együtt vagy az alanyt kitehetjük egy környezeti TD antigén hatásának, például egy allergénnek. Előnyben részesített megvalósítási módokban a TD antigén egy olyan ágens, amelyet terápiás céllal adunk az alanynak. Ez az ágens lehet például terápiás antitest vagy egy terápiás drog más formája, amely TD antigén. A humorális immunválasz gátlása például egy terápiás antitesttel szemben meghosszabbíthatja annak in vivő hatásosságát, megelőzve a terápiás antitest eltűnését az alanyból. Terápiás ágensként működő kis molekulák szintén lehetnek célantigének, amelyekkel szemben elnyomjuk a humorális immunválaszt, ha ezeket a - hapténként funkcionáló molekulákat olyan fehérjével vagy más hordozóval adjuk be, amely T-sejtes segítőfünkciót vált ki a B-sejtek aktiválására; a humorális immunválasz elnyomása ezekkel a terápiás ágensekkel szemben hasonlóképpen meghosszabbíthatja ezek hatásosságát.

A találmány módszerei oly módon gondoskodnak a TD antigénekkel szembeni humorális immunitás elnyomásáról, hogy közben nem befolyásolják a tímusztól független II típusú (TI—2) antigénekre adott válaszokat. A TI-2 antigének közé poliszacharidok és lipidek tartoznak, amelyek képesek nemspecifikusan aktiválni a B-sejteket poliklonális módon. Ahogyan azt már definiáltuk a találmányban, a „TI-2 antigén” kifejezés olyan antigének felölelésére irányul, amelyeknek nincs szükségük a T- és B-sejtek közötti gp39-CD40 kölcsönhatásra az antigénnel szembeni humorális immunválasz kiváltásához. A találmány módszert nyújt annak azonosítására, vajon egy antigén TD vagy TI-2 típusú antigén, a találmányban definiált módon meghatározva, hogy az antigénre adott humorális immunválasz gátolható-e gp39-antagonistával.

III. A humorális immunitás elnyomása

A találmány tárgyát TD antigénnel szembeni humorális immunválaszt gátló módszerek képezik. A humorális immunválasz lehet elsődleges immunválasz TD antigén hatásának történő első kitétel esetén, vagy másodlagos immunválasz az antigénnel történő ismételt talál5

HU 220 192 Β kozás esetén. Az antitestek egy vagy több izotípusának termelődését gátolhatjuk. Az elsődleges humorális immunválasznál, ahol túlnyomórészt IgM keletkezik, elsősorban az IgM-termelődést gátoljuk. A másodlagos immunválasznál több különböző izotípus, beleértve az IgM-et, IgG-ét és IgE-t, termelődését nyomhatjuk el.

A találmány TD antigénnel szembeni humorális immunitás meghosszabbított szuppressziójára szolgáltat módszereket. A „meghosszabbított szuppresszió” kifejezés, ahogyan itt használjuk, azt jelenti, hogy egy TD antigénnel szembeni antitesttermelődés szuppresszióját fenntartjuk, miután a gp39-antagonista in vivő beadása már befejeződött.

IV. gp39-antagonisták beadása

A TD antigénnel szemben adott humorális immunválasz gátolható az itt leírt módszerek szerint, a TD antigén hatásának kitett alanynak történő gp39-antagonisták beadásával. Egy megvalósítási módban a gp39-antagonistát a TD antigénnel kapcsoltan adjuk be. A gp39-antagonistát előnyösen a TD antigénnel egyidejűleg adjuk be, de beadhatjuk a TD antigén beadása előtt vagy közvetlenül a TD antigén után annyi idővel, hogy a gp39antagonista beadása megtörténjen mielőtt bekövetkezik a TD antigén kiváltotta B-sejt-aktiváció. Más megvalósítási módokban az alanyt környezeti antigén hatásának tesszük ki. Ebben az esetben a gp39-antagonistát az antigénbehatást követően közvetlenül kell in vivő beadni, elég rövid időn belül ahhoz, hogy megelőzzük a B-sejtaktivációt.

A találmányban foglalt antagonistákat gyógyászati beadásra alkalmas biológiailag kompatibilis formában adjuk be az alanyoknak in vivő, hogy elnyomjuk a humorális immunválaszt. Az „ in vivő beadásra alkalmas biológiailag kompatibilis forma” a beadandó antagonistának olyan formáját jelenti, amelyben bármilyen toxikus hatást ellensúlyoz a fehéije terápiás hatása. Az alany kifejezés olyan élő organizmusok felölelésére irányul, amelyekben immunválasz váltható ki, például emlősökre. A példák alanyokra magukban foglalják az embereket, kutyákat, macskákat, egereket, patkányokat és ezek transzgén fajait. Olyan antagonisták beadása, amelyek gátolják a gp39 és CD40 közötti kölcsönhatást, ahogyan azt itt leírtuk, történhet bármilyen gyógyszerformában és gyógyászatilag elfogadható hordozóval. A találmány szerinti terápiás összetételek terápiásán aktív mennyiségének beadását úgy definiáljuk mint a kívánt eredmény eléréséhez elengedhetetlenül szükséges dózisokban és ideig adott hatásos mennyiséget. Például egy, a gp39 és CD40 közötti kölcsönhatást megakadályozó antagonista terápiásán aktív mennyisége változhat olyan faktorok szerint, mint az egyén betegségének stádiuma, életkora, neme és testsúlya, és az antagonistának az egyénben a kívánt válasz kiváltására való képessége. A dózis regimat úgy kell beállítanunk, hogy biztosítsuk a terápiás válasz optimumát. Például többfelé elosztott adagot adhatunk be naponta vagy arányosan csökkenthetjük az adagot, ahogyan azt a terápiás helyzet megkívánja.

Az aktív vegyület (például antagonista) beadható a szokásos módon, úgymint injekcióval (szubkután, intravénásán stb.), szájon át, inhaláció útján, bőrön keresztül vagy végbélbe adva. A beadás útvonalától függően az aktív komponenst bevonhatjuk egy anyaggal, hogy megvédjük a vegyületet enzimek, savak és más természetes körülmények hatásától, amelyek inaktiválhatják a vegyületet.

A gp39 és CD40 kölcsönhatását megakadályozó antagonista nem parenterális úton történő beadásakor szükség lehet az antagonista becsomagolására vagy azt az inaktiválástól megvédő anyag egyidejű beadására. Például egy antagonista beadható az egyénnek egy megfelelő hordozóban vagy hígítószerben enziminhibitorokkal egyidejűleg, vagy egy megfelelő hordozóban, úgymint liposzómában. Gyógyászatilag elfogadható hígítószerek só- és vizes pufferoldatokat foglalnak magukban. Az enziminhibitorok felölelik a pankreász tripszininhibitort, diizopropil-fluorofoszfátot (DEP) és a trazilolt. A liposzómák közé tartoznak a víz-olaj-víz emulziók ugyanúgy, mint a hagyományos liposzómák [Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)].

Az aktív vegyületet beadhatjuk parenterálisan vagy intraperitoneálisan is. Készíthetünk diszperziókat glicerinben, folyékony polietilénglikolban és ezek keverékeiben és olajokban. Közönséges tárolási és felhasználási körülmények között ezek a készítmények tartalmazhatnak tartósítószert a mikroorganizmusok növekedésének megakadályozására.

Az injektálásra alkalmas gyógyszerkészítmények magukban foglalnak steril vizes oldatokat (ahol vízoldható) vagy diszperziókat és steril porokat a steril injektálható oldatok vagy diszperziók azonnali elkészítéséhez. A készítménynek minden esetben sterilnek kell lennie és oly mértékig folyékonynak, hogy könnyen injektálható legyen. Stabilnak kell lennie az előállítás és tárolás körülményei között és védettnek kell lennie mikroorganizmusok, úgymint baktériumok és gombák okozta fertőzésektől. A hordozó lehet egy oldószer vagy diszperziós tápoldat, amely például vizet, etanolt, poliolt (például glicerint, propilénglikolt és folyékony etilénglikolt és hasonlókat) és ezek alkalmas keverékeit tartalmazza. A megfelelő folyékonyságot fenntarthatjuk például bevonószerek, úgymint lecitin alkalmazásával, diszperziók esetében a kívánt részecskeméret megtartásával és felületaktív anyagok alkalmazásával. A mikroorganizmusok támadása elleni védelem elérhető különböző antibakteriális és antifúngális szerek, például parabének, klorobutanol, fenol, aszkorbinsav, timerozal és hasonlók felhasználásával. Sok esetben előnyben részesítjük izotóniás szerek, például cukrok, polialkoholok, úgymint mannitol, szorbitol és nátrium-klorid jelenlétét a készítményben. Az injektálható készítmények meghosszabbított abszorpcióját idézhetjük elő olyan szer bevitelével a kompozícióba, amely késlelteti az abszorpciót, például alumínium-monosztearáttal és zselatinnal.

Steril injektálható oldatokat állíthatunk elő az aktív vegyület (például a gp39 és CD40 közötti kölcsönhatást megakadályozó antagonista) kívánt mennyiségének bevitelével egy megfelelő oldószerbe a fent felsorolt összetevők egyikével vagy kombinációival, szükség szerint, szűréses csírátlanítást követően. A diszper6

HU 220 192 Β ziókat általában az aktív vegyületnek egy olyan steril hordozóba történő beépítésével állítjuk elő, amely tartalmazza az alap diszperziós tápoldatot és a szükséges egyéb komponenseket a fent felsoroltakból. Steril injektálható oldatok készítésére szolgáló steril porok esetén az előnyben részesített előállítási módszerek a vákuumszárítás és fagyasztva szárítás, amelyek az aktív összetevőt (például antagonistát) és valamilyen hozzáadott kívánt komponenst, annak előzőleg sterilre szűrt oldatából por alakban szolgáltatja.

Ha az aktív vegyület megfelelően védve van, ahogyan azt fent leírtuk, a fehérjét beadhatjuk szájon át, például egy inért hígítóval vagy egy asszimilálható, ehető hordozóval. A „gyógyászatilag elfogadható hordozó”, ahogyan itt használjuk, magában foglal mindennemű oldószert, diszperziós tápoldatot, bevonószereket, antibakteriális és antifungális szereket, izotóniás és abszorpciós késleltetőágenseket, és hasonlókat. Ilyen tápoldatok és szerek alkalmazása gyógyászatilag aktív anyagokhoz jól ismert a szakmában. Kivéve, ha bármilyen hagyományos tápoldat vagy szer összeférhetetlen az aktív vegyülettel, azok alkalmazása a terápiás összetételekben megfontolandó. Kiegészítő aktív vegyületek is bevihetők a készítményekbe.

Különösen előnyös a parenterális készítmények egységnyi adagokba történő formulázása a könnyű beadhatóság és a dozírozás egységesítése céljából. Az egységnyi adagolás az itt alkalmazottak szerint fizikailag különálló egységekre vonatkozik, amelyeket egységnyi adagokban használunk fel emlősalanyok kezelésére; minden egység az aktív vegyületnek előre meghatározott mennyiségét tartalmazza, amelyet a kívánt terápiás hatás elérésére - a szükséges gyógyszerészeti hordozóval társítva - számítunk ki. A találmány szerinti adagolási egységekre vonatkozó specifikáció közvetlenül függ a) az aktív vegyület egyedi tulajdonságaitól és az elérendő különleges terápiás hatástól, és b) egy ilyen, egyedek érzékenységének kezelésére szolgáló, aktív vegyület összeállításában rejlő szakmai korlátoktól.

V. gp39-antagonisták és más immunszuppresszív anyagok együttes beadása

Kimutatták, hogy a CD28 jelfelismerőnek - amely egy együtt stimuláló molekula a Th sejtek felületén oldható CTLA-4 általi akadályozása szintén elnyomja a TD antitestválaszokat [Linsley et al., Science 257, 792 (1992)], és blokkolja a xenogén transzplantátumkilökődést [Lenschow et al., Science, 257, 789 (1992)]. Az anti-gp39 nyújtotta hatáshoz hasonlóan a CTLA-4 meghosszabbított immunszuppressziós állapotot váltott ki. Mivel az anti-gp39 és a CTLA-4 a Immorális immunválasz különböző szintjein fejtik ki immunszuppresszív hatásukat, e két immunszuppresszív gyógyszer additív vagy szinergén immunszuppresszív hatást fejthet ki az immunitásra.

Az allergiás válaszokat az IgE antitestek közvetítik. Az IgE-válaszok létrejöttéhez az IL-4 citokinre van szükség. TD antigénnel szembeni IgE-válaszok gátlása sokkal hatásosabban történhet egy gp39-antagonista és egy IL-4 inhibitor, például anti-IL-4 antitest együttes beadásával.

A találmányt a továbbiakban a következő, az oltalmi kör korlátozását nem jelentő példákkal szemléltetjük. A bejelentés egészében idézett minden hivatkozás és közzétett szabadalmi bejelentés tartalmát itt építettük be referenciaként. Az ugyanezzel a dátummal, ezúttal Randolph J. Noelle néven és „Methods fór Inducing Antigen-Specific T Cell Tolerance” („Eljárások antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kiváltására”) címmel benyújtott szabadalmi bejelentés tartalmát ide építettük be referenciaként.

A példákban a következő módszertant alkalmaztuk. Anyagok és módszerek

Állatok: 6-8 hetes nőstény Balb/c egereket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) használtunk a találmányban bemutatott in vivő kísérletekhez. Az állatokat specifikus, patogénektől mentes állattartás körülményei között tartottuk a Dartmouth Medical Schoolban.

Helper T-sejt-klónok (Thi): A D1.6-ot, egy I-A^d restrikciósán hasított nyúl-Ig-specifikus Thi kiónt [Kurt-Jones et al., J. Exp. Med. 166, 1774 (1987)] Dr. Dávid Parkertől kaptuk a University of Mass at Worcesterből. A találmányban a D1.6-ot Thl-nek nevezzük.

Reagensek és antitestek: MRl-et, hörcsög-antiegér-gp39 mAb-t [Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6550 (1992)] tisztítottunk-DEAE-HPLC-vel hasüregi folyadékból. Kontroliantitestként használt hörcsög-Ig-t (Híg) hasonlóan tisztítottunk hörcsögszérumból (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbuty, NY). RG7/7.6.HL-t, egér-antipatkány-κlánc (erősen keresztreaktív a hörcsög-K-lánccal) antitestet (RG7) [Springer et al., Hybrid 1, 25 (1982)] konjugáltunk HRPO-val vagy FITC-vel és felhasználtuk másodlagos reagensként MR1 és Híg kimutatására. Affinitással tisztított kecske-antiegér-IgMet, -IgGj-et, -IgG_2at, IgG_2b-t és IgG₃-at (Southern Biotechnology, Birmingham Al) használtunk detektáló antitestekként az antigénspecifikus ELISA-tesztekben ugyanúgy, mint a teljes IgM és IgGj ELISA-ban. BlE3-at, (amelyet Dr. T. Waldschmidt az Iowa Egyetemről bocsátott rendelkezésre) egy monoklonális antiegér-IgE-t használtunk detektáló antitestként az IgE-anti-KLH ELISA-hoz. Kiméra L6-ot (Chi-L6), az L6 tumorantigénre [Hellstrom I., Can. Rés. 46, 3917 (1986)] specifikus, humanizált IgG_ret a Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle WA bocsátotta rendelkezésre. Anti-CD4, GK 1.5 [Wilde et al., J. Immunoi. 131, 2178 (1983)] hasüregi folyadék HPLC-es tisztításával készült. A birkavörösvérsejteket (sheep red blood cells=SRBC) a Colorado Serum Co.-tól (Denver, CO) szereztük be. Az anti-SRBC plaque assay-hez (tarfoltmódszerhez) használt tengeri agarózt az FMC Corporationtől (Rockland MA) vásároltuk. A bébi nyúl teljes mennyiségét a Cedarlane-től (Homby, Ontario Canada) szereztük be. KLH, keyhole limpet hemocianint (a Megathura crenulata tapadó tengeri csigából) a Calbiochem (LaJolla, CA) cégtől szereztünk be. Komplett Freund-féle adjuvánst (complete Freund’s adjuvant=CFA) az immunizáláshoz a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO) vásároltuk. A TNP-SRBC-ét,

HU 220 192 Β

TNP-KLH-át és TNP-BSA-t az előzőleg leírtak szerint [Snow és Noelle, Immunoi. Rév. 99, 173 (1987)] készítettük el.

Immunizációk az in vivő elsődleges és másodlagos antitestválaszok létrehozására

Elsődleges immunválaszok: SRBC-re vagy TNP-SRBC-re adott elsődleges immunválasz kiváltására egereket immunizáltunk 200 μΐ 1%-os SRBC- vagy TNP-SRBC-szuszpenzióval (iv.=intravénásán). Az IgM-, anti-SRBC-választ 5 nappal az antigén beadása után határoztuk meg módosított Jeme-féle tarfoltmódszerrel [Jeme et al., Transplant Rév. 18, 130 (1974)]. Az IgM-anti-TNP-válaszokat ELISA-val mértük a 6. napon. Chi-L6 heterológ immunglobulinra adott elsődleges immunválaszt hoztunk létre egerenként 100 pg, timsóra felvitt Chi-L6-tal ip. (ip.=intraperitoneálisan) történő immunizálással. A szérum IgM-antiChi-L6 antitestválaszt 7 nap elteltével mértük. TNP-Ficoll-ra adott elsődleges immunválaszt hoztunk létre 25 pg TNP-Ficoll-lal ip. történő immunizálással. Az IgM-anti-TNP-választ a 6. napon mértük ELISA-val. Másodlagos immunválaszok: KLH-ra adott másodlagos humorális immunválaszok létrehozására állatokat immunizáltunk CFA adjuvánsra felvitt KLH-val (50 pg; ip.). Az egereket ezt követően 10 pg oldható KLH-nak tettük ki (ip.) három hónappal később. Az anti-KLH antitestválaszt a 7. napon mértük az immunizált egerek szérumából izotípus-specifikus ELISA alkalmazásával. Chi-L6-ra adott másodlagos antitestválaszt hoztunk létre azáltal, hogy Chi-L6-tal immunizált egereket tettünk ki 10 pg oldható Chi-L6 hatásának ip. A szérum IgG_ranti-Chi-L6 antitestválaszt 7 nappal később mértük.

Anti-gp39-kezelés: Steril, HPLC-vel tisztított antigp39-et (MRl-et) vagy HIg-ét (mint antitestkontrollt) adtunk be (ip.) az immunizálást vagy a kezelést követő 0., 2. és 4. napon, ahogyan azt minden kísérlemél jelezzük.

Antigénspecifikus ELISA-k: Az antigénspecifikus IgM, IgG^ IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ és IgE antitesttitereket izotípus-specifikus ELISA-k alkalmazásával határoztuk meg. Röviden, az antigént (1 mg/ml KLH, Chi-L6, TNP₁₆-BSA vagy TNP₂-BSA PBS-ben) flexibilis polivinil mikrotiteredényekre abszorbeáltuk, egy éjszakán át 4 °C-on tartottuk. A lemezeket mostuk és PBS-1% FCS-nátrium-aziddal blokkoltuk. A hígított szérummintákat 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A mintákat mostuk és az antigénspecifikus antitesttitert a következő, alkalikus foszfatázzal konjugált detekciós antitestek valamelyikével határoztuk meg: kecske-antiegérIgM, -IgG,, -IgG_2a, -IgG_2b vagy -IgG₃ (Southern Biotechnology, Birmingham, Al). Az IgE-specifikus ELISA-t biotinnal konjugált B1E3 és azt követő alkalikus foszfatázos avidin (South San Francisco, CA) alkalmazásával detektáltuk. Minden ELISA-t az alkalikus foszfatáz foszfatázszubsztráttal (Sigma Chemical, Co., St. Louis, MO) történő reakciójával fejlesztettünk ki. A lemezeket egy Dynatech MR700 ELISA-leolvasón értékeltük ki 410 nm-en. Az egységek a standard immunszérum titrálási görbéjén alapuló tetszőleges értékeket mutatnak. Minden kísérleti csoportot 1:100-tól 1:100 000-ig titráltunk, és a titert többszörös pontanalízis alapján állapítottuk meg. Az anti-KLH, antiChi-L6 és anti-TNP antitestek szintje a nem változtatott kontroliokban a kimutatási határ alatt volt. Szérum-anti-gp39 kimutatása

Érintetlen anti-gp39 mennyiségi meghatározása antigp39-cel kezelt egerek szérumában: 750 pg anti-gp39-et (250 pg-ot a 0., 2. és 4. napon) kapott egerekből szérumot nyertünk ki az anti-gp39-cel történt kezelés kezdetét követő 7., 14. és 21. napon. A szérumot 7,5%-os SDSgélen futtattuk nem redukáló körülmények között, átvittük nitro-cellulózra és HRPO-val konjugált RG7 blotnak vetettük alá. Kemilumineszcenciás detektálást követően a 150-165 kD-nak megfelelő foltokat egy Apple Scanner segítségével letapogattuk és digitalizáltuk az Image 4.1 szoftverprogram alkalmazásával.

Biológiailag aktív anti-gp39 kimutatása kezelt egerek szérumában: Anti-CD3-mal aktivált Thl sejteket, amelyek gp39-et fejeznek ki, festettünk meg 750 pg antigp39-et (250 pg-ot a 0., 2. és 4. napon) kapott egerek szérumának hígított oldataival, a szérumban maradt biológiailag aktív gp39 mennyiségének meghatározására. Az anti-gp39-et tartalmazó szérumok titrálásait aktivált Thl sejtklónokkal inkubáltuk 30 percig 4 °C-on, amelyet mosás és FITC-RG7-tel történő inkubálás követett 30 percig 4 °C-on. MFI vs anti-gp39 koncentráció standard görbét tisztított anti-gp39 felhasználásával vettünk fel. A mintákat Becton Dickinson FACScan-en határoztuk meg, és a szérumban maradt anti-gp39-százalékot az anti-gp39 standard görbére vonatkoztatva számítottuk ki. A szérumban levő anti-gp39-szintet a 7. napon 100%-ra becsültük.

Helper T-sejtek adoptív transzferé: Egereket SRBCvel (200 pl 1%-os SRBC, iv.) immunizáltunk és antigp39-et vagy HIg-ét (250 pg-ot a 0., 2, és 4, napon) adtunk be. A 7. napon lépsejteket (splenocytes) távolítottunk el nem immunizált vagy SRBC-vel immunizált egerekből, a vértesieket leszívtuk, mostuk és besugárzott (600 rád) befogadóegyedekbe vittük át (iv., 50xl0⁶/egér) immun-B-sejt-forrásként szolgáló TNP-KLH-val feltöltött (TNP-KLH-CFA, 50 pg, ip.) egerekből nyert 50 χ 10⁶ lépsejttel együtt vagy a nélkül. A transzfer ideje alatt az egereket TNP-SRBC-vel (200 pl 1%-os TNP-SRBC, iv.) immunizáltuk. A szérum-IgGj-anti-TNP-titert a transzfert követő 6. napon állapítottuk meg.

1. példa

Anti-gp39 gátolja az eritrocita antigénekre adott elsődleges antitestválaszok létrejöttét

A HIM-mel rendelkező betegekben megfigyelt megromlott TD immunitás ugyanúgy, mint az anti-gp39 és CD40-Ig potenciális gátlóhatása a Th-fuggő B-sejt-aktiválásra in vitro, szolgáltatta az alapot az anti-gp39-nek a humorálisan közvetített immunitásra in vivő gyakorolt potenciális immunszuppresszív hatásai tanulmányozására. A gp39-CD40 kölcsönhatásoknak az elsődleges TD humorális immunválaszokban játszott szerepét vizsgálandó, meghatároztuk az anti-gp39 in vivő beadásának

HU 220 192 Β hatását a birkavörösvértestekre (SRBC) adott elsődleges antitestválaszra. Állatokat immunizáltunk SRBC-vel és anti-gp39 mAb-ét (vagy kontroll- HIg-ét) adtunk be négynapos időszak alatt. Az 5. napon megállapítottuk az anti-gp39-cel kezelt, a HIg-vel kezelt és a kontrollegerek elsődleges anti-SRBC antitestválaszát. Az összesen 1,5 mg anti-gp39-et (500 pg/egér a 0., 2. és 4. napon) kapott egerek IgM-anti-SRBC plakk-képző sejt (plaque forming cell=PFC) válasza 99%-kal csökkent a kontroll- vagy HIg-vel kezelt egerek anti-SRBC PFC-válaszaival összehasonlítva (IA. ábra). Ezenkívül olyan kevés anti-gp39 beadása, mint 300 pg/egér (100 pg/egér a 0., 2. és 4. napon) az anti-SRBC elsődleges immunválaszt 66%-kal csökkentette. E kísérletekből kapott eredmények azt mutatják, hogy az anti-gp39-kezelés csökkenti az elsődleges antitestválaszokat in vivő.

Ezt követően az anti-gp39-nek az SRBC-re adott elsődleges humorális immunválaszra gyakorolt immunszuppresszív hatása időtartamát vizsgáltuk. SRBC-vel immunizált egereket kezeltünk anti-gp39-cel 4 napon keresztül, és különböző későbbi időpontokban meghatároztuk az elsődleges anti-SRBC-válasz emelésének képességét. A kísérleteknek ebben a csoportjában minden állatot a 0. napon immunizáltunk SRBC-vel, és az antigp39-et vagy HIg-ét a 0., 2. és 4. napon adtuk be. Az IgM-anti-SRBC PFC-választ egy csoportnál az 5. napon mértük meg. További SRBC-immun csoportokat tettünk ki SRBC-nek a 7. és 14. napon. Minden antigénnel szembeni kihívást követően 5 nappal (12. és 19. napon) megmértük az IgM-anti-SRBC PFC-választ. Egy ilyen kísérlet eredményeit ábrázoljuk az IB. ábrán. Ahogyan az 1A. ábrán látható, az elsődleges antiSRBC-válaszok 80-90%-ban gátoltak voltak 5 nappal az anti-gp39 beadásának kezdete után. Ezenkívül az anti-gp39-kezelést követő 12. és 19. napon az elsődleges anti-SRBC-válaszok szintén gátoltak voltak, több mint 90%-ban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy rövid anti-gp39-kezelés az elsődleges antitestválaszok meghosszabbított gátlását eredményezi.

2. példa

Anti-gp39 gátolja a másodlagos anti-KLH antitestválaszok létrejöttét

Az elsődleges antitestválaszokat vizsgáló kísérletek azt sugallják, hogy a gp39-CD40 kölcsönhatás kritikus szerepet játszik az elsődleges humorális immunitás kiváltásában. Ezek a kísérletek azonban nem adnak felvilágosítást arról, vajon gp39-függő CD40 jeladás szükséges-e a másodlagos antitestválaszok létrejöttéhez. Ezért tehát meghatároztuk anti-gp39 beadásának hatását az oldható KLH-kihívásra adott másodlagos immunválaszra, KLH-immun egerekben.

Az elsődleges anti-SRBC PFC-választ csökkentő anti-gp39-beadás ütemtervét felhasználva, kísérleteket terveztünk az anti-gp39-kezelés másodlagos antitestválaszokra kifejtett hatásainak értékelésére. Ezekben a kísérletekben KLH-immun egereket (3 hónappal korábban CFA-val és KLH-val immunizálva) tettünk ki oldható KLH (10 pg/egér/iv.) hatásának. Az antigén hatásának való kitétel napján (0. nap) az egereknek 250 pg anti-gp39-et vagy HIg-ét is adtunk, ezt követte antigp39 vagy Híg adása a 2. és 4. napon. A KLH-kihívást követő 7. napon (2. ábra, A tábla) és 14. napon (2. ábra, B tábla) vért vettünk az egerektől, és meghatároztuk az IgM, IgG_b IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ és IgE antitestek titereit. Az eredmények azt mutatják, néhány pontban: 1. az oldható KLH-nak történő kitétel maradandó másodlagos immunválaszt váltott ki, amely egészen a 14. napig fennállt; 2. az anti-gp39 beadása szignifikánsan csökkentette az izotípusok másodlagos anti-KLH-válaszát ugyanolyan mennyiségű Híg beadásával összevetve; 3. az anti-gp39 immunszuppresszív hatásai kitartónak mutatkoztak az anti-gp39-kezelés kezdete után legalább 14 napig. Összefoglalva, e kísérletek eredményei azt mutatják, hogy az elsődleges humorális immunválaszokhoz hasonlóan, a másodlagos humorális immunválaszokat is blokkolta az anti-gp39.

3. példa

Anti-gp39 gátolja heterológ Ig-re adott antitestválaszok létrejöttét

Az 1. ábrán ábrázolt kísérletek mutatják az antigp39 immunszuppresszív aktivitását egy erősen immunogén részantigénre, az SRBC-re adott elsődleges válasz során. Az eritrociták celluláris természete egyedivé teszi azokat erős immunválaszok kiváltásának képességére. Heterológ Ig-molekulák osztják ezt a magasan immunogén tulajdonságot, ezért egy további modellantigénrendszert szolgáltatnak az anti-gp39-kezelésnek az elsődleges és másodlagos antitestválaszokra kifejtett hatása vizsgálatára. Állatokat immunizáltunk Chi-L6 heterológ Ig-molekulával, egy humanizált egér-antitumorsejt mAb-vel, és anti-gp39-cel vagy kontroll-HIgvel kezeltük azokat. 7 nap után szérumot gyűjtöttünk, és meghatároztuk a termelt IgM-anti-Chi-L6 antitesteket. Ezenkívül egereket tettünk ki Chi-L6 hatásának 14 nappal a kezdeti immunizálás és anti-gp39-kezelés után, és meghatároztuk az IgG_ranti-Chi-L6 antitestképződést a 21. napon. A 3. ábra mutatja egy ilyen kísérlet eredményeit. A Chi-L6-ra adott elsődleges antitestválasz az anti-gp39-cel kezelt egerekben több mint 90%-ban gátolt, összehasonlítva a HIg-vel kezelt egerekkel. Ezenfelül a Chi-L6-ra adott másodlagos IgGj-válasz hasonlóan gátolt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az anti-gp39-kezelés a TD antigénnek egy második típusára, heterológ Ig-re adott elsődleges és másodlagos antitestválaszokat ugyanolyan hatékonyan csökkenti, mint ahogyan elnyomja az eritrocitákra és oldható fehérjeantigénekre adott válaszokat.

4. példa

Anti-gp39 nem gátolja a T-töl független II. típusú antigénre, TNP-Ficoll-ra adott elsődleges antitestválaszok létrejöttét

Bár az előző kísérletek azt mutatják, hogy az antigp39 hatásosan blokkolja a TD antigénekre adott elsődleges és másodlagos antitestválaszokat in vivő, az nem tisztázott, vajon a gp39-CD40 kölcsönhatás szerepet játszik-e a TI antigénekre adott humorális válaszok kiváltásában. A csatolt iratokban bemutatott adatok azt

HU 220 192 Β mutatják, hogy a TI II. típusú antigénnel, TNP-Ficolllal történő immunizálás Th sejtek általi gp39-kifejeződést eredményez in vivő. Annak kiderítésére, vajon szükséges-e a gp39-CD40 kölcsönhatás a TI antigénre adott antitestválaszok létrejöttéhez, anti-gp39-kezelés hatását becsültük fel TNP-Ficoll-lal immunizált egerekre. TNP-Ficoll-lal vagy TNP-SRBC-vel immunizált egereket kezeltünk anti-gp39-cel vagy HIg-vel és 6 nap után meghatároztuk az IgM-anti-TNP antitestválaszt. A 4A. ábra mutatja, hogy a TNP-SRBC TD antigénnel immunizált állatok szignifikáns anti-TNP szérumantitestválaszt adnak. Ahogyan az előzőleg leírt kísérletekből előre jósolható volt, az anti-gp39-kezelés erőteljesen gátolja az ezekben az egerekben előidézett elsődleges anti-TNP-választ. Ezzel egyezően, a TNP-Ficoll-lal immunizált egerek magasabb titerű anti-TNP antitestválaszt értek el (4B. ábra); az anti-gp39-kezelés azonban nem gátolta a TNP-Facoll-ra adott antitestválaszt. Ezekből a kísérletekből kapott eredmények azt mutatják, hogy a TD antigénekre adott válaszoktól eltérően az anti-gp39 nem blokkolja a TNP-Facoll-ra adott humorális válaszok létrejöttét, azt sugallva, hogy a TI antigénekre adott válaszok valószínűleg nem gp39-függőek.

5. példa

Anti-gp39 beadása funkcionálisan nem semmisíti meg az SRBC-specifikus Th sejteket

Az előző kísérletekből ismert, hogy anti-gp39 megakadályozza a TD humorális immunitást; a mechanizmus azonban, amellyel az anti-gp39-kezelés elnyomja a humorális válaszokat, nem tisztázott. Az anti-gp39 okozta immunszuppressziót közvetítheti: 1. a gp39-et hordozó T-sejtek negatív jeladása Th anergiát okozva;

2. az anti-gp39-et hordozó CD4+ T-sejtek mAb-közvetítette citotoxikus megsemmisítése; és/vagy 3. a gp39 CD40-hez való kötődésének blokkolása. Kísérletsorozatot végeztünk, hogy közelebbről betekintsünk, ezek közül a mechanizmusok közül melyik működhet közre az anti-gp39-terápiánál megfigyelt, elnyújtott immunszuppresszióban. Annak a lehetőségnek a felderítésére, hogy antigénspecifikus Th sejtek megsemmisültek vagy anergizálódtak anti-gp39-terápia következtében, gp39-cel kezelt egerekből adoptív transzferrel mértük az antigénspecifikus Th funkciót. Röviden, az egereket SRBC-vel immunizáltuk (SRBC-specifikus Th feltöltés) és anti-gp39-et vagy HIg-ét (250 pg/egér a 0., 2. és 4. napon) adtunk be. 7 nap után nem immunizált egerek lépsejtjeit vagy SRBC-immun lépsejteket HIg-vel kezelt vagy anti-gp39-cel kezelt egerekből vittünk át adoptívan, TNP-immun lépsejtekkel - mint TNP-vel töltött B-sejtek fonásaival - rendelkező befogadó egerekbe. Az egereket egyidejűleg TNP-SRBC hatásának tettük ki, és megállapítottuk az IgG_ranti-TNP-titert az 5. napon. SRBC-vel feltöltött T-segítősejtekre szükség van másodlagos anti-TNP-válasz kiváltásához a befogadó egerekben. Ezt mutatja az a tény, hogy azok a befogadó egerek, amelyek nem immunizált donortól származó lépsejteket kaptak, lényegesen kevesebb IgGj-antiTNP-t termeltek, összehasonlítva azokkal az egerekkel, amelyek SRBC-vel feltöltött állatoktól kaptak lépsejteket (5. ábra). Még fontosabb, hogy ezeknek a kísérleteknek az eredményei feltárták, a HIg-vel kezelt és antigp39-cel kezelt egerekből származó SRBC segítőaktivitás hasonló, jelezve, hogy az anti-gp39-kezelés nem változtatja meg a Th funkciót, vagy nem blokkolja a Th sejtek feltöltődését. Továbbá antigénre fogékony Th sejtek nem semmisültek meg vagy nem anergizálódtak az anti-gp39-kezelés eredményeként, mivel a transzfer során helpereffektor funkciót szolgáltattak.

6. példa

Hörcsög-anti-gp39 in vivő kitisztulása

Korábbi tanulmányok megállapították, hogy antigp39 (MR1) blokkolja a gp39 CD40-hez történő kötődését [Noelle et al., Immunoi. Tód. 13, 431 (1992)] és ily módon alátámasztják azt a hipotézist, hogy az antigp39 in vivő immunszuppresszív hatása a gp39-CD40 kölcsönhatás blokkolásának tulajdonítható. Ha feltételezzük e hipotézis helyességét, az anti-gp39-beadásnál megfigyelt hosszú ideig tartó immunszuppresszióhoz szükség van az anti-gp39 folyamatos jelenlétére a gazdaszervezetben. Annak meghatározására, hogy az anti-gp39 kimutatható-e az alatt az időszak alatt, amíg az immunszuppresszió megnyilvánul, meghatároztuk az anti-gp39 in vivő kitisztulási arányát a szérumból. Egereknek antitesteket (3x250 pg antigp39) adtunk be 4 napos időszak alatt, és meghatároztuk a szérum-anti-gp39-szintjét az antitest beadásának kezdetétől számított 7., 14. és 21. napon. A nem redukált MR1 (160 kD) Westem-blot-analízise azt mutatta, hogy érintetlen szérum-anti-gp39 kimutatható volt az antitesttel történt kezelés kezdete után legalább 21 nappal (6A. ábra). A szérum anti-gp39-koncentrációja az állatokban a 21. napon körülbelül 5% (scanning denzitometriával), összehasonlítva az antitestterápia kezdetétől számított 7. napon analizált állatok szérumából származó jellel.

Jóllehet azt meghatároztuk, hogy érintetlen antigp39 volt jelen a szérumban, azt is fontos volt megállapítani, hogy az anti-gp39 biológiailag aktív. Ezért olyan egerek szérumát, amelyek 3 x 250 pg anti-gp39-et kaptak 4 napos időszak alatt, felhasználtuk gp39-et hordozó Th sejtek festésére (6B. ábra). A szérum anti-gp39szintje 3 nappal az utolsó injekció után (7 nappal az antitesttel történt kezelés kezdetét követően) 100 volt. Az antitestterápia kezdetét követően 14 nappal körülbelül 10-15% biológiailag aktív anti-gp39 mAb-ét mutattunk ki a szérumban. A terápia kezdete után 21 nappal 2-3% anti-gp39 maradt a szérumban. Tehát mind az érintetlen gp39 meghatározása Westem-blottal, mind a biológiailag aktív anti-gp39 kimutatása azt tárta fel, hogy az anti-gp39-nek körülbelül 5%-a volt jelen az antigp39-terápia kezdetét követő 21. napon. Az eredmények azt mutatják, hogy az anti-gp39 felezési ideje körülbelül 12 nap és a hipotézissel egyezően nyilvánvalóvá teszik, hogy az anti-gp39-cel kiváltott humorális immunválaszok meghosszabbított szuppressziója a Th funkció folyamatosan fennálló blokkolásának tulajdonítható.

A találmány bemutatja, hogy egy anti-gp39 antitest - amely in vitro blokkolja a gp39-CD40 kölcsönhatást

HU 220 192 Β

- in vivő beadása alaposan gátolja a TD antigénekre adott mind elsődleges, mind másodlagos humorális immunválaszokat, a TI II. típusú antigénekre adottakat viszont nem. Ezenkívül ez a tanulmány bemutatja, hogy az anti-gp39-kezelés nem blokkolja a Th sejtek antigénnel való feltöltődését. Tehát a gp39-CD40 ligandumreceptor pár felhasználható a humorális immunválaszba történő terápiás beavatkozás célpontjaként.

Ahhoz, hogy betekintést nyerjünk, hogyan fejtette ki immunszuppresszív hatását az anti-gp39 a humorális immunitásra, az anti-gp39-nek a Th funkcióra gyakorolt közvetlen hatásait derítettük fel. Az adatok azt jelzik, hogy anti-gp3 9-cel kezelt egerekből származó SRBC-immun Th sejtek teljes mértékben képesek segítőhatást kifejteni adoptív transzfer során, azt sugallva, hogy az anti-gp39-kezelés nem okozott Th megsemmisítést vagy anergiát in vivő. Ezek az eredmények ahhoz a megfontoláshoz vezettek, hogy az anti-gp39 immunszuppresszív hatását a gp39 CD40-hez való kötődésének megakadályozásával fejti ki és nem a gp39-et hordozó Th inaktiválása révén. E hipotézis alátámasztására in vitro kísérletekben megállapítást nyert, hogy antigp39 blokkolja a CD40 gp39-hez való kötődését [Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6550 (1992)]. Továbbá biológiailag aktív anti-gp39 kimutatható volt a szérumban az idő alatt, amíg az immunszuppresszió fennállt. Bár csak 5% anti-gp39 volt jelen a szérumban az immunszuppresszió megnyilvánulásának időszaka alatt, lehetséges, hogy az anti-gp39 helyi szöveti koncentrációja a másodlagos limfoid szervek specifikus helyein magasabb, és a kitisztulási arányok lassúbbak, mint a szérum-anti-gp39 esetében. Egerek anti-gp39-cel történő kezelése gátolta az SRBC-re és heterológ Ig-re adott elsődleges immunválaszt több mint 90%-ban hosszabb időn keresztül. Feltételezve, hogy az anti-gp39 a gátlást a gp39 funkciójának blokkolása révén közvetíti, ezek az adatok a gp39-CD40 kölcsönhatásokat létfontosságúként vonják be a TD antigénekre adott elsődleges immunválaszok kifejlődésébe. Immunhisztokémiai analízissel megállapítottuk, hogy gp39 a TD antigénekkel való immmunizálás következtében keletkezik és funkcionális jelentőséggel bír. A gp39-kifejeződés in situ tanulmányozása azt mutatja, hogy az elsődleges humorális immunválaszok során fellépő gp39-CD40 kölcsönhatás indítóhelye a periarterioláris limfoid hüvelyek (periarteriolar lymphoid sheaths=PALS) perifériás oldalain és a lép terminális arteriolái (terminál arterioles=TA) körül található. Ezek azok a helyek, ahol gp39-et kifejező Th sejtek és antigénspecifikus B-sejtek közötti konjugátumokat egymás mellett elhelyezkedve találtunk, valószínűsítve, hogy a külső PALS képezi a T-sejt-B-sejt kölcsönhatás fő helyét az elsődleges humorális immunválaszok során. Tehát a PALS lehet az a hely, ahol az anti-gp39 kölcsönhatásba lép gp39-et kifejező Th sejtekkel, hogy végül meggátolja a T-B kölcsönhatást és az azt követő Ig-termelődést.

Az elsődleges válaszokhoz hasonlóan a CFA+KLHval feltöltött egerek másodlagos humorális immunválaszának anti-gp39 beadásával előidézett gátlását szintén kimutattuk. Az anti-SRBC PFC anti-gp39 által előidézett csökkenésével egyezően, antigénkihívásra bekövetkező szérumantitesttiter-csökkenést szintén észleltünk. Minden mért anti-KLH lg izotípustitere (IgM, IgG_b IgG₂.„ IgG₂b, IgG₃ és IgE) csökkent a szérumban az egerek anti-gp39-cel történt kezelése következtében. Az anti-gp39 beadásának hatása a második antigénkihívást követően legalább 14 napon keresztül nyilvánvaló volt, fenntartva egy anti-gp39 által okozott folyamatos immunszuppressziót. A KLH-ra adott másodlagos válaszok anti-gp39 közvetítette immunszuppressziója nem egyedi, a KLH-ra érvényes, mivel heterológ Ig-re és heterológ eritrocitákra adott másodlagos immunválaszokat szintén gátolt az anti-gp39-terápia. A gp39-et kifejező Th sejtek anatómiai eloszlása azonos volt azzal, amelyet az elsődleges immunizálásnál tapasztaltunk, a gp39-et kifejező Th sejtek gyakorisága az immunizált lépben azonban az elsődleges immunválasz során megfigyelt érték fölé emelkedett. Nem találtunk gp39-et kifejező Th sejtet a csíraközpontokban vagy az immunizált lép follikuláiban. Ilyenformán úgy tűnik, hogy a B-sejtek az aktivált Th sejtekre adott válaszul keletkeznek a lép-PALS-ban és -TA-ban és később vándorolnak a follikulákba és csíraközpontokba.

A találmány fókuszában az állt, hogy megmutassuk az antigp39 lehetséges alkalmazását a TD humorális immunitás ellenőrzésében. Anti-gp3 9-cel történt rövid kezelések elnyújtott szuppresszíót eredményeztek, amely vonzó sajátsága ennek a terápiás antitestnek. Speciális érdeklődésre tarthat számot az anti-gp3 9-nek az a képessége, hogy megakadályozza a más heterológ, terápiás antitestekre, úgymint Chi-L6-ra, adott elsődleges és másodlagos humorális válaszokat. Ez lehetővé tenné betegek kezelését heterológ terápiás antitestek ismételt beadásával.

7. példa

Anti-gp39 antitestek előállítása és jellemzése

1. Kísérlet - Humán gp39 ellen irányuló antitestek

Antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kialakítására egy humán alanyban, előnyös a humán gp39 ellen irányuló antitest beadása. A következő módszertant használtuk egér-antihumán-gp39 monoklonális antitestek előállítására. Balb/c egereket immunizáltunk egy oldható gp39 fúziós fehérjével, gp39-CD8-cal, komplett Freund’s-adjuvánsban (CFA-ban). Az egereket ezt követően 6 héttel oldható gp39-CD8 hatásának tettük ki inkomplett Freund’s-adjuvánsban (IFA-ban). Oldható gp39-CD8-at adtunk oldható formában 4 héttel a második immunizálás után. Ezután 2 héttel az egereket felerősítettük aktivált humán perifériás vérlimfocitákkal, amelyet újabb 2 hét elteltével oldható gp39-CD8cal történő végső felerősítés követett. A lépsejteket az NS-1 fúziós partnerrel fúzionáltattuk az utolsó immunizálást követő 4. napon standard előírások szerint.

Az antihumán gp39 antitesteket termelő kiónokat egy összetett screenelőeljárás alapján választottuk ki. A kiónokat először egy lemezes kötődési meghatározással screeneltük gp39-CD8 felhasználásával. A pozitív kiónokat ezután egy kontroll-CD8 fúziós fehérjével,

HU 220 192 Β

CD72-CD8-cal, szemben screeneltük. Azokat a kiónokat, amelyek pozitív eredményt adtak a CD8-CD72 lemezes kötődési analízisnél, eltávolítottuk. A maradék kiónokat ezután pihenő és 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfocitákon (peripherial blood lymphocytes=PBL) screeneltük áramlásos citometriás analízissel. Azokat a hibridómákat, amelyek az aktivált PBLeket megfestették a pihenőket viszont nem, pozitívnak tekintettük. Végül a maradék kiónoknak a CD40Ig lemezhez kötött gp39-hez való kötődését blokkoló képességét teszteltük.

Körülbelül 300 kiónt screeneltünk először gp39-CD8 és CD72-CD8 ellen a lemezes kötődési analízisekben. Ezekből a kiónokból 30-at találtunk, amelyek a lemezhez kötött gp39-et detektálták és nem a CD8-at. Ezeket a kiónokat ezt követően gp39-nek aktivált humán PBL-en történő kimutatására screeneltük. Körülbelül 15 klón mutatott ki molekulát aktivált PBLen, a pihenő sejteken viszont nem. A specificitást később megerősítettük, meghatározva a kiónoknak azt a képességét, hogy blokkolják a lemezhez kötött gp39 CD40Ig kimutatását. 10 klónból 3-ról mutattuk ki, hogy blokkolja a CD40Ig-kötődést ennél a meghatározásnál. Ezek a kiónok a 3E4, 2H5 és 2H8 voltak. Ilyen kiónok használatát előnyben részesítjük az itt leírt módszereknél. Azokat a kiónokat, amelyek pozitív tesztet adtak az aktivált PBL-eken a pihenőkön viszont nem, egy aktivált patkány-T-sejt-klónnal - POMC8cal - való reaktivitásra screeneltük. A 2H8 klón keresztreakciót adott ezzel a patkánysejtvonallal.

2. Kísérlet - Humán gp39 ellen irányuló antitestek

Az 1. kísérletben leírtakhoz hasonló immunizációs eljárást alkalmaztunk további, humán gp39 ellen irányuló antitestek előállítására. Balb/c egeret immunizáltunk oldható gp39-CD8-cal CFA-ban, amelyet 4 héttel később 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfocitákkal történő kihívás követett. Az egeret ezután oldható gp39-CD8-cal erősítettük fel 4 nappal a lépsejteknek az NS-1 fúziós partnerrel történő fúzióját megelőzően, standard előírások szerint. A hibridóma kiónok screenelését 6 órás aktivált humán PBL-ek áramlásos citometriás festésével végeztük el. Kiválogattuk azokat a kiónokat, amelyek az aktivált humán PBLeket megfestették, a pihenőket viszont nem. Hat kiónt, 4D9-8,4D9-9,24-31,24-43,89-76 és 89-79 jelűeket választottunk ki a további analízisekhez.

A kiválasztott antitestek specificitását többféle meghatározással erősítettük meg. Először áramlásos citometriás analízissel megmutattuk, hogy mind a hat mAb megfesti az aktivált perifériás vér-T-sejteket, a pihenőket azonban nem (lásd a 7B. és 7C. ábrákat szemléltető példaként, amelyek az aktivált T-sejtek 4D9-8-cal és 4D9-9-cel való festődését mutatják). A mind a hat antitest által felismert molekula kifejeződése kimutatható az aktiválás 4 óráján belül, maximális 6-8 órával az aktiválás után, és nem mutatható ki 24 órával az aktiválás után. Mind a hat mAb felismeri az aktivált CD3+PBLek felületén kifejezett molekulát, elsősorban a CD4+ fenotípust, de a CD8+ T-sejtek egy része is kifejezi a molekulát. A hat mAb által felismert molekula kifejeződését gátolja a tápoldatban levő ciklosporin A, úgy mint a gp39 kifejeződését (lásd a 8A. és 8B. ábrákat szemléltető példaként, amelyek a ciklosporinnal kezelt T-sejtek 4D9-8-cal és 4D9-9-cel való festődését mutatják). E hat mAb által felismert molekula kifejeződésének kinetikája és megoszlása azonos a gp39-ével, ahogyan azt a humán CD40Ig fúziós fehéijével kimutattuk. Ezenfelül mind a hat mAb blokkolja a gp39 CD40Ig-vel való festődését (lásd a 9A. és 9B. ábrákat szemléltető példaként, amelyek a gp39 CD40Ig-vel való festődésének gátlását mutatja 4D9-8 és 4D9-9 jelenlétében). ELISA-meghatározásnál mind a hat mAb felismeri a gp39-CD8-at, a gp39-molekulának egy oldható fúziós formáját. Továbbá immunreakcióban mind a hat mAb kicsapja a ³⁵S-metioninnel jelölt aktivált humán PBLből származó körülbelül 36 kD molekulát. Az immunreakcióban kicsapott molekula azonos azzal, amelyet a humán CD40Ig fúziós fehérjével csaptunk ki.

A hat kiválasztott mAb (4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76, 89-79) fúnkciós aktivitását a következők szerint határoztuk meg. Először az mAb-k IL-4gyel és oldható gp39-cel tenyésztett, tisztított humán Β-sejtek szaporodását gátló képességét mértük meg. Tisztított humán B-sejteket tenyésztettünk IL-4-gyel és gp39-cel, tisztított monoklonális antitestek vagy CD40Ig - 0-12,5 pg/ml közötti dózisok - jelenlétében vagy a nélkül. 3 nap elteltével meghatároztuk a Β-sejtek szaporodását a tenyészetben timidin beépítésével. Az eredmények azt mutatják (10. ábra), hogy mind a hat mAb képes meggátolni a gp39 és IL-4 kiváltotta B-sejt-szaporodást. A 89-76 és 24-31 mAb volt a leghatékonyabb az indukált B-sejt-szaporodás gátlásában.

A következőkben az mAb-k B-sejt-differenciálódást gátló képességét vizsgáltuk, ahogyan azt az anti-CD3mal aktivált T-sejtek és IL-2 kiváltotta Ig-termelődésnél mértük. Tisztított IgD⁺ humán B-sejteket állítottunk elő FACS-sel történő pozitív szelekcióval, ezután anti-CD3mal aktivált T-sejtekkel (mitomicin C-vel kezelt) és IL-2-vel tenyésztettük 6 napig, tisztított anti-gp39 monoklonális antitestek -0-10 pg/ml közötti dózisok - jelenlétében vagy a nélkül. Az IgM-, IgG- és IgA-termelődést becsültük meg ELISA-val a 6. napon. Az eredmények (1. táblázat) azt mutatják, hogy mind a hat antitest képes gátolni a T-sejt-függő B-sejt-differenciálódást az IgM-, IgG- és IgA-termelődés mérése alapján.

1. táblázat

	Immunglobulin-termelődés
mAb	pg/ml	IgM	IgG	IgA
nincs	-	17 500	6710	4471
	0,1	4 813	2130	2819
4D9-8	1,0	4 394	2558	1519
	10,0	1 081	389	396
	0,1	3 594	919	1731
4D9-9	1,0	2 659	1233	1606
	10,0	374	448	266

HU 220 192 Β

1. táblázat (folytatás)

	Immunglobulin-termelődés
mAb	pg/ml	IgM	IgG	IgA
	0,1	3 863	981	344
24-31	1,0	1287	314	165
	10,0	1 120	596	23
	0,1	6 227	4132	432
24-43	1,0	3 193	2130	192
	10,0	7 021	1232	1081
	0,1	3 783	1069	344
89-76	1,0	2180	352	171
	10,0	818	551	19
	0,1	9 763	1924	3021
89-79	1,0	2 314	460	156
	10,0	183	135	434

Az anti-gp39 mAb-k T-sejt-válaszokra gyakorolt hatásának vizsgálatára az mAb-ket standard kevert limfocitareakciókba (mixed lymphocyte reactions=MLR) vittük be. 300 000 humán perifériás vérlimfocitát (válaszadók =responders=R) tenyésztettünk 100 000 besugárzott, allogén perifériás vérlimfocitával (stimulátorok=stimulators=S) anti-gp39 mAb jelenlétében (10 pg/ml) vagy a nélkül. A tenyészeteket ³H-timidinnel pulzáltattuk a 4., 5. és 6. napon, majd 18 órával később kinyertük a sejteket. Mind a hat antihumán gp39 mAb gátolta az allospecifikus válaszokat az MLR-mérés alapján (lásd all. ábrát szemléltető példa10 ként, amely az allospecifikus válaszok gátlását mutatja, ha R és S sejteket 24-31 vagy 89-76 jelenlétében inkubáljuk; CTLA4 immunglobulin fúziós fehérjét és antiCD28 mAb-t használtunk pozitív kontrollként).

Annak meghatározására, vajon a hat mAb felismeri-e a humán gp39-molekula felületén levő különböző epitópokat, keresztblokkoló kísérleteket végeztünk. Először aktivált humán PBL-eket blokkoltunk a hat mAb mindegyikével (25 pg/ml nem konjugált antitesttel). A sejteket mostuk azután megfestettük 10 pg/ml biotinnal kon20 jugált antitesttel, amelyet fitoeritrinnel (phytoerythrin=PE) konjugált avidinnel (PE-Av) történő reakció követett. A sejtek PE-Av-vel való festődését FACS-sel analizáltuk. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be.

2. táblázat

Blokkolás	Színező antitest
mAb	4D9-8	4D9-9	24-31	24-43	89-76	89-79
nincs	+ + +	+ + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
4D9-8	ND	-	+ + + +	+ + + +	+ + +	+ + +
4D9-9	+ + +	ND	+ + +	+ + + +	+ + +	+ + +
24-31	4-	+	ND	+ + +	+ +
24-43	+	+	+ + +	ND	+ +	+
89-76	+	+	+ + +	+ + +	ND	+ + +
89-79	+	+ +	+ + +	+ + +	+ + +	ND

A megfestődés intenzitását és a pozitív sejtek százalékát a + jelzés mutatja (+ + + + =MI>200; + + + =MI>125; + + =MI>50; +=MI>25; -=a háttérhez képest nem festődött meg; ND=nincs meghatározás.

Minden antitest blokkolta a CD40Ig aktivált humán PBL-ekhez történő kötődését. A 2. táblázatban bemutatott adatok azonban egyértelműen megmutatják néhány 45 antitest hibáját más antitesteknek az aktivált humán PBL-ekhez való kötődése blokkolásában, azt sugallva, hogy felismerik a humán gp39-molekula felületén levő különböző epitópokat.

A 89-76 és 24-31 hibridómákat, amelyek a 50 89-76 és 24-31 antitesteket termelik, a Budapesti Szerződés és az American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., rendelkezései alapján letétbe helyeztük 1994. szeptember 2-án. A 89-76 hibridómát az ATCC HB11713 beszerzési számmal és a 55 24-31 hibridómát az ATCC HB11712 beszerzési számmal jelöltük meg.

3. Kísérlet - Egér-gp39 ellen irányuló antitestek

A találmány egy megvalósítási módjában a gp39-antagonista egy antiegér-gp39 monoklonális antitest, az 60

MR1. Az MR1 monoklonális antitest előállítására a következő módszert alkalmaztuk és ez használható más, a gp39 ellen irányuló antitestek létrehozására.

Hörcsögöket immunizáltunk intraperitoneálisan 5 χ 10⁶ aktivált Thl sejttel (dl.6) 1 hetes intervallumokban 6 héten keresztül. Amikor a muréna Thl-gyel szembeni szérumtiter magasabb volt, mint körülbelül 1:10 000, sejtfúziókat végeztünk polietilénglikollal immun hörcsöglépsejteket és NS-l-et alkalmazva. A szaporodó hibridómák felülúszóját screeneltük áramlásos citometriával pihenő és aktivált Thl sejteken. Egy különleges hibridómát, amely az aktivált Th-át szelektíven felismerő mAb-t termelt, tovább teszteltük és szubklónoztuk, hogy MRl-et kapjunk. MRl-et állítottunk elő a hasüregi folyadékban és ioncserélő HPLC-vel tisztítottuk. Az American Type Culture Collecton gyűjteménynél hibridóma MRl-et helyeztünk letétbe, amelyet a HB11048 beszerzési számmal jelöltünk.

HU 220 192 Β

Megfelelések

A szakmában mindennapos gyakorlat felismer vagy képes kideríteni - nem több mint rutinkísérletek alkalmazásával - az itt leírt találmány specifikus megvalósítási módjainak sok megfelelőjét. Ilyen megfelelőket szándékoznak felölelni a következő igénypontok.

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Oldható TD antigén és egy gp39-antagonista alkalmazása egy TD antigénre adott in vivő humorális immunválasz gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amelyben az antigén nem fejeződik ki a sejtfelületen.
2. 2. Egy gp39-antagonista és egy oldható TD antigén alkalmazása olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely TD antigénnek kitett alanyban gátolja a TD antigénre adott antigénspecifikus IgE-választ.
3. 3. Egy gp39-antagonista és egy oldható TD antigén alkalmazása a TD antigénnel in vivő kiváltott aktivált Th sejtfúnkció immunszuppresszálására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amely oldható TD antigén nem fejeződik ki a sejt felületén.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a humorális immunválasz egy elsődleges humorális immunválasz.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a humorális immunválasz egy másodlagos humorális immunválasz.
6. 6. Az 1. vagy a 3-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a TD antigén egy fehérje.
7. 7. Az 1. vagy a 3-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a TD antigén egy antitest.
8. 8. Az 1. vagy a 3-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a TD antigén egy terápiás hatóanyag.
9. 9. A 3. vagy 4. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gp39-antagonista egy anti-gp39 antitest.
10. 10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest a 24-31 monoklonális antitest (ATCC HB11712).
11. 11. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest a 89-76 monoklonális antitest (ATCC HB11713).
12. 12. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest egy kiméra monoklonális antitest.
13. 13. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest egy humanizált monoklonális antitest.
14. 14. A 3. vagy 4. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gp39-antagonista a gp39 ligandum egy oldható formája.
15. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gp39 ligandum a CD40.
16. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a CD40 egy fúziós fehérje.
17. 17. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a TD antigén egy allergén.
18. 18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítmény egy IL-4 inhibitort is tartalmaz.
19. 19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az IL-4 inhibitor egy anti-IL-4 antitest.
20. 20. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az aktivált Th sejtek nem küszöbölődnek ki.
21. 21. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az aktivált Th sejtek nem anergizáltak.