CZ2699A3 - Použití činidla, které inhibuje interakci CD40 a ligandu, pro přípravu léčiva a způsob selekce takového činidla - Google Patents

Použití činidla, které inhibuje interakci CD40 a ligandu, pro přípravu léčiva a způsob selekce takového činidla Download PDF

Info

Publication number
CZ2699A3
CZ2699A3 CZ9926A CZ2699A CZ2699A3 CZ 2699 A3 CZ2699 A3 CZ 2699A3 CZ 9926 A CZ9926 A CZ 9926A CZ 2699 A CZ2699 A CZ 2699A CZ 2699 A3 CZ2699 A3 CZ 2699A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
atom
smooth muscle
cells
muscle cells
asn
Prior art date
Application number
CZ9926A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297300B6 (cs
Inventor
Michael J. Yellin
Seth Lederman
Leonard Chess
Mihail N. Karpusas
David W. Thomas
Original Assignee
The Trustees Of Columbia University In The City Of New York
Biogen, Incorporated
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Trustees Of Columbia University In The City Of New York, Biogen, Incorporated filed Critical The Trustees Of Columbia University In The City Of New York
Publication of CZ2699A3 publication Critical patent/CZ2699A3/cs
Publication of CZ297300B6 publication Critical patent/CZ297300B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Description

Vynález také zahrnuje . methioninové analogy například sulfonové a . sulfoxidové analogy Vynález také zahrnuje soli proteinů, jako jsou soli amoniové, včetně alkylamoniových nebo arylamoniových solí, a dále soli jako síran, hydrosíran, fosforečnan, hydrofošforečnan, dihydrofosforečnan, thiosíran, uhličitan, hydrogenuhličitan, benzoát,. sulfonát, thiosulfonát, mezylát, etylsulfonát a benzensulfonát.
·· ·· ► · · « ·· < • · ·
Rozpustný monomerní protein CD40-L může obsahovat celou nebo část extracelulární oblasti CD40-L. Extracelulární oblast CD40-L obsahuje doménu, která se váže na CD40. Tedy rozpustný CD40-L může inhibovat interakci mezi CD40L a buňkou nesoucí CD40. Tento vynález předpokládá, že SCD40-L (rozpustný CD40-L) může tvořit celou extracelulární oblast CD40-L, nebo fragment nebo derivát obsahující. doménu, která váže CD40.
Rozpustný protein CD40 (sCD40) obsahuje extracelulární oblast'. CD40. sCD40 inhibuje interakci mezi CD40L a buňkami nesoucí CD40. sCD40 může být v monomerní nebo oligomerní formě.
V dalším provedení předkládaného, vynálezu protein, obsahující rozpustnou extracelulární oblast CD40 nebo' její část, dále obsahuje oblast Fc fúzovanou k extracelulární oblasti CD40 nebo jeho části. Ve specifickém provedení je oblast Fc schopna vazby k proteinu A nebo proteinu G. V dalším provedení oblast Fc obsahuje IgG, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAi, IgA2, IgM, IgD nebo IgE.
Rozpustný fúzní protein CD40/Fc může být připraven za použití obvyklých technik enzymového štěpení a ligace fragmentů ze žádoucích sekvencí. Vhodné oblasti Fc pro fúzní protein jsou oblasti Fc, které se můžou vázat na protein A nebo protein G, nebo které jsou způsobilé k tomu být rozeznávány protilátkou, která může být použita při purifikaci nebo detekci fůzního proteinu obsahujícího oblast Fc. Například oblast Fc může zahrnovat oblast Fc lidského IgGi nebo myšího IgGi. Předkládaný vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein CD40/Fc.
Způsob přípravy rozpustných forem membránových molekul rekombinantními technikami, při kterých jsou sekvence kódující transmembránové a cytoplazmatické domény deletovány, je dobře
4·
44 ·· ·· ·· 4 · · · 4 4 4 4
4 4 4 4444
444 · 4 · ······
4··· · ·
44 4 4 · 4 ·· ·· nesoucích protein, znám. Viz obecně Hammonds et al., patent USA č. 5 057 417.
Kromě toho jsou známy způsoby přípravy fúzního proteinu sCD40 a CD40/Fc. Viz např. mezinárodní přihláška PCT č. W093/08207, a také Fanslow et al., „Soluble Forms of CD40 Inhibit Biologie Responses of Human B Cells, J. Immunol., díl 149, ss. 655-60, červenec 1992.
V provedení předkládaného vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou.
'Ve specifickém provedení vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou, která obsahuje izolaci vzorku buněk, kultivaci vzorku za podmínek umožňujících aktivaci buněk CD40, kontakt vzorku s buňkami exprimujícími který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, účinným aktivovat buňky nesoucí CD40, kontakt vzorku s množstvím přípravku účinným inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, jestliže je' přípravek schopný inhibovat aktivací buněk nesoucích CD40, a určení, zda buňky exprimující protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, aktivují buňky nesoucí CD40 v přítomnosti přípravku. Buněčný vzorek může být izolován z různých tkání, včetně buněčných linií v tkáňových kulturách, nebo buněk izolovaných ze zvířete, jako jsou rozptýlené buňky z pevné tkáně, buňky pocházející z biopsie kostní dřeně, nebo buňky «0 • 0 00
00
0 0 ·
0
· · ·
0 0 0
000 000
0 izolované z tělesné tekutiny, jako je krev nebo lymfatická tekutina.
V dalším, specifickém provedení vynálezu je přípravek (molekula) vybrána na základě trojrozměrné struktury rozpustné extracelulární oblasti .ligandu CD40 nebo její části schopné inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Přípravek může být vybrán z knihovny známých přípravků, modifikován ze známého přípravku na základě trojrozměrné struktury nebo navržen a syntetizován de novo na základě trojrozměrné struktury. Ve specifických provedeních vynálezu je přípravek (molekula) navržen strukturální optimalizací, základního (vedoucího) inhibičního přípravku na podkladě trojrozměrné struktury komplexu rozpustné extracelulární oblasti ligandu CD40 nebo jeho části se základním inhibičním přípravkem. Základní inhibiční přípravek je molekula, která se pozná tak, že je-li v kontaktu s ligandem CD40, naváže se a vytvoří komplex s rozpustnou extracelulární oblastí ligandu CD40, CD40, nebo její částí, a tím ; snižuje schopnost komplexního nebo navázaného ligandu CD40 nebo části ligandu CD40 aktivovat buňky nesoucí CD40. V dalším provedení vynálezu může základní - inhibiční přípravek působit prostřednictvím interakce buď s extracelulární oblastí ligandu CD40, CD40, nebo v terciárním komplexu jak s částí ligandu CD40, tak s CD40, a tím snižovat schopnost komplexu ligandu CD40-CD40 aktivovat buňky nesoucí CD40. Ve způsobech podle předkládaného vynálezu může být ligand CD40 buď rozpustný nebo navázaný na buňky, jako jsou aktivované T buňky, a může být buď nezkrácený nativní ligand CD40 nebo jeho části. Snížená schopnost aktivovat, buňky nesoucí CD40 se může měřit různými způsoby. Jeden způsob, jak se může měřit, je prokázat, že ligand CD40 v přítomnosti inhibitoru způsobí menší stupeň aktivace buněk • ·· ·· ·· ·· ·· 00 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0
00 0 · · · · · Λ · 00 000 0 0· ·♦· ··· 00 0 000 0 ·
000 0 0 ·· 0000 00 00 nesoucích CD40 ve srovnání s působením podobného množství ligandu CD40 na buňky bez inhibitoru za podobných podmínek. Snížená schopnost aktivovat buňky nesoucí CD40 může být také indikována vyšší koncentrací komplexu inhibitoru-ligand CD40, která je vyžadována pro tvorbu podobného stupně aktivace buněk nesoucích CD40 při srovnání s nenavázaným ligandem CD40 za podobných podmínek. V krajnosti může být ' ligand CD40 kontaktovaný inhibitorem neschopný aktivovat buňky nesoucí CD40 v koncentracích a za podmínek, které umožňují aktivaci těchto buněk nenavázaným ligandem CD40 nebo jeho danou částí.
Přípravek (molekula) může být vybrán výpočtovou testovací metodou na základě krystalické struktury rozpustného fragmentu extracelulární domény lidského CD40L obsahujícího zbytky Glyn6-Leu26i (sekvence s id. č. 1) (sCD40L 116-261) .
Krystalická struktura vhodná pro použití při testování byla určena v rozlišovací schopnosti 2 Á metodou molekulové náhrady. :V krátkosti se jednalo· o to, že rozpustný fragment extracelulární domény lidského ligandu CD40, obsahující aminokyselinové zbytky Glyne až k zbytku Leu26i na C-koncové části, byl poprvé vytvořen v rozpustné formě, poté purifikován a krystalizován. Krystaly byly použity pro sběr difrakčních dat. Nahrazování molekul a upřesňování se provádělo s programy XPLOR a QUANTA (Molecular Simulations, lne.). Konkrétně, zkonstruoval se trojrozměrný model lidského sCD40L za použití myšího modelu CD40L pomocí programu QUANTA modelujícího proteinovou homologii. Tento' model se použil jako sonda pro kalkulace krystalografické analýzy a upřesnil za použití XPLOR. Tato metoda určování krystalické struktury sCD40L je detailněji popsána v Karpusas et al., „2 Á crystal structure of an extracellular fragment of human CD40 ligand, Structure, 3(10), 1031-1039, říjen 1995. Atomové . souřadnice SCD40L • ·· · · • 44 • 4 4 • · · ·»· 44 ·* • · 4 <
4 4
4 4
4 4
4444
44
4 · 4
4 4 4
444 444
4
44 (116-261) jsou v této přihlášce uvedeny na obrázcích 2A-Y. Testovací metoda pro výběr přípravku zahrnuje výpočtový návrh přípravku a opakovanou optimalizaci struktury, jak bude dále popsáno.
Přípravek může být inhibitor vybraný za použití výpočtového návrhu přípravku. Při použití této metody, jsou použity souřadnice krystalické struktury SCD40L jako vstup pro počítačový program, jako je DOCK, jehož výstupem je seznam molekulových struktur, u kterých se očekává vazba k CD40L.
Použití takových počítačových programů je odborníkovi dobře známo. Viz např. Kuntz, „Structure-Based Strategies for drug design and discovery, Science, díl 257, s. 1078, 1992. Seznam molekulových struktur může být poté testován biochemickými testy na vazbu CD40L. Mohou být použity biochemické testy kompetitivního typu, které jsou v oboru dobře známy. Viz např.
Bajorath et al., „Identification of residues of CD40 and its ligand which are crítical for the receptor-ligand interaction, Biochemistry, 34, s. 1833, 1995. Struktury, u kterých se zjistilo, že se vážou k CD40L, mohou být tedy použity jako přípravky podle předkládaného vynálezu. Přípravek může také být modifikovaná’ nebo navržená molekula, určená interaktivními cykly strukturální optimalizace. Za použití * tohoto přístupu může být malá molekula inhibitoru CD40L, nalezená za použití výše uvedeného výpočtového přístupu nebo jiného přístupu, společně krystalizována s sCD40L a krystalická struktura komplexu může být řešena nahrazováním molekul. Informace získaná prostřednictvím molekulového nahrazování může být použita pro optimalizaci struktury inhibitorů tak, že vede k objasnění toho, jak molekuly interagují s CD40L. Molekula může být modifikována, aby se • · · · · · • · · ti • · · · • · ·
zlepšily její fyzikálněchemické vlastnosti, včetně specifity a afinity pro CD40L.
V provedení tohoto vynálezu je přípravek malá molekula. Malá molekula je v tomto popise vynálezu sloučenina mající molekulovou hmotnost mezi 20 D a lxlO6 D, výhodně od 50 D do 2 kD.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob, jak inhibovat aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40 na povrchu buněk ligandem CD40, u pacienta, kterýžto způsob zahrnuje podávání pacientovi přípravku schopného inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, přičemž přípravek je přítomný v množství, které účinně inhibuje aktivaci buněk pacienta.
Ve specifickém provedení vynálezu buňky hladkého svalstva nesoucí CD40 jsou buňky hladkého svalstva měchýře, buňky hladkého svalstva cév, buňky hladkého svalstva bronchů, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterií, buňky hladkého svalstva pulmonálních žil nebo buňky hladkého svalstva gastrointestinálního traktu. Ve specifičtějších provedeních vynálezu jsou buňky hladkého svalstva gastrointestinálního traktu buňky hladkého svalstva jícnu, žaludku nebo střev, včetně buněk hladkého svalstva tenkého nebo tlustého střeva.
V provedení předkládaného vynálezu přípravek inhibuje vazbu ligandu CD40 na CD40 na buňkách.
V provedení předkládaného vynálezu je přípravek protein. V dalším provedení vynálezu je přípravek neproteinové povahy.
Ve specifickém provedení vynálezu protein zahrnuje protilátku nebo její část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Protilátka je monoklonální nebo polyklonální protilátka. Ve specifičtějším provedení.
vynálezu se monoklonální protilátka specificky váže .na epitop, ke kterému se specificky váže monoklonální protilátka 5c8 (přístupové č. ATCC HB 10916). Příklad takové monoklonální protilátky je monoklonální protilátka 5c8 (přístupové č. ATCC HB 10916). V dalších provedeních vynálezu je .monoklonální protilátka chimérická nebo humanizovaná protilátka.
Ve specifickém provedení vynálezu část protilátky obsahuje oblast určující komplementaritu nebo variabilní oblast lehkého Či těžkého řetězce. V dalším specifickém provedení vynálezu část protilátky obsahuje oblast určující komplementaritu nebo variabilní oblast. V dalším specifickém provedení část protilátky obsahuje Fab nebo jednoduchý řetězec (
protilátky.
V dalším provedení vynálezu protein obsahuje rozpustnou extraceluiární oblast ligandu CD40 nebo jeho část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, nebo rozpustnou extraceluiární oblast CD40 nebo jeho část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Ve specifickém provedení vynálezu je rozpustná extraceluiární oblast ligandu CD40 nebo CD40 monomer. V dalším provedení rozpustná extraceluiární oblast CD40 je oligomer.
V dalším provedení předkládaného vynálezu protein obsahující rozpustnou extraceluiární oblast CD40 nebo její část dále obsahuje oblast' Fc fúzovanou k extraceluiární oblasti CD40 nebo její části. Ve specifickém provedení vynálezu je oblast Fc schopna vazby k proteinu A nebo proteinu G. V dalším provedení oblast Fc obsahuje IgG, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAi, IgA2, IgM, IgD nebo IgE.
Jsou-li podávány, jsou proteiny často rychle odstraněny z oběhu, a mohou tudíž vyvolat pouze relativně krátkodobý farmakologický účinek. Následkem toho mohou být vyžadovány pro » ·· • · · udržení léčebného účinku časté injekce relativně velkých dávek biologicky aktivních proteinů. 0 proteinech modifikovaných kovalentním připojením ve vodě rozpustných polymerů, jako je polyetylenglykol, kopolymerů polyetylenglykolu a polypropylenglykolu, karboxymetylcelulózy, dextranu, polyvinylalkoholů, polyvinylpyrolidonu nebo polyprolinu, je známo, že projevují podstatně delší poločasy po intravenózní injekci v séru, než projevují odpovídající nemodifikované proteiny (Abuchowski et al., v: „Enzymes as Drugs, Holcenberg et al., eds.. WileyInterscience, New York, NY, 367-383, 1981, Anderson, W.F., Human Gene Therapy, Science, 256, 808-813, 1992, Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4, 185-189, 1982, a Katre et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1487-1491, 1987). Takové modifikace mohou také zvýšit rozpustnost proteinu ve vodných roztocích, eliminovat agregaci, zvýšit fyzikální a chemickou stabilitu proteinu, a značně snížit imunogenní a antigenní působení proteinu. Výsledkem je, že u takových adičních sloučenin polymer-protein se dosáhne požadované biologické aktivity in vivo méně častým podáváním, nebo v nižších dávkách, než při použití nemodifikovaného proteinu.
Připojení polyetylenglykolu (PEG) k proteinům je užitečné obzvláště proto, že PEG je pro savce velmi málo toxický (Carpenter et al ., 1971). Například adiční sloučenina PEG-adenosindeamináza byla ve Spojených Státech schválena pro použiti u lidí pro léčbu vážného kombinovaného imunodeficitního syndromu. Druhá výhoda poskytnutá konjugací PEG je, že účinně snižuje imunogenní a antigenní působení heterologních proteinů. Například adiční sloučenina PEG-lidský protein může být použitelná pro léčení nemoci u dalších druhů savců bez rizika vyvoláni vážné imunitní odpovědi. V jednom provedení tohoto vynálezu může být protein podáván • ·
.······♦ • ·· · · * ···«·· · • · · · · · •••'44 ·· ···· 27 v mikroopouzdře (microencapsulation device), aby.se snížilo riziko nebo zabránilo imunitní odpovědi hostitele proti proteinu. Protein může být také podáván v membránovém mikroopouzdře jako je lipozom.
Polymery, jako je PEG, mohou být pohodlně připojeny k jednomu nebo více reaktivním aminokyselinovým zbytkům v. proteinu, jako například a-aminoskupina aminokyseliny N-koncové části, ε-aminoskupiny lysinových postranních řetězců, . sulfhydrylové skupiny cysteinových postranních řetězců, karboxylové skupiny asparagylových a glutamylových postranních řetězců, α-karboxylová skupina aminokyseliny C-koncové části, tyrosinové postranní řetězce, nebo aktivované deriváty glykosylových řetězců připojené k určitým asparaginovým, serinovým nebo threoninovým zbytkům.
Byly popsány četné aktivované formy PEG vhodné pro přímou reakci s proteiny. Použitelné PEG reagencie pro reakci s proteinovými aminoskupinami zahrnují aktivní estery karboxylové kyseliny nebo uhličitanové deriváty, zejména ty, ve kterých výchozí skupiny jsou N-hydroxysukcinimid, p-nitrofenol, imidazol nebo l-hydroxy-2-nitrobenzen-4sulfonát. Deriváty PEG obsahující maleimidové nebo haloacetylové skupiny jsou použitelné reagencie pro modifikaci proteinových volných sulfhydrylových skupin. Podobně PEG reagencie obsahující aminohydrazinové nebo hydrazinové skupiny, jsou použitelné pro reakci s aldehydy vzniklými jodistanovou oxidací uhličitanových skupin v proteinech.
Subjekt, který může být léčen popsanými způsoby, je zvíře. Výhodně je zvířetem savec. Příklady savců, které mohou být léčeny zahrnují, ale nejsou omezeny na, lidi, primáty jiného než lidského původu, hlodavce (včetně krys, myší, křečků a morčat), krávu, koně, ovci, kozu, prase, psa a kočku.
44 » 4 4 · • « 4 444 44·
4 · · »4 4 4 44 · · · · nesoucích protein,
V provedení vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou.
Ve specifickém provedení vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou, která obsahuje izolaci vzorku buněk, kultivaci vzorku za podmínek umožňujících aktivaci buněk CD40, kontakt vzorku s buňkami exprimujícími který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, účinným aktivovat buňky nesoucí CD40, kontakt vzorku s množstvím přípravku účinným inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, jestliže je přípravek schopný inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, a určení, zda buňky exprimující protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10916, aktivují buňky nesoucí CD40 v přítomnosti přípravku. Buněčný vzorek může být izolován z různých tkání, včetně buněčných linií v tkáňových kulturách, nebo buněk izolovaných ze zvířete, jako jsou rozptýlené, buňky z pevné tkáně, buňky pocházející z biopsie kostní dřeně, nebo buňky izolované z tělesné tekutiny, jako. je krev nebo lymfatická tekutina.
V dalším specifickém provedení vynálezu je molekula (přípravek) vybrána na. základě, trojrozměrné struktury rozpustné extracelulární oblasti ligandu CD40 nebo její části schopné inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40. na buňkách. Molekula může být vybrána z knihovny známých molekul, • · * • · • # ' • · » · ·· · ·· ·♦ » · * · » · · · ··9 ··· modifikována ze známé molekuly na základě trojrozměrné struktury nebo navržena a syntetizována de novo na základě trojrozměrné struktury. Ve specifických provedeních vynálezu jsou přípravek nebo optimalizací základního trojrozměrné struktury molekula navrženy strukturální inhibičního přípravku na základě komplexu rozpustné extracelulární oblasti ligandu CD40 nebo jeho části se základním inhibičním přípravkem.
Způsob léčení
Předkládaný vynález poskytuje způsob léčení nemoci závislé na buňkách hladkého svalstva u subjektu. Způsob léčení obsahuje výše popsaný způsob, jak inhibovat aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40 na svém povrchu ligandem CD40, což spočívá v podávání přípravku schopného inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách subjektu, přičemž přípravek je podáván v množství, které účinně inhibuje aktivaci buněk u subjektu.
V provedení vynálezu je . nemocí závislou na buňkách hladkého svalstva cévní nemoc. Ve specifickém provedení vynálezu je cévní nemocí ateroskleróza.
V dalším provedení vynálezu je nemocí závislou na buňkách hladkého svalstva nemoc gastrointestinálního traktu. Ve specifickém provedení vynálezu je nemoc gastrointestinálního traktu vybrána ze skupiny obsahující poruchy motility jícnu, zánětlivé střevní nemoci a sklerodermie.
V provedení vynálezu je nemocí závislou na buňkách hladkého svalstva onemocnění měchýře.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány jakýmkoliv způsobem, který je lékařsky přijatelný. To může zahrnovat injekce parenterálními cestami, jako je intravenózní, intravaskulární, inťraarteriální, subkutánní, intramuskulární, intratumorová, intraperitoneální', intraventrikulární, intraepidurální, nebo další, a také perorální, nazální, oftalmická, rektální, topická nebo inhalační. Podávání s prodlouženým uvolňováním je ve vynálezu také specificky zahrnuto způsobem jako jsou depotní injekce rozpadavých implantátů aplikovaných přímo během chirurgického výkonu.
Sloučeniny jsou podávány v jakékoliv dávce na kg tělesné hmotnosti a při jakékoliv četnosti dávkování, jaké jsou lékařsky přijatelné. Přijatelné dávkování zahrnuje rozmezí mezi asi 0,01 až 200. mg/kg tělesné hmotnosti pacienta. Výhodné rozmezí dávkování je mezi asi 0,1 a 50 mg/kg. Obzvláště výhodná jě dávka mezi asi 1 a 30 mg/kg. Dávkování se opakuje v intervalech v rozmezí od každého dne po každý druhý měsíc. Jeden výhodný dávkovači režim je podávat sloučeninu vynálezu denně první tři dny léčení, po kterých je sloučenina podávána každé 3 týdny, přičemž každé podávání je intravenózní v dávce 5 nebo 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Další výhodný režim je podávat sloučeninu podle vynálezu denně intravenózně v dávce 5 mg/kg tělesné hmotnosti po první tři dny léčby, po kterých je sloučenina podávána subjektu subkutánně nebo intramuskulárně každý týden v dávce 10 mg. Další výhodný režim je podávat jednu dávku sloučeniny vynálezu parenterálně v dávce 20 mg/kg tělesné hmotnosti, což je následováno podáváním sloučeniny subjektu subkutánně nebo intramuskulárně každý týden v dávce 10 mg.
Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány jako jedna dávka pro určité indikace, jako je prevence.imunitní odpovědi na antigen, kterému je subjekt vystaven krátkou dobu, např. exogenní antigen, podaný jeden den léčby. Příklady takových ·» ·· • · · · • · ·
* · • · • · . · • «
« · antigenů by zahrnuly společné podávání' sloučeniny vynálezu spolu s vektorem genové terapie, nebo léčebným přípravkem, jako je antigenní farmaceutický nebo krevní produkt. V indikacích, kde je antigen přítomný chronicky, jako je kontrola imunitní reakce na transplantovanou tkáň nebo na chronicky podávaná antigenní léčiva, jsou sloučeniny vynálezu podávány v intervalech po tak dlouhou dobu, jak je lékařsky indikováno, v rozmezí od dnů nebo týdnů až doživotně.
Zánětlivé odpovědi jsou charakterizovány zarudnutím, otokem, horkostí a bolestí, jako následky kapilární dilatace s otokem a migrací fagocytujících leukocytů. Zánět je dále definován Gallinem (kapitola 26, Fundamental Immunology, 2. vyd., Raven Press, New York, s. 721-733, 1989), což je zahrnuto v odkazech.
Pro lepší porozumění vynálezu uvádíme v následujících příkladech řadu experimentálních detailů. Avšak odborníkovi je zřejmé, že uváděné specifické metody a výsledky pouze ilustrují vynález, který je plně popsán v patentových nárocích, které poté následují.
Příklady provedení vynálezu
Příklady 1 a 2
Příklady 1 a 2 dále uvedené demonstrují, že zánětlivé cytokiny vyvolávají u buněk hladkého svalstva expresi CD40. Kromě toho dokazují, že signály zprostředkované CD40L regulují funkce hladkého svalstva.
• 4 * » w w ’ Λ a ··»*·** ·>·’···· ** ·· 32
Příklad 1
Pro zjištění, zda buňky hladkého svalstva exprimuji CD40, byla použita analýza FACS. Na 6 jamkových destičkách se kultivovaly buňky hladkého svalstva lidské aorty v živném médiu M199 doplněném 25% FCS, 5% lidským sérem, heparinem 90 gg/ml, růstovým faktorem endotelových buněk 15 μg/ml, a 1% penicilinem-streptomycinem. Média se měnila každé 2-3 dny a když byly buňky blízko konfluenci, byly 72 hodin pěstovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti IFN-γ (1000 U/cm3) , IL-la (1 ng/cm3) nebo TNF-a (200 U/cm3). Buňky se' sbíraly ošetřením trypsin-EDTA a exprese CD40 se určovala analýzou FACS pomocí mAb anti-CD40 G28.5. Buňky byly také označeny izotypovou negativní kontrolní mAb a jako pozitivní kontrola byla použita mAb anti-CD54 (ICAM-1) .
Buňky hladkého svalstva neexprimuji konstitutivně CD40, jak je ukázáno na obrázku 1A. Avšak IFN-γ na rozdíl od IL-la nebo TNF-a vyvolává expresi CD40 buňkami hladkého svalstva, (obrázky ΙΑ, 1B a 1C). Tyto studie dokazují, že IFN-γ vyvolává expresi CD40 na buňkách hladkého svalstva lidské aorty.
Příklad 2
Exprese CD40 na buňce hladkého svalstva byla vyšetřována in sítu. Buňky nalezené v medii normálních cév, které jsou morfologicky podobné buňkám hladkého svalstva, nereagují s mAb anti-CD40. Avšak buňky, které se morfologicky podobají buňkám hladkého svalstva, nalezené v zánětlivých lézích u akcelerované aterosklerózy po transplantaci, exprimuji CD40 in šitu. Tyto studie svědčí pro to, ze zánětlivé cytokiny indukují buňky hladkého svalstva, aby exprimovaly CD40. Kromě toho, tyto studie dokazují, že signály zprostředkované CD40L regulují funkce buněk hladkého svalstva.
• · • ·
9
9 9 · » **
9
9999
Příklad 3
CD40L+ CD4+ T buňky a CD40+ cílové buňky jsou přítomné u aterosklerózy a ischemické choroby srdeční po transplantaci srdce.
Aktivované endotelové buňky (EC) , makrofágy (Mac) a CD4+ T buňky jsou přítomné časně v lézích koronární aterosklerózy (CA) a aterosklerózy po transplantaci srdce (TA) . Protože CD40.L je CD4+ povrchová molekula T buňky indukovaná aktivací, která přenáší aktivační signály závislé na kontaktu CD40+ cílovým buňkám, včetně EC (vyvolaná exprese ICAM, VCAM a E-selektinu) a Mac (indukuje tvorbu NO, TNF-α a IL-1), zkoumali jsme in šitu expresi CD40L a CD40 u CA (n=5) a TA (n=5) . Exprese CD40L a CD40 se určovala .za použití mAb anti-CD40L. 5c8, mAb anti-CD40 G28.5 nebo příslušných kontrolních mAb. Zmrazené řezy normálních koronárních arterií (n=3) neobsahují T. buňky a exprese CD40 je omezena na EC. Na rozdíl od toho . léze spojené s CA a TA obsahují CD40L+ CD4+ T buňky, jak bylo určeno imunologickým značením sériových řezů. Kromě toho exprese CD40 na zmrazených řezech od pacientů s CA a TA je výrazně zvýšena na EC, infiltruj ících mononukleárních buňkách, pěnových buňkách a buňkách hladkého svalstva intimy (SMC) . Dvoubarevná imun.ohistochemická analýza (tj. s dvojím značením) tkáně fixované v parafinu za použití specifických markérů pro SMC (aktin hladkého svalstva) nebo Mac (HAM-56) potvrdila expresi CD40 na těchto .buňkách. Je zajímavé, že SMC intimy vzdálené zánětlivým buňkám a SMC medie jsou CD40~, což svědčí pro to, že místní zánětlivé mediátory vyvolávají expresi CD40 na SMC in vivo. Aktivace CD40 a CD40L+ CD4+ T buněk byla zjištěna ve všech stádiích TA a byla nejpatrnější v časných lézích CA, včetně lipidových proužků.
* · · • ·
4 4 • · • · ··
4 4 4 • 4 » 4
444 444
4
44
Úhrnem tyto studie, svědčí pro to, že CD40L+ T buňky mohou interagovat s CD40+ cílovými buňkami u CA a TA a přispět k patogenezi těchto nemocí podporováním tvorby prozánětlivých molekul.
Příklad 4
CD40 je· exprimován na buňkách hladkého svalstva a makrofázích v lézích aterosklerózy po transplantaci
Exprese CD40 in šitu u nativní aterosklerózy nebo aterosklerózy po transplantací byla studována dvoubarevnou imunohistochemickou analýzou. Studie s dvojitým imunohistochemickým značením se prováděly na koronárních arteriích, které byly fixovány v 10% pufrovaném formalínu a zality parafinem. Parafin se z řezů odstranil xylenem, řezy se hydratovaly a endogenní peroxidáza se utlumila 1,5% Η2Ο2 v 80% alkoholu. Řezy byly poté ošetřeny 0,01% pepsinem v HCI (pH 1,5) 15 minut ve 37 °C. Poté se řezy propláchly PBS a inkubovaly s 10% koňským sérem 20 minut, aby se blokovalo nespecifické značení. Poté se detekovalo anti-CD40 značení pomocí soupravy Vector ABC Elitě Kit (Vector) používající postupně biotinylovanou sekundární protilátku, komplex avidin-peroxidáza a jako vývojku 3,3' diaminobenzidin. Výskyt CD40 byl pozorován jako hnědé značení. Nato byly řezy opláchnuty PBS a opět blokovány 10% koňským sérem. Řezy se pak inkubovaly po dobu jedné hodiny s mAb specifickou pro buňky hladkého svalstva (aktin hladkého svalstva) nebo pro makrofágy (HAM 56). Primární protilátky se poté konjugovaly s alkalickou fosfatázou ' za použití systému avidin-bioti.n (Vector). Pro detekci aktivity alkalické fosfatázy byl použit vektor Red (Vector) a reakce poskytla červené značení. Proto dvojitě • ·· červené (buňky Pro kontrolu značené buňky vykazovaly hnědé (CD40) a hladkého svalstva nebo makrofágy) značení, interference mezi těmito dvěma imunohistochemickými postupy použitými pro analýzu dvojitým značením byly sériové řezy každého vzorku značeny také buď na CD40 aktin hladkého svalstva nebo HAM 56. Viz obrázky 3A a 3B. Kontrolní řezy vykazovaly stejnou distribuci imunoreaktivity pro každou z primárních mAb jako dvojitě označené řezy.
Příklad 5
Distribuce CD40L a CD40 u nativní koronární aterosklerózy a ischemické chorobě, srdeční po transplantaci srdce: korelace exprese CD40 s výskytem intercelulárních adhezivních molekul, aktivovaného NF-κΒ a výskytem T lymfocytů
T buňky hrají roli v patogenezi nativní koronární aterosklerózy (CA) a ischemické choroby srdeční po transplantaci srdce (TCAD), avšak mechanismus, kterým. T buňky interagují s dalšími buňkami v těchto lézích, není plně znám. CD40L je povrchová molekula CD4+ T buňky indukovaná aktivací, která interaguje s CD40+ cílovými buňkami, včetně makrofágů a endotelových buněk, a indukuje tvorbu prozánětlivých molekul, včetně ICAM-1 a VCAM-1. Kromě toho je známo, že vazba CD40 aktivuje transkripční faktor NF-κΒ. Aby se zjistilo, zda interakce CD40L-CD40 mohou hrát roli v patogenezi CA nebo TCAD, prováděla se imunohistochemické studie exprese CD40L a CD40 na zmrazených řezech koronárních arterií získaných od příjemců srdečního aloštěpu s CA (n=10) nebo TCAD (n=9). Za použití dvou různých mAb anti-CD40L bylo nalezeno, že exprese CD40L byla u CA a TCAD omezena na infiltruj ící lymfocyty. 'Exprese CD40 byla výrazně aktivována na endotelových buňkách intimy, pěnových buňkách, makrofázích a buňkách hladkého svalstva u obou nemocí. Dvojité imunologické značení prokázalo, že mnoho CD40+ buněk exprimovalo společně ICAM-1, VCAM-1 nebo aktivovanou formu NF-κΒ. Rozsah exprese CD40, ICAM-1 a VCAM-1 vykazoval statisticky významnou korelaci s vážností onemocnění a množstvím intimálních lymfocytů. Tyto studie úhrnem dokazují výskyt aktivovaných buněk CD40L+ a CD40+ u obou lézí, CA i TCAD, a svědčí pro to, že CD40L zprostředkovaná interakce s CD40+ makrofágy, pěnovými buňkami, buňkami hladkého svalstva a/nebo endotelovými buňkami může přispět k patogenezi těchto nemocí.
Několik, linií důkazů naznačuje, že imunitní mechanismy zprostředkované buňkami přispívají k zánětlivým lézím (1-4) charakteristickým pro nativní koronární aterosklerózu (CA) (5-10) a ischemickou chorobu srdeční po transplantaci srdce (TCAD) (11-13). Například infiltrující T buňky intimy exprimující aktivační markéry, jako jsou CD25 a molekuly MHC
II. třídy, jsou přítomné časně při vývoji vaskulárních lézí u obou nemocí (5, 14). Aktivované makrofágy jsou obecně nalézány v lézích u obou nemocí, stejně jako cytokiny spojené s imunitní odpovědí závislou na T buňkách, včetně IFN-γ, IL-1 a TNF-cc (5-17), Jako další důkaz, že T buňky mohou hrát patogenní roli u CA, byly izolovány CD4+ T buněčné klony z lidských fibroateromatózních plátů u CA, které proliferují a secernují IFN-γ, jsou-li přivedeny do kontaktu s oxidovanými LDL (18), hlavní složkou lézí u obou nemocí, nativní CA a TCAD (1, 19, 20). Kromě toho, hyperlipidemií vyvolané aterosklerotické léze jsou redukované u myší ošetřených mAb anti-CD4 (21). Podobně vaskulární léze u TCAD se významně zlepší, když jsou kmenům myší geneticky deficitních v T buňkách (13) transplantovány aloštěpy, nebo jsou tyto kmeny ošetřeny mAb i
• ·· ·« ·· ·· ·* a a « 4 4 44 4 4 44 · •J 44 4 4 · 4 4 4 4 •44444 44 444 444
444 444 4 4
444 44 44 4 4 44 44 44 anti-CD413- nebo anťi-IFN-γ (22) . Úhrnem tato data silně svědčí pro to, že v patogenezi těchto nemocí jsou zapojeny T buňky a také efektorové molekuly pocházející z T buněk (9, 23, 24).
CD40L je povrchová molekula o molekulové hmotnosti 30-33 k.D exprimovaná na aktivovaných CD4+ T buňkách, která přináší signály závislé na kontaktu k CD40+ cílovým buňkám, jako jsou B buňky (25-29) . CD40L zprostředkované signály jsou kriticky důležité ve vývoji humorální imunitní odpovědi in vitro a in vivo závislé na T buňkách (30) . Není známo, zda interakce CD40L-CD40 hrají také roli v imunitní odpovědi in vitro a in vivo zprostředkované buňkami (31, 32) . Je zajímavé, .že makrofágy a endotelové buňky, buněčné typy, o nichž je známo, že se účastní patogeneze CA a TCAD, také exprimují CD40 (33—37). Kromě toho vazba CD40 na makrofágy a endotelové buňky in vitro vyvolává tvorbu molekul, které zesilují imunitní odpovědi a/nebo mají prozánětlivé účinky. Například interákce CD40L-CD40 vyvolávají expresi molekuly MHC
II. třídy a společné stimulační molekuly CD86 -na makrofázích in vitro (38). Kromě toho vazba CD40 na makrofágy vyvolává tvorbu cytokinů (TNF-a, IL-Ιβ, IL-12), chemokinů (IL-8., ΜΙΡ-la), oxidu dusnatého ' (NO) prostřednictvím indukce NO-syntetázy 2, prokoagulačního proteinového tkáňového faktoru a metaloproteináz mezibuněčné hmoty (33, 34, 39-42). Interakce CD40L-CD40 aktivují intercelulární adhezivní molekuly CD54 (ICAM-1), CD106 (VACM-l) a CD62E (E-selektin) na endotelových buňkách (35-37). Mnoho účinků vazby CD40 závisí na aktivaci transkripčního faktoru NF-kB (43-45).
Tyto nálezy společně nasvědčují představě, že vazba CD40 na celou řadu cílových buněk může zesilovat CD4+ T buňkami zprostředkovanou zánětlivou reakci in vivo. Tuto hypotézu podporuje aktivace .exprese CD40 v ledvinách pacientů • ·· ·· · * • ·· • · · · • · t ·· · 99
99
9 9 9
9 9
9 9
9 9
9999
99
9 9 9
9 9 9 * «····· • ·
99 s lupoidní glomerulonefritidou, nefropatií IgA a glomerulonefritidou ANCA+ a v kůži pacientů s psoriázou (35, 46) . Kromě toho CD40L+ T buňky infiltrují ledviny pacientů se zánětlivými renálními nemocemi (46). Protože interakce T buněk s makrofágy, endotelovými buňkami a možná dalšími buňkami hraje roli v patogenezi CA a TCAD, je v současné studii zkoumána exprese CD40L a CD40 u těchto dvou nemocí za použití imunohistochemických metod. CD.40L je exprimován na T buňkách a exprese CD40 je aktivována na endotelových buňkách, buňkách hladkého svalstva, makrofázích a „pěnových buňkách v intimálních lézích u obou nemocí. Kromě toho, při použití dvojitého imunologického značení bylo nalezeno, že mnoho CD40+ buněk v těchto lézích exprimuje společně CD54, CD106 a aktivovanou formu NF-kB.
Popis,použitých metod
Lidské koronární arterie
Z explantovaných srdcí 23. příjemců srdečního aloštěpu se získaly segmenty levé koronární arterie nebo proximální části rámus interventricularis anterior. Devět pacientů podstoupilo retransplantaci, protože se u nich vyvinula těžká ischemická choroba srdeční po transplantaci srdce (TCAD). U těchto pacientů bylo přežití prvního aloštěpu v rozmezí mezi 38 a 103 měsíci. Deset pacientů obdrželo srdeční aloštěpy, protože se u nich vyvinula těžká ischemická choroba srdeční a ischemická kardiomyopatie. Kontrolní koronární arterie bez aterosklerotických změn byly získány z explantovaných srdcí 4 pacientů, 3 měli idiopatickou kardiomyopatii a jeden srdeční sarkom. Části každé cévy byly rychle zmraženy v izopentanu v -80 °C a na kryostatu (Reichert Histostat) se řezaly sériové ··· • ♦ · · · * · · · • · ·· · * · ···· ·· řezy v tloušťce 4 mm. Řezy byly upevněny na podložních sklíčkách potažených sialinem, sušeny na vzduchu, 1 minutu fixovány ve studeném acetonu, dalších 7 minut ve směsi studený aceton/chloroform 1:1 a uskladněny v -80 °C. Jeden řez z každé koronární arterie byl fixován v 10% formalinu a obarven hematoxylinem a eosinem pro histologické vyhodnocení.
Primární protilátky
Anti-CD40 z hybridomu G28.5 (IgGl) byla získána ze Sbírky buněčných kultur (American Type Culture Collection, Rockville, MD) . Protilátka mAb anti-CD40L 5C8 (IgG2a) byla připravena jak již bylo popsáno (28). Obě mAb G28.5 a 5C8 byly purifikovány z ascitu za použití kolony pro protein G (Pharmacia, Piscataway, NJ). Další mAb anti-CD40L (IgGl) byla získána od firmy Calbiochem (San Diego, CA) . Od firmy Caltag (Burlingame, CA) byla získána IgM mAb anti-CD40 a byla použita pro studie s dvojitým imunologickým značením. Monoklonální Ab proti CD3, CD4, CD8, CD34, CD68 (Novocastra, Burlingham, CA, všechny IgGl) a proti aktinu buněk hladkého svalstva (SMA) (DAKO, Carpinteria, CA, IgG2a) byly použity pro rozlišení různých buněčných typů v intimálních plácích, včetně T buněk (CD3, CD4 nebo CD8), endotelových buněk (CD34), makrofágů (CD68) a buněk hladkého svalstva (SMA). mAb anti-ICAM-1 (IgGl) a anti-VCAM-1 (IgGl) byly získány od CHEMICON™ (Temecula, CA) . Distribuce aktivovaného NF-κΒ se detekovala pomocí mAb p65 (IgG3) (BOEHRINGER . MANNHEIM™) , která se váže na epitop podjedn.otky p65 NF-κΒ blokovaný IkB, tento epitop je pak přístupný pouze, když je NF-κΒ aktivován disociací IkB (47) . Isotypová kontrolní mAb (Mopec 21, 22) byla získána od SIGMA™ (St. Louis, MO). .
• · • ·
4
4
Imunohistochemická metoda
Zmrazené řezy byly promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnany (PBS) a endogenní peroxidáza se Utlumila 0,5% peroxidem vodíku. Řezy byly „blokovány 10% kozím sérem a agregovaným lidským. Ig (80 mg/ml) v PBS, a poté byly jednu hodinu inkubovány s indikovanou primární mAb nebo odpovídající kontrolní mAb. Jako pozitivní kontroly pro určení optimálního ředění každé mAb byly použity zmrazené řezy tonzil s folikulární hyperplazií. Primární mAb navázaná na cílový antigen byla spojena s biotinem značeným, izotypově specifickým kozím anti-myším IgGl, IgG-2a, IgG3 nebo IgM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), který byl poté konjugován s komplexy avidin-biotin-peroxidáza (VECTOR ELITE KIT™, VECTOR™, Burlingham, CA). Peroxidázová aktivita se detekovala chromogenem (červeně) 3-amino-9-etylkarbazolem (AEC, VECTOR™, Burlingham, CA) a řezy byly kontrastně nabarveny Mayerovým hematoxylinem (SIGMA™, St. Louis, MO) .
Imunohistochemické vyšetření s dvojitým značením bylo použito pro identifikaci buněčných typů exprimujících CD40 a pro analýzu distribuce CD40 ve vztahu k ICAM-1, VCAM-1 nebo aktivovanému NF-κΒ v aterosklerotických lézích. Všechny řezy byly nejdříve imunologicky, značeny mAb IgM anti-CD40. Sekundární Ab byl biotinylovaný kozí anti-myší IgM, který byl poté konjugován s komplexem avidin-biotin-peroxidáza. Chromogen použitý pro detekci výskytu mAb anti-CD40 IgM' byl 3,3' diaminobenzidin (hnědý). Řezy byly poté důkladně promyty a inkubovány s druhou primární mAb, která označovala buď buněčně specifický markér pro buňky hladkého svalstva (SMA) nebo makrofágy (CD68), leukocytární adhezivní molekuly (ICAM-1, VCAM-1) nebo aktivovanou formu NF-κΒ. Všechny tyto druhé primární mAb byly isotypu buď IgGl, IgG2a nebo IgG3.
« • « ··
··
4 4
4 4
444 444 ' 4 4
Byla aplikována příslušná isotypově specifická biotinylovaná sekundární protilátka a konjugována s komplexem, avidin-biotinalkalická fosfatáza (VECTOR™, Burlingham, CA). Aktivita alkalické fosfatázy se prokazovala' chromogenem Vector Red (VECTOR™, Burlingham, CA) . Interferenci mezi postupně aplikovanými značícími postupy bylo zabráněno použitím různých imunoenzymatických technik (peroxidáza a alkalická fosfatáza) a izotypově specifickou sekundární Ab pro každý cílový antigen. Kromě toho byly připraveny dvojitě značené kontrolní řezy, ve kterých jedna ze dvou primárních mAb byla nahrazena isotypově souhlasnou kontrolní mAb.
Semikvantitativní analýza lézí
Rozsah aterosklerotických lézí· byl kvantifikován v každém řezu stupněm zúžení vaskulárního lumina ve škále od 0 do 4, ve které 0 znamenala žádné zúžení, 1 méně než 25 %, 2 méně než 50 %, 3 méně než 90 % a 4 přes 90 % zúžení lumina. Každá léze koronární arterie byla také hodnocena na obsah intimálních makrofágů, buněk hladkého . svalstva, pěnových buněk, endotelových buněk (néovaskularizace) (48) a T buněk, kdy 0 znamenala nepřítomnost příslušného buněčného typu, 1 ojedinělé izolované buňky, 2 malé soubory buněk, 3 výskyt ložiskových denzních agregátů a 4 denzní agregáty přítomné v celém plátu. Podobně byl ve škále od 0 do 4 hodnocen výskyt CD40, ICAM-1 a VCAM-1, kdy 0 znamenala nepřítomnost příslušné molekuly, 1 její výskyt na ojedinělých buňkách, 2 výskyt na méně než 50 %, 3 na méně než 90 % a 4 na více 90 % ze všech buněk (49) . Protože exprese CD40L v pozitivních vzorcích byla omezena na izolované buňky, nebyl jeho výskyt přístupný kvantitativnímu hodnocení.
• ·· ·♦ ·· ··· · · ·· · * *· · · · • · · · · · · • · · » · · ··· ·· ·· ····
Statistická analýza
Rozdíly v.histologickém hodnocení mezi skupinami vzorků byly analyzovány za použití neparametrického Kruskal-Wallisova testu. Závislost mezi proměnnými byla stanovena za použití Spearmanovy korelace.
Výsledky
Normální koronární arterie
Segmenty koronární arterie čtyř kontrolních pacientů nejevily žádné ztluštění intimy nebo zánět, jak bylo dokázáno barvením hematoxylinem a eosinem (obrázky 4A-4B). Specificky, makrofágy, buňky hladkého svalstva, pěnové buňky nebo lymfocyty nebyly v intimě přítomné a buňky nebyly imunoreaktivní ani s jednou mAb anti-CD40L použitou v této studii. Imunoreaktivita CD40 byla přítomna a ohraničená na endotelové buňky lemující cévní lumen kontrolních arterii (obr. 4B) . Buňky kontrolních cév neexprimovaly VCAM-1 nebo aktivovaný NF-κΒ a ojedinělé vaskulární endotelové buňky slabě exprimovaly ICAM-1.
Histologie nativní CA a TCAD
U 7 z 10 pacientů s CA byly v segmentech koronární arterie ' nalezeny vystupující fibroateromatózní pláty s excentrickým zúžením, bezbuněčným centrem bohatým na lipidy, štěrbinami . s cholesterolem a překrývajícím fibrózním krytem. Buněčnost lézí byla největší v „raménkových oblastech, které obsahovaly makrofágy a lymfocyty (obr. 5A). V intimálních lézích byly také roztroušené buňky hladkého svalstva, makrofágy, pěnové buňky a ložiska neovaskularizace:. Pláty u 3 pacientů s mírnými, . časnými vaskulárními lézemi, byly ·· ·· ·· ·· ·· • · · ·· · · ·· ·
.. · · · · · · · . · · · · · · ··· ··· • · « · · · · «· ·· ·»·· ·· ·· excentrické, malé, bohaté na makrofágy, pěnové buňky a lymfocyty.
Léze koronárních arterií u 9pacientů s TCAD projevovaly obvodové ztluštění intimy se značným zúžením lumina (viz tabulka 2) .
Tabulka 2
Semikvantitativní vyhodnocení (škála 0-4) buněčného složení intimální léze u nativní koronární aterosklerózy (CA) a ischemické choroby srdeční po transplantaci srdce (TCAD) a imunoreaktivity pro CD40, ICAM-1 a VCAM-1. Hodnoty jsou vyjádřené jako průměr + standardní odchylka.
Intimální plát Kontrola (n=4) CA (n=10) TCAD (n=9)
Tloušťka 0,3 ± 0,5 2,1 ± 0, 9* 3, 1 ± 0,8*
CD4+ lymfocyty 0 1,3 ± 0, 9* 3,2 ± 0,8*
CD8+ lymfocyty 0 0,3 ±0,5- 2,6 ± 1,1*
Makrofágy (CD68) 0,5 ±0,6 2,1 ± 0,8* 3, 8 ± 0,4*
Pěnové buňky 0 1,2 ± 0,8* 2,4 + 1,3*
Buňky hladkého svalstva 0, 8 ± 1 1,7 ± 0,7 2,9- ±0,8*
Neovaskularizace 0 1,8 ± 0,7* 2, 6 ± 0, 9*
CD4 0 0,5 ± 0,6 2,2 ± 0,7* 3,3 ± 0, 9*
ICAM-1 0,5 ± 0,6 2,3 ± 1,7* 3, 6 ± 0, 7*
VCAM-1 0,3 ± 0,5 1,7 ± 0,7* 2, 9 ± 0, 9*
* p 0,05 pro CA nebo TCAD proti kontrolám Kruskal-Wallisovým testem
J ·· · · · · · · · ζ « · · · · · · ·*· *·· ······ · · ··· <· ·» ·*·*. #· ··
Léze byly složeny z koncentrických vrstev buněk hladkého svalstva a mezibuněčné hmoty a byla zde nadměrná infiltrace makrofágů a lymfocytů spolu s oblastmi neovaskularizace. Ve 4 koronárních arteriích byly vedle koncentrických vrstev buněk hladkého svalstva rozpoznány ateromatózní léze bohaté na' lipidy a „pěnové buňky (obr. 6A-C). Charakteristickými rysy pozorovanými u lézí TCAD bylo také subendotelové nahromadění lymfocytů („endotelitida) a agregáty lymfocytů v adventicii.
Imunohistochemická analýza exprese CD40L u CA a TCAD
Značným rozdílem od normálních koronárních arterií, které jsou bez infiltrujících lymfocytů nebo buněk exprimujících CD40L, je, že obě léze, CA i TCAD, obsahují buňky CD40L+.. U. nativní aterosklerózy bylo imunologické značení pozitivní na CD40L omezeno na menšinu lymfocytů intimy. Značení CD40L bylo obvykle slabé a pozorováno buď v malých . cytoplazmatických granulích nebo na povrchu buněk (obr. 7A-D). U nativní CA většina intimálních lymfocytů byly CD4+ T buňky, CD8+ T buňky byly přítomny pouze ojediněle (obr. 7A-D). Analýza sériových řezů označených s mAb anti-CD4 nebo anti-CD8 svědčí pro tó, že CD40L+ lymfocyty byly primárně CD4+ T buňky. Endotelové buňky, buňky hladkého svalstva, makrofágy a „pěnové buňky nereagovaly s žádnou mAb anti-CD40L použitou v této studii.
U isotypových kontrolních mAb nebylo pozorováno žádné značení.
U lézí TCAD bylo pozitivní imunologické značení na CD40L také spojeno výlučně s lymfocyty . (obr. 8A-C). Na rozdíl od CA, byly u lézí TCAD přítomné jak CD8+ tak CD4+ T buňky. Avšak CD8 +
T buňky se nacházely převážně v subendotelových oblastech „endotelitidy (obr. 8A-C) , zatímco CD4+ T buňky byly lokalizovány v agregátech hlouběji v intimě přilehlé k vnitřní elastické, membráně (obr. 8A-C) a adventicii koronárních ·· ti· titi • · · ti · • · · • · · · · ti • tititi ·· ···♦ • · ti ti • titi ti
arterií. Exprese CD40L korelovala prostorově s CD4+ T buňkami v intimě a adventicii koronárních arterií u TCAD. Počet CD40L+ T buněk byl vyšší u TCAD lézí než u nativních CA lézí. Podobně jako , u CA, endotelové buňky, buňky hladkého svalstva, makrofágy.nebo „pěnové buňky u lézí TCAD nereagovaly s žádnou mAb anti-CD40L použitou v této studii (obr. 9A-B) . Tato data naznačují, že CD40L exprimující buňky, pravděpodobně CD4+ T buňky, jsou přítomné v lézích nativní CA a TCAD.
Imunohistochemická analýza exprese CD40 u CA a TCAD
Na rozdíl od slabé exprese CD40 omezené na endotelové buňky lumina u normálních koronárních arterií (obr. 4A-B) , CD40 imunoreaktivita byla aktivována a široce rozšířena v lézích nativní CA (obr. 5A-B). Exprese CD40 byla zaznamenána v endotelových buňkách, buňkách hladkého svalstva, makrofázích a „pěnových buňkách. V intimálních lézích nativní CA byl významně vyšší průměrný počet CD40 pozitivních . buněk než v kontrolních arteriích (2,2 + 0,7 proti 0,5 + 0,6, tabulka '2). Dvojí imunologické značení specifickými markéry pro makrofágy. nebo buňky hladkého svalstva potvrdilo, že tyto buňky a „pěnové buňky obou linií exprimují CD40 (obr. 10A-B). Je zajímavé, že CD40+ buňky hladkého svalstva byly přítomné v intimě blízko zánětlivých infiltrátů, zatímco buňky hladkého svalstva v medii arterií nevykazovaly pozitivní imunoreaktivítu pro CD40 (obr. 10A-B). Analýza sériových řezů označených CD40 nebo endotelovým markérem CD34 svědčí proto, že endotelové buňky lemující novotvořené cévy intimy a vasa vasorum adventicie byly také silně CD40+ (obr. 11A-D).
V arteriích pacientů s TCAD byl model distribuce exprese CD40 podobný jako u nativní CA. Avšak průměrné hodnocení CD40 imunoreaktivity bylo významně vyšší u TCAD než u nativní CA
nebo kontrolních arterií (tabulka 2). Dvojité imunologické značení ukázalo, že buňky hladkého svalstva intimy a makrofágy exprimují CD4 0 (obr. 10A-B.) . Kromě toho pěnové buňky (obr. 6A-B) a . endotelové buňky lemující vaskulární / lumen, novotvořené cévy intimy a vasa vasorum adventicie byly výrazně CD40+. Tato data společně dokazují, že éndotelové buňky, buňky hladkého svalstva a makrofágy exprimují CD40 jak u nativní CA, tak u TCAD.
Vztah exprese CD40 a intercelulárním adhezivním molekulám a aktivaci NF-κΒ u lézí CA a TCAD.
Makrofágy a endotelové buňky u CA a TCAD exprimují intercelulární adhezivní molekuly, které regulují vcestování. leukocytů do lézí. Protože vazba CD40 vyvolává aktivaci intercelulárních adhezivních molekul a aktivaci NF-κΒ na buňkách in vitro, bylo otázkou, zda exprese CD40 byla spojena se společnou expresí intercelulárních adhezivních molekul nebo NF-κΒ u lézí CA nebo TCAD. Nejdříve bylo dokázáno u nativní CA, že endotelové buňky lumina projevují ložiskové pozitivní imunologické značení na ICAM-1,, s ojedinělými endotelovými buňkami exprimujícími VACM-1. Na rozdíl od toho, endotelové buňky lemující novotvořené cévy intimy a vasa vasorum adventicie byly na ICAM-1 a VCAM-1 silně pozitivní (obr. 11A-D). Buňky hladkého svalstva intimy, makrofágy a „pěnové buňky byly také mírně až silně pozitivní na ICAM-1 a VCAM-1 (obr. 12A-C) . Mezi hodnocením CD40 a hodnocením ICAM-1 (r=0,85) a VCAM-1 (r=0,72) byla významná korelace (p<0,05). Počet lymfocytů intimy. významně koreloval s hodnocením pro CD4Ó a leukocytární adhezivní molekuly (viz tabulka 3).
·· 0 0 0 0 · · · · • 0 · · 0 · · ·· ·
0. 0 · · ····-• 000 0 · · 000000
000« »0 ··
Tabulka 3
Korelace hodnocení (0-4) pro různé buněčné typy intimálních lézí u CA (n=10) nebo TCAD (n=9) s hodnocením. (0-4) pro expresi CD40 a adhezivních molekul (ICAM-1, VCAM-1). Hodnoty jsou vyjádřeny jako Spearmanův korelační koeficient (rozmezí -1 až 1, přičemž „0 je žádná korelace, a „-1 nebo „1 dokonalá korelace).
Buněčný typ Skupina CD40 ICAM-1 VCAM-1
T lymfocyty (CD4+ a CD8 + ) CA 0,78* 0, 77* 0,83**
TCAD 0, 79* 0,87** 0, 7 7*
Makrofágy (CD68+) CA 0,93*** 0,84** 0,77*
TCAD 0,81** 0, 68* 0,55
Pěnové buňky CA 0,81** 0,68* 0,36
TCAD 0, 44 0,33 0,26
Buňky hladkého svalstva (SMA+) CA 0, 72* 0,81** 0,5 6
TCAD 0, 12 0,38 0, 02
Novotvořené cévy (CD34 + ) CA 0,69* 0,72* 0,53
TCAD 0,85** 0,87** . 0,77*
*p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001 hladina významnosti pro
Spearmanovu korelaci.
Ze všech uvedených buněčných typů pouze hodnocení intimálních lymfocytů významně korelovalo s expresí CD40, a rozsah ICAM-1 a VCAM-1 v intimálních plátech jak u CA, tak u TCAD nasvědčoval tomu, že lymfocyty jsou zapojeny v indukci CD40 a adhezivních molekul u obou nemocí. Makrofágy • *
a neovaskularizace také vykazovaly významnou korelaci s expresí CD40 u CA a TCAD.
Dvojité imunologické značení lézí CA s mAb anti-CD40 a anti-ICAM-1 nebo anti-VCAM-1 ukázalo, že CD40 byly lokalizovány společně s těmito adhezivními molekulami na mnoha buňkách (obr. 12A-C) . Kromě toho, v jádrech neointimální.ch endotelových buněk, makrofázích a buňkách hladkého svalstva byl pozorován aktivovaný NF-κΒ (obr. 13) a dvojité imunologické značení prokázalo, že mnoho CD40+ buněk také exprimovalo aktivovaný NF-kB.
U TCAD bylo přítomné silně pozitivní imunologické značení na ICAM-1 a VCAM-1 v endotelových buňkách lumina, zejména v těch, které byly blízko ložiskům endotelitidy. Endotelové buňky intimálních novotvořených cév vasa vasorum adventicie byly silně imunoreaktivní na ICAM-1 a VCAM-1. Hodnocení imunologického značení adhezivních molekul u TCAD bylo vyšší než u CA nebo normálních koronárních arterii (tabulka 2) . Byla významná korelace (p<,05) mezi . hodnocením CD40 a hodnocením ICAM-1 (r=0,82) a VCAM-1 (r=0,89). Počet intimálních lymfocytů také koreloval významně s expresí CD40, ICAM-1 a VCAM-1 (tabulka 3). Podobně jako u CA, dvoubarevné imunbhistochemické studie dokázaly, že mnoho CD40+ buněk u lézí TCAD exprimuje společně ICAM-1 nebo VCAM-1 (obr. 12A-C). Imunologické značení na aktivovanou jadernou formu NF-κΒ bylo siřeji rozprostřeno u TCAD než u nativní CA. NF-κΒ pozitivní makrofágy a buňky hladkého svalstva byly shodně CD40+ (obr. 13). Tyto studie společně dokazují, že v lézích jak nativní CA, tak TCAD, je CD40 společně exprimován na mnoha buňkách s intercelulárními adhezivními molekulami a/nebo NF-kB.
·· · · ·· · * ·· • · · ·· · · · · * • · · · · · « ··· ··· • · · · * · · • · · · · · · ·
Diskuse
Nativní ateroskleróza (CA) ateroskleróza po transplantaci (TCAD) jsou zánětlivé nemoci zprostředkované složitými interakcemi mezi aktivovanými T buňkami, endotelovými buňkami, makrofágy a buňkami hladkého svalstva (2, 8, 12, 13, 17) . Má se za to, že T buňky hrají roli v patogenezi CA a TCAD, ale mechanismus, kterým se zapojují do těchto procesů, není plně znám (5, 9, 50). Studie ukázaly, že CD40L, povrchová molekula CD4+ T buňky indukovaná aktivací, přináší aktivační signály závislé na kontaktu k endotelovým buňkám a makrofágům exprimujícím CD40, což má za následek tvorbu prozánětlivých molekul, jako jsou intercelulární adhezivní molekuly ICAM-1 a VCAM-1 (31, 32, 35-37) a aktivaci transkripčního aktivačního faktoru NF-kB (43-45, in vitro). Je zajímavé, že TCAD na myších modelech je alespoň částečně závislá na interakcích CD40L-CD40 (51). Ve studii Larsona a kolegů léčba mAb anti-CD40L výrazně inhibovala rejekci alogenního heterotopického transplantátu, a částečně blokovala přidruženou vaskulopatii. Kromě toho, TCAD u tohoto modelu bylo téměř kompletně zabráněno podáváním kombinace mAb anti-CD40L a fúzního proteinu CTLA4-Ig, molekuly, která blokuje společné stimulující dráhy T buňky (51). Je možné, že interakce CD40L-CD40 se mohou podílet v patogeneze CA a/nebo TCAD u lidí.
Pro další zkoumání této hypotézy byly na normální a aterosklerotické koronární arterie . použity další imunohistochemické techniky, aby bylo možné studovat expresi a buněčnou distribuci CD40L a CD40. Normální koronární arterie neobsahují buňky exprimující CD40L a CD40 imunoreaktivita byla u těchto cév omezena na endotelové buňky lumina. Na rozdíl od toho, CD40L je exprimován na lymfocytech v.lézích jak nativní
4 · · · · * 4 < ·· · · * · · ·· · · · ···· « 4·· · · · 444444 • · · · · * *
4 ··.···· · · ··
CA tak TCAD. Bylo nalezeno, že léze CA obsahovaly málo CD8 + T buněk, zatímco léze TCAD obsahovaly CD8+ T buňky v těsné blízkosti endotelu lumina („endotelitis) a CD4+ T buňky hlouběji v intimě a adventicii. Na základě lokalizace a značení sériových řezů mAb anti-CD4 nebo anti-CD8 bylo uzavřeno, že lymfocyty CD40L+ jsou nejpravděpodobněji CD4+ T buňky v lézích u obou nemocí. Za použití dvou odlišných mAb anti-CD40L bylo zjištěno, že CD40L imunoreaktivita byla slabá a nebyla spojená ani s granuly či cytoplazmou nebo buněčným povrchem. Podobný model CD40L imunoreaktivity byl pozorován ve studii exprese CD40L a CD40 u glomerulonefritidy (46) . To, žě je model značení exprese CD40 v zánětlivých tkáních slabý a často cytoplazmatický, se může vztahovat k přechodné povaze exprese CD40 na aktivovaných T buňkách (27-29) a faktu, že obsazení CD40 na cílových buňkách vyvolává rychlé utlumení CD40L endocytózou zprostředkovanou receptorem (52) a opadáváním receptorů (53) . Tyto regulační mechanismy pravděpodobně slouží . k zaměření signálů zprostředkovaných CD40L na příslušné rozpoznávané cílové buňky.
Bylo zjištěno, že exprese CD40 byla výrazně aktivována na mnoha buňkách v lézích u obou nemocí. Makrofágy a „pěnové buňky exprimující CD40 byly obzvláště nápadné v zánětlivém infiltrátu „raménkových oblastí plátů bohatých na lipidy, o nichž je známo, že obsahují denzní zánětlivé infiltráty (54, 55) . Exprese CD40· byla také aktivována na endotelových buňkách lumina u obou nemocí, což bylo nápadné zejména u TCAD. Endotelové buňky novotvořených cév intimy a vasa vasorum adventicie byly u obou nemocí silně CD40+. Buňky hladkého svalstva exprimující CD40 se vyskytovaly v intimě obou CA a TCAD, obvykle v těsné blízkosti zánětlivých infiltrátu. Je zajímavé, že buňky hladkého svalstva v medii stejných cév byly ·· ·» 99
9 9 9
9 9
9 9 9 9 • 9 9 9
99 999
9 99
hodnoceny jako CD40-. IFN-γ vyvolával expresi CD40 na mnoha buňkách in vitro (33, 35-37, 56) včetně buněk hladkého svalstva, a tento účinek je zesílen cytokiny, jako je IL-Ιβ a TNF-a (36) . Proto výrazná aktivace CD40 exprese na mnoha buněčných typech u těchto lézí může být následek uvolnění cytokinů T buňkami, makrofágy a dalšími buňkami léze. Dvojité imunologické značení ukázalo, že mnoho CD40+ buněk také současně exprimuje intercelulární adhezivní molekuly ICAM-1 a VCAM-1, a také aktivovanou formu. NF-κΒ. Současná studie zároveň dokazuje přítomnost CD40L+ T buněk a aktivovaných CD40+ cílových buněk ve vaskulárních lézích nativní CA a TCAD.
Dřívější studie ukázaly, že CD40 byl exprimován na některých nádorech epitělových buněk a B buňkách (57, 58).
Nověji bylo zaznamenáno, že CD40 je konstitutivně exprimován nebo indukovatelný na mnoha buněčných typech in vitro (33-37, 56) . Dále je stále více zřejmé, že interakce CD40L-CD40 mají klíčovou úlohu v zánětlivých reakcích zprostředkovaných buňkami in vivo (31, 32). V tomto ohledu současné publikace demonstrují in šitu CD40L a/nebo CD40 expresi u lidských zánětlivých nemocí (35, 46, 59) . Například exprese CD40 je aktivována na makrofázích infiltrujících mozky pacientů se sclerosis multiplex (59), na kožních endotelových buňkách a keratinocytech u psoriázy (35), a na mnoha buňkách v ledvinách pacientů se zánětlivými glomerulonefritidami (46). Mimoto zánětlivé infiltráty v mozcích pacientů se sclerosis multiplex (59) a v ledvinách pacientů se zánětlivými glomerulonefritidami (46) obsahují CD40L+ T buňky. Je proto pravděpodobné, že exprese CD40 je aktivována u mnoha zánětlivých nemocí a představuje molekulární mechanismus, který umožňuje T buňkám přenášet prozánětlivé signály k celé řadě cílových buněk. Z tohoto zřetele nálezy zde prezentované, • · * 9
• · ··
že exprese CD40 je aktivována u CA a TCAD, a že CD40L+ infiltrujicí T buňky jsou nalézány v lézích, slouží jako důkaz hypotézy, že imunitně zprostředkované zánětlivé reakce hrají roli v patogenezi těchto nemocí (5-7, 9, 18,. 21, 23, 50) .
Pozorování týkající se CD40L zprostředkované aktivace endotelových buněk a makrofágú in vitro a studie interakcí CD40L-CD40 v patogenezi TCAD na myších modelech, svědčí pro možnou patogenní úlohu interakcí CD40L-CD40 u CA a TCAD. Například CD40L zprostředkované signály aktivují expresi ICAM-1 a VCAM-1 na endotelových buňkách, in vitro (35-37),. Tyto intercelulární adhezivní molekuly, které regulují odchod a retenci leukocytů na'zánětlivých místech, jsou aktivovány na endotelových buňkách u CA a TCAD a jsou významné zejména na endotelových buňkách novotvořených cév intimy a vasa vasorum (49, 60) . Proto je zajímavé, že v lézích CA a TCAD bylo nalezeno mnoho CD40+ buněk, a zejména endotelových buněk intimy a vasa vasorum, které exprimují současně ICAM-1 a/nebo VCAM-1. Je známo, že aktivace IČAM-1 a VCAM-1 je závislá na aktivací NF-kB (61). V předkládané studii bylo. také dokázáno, že CD40+ intimální makrofágy, buňky hladkého svalstva a endotelové buňky exprimují aktivovanou formu NF-kB. Tyto studie svědčí pro to, že CD40L+ CD4+ T buňky mohou vyvolat aktivaci intercelulárních adhezivních molekul na CD40+ cílových buňkách u CA a'TCAD, částečně možná aktivací NF-kB.
Signály zprostředkované CD40L také vyvolávají u endotelových buněk sekreci IL-6 a IL-8 (62) a podněcují prokoagulační povrch aktivací tkáňového faktoru a utlumením exprese trombomodulinu. S ohledem na makrofágy, interakce CD40L-CD40 vyvolávají u těchto buněk sekreci prozánětlivých cytokinů (IL-la, IL-Ιβ, IL-6 TNF-a), chemokinů, metaloproteináz mezibuněčné hmoty a exprimují tkáňový faktor ·· *» *· • · · · * · ·· · · · • · · · · · • · · · · • ·· ·· ···· ··.
·· • · * · • · .· · « · · · · · in vitro (33, 34, 38, 41, 42) . Všechny tyto ' prozánětlivé molekuly mají pravděpodobně úlohu v patogenezi CA a TCAD (10, 17, 63-66). Vazba CD40 na makrofágy také vyvolává tvorbu NO (39, 40). Je zajímavé, že blokování interakcí CD40L-CD40 u myších modelů TCAD je spojeno ,s. utlumením exprese iNOS. a redukcí TCAD lézí (51). Bylo dokázáno, že iNOS je exprimován v lézích CA (67, 68), reje.kcí srdečního aloštěpu (69, 70) a TCAD (71, 72). Signály zprostředkované CD40L 1 mohou být zapojeny v podpoře tvorby jakékoliv z těchto molekul u CA nebo TCAD. Interakce CD40L-CD40 mají jasně prozánětlivé účinky u myších modelů TCAD (51), a také u artritidy indukované kolagenem (73), glomerulonefritidy podobné glomerulonefritidš (74) encefalomyelitidy (59).
Zkoumala se také experimentální lupoidní alergické
CD40 exprese CD40L a u aterosklerózy karotid u lidí. Bylo zjištěno, že CD40 byl v lézích aktivován a měl rozsáhlou buněčnou distribuci. Bylo publikováno, že CD40L je široce exprimován na buňkách hladkého aterosvalstva, endotelových buňkách . a makrofázích sklerotických lézí, zatímco v předkládané studii za použití dvou různých mAb anti-CD40L, byla exprese CD40L omezena na T buňky. U žádné nemoci nebyla pozorována^ in šitu exprese CD40L na makrofázích, endotelových buňkách nebo buňkách hladkého svalstva. Podobně bylo také zjištěno, že CD40L imunoreaktivita je omezena na T. buňky u jiných zánětlivých nemocí, . včetně glomerulonefritidy (46), revmatoidní artritidy a chronické sinusitidy. Navíc Gerritse et al. publikovali, že exprese CD40L byla omezena na CD4+ T buňky v ložiscích u sclerosis multiplex (59). Nesrovnalosti mezi výsledky zde uvedenými a výsledky Macha a kolegů jsou v současné době • ·· ·· ·· ·: ·..· : : *. i· ϊ i . · . · · · · ··· ··; · · * ·. · ·_· ··· .· ·· ···· ·· ·· nejasné, ale mohou se týkat jemných odchylek v imunohistochemických technikách nebo v povaze lézí.
Seznam citované literatury
1. Nilsson, J. 1993. Transplant Proč . 25:2063-2064.
2. Munro, J- , and R. Cotran. 1988.. Lab Invest
58:249-261.
3. Cramer, D. , et al. 1992. J Heart Luna Transplant
11:458-466.
4 . Rillingham, M. 1992. J Heart Lung Transplant
1I:S38-S44.
5. Zhou, X., et al. 1996. Am J Pathol. 14 9:3.59-366.
.
.
Wick, G. , et al. 1995. Immunol. Today. 16:27-33. Sterarae, S., et al. 1992'. Arteriosclerosis and
Tnrombc. 12:206-211.
8. Ross, R. 1993. Nátuře. 362:801-809.
9 . Lichtman, A , eí. G- . 1996. Am J Pathol. 149:351-357
10 . Kishikawa, u •»· / e t al. . 1993. Virchows Arch
423 :433-442. Krensky, A. 19 94 . K idney Int. 45:50S-56S..
2. . Salomon, R. et G J. . 199.1. Am J Pathol. 138:791-798
12 Shi, C., e t a _ 1 996. Proč Nati Acad Sci, USA
93 : 2_ ‘I . 4051-4056 . Jonassor., - et al. 1985. J Clin Invest
c : Rus seli, P S . t et al . 19 94. Am. J. Pathol
260-274.
16. Nover, C., et al. 1992. J Pathol. 138:951-960.
17. Libbv, F., and Z. Gallis. 1995.. Ann NY Acad Sci. 748:155-168.
18. Stemme, S., et al. 1995. Prcc Nati Acad Sci, USA.
92:3893-3897.
19. Witztum, J., and D. Steinberg. 1991. J Ciin Invest. 8S:1785-1792 . .
• ·· ·* ·· · · · * · • ·· · · • · · · · · • » · · ♦ · • · · · · · 4 4 • 4 4 4 ·
4 4 4 4
I 4 ··· ··· • ·
4444 ·
C. de Lorgeril 125:974 -9SQ.
. Emescr., E. , e . Russell, E . 57:1357-1371.
et ar.. 19 92. Am Hsart 3.
1995. Am 3 Pathci. 149:575-585. al. 1994. Transolar.taticn.
23. Russell, M., et al. 1996. J Clin Invest. 97:833-838.
24. Hancock, W., et al. 1996. Proč Nati Acad Sci.
93:13967-13972.
25. Graf, D., et al. 1992. Eur J Immunol. 22 :3191-3194 .
26. Armitage, R. J., et al. 1992. Nátuře. 357 (6373) :80-2.
27. Lané, P., et al. 1992. Eur J Immunol. 22:2573-2578. 26. Lederman, S., et al. 1992. J Exp Med. 175 (4) : 1091-101.
29. Noelle, R. et al. 1992. Proč Nati Acad Sci USA. 89 :6550-6554.
30. Banchereau, 3., et al. 19 94. Annu. ReV. Immunol. 12:881-922.
31. Noelle, R. 1995. Immunitv.' 4:415-419.
32: Stout, R., and 3. Suttles. 1996. Immunol Today.
:487-492.
33. Aiderson, M. R. , et al . 1993. J Exp Med . 178 '2) : 66 9-74 .
4. Caux, 3., et al.
35. Kcllenbaugh, D.
2:33 -4 C.
35. Karmann, K. , et al.. 1995. Proč Nati Acad Sci, USJ rn
1994. 3. Exp. Med. 180:1263-1272.
, ec al. 1995. J. Exd. Med.
92:4342-4346.
37. Yellin, M. 182:1657-1664.
•3 C ar .
Exc Med
1995. 3 Immunol. 155:4517-4925. 35. Stout, R., et al. 1996. 3 Immunol. 156:8-11.
2. Tiar., L., et al . 1995. Eur 3 Immunol. 25:306-305.
• ·· *· ·· ·· ·· AA A A · » · · A · « · • ·· A A · A A A A
A A · A A · · · ··· ···
A A · A A A
AAA AA ·· ···· '
41. Pradier, C., et al .
26:3048-3054.
42. Malík, K., e: al . 1596. J Immunol. 155:3.952-3960.
42.. Berberich, I., e: al. 1994. J Immunol.
153:4257-4366.
44. Hess, S., et al . 1995. C Immunol. 155:4586-4595.
Ξ . Ksrnianr., K. , et al. 19 95. C- Exp Med. 184:172-182. 46. Yellzr., M., ez al. 1997. Arthritis Rheum.
40:124-124.
47. Brand, K., et al. 1996. J Clin Invest. 97:1715-1722.
1996. tur J Immunol.
Kuamamoto, M., et al. 1995. Human Path. 26:450-456. 0'3rien, K., et al. 1996. Circulation. 93: 672-682.
1995. Virchows Arch.
et al .
.
50. Haraoka,
426:307-315.
51. Larsen, C. , et al. 1996. Nátuře . 381 : 4,34-438 .
52. Yellin, M. J., et al. 1994
J Immunol. 152 (2) :598-608 =:-5.
Graf, D.·, et al. '1995. Eur
Immunol. 25:1749-1754.
54. Bjoerkerud, S., and B. Bjoerkerud. 1996. Am J Pathol. 149:367-380.
55. van der Wal, A., et al. 1994 . Circulation. 8 9:36-44.
56. Yellin, M. J., et al. 1995. J. Leuk. Biol.
: 209-216.
57. Pauli, S,,. et al. 1985. Cancer Immunol. Immunother. 20:23-28.
58. Clark, E. A., and J. A. Ledbetter. 1986. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 83:4494-4498.
59. Gerritse, K. , et al . ,1996. Proč. Nati. Acad. Sci. 93:2499-2504.
Davies, M., et al. 1993. J Pathol. 171:223-229. Coilins, T., et al. 1995. FASEB J. 9:899-909.
Mach, F. , et al . 1997. Proč Nati Acad Sci, USA.
:1931-1936.
• 4 • · • ·· • 4 4
4 · ··· ··
-♦· • ·
4
4
4
444
4
4
4 4 4
č 5 . Li, Z. , et al. 1955. Αττ. C Fath. 148:121-128..
6 £ . Gan s , Z , et al. 1994. J Clin Invest. 94:2493-2503
5 7. Buttery, L. , et al.. 199c . Lab . Invest . 75:77-85.
6 £ . Aji, W. , et al. 1997. Cir culation. 95:430-437.
£ Yar.g, X. , et a_. 1554.c Clin Invest. 94:714-721.
70 . Worrall, N. , et al. 1955 . J Exp Med. 181:63-70.
í *7 * Russell, M. , et al. 1955. Čirou' atior.. 92:457-464.
72 . Akyurek, 1. , et al. 1956. An~ J Pathoi
» 2 4 c 1851-1990
73 . Durie, F . H., et al. 1993 . Science. 261:1326-1330.
74 . Mohan, C . , et al. 1995. J Immunol. 154:1470-1480.
Φ 00 · * 0 00
0 0
0 ·
000 00
0 0 0
0 · 0 0
0 0
0000
0
0 0 0
0 0
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 146 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE:, lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ:, ne
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1
Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala Hrs Val Ile Ser Gl u Ala Ser
5 10 15
Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trn Ala Glu Lvs Glv Tv r Tyr Thr
2 0 25* 3 0
Met Ser . Asn ' 35 Asn Leu Val Thr Leu 40 Glu Asn Gly Lys Gin 45 Leu Thr' Val
Lys Arg 50 Gin Gly Leu Tyr Tyr 55 Ile Tyr Al a Gin Val 60 Thr Phe Cys Ser
Asn 65 Arg Glu Ala Ser Ser 70 Gin Ala Pro Phe Ile 75 Al a Ser Leu Cys Leu eo
Lys Ser Pro Gly Arg es Phe Glu Arg Ile Leu 90 Leu Arg Ala Ala Asn 95 Thr
Kis Ser Ser Ala 100 Lys Pro Cys Gly Gin 105 Gin Ser Ile His Leu 110 Gly Gly
Val Phe Glu 115 Leu Gin Pro Gly Ala 120 Ser Val Phe Val Asn 125 Val Thr Asp
Pro Ser 130 Gin Val Ser His Gly 135 Thr Gly Phe Thr Ser 140 Phe Gly Leu Leu
Lvs Leu 145 ♦ tititi • ti ti
• ti ti • ti • ti ti • titi • ti titi ti··· • titi

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití činidla, které inhibuje interakci mezi ligandem CD40 a CD40, pro přípravu léčiva k inhibici aktivace buněk, nesoucích na buněčném povrchu CD40, způsobené ligandem CD40, kde buňky nesoucí CD40 jsou buňky hladkého svalstva měchýře, buňky hladkého svalstva cév, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterií, buňky hladkého svalstva pulmonálních žil nebo buňky hladkého svalstva gastro-intestinálního traktu.
    2. Použití podle nároku 1, kde buňky hladkého svalstva gastro-intestinálního .traktu jsou buňky hladkého svalstva jícnu, buňky hladkého svalstva žaludku, buňky hladkého svalstva střev nebo buňky hladkého svalstva tenkého střeva.
    3. Použití podle nároku 1, kde .činidlo specificky inhibuje vazbu ligandu CD40 na CD40 buněk hladkého svalstva.
    4. Použití . podle nároku 1, kde činidlo specificky váže epitop, na který se specificky váže monoklonální protilátka 5c8, produkovaná hybridomem ATCC č. HB 10916.
    5. Použití podle nároku 1, kde se činidlo specificky váže k CD40.
    6. Použití podle nároku 1, kde činidlo je vybráno ze skupiny obsahující proteiny, látky jiné než proteiny a peptidómimetické sloučeniny.
    • · • 4
    44
    44 • 4 4 · • · · • · · 4 4 • 4 4 •4 4444
    44
    4 ·
    4 4
    444 444
    4
    44
    7. Použití podle nároku 6, kde protein představuje-protilátku nebo její část.
    8. Použití podle nároku 7, kde protilátka je vybrána ze skupiny obsahující monoklonální protilátky., polyklonální protilátky, chimérické protilátky, humanizované , protilátky, primatizované protilátky a takové protilátky, které obsahují oblast CDR jednoho člověka a kostru protilátky jiného člověka.
    9. Použití podle nároku 8, kde monoklonální protilátka je protilátka 5c8 produkovaná hybridomem ATCC č. HB 10916.
    10. Použití podle nároku 6, kde protein obsahuje rozpustný extracelulární úsek ligandu CD40, nebo jeho varianty včetně konzervativních substituentů, nebo jeho části, nebo obsahuje rozpustný extracelulární úsek CD40, nebo jeho varianty včetně konzervativních substituentů, nebo jeho části. '
    11. Použití podle nároku 10, kde rozpustný extracelulární úsek ligandu CD40 nebo CD40 je monomer nebo oligomer.
    12. Použití podle nároku 10, kde rozpustný extracelulární úsek CD40 nebo jeho část dále obsahuje úsek Fc fúzovaný s extracelulárním úsekem CD40 nebo jeho částí nebo ligandem CD40 nebo jeho částí.
    13. Použití podle nároku 1, kde činidlo je vybráno nebo navrženo pomocí optimalizace struktury základního • 4 ·4 ··
    4 4 4 4
    4 4 4 4
    4 444 444 · 4
    444 44 44 inhibičního činidla na základě trojrozměrné struktury komplexu rozpustného extracelulárního úseku CD40 nebo jeho části se základním inhibičním činidlem.
    14. Použití podle nároku 1, kde činidlo specificky inhibuje buněčnou aktivaci prostřednictvím ligandu CD40 buněk hladkého svalstva nesoucích CD40, které se podílejí na nemoci závislé na buňkách hladkého svalstva.
    15. Použití podle nároku 14, kde nemoc závislá na buňkách hladkého svalstva patří do skupiny obsahující cévní nemoci, nemoci měchýře a nemoci gastro-intestinálního traktu.
    16. Použití podle nároku 15, kde' nemoc gastro-intestinálního traktu patří do skupiny obsahující poruchy motility jícnu, zánětlivé střevní nemoci a sklerodermie.
    17. Použití podle nároku 15, kde cévní nemoc je ateroskleóza.
    18. Použití podle nároku 1, kde činidlo je vybráno testovací metodou, která spočívá v provedení následujících kroků:
    a) izoluje se vzorek buněk hladkého svalstva, přičemž tyto buňky jsou buňky hladkého svalstva měchýře, buňky hladkého svalstva cév, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterií, buňky . hladkého svalstva pulmonálních žil nebo. buňky hladkého svalstva gastro-intestinálního traktu,
    b) vzorek se kultivuje v podmínkách, které dovolují aktivaci těch buněk hladkého svalstva ve vzorku, které .nesou CD40, .
    > 4.-4 « » * · «
    444 ··« • <
    44
    č. HB 10916, s proteinem, vzorek se přivede do kontaktu . s buňkami exprimujícími protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC nebo se vzorek přivede do kontaktu který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC č. HB 10916, přičemž uvedené buňky nebo protein účinně aktivují buňky hladkého svalstva nesoucí CD40,
    d) vzorek se přivede do kontaktu s množstvím . činidla, které účinně inhibuje aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40, pokud uvedené činidlo inhibuje na CD40-CD40L závislou aktivaci . buněk hladkého svalstva nesoucích CD40, a
    e) určí se, zda buňky exprimující protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC č. HB 10916, nebo zda. protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC HB 10916, aktivují v přítomnosti činidla buňky hladkého svalstva nesoucí CD40.·
    19. Způsob selekce, činidla, které inhibuje interakci ligandu CD40 buněk hladkého svalstva, přičemž se jedná o buňky hladkého svalstva měchýře, buňky hladkého svalstva, cév, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterii, buňky hladkého svalstva pulmonálních žil nebo buňky hladkého svalstva gastro-intestinálního traktu, které nesou na svém buněčném povrchu CD40, vyznačující se tím, že se skládá z kroků, kdy se
    9 '9 9 9 ·· • 9 9
    9
    9
    9999
    9
    99
    a) izoluje vzorek buněk hladkého svalstva, přičemž tyto buňky jsou buňky hladkého svalstva měchýře, buňky hladkého svalstva cév, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterií, buňky hladkého svalstva pulmonálních žil nebo buňky hladkého svalstva gastro-intestinálního traktu,
    b) vzorek kultivuje v podmínkách, které dovolují aktivaci těch buněk hladkého svalstva ve vzorku, které nesou CD40,
    c) vzorek přivede do kontaktu s buňkami, exprimujícími protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC HB 10916, nebo se vzorek přivede do kontaktu s proteinem, který je specificky rozpoznáván.monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC č. HB 10916, přičemž uvedené buňky nebo protein účinně aktivují buňky hladkého svalstva nesoucí CD40,
    d) vzorek přivede do kontaktu s množstvím činidla, které účinně inhibuje aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40, pokud uvedené činidlo inhibuje na CD40-CD40L závislou aktivaci buněk hladkého. svalstva nesoucích CD40,: a
    e) určí, zda buňky exprimující protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC č. HB 10916, nebo zda protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem ATTC HB 10916, aktivují v přítomnosti činidla buňky hladkého svalstva nesoucí CD40.
    ·· ·· » · · 1 ·· • · ·· ····
    20. Použití podle nároku 18, kdy vzorek buněk hladkého svalstva je vybrán ze skupiny obsahující: buněčné linie v kultuře, buňky izolované ze zvířete, buňky izolované z pevné tkáně, buňky získané z biopsie kostní dřeně a buňky izolované z tělních tekutin.
    21. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že vzorek buněk hladkého svalstva se vybere . ze skupiny obsahující: buněčné linie v kultuře, buňky izolované ze zvířete, buňky . izolované z pevné tkáně, buňky získané z biopsie kostní dřeně a buňky izolované z tělních tekutin.
    Obr. IA
    Obr. 1B
    Obr. 1C
    Obr. ID
    VV Z& - ^(.7 •ti ·· ·· • · 9 9 9 9
    1/42
    IL-1
    TNF-θ' • ti
    9 • ti
    9 9
    2. ς • ·· · · · · ·· ··· · · ·· · · · ··· · · ····· ·· ··· · · · ······ ······ · · ··· ·· ·· ···· ·· ··
    2/42
    Obr. 2A
    REMARKS ATOMIC 0 OORDI NATES OF CD4 0L CRYSTAL STRUCTURE ΣΝ PDB FORMÁT CRYST ATOM 77 . 170 N 77 . GLY 170 116 90 . .460 90. - 7.954 00 90.00 -16.144 120.00 22.488 R3 2 . 00 64.71 * Λ ATOM 2 KT1 GLY 116 -7.087 -15.852 21.964 • Γ» « . V 15.00 A ATOM 3 HT2 GLY 116 -8.082 -17.142 22.242 1. 00 15 .00 A ATOM 4 HT3 GLY 116 -8.630 -15.576 21.928 2.00 25.00 A ATOM 5 CA Oi-J 116 -7.927 -15.755 23.928 1.00 64 .37 A ATOM 6 r·· U GLY 116 -6.990 -16.621 24.7B0 1.00 64 .34 A ATOM 7 0 GLY 116 -6.968 -17.814 24.563 1.00 64.44 A ATOM 8 N ASP 117 -6.238 -16.043 25.740 1.00 64 . 04 A ATOM 9 K ASP 117 -5.617 -16.709 26.170 1.00 15.00 A ATOM 10 CA ASP 117 -6.284 -14.616 26.130 1.00 63.57 A ATOM 11 CB ASP 117 -5.711 -14.402 27.539 1.00 63 .36 A ATOM 12 CG ASP 117 -6.518 -15.163 28.574 1.00 63.71 A ATOM 13 OD1 ASP 117 -6.090 -16.247 28.965 1.00 63.24 A ATOM 14 OD2 ASP 117 -7.566 -14.668 28.987 1.00 63.29 A ATOM 15 ASP 117 -5.651 -13.585 25.184 2.00 63.31 • Λ ATOM 16 0 ASP 117 -6.039 -12.427 25.145 1.00 63.35 A ATOM 17 N GLN 118 -4.713 -14.090 24.379 1.00 62.72 A ATOM 18 H GLN 118 -4.45G -15.040 24.541 1.00 15.00 A ATOM 19 CA GLN 11B -4.097 -13.313 23.281 1.00 €1.79 A ATOM 20 CB GLN 118 -2.918 -14.117 22.687 1.00 62.46 A ATOM 21 CG GLN 118 -3.047 -15.659 22.562 1.00 62.95 A ATOM 22 co GLN 118 -4.277 -16.118 21.790 1.00 63.26 A ATOM 23 OE1 GLN 118 -5.396 -16.000 22.277 1.00 63 .43 A ATOM 24 NE2 GLN 118 -4.044 -16.665 20.601 1.00 63.42 A ATOM 25 HE21 GLN 118 -4 . B36 -16.715 19.975 1.00 15.00 A ATOM 26 KE22 GLN ne -3.151 -16.995 20.298 1.00 15.00 A ATOM 27 GLN 118 -4.999 -12.841 22.128 1.00 60.59 A ATOM 28 0 GLN 118 -4.887 -13.379 21.052 1.00 60.79 A ATOM 29 N ASN 119 -5.912 -11.901 22.445 1.00 58.61 * ATOM 30 ASN 119 -5.917 -11.600 23.389 1.00 15.00 A ATOM 2 2 CA ASN 119 -6.6B9 -11.222 21.386 1.00 56.39 A ATOM 5 2 CB ASN 119 -7.947 -11.982 20.936 1.00 56 . 95 A ATOM 3 3 wO ASN 119 -7.652 -13.352 20.3^5 1.00 57.45 Λ ATOM. 34 OD1 ASN 119 -7.941 -14.303 21.084 1.00 58 . 50 A ATOM 35 ND2 ASN 119 • -7.005 -13.431 19.241 2.00 58.58 A ATOM 3 6 HD21 ASN 119 -6 .843 -12.617 18.646 1.00 15.00 A ATOM 37 KD22 ASN 119 -6.740 -14.221 18.684 2.00 15.00 A ATOM 3B s— ASN 119 -7.053 -9.724 21.571 1.00 53.62 A ATOM. 39 0 ASN 119 -6.746 -8.933 20.694 2.00 56.55 A ATOM. 40 N PRO 12C -7.737 -9.288 22.698 1.00 50.17 A ATOM 41 cc PRO 120 -8.151 -10.129 23.810 2.00 51.90 A ATOM 42 CA PRO 120 -8.402 -7.945 22.818 1.00 4 «8 . 19 ATOM 43 PRO 12C - 5.191 -8.008 24.117 2.00 47.42 A ATOM 4 4 PRO 12C -9.444 -9.493 24.322 1. co 51.93 ry ATOM. 45 £ PRO 22 2 -7.750 -6.524 22.657 1.00 45.59 Λ ATOM. 46 C PRO 12 0 -3.187 -5.516 23.225 1.00 45.37 A ATOM. 4 * N GLN 2 2 2 -6.789 -6.458 21.721 1.00 38.52 n ATOM 4 8 H GLN 2 2 2 -5.287 -7 . ->04 21.505 1.00 15.00 A ATOM 4 9 CA GLN 121 -5.733 -5.359 20.753 2.00 29.14 A ATOM 5 C C3 GLN * 4. «. -5.454 -5.735 19.971 2.00 26.30 A ATOM. x * GLN 2 2 2 - 5.128 -4.943 18.710 2.00 26 . 84 Λ ATOM. = 2 ___ * GLN •4.923 - 3 . 460 18.949 1.00 27.26 * ΖΛ ATOM = 2 * GLN 2 2 2 • * ·* «* -2.668 28.709 1.00 28.66 A ATOM 54 ΝΞ2 uLN • «^ · • 2 . - 3 . ICO 19.341 2.00 33 . 90 r\ ATOM. = = mN 2 2 2 2.883 -3.614 25.564 1.00 15.00 ATOM. 5 í ~ ··___i GLN 2 2 2 -3.442 -2.138 29.204 1.00 25.00 A ATOM. s - - wN 22 2 -8.065 -5 .218 19.903 2.00 26.33 A ATOM. 5-5 2 <jLN 2 2 2 - 5.905 -6.097 19.834 1 . 00 21.41 Λ ATOM. = ř n 2 LZ 22 2 -8.288 -4.051 15.272 1.00 21.21 Λ
    ·« ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · ·· · · · · · · · • · · · · 4 4 · · · · · · • · · · · · · • · · · · 4 4 · 44 44
    3/42
    Obr. 2B
    ATOM 6 Z H * 3 22 - ~.500 -3.220 19.337 • toto is.:; ATOM w to ZA 3 LZ 122 -=.383 -3.952 18.295 • «> <\ to V w z z. ? z ATOM c 73 . to Z. 322 -10.238 -2.629 18.396 ♦ Λ i* 22.1“ ATOM o 3 7<j2 to ItoZ 322 -11.275 -2.428 17.272 1.00 21.51 ATOM 64 CG1 ILZ 122 -11.076 -2.744 19.668 1.00 24 . 13 ATOM € 5 CDl ZLE 122 -11.751 -1.440 20.073 1.00 23.04 ATOM e 6 r* -LZ 122 -8.633 -4.108 16.895 1.00 18.96 ATOM 57 O ZLE 122 -8.135 -3.243 16.379 1.00 17.93 ATOM 6 s N ALA 123 -9.159 -5.240 16.283 1.00 14.72 ATOM 5 9 H ALA 123 -9.599 -5.978 16.805 1.00 15.00 ATOM 7 0 r* * *to ALA 123 -6.656 -5.401 14.917 1. oc 14 .29 i. TOM n · Ca ALA 123 -7.176 -5.868 14.903 1.00 12.83 ATOM 72 r* ALA 123 -9.483 -6.315 13.985 1.00 15.66 ATOM 73 0 ALA 123 -IC.170 -7.261 14.323 1.00 13.58 ATOM 74 N ALA 124 -9.388 -6.009 12.724 1.00 13.45 ATOM 5 K ALA 124 -8.894 -5.185 12.456 1.00 15.00 ATOM 7 0 7A ALA 124 -10.087 -6.920 11.836 1.00 14.55 ATOM 7 7 03 ALA 124 -11.486 -6.368 11.446 1.00 11.37 ATOM 76 c % · » /WA 124 -9.271» -7.123 10.563 1.00 13 . 54 -.TOM 79 o ALA 124 -8.501 -6.274 10.129 1.00 16.29 -.TOM 80 N HIS 125 -9.544 -8.248 9.937 1.00 11.49 VTOM. S 1 u HIS 125 -IC.100 -8.900 10.426 1.00 15.00 -.TOM 82 CA HIS 125 - 9.100 -8.524 8.590 1.00 11.51 .TOM £ 3 Ca HIS 125 -7.605 -8.908 B.614 1.00 11.43 %TOM 84 to to> HIS 125 -7.119 -9.116 7.205 1.00 7.41 %TOM £ Ξ NUL HIS 12 5 -6.750 -8.130 6.421 1.00 6.60 -.TOM 38 HZ 3 HIS 125 -6.708 -7.168 6.621 1.00 15.00 ,TOM £ * *··*.* HIS 32 5 -7.075 -10.291 6.456 1.00 12.36 -.TOM se NE2 HIS 125 -6.670 -9.971 5.234 1.00 6.20 e = to Xr 3 HIS 325 -6.462 -8.646 5.211 1.00 4.48 -.TOM ?: HIS 125 -10.024 -9.570 7.931 1.00 12.63 -.TOM 9 2 HIS 125 -10.324 -10.650 8.363 1.00 13 . 14 .TOM 5 3 N VAL 126 - 10.550 -9.129 6.806 1.00 15.65 -.72 m 9 3 VAL 126 -10.169 -8.286 6.426 1.00 15.00 -.7O.M. ? 4 7A VAL 126 -11.743 -9.717 6.201 1.00 14.38 -.TOM 9 5 VAL 126 - 12.877 -8.808 6.675 1.00 13 . 37 ATOM 99 toSU * VAL 126 -13.794 -9.722 7.379 1.00 12.60 ATOM Z T 732 VAL 126 -13.449 -7.663 5.814 1.00 9 . 61 ATOM 55 — VAL 126 -11.502 -9.971 4.685 1.00 16.03 7?.M. Q C 0 VAL 126 -10.684 -9.297 4 . 074 1.00 15.42 ATOM 3 3 3 N * xjX» 127 -12.118 -11.013 4 . 136 1.00 15.99 —«*\v ’ 7 ‘ u t · Γ 127 -12.807 -11.481 4.691 1.00 15.00 ATOM LCZ toA I toC • «* toZ * -11.651 -11.532 2 . Θ31 1. 00 14 . 86 ATOM. 3 3 3 7 c 127 -11.414 -13.051 3.002 1.00 1 56 ATOM - 3 4 * to 3 LZ • 7 - 11.715 -13.91C 1.7£5 1 . 00 • «· · «» ATOM 1 os «j » 3 LZ 127 - 9.972 -13.316 3.399 1.00 16.47 ATOM 3 0 6 2~· · * Lm 1 < -9.705 -12.992 4 . 864 1.00 19.64 ATOM * “ 7 — 3LZ ·«»·» -32.693 -11 . 26 9 1.765 1.00 18.96 ATOM 3 3 5 I LZ 1 ·' -13.898 -11.391 2.016 1.00 20 . Cl ATOM 3 3 5 SZR 128 -12.229 -10.882 0.581 1.00 1“ . 54 X.77M * Λ - SZR 128 -11.232 -10.871 C .3B2 1.00 15.0 C ATOM 000 SZR 12 8 -13.274 -10.667 -0.437 1 . co i: . :5 ATOM. 3 3 to *« SZR 12 5 -32.664 -10.130 -1.705 1.00 18.16 ATOM. _ _ j * 7 SZR 13 5 - 10.205 -11.207 -2.574 1 . 00 19.90 ATOM • · 4 7·, w· C to»·*· • i L· -10.832 -33.531 - 2 . C2S 1 . co 15 . 00 ATOM • ♦ o C to Γ*· 3 2 5 -14.255 -11.761 - Z 753 1 . cc .3.62 -.77y. 3 3 5 SZR 3 2 5 -14.052 -12.960 -0.832 1.00 ; . 98 -.77K • . « 3 2 5 -15.492 -11.245 -1.027 2.00 11.36 ATOM. • * = Sto— 32 5 -35.663 •10.2=7 -0.937 I . 00 • X n • to . w V X**“7*«* .Oř 3 A to to to 3 2? -35 .3*5 - 12.024 -1.840 1.00 . ~ . 2 Z
    >>>>>> 3» >>>>>>> j. >>> j. >,
    T>M 2C-R7 • ·· · · · · ·· ·· ♦ 4 4 ♦ 4444 4444 • 44 44 4 4444 • 4 444 4 4 4 444 444
    444444 4 4
    444 44 44 4444 44 44
    4/42
    Obr. 2C
    ATOM C3 GLu 029 - 07.052 -13 . 117 -1.021 I . 00 2 0 . = x r\ ATOM 021 CG oLL 029 -08.052 - 12.694 -0.036 1 . 00 17.92 ATOM 122 00 GLU 025 -18.750 -13.551 0.376 1.00 21.98 ATOM 123 ΟΞ1 GLU 22 9 -19.997 -13.932 0.368 1 . oc 32.23 A ATOM 124 ΟΞ2 GLU 025 -ie.150 -14.938 0.734 1.00 33.12 A ATOM 125 2 GLU 025 -17.371 -11.409 -2.809 1.00 17.71 * Λ ATOM 126 GLU 029 -17.972 -10.389 -2.553 1.00 21.59 * Λ ATOM 127 N ALA 030 -17.550 -12.145 -3.914 1.00 20.52 A ATOM 126 H ALA 130 -17.136 -13.057 -3.923 1.00 15.00 A ATOM 129 CA ALA 130 -18.379 -11.649 -5.019 1.00 23.36 A ATOM 130 03 ALA 130 -18.424 -12.633 -6.208 1.00 19.66 * Λ ATOM 21 2 ALA 130 -19.811 -11.298 -4.570 1.00 26.86 * rv ATOM 032 0 ALA 130 -20.519 -12.022 -3.869 1.00 29.40 A ATOM 033 N SER 131 -20.198 -10.086 -4.968 1.00 21.70 A ATOM .34 H SER 131 -19.515 - 9.481 -5.410 1.00 15.00 A ATOM 25 CA SER 131 -21.592 -9.782 -4.732 1.00 20.04 A ATOM 36 03 SER 131 -21.829 -8.266 -4.787 1.00 20.65 A ATOM 37 r» SER 131 -23.182 -8.001 -4.435 1.00 15.24 A ATOM 38 HG SER 131 -23.329 -7.069 -4.559 1.00 15.00 A ATOM 39 2 SER 131 -22.546 -10.501 -5.668 1.00 17.15 A ATOM 40 z-\ SER 131 -22.236 -10.853 -6.786 1.00 14.30 A ATOM 4 1 N SER 132 -23.756 -10.731 -5.187 1.00 20.15 A ATOM 42 SER 132 -23.967 -10.586 -4.209 1.00 15.00 A ATOM 4 3 CA SER 132 -24.674 -11.250 -6.218 1.00 21.62 A ATOM 44 cs SER 132 -25.266 -12.616 -5.893 1.00 16.00 A ATOM 4 o CG SER 13 2 -26.203 -12.324 -4.894 1.00 23.84 A ATOM 46 π SER 132 -26.016 - 12.944 -4.179 1 . 00 15.00 A ATOM 4 ' *· SER 132 -25.727 -10.268 -6.671 1.00 20.07 A ATOM 4 E SER 132 -26.535 - 10.544 -7.547 1.00 20.27 A ATOM 45 LYS 133 -25.606 -9.063 -6.118 1.00 21.87 A ATOM * h LYS 13 3 -24.904 -8.969 -5.397 1.00 15.00 A — Z*k LYS 133 -26.406 -7.916 -6.517 1.00 19.23 A AT C*** —z LYS 122 -27.024 -7.309 -5.256 1. oc 23.08 A ATOM. X · — -) LYS 133 -27.6B4 -8.364 -4.354 1.00 21.07 ATOM. X 4 **— LYS 133 -29.174 -6.110 -4.330 1.00 27.36 A ATOM. Ξ x X» LYS 133 -29.939 -7.884 -5.670 1.00 30.56 A ATOM. 3 č LYS 133 -31.323 -7.515 -5.345 1.00 21.56 A ATOM. x * K21 LYS 133 -31.862 -7.351 -6.218 1.00 15.00 A ATOM. se HZ 2 LYS 133 -31.753 -8.299 -4.811 1.00 15.00 A χ 3 ·_· *· X LYS 13 3 -31.333 -6.654 -4.760 1.00 15.00 A AToy 60 LYS 133 -25.579 -6.876 -7.194 1.00 20.10 A ATOM. ó 0 LYS 133 -24.378 -6.801 -7.007 1.00 17.94 A ATOM. Zl «. N — 134 -26.260 -6.052 -7.983 1.00 22.95 A ATOM. 3 3 K THR 134 -27.275 -6.130 -8.036 1.00 15.00 2 · - • j 4 •25.556 -4.679 -6.561 1.00 27.89 A ATOM. : = 03 THR 134 -26.498 -4.274 -9.592 1.00 24.59 Λ ATOM. c z THR 134 -26.540 - 5.037 -10.792 1.00 24.32 Λ ATOM. HG 3 THR 134 - 26.232 -4.411 -11.456 1.00 15.00 ATOM í e _ O *. THR 034 - 2 ó.04 4 -2.857 -9.968 1.00 22.97 Λ\ ATOM. τ r - -ux 1«? 4 -24.5£7 - 3.798 -7.559 1 . co 32.51 A •7 * THR 034 -25.65E -3.461 -6.603 1.00 38.43 - . »· ••j: • X X .XX ·** “· -3.352 -7.690 1 oc 3 5 96 ATOM -- z: THR. . 2x .2 52 • 2 · 5 Ξ 5 -E.585 1 . oc 15.00 Λ—IV -·JX • X X - 02 . 564 « Λ X * r ~ ATOM A 1 -z THR. O Μ » -6.534 2 . 0 C 36 . 01 Λ ATOM. 1 x “ — . —•„•z 0 2: • 2 2.64 x - 5 . 388 ·- .488 1.00 3 0.60 ΖΛ • - X '_· 7 ’ — LÍZ 1 · z •22.255 i. 094 -7.312 1.00 15.00 l“> ATOM MM*. HR 0 2 x - 2 0.£66 - 4 77c -5.264 1 . co J 3 , 3 X r. ATOM * X * X -22.545 -2.25c -5.404 1 . 00 2 C . 2 x A ATOM. i r * THR * X X •22.541 -2.346 - 4 . 2 2 2 • X «* 25 .35 n
    • ·· ·· ·« ·· ·· • · · · · · · ti · ·· · • titi · ti · · · · · • ti tititi ti ti · ti····· ······ · · ··· ·· ·· ···· ·· ··
    5/42
    Obr. 2D
    ATOM o r. N SER 136 -22.294 -1.146 - 5.77č • Λ Λ 2 3.35 ATOM a S * n SER 13 6 -02.826 -0.357 -5.460 1 . oc 15.00 ATOM 15 2 SER 136 -20.8=7 - 1.051 -6.143 1 . oc 53.04 ATOM 155 C3 SEP. 136 -20.560 0 . 187 -6 . 96 5 2*00 51.03 ATOM 134 OG SER 136 -20.624 1.261 -6.043 1.00 28.51 ATOM 15 5 HG SER 136 -19.815 1.793 -6.008 1.00 15.00 ATOM 186 C SER 136 -15.853 -1.090 -4.95B 1.00 51.77 ATOM 187 O SER 13 5 -16.630 - 1.096 -5.080 1.00 21.94 ATOM iee N VAL 137 -20.452 -1.227 -3.752 1.00 24.03 ATOM 189 K VAL 137 -21.440 -1.063 -3.705 1.00 15.00 ATOM 1 9 C CA VAL 137 -15.699 -1.632 -2.570 1.00 19.65 ATOM 191 CS VAL 137 -20.218 -1.010 -1.248 1.00 21.14 ATOM 152 CGl VAL 137 -20.419 -1.907 -0.058 1.00 18.16 ATOM 193 CG2 VAL 137 -21.322 -0.026 -1.442 1.00 13.49 ATOM 194 r» 4te VAL 137 -19.370 -3.116 -2.473 1.00 17.15 ATOM 195 O VAL 137 -20.209 -3.969 -2.593 1.00 16.69 ATOM 196 N LEU 138 -18.077 -3.344 -2.271 1.00 15.84 ATOM 197 H LEU 138 -17.502 -2.528 -2.246 1.00 15.00 ATOM 198 CA LEU 138 -17.507 -4.667 -1.938 1.00 18.21 ATOM 199 C3 LEU 138 - 15.962 -4.530 -1.791 1.00 13.60 ATOM 200 CG LEU 138 - 15.273 -3.854 -2.998 1.00 16.09 ATOM 201 2.EU 138 -15.923 -4.379 -4.300 1.00 20.35 ATOM 502 CD2 LEU 138 -13.710 -3.936 -2.982 1.00 12.34 ATOM 203 r· LEU 138 -18.170 -5.480 -0.772 1.00 16.29 ATOM 2 04 O 13 8 -18.498 -4.986 0.301 1.00 12.97 ATOM 2 05 N GLN 135 -18.345 -6.768 -1.035 1.00 13.04 ATOM 2 05 K GLN 139 - 18.052 -7.078 -1.960 1.00 15.00 ATOM *í Γ GLN 2 3 9 - 18.757 -7.658 0.013 1.00 15.32 ATOM η Λ C 03 GLN 135 -19.847 -8.678 -0.481 1.00 13.99 ATOM 2 0 5 te. o GLN 135 -21.068 -7.960 -1.113 1.00 20.85 ATOM — — v /tete^ GLN 135 -21.872 -7.022 -0.193 1.00 52.04 ATOM GLtN 13 5 -52.343 -7.439 C . 878 1.00 25.45 ATOM _ 1 „ ΝΞ2 GLN 2 3 9 -21.963 -5.739 -0.616 1 . 00 17.74 ATOM KE 21 GLN 2 3 9 -22.697 -5.181 -0.506 1.00 15.00 — - 1 Γ*. X.te Gx^N 135 -21.460 - 5.326 -1.374 1.00 15.00 ATOM te 1 ΐ *“ GLN 135 - 17.527 -8.383 0.541 1.00 14.26 ATOM 216 2 viL*N 135 -16.554 -8.640 -C . 144 1.00 14.40 ATOM - · - K· 4« TRP 140 - 17.647 -8.780 1.805 1 . oc 15 .BO ATOM 215 K TRP 140 -18.433 -8.447 5.297 1.00 15.00 ATOM te · ? /· ». teAt TRP 140 -16.542 - 9.500 2.463 1 . co 14.03 ATOM 2 2 2 TRP * 4 v - 15.813 -8.623 3.483 1.00 14.16 ATOM te u TRP 140 - 15.467 -7.251 5.823 1.00 8.44 ATOM te * CC 2 TRP 14 0 - 14 .379 - 6.966 1.941 1.00 9.01 ATOM *. μ te Σ. μ TRP 140 -14.549 -5.62= 1.4B2 1 . 00 6.40 - χ — — Ί 140 . · “ Λ ft -“.688 1.581 1 . 00 10.14 ATOM 2 2- 001 TRr 14 0 -16.525 -£.13 5.863 1 . oc 11.59 ATOM. 2 2 5 ΝΞ1 TRP 140 -15.710 -5.15C 5.077 1.00 14.27 ATOM. MX. * TRP 14 0 • 3 £ . 121 -4 ,26e 5.010 1.00 15.00 ATOM μ * c te μ te TR? 2 4 0 - 13 . 64C -5.009 0.590 1.00 6.16 ATOM. 5 3? CZ 3 TR? -15.252 -7.065 0.713 1.00 13.90 ATOM. te J * CK2 TRr 2 4 2 -15.457 -5.745 0.215 1. oc 23.33 ATOM. te te te TRP • · r Á ·» v - 2 7 . 0 3 £ - 10.701 2 .170 1.00 14 . 34 ATOM. te J te - ·* * *n . -26.193 - 10.865 3.392 * . 0 c 16 . 00 Λ72!** te e · r\te-r. - 4 2 -26 .15 2 •11.3 2 6 3 . 558 1.00 14.80 ATOM te zn <teZ“. - 1 - 1 i.- . · · - — “ 2 . 294 1 . co 15.05 ATOM 0 2 : . Z“. tel. -16.489 4 . 394 1.00 1=.2-1 ATOM o :· ť 3= ALA . 4 te - 1 £ . 5 0 4 . · “5 3 ·> r 3.563 1.00 16.97 I-- - - - - - 1 te -26 .555 -15.761 5.607 1.00 15.90 ATOM • í - - 4 2 - 14 .453 -15.338 5.550 1.00 14.25 ATOM te J ? te* te te - 4 » • 2 £ . 0 £ 6 - 2 3 . 3 £ £ 6.688 1.00 3 3 . 4
    >>♦ 3· >·)« 3* 3· >·> 5’ >* 5’ > 5· J' >>>>>>>>>>>>>>>>>>> > > j, > j, > > > j,
    Λ\ • ♦· ·· · · ·· ·· ·· · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · · ······ ······ · · ··· ·· · · ··»· ·· ··
    6/42
    Obr. 2E
    ATOM 040 H 242 -17.0=5 - 13 . 5*74 6.656 — «. 1 5 . 2 C ZA ATOM 2 4 1 CA •J Xri w 24 2 -15.149 -13.759 7.721 1. oc 2 Ξ . 3 3 ATOM 242 os GLU 142 -15.794 -13.910 C “ * 7 1. oc 21.75 za ATOM 243 CG □ LU 142 -15.716 -12.455 5.647 1 . 00 24 . 2 5 ZA ATOM 244 00 GLU 142 -16.749 -12.087 10.711 1.00 2 6.62 A ATOM 245 OE1 GLU 142 - 17.906 -11.886 10.361 1.00 34.72 * za ATOM 246 OE2 GLU 142 -16.404 -11.964 11.866 1 . 00 30.07 A ATOM 247 c GLU 142 -14.200 -14.797 7.193 1.00 33 .25 za ATOM 24S 0 GLU 142 -13.156 -14.349 6.737 1.00 4 1.84 A ATOM 249 N LYS 143 -14.577 -16.080 7.064 1.00 34 . 17 ZA ATOM 250 K LYS 143 -15.432 -16.384 7.492 1.00 15.00 A ATOM 251 CA LYS 14 3 -13.682 -16.654 5.980 1.00 35.31 A ATOM 252 CS LYS 143 -14.673 -16.603 4.661 1.00 37.64 A ATOM 253 CG LYS 143 -14.300 -17.505 3.531 1.00 47.37 A ATOM 254 CO LYS 143 -15.022 -17.264 2.202 1.00 50.37 A ATOM 255 CE LYS 143 -14.666 -16.047 1.357 1.00 49.23 A ATOM 256 NZ LYS 143 -15.632 -16.097 0.221 1.00 51.67 * za ATOM 257 H21 LYS 143 -15.333 -15.445 -0.534 1.00 15.00 A ATOM 256 HZ2 LYS 143 -15.660 -17.061 -0.177 1.00 15.00 A ATOM 259 KZ3 LYS 143 -16.564- -15.833 0.565 1.00 15.00 A ATOM 260 c LYS 143 -12.330 -16.979 5.637 1.00 32.80 A ATOM 2 61 c LYS 143 -11.831 -16.041 5.276 1.00 35.64 A ATOM 262 N GLY 144 -11.522 -15.923 5.637 1.00 26.26 A ATOM 2 6 3 H GLY 144 -11.718 -14.995 5.910 1.00 15.00 A ATOM 2 6 4 <» * —ZA GLY 144 -10.243 -16.458 5.194 1.00 32.94 A ATOM 2 6 5 — GLY 144 -9.176 -16.862 6.160 1.00 29.93 A ATOM 2 5 6 —\ GLY 144 -9.345 -17.454 7.205 1.00 24.67 A ATOM * í ·? N TYR 145 -6.069 - 16.270 5.615 1.00 25.37 A ATOM 0 66 H TYR 145 -6 .160 -15.729 4 . 966 1.00 15.00 A ATOM 269 CA TYR 145 -7.027 -16.002 6.777 1.00 27.61 A ATOM - H r CB TYR 145 -5.708 -15.577 5 . 947 1.00 37.54 ZA ATOM - — - — ,j TYR 145 -5.962 -15.774 4.456 1.00 50.95 A ATOM - — - TYR 145 -5.662 -14.633 3.706 1.00 53.22 A -.70.^ '“T · TYR 145 -6.313 -14.377 2.468 1.00 60.26 * ZA ATOM _ · ·» **··* - TYR 145 -6.591 -16.647 3.791 2.00 53.12 A ATOM. - n S, CB 2 TYR 145 -7.207 -16.695 2 . Ξ 51 1 . 00 56.30 za ATOM 076 CC TYR 145 -7.162 -15.430 1 . 873 1.00 61.12 A ATOM. - — — OH TYR 145 -7.B12 -15.119 0.665 1.00 62.63 A ATOM. 2 7 S HH TYR 145 -6.575 -15.666 0.401 1.00 15.00 A ATOM --,0 r* TYR 145 -7.532 -14.762 7.620 1.00 22.41 /Λ ATOM. 050 c TYR 14 5 -7.000 -13.677 7.650 1.00 22.68 ZA ATOM 2 S1 N TYR 146 -6.731 - 14 .864 6.196 1.00 20.39 A ATOM 2 52 H TYR 14 6 -6.935 -15.824 6.509 1.00 15.00 A ATOM. 2 5 2 —za TYR 146 -9 .423 -13.700 6.725 1.00 20.40 A ATOM. 254 CB TYR 146 -10 . 566 -13.673 S . 306 1.00 2 c 3 ZA ATOM “OO — o TYR 1 *t 6 -11.71 c 14 .462 5.266 1.00 23 . C2 A ATOM. 2 5 6 CCl TYR 14 6 -11.635 -15.673 9.236 2 . 00 25.99 ZA ATOM 2 5 7 >— 2.1 TYR 14 6 - 12.2 54 -16.623 10.239 1.00 25.44 A 2.—'W “ Z £ *·* * TVO -12.477 - 13.766 10.2 3 6 1.00 2 3.45 - TOM. a ς CEO -vc 14 6 -13.150 -14 .520 11.205 1 . 00 2 5.61 ZA ATOM 0 5 0 TV7. 14 6 -13.007 -15.937 11.204 1.00 27.40 ZA ATOM. ·. 7 * OH ~ 72 14 6 -13.647 - 16.669 12.170 1 . 00 31.91 A “ z · ~7C . · - c · · -17.060 12.676 1.00 15.00 1 — “ 2 - -vs , c · c· -13.415 10.219 1 . 00 • c *7 ς ATOM - 7 4 TYR . 4 ? -6.504 14 . tí * - 11.012 2 . 00 16.13 ZA • 2 2 —-•Z • 5.5 ?6 - * ? ‘ 4 - 1C.556 1.00 1 . 54 ATOM Z-Z-5 •r; —-•z -9.573 -11.60 9 . 63C 1.00 15.00 ZA ATOM o Z“. —-’Z • -3.432 -11.764 11.946 2.00 14.06 za ATOM Z 7 2 ·- — “Hr. «. i - = . 152 -10.675 12.162 1.00 13.66 ZA A73.v • 7 7 w W* · “72 . 1 • τ . - 12 -11.505 11.555 1.00 12.3* ZA
    7/42 ic • ·* 444« 44 44
    44 4444 4444
    44 44 · «444
    4 444 4 4 · 444 444
    444444 4 4
    444 44 44 «444 44 44
    Obr. 2F
    ATOM J A KG1 TKR 147 -5.934 -11.898 10.980 1 2 C 1 5 . 2 Z r\ ATOM 301 CGx TKR 147 -S .025 -10.236 13.554 1.00 .22 ΛΛ ATOM 302 TKR 147 -10.519 -10.925 12.253 • 15 . 6 C ry ATOM 303 0 TKR Á *1 · -11.044 -10.074 11.496 « aj W 1 c . 3 ? ry ATOM 304 N MET 146 -11.144 -11.139 13.412 1 . 00 2 0.57 Λ ATOM 305 K MET 146 - 10.836 -11.988 13 . 828 1 . co 15.00 Λ ATOM 306 CA MET 148 -12.124 -10.311 14.110 1.00 19.71 A ATOM 307 C3 MET 146 -13.546 -10.702 13.705 1.00 17.89 Λ ATOM 306 CG MET 146 -14.541 -9.580 14.019 1.00 13.53 A ATOM 309 so MET 148 -14.492 -8.149 12.952 1.00 14.69 % ATOM 310 CE MET 148 -14.566 -8 .928 11.333 1.00 10.10 ATOM 311 £ MET 148 -11.915 -10.282 15.639 1.00 21.49 A ATOM 312 O MET 146 -12.594 -10.905 16.436 1.00 22.98 * ry ATOM 313 N SER 149 -10.955 -9.412 16.055 1.00 20.58 Ά ATOM 314 H SER 149 -10.516 -8.786 15.406 1.00 15.00 A ATOM 315 CA SER 149 -10.388 -9.698 17.419 1.00 19.11 n ATOM 316 C3 SER 149 -9.174 -8.860 17.792 1.00 12.17 A ATOM 317 OG SER 149 -9.540 -7.513 17.975 1.00 14.10 f\ ATOM 316 HG SER 149 -9.571 -7.487 18.934 1.00 15.00 Λ ATOM 319 C SER 149 -11.203 -9.844 18.727 1.00 22.19 A ATOM 32C c SER 149 -10.728 -10.267 19.772 1.00 22.95 A ATOM 321 N ASN 150 -12.456 -9.322 18.631 1.00 22.71 A ATOM 322 H ASN 150 -12.782 -9.247 17.688 1.00 15.00 * fy ATOM 3 23 CA ASN 150 -13.361 -9.236 19.764 1.00 20.32 * M ATOM 324 C3 ASN 150 -12.734 -8.446 20.955 1.00 21.56 A ATOM 3 2 5 ASN 150 -12.343 -6.962 20.706 1.00 20.71 A ATOM 326 OO1 ASN 150 -13.059 -6.187 20.119 1.00 17.61 A ATOM 3 2 7 ND2 ASN 150 -11.222 -6.485 21.271 1.00 23.86 A ATOM 325 HO21 ASN 150 -11.035 -5.521 21.092 1.00 15.00 A ATOM 325 KD22 ASN 150 -10.670 -7.109 21.821 1.00 15.00 A ATOM 3 30 2 ASN 150 -14 .644 -8.657 19.256 1.00 20.60 A ATOM J J . 0 ASN 150 -14.718 -8.130 16.148 1.00 20.56 ATOM X £ Λ. N ASN 151 - 15.637 -6.713 20.149 1.00 23.49 ΛΛ ATOM £ £ * H ASN 151 -15.455 -9.124 21.038 1.00 15.00 Λ I —-w — > ASN 151 - 16.974 -6.08C 19,823 1.00 24.71 ΛΛ ATOM ASN Ί £ Ί -18.130 -8.645 20.712 1 . oc 2 6.30 Λ ATOM 2 3c CG ASN 151 -17.959 -6.271 22.173 1.00 32.23 A ATOM 3 3 GDI ASN 151 -17.075 -7.562 22.606 1.00 39.79 A ATOM 336 NO 2 ASN 151 -18.782 -8.838 23.011 1.00 38.32 A ATOM *Í T Q ED21 ASN 151 -18.553 -8.524 23.928 1.00 15.00 A ATOM 34 0 KD2 2 ASN 151 -19.495 -9.465 22.733 1.00 15.00 ry ATOM 341 2 ASN 151 - 17.172 -6.531 19.645 1.00 22.53 A ATOM 342 C ASN * * 7 -18.254 -6.046 19.374 1.00 21.32 A ATOM 34 3 N LEU 152 -16.066 - 5.762 19 . 859 1.00 23.00 ry ATOM 344 H LEU 15 2 -15.247 -6.269 20.C7C 1 . oc 15.00 x.Tcy 3 4 5 CA LEU • c -15.924 -4.33: 15.525 1 . 00 18.87 A ATOM 3 4c CE LEU ’ c 2 -14.830 - 3 . 70C 20.325 1.00 21.77 ry ATOM ~ ·» · CG v. >· u 1 x«. -14.981 - 3.999 21.806 i . 00 24 . 80 A f“l i · · 34 6 · • 15 2 -16.390 -3.645 22.316 1.00 22.82 A X.Ty * 4 ? S. M ·- • ?T« 1 x -13.847 • 3 .25c 22.556 1.00 23.56 n ATOM 3 5 C LEU 152 -15 .565 -3.993 16.094 1.00 17.34 ry ATOM MM W 15 2 - 1 5.5 9 C -2.840 17.708 1.00 12.39 ry ATOM 2 - » VAL 1 x · -15.267 -5.054 1 . 3 0 9 1.00 18.65 fy ATOM ‘ H VAL Z ' • . Ξ . . 2 5 -5.962 17.716 1 . 00 15.00 r. -.ccy ~ X • <\m . z z •15.439 -4.910 15.649 1.00 16.61 fy ATOM 3 5: 0Ξ VAL - J • 14 . L j c . £ λ -j · 14.980 1.00 15.23 ry x.Ty L5-č » Λμ 153 -12.908 • 5 ?1£ 15.562 1 . 00 21.22 ry - Z - - £ \ . · “ — *7 z, . \ ~ ~ 14.287 1.00 16.95 ry x Ty “. £ £ VAm 153 -16.405 -5.964 15.301 1 . oc 13.48 ry ATOM 3 Ξ r /Am Z • 1 6 . 3 c 3 • T , 115 15.647 1.00 13.05 r·.
    Φ· »* * « · » ·«« «·· * φ
    8/42
    Obr. 2G
    ATOM N —z,· z 254 -27.207 -5.546 14.358 2.00 20.06 Λ ATOM 2 c — THR 154 -27.313 -4.568 14.215 1.00 2 5 . C C rv ATOM 3 62 TA THR 254 -27.903 -6.600 13.615 1.00 2£ .25 Λ ATOM 3 5 3 THR 254 -15.366 -5.747 14.157 1 . oc 15.51 r\ ATOM 364 wo THR 254 -29.955 -5.459 14.205 1.00 29.31 A ATOM 365 HGl THR 154 -20.577 -5.508 14.949 1.00 15.CC A ATOM 3 5 5 CG2 THR 254 -15.502 -7.288 15.571 1.00 21.62 A ATOM 367 THR 254 -17.997 -6.252 12.107 1.00 18.10 Λ ATOM 366 0 THR 154 -17.992 -5.110 11.605 1.00 16.55 A ATOM 3 5 9 N LEU 155 -13.101 -7.324 11.357 1.00 16.77 A ATOM 370 u LEU 155 -13.056 -8.202 11.791 1.00 15.00 A ATOM 370 CA LEU 155 -18.514 -7.198 9.967 1.00 17.10 A ATOM 372 CS LEU 155 -17.629 -6.353 9.204 1.00 20.04 A ATOM 373 CG LEU 155 -17.524 -8.42B 7.692 1.00 20.82 A ATOM 374 * WW « LEU 155 -17.622 -7.159 6.908 1.00 17.03 A ATOM 375 CD2 LEU 155 -17.912 -9 . BIO 7.139 1.00 12.42 A ATOM 376 £ LEU 155 -20.055 -7.187 9.904 1.00 20.71 A ATOM z *7 7 z* W LEU 155 -20.712 -B.163 10.217 1.00 18.01 * Λ ATOM 37e N 156 -20.593 -5.995 9.561 1.00 19.51 A ATOM 379 H GLU 156 - 19.959- -5.230 9.440 1.00 15.00 A ATOM 3BC CA GLU 156 -22.036 -5.888 9.413 1.00 21.95 A ATOM 381 CS GLU 156 -22.641 -4.631 10.033 1.00 18.95 A ATOM 332 CG GLU 156 -22.098 -4.412 11.436 1.00 27.68 A ATOM. 263 GLU 156 -22.721 -5.194 12.587 1.00 31.62 A ATOM 3S4 CEL GLU 156 -23.347 -6.248 12.367 1.00 33.40 A ATOM. 3 £ 5 ΟΞ2 GLU 156 -22.532 -4.721 13.724 1.00 35.00 A ATOM 3 = 6 — GLU 156 -22.457 -5.966 7.964 1.00 25.36 A ATOM 23- c GLU 156 - 21.958 -5.298 7.077 1.00 22.70 A ATOM 3 £ £ »· ASN 157 -23.437 -6.808 7.696 1.00 30.92 Λ ATOM 339 H ASN 157 -23.594 -7.590 8.300 1.00 15.00 A ATOM 2 9 3 —A ASN * ~ ' - 23.804 - 6.6 2 C 6.300 1.00 33.31 A ATOM. 3 51 ''Z ASN 157 -23.856 -7.970 5.614 1.00 31.69 A ATOM. 3 ? — ASN 257 - 23.669 -7.693 4 .168 1.00 27.70 A i — “ c, “ f—' · ASN •. ς ·? -23.397 -6.593 3.810 1.00 25.89 A ATOM 3 9 4 NC~ ASN 15* - 23.693 -8.640 3.275 1.00 41.69 A ATOM. 2 95 HCL 1 ASN 257 -24.069 -9.603 3.467 1.00 15.00 A ATOM. 2 56 KCZ 2 ASN 257 -.23 . 745 -8.295 2.340 1.00 15.00 Λ ATOM c - — ASN 257 -24 .988 -5.658 6.118 1.00 35.08 A ATOM 3 55 3 ASN 257 -26.107 -5.949 6.499 1.00 37.06 A ATOM z o q N GLY 256 -24 .746 -4.443 5.560 1.00 40.03 A ATOM 4 W w GLY 253 -25.601 - 2 .952 5.429 1 . 00 15.00 A ATOM t w — «. A GLY 15 6 -23.422 - 3.88 5.121 1.00 38.21 A ATOM 4 ** GLY 253 - 23.062 -2.720 3.617 1.00 37.46 A ATOM 4 C 3 * GLY 258 - 23 . e9C -3.108 2.950 1.00 41.11 Λ ATOM 4 0 4 *» LYS 23 9 •21.86 -4.220 3 . 135 1.00 32 . Λ\ A.TTM 4 Σ Ξ LYS 259 -22.904 -4.134 0.130 1 . 00 15.00 fy ATOM. 4 u c _ A * YS 259 -21.628 -4.528 2 . 962 1.00 27.83 fy ATOM • r —> 1 «- os ♦ vc - ς c -20.217 -6.222 3.217 1 . 00 2 8.27 A ATOM. i >. ? • vz 23 9 - 19 . 34 -.168 4.069 1.00 20.48 A ATOM. 1 w Ϊ* -- LYS 2 3 9 • 2 C . 5 3 3 -5.426 4.192 1.00 2 9.62 fy ATOM. H * «. —z· LYS 23 5 - 2 C . 5 -5.191 0.869 1 . 00 4 0.41 A ATOM 4 · » LYS 259 -01.95 -12.663 0.9B6 1 .00 40.88 A ATOM. • v z 25 9 - 2 2.2 5 - 11.087 0.035 1.00 15.00 fy ATOM v - - • v z • z L . * - ~ «Ί Γ -11.087 2.600 1 . 00 15.00 fy » — 1 ·.* z • Z L . · “ Z = - 10 .34 8 2.385 1.00 15.00 •—,v • 1 s - ’ z • z z •19.6=8 -4.065 4.463 1 . oc 25.05 ry ATOM n ± Z •_Y = 13 9 * * Z 2 a. J •2.369 3.696 1 . oc 2 5.01 fy ATOM 4 1 *7 1 » o ·»* * : i: • l· ? . £ £ 3 • 3 . 9 9 C 5.807 «. . W V 28.90 fy ATOM. 4 x z GLN ž 1 •^.2.222 - 4 .6 74 6.319 1. oc 25 . 00 fy ATOM 4 1 9 C A 2 —L 2 3 2 • 2 £. 52 2 •2.929 5 464 2.0C 13.59 fy
    • 4 4 4 · ·· 4 4 ·· • · · · 4 44 4 4 44 4 • · · 4 4 · 4444
    444 4 · 4 444444
    444444 4 4 « . 44444 444444 44 44
    9/42
    Obr. 2H
    ATOM 420 03 GLN 160 -19.778 -1.694 5.511 1.00 16.79 A ATOM 4 2 2 CG GLN 160 -20 . B81 -1.896 . 6 3 3 1.00 18.34 A ATOM 422 00 GLN 160 -22.133 -1.166 7.193 1.00 2 3.57 rs ATOM 423 OE1 GLN 160 -23.088 - 0.970 7.893 1 . oc 31.18 ATOM 424 NE2 GLN 160 -22.257 -0.771 5.948 1.00 2B . 16 Λ ATOM 425 HE21 GLN 160 -23.194 -0.420 5.928 1 . 00 15.00 A ATOM 426 ΗΞ22 GLN 160 -21.624 -0.780 5.186 1.00 15.00 A ATOM 427 Z GLN 160 -18.313 -3.309 7.777 1.00 12.87 A ATOM 428 0 GLN 160 -18.838 -4.151 8.498 1.00 14 . 78 A ATOM 429 N LEU 161 -17.187 -2.637 8.085 1.00 11.22 A ATOM 430 H LEU 161 -16.767 -2.124 7.340 1.00 15.00 A ATOM 431 CA LEU 161 -16.583 -2.870 9.405 1.00 9.71 A ATOM 432 03 LEU 161 -15.052 -2.939 9.390 1.00 4.67 A ATOM 433 CG LEU 161 -14 .43B -4.060 8.559 1.00 7.30 A ATOM 434 001 LEU 161 -14.511 -5.447 9.207 1.00 10.80 A ATOM 435 CD2 LEU 161 -12.964 -3.794 Θ .389 1.00 5.48 A ATOM 436 c LEU 161 -17.082 -1.836 10.412 1.00 10.17 A ATOM 437 0 LEU 161 -16.826 -0.657 10.341 1.00 13.36 A ATOM 438 N THR 162 -17.848 -2.338 11.375 1.00 16.94 A ATOM 439 H THR 162 -18.153 -3.279 11.251 1.00 15.00 A ATOM 440 CA THR 162 -18.317 -1.480 12.493 1.00 16.14 A ATOM 441 OB THR 162 -19.807 -1.769 12.640 1.00 13.33 A ATOM 442 0G1 THR 162 -20.339 -1.707 11.308 1.00 16.73 A ATOM 443 HG1 THR 162 -21.211 -1.254 11.343 1.00 15.00 A ATOM 444 002 THR 162 -20.553 -0.832 13.562 1.00 15.01 A ATOM 445 2 THR 162 -17.531 -1.547 13.842 1.00 13.28 A ATOM 4 4 6 THR 162 -17.358 -2.587 14.449 1.00 20.21 A ATOM 447 K· VAL 163 -16 . 994 -0.437 14.282 1.00 14.22 A ATOM 44 5 U VAL 163 -16.859 0.243 13.567 1.00 15.00 A ATOM 4 4 9 CA VAL 163 -16.326 -0.358 15.586 1.00 15.72 A ATOM 4 5 v 03 VAL 163 -15 .038 0.426 15.42B 1.00 11.82 A ATOM 4 51 w a „ VAL 163 -15.191 1.944 15.368 1.00 9.87 A ATOM 4 2, z CGx VAL 163 -14.229 -0.124 14.245 1.00 18.88 A ATOM 4 x _* VAL 163 -17.193 0.263 16.706 1.00 17.93 A ATOM. 4-4 2- VAL 26 3 - 18.001 1.180 16.453 1.00 20.25 A ATOM 4 5 5 LYS 164 -17.037 -0.232 17.925 1.00 15.44 A ATOM. 4 5c H LYS 164 -16.254 -0.858 18.020 1.00 15.00 A ATOM 457 LYS 164 - 17.856 0.138 19.109 1.00 17.33 A ATOM 45 = 03 LYS 164 -18.351 -1.150 19.807 1.00 19.58 A ATOM. 455 ta«“« ta kj LYS 164 -19.214 - 1.885 18.759 1.00 23.56 * Λ ATOM. 4 © 0 22 LYS 164 -19.417 -3.410 18.851 1.00 28.85 » Λ ATOM. 4 61 LYS 164 -20.039 -4.047 17.554 1.00 33.81 A ATOM. 4 62 KZ LYS 164 -19.428 -3.6B1 16.227 1.00 18.98 A ATOM 453 HZ 1 LYS 164 -19.195 -2.667 16.222 1.00 15.00 A ATOM. 4 ó 4 r.x.^ LYS 164 •15.552 -4.223 16.092 1.00 15.0 C A ATOM. 4 6 5 HZ 3 LYS 164 -20.064 -3 . 886 15.445 1 . oc 15 . OC A ATOM 4 6 ó — LYS 164 -17.193 1.099 20.056 1.00 15.14 A ATOM 4 c’ —\ LYS 164 -17.712 1.588 21.048 1.00 17.72 * Λ ATOM. 4 c 5 N ARG 165 -15.992 1.428 19 . 621 1.00 17.49 /Λ ATOM 4 c 5 H ARG 16 5 -15.550 0 . Θ3Ε 18 . 932 1.00 15.00 A ATOM 4 ' w w A ARG 15 5 - 15.184 2.415 2C.325 1.00 20.18 A ATOM Ί ' - s ARG 155 -13.985 1.806 21.049 1.00 24.65 A ATOV n ARG 16 5 - 14 . 3 5 2 0.833 22.225 2 . C 0 29.54 A ATOM 4 ZZ Aj\ta· 15 5 -13 .274 1 . C77 23.145 1.00 38.82 A ATOM. ·» » ♦ · T rk/Vta· 153 - 15 ~ 1 9 1.998 24 .186 1 . oc 4 3.41 λ ATOM. 1 ' - :-:e Z-ta% ta • í s -14.331 1.671 24 . 908 1.00 15.00 A ' — •t ' Ϊ ta ta> AR ta 155 -13.190 2 .250 24 .362 1.00 44.06 ATOM *» NH1 ARG 153 - 1 3 .4 06 2.755 25,552 1.00 41.25 fy ATOM. 4 c HH11 Ajwj 16 3 -13.054 4.683 25.763 1 . co 15.00 * fy ATOM n T H.—· 2 Ar. ta 153 -13.919 2.249 26.250 ' 1. oc 2 Ξ . 0 0 fy
    • ·· ·· ·· ·· · · · · · <
    • · · · · ······ · • · · · · · • ·· · · ·· · · · <
    10/42
    Obr. 21
    ATOM 480 NH2 ARG 165 -12.485 3 . 946 23.425 1 . 00 31.65 ATOM 481 HK21 ARG 165 -12.133 4.860 23.623 1.00 15.00 Λ ATOM 482 HK22 ARG 165 -12.322 3.527 22.530 1.00 15.00 fy ATOM 463 /- ARG 165 -14.606 3 . 554 19.510 1.00 17.70 fy ATOM 484 0 ARG 165 -14.018 3.450 18.441 1.00 18.26 A ATOM 485 N GLN 166 -14 .763 4.687 20.151 1.00 17.43 A ATOM 486 H GLN 166 -15.263 4.614 21.007 1.00 15.00 A ATOM 4B7 CA GLN 166 -14 .136 5.911 19.698 1.00 19.00 A ATOM 468 CS GLN 166 -14.613 7.021 20.610 1.00 23.79 A ATOM 489 CG GLN 166 -14.067 8.409 20.386 1.00 34 . 06 A ATOM 490 CD GLN 166 -15.178 9.399 20.659 1.00 45.91 A ATOM 491 OE1 GLN 166 -15.102 10.492 20.135 1.00 53.64 A ATOM 492 NE2 GLN 166 -16.202 9.046 21.418 1.00 44.10 A ATOM 493 HE21 GLN 166 -16.906 9.765 21.443 1.00 15.00 A ATOM 4 94 ΗΞ22 GLN 166 -16.577 8.287 21.935 1.00 15.00 A ATOM 495 C GLN 166 -12.649 5.881 19.644 1.00 17.48 A ATOM 496 O GLN 166 -12.029 5.378 20.561 1.00 18.13 A ATOM 497 N GLY 167 -12.160 6.478 16.565 1.00 14 .83 A ATOM 498 K GLY 167 -12.750 6.836 17.850 1.00 15.00 A ATOM 4 99 CA GLY 167 -10.728 6.711 18.557 1.00 16.28 A ATOM 500 C GLY 167 -10.044 6.685 17.204 1.00 16.48 A ATOM 501 O GLY 167 -10.674 6.601 16.162 1.00 19.19 A ATOM 502 N LEU 168 -B .720 6.735 17.209 1.00 17.06 A ATOM 503 K LEU 168 -8.311 6.890 18.120 1.00 15.00 A ATOM 504 CA LEU 168 -7.925 6.625 15.992 1.00 16.60 A ATOM 5 05 CS LEU 166 -6.600 7.343 16.289 1.00 21.87 A ATOM 506 CG LEU 168 -6.247 8.745 15.716 1.00 22.69 A ATOM 507 CD i LEU 166 -5.119 9.410 16.539 1.00 21.20 A ATOM 508 CG 2 LEU 168 -7.436 9.617 15.361 1.00 18.38 A ATOM 509 C LEU 166 -7.686 5.136 15.604 1.00 14 . 84 A ATOM 51C O LEU 166 -7.282 4.278 16.392 1 . oc 15.89 A ATOM — ’ Λ N TYR 169 -7.943 4.873 14.300 1.00 10.57 A ATOM. X a. ·. u TYR 169 -8.313 5.659 13.807 1.00 15.00 A ATOM. C · CA TYR 169 -7.683 3.572 13.656 1.00 5.27 A ATOM. Ϊ * *í CS TYR 169 -8.989 3.014 13.230 1 . 00 5.83 A ATOM. c · c. TYR 169 -9.857 2.620 14.423 1.00 6 . 94 A ATOM. 516 r· ~>y TYR 169 -10.524 3.598 15.168 1.00 7.40 A ATOM 517 C£1 TYR 169 -11.390 3.193 16.218 1 . oc 7.77 A ATOM. sie <»«< ·* TYR 169 -10.016 1.255 14.744 1.00 8.89 Λ ATOM. 519 CE2 TYR 16 9 -10.850 0.841 15.804 1.00 9.40 A ATOM. 52 0 CZ TYR 169 -11.563 1.827 16.534 1.00 10.39 A ATOM 521 OK TYR 169 -12.443 1.410 17.534 1.00 7.99 A ATOM. KH TYR 169 -13.009 2.117 17.800 1.00 15.00 A ATOM. 523 * TYR 169 -6.810 3.642 12.390 1.00 6.72 A ATOM. 524 o TYR 16 9 -6 . 917 4 .49B 11.557 1.00 9.12 A ATOM. N TYR 17 0 -5.899 2.722 12.22e 1.00 9.53 A ATOM. 5 2c u TYR 170 -5.806 2.081 12.986 1.00 15 . CO A ATOM. 521 CA TYR 17C -5.313 2.511 10.899 1.00 10.01 A ATOM. 5 2 5 Cc TYR 170 - 3.967 1.797 11.044 1.00 7.46 A ATOM 5 2 5 TYR 170 -3.259 1 .636 9 . 679 1.00 13.45 ATOM 53 2 » wL·* - TYR 17C -2.680 2.766 9.052 i . oc 12.66 A ATOM 5 3 2 T* TYR 17C -2.213 2.656 7.738 1 . oc 10.18 > fy ATOM. 5 3 2 ccz TYR 1 7 C -3.304 C . 385 9.057 1 . oc 1 0.90 ry ATOM = 22 TYR 17 0 -2.B91 0.303 7.730 1 . oc 8.68 fy ATOM. - j 4 22 TYR - — - -2.231 1.419 7.124 1 0 c fy ATOM. 5 3 5 2Ή TYR 17 0 -1.774 1.286 5.859 1 . oc 1- . 50 f\ ATOM. 5 3 č nK TYR ~ i -1.386 0.404 5.514 1 . cc C r· « w A ATOM. 1 2 * 2 TYR • ·* r, -6.275 1.610 10.073 1.00 10.40 fy ATOM 5 3c TYR 170 -6.679 0.500 10.421 1.00 12.52 fy ATOM. 5 3? ♦ 1 LE -6.704 2 . 174 8.968 1 . cc 12.16
    11/42
    Obr. 2J
    ATOM 54 0 H » MM • -1Ί - < Λ -6.475 3.135 8.808 • Ί • z ΖΛ ATOM 541 OA Z MM 171 -7.608 1.430 3 .138 1 . 30 5.37 /n ATOM 542 03 Z LE 171 - 9 . C70 1 . 990 8.317 • Λ .Ί ·. ' · ry ATOM 543 002 T · *· • 7 · - 5.326 3 .501 6.677 - . W* L· ΖΛ ATOM 544 /»*» ILS 171 -10.046 1.564 7.214 1.00 13 .33 ry ATOM 545 001 ils 171 -10.647 0.250 7.619 1 . 00 17.=2 ry ATOM 545 f* Z LE 171 -7.074 1.234 6.694 1.00 8.34 f\ ATOM 547 0 ILS 171 -6.453 2.088 6.082 1.00 6 . 96 A ATOM 548 N TYR 172 -7.286 0.005 6.216 1.00 11.07 fy ATOM 549 H TYR 172 -7.809 -0.624 6.786 1.00 15.00 ry ATOM 550 CA TYR 172 -6.708 -0.37B 4 . 922 1.00 15.60 /y ATOM 551 03 TYR 172 -5.332 -1.082 5.037 1.00 14.32 X fy ATOM 552 CG TYR 172 -5.389 -2.397 5.796 1.00 9.21 A ATOM 553 001 TYR 172 -5.342 -2.402 7.216 1.00 12.52 A ATOM 554 031 TYR 172 -5.607 -3.620 7.901 1.00 10.88 A ATOM = 55 002 TYR 172 -5.565 -3.586 5.050 1.00 12.66 X z\ ATOM 5 5 5 032 TYR 172 -5.829 -4.800 5.740 1.00 15.83 * fy ATOM 5 = 7 TYR 172 -5.822 -4.808 7.164 1.00 11. 94 A ATOM 55B OH TYR 172 -5.995 -6.002 7.820 1.00 12.17 A ATOM 559 HK TYR 172 -6.433 -5.843 8.657 1.00 15.00 A ATOM 550 r* TYR 172 -7.605 -1.276 4.106 1.00 16.85 A ATOM 5 c i 0 TYR 172 -8.346 -2.057 4.692 1.00 14.06 fy ATOM 5 5 2 N ALA 173 -7.448 -1.141 2.776 1.00 16.29 A ATOM 553 H ALA 173 -6.751 -0.490 2.503 1.00 15.00 A ATOM 554 OA ALA 173 -7.940 -2.152 1.836 1.00 15.11 A ATOM 5 5 5 03 ALA 173 -9.300 -1.725 1.292 1.00 12.08 ty ATOM 56 5 ALA 173 -7.007 -2.537 0.653 1.00 15.86 A ATOM 5 5 0 Ό ALA 173 -6.147 -1.806 0.191 1.00 14.20 A ATOM 5 5 5 N GLN 174 -7.244 -3.714 0.109 1.00 16.56 A ATOM 5 5 5 H GLN 174 - 7.774 -4.389 0.620 1.00 15.00 A ATOM z ** * <. A GLN 174 -6.470 -4.119 -1.070 1.00 19.25 Λ ATOM. Z -* * 0Ξ GLN 174 -5.582 -5.292 -0.832 1.00 21.99 fy ATOM z ** *· _ -» 174 -4.205 -4.727 -1.030 1.00 30.99 ty ATOM z *· * GLN 174 -3.174 -5.845 -0.979 1.00 34.25 A /*.*· Ί GLN 174 -2.308 - 5 899 -0.105 Z 00 i? 93 ATOM N£2 GZ-N 174 -3.268 -6.699 -2.014 1.00 31.50 A ATOM. 5 5 H321 GLN 174 -2.668 -7.487 -1.970 1.00 15.00 A ATOM. Z · — UT * GLN 174 -3.973 -6.621 -2.714 1.00 15.00 fy ATOM 5~S — GLN 174 -7.413 -4.644 -2.114 1.00 19.20 fy ATOM. = 10 r* GLN 174 -8.285 -5.434 -1.880 1.00 20.03 * fy ATOM 5 Ξ : N VAL 175 -7.291 -4.107 -3 .301 1.00 19.28 fy ATOM 5 5 2 H VAL 17 = -6.594 -3.401 -3.400 1.00 15.00 > ΖΛ ATOM. 5 S 2 OA VAL 175 -8.247 -4.500 -4.323 1.00 22.43 fy ATOM. 5 = 3 03 VAL ·. -7 C. -9.319 -3.409 -4 .644 1.00 21.41 A ATOM 584 «j 1 » * » v rtM 175 -10.146 -2 . 830 -3.495 1.00 20 . I-7 A ATOM 5 = 5 «. .J Λ. VAL 175 -10.268 -4.061 -5.639 1.00 22.86 fy ATOM 5 3c « · * · V Zu-> Z 7 5 - 7 . 508 -4.859 -5.615 1.00 24.56 ry ATOM. 5 5” **· VAL 175 -6.926 -3.997 -6.301 1.00 23.28 fy ATOM 588 s THR 175 -.5£ 3 -6.180 -5.879 1.00 25.4C ry ATOM 5 5 9 THR Z 7 £ -7 . =94 -6.850 -5.250 1 . co 15.00 fy ATOM 5 5: — z·. UC Z 7 5 -7.066 -6.501 -7.222 1.00 24 .46 ry ATOM, 5 91 Sc THR Z 7 £ - 5 . 844 -7.454 -7.256 1.00 24.73 fy ATOM j ·„ THE * 7 £ - 5 . 945 - 3.650 - 8.028 i . 00 2C .31 ry ATOM 5 5 1 —· —, · ••„•z 1 6 -5.250 -5,2*3 -7.796 1.00 1= . 00 i. ♦ — “ - 4 • * - . = “ -J o . ·* 7 * * -5.867 z oc 17 07 3 3 3 - 1 “5 - « . Z 7 5 -6.700 -5.272 1 .co 2 5.44 /y ATOM 5 55 “’—’Ζ • “ £ -5.32c· -~.043 -7 .995 1 . co 2 6.86 ry Α^^’Μ Z i — Z-7 • — * . ? sex - c . 3 4 Z -9.506 1 . oc 22.44 fy i £ £ Z - Γ Q * Λ -6.083 -5.732 1 . oc 15.00 ATOM. 3 5 5 - z*. 9ΗΞ 1~~ -5.939 c . 5 Z Z -10.475 1 . 00 22.70 1
    TM 2C--Q9 • ·· ·· ·· ··
    ........ * ;
    • ·· · · · · · ·· ··· · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ···· ··
    12/42
    Obr. 2K
    ATOM soc 03 PHE 177 -5.746 -5.194 -10.599 . .00 2 0.92 A ATOM óci w U phe 1 77 -8.813 -4.034 -10.927 1 . 00 tí. * . 3 . A ATOM 5 02 001 PHE 177 - 8.771 -3.546 -12.252 1 . 00 22.11 Λ ATOM 5 03 002 PHE 177 -8.011 -3.422 -9.920 1 . 00 21.87 ry ATOM 5 04 CEl PKE 177 -S.041 -2.387 -12.550 1.00 2 0.53 A ATOM 5 05 CE2 PHE 177 -7.289 -2.247 -10.204 1.00 20.44 * fy ATOM 6 06 CZ PHE 177 -7.376 -1.713 -11.500 1.00 22.79 A ATOM 507 C PHE 177 -8.3B1 -6.949 -11.800 1.00 22.14 A ATOM 506 0 PHE 177 -7.219 -6.695 -12.072 1.00 21.60 A ATOM 609 N CYS 178 -9.210 -7.555 -12.625 1.00 24.52 A ATOM 610 H CYS 17B -10.146 -7.797 -12.370 1.00 15.00 A ATOM 611 CA CYS 17B -8.599 -7.849 -13.942 1.00 2 9.77 A ATOM 612 C3 CYS 178 -8.501 -9.365 -14.214 1.00 32.06 A ATOM 613 SG CYS 178 -7.685 -9.731 -15.792 1.00 35.17 A ATOM 614 C CYS 178 -9.323 -7.146 -15.088 1.00 28.41 A ATOM 615 0 CYS 178 -10.534 -7.247 -15.185 1.00 27.54 A ATOM 616 N SER 179 -8.589 -6.393 -15.910 1.00 28.86 A ATOM 517 H SER 179 -7.608 -6.271 -15.754 1.00 15.00 A ATOM 51B CA SER 179 -9.374 -5.454 -16.704 1.00 29.01 A ATOM 515 C3 SER 179 -9.37S -4.118 -16.020 1.00 30.82 A ATOM 620 OG SER 179 -10.615 -3.492 -16.319 1.00 39.79 A ATOM 6 21 HG SER 17 9 -10.725 -2.812 -15.667 1.00 15.00 A ATOM 622 2 SER 179 -9.063 -5.196 -18.165 1.00 31.16 A ATOM 523 0 SER 179 -7.931 -4.953 -18.537 1.00 28.58 A ATOM 6 2 4 N ASN 180 -10.083 -5.255 -19.042 1.00 35.32 A ATOM 6 2 5 H ASN 180 -10.966 -5.700 -18.834 1.00 15.00 A ATOM 6 2 6 r* * νΛ ASN 180 -9.782 -4.725 -20.366 1.00 34.74 A ATOM 5 2 ~ 22 ASN 180 -10.205 -5.554 -21.589 1.00 37.96 A ATOM 525 —u ASN 180 - 9.650 -4.980 -22.896 1.00 37.12 A ATOM 5 2 5 001 ASN 180 - 10.058 -3.947 -23.356 1.00 40.66 A ATOM. 5 3 0 NE 2 ASN 180 -8.619 -5.536 -23.456 1.00 35.85 * K ATOM. 5 3 1 ri G 2 Z ASN 180 -8.343 -6.475 -23.306 1.00 15.00 A i—~>w C w H 2 2 2 ASN 180 -6.153 -4.891 -24.065 1 . 00 15.00 A ATOM ž Z· Z· — ASN 160 -10.197 -3.331 -20 . ?88 1.00 36.96 fy ATOM. z j 4 ASN 180 -11.314 -2.894 -20.433 1.00 37.89 A ATOM £ 2 5 N ARG 181 -9.147 -2.699 -21.068 1.00 41.95 A ATOM. £ 3 £ H ARG 181 -8.363 - 3.318 -21.141 1 . 00 15.00 A ATOM. - · ~ *A ARG 181 -8.997 -1.313 -21.489 1.00 44 . 24 A ATOM. c 3 S *·- ARG 181 -7.563 -1.279 -22.026 1.00 43.43 A ATOM. £3 ? Gu ARG 181 -6.348 -1.638 -21.101 1.00 4 5.11 A ATOM o 4 <. 33 ARG 181 -6.235 -2.853 -20.134 1.00 40.68 A ATOM e 4 Z ΝΞ ARG 181 - 5.064 - 2.772 -19.271 1.00 46.11 K ry ATOM. £43 ΗΞ ARG 181 -4.991 - 2.058 -18.578 1.00 15.00 λ ATOM. £ 4 2 33 ARG s » -4.024 -3.611 -19.432 1.00 4 9.77 A ATOM. c 4 4 ΝΉ2 ARG 2Ξ2 - 2 . B86 -3.414 -18.790 1.00 54.33 A ATOM c 4 x HH2 2 ARG 192 •2.113 - 4 .032 -1B.918 1.00 15.00 ry ATOM. £ 4 £ KK 2 2 AR\_j 292 - 2.807 -2.642 -18.161 1. oc 15.00 A ATOM. c 4 NH2 ARG 281 -4.085 -4.641 -20.247 1.00 54.26 A ATOM t 4 £ Η H 2 2 ARG 2 5 2 - 3.286 -5.230 -20.354 1.00 15.00 ry ATOM £ 4 τ’ η K 2 2 ARG 2 9 2 - 4 .918 -4.833 -20.761 1.00 15.00 ry ATOM. £ 5 C — ARG 2 8 2 -10.049 -0.866 -22.499 1.00 47.10 ry ATOM. £ = Z - ARG 2 8 2 -10.579 - 0.112 -22.227 1.00 49.2C A ATOM 1 2 w t * Um* 2 9 2 -5.595 - 1.447 -23.690 1 . 00 4 9.54 ry ATOM £ £ Z· _ m** 2 9 2 -5.20. - 2.166 -23.775 1.00 15 . CC A £24 w ·*» 2 Z/J 2 9 2 -10.576 -1.365 - 24 .675 1.00 52.41 fy ATOM £ £ Ξ «ί 2 9 2 -.0.43 -2.020 -25.970 1.00 55.93 fy ATOM. £ x £ 2**· U » w 2 x * -'0.532 -1.418 -27.295 1.00 66.05 A « • z - -- u —. - 2 x «. -11.755 0.116 -27.327 1.00 70.54 A Λ.Τ2*** £ x £ 2 22 Um* 2 52 -5.613 0.586 -27.442 1.00 72 . 9B Λ ATOM. £ x £ Um* 2 82 . · * 7 “? £ 0.830 -27.244 1.00 72.46 A
    • 4
    4 • · ·
    ·
    13/42 •44 444 • 4
    44
    Obr. 2L
    ATOM o o 0 GLU 182 -12.393 -1.934 -24.304 1 . 00 53.00 ATOM 6 61 GLU 182 -13.379 -1.492 -24.862 1.00 54.27 ATOM 662 N ALA 15 3 -12.505 -2.877 -23.335 1.00 52 . 34 ATOM 6 6 3 K ALA 13 3 -11.676 -3.173 -22.865 1.00 15 . 00 ATOM 6 64 CA ALA 183 -13.867 -3.258 -22.899 1.00 50.19 ATOM 665 C3 ALA 183 -13.855 -4.721 -22.447 1.00 45.02 ATOM 6 66 r ALA 183 -14.562 -2.321 -21.867 1.00 50.66 ATOM 667 0 ALA 183 -15.712 -1.945 -21.990 1.00 47.77 ATOM 66S N SER 184 -13.773 -1.888 -20.878 1.00 52.95 ATOM 669 H SER 184 -12.826 -2.172 -20.991 1.00 15.00 ATOM 670 CA SER 1B4 -14.228 -1.043 -19.729 1.00 56.78 ATOM 671 CB SER 184 -13.384 -1.397 -18.481 1.00 53.58 ATOM S72 00 SER 184 -13.975 -2.448 -17.721 1.00 47.46 ATOM 673 HG SER 184 -13.291 -3.019 -17.388 1.00 15.00 ATOM 674 C SER 184 -14.183 0.517 -19.880 1.00 59.95 ATOM 675 0 SER 184 -13.913 1.297 -18.964 1.00 65.25 ATOM 676 N SER 185 -14.324 0.995 -21.131 1.00 60.08 ATOM 677 H SER 185 -14.623 0.345 -21.B31 1.00 15.00 ATOM 67B CA SER 1S5 -13.825 2.375 -21.391 1.00 60.12 ATOM 679 CB SER 185 -13.522 2.640 -22.869 1.00 60.49 ATOM 680 CG SER 185 -12.243 2.098 -23.242 1.00 59.80 ATOM 681 HG SER 185 -12.158 1.234 -22.833 1.00 15.00 ATOM 682 2 SER 185 -14.580 3.589 -20.885 1.00 59.59 ATOM 683 0 SER 1B5 -15.437 4.159 -21.543 1.00 60.08 ATOM 684 N GLN 186 -14.200 3.990 -19.670 1.00 57.71 ATOM 685 H GLN 186 -13.601 3.376 -19.153 1.00 15.00 ATOM 6 8 6 CA GLN 166 -15.121 4.936 -18.993 1.00 57.00 ATOM 687 CB GLN 186 - 16.094 4.062 -18.175 1.00 58.66 ATOM 686 CG GLN 186 -15.355 3.354 -17.050 1.00 59.69 ATOM 689 CO GLN 186 -16.369 2.789 -16.088 1.00 59.92 ATOM 690 ΟΞ1 GLN 186 -17.270 3.513 -15.687 1.00 59.81 -.70^. 6 51 NE 2 GLN 186 -16.249 1.503 -15.787 1.00 59.63 ATOM ΗΞ21 GLN 186 -15.492 0.948 -16.113 1.00 15.00 atcí** 6 93 HE2 2 GLN 186 -16.950 1.119 -15.168 1.00 15.00 Λ.70***. 6 54 GLN 186 - 14.758 6.290 -18.221 1.00 54 .36 ATOM 6 5 S c Gx^K 186 -15.596 7.198 -18.298 1.00 53 . 98 ATOM. 696 N ALA 167 -13.566 6.424 -17.511 1.00 50.35 ATOM 6 9 H ALA 187 -13.476 7.274 -16.970 1.00 15.00 ATOM. 695 CA ALA 187 -12.388 5.599 -17.832 1.00 43.26 a.tcv 695 C3 ALA 187 -11.546 6.264 - 18.918 1.00 38.95 ATOM. ~CC ** ALA 187 -11.456 4 .882 -16.849 1.00 40.48 ATOM Ol /» V ALA 16*7 - 10.887 3 . 875 -17.295 1.00 43.24 i— N PRO 188 -11.210 5.383 -15.594 1.00 38.66 ATOM. *·»^» PRO 188 -11.543 6.687 - 15.000 1.00 38.15 ATOM 04 CA PRO IBS -10.220 4 .665 - 14.751 1.00 35.94 A ΤΟ V. ·* Λ C *··: PRO 158 -9.395 5.813 -14.150 i. οσ 33.99 ATOM. 06 CG PRO 168 - 10.377 7.000 -14.036 i . oo 32.69 ATOM. ” Γ 2 PRO 188 -10.840 3.783 -13.683 1.00 33.66 ATOí< 08 o PRO 188 -11.885 4 . 062 -13.140 1.00 33.41 ATOM 0 5 N PHE 3 5 5 •10.147 2.695 -13 .346 i . 00 28.66 ATOM 10 PHE 185 -5.260 2.508 -13.748 1.00 15.00 ATOM. — · · PHE 15 5 „ · *· «γ — · 2.013 -12.171 1.00 26.71 X — — - - Cs 1 5 5 • 12 .222 2 . č 0 2 -12.034 1 . oc 26.21 x, V ** ThL 15 5 2 2 . č 2 -0.189 -10.849 i . 00 22.92 -.??y · r “ z. 15 5 • 2 2 .22 z 0.005 -5.556 1.00 17.72 X --\M - · i — - C*-T • c z - 11 . 6E7 -1.165 -11.064 1 . 00 21.38 ATOM 16 CCl cur 13 9 -12.^90 -0.815 -3.522 1 . 00 19.12 77V 1 ’ w X. PHE 15 5 •22.124 •2.995 -10.011 1.00 21.13 - » x — f* f. Σ. • □ z •11.5! -1.806 -8.736 1.00 18.44 ATOM — · l PHE 15 3 • 12 .44* 2 . S 2 5 - 10.909 1 . oc 27.14
    A
    A z\
    A
    A
    A
    A r\
    A
    A
    A
    A
    A
    A
    A
    A
    A
    A
    A *
    A
    A *
    Λ λ
    Λ x
    Λ
    Μ
    Α
    Α
    Α *
    Λ
    Α
    Α
    Λ
    Α »
    /Λ
    Μ fy fy r\ fy *
    fy fy • · ······ · • · · · · · ··· · · ·· ····
    14/42
    Obr. 2M
    ATOM «X — ?ΚΞ 289 -9.305 5 . 244 - · ~ . 7 £· £ Z Z te te te te te ATOM N » -. Γ 190 - 11 .4óS Z . 934 • -» Λ * • te » ** * * ΛΑ ATOM ‘ ·· *. te —te 290 -12.408 2 .766 -10.389 i.: o • * * ry ATOM *í te CA x —Z. 290 - Z Z . Z 5 3 3 . 625 -8.788 1.00 te . te te 1 . » Z t-. ATOM 724 CS ZLE 2 90 -11.315 5.242 -8.743 1.00 2 6.86 fy ATOM -25 CG2 T * z* 290 -11.892 5.979 - 9.997 Z · 0 Z Z 5 . 5 A ATOM 725 » » «» 290 -11 . 801 5.888 -7.424 1 . oc 22.54 x M ATOM 727 CD1 ZLE 290 -12.819 7.012 -7.645 2.00 28.56 ZA ATOM 728 £ 2LE 190 - 11.844 2.812 -7.656 1.00 21.97 zS ATOM 729 0 Z LE 190 -12.891 2.197 -7.001 1.00 16.30 ► ATOM 730 N ALA 191 -11.026 2.700 -6.590 1.00 Z ? . 2 Z X ΖΛ ATOM 732 K ALA 191 -10.124 3 .124 -6.662 1.00 15 . OC X ATOM 32 CA ALA 191 -11.501 2.195 -5.321 2.00 15.20 ry ATOM 733 C3 ALA 191 -10.730 0.928 -4.968 2.00 14.79 ry ATOM 734 r* s- ALA 191 -11.439 3.230 -4.206 1.00 17.11 A ATOM *7 *5 s 0 ALA 191 -10.467 3 . 961 -4.052 2.00 14.04 A ATOM 736 N SER 192 -12.511 3.245 -3.433 2.00 14.72' A ATOM 2 Π SER 192 -13.277 2.694 -3.804 1.00 15.00 A ATOM 738 te.Z\ SER 192 -12.725 4.289 -2.423 1.00 16.69 A ATOM 7 2 o C3 SER 192 -13.931 5.144 -2.803 1.00 14.83 A ATOM 740 OG SER 192 -13.556 5.828 -3.994 1.00 21.23 A ATOM 74 2 KG SER 192 -14 .367 5.966 -4.520 i .00 15.00 A ATOM 742 SER 292 -12.980 3.682 -1.069 2.00 17.77 A ATOM 743 rx SER 292 -13.753 2.738 -0.947 1.00 20.76 A ATOM 4 4 N LEU 193 -12.2δ5 4.209 -0.038 1.00 15.56 A ATOM 745 u; LEU 193 -11.681 4.959 -0.280 1.00 15.00 A ATOM 4 č CA LEU 193 -12.510 3.761 1.366 2.00 13.27 A ATOM 4 CS LEU 193 -11.195 3 . 825 2.217 1.00 12.74 A ATOM 74 8 <. o te 193 -11.051 3.141 3.604 1.00 14.37 X ry ATOM 74 9 LEU 193 - 12.272 2.354 4 . 116 1.00 14.67 A ATOM - z ,* LEU Z S 3 - 10.274 3 .986 4.622 2.00 12.64 A a ccy. ~ 5 2 «.ZU Z S 3 -13.497 4.748 1. 911 2.00 11.22 A ATOM LEU 193 - 13.188 5.912 1.903 2.00' 22.22 A ATCM “· Z “ N CYS 194 -14.652 4.326 2.310 1.00 13.66 fy - “Cy. ? 4 K CYS 194 -14 . 828 3.347 2.276 1.00 15.00 A ATOM “2 2 CA CYS 194 - 15.595 5.360 2.713 • <te Λ te · te te 14 . 84 fy ATOM “ z X S CYS 194 -16.915 5.409 1.918 1.0 0 17.58 A ATCX - Z “ SG CYS 194 - 16.623 5.417 C . 165 1.00 16 .33 A ATOM 5-£ — CYS 194 - i6.04 6 5 . 163 4.137 2.00 12.81 A 2, ·? z z 0 CYS 194 -15.983 4.072 4.655 1.00 10.34 A ATOM z Z X· te<Z. w 195 • 15.557 6.254 4.697 2.00 14 .32 fy ATOM cl H te«li te 1 95 -15.541 7.088 4 . 154 2.00 15.00 A ATOM r X - 2A LEU 195 •17.039 6.291 6.076 1.00 14.89 fy ATOM o 3 CS LEU Z 5 Ξ -16.195 7 .372 6.789 1 . OC 15. 56 A ATOM Ó4 te te 195 • 1 6 .572 7.680 6.242 1.00 Z z . z é A ATOM - i z —·*. te.te.te Z 9 5 •15.932 £ . 96 8.762 • Q Γ\ fy ATOM z ž te, te te*M te Z 9 5 -16.463 6.446 9.154 1.00 17.25 A ATOM Γ Z “ 7 LEU Z 9 5 -18.546 6.544 6.209 1 . co 23.54 fy ATOM “ £ s Li»-' 195 •19.038 ? . zZZ 5.705 1.00 14.56 fy ATOM í ? >* • νς Z 9č -19.236 5.667 6.905 1.00 16.36 fy ATOM - * ς H • v Z Z c; • Z z . Z 9 4.8^5 ~ .197 1 . co 15.00 A 2, - - · — r> • v z 195 • 2 C . z z . S7Z 7.405 1 . 00 22.01 A ATCY - - - ** LYS 195 te · . i 'Z 4 . 726 ~ . 146 te · te te 22.66 fy ATOM - - - - LYS 19 5 - te . Z Z 4 4.335 . z S Z· te . 0 te 2 Z . Z z ry i. V — - LYS 1 9 ž • . J . J ϊί 4.915 9.204 ’ te Z 40.25 ry - - 2 te-. LYS 1 95 -23.189 3.694 10 . 060 Z . 0 z 43.56 ry ATOM - - 2 LYS 195 • « J .004 4 . Z 5 3 11.4=3 1 . 00 4 4.46 ry i —~ v — ·. ·.· z Z •ZZ . Z£2 4.799 Z Z . 4 o 2 . 00 25.00 ry ATOM ·_·-- ·.: i ?? -23.847 4.665 12.77S 2.00 15.00 A A,cy. - - i Γ» te « LYS 195 • Z Z . 3 0 2.334 22.066 1 . 00 Z z . Z Z ry
    • ·« ·· ·· · ♦ ·· «·· · · 9 9 9 9 9 9 9 . ·· ·· · ···· • a ··· · · A AAA AAA ··»··· · ·
    AAA AA AA AAAA 99 99
    15/42
    Obr. 2N
    ATOM 730 *· LYS 195 2 2 . 4 7 £ 6.290 3.899 • * “ · Z 0 z ATOM 7£1 2 LYS 2 56 -20.154 5 .434 9.714 . toto 18.35 ΛΛ ATOM 782 N SER 197 -20.564 7.534 9 . 272 • Λ 2 0.63 Λ5 ATOM 783 Π SER 197 -20.891 S .247 8.615 • n * 2 5.02 r\ ATOM 784 CA SER 1 5 -20.752 7.701 10.729 » to* v 24 . 87 * ATOM 785 SER 197 -19.898 8 . 878 11.207 1 . 00 2 5.62 A ATOM 786 OG SER 197 -19.563 8.687 12.588 1.00 32.22 A ATOM 707 HG SER 197 -18.795 6.110 12.611 1.00 15.00 A ATOM 788 r· SER 197 -22.216 7.810 11.218 1.00 26 .33 A ATOM 789 0 SER 197 -23.078 8.303 10.497 1.00 2 6.5 A ATOM 790 N PRO 198 -22.534 7.274 12.407 1.00 26.77 A ATOM 791 CO PRO 198 -21.649 6.526 13.301 1.00 32.92 A ATOM 792 CA PRO 198 -23.919 7.381 12.913 1.00 28.73 A ATOM 793 C3 PRO 19B -23.784 6.789 14.318 1.00 32.89 A ATOM 794 CG PRO 198 -22.289 6.726 14.659 1 . oc 33 .55 A ATOM 795 C PRO 198 -24 .591 8.789 12.847 1.00 26.60 » ATOM 796 0 PRO 198 -24.035 9.817 13.242 1.00 20.20 A ATOM 797 N GLY 199 -25.729 8.773 12.119 1.00 25.75 A ATOM 79β K GLY 199 -26.170 7.857 12.057 1.00 15.00 A ATOM 799 r* * GLY 199 -26.486 10.003 11.790 1.00 26.91 * Λ ATOM 800 c GLY 199 -25.821 10.971 10.816 1.00 28.98 A ATOM SOI 0 GLY 19 9 -26.084 12.151 10.797 1.00 31.05 A ATOM ec2 N ARG 20C -24.898 10.464 10.001 1.00 30.15 A ATOM 3 03 H ARG 200 -24.629 9.519 10.165 1.00 15.00 A ATOM 804 «-Λ ARG 200 -24.140 11.384 9.166 1.00 28.98 A ATOM 805 03 ARG 200 -22.749 11.590 9.783 1.00 33.16 A ATOM 506 w <3 ARG 200 -22.739 12.290 11.162 1.00 38.34 A ATOM £ 0 7 ARG 200 -21.327 12.530 11.705 1.00 42.14 A ATOM 305 KE ARG 20C -21.292 12.875 13.131 1.00 43.64 A ATOM 3Q9 ΗΞ ARG 200 -21.327 13.831 13.424 1.00 15.00 * A7C.M. Z to 'w CZ ARG 2 00 -21.138 11.896 14.051 1.00 46.40 * Λ ATOM z 2 2 Krí2 ARG 200 -21.219 10.603 13.733 1.00 46.31 r\ ATOM z · 7 HH11 ARG 2 00 - 21.104 9.910 14.445 1.00 15.00 A ATOM 513 HH22 ARG 200 -21.394 10.320 12.789 1.00 15.00 A ATOM 2 2 4 KK2 ARG 20C -20.901 12.226 15.311 1.00 46.65 A ATOM 515 HH21 ARG 200 -20.847 13.193 15.566 1.00 15.00 A ATOM £16 HK22 ARG 200 -20.785 11.510 16.002 1.00 15.00 A ATOM 2 · 7 2 ARG 200 -24.084 10.967 7.710 1.00 27.77 A ATOM Ξ Z. £ 0 ARG 200 -24.264 9.791 7.449 1.00 28.21 A ATOM 219 K PHE 201 -23.853 11.926 6.792 1.00 30.83 n ATOM 520 n PHE 2 01 -23.513 12.821 7.126 1.00 15.00 A ATOM *» * PHE 201 -24.016 11.708 5.339 1 . co 34 . 17 * Λ ATOM Z> ·. «. PHE 2 0 * -23.851 12.996 4 . 572 1 . 00 31.58 A ATOM 2 2 3 to toJ PHE 2C1 -25.154 13.730 4 .614 1.00 34.85 A ATOM 2 2 4 — - ?K£ • n · -25.174 15.062 5.081 1.00 37.56 A 3 m 3 to pur ·* r ♦ -26.335 13.031 4 . 190 1.00 27.59 A ATOM 2 2 2 — —. PHE * · -26.39 15 . 74S 5.182 1.00 35.91 ATOM C£2 PHE 201 22 . 762 4 .280 1 . 00 38 . 9B A ATOM 2 2c pur 2 71 . ~ 7 c. ·? i 15.065 4 . 81 = 1.00 3 7.51 ATOM 329 *- rH£ 2 71 - “ Ί . Z’”’ 10.605 4.545 1 . oc 39.40 r\ ATCK - * o pur 2 21 •22.553 10.034 3.604 1 . oc 4 5.71 A ATOM 5 3 1 toto to' - 2 2 . -2· 2 2 22.226 5.034 1 . oc 35.75 A z - * •j 7 ·· * * - . “ c ·* c 10.7=3 5 . 925 1.00 15.00 A ATOM 2 2 1· -X w to -22.564 5.564 4.315 1 . 00 3 4.52 n to to to Z .· n «. z .Jto-to to to to • . - . — 7 C Z . -i J *í « . C v J «ί . 50 5 2 = J to. to to W to - 21.924 . 245 . * · * 1.00 4 C . 6 1 A - ‘ - 33 -J to. to 2 2 2 • 22 .64 7 6 .505 2.562 2 Ό V 4 6.22 r\ z - » ~ to.. „· _ w’ 2 2 7 - 2 2 .462 5.622 2.866 1 .00 46.85 A.TCV. = 25 z. to Jto-w 2 2 2 - 22 .41“ 6.224 1 . 37C • to r* * w V 4 5.63 A * z : c - SLT to to to •19.924 10.45C to to to to> 2.02 -/¾ as
    16/42
    XC
    Obr. 20
    ATOM 54 0 300’ 2C2 -20.137 ZZ.567 3.300 1.00 3 0.7 £ fy ATOM 341 N ARG 203 -15.723 5.697 3.856 I .00 2 6.88 ry ATOM. 942 ARG 203 -16.690 8.996 4.285 1 . 00 15.00 ry ATOM 643 CA ARG 203 -17.539 10.603 3.358 1.00 21.85 ry ATOM 644 C3 ARG 203 -16.619 11.410 4.457 1.00 2 7 . Z 7 ry ATOM. Θ45 CG ARG 203 -17.6Θ1 12.187 5.467 1.00 37.32 Λ ATOM 846 CD ARG 203 - 16.894 13.213 6.339 1.00 46.09 A ATOM 847 NE ARG 203 -15.911 12.667 7.308 1 . 00 56.90 * Λ ATOM 848 KS ARG 203 -16.240 12.433 8.223 1.00 15.00 A ATOM 849 CZ ARG 203 -14.572 12.475 7.001 1.00 66.77 A ATOM 950 NH1 ARG 203 - 13.702 12.002 7.911 1.00 68.44 A ATOM. esi HH11 ARG 203 -12.745 11.829 7.666 1.00 15.00 A ATOM 652 HK12 ARG 203 -14.016 11.822 8.845 1.00 15.00 A ATOM 653 NK2 ARG 203 -14.084 12.716 5.766 1.00 67.68 A ATOM 854 HH21 ARG 203 -14.670 13.108 5.060 1.00 15.00 A ATOM B55 HH22 ARG 203 -13.143 12.499 5.544 1.00 15.00 A ATOM 556 2 ARG 203 -16.517 9.633 2.678 1.00 17.71 A ATOM 857 *-> oj ARG 203 -16.375 8.418 2.931 1.00 7.69 A ATOM 556 N ZLE 204 -15.789 10.253 1.791 1.00 14.42 A ATOM 559 K ZLE 204 -15.915 11.228 1.561 1.00 15.00 A ATOM 66C CA ZLE 204 -14 .662 9.482 1.353 1.00 18.32 A ATOM 6 61 CB ILE 204 -14.520 9.392 -0.231 1.00 24.52 A ATOM, 6 6 2 CG 2 ILE 204 -15.820 9.529 -1.069 1.00 21.85 A ATOM 6 6 3 CG 2 ILE 204 -13.439 10.195 -0.949 1.00 26.35 A ATOM. 9 64 Γ·~\Ί A ι<Γ, 204 - 13.992 11.231 -1.961 1.00 36.33 A ATOM 515 ILE 204 -13.387 9.819 2.153 1.00 16.58 A ATOM. 9 6 6 V* ILE 204 -13.070 10.956 2.457 1.00 18.63 A ATOM, £67 N LEU 205 - 12.718 8.725 2.571 1.00 13.32 * ATOM 5 5 6 Π LEU 205 -13.142 7.853 2.321 1.00 15.00 fy ATOM 55 5 CA LEU 205 -11.467 8.829 3.322 1.00 10.01 A ATOM a * 2 C3 LEU 205 -11.440 7.688 4 . 382 1.00 6.66 A ATOM. a . LEU 205 -12.571 7.727 5.441 1.00 7.99 A ATOM S7 *·*·» LEU 205 -12.722 9.088 6.089 1.00 8.7B A T0.v. s — “ CG2 LEU 205 -12.419 6.72 0 6.582 1 . 00 8.08 A ATOM a ' 4 2 LxlU 205 -10.268 8.811 2.377 1.00 9.75 fy ATOM z ” 5 *. LEU 205 -9.416 9.655 2.320 1.00 10.25 fy ATOM. = iz N LEU 206 -10.252 7.769 1.562 1.00 10.28 A ATOM -77 H LEU 206 - 10.991 7.119 1.684 1.00 15.00 fy ATOM 575 CA LEU 206 - 9.166 7.555 0.610 1.00 10.02 k ATOM. 57? CB LEU 206 -8.249 6.384 0.990 1.00 11.94 fy ATOM 9 30 2'j —r T, j 206 - 7.001 6 . 527 1.859 1 . oc 14.40 fy ATOM 681 LEU 206 -7.094 5.595 3.074 1.00 14.49 fy ATOM. 5 8 2 ccc LEU 206 -5.531 7.958 2.151 1.00 e .78 ry ATOM 363 MM U 2 06 5.756 7.071 -0.697 1.00 11.91 A ATOM. = 94 j 206 -10.752 6.406 - 0.77e 1.00 10.67 n ATOM. ; c : ARG • * 7 -9.005 7.428 - 1.720 1.00 8.06 fy ATOM 5 5 5 H ARG a_ -E.196 7.992 -1.553 1.00 15 . OC fy ATOM. 5 = 7 ARG 2C -5.309 5 . 823 -2.992 1.00 10.45 ry ATOM. a a c » a ARG 20“ - 9.974 7.790 -3.904 1.00 8.71 fy — ''V = 55 23 ARG - * *“ -11 .256 5 . 27C -3.357 1 . co 15.68 Λ - = 50 ARG - Z Z.£ 52 9.459 - 4 . 16 3 I .00 22.25 fy -Toy 5 51 ΝΞ ARG A <- - 12.67C 5.192 -5 .171 1.00 29.59 fy ATcy Z “ * ·_· Γ - - ~ • Z 2 . Z Z z 5.300 -5.249 1.00 15.00 fy 5 5 5 -- ARG * * ~ - Z 2.0 č 2 • - n 7 - •Ξ .915 1.00 4 2 . C 5 ry -.72*·* 7 ? «η ζ%Λ «; Z Σ -12.462 11.496 -5.812 1.00 5 6.22 fy - - = aa_2_l Αλ *»«· • Z Z . 8 Z 2 12.246 -6.391 1 .00 15.00 fy ATOM žrž HH 2 2 λΛ • * — _ Z . 7 7 7 Z Z . č 5 Z - 5 . Z € 5 Z . 0 0 15.00 ry 1 — v : z. “ Nr. - ·» * “ Z ή . Z D 7 • r i * · » · -6.773 1.00 40.66 fy ATOM z - 5 HK 2 1 ARG - * — • i 4 2 92 10.87- -- . 329 1.00 15.00 fy ATOM 5 5 5 ržr.Z 2 ηΛυ - - — - 1 4 .456 5.207 -6.853 Z 5.2 2 fy
    17/42
    • · · · »» • · · · · · • · · · · • · · · · ··· • · · ···· ·· ··
    Obr. 2P
    ATOM a n r — ARG 207 - 3.04 4 6.456 -3.742 2 . 00 12.77 fy ATOM 5 21 ΛΛυ 2 0 7 .053 . 150 -3.7B ..22 15.55 A ATOM 902 v 11 ALA 208 -S.09ó 5.358 - 4 .455 2 . 00 ATOM 5 03 K ALA 208 -8.879 4 . 758 -4.355 ί Λ Γ» 1 ~ . č 2 fy ATOM 904 CA 208 --.025 5.128 -5.465 2.00 2 7 . oc ry ATOM 905 C3 ALA 208 -5.052 4 . 020 - 5.072 1.00 14.69 fy ATOM 906 c ALA 208 -7.544 4 . 830 -6 . 854 1 . 00 20.46 A ATOM 907 c ALA 208 -8 .438 4 . 020 -7.057 1.00 21.89 A ATOM 908 N ALA 209 -6.986 5.586 -7.808 2.00 26.22 A ATOM 909 K ALA 209 -6.280 6.235 -7.533 1.00 15.00 A ATOM 910 CA ALA 209 -7.253 5.208 -9.196 2.00 28.06 A ATOM 911 C3 ALA 209 -7.702 6.380 -10.069 1.00 27.10 A ATOM 912 r* ALA 209 -6.075 4.461 -9.832 2.00 32.54 A ATOM 913 0 ALA 209 -4.895 4.726 -9.593 2.00 33.00 A ATOM 914 N ASN 210 -6.502 3.491 -10.634 1.00 32.11 A ATOM 915 H ASN 210 -7.466 3.249 -10.531 1.00 15.00 A ATOM 91c CA ASN 210 -5.674 2.893 -11.662 1.00 36.00 A ATOM 517 CS ASN 210 -5.366 1.446 -11.355 1.00 39.53 A ATOM 918 <1 ASN 210 -4.463 1.366 -10.154 1.00 42.59 A ATOM 919 OD1 ASN 210 -4 .285 2.273 -9.342 1.00 39.26 k, f\ ATOM 92C ND2 ASN 210 -3.951 0.165 -10.055 1.00 41.77 A ATOM = 21 HD21 ASN 210 -3.990 -0.479 -10.817 1.00 15.00 A ATOM 5 22 HD22 ASN 210 -3.364 -0.081 -9.279 1.00 15.00 A ATOM. 923 2 ASN 210 -6.299 2.931 -13.043 1.00 36.95 A ATOM = 24 ASN 210 -7.492 2.752 -13.259 1.00 36.93 A ATOM = 25 N THR 211 -5.447 3 .168 -14.013 1.00 37.83 A ATOM 526 H THR -5 · · -4.484 3.377 -13.821 1.00 15.00 A ATOM 5 2 > THR 211 -6 .119 3.224 -15.314 1.00 42.27 A ATOM 528 CS THR 211 -5.325 4 . 158 -16.268 I . 00 44 . 53 A ATOM. 52 9 03 2 THR 211 -6.076 4 . 506 - 17.438 1.00 49.34 A i.ccy. 5 3 C HCI THR 211 -5.032 5.493 -17.508 2.00 15.00 A - 'Zy. 5 31 ·. THR “ · 1 -3.926 3.604 -16 . 581 2.00 46.08 A T J — — THR 211 -6.434 1.833 - 15.878 1.00 39.17 A -'-'M 5 5 2· THR 211 - 5.822 0 . B63 -15.475 2.00 36.48 A ATOM 7 · i N his 212 -7.416 1.718 -15.789 2.00 37.14 r\ ATOM w “ * H HIS 212 -8.106 2.43B -16.878 1.00 15.00 fy ATOM 5 3c v. A HIS 2 » x -7.294 0.454 -17.529 1 . 00 33.23 * r, ATOM c - - C3 HIS 212 -8.680 -0.012 -18.082 1.00 27.73 fy ATOM = 38 HIS ·.«. x -9.856 0.060 •27.111 2.00 24.58 A -.TOM 5 3 5 NC1 HIS 212 -10.862 0.967 -17.151 1 . cc 24.59 M . — 5 4 - 7· » Κ2Ξ -i « -11.OOC 2.702 -27.794 2.00 15.00 A ATOM 54 2 Μ «1 KZS 212 -10.049 -0.723 -15.985 2.00 20.65 » fy 1 — ΝΞ2 ·-· T c * - “ -11.154 -0.265 -15.383 1.00 24 . Cl ry ATOM 5 4 - HIS -11.665 0.780 -16.092 2.00 17.55 fy ATOM 544 *· n * * * * - £.257 0.533 -18.683 1.00 38.31 fy ATOM 7 4 a 2 2 1 o -3.363 -2.112 -18.923 1.00 33.92 fy Λ -^w 7 4 c k ’ SER - 6 . 444 1 .737 -19.443 1.00 4 6.63 fy ATOM 7 *4 ’ H SSr. 21 j - ~ . 15c 2 .323 -19.055 1.00 15.00 f\ - ”*2?y 5 4c 2 1 j - 3 . Oc 2.177 -20.67= 1.00 53.51 fy ATOM 7 4 7 CS » * .* I . 704 -23.400 1.00 7^ . C fy ATOM. 5 3 2 *»' 3 5 SR -2.256 1.657 -20.547 1.00 53 . 97 ry -ΏΥ ΞΞ-2 7ÍC * 7 - :· .353 1.064 -19.823 1 . cc 15.00 fy ATOM. 5 30 SER » ~ J -Ξ .54 4 1.508 - 22.097 • n r- 6 0.21 fy • —-\v = = ~ 7 TO ·. « » • * . 2 Z 7 o · · -22.682 • <» r\ * ί · a ry 2 — '“'V ·· í 4 “ TT - - 4 • . 4 7 2 . 5 2 7 - 2 2.585 . · v 'w 64 . 55 fy ATOM = = = - cr: - -1 . — — · 7 2.222 -22.146 1.00 * * H Z A“. X ——Λ* L Z - Z. 7 77 - - 4 • 4 5 7 2.455 -24 .094 1 . oc 5 5.62 ri 2. —-^v i : “ = 7 77 ·. - 4 2.22c -24 .4 9 = 1 . oc 67 . S2 fy 5-Ξ-5 CS 777 — - π -5.563 2.2c -23.336 1 0 c 6 7.04 fy 1,— ř: 5 r 7 7 » 4 -12.455 2.355 - 2 2.622 1.22 15 2 2 fy
    T>\j • ·· ·· ·· ·· ·· ·· · · 9 9 9 9 9 9 9 9
    99 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 ·9 9 9 99
    9 9 9 9 9 9 9
    999 99 99 ···· 99 99
    18/42
    Obr. 2Q
    ATOM 96C 2 SZR ta X 1 -6.518 1.587 - 2 5 3 0 *2 • Λ ta * w V '2.03 r\ ATOM 561 3 gr? 014 -6.202 2.683 -25.66c » 2 2 .•A ATOM 362 % · i* ALA * ’ c -6.175 0.409 -25.999 » 4/ * . jc ry ATOM 563 H ALA 215 -5.456 0.595 -26.56 5 . ta «·, ta ta a «ϊ .02 r\ ATOM 964 CA * * * Z-UtaJ-k 215 -6.858 -0.915 -25.753 2 . C 2 7 2.62 A ATOM 565 03 ALA 215 -7.199 -1.505 -27.136 1.00 73.06 A ATOM 566 Z* ta. * * * 215 -6.331 -2.148 -24.983 1.00 72.11 A ATOM 967 ta· ALA 215 -7.020 -3.161 -25.069 1.00 '2.74 ATOM 9ée N LYS 216 -5.153 -2.076 -24.282 1.00 70,17 * fy ATOM 969 H LYS 216 -4.747 -1.165 -24.199 1.00 15.00 fy ATOM 97C * ta. Λ LYS 216 -4.482 -3.256 -23.626 1.00 67.38 ry ATOM 571 03 LYS 216 -3.458 -2.691 -22.648 1.00 65.30 Λ ATOM 972 CG LYS 216 -2.217 -2.107 -23.321 1.00 56.86 A ATOM 973 LYS 216 -1.419 -3.149 -24.134 1.00 68.81 A ATOM 974 CE 1YS 216 -0.082 -2.674 -24.740 1.00 67.51 A ATOM 975 NZ LYS 216 0.483 -3.722 -25.596 1.00 67.80 A ATOM 976 KZ1 LYS 216 0.620 -4.590 -25.041 1.00 15.00 A ATOM 577 nZ2 LYS 216 -C . 168 -3.914 -26.385 1.00 15.00 A ATOM 578 HZ3 LYS 216 1.401 -3.406 -25.973 1.00 15.00 «, Λ ATOM 975 LYS 216 -5.321 -4.441 -22.993 1.00 66.99 A ATOM 980 0 LYS 216 -6.462 -4.266 -22.575 i . 00 69.90 A ATOM 981 N PRO 217 -4.835 -5.724 -22.952 1.00 €5.06 A ATOM 582 CZ PRO 217 -3.525 -6.262 -23.308 1.00 67.91 A ATOM 55 3 z-» * PRO 217 -5.792 -6.827 -22.626 1.00 62 . BO A ATOM 984 C£ PRO 217 -5.285 -8.004 -23.464 1.00 64.33 A ATOM 985 taj PRO 217 -3.755 -7.799 -23.338 1.00 69.63 A ATOM 966 2 PRO 217 -5.837 -7.237 -21.150 1.00 59.77 A ATOM PRO 217 -4 .747 -7.318 -20.569 1.00 56.81 A ATOM 5 6 6 N CYS 21B -7.115 -7.516 -20.627 1.00 55.45 A ATOM 5 6 5 H ZYS 218 -7.874 -7.287 -21.233 1.00 15.00 A ATOM 5-5Z ta.Z*k ZYS 21S -7.433 -7.929 -19.210 1.00 46.55 A 2. -‘''V ? 5 L CYS 219 -B.105 - 9.2BS -19.079 1.00 44.69 A , ta, tas M 5 ?Σ £ J ZYS 218 -8.855 -9.822 -17.460 1.00 43.11 A ATOM 2 ZYS 216 -6.265 -7.994 - 18.263 1.00 43.24 fy ^ta.ta,y “ Γ i ZYS 2 2 s -5.720 - 9.026 - 17.959 1.00 44.68 fy ATOM 5 5 5 n OLY 219 -5.853 -6.820 -17.876 1.00 40.28 A ATOM 5 5 6 H GLY 219 -6.328 -5.961 -18.059 1.00 15.00 A ATOM 5 5 taZ\ 3L2 219 -4.659 -6 .828 -17.070 1.00 36.27 A ATOM 5 5 5 2 G1Y 215 -5.017 -7.080 -15.643 1.00 33.86 A ATOM c o c 2 G1Y 219 - 5.906 -6.452 -15.057 1.00 34 . 90 fy • Λ ·** 1» i» Jtab 2 2 0 -4 .313 -7.996 -15.023 1.00 33.15 fy ATOM 12 2 2 H GLN 222 - 2 . B35 -3.684 -15.580 1.00 15.00 A A.Tzy. « <·.’ v ta taZta GIN 2 2 2 -4.448 -7 .929 - 13.578 1.00 29.92 Λ ATOM . *. * * . j j *ta 220 -4.298 -9.282 -12.936 1.00 27.61 fy ATOM . 2 Z 4 ta. ta jtaN 22C • 5 . 3BC -9.340 -11.883 1.00 30.94 A ATOM • *· r - tata ZtaN - · r 4. ta w’ -5.285 -22.532 -11 .132 1 . oo 35.37 A ATOM 0 c ta —. GLN * — Λ ta X ta -4 .216 -13.969 -1C . 6 61 1.00 38.47 fy ATOM. ne: \J ta*’ 22 C -6 .425 -11.296 -10.977 1.00 37.61 fy ATOM, . . c Γ, m ta ta ta , v· Jtať * -í * -5.255 -12 .235 -10.65 1 . 00 15.00 ry ATOM. ;:: 9 ta «. ta GIN 2 2 2 -~.373 -11.036 - 11.200 1 . 00 15.00 fy ATOM. ta u taN • » r • } . ó é © -6.845 -12.859 1.00 27.48 ry ATOM .... 3 Li’ tata*. -2.452 -6 .694 -22.959 1.00 27.61 fy ATOM 10 10 U ta· · 2 2 « - 4 .436 - 5.04 0 - . ta η · ta 1 . oc 2 5.22 ry 2“ZV .... ta m * ta«. > • * . 4 J • · ta t “ C . ta ’ ·» -22.243 1 . oc ta C · V' ’w ry .... ta » t * — . . ·. ar·: -4.529 -22.35 . ta ta i TZíť Jta4’ ta ta ta • 4 . v -:-.525 -22.945 1 . 00 A ATOM J ta«’ 2 21 • 2 .2 84 -3.029 - 2 « .253 «.'tata 3 2.2c ry tata . - . . T *7 S í 1 . 00 ATOM • - * a “£1 ta · fc · ta ta ta -1 .746 •0.753 -12.55= 2.20 4 2.12 fy ATOM 1 3 1 .- t ~ ·* jLL 2 - 2 -4 .648 -1.507 -14.2 95 . tata • 4 . < j r.
    • ·♦ ·· ·· ·· ·· ·· · · ···* · · · · • ·· ·· · ···· • · ··· · · · ······ ······ · · ··· ·· ·· ···· ·· ··
    19/42
    Obr. 2R
    ATOM 1020 KE 21 GLN 221 -4.981 - 2.2 5 -15.042 i. o: 1 X . Z a A ATOM ::2: ur: ? GLN 221 -4.844 -0.551 - 14 . š7: i . Z Z Z x . Z Z A ATOM 1022 2 Gx>N 2 2 2 -4 .22 -4.913 -9 . 94B 1.00 15.54 .—l ATOM 102 3 0 GLN’ 221 -5.300 -5.381 - 9.611 1 . z z 15.46 ATOM 1024 N SER 222 -3.374 -4 . 330 -9.123 1.00 15.12 ZA ATOM 1025 H SER 222 -2.442 -4.09B -9.441 1.00 15.00 * ZA ATOM 1026 r* * \_ZA SER 222 -3.851 -4.120 -7.752 1.00 19.45 A ZA ATOM 1027 C3 SER 222 -3.104 -4.947 -6.691 1.00 19 . 99 A ZA ATOM 1028 OG SER 222 -3.096 -6.339 -7.053 1.00 24 . 64 A ATOM 1029 HG SER 222 -2.651 -6.336 -7.904 1.00 15.00 A ATOM 1030 r· SER 222 -3.731 -2.688 -7.330 1.00 24 . 09 ZA ATOM 1031 O SER 222 -2.992 -1.929 -7 .944 1.00 29.41 A ATOM 1032 N Z LE 223 -4.534 -2.3B6 -6.283 1.00 22.81 A ZA ATOM 1033 H ILE 223 -5.172 -3.127 -6.074 1.00 15.00 A ATOM 1034 CA ILE 223 -4.567 -1.122 -5.530 1.00 21.06 A ATOM 1035 C3 ILE 223 -5.970 -0.490 -5.852 1.00 19.87 A ATOM 1036 CG 2 ILE 223 -6.564 0.315 -4.673 1.00 16.59 A ATOM 1037 ILE 223 -5.911 0.278 -7.188 1.00 15.22 A ATOM 1038 CD1 ILE 223 -7.229 0.868 -7.709 1.00 20.54 A ATOM 1039 c ILE 223 -4.367 -1.446 -4.007 1.00 21.62 A ATOM 1040 o ILE 223 -5.09B -2.269 -3.444 1.00 19.58 A ATOM 1041 N HIS 224 -3.429 -0.767 -3.340 1.00 19.73 A ATOM 104 2 K HIS 224 -2.794 -0.230 -3.899 1.00 15.00 A ATOM 1043 CA HIS 224 -3.497 -0.671 -1.B58 1.00 16.45 A ATOM. 104 4 C3 HIS 224 -2.164 -1.183 -1.227 1.00 18.74 A ATOM 1045 CG HIS 224 -2.182 -1.442 0.296 1.00 14 . 92 A ATOM 1046 NDI HIS 224 -2.479 -2.628 0.832 1.00 15.33 A ATOM 104 7 un’ HIS 224 -2.667 -3.515 0.505 1.00 15.00 A ATOM 104 8 CD2 HIS 224 -1.964 -0.524 1.310 1.00 13.79 A ZA ATOM 104 9 NE2 HIS 224 -2.137 - 1.127 2.517 1.00 10.52 A ATOM 1C5C ΓΓ “ HIS 224 -2.458 -2.411 2.232 1 . oc 11.70 ZA ATOM 1051 2 HIS 224 -3.914 0.699 - 1.284 1.00 15.18 A ZA ATOM ’ * * ·· HIS 224 -3.338 1.732 -1.520 1.00 14 .36 A ATOM ' X N LEU 225 -4.970 0.673 -0.466 1.00 16.85 A ATOM 1 254 H LEU 225 -5.317 -C . 238 -0.252 1.00 15.00 ZA ATOM 1055 A LEU 225 -5.395 i . 885 0.256 1.00 15.55 A ATOM 1056 CB LEU 225 -6.927 2.082 0.208 1.00 17.15 A ATOM 1057 Cu LEU 225 -7.495 2.456 - 1.154 1. 00 13.03 ZA ATOM r-—,· LEU 225 -6.792 3.659 - 1.774 1.00 19.34 A ATOM • > C X CD 2 LEU 225 -8.994 2.559 - 1.098 1.00 13.66 ZA 1060 • CT· 225 -5.074 I . 758 1.739 1.00 14.77 ZA ATOM 1 2 c 2 Z LEU 22 5 -5.347 0.726 2.345 1. oc 12.20 A ATOM 1 3 č 2 N OLY 226 -4 . 544 2.629 2.344 1.00 18.04 ZA ATOM 1 06 3 V GLY 226 -4.218 3.616 1.813 1 . 00 15 . OC ZA ATOM 3 c 4 *·» « -rt GLY 226 -4.541 2.833 3.841 1 . oc 18.3? ZA ATOM L 3c x 2 GLY 2 *; 6 -4.153 4.171 4.544 1.00 17.05 ZA ATOM 1 3c c z GLY 22c - 2.3B5 4 . 906 4 . 055 1.00 13.75 ZA ATOM • * z “ N GLY • - 7 -4.761 4.457 5.725 1.00 16.30 ZA ATOM ; 5 : K GLY 2 2 -5.434 2.77; 6.036 2.00 15.00 ZA ATOM L 3c x \-ZA GLY 22 -A.35 :.649 6 .490 1 . 00 5.52 ZA ATOM • · - * * GLY 2 3 -4.925 5.631 7.959 1.00 i 2.7 X ZA ATOM 2 GLY • x . é x - 4.748 8.466 1 . oc 1C . 57 A X — *\V - - - k · » » » * « za*- 22 = -4.5B8 6.696 5.675 1.00 5.22 ZA X — .... r. » za·- 2 2 x ή .0A C . 295 5.222 1 . co 25.00 ZA AT0‘·' • · · X ·. r*> • za— 2 « x • x .222 £ . 515 10.067 1 . 00 21.74 za • - - 0 23 • za— X -4.055 ' . 220 11.144 1.00 14.30 ZA ATOM » — C 2222 • za — 2 — x -2.530 6.445 11.333 1.00 « A ~ · * » . f * ZA ATOM a. ♦ za— 2 2 x -4.785 - . 565 12.479 1.00 17.07 ZA ATOM • - - X - * za — 2 2 5 -6.236 - . 803 10.098 1.00 5.02 A ATOM • - - z. * • Λ- 2 2 5 -6.089 5.937 5.649 1.00 12.01 ZA
    g\í ze ·« ·· ··
    20/42
    Obr. 2S
    ATOM ATOM 108 0 1081 N π PHE 22 9 229 -7.347 -7.329 7.295 6.332 2 0.0 4 0 10.922 • rs r· 1.00 5.88 15.01 r\ ATOM L082 * teZI ΡΗΞ 229 - 6.566 8.106 20.772 1.00 11.1 = A ATOM 1053 03 PHE 229 -9.578 7.687 9.666 1.00 5.11 Λ ATOM 1094 te’-J PHE 229 -9.063 7.912 8.233 1.00 5.40 f\ ATOM Ι0Θ5 -*· * PHE 229 -9.140 9.196 7.645 1.00 10.03 r\ ATOM 1086 CO 2 PHE 229 -8.433 6.883 7.517 1.00 6.57 ry ATOM 1087 CE1 PHE 229 -8.512 9.443 6.395 1.00 5 .18 ry ATOM 1088 ΟΞ2 PHE 229 - 7.771 7.128 6.282 1.00 4 .26 fy ATOM 1069 *— ·? PHE 229 -7.913 6.424 5.731 1.00 £ *7 ty ATOM 1090 .** PHE 229 -9.202 8.014 12.197 1.00 14.39 Λ ATOM 1091 0 PHE 229 - 9.116 7.000 12.870 1.00 13 . 92 A ATOM 1092 N GLU 230 -5.863 9.064 12.672 1.00 17.93 Λ ATOM 1093 K GLU 230 -9.912 9.892 12.113 1.00 15.00 A ATOM 1094 CA GLU 230 -10.856 6.944 13.770 1.00 18.08 A ATOM 1095 03 GLU 230 -11.218 10.303 14.393 1.00 16.17 A ATOM 1096 CG GLU 230 -11.068 10.090 15.889 1.00 27.69 A ATOM 1097 CG GLU 230 -12.314 10.091 16.805 1.00 33 .06 A ATOM 1098 OE1 GLU 230 -13.355 10.707 16.552 1.00 38.26 * Λ ATOM 1099 OE2 GLU 230 -12.218 9.477 17.863 1.00 38.14 A ATOM 1100 λ S— GLU 230 -12.225 6.268 13.453 1.00 18.70 A ATOM 1101 Q GLU 230 -12.967 5.519 12.492 1.00 21.58 A ATOM I1C2 N LEU 231 -12.542 7.334 14.361 1.00 13.79 A ATOM 1103 K LEU 231 -11.840 7.125 15.015 1.00 15.00 A ATOM 1104 LEU 231 -13.B85 6.836 14.330 1.00 13.52 A ATOM 1105 cs LEU 231 -13.954 5.37B 14.002 1.00 13 . 90 A ATOM 1113 CG LEU 231 -13.199 5.064 12.725 1.00 15.44 A ATOM 1107 LEU 231 -13.781 5.712 11.436 1.00 10.24 A ATOM 1108 s-w X LEU 231 -12.970 3.569 12.769 1.00 22.74 A ATOM 1109 2 LEU 231 -14.638 7.074 15.591 1.00 14 .88 A ATOM • «· · r> z LEU 231 -14.145 6.912 16.692 2 . 00 12.46 A - TOM > · GLN 232 - 15.891 7.411 15.350 1.00 29.40 A ATOM L *«. ·> H ^9 .-Js 232 -16.107 “.560 14.394 1 . 00 15.00 A ATOM. > * * * CA GLN 232 -16.920 7.509 16.389 1.00 22.07 A ATOM. Z 1 Z. 4 GLN 232 -18.132 8.234 15.804 1. co 23.55 A ATOM • · Ί £. — GLN 232 -17.792 9.709 15.687 1.00 28.60 A ATOM Z.1 - c <··» GLN 232 -17.625 10.200 17.102 i . 00 33.66 *. fy ATOM • · · 7 031 GLN 232 -18.623 10.472 17.742 1 . 00 38.08 A ATOM 1118 ΝΞ2 jLN 232 -16.380 10.254 17.596 1.00 23 .41 A ATOM 1119 HE21 GLN 232 -15.596 10.186 16.972 1.00 15.00 fy ATOM. • « -1 £.’£ ~ GLN 2 3 2 •16.387 10.470 18.576 1.00 15.00 fy ATOM. Z Z. 2 Z 2 3 2 -17.402 6.148 16.851 1 . 00 21.86 A ATOM 11 e z GLN 232 -1 - . 3 5 8 5.21B 2 6.052 1.00 21.se fy ATOM. 1 e _ j n PRO 2 3 3 -1“ .906 6.013 18.115 1 . 00 22.31 fy ATOM 112 4 2C PRC 233 -17.962 “ . 033 29.168 1 . 00 21.41 fy ATOM. — Λ PRO te J J • 15 . 570 4.747 18.442 1. oc 21.21 fy ATOM. s PRO 2 21 . · £ Q · -. 4 . 987 19.866 1. oc 23.86 A ATOM. — a. PRC 2 2 2 -15.661 6.404 20.339 1.00 20.95 fy ATOM. 11 2 £ PRO 2 2 2 -15.667 4.417 17.434 1 . 00 23.66 ty ATOM . „ „ 7 PRC 2 2 2 - 2 0.27: 5.319 16 . 875 1 . 00 2 6.39 fy ATOM. • · «í - ·; — i 234 . ' c *7 “ ' 3.140 17.059 1.00 22.77 fy - ~'~’X • « X a _j __ · te j 4 -19.052 2.465 _ .· .42 ' 1. oc 15.00 fy ATOM Z Z á « A. * J 4 - 2 2 .76 6 2.767 16.072 1.00 19.45 fy ATOM. a a J » * j M; 2 34 •22.545 3.242 24 . 625 • Γ te . te v 15.67 fy ATOM. a a a’' 1 c> uu : — - ·» * te a . * £ £ 2 . ? 3 C 13.715 Z . 0 c 23 .81 ry ATOM. ♦ - £ » te X X -29.405 3.926 14.368 1.00 16.89 fy ATOM. Z 1 J £ L' r.^r\ te J X -25.056 4.485 s s ’ : * Λ .*» a . te te 15.00 fy ATOM. • ’; - - rvx-z-. te J X - 2 5 .4 3 2 3.515 13.296 1.00 22.1“ fy ATOM 1 Z Z· £ CE 2 x x •25.193 2.042 13.03 9 1.0 ο- 6 .68 fy ATOM Z 1 2 r - 2 2 x -15.542 4 . i 6 0 11.993 ι. 0 0 21.96 fy
    21/42
    Vv 2.0 -qg *« »0 »♦ «e • » · · · · « · · • · 0 0*00
    000 0 0 0 000000 0 0 0 0 0 0
CZ0002699A 1996-07-08 1997-07-03 Lécivo, které obsahuje protilátku inhibující vazbu ligandu CD40 na CD40 a je urcené k lécení nemocízávislých na bunkách hladkého svalstva CZ297300B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67773096A 1996-07-08 1996-07-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2699A3 true CZ2699A3 (cs) 1999-05-12
CZ297300B6 CZ297300B6 (cs) 2006-11-15

Family

ID=24719894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0002699A CZ297300B6 (cs) 1996-07-08 1997-07-03 Lécivo, které obsahuje protilátku inhibující vazbu ligandu CD40 na CD40 a je urcené k lécení nemocízávislých na bunkách hladkého svalstva

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20030219437A1 (cs)
EP (1) EP0956030A4 (cs)
JP (1) JP2000515507A (cs)
CN (1) CN1242809C (cs)
AU (1) AU731299B2 (cs)
BG (1) BG63489B1 (cs)
BR (1) BR9710264A (cs)
CA (1) CA2259962C (cs)
CZ (1) CZ297300B6 (cs)
EA (1) EA004401B1 (cs)
EE (1) EE9900010A (cs)
HU (1) HUP9904669A3 (cs)
IL (1) IL127884A0 (cs)
IS (1) IS4935A (cs)
NO (1) NO990019L (cs)
NZ (1) NZ333602A (cs)
PL (1) PL188408B1 (cs)
SK (1) SK499A3 (cs)
TR (1) TR199900029T2 (cs)
WO (1) WO1998001145A1 (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6797263B2 (en) 2000-05-12 2004-09-28 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for achieving immune suppression
US20020173053A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-21 Bassam Damaj Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
UY32802A (es) * 2009-07-23 2011-01-31 Provimi Holding B V Composiciones para reducir la metanogénesis gastrointestinal en rumiantes
WO2017197231A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Medimmune, Llc Cd40l-fc fusion polypeptides and methods of use thereof
WO2018088850A2 (ko) * 2016-11-11 2018-05-17 다이노나(주) Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US11793854B2 (en) 2019-03-21 2023-10-24 Op-T Llc Methods for reducing symptoms of multiple sclerosis using a six-amino acid long peptide that inhibits CD40-CD150 interaction

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
IL104684A0 (en) * 1992-02-14 1993-06-10 Bristol Myers Squibb Co The cd40cr receptor and ligands therefor
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6340459B1 (en) * 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US6822070B2 (en) * 1996-03-11 2004-11-23 David Baltimore Truncated CRAF1 inhibits CD40 signaling

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9904669A2 (hu) 2000-05-28
JP2000515507A (ja) 2000-11-21
CA2259962C (en) 2002-01-22
US20030219437A1 (en) 2003-11-27
CN1227494A (zh) 1999-09-01
IL127884A0 (en) 1999-10-28
IS4935A (is) 1998-12-23
NO990019L (no) 1999-03-08
NZ333602A (en) 2000-06-23
PL331104A1 (en) 1999-06-21
TR199900029T2 (xx) 1999-04-21
AU4229297A (en) 1998-02-02
EA199900091A1 (ru) 1999-08-26
BR9710264A (pt) 1999-08-10
AU731299B2 (en) 2001-03-29
EP0956030A1 (en) 1999-11-17
EP0956030A4 (en) 2001-11-28
CN1242809C (zh) 2006-02-22
SK499A3 (en) 1999-08-06
EA004401B1 (ru) 2004-04-29
CZ297300B6 (cs) 2006-11-15
US20080050369A1 (en) 2008-02-28
BG63489B1 (bg) 2002-03-29
BG103148A (en) 1999-10-29
PL188408B1 (pl) 2005-01-31
EE9900010A (et) 1999-06-15
HUP9904669A3 (en) 2001-06-28
NO990019D0 (no) 1999-01-04
WO1998001145A1 (en) 1998-01-15
CA2259962A1 (en) 1998-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018241099B2 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
US20230265189A1 (en) Anti-PD-1 Antibodies
AU2017210224B2 (en) Treatment of cancer with combinations of immunoregulatory agents
Yu et al. Phase I trial of a human-mouse chimeric anti-disialoganglioside monoclonal antibody ch14. 18 in patients with refractory neuroblastoma and osteosarcoma.
RU2192281C2 (ru) Способы и композиции для иммуномодуляции
JP2021138756A (ja) 腫瘍細胞の枯渇を亢進するための薬剤の組み合わせ
US20080050369A1 (en) Therapeutic applications of T-BAM (CD40L) technology to treat diseases involving smooth muscle cells
NZ531199A (en) Administration of an anti-PSGL-1 antibody for depletion and/or the induction of apoptosis in T cells and NK cells to treat autoimmunity conditions or a T cell cancer
EP1708961B1 (en) Anti-ip-10 antibodies
US11639385B2 (en) Anti-PD-1 antibodies
US7691591B2 (en) Methods of identifying and isolating cells expressing DC-sign
Kumamoto et al. TIRC7 is induced in rejected human kidneys and anti-TIRC7 mAb with FK506 prolongs survival of kidney allografts in rats
US9868792B2 (en) Methods of enhancing anti-tumor immunity by administering antibodies to the CCRL2 chemerin receptor

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20080703