EA004401B1 - Терапевтическое применение т-вам(cd40l)-технологии для лечения заболеваний с участием клеток гладкой мускулатуры - Google Patents

Терапевтическое применение т-вам(cd40l)-технологии для лечения заболеваний с участием клеток гладкой мускулатуры Download PDF

Info

Publication number
EA004401B1
EA004401B1 EA199900091A EA199900091A EA004401B1 EA 004401 B1 EA004401 B1 EA 004401B1 EA 199900091 A EA199900091 A EA 199900091A EA 199900091 A EA199900091 A EA 199900091A EA 004401 B1 EA004401 B1 EA 004401B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
smooth muscle
antibody
muscle cells
cells
ligand
Prior art date
Application number
EA199900091A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900091A1 (ru
Inventor
Майкл Дж. Йеллин
Сет Ледерман
Леонард Чесс
Михаил Н. Карпусас
Дэвид В. Томас
Original Assignee
Дзе Трастиз Оф Колумбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк
Байоджен, Инкорпорейтед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Трастиз Оф Колумбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк, Байоджен, Инкорпорейтед filed Critical Дзе Трастиз Оф Колумбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк
Publication of EA199900091A1 publication Critical patent/EA199900091A1/ru
Publication of EA004401B1 publication Critical patent/EA004401B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Активацию CD40-лигандом (CD40L) клеток гладкой мускулатуры, несущих CD40 на поверхности клеток, ингибируют in vivo и ex vivo посредством приведения в контакт этих клеток с агентом, способным к ингибированию взаимодействия между CD40L и CD40 на клетках. Ингибирование in vivo несущих CD40 клеток гладкой мускулатуры используют для лечения заболеваний, зависимых от клеток гладких мышц.

Description

Данная заявка претендует на приоритет заявки на патент Соединенных Штатов Америки под регистрационным номером 08/677730, зарегистрированной 8 июля 1996 г., содержание которой, таким образом, включается в качестве ссылки в настоящую заявку.
Описываемое изобретение осуществлено при поддержке Правительства по гранту Национального института здравоохранения (ΝΙΗ), 33 К08-АК-0194, ВО1-0А55713, ΚΟ1-ΑΙ-28367, ΚΟ1-ΑΙ-14969, НЬ21006, НЬ42833, НЬ50629 В ΚΟ1-ΑΙ-14969 от Департамента здравоохранения и Нитап 8егу1сек. Соответственно правительство США имеет некоторые права на данное изобретение.
В тексте данной заявки в скобках даются различные ссылки. Посредством этого эти публикации в целом включаются в данную заявку в качестве ссылок для более полного описания уровня области техники, к которой относится данное изобретение. Полное библиографическое цитирование этих ссылок можно найти в тексте или под соответствующими номерами в списке, следующем за разделом Подробности эксперимента.
Предпосылки создания изобретения
0Ό40 является молекулой клеточной поверхности, экспрессируемой на многих клетках, и взаимодействует с 30-33 кД контррецептором активационно индуцируемых СП4'-Т-клеток. названным С.П40С Взаимодействия 00406СО40 широко исследовались при взаимодействии Т- и В-клеток и являются существенными для зависимой от Т-клеток дифференцировки Вклеток и продуцирования 1дС, 1дА и 1дЕ. 0040 также экспрессируется на моноцитах, дендритных клетках, эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках и фибробластах. Экспрессия СО40 на этих клетках ίη νίίτο активируется цитокинами, наиболее заметно ΙΕΝ-γ. Интересно, что исследования ίη νίνο показали явную экспрессию активированных 0040 в очагах воспаления, например, в синовиальной мембране при ревматоидном артрите или в псориатических бляшках. Исследования ίη νίίτο с использованием моноклонального антитела (тАЬ) против СО40-клеток или 00406 -клеток показывают, что 0.Ό40 функционально экспрессируется на моноцитах, дендритных клетках, эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках и фибробластах.
Например, взаимодействия 00406-0040 побуждают моноциты секретировать провоспалительные цитокины Ш-Ια, Ш1 β, Ш-6 и ΤΝΕ-α, а дендритные клетки - секретировать ΤΝΕ-α. Взаимодействия 00406-0040 также промотируют моноциты и дендритные клетки для секреции хемокинов Ш-8 и ΜΙΡ1α. Кроме того, лигирование 0Ό40 усиливает опосредованное Ш-1 продуцирование СМ-086 тимическими эпителиальными клетками. Кроме того, опосре дованные 0040 сигналы побуждают моноциты секретировать Ш-10 и оксид азота и увеличивают продуцирование Ш-6 фибробластами. Фибробласты также пролиферируют после взаимодействий 00406-0040. Наконец, эндотелиальные клетки и фибробласты после лигирования 0Ό40 активируют факторы межклеточной адгезии.
Сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, лечат различными лекарственными средствами, в том числе лекарственными средствами, снижающими уровень холестерина, бета-блокаторами, блокаторами кальциевых каналов и антикоагулянтами. Теперь показано, что клетки гладкой мускулатуры компетентны для экспрессии 0040. Это представляет основу лечения сосудистых заболеваний посредством ингибирования взаимодействий между 0040 и 0040-лигандом (также известным как Т-ВАМ, 5с8 Ад, др39 и ΤΡΛΡ). Другие болезни, затрагивающие гладкую мышцу, также лечатся посредством ингибирования взаимодействий 0Ό400040Ш
Краткое изложение сущности изобретения
Данное изобретение относится к способу ингибирования активации лигандом 0Ό40 клеток гладкой мускулатуры, несущих 0Ό40 на поверхности клеток, включающему приведение в контакт клеток с агентом, способным к ингибированию взаимодействия между 0040лигандом и 0040 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации указанных клеток.
Данное изобретение относится к способу ингибирования активации СО40-лигандом клеток гладкой мускулатуры, несущих 0040 на поверхности клеток, у субъекта, включающему введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между СО40-лигандом и 0040 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта.
Данное изобретение относится к способу лечения субъекта от зависимого от клеток гладкой мускулатуры заболевания, включающему введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между СО40-лигадном и 0040 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта, и посредством этого лечат болезнь, зависимую от клеток гладкой мускулатуры.
Описание чертежей
Фиг. 1А - ЕА08-анализ покоящихся клеток гладкой мускулатуры аорты человека. Точечная линия представляет собой изотипное контрольное тАЬ; пунктирная линия представляет собой тАЬ против 0054; сплошная линия представляет собой тАЬ против 0040. Эта фигура показы вает, что клетки гладкой мускулатуры конститутивно не экспрессируют СЭ40.
Фиг. 1Б - ЕАС8-анализ клеток гладкой мускулатуры аорты человека после 72-часового присутствия в клеточной культуре ΙΕΝ-γ (1000 Е/см3). Эта фигура показывает активацию экспрессии СЭ40 клетки гладкой мускулатуры в ответ на ΙΕΝ-γ.
Фиг. 1В - ЕЛС8-анализ клеток гладкой мускулатуры аорты человека после 72-часового присутствия в клеточной культуре 1Ь-1а (1 нг/см3). Не наблюдается активации экспрессии СЭ40 клетками гладкой мускулатуры.
Фиг. 1Г - ЕЛС8-анализ клеток гладкой мускулатуры аорты человека после 72-часового присутствия в клеточной культуре ΤΝΡ-α (200 Е/см3). Не наблюдается активации экспрессии СЭ40 клетками гладкой мускулатуры.
Фиг. 2А-Ш - Координаты атомов кристаллической структуры растворимого внеклеточного фрагмента СЭ40Б человека, содержащего остатки С1у116-Ееи261 (в Банке данных о белках Вгоокйауеи) (ПОСЛЕД. № 1).
Фиг. 3А-Б - СЭ40 экспрессируется ίη δίΐιι на клетках гладкой мускулатуры и макрофагах при повреждении при гомологичном атеросклерозе. Приводятся микрофотографии, полученные при двухцветных иммуногистохимических исследованиях, показывающие экспрессию СЭ40 (коричневое окрашивание) на клетках гладкой мускулатуры (красное окрашивание) фиг. 3А и макрофагах (красное окрашивание) у больного с атеросклерозом, связанным с трансплантацией - фиг. 3Б.
Фиг. 4А-Б - Здоровая венечная артерия от пациента с идиопатической кардиомиопатией, окрашенная гематоксилином и эозином (фиг. 4А) и шАЬ против СЭ40 (фиг. 4Б). Фиг. 4А: отмечается отсутствие утолщения интимы или воспалительного инфильтрата. Фиг. 4Б: экспрессия СЭ40 ограничивается эндотелиальными клетками, выстилающими просвет сосуда. Отсутствует реактивность в отношении изотипного специфического контрольного тАЬ (не показано). (Фиг. 4А, 4Б х25).
Фиг. 5А-Б - Фиброатероматозная бляшка в венечной артерии больного с ишемической кардиомиопатией, окрашенная гематоксилином и эозином (фиг. 5А) и тАЬ против СЭ40 (фиг. 5Б). Фиг. 5А: фиброзная шапочка, перекрывающая частично обызвествленное атероматозное ядро, содержит многочисленные клетки зоны воспаления (стрелки). Фиг. 5Б: большая часть клеток зоны воспаления в фиброзной шапочке определенно представляет собой СЭ40+ (стрелки). Соседние клетки гладкой мускулатуры интимы и эндотелиальные клетки также представляют собой СЭ40+. (Фиг. 5А, 5Б х25).
Фиг. 6А-В - Раннее повреждение интимы, изобилующее пенистыми клетками, у пациента с коронарно-артериальной болезнью, связанной с трансплантацией (ТСАЭ), окрашенное гематоксилином и эозином (фиг. 6А) и тАЬ против СЭ40 (фиг. 6Б, 6В). Фиг. 6А: повреждение интимы содержит многочисленные пенистые клетки, макрофаги и клетки гладкой мускулатуры. Фиг. 6Б: в этом раннем повреждении при ТСАЭ СЭ40 определенно экспрессируется на многих клетках интимы. Фиг. 6В: в частности, пенистые клетки показывают обильное окрашивание по СЭ40. (Фиг. 6А х25, фиг. 6Б х50, фиг. 6В х400).
Фиг. 7А-Г - Воспалительный инфильтрат присутствует в фиброзной шапочке повреждения интимы при нативном СА, меченном тАЬ против СЭ40Б (фиг. 7А), контрольным тАЬ (фиг. 7Б), тАЬ против СЭ4 (фиг. 7В) и тАЬ против СЭ8 (фиг. 7Г). Фиг. 7А: характерная цитоплазматическая иммунореактивность и СО40Ь-иммунореактивность клеточной поверхности, которая ограничивается лимфоцитами. Фиг. 7Б: то же повреждение, окрашенное иррелевантным изотипным перекрестно-типируемым контрольным тАЬ, не показывает иммуного окрашивания. Фиг. 7В: фактически все лимфоциты в зонах повреждения при нативном СА (как и многие макрофаги и пенистые клетки) представляют собой СЭ4'. что наводит на мысль, что СЭ40Е+-лимфоциты представляют собой СЭ4+-Т-клетки. Фиг. 7Г: СЭ8+-Т-клетки редки в бляшках интимы при нативном СА (Фиг. 7А, 7Б Х1000, фиг. 7В, 7Г х400).
Фиг. 8А-В - Глубокие лимфоидные скопления в интиме при ТСАЭ, меченные тАЬ против СЭ40Б (фиг. 8А), контрольным тАЬ (фиг. 8Б) и тАЬ против СЭ4 (фиг. 8В). Фиг. 8А: при ТСАЭ большинство СО40Б -клеток (стрелки) обнаруживаются в лимфоидных скоплениях внутри интимы и в удалении от эндотелиальной поверхности. Фиг. 8Б: иррелевантное изотипное перекрестно-типируемое контрольное тАЬ не показывает клеточного окрашивания в таких лимфоидных скоплениях в интиме. Фиг. 8В: то же лимфоидное скопление в интиме, описанное выше, содержит почти исключительно СЭ4'-Тклетки, что наводит на мысль, что в зонах повреждения СЭ40Б экспрессируются на СЭ4'-Тклетках. (Фиг. 8А-В х400).
Фиг. 9А-Б - Очаг эндотелита при ТСАЭ, окрашенный тАЬ против СЭ8 (фиг. 9А) и тАЬ против СЭ40Б (фиг. 9Б). Фиг. 9А: при ТСАЭ СЭ8+-Т-клетки связываются с люминальными эндотелиальными клетками, характерными для эндотелита. Большинство СЭ8+-Т-клеток присутствует в очагах эндотелита, в то время как в лимфоидных скоплениях интимы, удаленных от эндотелиальной поверхности, они редко присутствуют. Фиг. 9Б: клетки зоны воспаления в очагах эндотелита представляют собой СО40Ь. Подобным образом, экспрессии СЭ40Б на эндотелиальных клетках не обнаруживается. (Фиг. 9А-Б х400).
Фиг. 10А-Б - Фиг. 10А: двойное иммунное окрашивание повреждения интимы при нативном СА шАЬ против СЭ40 (коричневое окрашивание) и маркером для макрофагов тАЬ против СЭ68 (красное окрашивание). Центральное скопление клеток (стрелки) показывает сильное окрашиванеие в случае как СЭ40. так и СЭ68. Фиг. 10Б: двойное иммунное окрашивание в случае ТСАЭ тАЬ против СЭ40 (коричневое окрашивание) и тАЬ против актина гладких мышц (красное окрашивание) показывает СЭ40'-клетки гладкой мускулатуры (стрелки). СЭ40-реактивность ограничивается клетками гладких мышц интимы (стрелки), в то время как медиальные миоциты являются СЭ40-. (Фиг. 10А-Б х400).
Фиг. 11А-Г - Серийные срезы при нативном СА, демонстрирующие реваскуляризацию интимы, и окрашенные тАЬ против СЭ34 (фиг. 11 А), против СЭ40 (фиг. 11Б), против 1САМ-1 (фиг. 11В) и против УСАМ-1 (фиг. 11Г). Фиг. 11А: эндотелиальные клетки новых сосудов интимы, видимые при окрашивании СЭ34. Фиг. 11Б: неоваскулярные эндотелиальные клетки интимы определенно экспрессируют СЭ40. Соседние клетки зоны воспаления также показывают СЭ40. Фиг. 11В, фиг. 11Г: очаги образования новых сосудов также показывают сильную эндотелиальную реактивность в случае 1САМ-1 (фиг. 11В) и УСАМ-1 (фиг. 11Г). (Фиг. 11А-11Г х400).
Фиг. 12А-В - Двойное иммунное мечение сильно воспаленной зоны повреждения интимы при нативном СА тАЬ против СЭ40 (коричневое окрашивание) и тАЬ против молекул адгезии 1САМ-1 (красное окрашивание) (фиг. 12А), тАЬ против УСАМ-1 (фиг. 12Б), и иррелевантным контрольным тАЬ (фиг. 12В). Фиг. 12А: фактически все СЭ40'-клетки (коричневое окрашивание) преобладающее количество макрофагов (длинные стрелки) и миоциты интимы (короткие стрелки) определенно реактивны в отношении 1САМ-1 (красное окрашивание). Фиг. 12Б: большое число СЭ40'-клеток зоны воспаления (коричневое окрашивание) и миоцитов интимы (стрелки) также реактивны в отношении УСАМ-1 (красное окрашивание). Фиг. 12В: то же повреждение интимы, дважды окрашенным - по СЭ40 (коричневое окрашивание) и иррелевантным изотипным перекрестнотипируемым контрольным АЬ, замененным тАЬ против 1САМ-1 и против УСАМ-1 (красное окрашивание). Различается только коричневое окрашивание, без красного, что указывает на отсутствие вмешательства методов регистрации в случае последовательного применения тАЬ против СЭ40 и против 1САМ или против УСАМ (см. раздел Материалы и методы). (Фиг. 12А-12В х400).
Фиг. 13 - Двойное иммунное окрашивание повреждения интимы при нативном СА тАЬ против р65, метящим активированный ΝΡ-кВ (коричневое окрашивание) и СЭ40 (красное окрашивание). Активированный ΝΡ-кВ виден исключительно в ядрах СЭ40'-клеток (стрелки), большинство из которых представялет собой макрофаги. (х400).
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к способу ингибирования активации лигандом СЭ40 клеток гладкой мускулатуры, несущих СЭ40 на своей поверхности, включающему приведение в контакт клеток с агентом, способным к ингибированию взаимодействия между СЭ40-лигандом и СЭ40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток. В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент способен ингибировать любое взаимодействие между СЭ40-лигандом и СЭ40. Выражение взаимодействие между СЭ40-лигандом и СЭ40 на клетках относится к одному или нескольким аспектам, функциональным или структурным, взаимосвязи СЭ40-лиганд СЭ40. Поэтому в одном из вариантов воплощения изобретения агент, который ингибирует взаимодействие, может конкурентно связываться с СЭ40лигандом и таким образом блокировать или уменьшать связывание СО40-лиганда с клеточным СЭ40. В другом варианте воплощения изобретения агент, ингибирующий взаимодействие, может связываться с СЭ40 или СЭ40-лигандом способом, при котором не ингибируется связывание СЭ40-лиганда с клеточным СЭ40, но который влияет на клеточный ответ на лигирование СЭ40, например, посредством изменения скорости функционального цикла клеточного СЭ40 или комплекса СЭ40-агент, посредством изменения кинетики связывания СЭ40 с СЭ40лигандом, или посредством изменения скорости или степени клеточной активации в ответ на лигирование СЭ40.
В определенных вариантах воплощения изобретения несущие СЭ40 клетки гладкой мускулатуры представляют собой клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетки гладкой мускулатуры сосудов, клетки гладких мышц бронхов, клетки гладкой мускулатуры аорты, коронарные клетки гладкой мускулатуры, клетки гладких мышц легких или клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта. В более конкретных вариантах воплощения изобретения клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта представляют собой клетки гладких мышц пищевода, желудка или кишечника, в том числе, клетки гладкой мускулатуры тонкой кишки или толстой кишки (кишечник).
В варианте воплощения данного изобретения указанный агент ингибирует связывание СЭ40-лиганда с СЭ40 на клетках.
В варианте осуществления данного изобретения указанный агент представляет собой белок.
В другом варианте воплощения данного изобретения указанный агент представляет собой нонпротеин. Используемый здесь термин нонпротеин включает любое и все соединения или агенты, содержащие иные элементы, чем простые или конъюгированные полипептидные цепи. К ним относятся элементы, такие как аминокислоты с непептидными связями; небелковые аминокислоты, такие как β-, γ- или δ-аминокислоты, аминокислоты в Ό-конфигурации или другие небелковые аминокислоты, в том числе гомоцистеин, гомосерин, цитруллин, орнитин, γ-аминомасляная кислота, канаванин, дьенколовая кислота или β-цианоаланин; моносахариды, полисахариды или углеводные группы; жирные кислоты или липидные группы; нуклеотидные группы, минеральные группы; или другие небелковые элементы.
В другом варианте воплощения данного изобретения указанный агент представляет собой псевдопептидное соединение. Псевдопептидное соединение может быть, по меньшей мере, частично неприродным. Псевдопептидное соединение может имитировать маленькую молекулу. Соединение может обладать увеличенной устойчивостью, эффективностью, возможностями и биологической доступностью по причине имитатора. Кроме того, соединение может иметь пониженную токсичность. Псевдопептидное соединение может обладать повышенной проницаемостью в слизистые оболочки и кишки. Такое соединение можно получить синтетическим путем. Соединение настоящего изобретения может включать Ь-, Ό- или неприродные аминокислоты, α-, α-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочную кислоту (изоэлектрический аналог аланина). Пептидный скелет соединения может иметь по меньшей мере одну связь, замененную Ρ8Ι[СН=СН] (Кетр! е! а1. (1991), 1и!1. 1. Рерббе аиб Ргок. Век., 38, 237-241). Соединение может также включать трифтортирозин, и-С1-фенилаланин, п-Вг-фенилаланин, поли-Ь-пропаргилглицин, поли-О,Ь-аллилглицин или поли-Ьаллилглицин.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения псевдопептидное соединение с биологической активностью ингибирования взаимодействия между СЭ40-лигандом и СЭ40 на клетках может иметь связь, пептидный скелет или аминокислотный компонент, замещенный подходящим имитатором. Примерами неприродных аминокислот, которые могут быть подходящими аминокислотными имитаторами, являются β-аланин, Ь-а-аминомасляная кислота, Τ-γ-аминомасляная кислота, Ь-а-аминоизомасляная кислота, Ь-е-аминокапроновая кислота, 7-аминогептановая кислота, Ь-аспарагиновая кислота, Ь-глутаминовая кислота, цистеин (ацетаминометил), №е-Вос-№а-СВ2-Ь-лизин, Ν-εВос-№а-Ртос-Ь-лизин, Ь-метионинсульфон, Ь норлейцин, Ь-норвалин, №а-Вос-б-СВ2-Ьорнитин, ^6-Вос^-а-СВ2-Р-орнитин. Вос-пнитро-Ь-фенилаланин, Вос-гидроксипролин, Вос-Ь-тиопролин (В1оибе11е, 8.Е., е! а1. (1994), Ли11т1сгоЫа1 ЛдеШк аиб СйетоШегару, 38, 22802286; РтШа, С, е! а1. (1995), Рерббе 8с1еисе, 37, 221-240).
В определенном варианте белок содержит антитело или его часть, способное к ингибированию взаимодействия между СЭ40-лигандом и СЭ40 на клетках. Антитело является мноклональным или поликлональным антителом. В более специфичном варианте моноклональное антитело связывается с эпитопом, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5с8 (АТСС, инвентарный номер НВ 10916). Примером такого моноклонального антитела является моноклональное антитело 5с8 (АТСС, инвентарный номер НВ 10916). В другом варианте антитело специфически связывается с СЭ40. Одним из примеров антитела против СЭ40 является моноклональное мышиное антитело против СЭ40 человека, доступное от Се мху те Сик1отег 8егу1се (продукт 80-3702-01, Кэмбридж, Миннесота). В других вариантах моноклональное антитело представляет собой химерное антитело, приматизированное антитело, гуманизированное антитело или антитело, включающее СЭВ-область от первого человека и каркас антитела от второго человека.
Смысл терминов химерное, приматизированное и гуманизированное антитело и способы их получения хорошо известны специалистам в этой области техники. См., например, международную публикацию РСТ № XV О 90/07861, опубликованную 26 июля 1990 г. (Онеем е! а1.); и фиееи е! а1., Ргос. №111 Асаб. 8сг И8А (1989), 86:10029. Способы получения приматизированных антител описываются, например, в международной публикации РСТ, соответствующей международной заявке № РСТ/И8 92/06194 (1бес РйагтасеибсаН); и в работе №\νιη;πι е! а1., Вю!есйио1о§у (1992), 10:14551460, включенных в данную заявку в качестве ссылок.
Вообще гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее один или несколько гипервариабельных участков (СЭВ.) нечеловеческого антитела, функционально связанных с сегментами человеческой остовной области. Могут присутствовать, необязательно, дополнительные остатки, связанные с нечеловеческим антителом. Типично по меньшей мере одна тяжелая цепь или одна легкая цепь содержит нечеловеческие СЭВ. Типично, нечеловеческие СЭВ представляют собой мышиные СЭВ. Вообще приматизированное антитело является антителом, содержащим один или несколько гипервариабельных участков (СЭВ) антитела вида иного, чем не являющегося человеком примата, функционально связанных с сегментами остовной области примата, не являющегося человеком. Могут присутствовать, необязательно, дополнительные остатки, связанные с видом, от которого происходит СОЯ. Типично, по меньшей мере одна тяжелая цепь или одна легкая цепь содержит СОЯ вида, который не является приматом, не представляющим человека. Типично, СОЯ являются СОЯ человека. Как правило, химерное антитело является антителом, легкая и/или тяжелая цепи которого содержат области от разных видов. Например, один или несколько сегментов вариабельной (V) области одного вида могут быть связаны с одним или несколькими сегментами константной (С) области другого вида. Типично, химерное антитело содержит сегменты вариабельной области мыши, связанные с сегментами константной области человека, хотя могут использоваться сегменты других видов млекопитающих.
Моноклональное антитело 5с8 продуцируется гибридомной клеткой, депонированной 14 ноября 1991 г. Американской коллекцией типовых культур (АТСС), 12301 Рагк1а\\п Опус. ЯоскуШе, Магу1аиб 20852, и.8.А., по условиям Будапештского договора о международном различении депозита микроорганизмов для целей патентной процедуры. Гибридоме соответствует инвентарный номер АТСС НВ 10916.
В специфичном варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область легкой или тяжелой цепи. В другом специфическом варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область. Еще в одном специфическом варианте часть антитела содержит БаЬфрагмент или антитело с одной цепью. Антитело с одной цепью получают из вариабельных областей, связанных белковыми спейсерами в одну белковую цепь.
В другом варианте белок содержит растворимую внеклеточную область СО40-лиганда или его часть, или его вариант, способные к ингибированию взаимодействия между СО40лигандом и СО40 на клетках; или растворимую внеклеточную область СЕНО, или его часть, или его вариант, способные к ингибированию взаимодействия между СГ)40-лигандом и СГ)40 на клетках. В специфическом варианте растворимая внеклеточная область СЕИО-лиганда или СЕНО представляет мономер. В другом варианте растворимая внеклеточная область СЕНО представляет олигомер.
Варианты могут отличаться от встречающихся в природе СЕНО или СЕИО-лиганда по аминокислотной последовательности или по признакам, к которым не относится последовательность, или по обоим моментам. Варианты по аминокислотной последовательности получаются тогда, когда одна или несколько аминокислот во встречающихся в природе СЕНО или СЕИО-лиганде замещаются другой природной аминокислотой, производным аминокислоты или ненативной аминокислотой. Особенно предпочтительными вариантами являются встречающиеся в природе СЕНО или СЕНОлиганд, или биологически активные фрагменты встречающихся в природе СЕНО или СЕНОлиганда, чьи последовательности отличаются от последовательности дикого типа одним или несколькими консервативными замещениями аминокислот, которые, как правило, имеют минимальное влияние на вторичную структуру и гидрофобный характер белка или пептида. Варианты также могут иметь последовательности, отличающиеся одним или несколькими неконсервативными заменами аминокислот, делениями или инсерциями, которые не разрушают биологической активности СЕНО или СЕНОлиганда. Консервативные замены включают, обычно, замену одной аминокислоты на другую с похожими характеристиками, например, замены в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. К неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярными нейтральными аминокислотами являются глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженными (основными) аминокислотами являются аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженными (кислыми) аминокислотами являются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.
Другие консервативные замены можно взять из табл. 1, а еще ряд замен описан ОауйоЕЕ в А11а§ о£Рго!еш 8сс|испсс аиб 81гис1иге (1988).
Таблица 1
Консервативные аминокислотные замены
Аминокислота Код Заменяется на любую из
Аланин А 0-А1а, С1у, бета-А1а, Ь-Суз, ϋ-Суз
Аргинин В ϋ-Агд, Ьуз, гомо-Агд, ϋ-гомо-Агд, Мес, Ο-МеС, Не, О-11е, Огп, О-Огп
Аспарагин N ϋ-Азп, Азр, ϋ-Азр, С1и, О-С1и, <31η, О-С1П
Аспарагиновая кислота ϋ Ц-Азр, ϋ-Азп, Азп, С1и, Э-С1и, С1п, ϋ-ΟΙη
Цистеин С 0-Суз, З-Ме-Суз, МеС, ϋ-МеС, ТЬг, ϋ-ТЬг
Глутамин 0 Ц-С1п, Азп, ϋ-Азп, С1и, О-С1и, Азр, ϋ-Азр
Глутаминовая кислота Е 0-61и, Э-Азр, Азр, Азп, С-Азп, С1п, ϋ-(31η
Глицин С А1а, О-А1а, Рго, Г-Рго, бета-А1а, Аср
Изолейцин I Ώ-Пе, Уа1, ϋ-νβΐ, Ьеи, Ο-Ьеи, МеС, О-МеС
Лейцин ь Ό-Ьеи, Уа1, О-Уа1, МеС, ϋ-Мес
Лизин к ϋ-Ьуз, Агд, О-Агд, гомо-Агд, О-гомо-Агд, МеС, Ό-МеС, Не, Ό-Ие, Огп, ϋ-Огп
Метионин м Ό-Мес, З-Ме-Суз, Не, ϋ-Ые, Ьеи, О-Ьеи, Уа1, О-Уа1, Ыог1еи
Фенилаланин Е Ό-РЬе, Туг, О-Туг, Ь-Оора, ΗΪ3, 0-ΗΪ3, Тгр, Ο-Тгр, транс-3-, 4- или 5-фенилпролин, цис-3-, 4- или 5-фенилпролин
Пролин Р ϋ-рго, Ь-1-тиоазолилин-4~карбоновая кисло- та, О- или Ь-1-оксазолидин-4-карбоновая кислота
Серин 3 Б-5ег, ТЬг, Ό-ТЬг, алло-ТЬг, МеС, Ώ-МеС, Мес(О), О-МеС(О), Уа1, ϋ-Уа!
Аминокислота Код Заменяется на любую из
Треонин Т Ο-ТЬг, 8ег, О-Зег, алло-ТЬг, МеБ, О-МеБ, МеБ(О), Б-МеБ(О), Уа1, О-Уа1
Тирозин Υ Ο-Туг, РЬе, ϋ-РЬе, Б-Бора, ΗΪ3, 0-ΗΪ3
Валин V Р-Уа!, Беи, Ο-Беи, Не, ϋ-Не, МеБ, О-МеБ
Другие варианты в пределах данного изобретения представляют собой варианты с модификациями, увеличивающими стабильность пептида. Такие варианты могут содержать, например, одну или несколько непептидных связей (которые замещают пептидные связи) в пептидной последовательности. Также включаются варианты, содержащие иные остатки, чем встречающиеся в природе Ь-аминокислоты, такие как ϋ-аминокислоты, или невстречающиеся в природе или синтетические аминокислоты, такие как β- или γ-аминокислоты и циклические варианты. Включение в полипептид Όаминокислот вместо Ь-аминокислот может увеличить его устойчивость к протеазам. См., например, патент США 5219990.
Пептиды данного изобретения можно также модифицировать посредством различных изменений, таких как инсерции, делеции и замены, либо консервативные, либо неконсервативные, когда такие изменения могут обеспечить некоторые преимущества при их применении.
В других вариантах воплощения изобретения варианты с аминокислотными заменами, являющимися менее консервативными, также могут дать в результате нужные производные, например, если вызвать изменения заряда, конформации и других биологических свойств. Такие замены обычно включают, например, замену гидрофильного остатка на гидрофобный остаток, замену цистеина или пролина на другой остаток, замену остатка с небольшой боковой цепью на остаток с объемной боковой цепью, или замену остатка с общим положительным зарядом на остаток с общим отрицательным зарядом. Когда результат данной замены нельзя предсказать с уверенностью, производные можно легко проанализировать описанными здесь методами и определить наличие или отсутствие нужных свойств.
Варианты в объеме данного изобретения включают белки и пептиды с аминокислотными последовательностями, имеющими по меньшей мере восемь процентов гомологии с внеклеточной областью СО40 или внеклеточной областью СО40-лиганда. Предпочтительнее, чтобы гомология последовательностей составляла по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%.
До тех пор, пока возможны замены в скелете, также возможно замещать функциональные группы, декорирующие скелет, группами, характеризующимися подобными признаками. Такие замещения, в первую очередь, будут консервативными, т.е. замещающая группа будет приблизительно того же размера, формы, гид рофобности и заряда, что и первоначальная группа. Модификации, не относящиеся к последовательности, могут включать, например, дериватизацию частей встречающихся в природе СО40 или СО40-лиганда ίη νίνο или ίη νίίτο, а также изменения степени ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования или гликозилирования.
В другом варианте воплощения изобретения белок, включающий внеклеточную область СО40-лиганда и СО40, подвергают химическим модификациям, при которых сохраняется активность. Например, белки можно амидировать, сульфировать, однократно или несколько раз галогенировать, алкилировать, карбоксилировать или фосфорилировать. Белок также можно один или несколько раз ацилировать, например, ацетильной группой, фарнезильной группой или жирной кислотой, которая может быть насыщенной, мононенасыщенной или полиненасыщенной. Жирная кислота также может иметь один или несколько атомов фтора. Данное изобретение также включает метиониновые аналоги белка, например, метионинсульфоновые и метионинсульфоксидные аналоги. Данное изобретение также включает соли белков, такие как аммониевые соли, в том числе алкил- или ариламмониевые соли, сульфаты, гидросульфаты, фосфаты, гидрофосфаты, дигидрофосфаты, тиосульфаты, карбонаты, бикарбонаты, бензоаты, сульфонаты, тиосульфонаты, мезилаты, этилсульфонаты и бензолсульфонаты.
Растворимый мономерный СО40-Ь-белок может содержать всю или часть внеклеточной области СО40-Б. Внеклеточная область СО40-Б содержит домен, который связывается с СО40. Таким образом, растворимый СО40-Б может ингибировать взаимодействие между СО40Б и несущей СО40 клеткой. Данное изобретение предполагает, что §СО40-Ь может составлять целую внеклеточную область СО40-Б или фрагмент или производное, содержащее домен, который связывается с СО40.
Растворимый СО40-белок (§СО40) содержит внеклеточную область СО40. 5θΌ4Ο ингибирует взаимодействие между СО40Б и СО40несущей клеткой. 8СО40 может находиться в мономерной или олигомерной форме.
В другом варианте воплощения данного изобретения белок, содержащий растворимую внеклеточную область СО40 или ее часть, содержит также Ес-область, слитую с внеклеточной областью СО40 или ее частью. В конкретном варианте воплощения изобретения Есобласть способна к связыванию с протеином А или протеином С. В другом варианте Ес-область содержит 1дС. 1§6ι, 1дС2. 1дС3. Ι§64, 1§А, Ι§Αι, 1дА2,1дМ, 1дЕ> или 1дЕ.
Растворимый слитый СО40/Ес-белок можно получить с использованием обычных методов разрезания ферментами и лигирования фрагментов из нужных последовательностей.
Подходящими Рс-областями для слитого белка являются Рс-области, которые могут связываться с протеином А или протеином С, или которые способны к распознаванию антителом, которое можно использовать при очистке или регистрации слитого белка, содержащего Рсобласть. Например, Рс-область может представлять собой Рс-область человеческого 1дС1 или мышиного 1дС1. Данное изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок С.П4()/Рс.
Хорошо известен способ создания растворимых форм мембранных молекул методами рекомбинантной технологии, при котором вырезаются последовательности, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены. См., для общего представления, патент США № 5057417, Наттопбк е! а1. Кроме того, хорошо известны способы получения кСО40 и слитого белка СЭ40/РС. См., например, международную публикацию РСТ № АО 93/08207; Рапк1о\г е! а1., 8о1иЫе Рогтк о! СО40 ΙπΙιίΝΐ Вю1одк Векропкек о! Нитап В Се11к, 1. 1ттипо1., уо1. 149, рр. 655-60 (1и1у 1992).
В варианте воплощения данного изобретения агент отбирают методом скрининга.
В конкретном варианте агент отбирают методом скрининга, включающим выделение образца клеток; культивирование образца в условиях, допускающих активацию несущих С.П40 клеток; приведение в контакт образца с клетками, экспрессирующими белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, или с белком, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, эффективными для активации 0040-несущих клеток; приведение в контакт образца с количеством агента, эффективным для ингибирования активации СО40несущих клеток, если агент способен ингибировать активацию СО40-несущих клеток; и определение того, активируют ли клетки, экспрессирующие белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, или белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, СО40-несущие клетки в присутствии этого агента. Образец клеток можно выделить из разных тканей, включая клеточные линии в культуре или клетки, извлеченные из животного, такие как клетки в суспензии твердой ткани, клетки, полученные при биопсии костного мозга, или клетки, выделенные из жидкости организма, такой как кровь или лимфа.
В другом конкретном варианте воплощения изобретения агента (молекулу) отбирают, основываясь на трехмерной структуре растворимой внеклеточной области СО40-лиганда или его части, способных к ингибированию взаимодействия между СО40-лигандом и СО40 на клетках. Указанный агент можно выбрать из библиотеки известных агентов, модифицировать известный агент на основе трехмерной структуры или спроектировать и синтезировать его заново, основываясь на трехмерной структуре. В конкретных вариантах воплощения изобретения агент (молекулу) проектируют посредством оптимизации структуры ведущего ингибирующего агента на основе трехмерной структуры комплекса растворимой области СО40лиганда или его части с ведущим ингибирующим агентом. Ведущий ингибирующий агент представляет молекулу, которая идентифицирована, которая, когда ее приводят в контакт с СО40-лигандом, связывается и образует комплекс с растворимой внеклеточной областью СО40-лиганда, СО40 или их частями, причем посредством этого снижается способность входящего в комплекс или связанного СО40лиганда или части СО40-лиганда активировать СО40-несущие клетки. В другом варианте ведущий ингибирующий агент может действовать посредством взаимодействия либо с внеклеточной областью СО40-лиганда или СО40, либо в тройном комплексе как с частью СО40-лиганда, так и с СО40, снижая способность входящего в комплекс с СО40 СО40-лиганда активировать СО40-несущие клетки. В способах изобретения СО40-лиганд может быть или растворимым или связываться с клетками, такими как активированные Т-клетки, и может представлять или непроцессированный нативный СО40-лиганд, или его части. Пониженную способность активировать СО40-несущие клетки можно измерить различными способами. Одним из способов ее измерения может быть демонстрация того, что СО40-лиганд в присутствии ингибитора вызывает активацию СО40-несущих клеток в меньшей степени по сравнению с обработкой клеток подобным количеством СО40-лиганда без ингибитора при тех же условиях. На пониженную способность активировать СО40-несущие клетки может также указать потребность в более высокой концентрации комплекса ингибитора с СО40-лигандом по сравнению с несвязанным СО40-лигандом для получения одинаковой степени активации СО40-несущих клеток при одинаковых условиях. В крайнем случае, ингибитор, приведенный в контакт с СО40-лигандом, может быть неспособен активировать СО40несущие клетки при концентрациях и при условиях, при которых возможна активация этих клеток несвязанным СО40-лигандом или его данной частью.
Агент (молекулу) можно выбрать посредством скрининга с применением вычислительной техники с использованием кристаллической структуры растворимого фрагмента внеклеточ ного домена человеческого СО40Ь, содержащего остатки С1у116-Ьеи261 (ПОСЛЕД. № 1) (8СО40Ь (116-261)).
Кристаллическую структуру, используемую при методе скрининга, определяют с разрешением 2А методом молекулярного замещения. Коротко, растворимый фрагмент внеклеточного домена человеческого СЭ40-лиганда, содержащего аминокислотные остатки с С1у 116 по С-концевой остаток Ьеи 261, сначала получают в растворимой форме, затем очищают и кристаллизуют. Кристаллы используют для сбора дифракционных данных. Молекулярное замещение и очистку осуществляют с помощью пакета программ ХРЬОК. и программного обеспечения ΟυΛΝΤΛ (Мо1еси1аг §1ти1а1юп8, 1пс.). В частности, 3-мерную модель человеческого 8СЭ40Ь создают с использованием модели мышиного СЭ40Ь с применением программы моделирования гомологии белков ΟυΛΝΤΛ. Эту модель используют в качестве зонда для вычислений при кристаллографическом анализе и совершенствуют с использованием ХРЬОК.. Этот способ определения кристаллической структуры 8СЭ40Ь подробнее описан в работе Кагршак е1 а1., 2 А сгу§1а1 ЧгисШге оГ ап ех1гасе11и1аг ГгадтеШ оГ йитап СЭ40 11-дапб, 8йисГиге (Ос1оЬег 1995), 3 (10):1031-1039. Атомные координаты 5СЭ40Ь (116-261) приводятся на фиг. 2А-Ш. Метод скрининга для отбора агента включает компьютерную разработку лекарственного средства и итеративную оптимизацию структуры, как описано ниже.
Агент может представлять собой ингибитор, выбранный с использованием компьютерной разработки лекарственного средства. При использовании этого метода координаты кристаллической структуры 8СЭ40Ь используют в качестве исходных данных для компьютерной программы, такой как ЭОСК, выдающей список молекулярных структур, которые, как ожидается, связываются с СО40Ь. Применение таких компьютерных программ хорошо известно. См., например, Кипк, ЗйисГиге-Вакеб 81га1еще5 Гог бгцд бебдп апб бщсоуегу. 8аепсе, уо1. 257, р. 1078 (1992). Список молекулярных структур затем можно скринировать посредством биохимических анализов на связывание СЭ40Ь. Можно использовать биохимические анализы конкурентного типа, которые хорошо известны. См., например, Ва)ога111 е1 а1., Гбепбйсабоп оГ геыбпе5 оГ СЭ40 апб й§ 1щапб \с1пс11 аге сгй1са1 Гог Гйе гесерГог-Ндапб йИегасПоп. Вюсйеткйу, 34, р. 1833 (1995). Структуры, для которых обнаруживают связывание с СО40Ь, можно, таким образом, использовать в качестве агентов для настоящего изобретения. Такой агент может также представлять собой модифицированную или разработанную молекулу, определенную посредством интерактивных циклов оптимизации структуры. С использованием такого подхода небольшую молекулу ингибитора СО40Ь, най денную с применением вышеописанного компьютерного подхода или иного подхода, можно сокриталлизовать с 5СЭ40Ь и кристаллической структурой комплекса, разрешенной посредством молекулярного замещения. Информацию, полученную с помощью молекулярного замещения, можно использовать для оптимизации структуры ингибиторов, выясняя, как молекулы взаимодействуют с СО40Ь. Молекулу можно модифицировать для улучшения ее физикохимических свойств, в том числе специфичности и аффинности к СО40Ь.
В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент представляет собой небольшую молекулу. Используемый здесь термин небольшая молекула относится к соединению с молекулярной массой от 20 Д до 1 х 106 Д, предпочтительно от 50 Д до 2 кД.
Данное изобретение также относится к способу ингибирования у субъекта активации СЭ40-лигандом клеток гладкой мускулатуры, несущих СЭ40 на поверхности клеток, включающему введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между 0040-лигандом и СЭ40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта.
В определенных вариантах воплощения 0040-несущие клетки гладкой мускулатуры представляют собой клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетки гладких мышц сосудов, клетки гладкой мускулатуры бронхов, клетки гладких мышц аорты, коронарные клетки гладкой мускулатуры, клетки гладкой мускулатуры легких или клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта. В более конкретных вариантах воплощения изобретения клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта представляют собой клетки гладких мышц пищевода, желудка или кишечника, в том числе клетки гладкой мускулатуры тонкой кишки или толстой кишки (кишечник).
В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент ингибирует связывание СЭ40-лиганда с СО40 на клетках.
В одном из вариантов осуществления данного изобретения указанный агент представляет собой белок. В другом варианте воплощения данного изобретения указанный агент представляет собой нонпротеин.
В определенном варианте осуществления данного изобретения белок содержит антитело или его часть, способные к ингибированию взаимодействия между СЭ40-лигандом и СО40 на клетках. Антитело является моноклональным или поликлональным антителом. В более специфическом варианте моноклональное антитело специфически связывается с эпитопом, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5с8 (АТСС, инвентарный номер НВ 10916). Примером такого моноклонального ан титела является моноклональное антитело 5с8 (АТСС, инвентарный номер НВ 10916). В других вариантах моноклональное антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.
В одном из конкретных вариантов часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область легкой или тяжелой цепи. В другом конкретном варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область. Еще в одном конкретном варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область. Еще в одном специфическом варианте часть антитела содержит ЕаЬ-фрагмент или антитело с одной цепью.
В другом варианте белок содержит растворимую внеклеточную область С.П40-лиганда или его часть, способные к ингибированию взаимодействия между СИ40-лигандом и СЭ40 на клетках; или растворимую внеклеточную область 0Ό40. или его часть, способные к ингибированию взаимодействия между С.П40лигандом и 0Ό40 на клетках. В специфическом варианте растворимая внеклеточная область С.П40-лиганда или 0Ό40 представляет собой мономер. В другом варианте растворимая внеклеточная область 0Ό40 представляет собой олигомер.
В другом варианте воплощения данного изобретения белок, содержащий растворимую внеклеточную область 0Ό40 или его часть, содержит также Ес-область, слитую с внеклеточной областью 0Ό40 или его частью. В определенном варианте воплощения изобретения Есобласть способна к связыванию с протеином А или протеином С. В другом определенном варианте Ес-область содержит 1дС, Ι§01, 1дО2, Ι§03, 1дС4, 1дА, 1§А1, 1дА2, 1дМ, ΙβΩ или 1дЕ.
При введении белков они часто быстро выводятся из циркуляции, и, следовательно, можно добиться относительно кратковременного фармакологического действия. В результате для поддержания терапевтической эффективности могут потребоваться частые инъекции относительно больших доз биологически активных белков. Известно, что белки, модифицированные посредством ковалентного присоединения водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин, демонстрируют существенно более длительные периоды полувыведения из крови после внутривенной инъекции, чем соответствующие немодифицированные белки (АЬис1ю\\ък| е! а1., в Епхутсх а§ Όιυ^δ, Но1сепЬегд е! а1., еб§. ^Йеу-1п1ег8с1епсе, Хс\\ Уогк, ΝΥ, 367-383 (1981); Апбегаоп, ^.Е. (1992), Нитап Сепе ТБегару. 8с1епсе, 255:808813; №\утагк е! а1. (1982), 1. Арр1. Вюсйет., 4:185-189; и Ка1ге е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8ск
И8А, 84:1487-1491 (1987)). Такие модификации могут также увеличить растворимость белка в водном растворе, устранить агрегацию, усилить физическую и химическую устойчивость белка и существенно уменьшить иммуногенность и антигенность белка. В результате нужной биологической активности ш у1уо можно достичь посредством менее частого введения таких полимернобелковых аддуктов, или введением их в меньших дозах, чем в случае немодифицированного белка.
Присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) к белкам особенно полезно, поскольку ПЭГ обладает весьма низкой токсичностью в организме млекопитающих (Сагреп1ег е! а1., 1971). Например, ПЭГ-аддукт аденозиндезаминазы одобрен в Соединенных Штатах Америки для применения людьми при лечении синдрома тяжелого сложного иммунодефицитного состояния. Второе преимущество, получаемое при конъюгации с ПЭГ, состоит в эффективном снижении иммуногенности и антигенности гетерологичных белков. Например, ПЭГ-аддукт человеческого белка может быть полезным для лечения болезни у других видов млекопитающих без риска возникновения тяжелой иммунной реакции. По одному из вариантов воплощения данного изобретения белок можно доставлять в устройстве для микроинкапсуляции, чтобы уменьшить или предотвратить иммунную реакцию хозяина против белка. Белок также можно доставлять инкапсулированным в оболочке, такой как липосома.
Полимеры, такие как ПЭГ, можно подходящим образом присоединить к одному или нескольким аминокислотным остаткам в белке, таким как α-аминогруппа аминоконцевой аминокислоты, ε-аминогруппы лизиновых боковых цепей, сульфгидрильные группы цис-теиновых боковых цепей, карбоксильные группы аспартильной или глутамиловой боковых цепей, αкарбоксильная группа карбоксиконцевой аминокислоты, тирозиновые боковые цепи, или к активированным производным гликозильных цепей, присоединенных к некоторым аспарагиновым, сериновым или треониновым остаткам.
Описаны многочисленные активированные формы ПЭГ, подходящие для прямого взаимодействия с белками. Полезными ПЭГ реагентами для взаимодействия с белковыми аминогруппами являются активные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в особенности, те, в которых отщепляющиеся группы представляют Ν-гидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1гидрокси-2-нитробензол-4-сульфонат. Производные ПЭГ, содержащие малеимидо- или галогенацетильные группы, являются полезными реагентами для модификации белка без сульфгидрильных групп. Подобным образом, ПЭГреагенты, содержащие аминогидразиновые или гидразидные группы, полезны для взаимодействия с альдегидами, образующимися при периодатном окислении углеводных групп в белках.
Субъект, которого можно лечить вышеописанными способами, представляет собой животное. Предпочтительно это животное является млекопитающим. Примерами млекопитающих, которых можно лечить, являются, но не ограничиваются перечисленным, человек, приматы (не человек), грызуны (в том числе крысы, мыши, хомяки и морские свинки), коровы, лошади, овцы, козы, свиньи, собаки и кошки.
В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент отбирают методом скрининга.
В определенном варианте агент отбирают методом скрининга, включающим выделение образца клеток; культивирование образца в условиях, допускающих активацию несущих СЭ40 клеток; приведение в контакт образца с клетками, экспрессирующими белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, или с белком, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, эффективным для активации СЭ40-несущих клеток; приведение в контакт образца с количеством агента, эффективным для ингибирования активации СЭ40несущих клеток, если агент способен ингибировать активацию СЭ40-несущих клеток; и определение того, активируют ли клетки, экспрессирующие белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, или белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5с8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, СЭ40-несущие клетки в присутствии этого агента. Образец клеток можно выделить из разных тканей, включая клеточные линии в культуре или клетки, извлеченные из животного, такие как клетки в суспензии твердой ткани, клетки, полученные при биопсии костного мозга, или клетки, выделенные из жидкости организма, такой как кровь или лимфа.
В другом определенном варианте воплощения изобретения молекулу (агент) выбирают, основываясь на трехмерной структуре растворимой внеклеточной области СЭ40-лиганда или его части, способных к ингибированию взаимодействия между СЭ40-лигандом и СЭ40 ка клетках. Указанную молекулу можно выбрать из библиотеки известных молекул, модифицировать известную молекулу на основе трехмерной структуры или разработать и синтезировать ее заново, основываясь на трехмерной структуре. В конкретных вариантах воплощения изо бретения агент или молекулу разрабатывают посредством оптимизации структуры ведущего ингибирующего агента на основе трехмерной структуры комплекса растворимой внеклеточной области СЭ40-лиганда или его части с ведущим ингибирующим агентом.
Способ лечения
Данное изобретение относится к способу лечения субъекта от заболевания, зависимого от клеток гладкой мускулатуры, включающему описанный выше способ ингибирования активации СЭ40-лигандом клеток гладкой мускулатуры, несущих СЭ40 на своей поверхности, который включает введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между СЭ40-лигандом и СЭ40 на клетках, причем этот агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта.
В одном из вариантов воплощения данного изобретения зависящая от клеток гладкой мускулатуры болезнь представляет собой сосудистое заболевание. В конкретном варианте воплощения изобретения сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.
В другом варианте воплощения данного изобретения зависящая от клеток гладкой мускулатуры болезнь представляет собой желудочно-кишечное заболевание. В конкретном варианте воплощения изобретения желудочнокишечное заболевание выбирают из группы, состоящей из нарушения моторики пищевода, воспаления кишечника и склеродермии.
В одном из вариантов воплощения изобретения зависящая от клеток гладкой мускулатуры болезнь представляет собой заболевание мочевого пузыря.
Соединения данного изобретения можно вводить любым способом, который приемлем с медицинской точки зрения. Это могут быть инъекции посредством парентеральных способов, таких как внутривенное, внутрисосудистое, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутриопухолевое, внутрибрюшинное, внутрижелудочковое, внутриэпидуральное введение, или другое, а также пероральный, назальный, офтальмический, ректальный, местный способы или ингаляция. Введение с отсроченным высвобождением также определенно включается в изобретение, с помощью таких средств, как инъекция разрушаемых имплантатов, непосредственно применяемых во время операции.
Соединения вводят в любой дозе на массу тела и с любой частотой, которые приемлемы с медицинской точки зрения. Приемлемая дозировка включает интервал примерно от 0,01 до 200 мг на кг массы тела субъекта. Предпочтительный интервал доз составляет примерно 0,150 мг/кг. Особенно предпочтительна доза примерно в 1-30 мг/кг. Введение дозы повторяют с интервалами от ежесуточного до ежемесячного. При одной из предпочтительных схем приема соединение согласно изобретению должно вводиться ежесуточно в первые трое суток лечения, после чего соединение вводят каждые 3 недели, причем каждое введение представляет собой внутривенное введение 5-10 мг на кг массы тела. По другой предпочтительной схеме соединение изобретения должно вводиться внутривенно ежесуточно в количестве 5 мг на кг массы тела в первые трое суток лечения, после чего соединение вводят подкожно или внутримышечно каждую неделю в количестве 10 мг на субъекта. При другой предпочтительной схеме необходимо вводить парентерально однократную дозу соединения изобретения в 20 мг на кг массы тела, после чего соединение вводят подкожно или внутримышечно каждую неделю в количестве 10 мг на субъекта.
Соединения согласно изобретению можно вводить в виде однократной дозы в случае определенных показаний, таких как предотвращение иммунной реакции на антиген, воздействовующий на субъекта непродолжительное время, такой как экзогенный антиген, вводимый в определенный день лечения. Примеры такого антигена могут включать совместное введение соединения согласно изобретению вместе с генотерапевтическим вектором, или лечебным средством, таким как антигенный, фармацевтический продукт или продукт из крови. При показаниях, когда антиген присутствует постоянно, таких как регулирование иммунной реакции против трансплантированной ткани или постоянно вводимых антигенных фармацевтических средств, соединения согласно изобретению вводят в течение времени, соответствующего медицинским показаниям, на протяжении от суток или недель до всей жизни субъекта.
Воспалительные реакции характеризуются покраснением, отеком, повышенной температурой тела и болью как следствиями расширения капилляров при отеке и миграции фагоцитарных лейкоцитов. Определение воспаления также дается у ОаШи (Сйар1ег 26, Еиибатеи1а1 1ттиио1оду, 26 Еб., Кауеи Рге55. №\ν Уогк, 1989, рр. 721-733), что включено в настоящее описание в виде ссылки.
Данное изобретение можно лучше понять из приведенных далее подробностей эксперимента. Однако специалисту в этой области техники легко представить, что обсуждаемые конкретные способы и результаты только поясняют изобретение, более полно описанное в приведенной далее формуле изобретения.
Подробности эксперимента
Приведенные ниже примеры 1 и 2 показывают, что цитокины в зоне воспаления побуждают клетки гладкой мускулатуры экспрессировать СБ40. Кроме того, в них показано, что опосредованные СБ40Ь сигналы регулируют функции клеток гладкой мускулатуры.
Пример 1.
Чтобы исследовать, экспрессируют ли клетки гладких мышц СБ40, используют ЕАС8анализ. В 6-луночных планшетах культивируют клетки гладких мышц аорты человека в среде М119 с добавлением 25% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕС8), 5% человеческой сыворотки, 90 мкг/мл гепарина, 15 мкг/мл энедотелиоцитарного фактора роста и 1% пенициллина-стрептомицина. Среду заменяют каждые 2-3 дня, и когда клетки почти сольются, их в течение 72 ч выращивают в присутствии или в отсутствие ΙΡΝ-γ (1000 Е/см3), 1Ь-1а (1 нг/см3) или ΤΝΡ-α (200 Е/см3). Клетки собирают посредством обработки трипсином с ЭДТА, и посредством ЕАС8-анализа с использованием тАЬ против СБ40 028.5 определяют экспрессию СБ40. Клетки также окрашивают изотопным отрицательным контрольным тАЬ, а в качестве положительного контроля используют тАЬ против СБ54 (1САМ-1).
Клетки гладкой мускулатуры конститутивно не экспрессируют СБ40, как показано на фиг. 1А. Однако ΙΡΝ-γ в противополжность 1Ь1α или ΤΝΡ-α активирует экспрессию СБ40 клетками гладкой мускулатуры (фиг. 1А, Б и В). Эти исследования показывают, что ΙΡΝ-γ активизирует экспрессию СБ40 на клетках гладкой мускулатуры аорты человека.
Пример 2.
Проверяют экспрессию СБ40 на клетке гладкой мускулатуры ίη δίΐιι. Клетки, обнаруженные в средах здоровых сосудов, которые морфологически похожи на клетки гладких мышц, не реагируют с тАЬ против СБ40. Однако клетки, которые морфологически схожи с клетками гладких мышц, обнаруженными в пределах зоны воспалительных повреждений при ускоренном атеросклерозе, связанном с трансплантацией, экспрессируют СБ40 ίη δίΐιι. Эти исследования наводят на мысль, что цитокины в зоне воспаления побуждают клетки гладких мышц экспрессировать СБ40. Кроме того, эти исследования показывают, что опосредованные СБ40Ь сигналы регулируют функции клеток гладкой мускулатуры.
Пример 3.
СБ40Ь+СБ4+-Т-клетки и СБ40+-клеткимишени присутствуют при атеросклерозе и гомологичной коронарно-артериальной болезни. Активированные эндотелиальные клетки (ЕС), макрофаги (Мас) и СБ4+-Т-клетки присутствуют в начале в повреждениях при коронарном атеросклерозе (СА) и гомологичном кардиоатеросклерозе (ТА). Поскольку СБ40Ь является индуцированной активацией молекулой поверхности СБ4+-Т-клетки, которая доставляет контактзависимые активирующие сигналы к СБ40+-клеткам-мишеням, включая ЕС (активированные 1САМ, УСАМ и экспрессией Еселектина) и Мас (вызывает продукцию ΝΟ, ΤΝΡ-α и 1Ь-1), авторы исследуют экспрессию ίη 8Йи СБ40Ь и СБ40 при СА (и=5) и ТА (и=5).
Экспрессию СЭ40Ь и С 040 определяют с использованием тЛЬ против СЭ40Ь 5С8, тЛЬ против СЭ40 028.5 или подходящих контрольных тАЬ. Замороженные срезы здоровых венечных артерий (п=3) не содержат Т-клеток, и экспрессия 0Ό40 ограничивается ЕС. Напротив, повреждения, связанные с СА и ТА, содержат СО40Г СО4'-Т-клетки. что определяется посредством иммунного мечения серийных срезов. Кроме того, заметно активируется экспрессия СЭ40 в замороженных срезах от пациентов с СА и ТА на ЕС, проникающих мононуклеарных клетках, пенистых клетках и клетках гладкой мускулатуры интимы (8МС). Двухцветовой иммуногистохимический анализ фиксированной в парафине ткани с использованием специфических маркеров для 8МС (актин гладких мышц) или Мас (НАМ-56) подтверждает экспрессию СО40 на этих клетках. Интересно, что 8МС интимы, отдаленные от клеток зоны воспаления, и медиальные 8МС представляют собой 0040/ что приводит к мысли, что медиаторы местного воспаления активируют экспрессию СО40 на 8МС ίη νίνο. Активация СИ40 и СО40Ь+СО4+-Тклетки обнаруживаются на всех стадиях ТА и наиболее заметны в зонах ранних повреждений при СА, включая жировые полоски. Одновременно эти исследования приводят к мысли, что СО40Ь+-Т-клетки могут взаимодействовать с СО40+-клетками-мишенями при СА и ТА и вносят вклад в патогенез этих болезней, промотируя синтез молекул зоны провоспаления.
Пример 4. СП40 экспрессируется на клетках гладкой мускулатуры и макрофагах в зонах повреждения при гомологичном атеросклерозе.
Экспрессия СИ40 ίη δίΐιι при нативном атеросклерозе или атеросклерозе, связанном с трансплантацией, исследуется с помощью двухцветного иммуногистохимического анализа. Иммуногистохимические исследования с двойным мечением осуществляют на венечных артериях, зафиксированных в 10% забуференном формалине и залитых парафином. Срезы освобождают от парафина в ксилоле, гидратируют и блокируют эндогенную пероксидазу 1/5% Н2О2 в 80% спирте. Затем срезы переваривают 0,01% пепсином в НС1 (рН 1,5) в течение 15 мин при 37°С. Затем срезы промывают в РВ8 и инкубируют с 10% лошадиной сывороткой в течение 20 мин для блокирования неспецифического окрашивания. Затем анти-СО40-окрашивание обнаруживают с помощью набора Уес1от АВС Е1йе (Уес1от) с использованием последовательно в качестве проявителя биотинилированного вторичного антитела, авидинпероксидазного комплекса и 3,3'-диаминобензидина. Присутствие СО40 отмечают как коричневое окрашивание. После этого срезы промывают в РВ8 и снова блокируют с 10% лошадиной сыворотки. Затем срезы инкубируют в течение 1 ч с тАЬ, специфическими клетками гладкой мускулатуры (актин гладких мышц) или к макрофагам (НАМ 56). Первичные антитела затем конъюгировали со щелочной фосфатазой с использованием авидин-биотиновой системы (Уес1от). Вектор Веб (Уес1от) используют для обнаружения активности щелочной фосфатазы, а окрашивание дает красный цвет. Следовательно, двукратно меченные клетки окрашиваются в коричневый цвет (СО40) и красный цвет (клетки гладких мышц или макрофаги). Чтобы проконтролировать взаимное влияние двух иммуногистохимических процедур, используемых для двухмаркерного анализа, серийные срезы каждого образца также окрашивают или актином гладких мышц для СО40, или НАМ 56. См. фиг. 3А и Б. Контрольные срезы показывают такое же распределение иммунореактивности для каждого из первичных тАЬ, как и срезы с двойным окрашиванием.
Пример 5. Распределение СО40Ь и СЭ40 при нативном коронарном атеросклерозе и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией: корреляция экспрессии СО40 с присутствием факторов межклеточной адгезии, активированных ΝΡ-кВ в присутствии Тлимфоцитов.
Т-клетки играют определенную роль в патогенезе нативного коронарного атеросклероза (СА) и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией (ТСАО), однако, механизм, с помощью которого Т-клетки взаимодействуют с другими клетками при таких повреждениях, известен не вполне. СО40Ь представляет собой индуцированную активацией молекулу на поверхности СО4+-Т-клетки, которая взаимодействует с СО4+-клеткамимишенями, включая макрофаги и эндотелиальные клетки, и вызывает продукцию молекул зоны провоспаления, в том числе 1САМ-1 и УСАМ-1. Кроме того, известно, что лигирование СО40 активирует фактор транскрипции ΝΡкВ. Чтобы исследовать, могут ли взаимодействия С040Ь-С040 играть роль в патогенезе СА или ТСАО, осуществляют иммуногистохимические исследования экспрессии СО40Б и СЭ40 на замороженных срезах венечных артерий, полученных от реципиентов кардиального аллотрансплантата с СА (п=9) или ТСАО (п=9). При использовании двух разных тАЬ против СО40Б находят, что экспрессия СО40Б при СА и ТСАО ограничена инфильтрующими лимфоцитами. При обоих заболеваниях экспрессия СО40 заметно активируется на эндотелиальных клетках интимы, пенистых клетках, макрофагах и клетках гладкой мускулатуры. Двойное иммунное окрашивание показывает, что многие СО40+клетки коэкспрессируют 1САМ-1, УСАМ-1 или активированную форму ΝΡ-кВ. Степень экспрессии СО40, 1САМ-1 и УСАМ-1 показывает значимую статистическую корреляцию с тяжестью заболевания и количеством лимфоцитов в интиме. В то же время эти исследования пока зывают присутствие активированных СО40Б- и СЭДО'-клсток в очагах повреждения как при СА, так и при ТСАЭ, и наводят на мысль, что опосредованные СЭ40Р взаимодействия с СО40+-макрофагами, пенистыми клетками, клетками гладкой мускулатуры и/или эндотелиальными клетками могут вносить вклад в патогенез этих заболеваний.
Ряд данных показывает, что опосредованные клетками иммунные механизмы вносят вклад в воспалительные повреждения (1-4), характерные для нативного коронарного атеросклероза (СА) (5-10) и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией (ТСАЭ) (11-13). Например, инфильтрирующие Т-клетки интимы, экспрессирующие маркеры активации, такие как С'П25 и молекулы класса II ГКГС, присутствуют с начала развития повреждений сосудов при обоих заболеваниях (5, 14). Обычно в местах повреждения при обоих заболеваниях обнаруживаются активированные макрофаги, как цитокины, связанные с зависимыми от Тклеток иммунными реакциями, включая ΣΡΝ-γ, 1Ь-1 и ΤΝΡ-α, (5-17). В качестве другого доказательства того, что Т-клетки могут играть патогенную роль при СА, из фиброатероматозных СА-бляшек человека выделены клоны С'П4'-Тклеток, которые пролиферируют и секретируют ΙΡΝ-γ в присутствии окисленного ЬПЬ (18) основного элементам повреждений как при нативном СА, так и при ТСАЭ (1, 19, 20). Кроме того, индуцированные гиперлипидимией атеросклеротические повреждения у мышей, обработанных тАЬ против СЭ4. уменьшаются (21). Подобным образом сосудистые повреждения при ТСАП существенно корригируются, когда аллотрансплантаты подсаживают в линии мышей с генетическим дефицитом Т-клеток (13) или обработанных тАЬ против С'П4 (13) или против ΙΡΝ-γ (22). Одновременно эти данные позволяют уверенно предположить, что Тклетки и образовавшиеся из Т-клеток молекулыэффекторы участвуют в патогенезе этих заболеваний (9, 23, 24).
СП40Ь представляет собой поверхностную молекулу с м.м. 30-33 кД, экспрессируемую на активированных СП4+-Т-клетках, которая доставляет контакзависимые сигналы к СЭ40'клеткам-мишеням, таким как В-клетки (25-29). Опосредованные СП40Ь сигналы являются существенно важными при развитии зависимых от Т-клеток гуморальных иммунных реакций ίη νίΐτο и ίη νίνο (30). Неизвестно, что взаимодействия СП40Ь-СП40 также играют роль при опосредованных клетками иммунных реакциях ίη νίΐτο и ίη νίνο (31, 32). Интересно, что макрофаги и эндотелиальные клетки - клеточные типы, как известно, принимающие участие в патогенезе СА и ТСАЭ - также экспрессируют СЭ40 (3337). Кроме того, лигирование С'П40 с макрофагами и эндотелиальными клетками ίη νίΐτο вы зывает продукцию факторов, которые усиливают иммунные реакции и/или обладают провоспалительным действием. Например, взаимодействия СП40Ь-СП40 активируют экспрессию ГКГС класса II и костимулирующего фактора С'П86 на макрофагах ίη νίΐτο (38). Кроме того, лигирование СП40 с макрофагами вызывает продукцию цитокинов (ΤΝΙ-α, ΡΠ-1β, ГР-12), хемокинов (0-8, МР-Р/Д окиси азота (ΝΟ) через индукцию синтеза ΝΟ (2), белкового тканевого фактора прокоагуляции и металлопротеиназ матрикса (33, 34, 39-42). Взаимодействия СП40Ь-СП40 активируют факторы межклеточной адгезии СП54 ДСАМ-1), СО 106 (УСАМ-1) и СП62Е (Е-селектин) на эндотелиальных клетках (35-37). Многие из эффектов лигирования СП40 зависят от активации фактора транскрипции ΝΡ-κΒ (43-45).
Вместе с тем, эти данные приводят к представлению, что лигирование СП40 с различными клетками-мишенями может усилить опосредованную С'П4'-Т-клетками воспалительную реакцию ίη νίνο. В поддержку такого предположения выступает факт, что экспрессия СЭ40 активируется в почках больных с напоминающим волчанку гломерулонефритом, !дАнефропатией и АNСА+-гломерулонефритом, и в коже больных псориазом (35, 46). Кроме того, СП40Р+-Т-клетки инфильтрируют почки больных с воспалительными болезнями почек (46). Поскольку взаимодействия Т-клеток с макрофагами, эндотелиальными клетками и, возможно, другими клетками играют роль в патогенезе СА и ТСАЭ, в данном исследовании с помощью иммуногистохимических методов изучается экспрессия СП40Ь и СЭ40 при этих двух заболеваниях. СП40Ь экспрессируется на Т-клетках, а экспрессия СП40 активируется на эндотелиальных клетках, клетках гладкой мускулатуры, макрофагах и пенистых клетках в местах повреждения интимы при обоих заболеваниях. Кроме того, с использованием двойного иммунного окрашивания обнаруживается, что многие СП40+-клетки в этих повреждениях коэкспрессируют 0054, СО 106 и активированную форму ΝΡ-κΒ.
Методы: человеческие венечные артерии
Получают сегменты из главной левой венечной артерии или проксимальной части левой передней нисходящей артерии от эксплантированных сердец 23 реципиентов кардиального аллотрансплантата. Девять больных подвергаются ретрансплантации, поскольку у них развилась тяжелая коронарно-артериальная болезнь, связанная с трансплантацией (ТС АО). У этих больных продолжительность существования первого аллотрансплантата составила от 38 до 103 месяцев. Десять больных получают кардиальные трансплантаты, потому что у них развилась тяжелая коронарно-артериальная болезнь и ишемическая кардиомиопатия. Кон трольные венечные артерии без атеросклеротических изменений получают из эксплантированных сердец 4 больных; у 3 идиопатическая кардиомиопатия, у одного кардиальная саркома. Части каждого сосуда быстро замораживают в изопентане при -80°С и делают серийные срезы толщиной 4 мм на криостате (Кс1сНсг( НМоЧа!). Срезы помещают на покрытые сиалином предметные стекла, сушат на воздухе, фиксируют в холодном ацетоне в течение 1 мин, еще в течение 7 мин в холодной смеси ацетона с хлороформом (1:1) и хранят при -80°С. По одному срезу от каждой венечной артерии фиксируют в 10% формалине и окрашивают гематоксилином и эозином для гистологической оценки.
Первичные антитела
Гибридому 628.5 (1д61) против СЭ40 закупают у Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд). шАЬ 5С8 (1д62а) против СО40Ь генерируют так, как описано ранее (28). тАЬ, как 628.5, так и 5С8, очищают от асцитов с использованием колонки с протеином 6 (Рйаттас1а, Р18са1а^ау, Нью-Джерси). Другое тАЬ против СО40Ь (1д61) закупают у Са1Ьюсйст (Сан-Диего, Калифорния). 1дМ - тАЬ против СЭ40 закупают у Са11ад (Витбидате, Калифорния), и используют для исследований с двойным иммунным окрашиванием. Моноклональные антитела против ί.Ό3. СЭ4. СЭ8. ί.Ό34. СО68 (Ыоуоса81га, ВшИпдйат, Калифорния, все 1д61) и актина гладкой мускулатуры (8МА) (ОАКО, СатрЫепа, Калифорния, 1д62а) используют для распознавания различных типов клеток бляшек интимы, в том числе, Т-клеток (СЭ3, СЭ4 или 608), эндотелиальных клеток (СО34), макрофагов (СЭ68) и клеток гладкой мускулатуры (8МА). У СНЕМ1СОЫ™ (Тетеси1а, Калифорния) закупают тАЬ против 1САМ1 (1д61) и против УСАМ-1 (1д61). Распределение активированного ΝΡ-кВ определяют с помощью р65тАЬ (1д63) (ВОЕНКГЫ6ЕК МАNNΗΕIМ™), которое связывается с эпитопом на субъединице р65 ΝΡ-кВ, блокированного 1кВ, и поэтому доступной только, когда ΝΡкВ активируется в результате диссоциации 1кВ (47). Изотипное контрольное тАЬ (Морес 21, 22) получают от 816МА™ (Сент-Луис, Миссури).
Иммуногистохимия
Замороженные срезы промывают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8) и эндогенную пероксидазу блокируют 0,5% перекисью водорода. Срезы блокируют 10% козьей сывороткой и агрегированным 1д человека (80 мг/мл) в РВ8 и затем инкубируют в течение одного часа с указанным первичным тАЬ или соответствующим контрольным тАЬ. Замороженные срезы миндалин с фолликулярной гиперплазией используют в качестве позитивного контроля для определения оптимального разведения каждого тАЬ. Первичное тАЬ, связанное с антигеном-мишенью, присоединяют к меченному биотином изотипному специфическому козьему антимышиному 1д61, 1д62а, 1д63 или 1дМ (Ещйет 8с1еп1Ию, Питтсбург, Пенсильвания), которое затем конъюгируют с авидин-биотин-пероксидазными комплексами (УЕСТОК ЕЫТЕ К1Т™, УЕСТОК™, ВшЛид113111, Калифорния). Перокидазную активность обнаруживают с помощью хромогена (красный) 3-амино-9-этилкарбазола (АЕС, УЕСТОК™, ВшИидйат, Калифорния), и срезы окрашивают контрастным веществом гематоксилином Майера (816МА™, Сент-Луис, Миннесота).
Иммуногистохимию с двойным окрашиванием используют для идентификации типов клеток, экспрессирующих СЭ40, и для определения распределения СЭ40 относительно 1САМ-1, УСАМ-1 или активированного ΝΡ-кВ при атеросклеротических повреждениях. Все срезы сначала метят иммунно с помощью 1дМтАЬ против СЭ40. Вторичное антитело представляет собой биотинилированный козий антимышиный 1дМ, который затем конъюгируют с авидин-биотин-пероксидазным комплексом. Хромоген, используемый для обнаружения присутствия 1дМ-тАЬ против СЭ40, представляет собой 3,3'-диаминобензидин (коричневое окрашивание). Срезы затем тщательно ополаскивают и инкубируют со вторым первичным тАЬ, имеющим мишенью или специфический маркер клеток гладкой мускулатуры (8МА), или макрофаги (СО68), лекоцитарные факторы адгезии (1САМ-1, УСАМ-1) или активированную форму ΝΡ-кВ. Все эти вторые первичные антитела представляют собой изотипы или 1д61 или 1д62а или 1д63. Применяют соответствующее изотипное специфическое биотинилированное вторичное антитело и конъюгируют с комплексом авидина с биотином и щелочной фосфатазой (УЕСТОК™, ВшИидйат, Калифорния). Активность щелочной фосфатазы регистрируют с помощью хромогена Уес1от Кеб (УЕСТОК™, ВшИидйат, Калифорния). Взаимных помех при последовательно применяемых процедурах окрашивания избегают путем использования различных иммуноферментных методов (пероксидаза против щелочной фосфатазы) и изотипных специфических вторичных антител для каждого антигена-мишени. Кроме того, получают контрольные срезы с двойным мечением, в которых одно из двух первичных тАЬ замещают изотипным подобранным под пару контрольным тАЬ.
Полуколичественный анализ повреждений
Степень атеросклеротических повреждений в каждом срезе определяют количественно по степени сужения просвета в сосуде по шкале от 0 до 4, на которой 0 указывает на отсутствие сужения, 1 соответствует сужению просвета менее 25%, 2 - сужению менее 50%, 3 - менее 90%, и 4 - сужению просвета свыше 90%. Каж дое повреждение венечной артерии также оценивают на содержание в нем макрофагов в интиме, клеток гладких мышц, пенистых клеток, эндотелиальных клеток (неоваскуляризация) (48) и Т-клеток, причем 0 указывает на отсутствие клеток соответствующего типа, 1 на редкие отдельные клетки, 2 соответствует небольшим скоплениям клеток, 3 - наличию точечных плотных скоплений, и 4 соответствует наличию плотных скоплений по всей бляшке. Подобным образом, присутствие СО40,1САМ-1 и УСАМ-1 оценивают по шкале от 0 до 4, на которой 0 указывает на отсутствие соответствующего фактора, 1 - на присутствие его на отдельных клетках, 2 соответствует присутствию данного фактора на менее 50% всех клеток, 3 - на менее 90%, и 4 - на более 90% всех клеток (49). Поскольку экспрессия СО40Б в положительных образцах ограничивается отдельными клетками, ее наличие не поддается количественной оценке.
Статистический анализ
Различия в гистохимических оценках групп образцов анализируют с использованием параметрической процедуры по 1<ги5ка1-\Уа11|5. Связь между переменными оценивают с использованием корреляции Спермана.
Результаты: здоровые венечные артерии
Сегменты венечных артерий от 4 контрольных больных не обнаруживают в интиме утолщения или воспаления, как показывает окрашивание Н&Е (фиг. 4А-Б). А именно, в интиме не регистрируются макрофаги, клетки гладкой мускулатуры или лимфоциты, и клетки не являются иммунореактивными в отношении какого-либо шАЬ против 0’0400 используемого при этом исследовании. Иммуннореактивность в отношении 0040 присутствует и ограничивается эндотелиальными клетками, выстилающими просвет сосуда контрольных артерий (фиг. 4Б). УСАМ-1 или активированный ΝΡ-κΒ не экспрессируются в контрольных сосудах, а 1САМ-1 слабо экспрессируется на редких сосудистых эндотелиальных клетках.
Гистология нативного СА и ТСАО
У 7 из 10 пациентов с СА в сегментах венечных артерий обнаруживают заметные фиброатероматозные бляшки с внецентровым сужением, ацеллюлярными изобилующими липидами сердцевинами, холестериновыми щелями и перекрывающими фиброзными шапочками. Клеточное сообщество повреждений наибольшее в плечевых участках, содержащих макрофаги и лимфоциты (фиг. 5А). В очагах повреждения интимы также разбросаны клетки гладкой мускулатуры, макрофаги, пенистые клетки и центры неоваскуляризации. Бляшки от 3 больных с умеренными, ранними сосудистыми повреждениями являются внецентровыми небольшими, изобилующими макрофагами, пенистыми клетками и лимфоцитами.
Паталогические изменения венечных артерий у 9 больных с ТСАЕ) обнаруживают кольце вое утолщение интимы с заметным сужением просвета (табл. 2).
Таблица 2
Полуколичественная оценка (шкала 0-4) клеточного состава в очагах повреждения интимы при нативном коронарном атеросклерозе (СА) и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией (ТСАО), и иммуннореактивность в отношении СО40, 1САМ-1 и УСАМ-1. Величины даются в виде среднего значения ± стандартное отклонение
Интимная бляшка Контроль (п=4) СА (п=10) ТСАБ (п=9)
Утолшение 0,3 ± 0,5 2,1 ± 0,9* 3,1 ± 0,8*
СО4‘-лимфоциты 0 1,3 ± 0, 9* 3,2 ± 0,8*
СЭ8‘-лимфоциты 0 0,3 ± 0,5 2,6 ± 1,1*
Макрофаги (СБ68) 0,5 ± 0,6 2,1 ± 0,8* 3,8 ± 0,4*
Пенистые клетки 0 1,2 ± 0,8* 2,4 ± 1,3*
Клетки гладких мышц 0,8 ± 1 1,7 ± 0,7 2,9 ± 0,8*
Неоваскуляризация 0 1,8 ± 0,7* 2,6 ± 0,9*
СЭ40 0,5 ± 0,6 2,2 ± 0,7* 3, 3 ± 0,9*
1САМ-1 0,5 ± 0,6 2,3 + 1,7* 3,6 ± 0,7*
УСАМ-1 0,3 ± 0,5 1,7 ± 0,7* 2,9 + 0,9*
* р < 0,5 в случае СА или ТСАО при сравнении с контролем по критерию КгизкаБАУаШз
Повреждения состоят из концентрических слоев клеток гладкой мускулатуры и интерстициального матрикса и имеется обильная инфильтрация макрофагов и лимфоцитов наряду с областями неоваскуляризации. В 4 венечных артериях, кроме концентрических слоев клеток гладкой мускулатуры, видны изобилиующие липидами атероматозные повреждения и пенистые клетки (фиг. 6А-В). Субэндотелиальные скопления лимфоцитов (эндотелит) и агрегаты лимфоцитов в адвентициальной оболочке также являются признаками, отмечаемыми в повреждениях при ТСАО.
Иммуногистохимический анализ экспрессии
СО40Ь-при СА и ТСАИ
В отличие от здоровых венечных артерий, свободных от инфильтрующихся лимфоцитов или экспрессирующих СО40 клеток, повреждения как при С А, так и при ТСАО содержат СО40Ь+-клетки. При нативном атеросклерозе положительное иммунное окрашивание для СО40Ь ограничивается меньшей частью лимфоцитов интимы. Окрашивание 0О4ОЬ обычно слабое и наблюдается или в небольших цитоплазматических гранулах, или на поверхности клеток (фиг. 7А-Г). При нативном СА большинство лимфоцитов интимы представляют собой СО4+-клетки; СО8+-Т-клетки встречаются только изредка (фиг. 7А-Г). Анализ серийных срезов, окрашенных птАЬ против СО4 или против СО8, дает основания полагать, что СО40Ь+лимфоциты представляют собой главным образом СО4+-Т-клетки. Эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, макрофаги и пенистые клетки не взаимодействуют с какимлибо птАЬ против СО40Б, используемом при этом исследовании. Окрашивания не отмечается с изотипными контрольными птАЬ.
В повреждениях при Т0А0 положительное иммунное окрашивание для 0О40Б также связано исключительно с лимфоцитами (фиг. 8А-В). В отличие от СА в повреждениях при Т0А0 присутствуют как 0Ό8+-, так и СЭ4'-Тклетки. Однако СЭ8+-Т-клетки обнаруживаются преимущественно в субэндотелиальных областях эндотелита (фиг. 9А-Б), в то время как СЭ4+-Т-клетки локализуются в скоплениях глубоко в интиме вблизи внутренней эластической мембраны (фиг. 8А-В) и адвентициальной оболочки венечных артерий. Экспрессия 0О40Б при Т0А0 в пространственном отношении коррелирует с 0О4+-Т-клетками в интиме и адвентициальной оболочке венечных артерий. Число 0040Б -Т-клеток в повреждениях при Т0А0 больше, чем при СА. Как и в случае СА, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, макрофаги или пенистые клетки в повреждениях при Т0А0 не взаимодействуют с каким-либо тАЬ против 0Ό406, используемым при этом исследовании (фиг. 9А-Б). Эти данные показывают, что в повреждениях при нативном СА и Т0А0 присутствуют экспрессирующие 0О40Б клетки, вероятно, СЭ4+-Т-клетки.
Иммуногистохимический анализ экспрессии СИ40 при СА и ТСАИ
В отличие от слабой экспрессии 0Ό40, ограниченной в здоровых венечных артериях люминальными эндотелиальными клетками (фиг. 4А-Б), 0040-иммуннореактивность активируется и широко распространяется в повреждениях при нативном СА (фиг. 5А-Б). Экспрессия 0Ό40 отмечается на эндотелиальных клетках, клетках гладкой мускулатуры, макрофагах и пенистых клетках. Среднее число СЭ40-положительных клеток в местах повреждения интимы при нативном СА существенно выше, чем в контрольных артериях (2,2±0,7 против 0,5±0,6, табл. 2). Двойное иммунное окрашивание со специфическими маркерами макрофагов или клеток гладких мышц подтверждает, что эти клетки и пенистые клетки обеих линий дифференцировки экспрессируют 0Ό40 (фиг. 10А-Б). Интересно, что СЭ40+-клетки гладких мышц присутствуют в интиме в тесной связи с воспалительными инфильтратами, в то время как клетки гладкой мускулатуры в артериальных срезах не показывают положительной иммунологической реактивности в отношении 0Ό40 (фиг. 10А-В). Анализ серийных срезов, окрашенных 0Ό40 или эндотелиальным маркером 0Ό34, наводит на мысль, что эндотелиальные клетки, выстилающие интиму новых сосудов и адвентициальные сосуды сосудов, также определенно представляют собой 0Ό40+ (фиг. 11А-Г).
В артериях от больных Т0А0 картина локализации экспрессии 0Ό40 подобна случаю нативного СА. Однако средний показатель 0040-иммунореактивности существенно выше при Т0А0, чем при нативном СА или в случае контрольных артерий (табл. 2). Двойное иммун ное окрашивание показывает, что клетки гладкой мускулатуры интимы, макрофаги экспрессируют 0040 (фиг. 10А-В). Однако пенистые клетки (фиг. 6А-Б) и эндотелиальные клетки, выстилающие просвет сосуда, интима новых сосудов и адвентициальные сосуды сосудов, явно представляют собой 0040'. Итак, эти данные показывают, что эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, макрофаги экспрессируют 0040 как при нативном СА, так и при Т0А0.
Взаимосвязь экспрессии СИ40 с факторами межклеточной адгезии и активацией ΝΓ- В в местах повреждений при Са и ТСАИ Макрофаги и эндотелиальные клетки при СА и Т0А0 экспрессируют факторы межклеточной адгезии, которые регулируют направление миграции лейкоцитов в очаги повреждения. Поскольку лигирование 0040 индуцирует активацию факторов межклеточной адгезии и активацию ΝΡ-кВ на клетках ίη νίίτο, спрашивается, связана ли экспрессия 0040 с коэкспрессией факторов межклеточной адгезии или ΝΡ-кВ в повреждениях при СА или Т0А0. В первую очередь показывают, что при нативном СА люминальные эндотелиальные клетки проявляют фокальное положительное иммунное окрашивание в случае ГСАМ-1 с редко встречающимися эндотелиальными клетками, экспрессирующими У0АМ-1. В противоположность этому, эндотелиальные клетки, выстилающие интиму новых сосудов адветициальные сосуды сосудов, определенно положительны в отношении ГСАМ-1 и У0АМ-1 (фиг. 11А-Г). Клетки гладкой мускулатуры интимы, макрофаги и пенистые клетки также умеренно определенно положительны в отношении ГСАМ-1 и У0АМ-1 (фиг. 12А-Г). Имеется существенная корреляция (р <0,05) между показателями для 0040 и показателями для ГСАМ-1 (г=0,85) и У0АМ-1 (г=0,72). Число лимфоцитов в интиме значимо коррелирует с показателями для 0040 и факторов лейкоцитарной адгезии (табл. 3).
Таблица 3
Корреляция показателей (0-4) для различных типов клеток в очагах повреждения интимы при СА (п=10) или Т0АБ (п=9) с показателями (0-4) для экспрессии 0Б40 и факторов адгезии (ЮАМ-1, У0АМ1). Величины выражаются в виде коэффициента корреляции Спермана (интервал от -1 до 1, где 0 - отсутствие корреляции, а -1 или 1 - полная корреляция)
Тип клеток Группа 0'1)40 ЮАМ-1 У0АМ-1
Т-лимфоциты СА 0,78* 0,77* 0,83**
(0Ώ4+ и 0'1)8·) Т0А1) 0,79* 0,87** 0,77*
Макрофаги СА 0 93*** 0,84** 0,77*
(0Ώ68+) Т0А1) 0,81** 0, 68* 0,55
Пенистые клетки СА 0,81** 0,68* 0,36
Т0А1) 0,44 0,33 0,26
Клетки гладких мышц СА 0,72* 0,81** 0,56
Клетки (8МА+) Т0А1) 0,12 0,38 0,02
Новые сосуды СА 0,69* 0,72* 0,53
(0Ώ34+) Т0А1) 0,85** 0,87** 0,77*
* р <0,05, ** р <0,01 и *** р <0,001 - уровень значимости для корреляции Спермана.
Из всех перечисленных типов клеток только показатель для лимфоцитов интимы значимо коррелирует с экспрессией СЭ40 и объемом 1САМ-1 и УСАМ-1 в интимных бляшках как при СА, так и при ТСАЭ, что наводит на мысль, что лимфоциты участвуют в индукции СЭ40 и факторов адгезии при обоих заболеваниях. Макрофаги и неоваскуляризация также показывают значимую корреляцию с экспрессией СЭ40 при СА и ТСА1А
Двойное иммунное окрашивание повреждений при СА тАЬ против СЭ40 и тАЬ против 1САМ-1 или тАЬ против УСАМ-1 показывает, что СЭ40 локализуются вместе с этими факторами адгезии на многих клетках (фиг. 12А-В). Кроме того, в ядрах неоинтимных эндотелиальных клеток, макрофагов и клеток гладкой мускулатуры наблюдают активированный ΝΡкВ (фиг. 13), и двойное иммунное окрашивание показывает, что многие СЭ40'-клетки также экспрессируют активированный ΝΡ-κΒ.
При ТСАЭ определенное положительное иммунное окрашивание для 1САМ-1 и УСАМ-1 присутствует на люминальных эндотелиальных клетках, в особенности, на клетках вблизи центров эндотелита. Эндотелиальные клетки интимы новых сосудов и адвентициальных сосудов сосудов определенно иммуннореактивны в отношении 1САМ-1 и УСАМ-1. Показатели для иммунного окрашивания факторов адгезии при ТСАЭ выше, чем при СА или для здоровых венечных артерий (табл. 2). Существует значимая корреляция (р <0,05) между показателями для СЭ40 и показателями для 1САМ-1 (г=0,82) и УСАМ-1 (г=0,89). Число лимфоцитов в интиме также значимо коррелирует с экспрессией СЭ40, 1САМ-1 и УСАМ-1 (табл. 3). Как и в случае СА, двухцветовые иммуногистохимические исследования показывают, что многие СЭ40'клетки в повреждениях при ТСАЭ коэкспрессируют 1САМ-1 или УСАМ-1 (фиг. 12А-В). Иммунное окрашивание в случае активированной нуклеарной формы ΝΡ-кВ также более пространно распределяется при ТСАЭ, чем при нативном СА. ΝΡ-кВ-положительные макрофаги и клетки гладких мышц представляют собой, сообразно, СЭ40+ (фиг. 13). Итак, эти исследования показывают, что в повреждениях как при нативном СА, так и при ТСАЭ СЭ40 на многих клетках коэкспрессируется с факторами межклеточной адгезии и/или ΝΡ-кВ.
Обсуждение
Нативный атеросклероз (СА) и атеросклероз, связанный с трансплантацией (ТСАЭ), являются воспалительными заболеваниями, посредованными комплексом взаимодействий между активированными Т-клетками, эндотелиальными клетками, макрофагами и клетками гладкой мускулатуры (2, 8, 12, 13, 17). Полагают, что Т-клетки играют определенную роль в патогенезе СА и ТСАЭ, однако, механизмы, с помощью которых они участвуют в этих процессах, не вполне ясны (5, 9, 50). Исследования показывают, что СЭ40Ь - индуцированная активацией молекула поверхности СЭ4'-Т-клетки доставляет контактзависимые активационные сигналы к экспрессирующим СЭ40 эндотелиальным клеткам и макрофагам, что приводит к продукции факторов провоспаления, таких как факторы межклеточной адгезии 1САМ-1 и УСАМ-1 (31, 32, 35-37), и активации фактора активации транскрипции ΝΡ-кВ (43-45, ίη νίίτο). Интересно, что ТСАЭ на мышиных моделях, по меньшей мере, частично зависит от взаимодействий СЭ40Р-СЭ40 (51). В исследованиях Ьагβοη с сотрудниками терапия с применением тАЬ против СЭ40Ь заметно подавляет отторжение аллогенного гетеротопного трансплантата и частично блокирует связанную с этим вазопатию. Кроме того, ТСАЭ на такой модели почти полностью предотвращается с помощью комбинации из тАЬ против СЭ40Ь и слитого белка СТЬА4-1д-молекулы, блокирующей Тклеточные костимуляторные каскады реакций (51). Возможно, что взаимодействия СЭ40ЬСЭ40 могут принимать участие в патогенезе СА и/или ТСАЭ у людей.
Для изученния этой гипотезы также применяют иммуногистохимические методы, чтобы исследовать экспрессию и клеточное распределение СЭ40Ь и СЭ40 в здоровых и атеросклеротических венечных артериях. Здоровые венечные артерии не содержат экспрессирующих СЭ40Ь клеток, а СЭ40-иммуннореактивность в таких сосудах ограничивается люминальными эндотелиальными клетками. В противоположность этому в местах повреждений как при нативном СА, так и при ТСАЭ, СЭ40Ь экспрессируется на лимфоцитах. Обнаружено, что САповреждения содержат незначительное количество СЭ8+-Т-клеток, в то время как в местах повреждений при ТСАЭ СЭ8'-Т-клетки содержатся непосредственно вблизи люминального эндотелия (эндотелита), а СЭ4'-Т-клетки более глубоко в интиме и адвентициальной оболочке. На основании локализации и окрашивания серийных срезов тАЬ против СЭ4 или тАЬ против СЭ8 делается вывод, что СЭ40Ь+лимфоциты, наиболее вероятно, представляют собой СЭ4'-Т-клетки в повреждениях при обоих заболеваниях. С использованием двух различных тАЬ против СЭ40Ь обнаружено, что иммунореактивность в отношении СЭ40Ь является слабой и ассоциируется или с гранулярной, или цитоплазматической, или клеточной поверхностью. Подобная картина СЭ40Ь-иммунореактивности отмечается при исследовании экспрессии СЭ40Ь и СЭ40 при гломерулонефрите (46). Слабую и часто цитоплазматическую картину окрашивания при экспрессии СЭ40 в очагах воспаления можно связать с переходным характером экспрессии СЭ40Ь на активированных Тклетках (27-29) и тем фактом, что зацепление
ί.Ό40 на клетках-мишенях индуцирует быструю отрицательную негативную модуляцию СО40Б посредством рецепторопосредованного эндоцитоза (52) и терминальной стадии тромбоцитопоэза (53). Эти регуляторные механизмы, вероятно, служат для фокусирования опосредованных 0Ό40 сигнальных событий на соответствующих родственных клетках-мишенях.
Обнаружено, что экспрессия СО40 заметно активируется на многих клетках в местах повреждений при обоих заболеваниях. Макрофаги и пенистые клетки, экспрессирующие 0Ό40. особенно заметны в воспалительных инфильтратах плечевых участков, изобилующих липидами бляшек, которые, как известно, содержат плотные воспалительные инфильтраты (54,
55) . Экспрессия 0Ό40 активируется также на люминальных эндотелиальных клетках при обоих заболеваниях, и это особенно заметно при ТСАО. Эндотелиальные клетки интимы новых сосудов и адвентициальных сосудов сосудов при обоих заболеваниях представляют собой определенно 0Ό40'. Экспрессирующие 0Ό40 клетки гладкой мускулатуры присутствуют в интиме как при СА, так и при ТСАО, обычно непосредственно вблизи воспалительных инфильтратов. Интересно, что клетки гладкой мускулатуры в средней части тех же сосудов представляют СО40-. ΙΡΝ-γ активирует экспрессию СО40 на многих клетках ίη νίίΓΟ (33, 35-37,
56) , в том числе на клетках гладкой мускулатуры, и этот эффект усиливается цитокинами, такими как ГС-1р и ΤΝΕ-α (36). Следовательно, заметное активирование экспрессии СО40 на клетках многих типов в местах таких повреждений может являться следствием высвобождения цитокинов лезиональными Т-клетками, макрофагами и другими клетками. Двойное иммунное окрашивание показывает, что многие СО40+клетки также коэкспрессируют факторы межклеточной адгезии 1САМ-1 и УСАМ-1, а также активированную форму ΝΓ-кВ. Итак, данное исследование показывает присутствие СО40+-Тклеток и активированных СО40+-клетокмишеней в местах повреждений сосудов при нативном СА и ТСАО.
Ранние исследования показали, что СО40 экспрессируются на некоторых эпителиальноклеточных опухолях и В-клетках (57, 58). Позднее отмечалось, что СО40 конститутивно экспрессируется или индуцибелен на многих типах клеток ίη νίΐτο (33-37, 56). Кроме того, все более очевидно, что взаимодействия С040Ь-С040 играют ключевую роль в опосредованных клетками воспалительных реакциях ίη νίνο (31, 32). В этом отношении, последние сообщения показывают экспрессию СО40Б и/или СО40 ίη Μΐι,ι при воспалительных заболеваниях человека (35, 46, 59). Например, экспрессия СО40 активируется на макрофагах, проникающих в головной мозг больных с рассеянным склерозом (59), на дермальных эндотелиальных клетках и кератиноцитах при псориазе (35), и на многих других клетках в почках больных с воспалительным гломерулонефритом (46). Кроме того, СО40+-Тклетки содержат воспалительные инфильтраты в головном мозге больных с рассеянным склерозом (59) и в почках больных с воспалительным гломерулонефритом (46). Следовательно, вероятно, что экспрессия СО40 активируется при многих воспалительных заболеваниях и представляет собой молекулярный механизм, который позволяет Т-клеткам доставлять провоспалительные сигналы ко многим клеткаммишеням. В связи с этим результаты, представленные здесь, показывающие, что при СА и ТСАО активируется экспрессия СО40, и что в повреждениях обнаруживаются СО40Ь+инфильтрующие Т-клетки, служат в качестве доказательства предположения, что иммунные опосредованные воспалительные реакции играют роль в патогенезе этих заболеваний (5-7, 9, 18, 21, 23, 50).
Наблюдения, касающиеся СО40Ь-опосредованной активации эндотелиальных клеток и макрофагов ίη νίΐτο, и исследования взаимодействий С040Ь-С040 в патогенезе мышиных моделей ТСАО наводят на мысль о возможной патогенной роли взаимодействий С040Ь-С040 при СА и ТСАО. Например, СО40Бопосредованные сигналы активируют экспрессию 1САМ-1 и УСАМ-1 на эндотелиальных клетках ίη νίΐτο (35-37). Эти факторы межклеточной адгезии, регулирующие выход и задержку лейкоцитов в зонах воспаления, при СА и ТСАО активируются на эндотелиальных клетках и особенно заметны на эндотелиальных клетках интимы новых сосудов и сосудов сосудов (49, 60). Следовательно, представляет интерес, что в повреждениях при СА и ТСАО обнаруживаются многие СО40+-клетки, и, в особенности, эндотелиальные клетки интимы и эндотелиальные клетки сосудов сосудов, которые коэкспрессируют 1САМ-1 и УСАМ-1. Известно, что активация 1САМ-1 и/или УСАМ-1 зависит от активации ΝΡ-κΒ (61). В настоящем исследовании также показано, что СО40+-интимные макрофаги, клетки гладкой мускулатуры экспрессируют активированную форму ΝΡ-кВ. Эти исследования означают, что СО40Ь+-СО4+-Тклетки могут при СА и ТСАО индуцировать активацию факторов межклеточной адгезии на СО40+-клетках-мишенях, вероятно, частично посредством активации ΝΡ-κΒ.
Опосредованные СО40Б сигналы также побуждают эндотелиальные клетки секретировать 1Ь-6 и 1Ь-8 (62) и промотируют прокоагулянтную поверхность посредством активирующего тканевого фактора и экспрессии регулирующего по типу отрицательной связи тромбомодулина. Что касается макрофагов, то взаимодействия С040Ь-С040 побуждают эти клетки секретировать цитокины (1Ь-1а, 1Ь-1 β, 1Ь-6 и ΤΝΡ-α), хемокины, металлопротеиназы матрикса и экспрессировать тканевый фактор ίη νίΐΐΌ (33, 34, 38, 41, 42). Все эти провоспалительные факторы, вероятно, играют роль в патогенезе СА и ТСАИ (10, 17, 63-66). Лигирование СЭ40 с макрофагами также вызывает продукцию N0 (39, 40). Интересно, что блокирование взаимодействий С040Ь-С040 в мышиных моделях ТСЛЭ связано с регуляцией по типу отрицательной обратной связи экспрессии 1Ν08 и редукцией повреждений при ТСЛЭ (51). Показано, что 1Ν08 экспрессируется в местах повреждений при СА (67, 68), отторжении кардиального аллотрансплантата (69, 70) и ТСЛЭ (71, 72). При СА или ТСЛЭ опосредованные СЭ40Ь сигналы могут вовлекаться в промотирование продукции любого из этих факторов. Взаимодействия С040Ь-С040 на мышиных моделях ТСЛЭ отчетливо имеют провоспалительный эффект (51), как и на моделях вызванного коллагеном артрита (73), напоминающего волчанку гломерулонефрита (74) и экспериментального аллергического энцефаломиелита (59).
Осуществлено исследование (62) экспрессии СО40Ь и СЭ40 при каротидном атеросклерозе человека. Обнаружено, что СЭ40 активируется в местах повреждений и имеет широкое клеточное распределение. Сообщается, что СЭ40 значительно экспрессируется на клетках гладких мышц, эндотелиальных клетках и макрофагах в местах атеросклеротических повреждений, в то время как в настоящем исследовании с использованием двух различных тАЬ против СО40Ь экспрессия СО40Ь ограничивается Т-клетками. В данном случае экспрессии СО40Ь ίη кби на макрофагах, эндотелиальных клетках или клетках гладкой мускулатуры не наблюдается. Подобным образом обнаружено, что СЭ40-иммунореактивность ограничивается Т-клетками при других воспалительных заболеваниях, в том числе, при гломерулонефрите (46), ревматоидном артрите и хроническом синусите. Кроме того, Сеггбке е! а1. сообщают, что экспрессия СЭ40Ь в бляшках при рассеянном атеросклерозе ограничивается СЭ4+-Т-клетками (59). Несоответствия между приведенными здесь результатами и результатами, полученными Масй с сотрудниками, пока не понятно, но может быть связано с трудно уловимыми различиями в иммуногистохимических методах или в характере повреждений.
Ссылки
1. №11ккоп, 1. 1993. Тгапкр1ап! Ргос. 25:20632064.
2. Мипго, 1., апб В. Со!гап. 1988. ЬаЬ. 1пνек!. 58:249-261.
3. Сгатег, Ό., е! а1. 1992. 1. Неай Ьипд Тгапкр1ап!. 11:458-466.
4. ВШшдЬат, М. 1992. ί. Неай Ьипд Тгапкр1ап!. 11:838-844.
5. 2йои, X., е! а1. 1996. Ат. 1. Ра!йо1. 149:359-366.
6. А1ск, С., е! а1. 1995. 1ттипо1. Тобау. 16:27-33.
7. 8!етте, 8., е! а1. 1992. Аг1епокс1егок1к апб ТйготЬо. 12:206-211.
8. Вокк, В. 1993. №а!иге. 362:801-809.
9. ЫсЫтап. А., е! а1. 1996. Ат. 1. Ра11ю1. 149:351-357.
10. КлкЫкатеа, Н., е! а1. 1993. Уисйотек Агсй. 423:433-442.
11. Кгепкку, А. 1994. К1бпеу 1п!. 45:508568.
12. 8а1отоп, В., е! а1. 1991. Ат. 1. Ра11ю1. 138:791-798.
13. 8Ы, С, е! а1. 1996. Ргос. №а!1. Асаб. 8с1, И8А. 93:4051-4056
14. 1опаккоп, Ь., е! а1. 1985. 1. С1т ИкекР 76:125-131.
15. Викке11, Р. 8., е! а1. 1994. Ат. 1. Ра!йо1. 144:260-274.
16. Моуег, С, е! а1. 1992. 1. РаШо1. 138:951960.
17. Ь1ЬЬу, Р., апб Ζ. СаШк. 1995. Апп. ΝΥ Асаб 8ск 748:158-168.
18. 8!етте, 8., е! а1. 1995. Ргос. №111. Асаб. 8с1, И8А. 92:3893-3897.
19. ΑίΙζΙιιιη. 1., апб Ό. 8!етЬегд. 1991. 1. С1т. 1птекР 88:1785-1792.
20. бе Ьогдегб, М., е! а1. 1993. Ат. Неаг! 1. 125:974-980.
21. Етекоп, Е., е! а1. 1996. Ат 1. Ра11ю1. 149:675-685.
22. Викке11, Р., е! а1. 1994. Тгапкр1ап!а!юп. 57:1367-1371.
23. Викке11, М., е! а1. 1996. 1. С1т. ИкекР 97:833-838.
24. Напсоск, А., е! а1. 1996. Ргос. №111. Асаб. 8с1. 93:13967-13972.
25. СгаР, Ό., е! а1. 1992. Еиг. 1. 1ттипо1. 22:3191-3194.
26. Агтбаде, В. 1., е! а1. 1992. №а!иге. 357 (6373):80-2.
27. Ьапе, Р., е! а1. 1992. Еиг. 1. 1ттипо1. 22:2573-2578.
28. Ьебегтап, 8., е! а1. 1992. 1. Ехр. Меб. 175 (4):1091-101.
29. №ое11е, В. е! а1. 1992. Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. И8А. 89:6550-6554.
30. Вапсйегеаи, 1., е! а1. 1994. Аппи. Веν. 1ттипо1. 12:881-922.
31. №ое11е, В. 1996. 1ттипбу. 4:415-419.
32. 8!ои!, В., апб 1. 8и111ек. 1996. 1ттипо1. Тобау. 17:487-492.
33. А1бегкоп, М. В., е! а1. 1993. 1. Ехр. Меб. 178 (2):669-74.
34. Саих, С, е! а1. 1994. 1. Ехр. Меб. 180:1263-1272.
35. Но11епЬаидй, Ό., е! а1. 1995. 1. Ехр. Меб. 182:33-40.
36. Кагтапп, К., е! а1. 1995. Ргос. №а!1. Асаб. 8с1, И8А. 92:4342-4346.
37. УеШп, М. 1., εΐ а1. 1995. 1. Ехр. Меб. 182:1857-1864.
38. К1епег, Р., εΐ а1. 1995. 1. 1ттипо1. 155:4917-4925.
39. δίοιιΐ. В., εΐ а1. 1996. 1. 1ттипо1. 156:8-
11.
40. Паи, Ь., εΐ а1. 1995. Еиг. 1. 1ттипо1. 25:306-309.
41. Ргаб1ег, О., εΐ а1. 1996. Еиг. 1. 1ттипо1. 26:3048-3054.
42. Майк, Ν., εΐ а1. 1996. 1. 1ттипо1. 156:3952-3960.
43. ВегЬепсй, I., εΐ а1. 1994. 1. 1ттипо1. 153:4357-4366.
44. Незе, 8., εΐ а1. 1995. 1. 1ттипо1. 155:4588-4595.
45. Кагтапп., К., εΐ а1. 1996. 1. Ехр. Меб. 184:173-182.
46. УеШп, М., с1 а1. 1997. АгШгШз ВЪеит. 40:124-134.
47. Вгапб, К., εΐ а1. 1996. 1. С1т. Ιηνεβΐ. 97:1715-1722.
48. КиататоЮ. М., с1 а1. 1995. Нитап Ра111. 26:450-456.
49. Ο'Βήεη, К., εΐ а1. 1996. С1гси1айоп. 93: 672-682.
50. Нагаока, 8., εΐ а1. 1995. Уйс110\\5 Агсй. 426:307-315.
51. Ьагзеп, С, εΐ а1. 1996. №11игс. 381: 434438.
52. УеШп, Μ. 1., εΐ а1. 1994. 1. 1ттипо1. 152(2):598-608.
53. С га Г. ϋ., εΐ а1. 1995. Еиг. 1. 1ттипо1. 25:1749-1754.
54. В_)оегкегиб, 8., апб В. В)осгксгиб. 1996. Ат. 1. РаШо1. 149:367-380.
55. уап бег \Уа1. А., с1 а1. 1994. Слгси1аОоп. 89:36-44.
56. УеШп, Μ. 1., εΐ а1. 1995. 1. Ьеик. ΒίοΙ. 58:209-216.
57. Раий, 8., εΐ а1. 1985. Сапсег. 1ттипо1. 1ттипоШег. 20:23-28.
58. С1агк, Е. А., апб 1. А. ЬебЬейег. 1986. Ргос. N811. Асаб. δει. υδΑ. 83:4494-4498.
59. СсггШс. К., εΐ а1. 1996. Ргос. Хаб. Асаб. δει. 93:2499-2504.
60. Οηνίεδ. Μ., εΐ а1. 1993. 1. Рабю1. 171:223-229.
61. СоШпз, Т., εΐ а1. 1995. ΡΑδΕΒ 1. 9:899909.
62. Масй, Р., εΐ а1. 1997. Ргос. Хаб. Асаб. δεί,υδΑ. 94:1931-1936.
63. Вегйпег, 1., с1 а1. 1995. СйсикШоп. 91:2488-2496.
64. ЫЬЬу, Р., εΐ а1. 1995. 1. Сагбюуазс Рйагт. 25 8ирр12:89-12.
65. Ы, Ζ., εΐ а1. 1996. Ат. I РаШ. 148:121128.
66. Сайз, Ζ., εΐ а1. 1994. 1. Сйп. Ιηνεβΐ. 94:2493-2503.
67. Вийегу, Ь., с1 а1. 1996. ЬаЬ. Ιηνεβΐ. 75:77-85.
68. Αίί, \ν., εΐ а1. 1997. С1гси1абоп. 95:430437.
69. Уапд, X., εΐ а1. 1994. 1. Сйп. Ιηνεβΐ. 94:714-721.
70. АУоггаП, X., εΐ а1. 1995. 1. Ехр. Меб. 181:63-70.
71. ВиззеП, Μ., εΐ а1. 1995. Сйси1айоп. 92:457-464.
72. Акуигек, Ь., εΐ а1. 1996. Ат. 1. РаШо1. 143:1891-1990.
73. Оипе, Е. Η., εΐ а1. 1993. δείεηεε. 261:1328-1330.
74. Мойап, С, εΐ а1. 1995. 1. 1ттипо1. 154:1470-1480.
Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (1> ЗАЯВИТЕЛИ: УеШп, М1СЙае1 3.
Ьебеппап, ЗейЬ
Сйезз, Ьеопагб
Кагризаз, МгсЬаН Ν. Тйогпаз, ϋβνίά в.
(II) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Т-ВАМ(СО40Ь)-ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ С УЧАСТИЕМ КЛЕТОК ГЛАДКОЙ МУСКУЛАТУРЫ (III) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 1 (IV) АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:
(A) АДРЕСАТ: Соорег & Оипйат ЬЬР (B) УЛИЦА: 1185 Ауепие о£ ййе АтегЬсаз (В) ГОРОД: Нью-Йорк (Г) ШТАТ: Нью-Йорк (Д) СТРАНА: США (Е) ΖΙΡ: 10036 (V) ФОРМА КОМПЬЮТЕРНОГО СЧИТЫВАНИЯ:
(A) ТИП СРЕДЫ: дискета (Б) КОМПЬЮТЕР: совместимый с системой ΙΒΜ РС (B) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-ООЗ/МЗ-БОЗ (Г) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: РагепМп КеЬеазе #1.0, версия # 1.30 (VI) СВЕДЕНИЯ О ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКЕ:
(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: пока не известен (Б) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ: прилагается (B) КЛАССИФИКАЦИЯ:
(VIII) СВЕДЕНИЯ ОБ АГЕНТЕ/ПОВЕРЕННОМ:
(A) ИМЯ: ИЬ1ке Езд., бойп Р.
(Б) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 28678 (B) НОМЕР ДЕЛА/РЕЕСТРА: 48559/6РМ/бМЬ (IX) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ:
(А) ТЕЛЕФОН: (212)278-0400 (Б) ТЕЛЕФАКС: (212)391-0525 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 1 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(А) ДЛИНА: 146 аминокислот (Б) ТИП: аминокислота (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: Оелок (III) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет

Claims (26)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ ингибирования у больного активации СБ40-лигандом клеток, несущих на своей поверхности СБ40. причем указанные СБ40несущие клетки являются клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетками гладкой мускулатуры сосудов, клетками гладкой мускулатуры аорты, коронарными клетками гладкой мускулатуры, клетками гладкой мускулатуры легких или клетками гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта, при этом указанный способ включает в себя стадию введения указанному больному терапевтически эффективного количества антитела, РаЬфрагмента или одноцепочечного антитела, причем указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело способно ингибировать активацию указанных СБ40-несущих клеток гладкой мускулатуры под действием СБ40лиганда у указанного пациента путем ингибирования взаимодействия между СБ40-лигандом с СБ40 на указанных клетках гладкой мускулатуры.
  2. 2. Способ по п.1, при котором указанные клетки гладкой мускулатуры желудочнокишечного тракта выбраны из группы, состоящей из клеток гладкой мускулатуры пищевода, клеток гладкой мускулатуры желудка, клеток гладкой мускулатуры кишечника и клеток гладкой мускулатуры тонкого кишечника.
  3. 3. Способ по п.1, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует связывание СБ40-лиганда и СБ40 на указанных клетках гладкой мускулатуры.
  4. 4. Способ по п.1, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает эпитоп, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5с8, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС Νο.ΗΒ 10916.
  5. 5. Способ по п.1, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически узнает белок, с которым связывается моноклональное антитело 5с8, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС Νο.ΗΒ 10916.
  6. 6. Способ по п.1, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает СБ40-лиганд.
  7. 7. Способ по п.1, при котором указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклональных антител, поликлональных антител, химерных антител, гуманизированных антител, антител человека, приматизированных антител и антител, которые включают в себя СБЯ-область от первого человека и каркас антитела от второго человека.
  8. 8. Способ по п.6, при котором указанное моноклональное антитело является монокло нальным антителом 5с8, продуцируемым гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС Νο.ΗΒ 10916.
  9. 9. Способ по п.1, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело выбрано или создано путем структурной оптимизации ведущего ингибирующего антитела, РаЬ-фрагмента или одноцепочечного антитела на основе трехмерной структуры комплекса растворимой внеклеточной области СБ40-лиганда или ее части с ведущим ингибирующим антителом, РаЬ-фрагментом или одноцепочечным антителом.
  10. 10. Способ по п.1, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует клеточную активацию СБ40-лигандом СБ40-несущих клеток гладкой мускулатуры, которые вовлечены в зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание.
  11. 11. Способ по п.10, при котором указанное зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание выбрано из группы, состоящей из сосудистого заболевания, заболевания мочевого пузыря и желудочно-кишечного заболевания.
  12. 12. Способ по п.11, при котором указанное желудочно-кишечное заболевание выбрано из группы, состоящей из нарушения моторики пищевода, воспалительного заболевания кишечника и склеродермии.
  13. 13. Способ по п.11, при котором указанным сосудистым заболеванием является атеросклероз.
  14. 14. Способ ингибирования активации СБ40-лигандом клеток гладкой мускулатуры, несущих на своей поверхности СБ40, включающий в себя стадию контактирования ш νίΐτο указанных клеток гладкой мускулатуры с антителом, РаЬ-фрагментом или одноцепочечным антителом, способным к ингибированию активации указанных СБ40-несущих клеток гладкой мускулатуры лигандом СБ40 путем ингибирования взаимодействия между СБ40-лигандом и СБ40 на указанных клетках гладкой мускулатуры, причем указанные клетки гладкой мускулатуры являются клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетками гладкой мускулатуры сосудов, клетками гладкой мускулатуры аорты, коронарными клетками гладкой мускулатуры, клетками гладкой мускулатуры легких или клетками гладкой мускулатуры желудочнокишечного тракта.
  15. 15. Способ по п.14, при котором указанные клетки гладкой мускулатуры желудочнокишечного тракта выбраны из группы, состоящей из клеток гладкой мускулатуры пищевода, клеток гладкой мускулатуры желудка, клеток гладкой мускулатуры кишечника и клеток гладкой мускулатуры тонкого кишечника.
  16. 16. Способ по п.14, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует связывание
    СО40-лиганда с СО40 на указанных клетках гладкой мускулатуры.
  17. 17. Способ по п. 14, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает эпитоп, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5с8, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС Νο.ΗΒ 10916.
  18. 18. Способ по и. 14, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически узнает белок, с которым связывается моноклональное антитело 5с8, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС Νο.ΗΒ 10916.
  19. 19. Способ по и. 14, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает СО40-лиганд.
  20. 20. Способ по любому из пи. 16-19, при котором указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклональных антител, поликлональных антител, химерных антител, гуманизированных антител, антител человека, приматизированных антител и антител, которые включают в себя СОЯ-область от первого человека и каркас антитела от второго человека.
  21. 21. Способ по и. 20, при котором указанное моноклональное антитело является моноклональным антителом 5с8, продуцируемым гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС Νο.ΗΒ 10916.
  22. 22. Способ по и. 14, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело выбрано или создано путем структурной оптимизации ведущего ингибирующего антитела, РаЬ-фрагмента или одноцепочечного антитела на основе трехмерной структуры комплекса растворимой внеклеточной области СО40-лиганда или ее части с ведущим ингибирующим антителом, РаЬ-фрагментом или одноцепочечным антителом.
  23. 23. Способ по и. 14, при котором указанное антитело, РаЬ-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует клеточную активацию СО40-лигандом СО40-несугцих клеток гладкой мускулатуры, которые вовлечены в зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание.
  24. 24. Способ по п.23, при котором указанное зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание выбрано из группы, состоящей из сосудистого заболевания, заболевания мочевого пузыря и желудочно-кишечного заболевания.
  25. 25. Способ по п.24, при котором указанное желудочно-кишечное заболевание выбрано из группы, состоящей из нарушения моторики пищевода, воспалительного заболевания кишечника и склеродермии.
  26. 26. Способ по п.24, при котором указанным сосудистым заболеванием является атеросклероз.
EA199900091A 1996-07-08 1997-07-03 Терапевтическое применение т-вам(cd40l)-технологии для лечения заболеваний с участием клеток гладкой мускулатуры EA004401B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67773096A 1996-07-08 1996-07-08
PCT/US1997/012925 WO1998001145A1 (en) 1996-07-08 1997-07-03 Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900091A1 EA199900091A1 (ru) 1999-08-26
EA004401B1 true EA004401B1 (ru) 2004-04-29

Family

ID=24719894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900091A EA004401B1 (ru) 1996-07-08 1997-07-03 Терапевтическое применение т-вам(cd40l)-технологии для лечения заболеваний с участием клеток гладкой мускулатуры

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20030219437A1 (ru)
EP (1) EP0956030A4 (ru)
JP (1) JP2000515507A (ru)
CN (1) CN1242809C (ru)
AU (1) AU731299B2 (ru)
BG (1) BG63489B1 (ru)
BR (1) BR9710264A (ru)
CA (1) CA2259962C (ru)
CZ (1) CZ297300B6 (ru)
EA (1) EA004401B1 (ru)
EE (1) EE9900010A (ru)
HU (1) HUP9904669A3 (ru)
IL (1) IL127884A0 (ru)
IS (1) IS4935A (ru)
NO (1) NO990019L (ru)
NZ (1) NZ333602A (ru)
PL (1) PL188408B1 (ru)
SK (1) SK499A3 (ru)
TR (1) TR199900029T2 (ru)
WO (1) WO1998001145A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001261585B2 (en) 2000-05-12 2006-08-31 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for achieving immune suppression
US20020173053A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-21 Bassam Damaj Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
UY32802A (es) * 2009-07-23 2011-01-31 Provimi Holding B V Composiciones para reducir la metanogénesis gastrointestinal en rumiantes
MX2018013762A (es) * 2016-05-13 2019-03-28 Medimmune Llc Polipeptidos de fusion de ligando de cumulo de diferenciacion 40 y fragmento cristalizable (cd40l-fc) y sus metodos de uso.
WO2018088850A2 (ko) * 2016-11-11 2018-05-17 다이노나(주) Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US11793854B2 (en) 2019-03-21 2023-10-24 Op-T Llc Methods for reducing symptoms of multiple sclerosis using a six-amino acid long peptide that inhibits CD40-CD150 interaction

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
IL104684A0 (en) * 1992-02-14 1993-06-10 Bristol Myers Squibb Co The cd40cr receptor and ligands therefor
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6340459B1 (en) * 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US6822070B2 (en) * 1996-03-11 2004-11-23 David Baltimore Truncated CRAF1 inhibits CD40 signaling

Also Published As

Publication number Publication date
AU731299B2 (en) 2001-03-29
US20080050369A1 (en) 2008-02-28
CN1227494A (zh) 1999-09-01
CZ2699A3 (cs) 1999-05-12
IL127884A0 (en) 1999-10-28
EA199900091A1 (ru) 1999-08-26
WO1998001145A1 (en) 1998-01-15
US20030219437A1 (en) 2003-11-27
CN1242809C (zh) 2006-02-22
CZ297300B6 (cs) 2006-11-15
EP0956030A4 (en) 2001-11-28
TR199900029T2 (xx) 1999-04-21
BG103148A (en) 1999-10-29
PL331104A1 (en) 1999-06-21
EE9900010A (et) 1999-06-15
CA2259962A1 (en) 1998-01-15
PL188408B1 (pl) 2005-01-31
SK499A3 (en) 1999-08-06
HUP9904669A3 (en) 2001-06-28
BG63489B1 (bg) 2002-03-29
CA2259962C (en) 2002-01-22
IS4935A (is) 1998-12-23
HUP9904669A2 (hu) 2000-05-28
NO990019D0 (no) 1999-01-04
NO990019L (no) 1999-03-08
NZ333602A (en) 2000-06-23
JP2000515507A (ja) 2000-11-21
AU4229297A (en) 1998-02-02
EP0956030A1 (en) 1999-11-17
BR9710264A (pt) 1999-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100585473B1 (ko) 혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 그의 사용 방법
JP4727992B2 (ja) 癌転移および癌転移に伴なう骨量減少を予防および処置するための方法
EA027623B1 (ru) Антитела, направленные против icos, и их применения
JP2007238630A (ja) 抗−Ｔ−ＢＡＭ（ＣＤ４０−Ｌ）モノクローナル抗体５ｃ８の治療適用
JP2006519163A5 (ru)
US20060172943A1 (en) Restoring vascular function
MXPA03009052A (es) Anticuerpo anti-osteopontina y uso del mismo.
US20090170767A1 (en) Soluble Endoglin Compounds for the Treatment and Prevention of Cancer
JP7487938B2 (ja) 抗ｃｄ５ｌ抗体及びその使用
US20080050369A1 (en) Therapeutic applications of T-BAM (CD40L) technology to treat diseases involving smooth muscle cells
KR101154550B1 (ko) 폰 빌레브란트 인자 특이적 절단 효소에 대한 항체 및그것을 이용한 분석계
KR20010013964A (ko) 치료용 단백질 저해제 증후군에 대한 ｃｄ154 차단 요법
JP4118336B2 (ja) メルトリン
US20080248011A1 (en) Methods for Isolating Monocytes
CA2585156A1 (en) Duffy antigen receptor for chemokines and use thereof
JP5399710B2 (ja) 細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ｒｇｄに対する抗体およびその製法と用途
DK2984108T3 (en) Anti-s100a7 antibodies for the treatment and diagnosis of cancer
JPH10512142A (ja) 抗炎症性ｃｄ１４ポリペプチド
US7820167B2 (en) IL1-β: a new target for myeloma therapy
KR100478322B1 (ko) 평활근세포와관련된질병을치료하기위한t－bam(cd４０l)기법의치료적용도
JP2002187856A (ja) 慢性関節リウマチの治療剤もしくは予防剤

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU