CN1227494A - T-bam(cd40l)技术在治疗涉及平滑肌细胞的疾病中的治疗应用 - Google Patents

T-bam(cd40l)技术在治疗涉及平滑肌细胞的疾病中的治疗应用 Download PDF

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Abstract

通过将细胞与能抑制CD40L与细胞表面的CD40相互作用的物质接触在体内和体外抑制在细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD40配体(CD40L)的活化。在体内，具有CD40的平滑肌细胞的抑制被用于治疗平滑肌细胞依赖疾病。

Description

T-BAM(CD40L)技术在治疗涉及 平滑肌细胞的疾病中的治疗应用
本申请享有1996年7月8日提出的美国专利申请系列号08/677,730的优先权，其内容在此被加入到本申请中以作参考。
本文所公开的发明是在卫生部(Department of Health and HumanServices)的NIH拨款号K08-AR-01904,RO1-CA55713,RO1-AI-28367,RO1-AI-14969,HL21006,HL42833,HL50629和RO1-AI-14969的政府支持下进行的。因此，美国政府在本发明中享有一定的权利。
在本申请中，各种参考文献被归总在括号中。这些出版物的全文公开在此被加入到本申请以作参考，从而更全面地描述本发明所涉及的现有技术状况。这些参考文献的全部文献引用可在本文中找到或由实验详述部分之后的数字列出。
CD40是一种在各种细胞中表达的细胞表面分子，且与称为CD40L的30-33kDa活化诱导的CD4+T细胞反受体相互作用。在T细胞-B细胞相互作用中，CD40L-CD40相互作用已被广泛研究，并且其对于T细胞依赖的B细胞分化以及IgG,IgA和IgE的产生是必需的。CD40还在单核细胞、树突细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞中表达。在体外，这些细胞中的CD40表达由细胞因子，最显著的是IFN-γ正调节。令人感兴趣的是，体内研究已证实在炎症位点，例如类风湿性关节炎滑膜或牛皮癣斑点有明显正调节的CD40表达。使用抗CD40单克隆抗体或CD40L+细胞的体外研究证实CD40在单核细胞、树突细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞中功能性表达。
例如，CD40L-CD40相互作用诱导单核细胞分泌促炎细胞因子IL-Iα、IL1β、IL-6和TNF-α以及树突细胞分泌TNF-α。CD40L-CD40相互作用还促进单核细胞和树突细胞分泌趋化因子IL-8和MIP1α。而且，CD40连接增强胸腺上皮细胞的IL-1介导的GM-CSF的产生。此外，CD40L介导的信号诱导单核细胞分泌IL-10和氧化氮并增加成纤维细胞IL-6的产生。在CD40L-CD40相互作用后成纤维细胞也增殖。最后，在CD40连接后，内皮细胞和成纤维细胞正调节胞间粘着因子。
已用各种药物，包括降低胆固醇的药物、β阻断剂、钙通道阻断剂和抗凝血剂来治疗血管病，如动脉粥样硬化。目前已证实平滑肌细胞能表达CD40。这为通过抑制CD40与CD40配体(也称为T-BAM、5c8Ag、gp39和TRAP)之间的相互作用来治疗血管病提供了基础。涉及平滑肌的其他疾病也通过抑制CD40-CD40L相互作用来治疗。
本发明提供抑制细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD配体活化的方法，包括将细胞与能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质接触，其中该物质以有效抑制该细胞活化的量存在。
本发明提供在宿主中抑制细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD配体活化的方法，包括给予该宿主能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质，其中该物质以在该宿主中有效抑制细胞活化的量存在。
本发明提供在宿主中治疗平滑肌细胞依赖性疾病的方法，包括包括给予该宿主能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质，其中该物质以在该宿主中有效抑制细胞活化的量存在，从而治疗平滑肌细胞依赖性疾病。附图说明
图1A：静息人主动脉平滑肌细胞的FACS分析。虚线代表同型对照单克隆抗体；短划线代表抗CD54单克隆抗体；实线代表抗CD40单克隆抗体。该图表明平滑肌细胞不组成性地表达CD40。
图1B：在存在IFN-γ(1000U/cc)下，在细胞培养物中72小时后的人主动脉平滑肌细胞的FACS分析。该图表明对IFN-γ产生应答的平滑肌细胞CD40表达的正调节。
图1C：在存在IL-1α(1ng/cc)下，在细胞培养物中72小时后的人主动脉平滑肌细胞的FACS分析。未观察到平滑肌细胞CD40表达的正调节。
图1D：在细胞培养物中72小时后，在存在TNF-α(200U/cc)下，人主动脉平滑肌细胞的FACS分析。未观察到平滑肌细胞CD40表达的正调节。
图2A-Y：含残基Gly116-Leu261(在Brookhaven蛋白质数据库格式中)(SEQ ID NO:1)的人CD40L的可溶性细胞外片段的晶体结构的原子坐标。
图3A-3B：在与移植相关的动脉粥样硬化损伤部位的平滑肌细胞和巨噬细胞中CD40原位表达。显示的是二色免疫组织化学研究的显微照片，表明在患有与移植相关的动脉粥样硬化的病人中的图3A中的平滑肌细胞(红色染色)以及图3B中的巨噬细胞(红色染色)中的CD40表达(褐色染色)。
图4A-4B：用苏木精和伊红(图4A)以及抗CD40单克隆抗体(图4B)染色的来自患有特发性心肌炎的病人的正常冠状动脉。图4A：注意不存在内膜加厚或炎症感染。图4B:CD40的表达局限于贴附在血管腔的内皮细胞。对同型特异性对照单克隆抗体没有反应性(未显示)。(图4A，图4B×25)。
图5A-5B：用苏木精和伊红(图5A)以及抗CD40单克隆抗体(图5B)染色的患有局部缺血心肌病的病人的冠状动脉中的纤维动脉粥样硬化斑点。图5A：覆盖在部分钙化的动脉粥样硬化核心的纤维帽含有许多炎症细胞(箭头)。图5B：纤维帽中的大多数炎症细胞为强CD40+(箭头)。相邻的内膜平滑肌细胞和内皮细胞也为CD40+(图5A，图5B×25)。
图6A-6C：用苏木精和伊红(图6A)以及抗CD40单克隆抗体(图6B,6C)染色的患有与移植相关的冠状动脉疾病(TCAD)的病人中的在泡沫细胞中富集的早期内膜损伤。图6A：内膜损伤包含许多泡沫细胞，巨噬细胞和平滑肌细胞。图6B：在TCAD的早期损伤中，CD40在许多内膜细胞中强烈表达。图6C：特别是，泡沫细胞显示大量的对CD40的染色。(图6A×25，图6B×50，图6C×400)。
图7A-7D：在用抗CD40L单克隆抗体(图7A)，对照单克隆抗体(图7B)，抗CD4单克隆抗体(图7C)和抗CD8单克隆抗体(图7D)标记的天然CA中的内膜损伤的纤维帽中存在的炎症感染。图7A：仅局限于淋巴细胞的特征性胞质和细胞表面CD40L的免疫反应性。图7B：用无关的同型配对对照单克隆抗体染色的相同损伤未显示免疫染色。图7C：事实上天然CA损伤中的所有淋巴细胞(以及许多巨噬细胞和泡沫细胞)是CD4+，表明CD40L+淋巴细胞为CD4+T细胞。图7D：在天然CA的内膜斑点中，CD8+T细胞很少。(图7A,7B×1000，图7C,7D×400)。
图8A-8C：在用抗CD40L单克隆抗体(图8A)，对照单克隆抗体(图8B)，抗CD4单克隆抗体(图8C)标记的TCAD中的深处内膜淋巴聚集物。图8A：在内膜中以及远离内皮表面的淋巴聚集物中发现了TCAD中的大多数CD40L+细胞(箭头)。图8B：无关同型配对对照单克隆抗体表明在该内膜淋巴聚集物中没有细胞染色。图8C：如上相同的内膜淋巴聚集物差不多只包含CD4+T细胞，表明在这些损伤中CD40L在CD4+T细胞中表达(图8A-8C×400)。
图9A-9B：用抗CD8(图9A)和抗CD40L(图9B)单克隆抗体染色的TCAD中的内皮炎病灶。图9A：与对内皮炎为特征性的TCAD中的腔内皮细胞相连的CD8+T细胞。大多数CD8+T细胞存在于内皮炎的病灶中，而它们很少出现在远离内皮表面的内膜淋巴聚集物中。图9B：内皮炎病灶中的炎症细胞为CD40L+。类似地，在内皮细胞中未检测到CD40L的表达(图9A-9B×400)。
图10A-10B：图10A：用抗CD40单克隆抗体(褐色)和作为巨噬细胞标记物的抗CD68单克隆抗体(红色)对天然CA的内膜损伤的双免疫标记。细胞的中心群(箭头)显示出强的对CD40和CD68的染色。图10B：用抗CD40单克隆抗体(褐色)和抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(红色)对TCAD的双免疫标记证实了CD40+平滑肌细胞(箭头)。CD40反应性局限于内膜平滑肌细胞(箭头)，而内侧的肌原细胞为CD40-。(图10A-B×400)。
图11A-11D：天然CA的系列区说明了内膜新血管形成，并被用抗CD34(图11A)，抗CD40(图11B)，抗ICAM-1(图11C)和抗VCAM-1(图11D)单克隆抗体染色。图11A：用CD34染色突出的内膜新血管的内皮细胞。图11B：内膜新血管内皮细胞强烈表达CD40。相邻的炎症细胞也可标记CD40。图11C,11D：新血管形成的病灶也显示强烈的对ICAM-1(图11C)和VCAM-1(图11D)的内皮反应性(图11A-11D×400)。
图12A-12C：在用抗CD40单克隆抗体(褐色)和粘着分子(红色)抗ICAM-1单克隆抗体(图12A)，抗VCAM-1单克隆抗体(图12B)和无关对照单克隆抗体(图12C)对天然CA的活化刺激的内膜损伤的双免疫标记。图12A：事实上所有的CD40+(褐色)细胞，主要是巨噬细胞(长箭头)，和内膜肌原细胞(短箭头)对ICAM-1(红色)强烈反应。图12B：许多CD40+(褐色)炎症细胞和内膜肌原细胞(箭头)也对VCAM-1(红色)反应。图12C：对代替抗ICAM-1和抗VCAM-1单克隆抗体(红色)的CD40(褐色)和无关同型配对对照抗体双标记的相同的内膜损伤。仅分辨出了褐色染色而没有红色染色，表明不存在顺序应用抗CD40和抗ICAM或抗VCAM单克隆抗体的检测技术的干扰(参见材料和方法)。(图12A-C×400)。
图13：用抗p65单克隆抗体标记活化的NF-kB(褐色)和CD40(红色)对天然CA的内膜损伤的双免疫标记。在CD40+细胞的核中仅仅分辨出活化的NF-kB(箭头)，其中大多数为巨噬细胞(×400)。
本发明提供一种抑制细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD40配体活化的方法，包括将细胞与能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质接触，其中该物质以有效抑制该细胞活化的量存在。在本发明的一个具体实施方案中，该物质能抑制CD40配体与CD40之间的任何相互作用。“CD40配体与细胞表面的CD之间的相互作用”指CD40-CD40配体一个或多个功能或结构方面的相互作用。因此，在一个具体实施方案中，抑制相互作用的物质可竞争性地与CD40配体结合以此方式来阻断或减少CD40配体与细胞CD40的结合。在另一个具体实施方案中，抑制相互作用的物质可以不抑制CD40配体与细胞CD40结合的方式与CD40或CD40配体结合，但它影响对CD40连接的细胞应答，例如通过改变细胞CD40或CD40-物质复合物的转化率，或通过改变CD40与CD40配体的结合动力学，或通过改变在对CD40连接的应答中细胞活化的比例或程度。
在具体的实施方案中，具有CD40的平滑肌细胞为膀胱平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、支气管平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞、肺平滑肌细胞或胃肠道平滑肌细胞。在更具体的实施方案中，胃肠道平滑肌细胞为食管、胃或肠道平滑肌细胞，包括小肠或大肠(肠)平滑肌细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，该物质抑制CD40配体与细胞表面的CD40的结合。
在本发明的一个具体实施方案中，该物质为蛋白质。
在本发明的另一个具体实施方案中，该物质为非蛋白质。如本文所采用的，术语非蛋白质包括任何或所有包含除简单或共轭多肽链外的部分的化合物或物质。这包括例如具有非肽键的氨基酸的成分；非蛋白氨基酸，如β、γ或δ氨基酸、D构型氨基酸或其他非蛋白氨基酸，包括高半胱氨酸、高丝氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸或β-氰基丙氨酸；单糖、多糖或碳水化合物部分；脂肪酸或脂质部分；核苷酸部分、无机物部分；或其他非蛋白分子。
在本发明的另一个实施方案中，该物质为肽模拟化合物。肽模拟化合物可至少部分为非天然的。肽模拟化合物可为小分子模拟物。由于为模拟物，该化合物可具有提高的稳定性、功效、效价和生物利用度。而且，该化合物可具有降低的毒性。肽模拟化合物可具有改善的肠粘膜通透性。可合成制备该化合物。本发明的化合物可包括L-,D-或非天然氨基酸，α、α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸(丙氨酸的等电类似物)。该化合物的肽骨架可具有至少一个被PSI-[CH=CH]替代的键(Kempf等(1991)国际肽和蛋白质研究杂志38,237-241)。该化合物可进一步包括三氟酪氨酸、对氯苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、多-L-炔丙基甘氨酸、多-D,L-烯丙基甘氨酸或多-L-烯丙基甘氨酸。
在本发明的另一个具体实施方案中，具有抑制CD40配体与细胞表面的CD相互作用的生物活性的肽模拟化合物可具有一个键，肽骨架或被适宜模拟物替代的氨基酸部分。可为适宜氨基酸模拟物的非天然氨基酸的实例包括β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸、L-γ氨基丁酸、L-α氨基异丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、半胱氨酸(乙酰氨基甲基)、N-∈-Boc-N-α-CBZ-L-赖氨酸、N-∈-Boc-N-α-Fmoc-L-赖氨酸、L-甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正颉氨酸、N-α-Boc-N-δCBZ-L-鸟氨酸、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鸟氨酸、Boc-对硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羟基脯氨酸、Boc-L-硫代脯氨酸(Blondelle,S.E.等(1994)抗微生物剂和化学疗法38,2280-2286；Pinilla,C.等(1995)肽科学37,221-240)。
在一个具体的实施方案中，蛋白质包括能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的的抗体或其一部分。抗体为单克隆或多克隆抗体。在一个更具体的实施方案中，单克隆抗体特异性地与单克隆抗体5c8(ATCC登记号为HB10916)特异性与其结合的表位结合。该单克隆抗体的一个实例为单克隆抗体5c8(ATCC登记号为HB10916)。在另一个具体实施方案中，抗体特异性地与CD40结合。抗CD40抗体的一个实例为单克隆小鼠抗人CD40，其可从Genzyme CustourerService(product 80-3702-01,Cambridge,MA)获得。在另一个具体实施方案中，单克隆抗体为嵌合抗体，灵长类源化抗体，人源化抗体或包含来自第一个人的CDR区的抗体和来自第二个人的支架的抗体。
“嵌合”，“灵长类源化”和“人源化”抗体的含义以及制备它们的方法对于本领域技术人员来讲是熟知的。参见例如1990年7月26公开的PCT国际申请号WO 90/07861(Queen等)；和Queen等Proc.Natl Acad.Sci.USA(1989)86:10029。制备灵长类源化抗体的方法公开在例如对应于国际申请号PCT/US92/06194的PCT国际申请公开号WO/02108(Idec药物)；和Newman等，生物技术(1992)10:1455-1460中，它们被引入本申请以作参考。
通常，人源化抗体为包含一个或多个功能性地与人框架部分相连的非人抗体的互补性决定区(CDRs)的抗体。可任选存在其他与非人抗体相关的其它部分。通常，至少一个重链或一个轻链包含非人CDRs。通常，非人互补性决定区为小鼠互补性决定区。一般来讲，灵长类源化抗体为包含一个或多个功能性地与非人灵长类的框架区部分连接的除非人灵长类外的种类的抗体的互补性决定区(CDRs)的抗体。可任选存在与其中CDR从中产生的种类相关的其它部分。通常，至少一个重链或一个轻链包含不是非人灵长类种类的互补性决定区。典型地，互补性决定区为人互补性决定区。一般，嵌合抗体为其轻链和/或重链含来自不同种类的区域的抗体。例如，一个种类的一个或多个可变(V)区部分可与另一个种类的一个或多个恒定(C)区部分相连。虽然可采用其他的哺乳动物种类，但通常嵌合抗体包含与人恒定区部分相连的小鼠的可变区部分。
通过杂交瘤细胞产生单克隆抗体，其中根据用于专利程序目的的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约的条款，该杂交瘤细胞于1991年11月14日保藏在美国典型培养物中心(ATCC),12301 ParklawnDrive Rockville，马里兰州20852，美国。该杂交瘤的ATCC登记号为10916。
在一个具体的实施方案中，抗体的某部分包含轻链或重链的互补决定区或可变区。在另一个具体实施方案中，抗体的该部分含互补决定区或可变区。在另一个具体实施方案中，抗体的该部分包含Fab或单链抗体。单链抗体由在单蛋白链中通过蛋白间隔区相连的可变区组成。
在另一个具体实施方案中，该蛋白包含能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的CD40配体，其一部分或其变异体的可溶性细胞外区；或能抑制细胞中CD40配体与CD40相互作用的CD40，其一部分或其变异体的可溶性细胞外区。在一个具体的实施方案中，CD40配体或CD40的可溶性细胞外区为单体。在另一个具体实施方案中，CD40的可溶性细胞外区为寡聚体。
变异体可在氨基酸序列上或以不涉及序列或两种序列的方式不同于天然存在的CD40或CD40配体。当天然存在的CD40或CD40配体中的一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸置换时产生氨基酸序列的变异体。特别优选的变异体包括天然存在的CD40或CD40配体，或天然存在的CD40或CD40配体的生物活性片段，其序列因一个或多个保守氨基酸取代与野生型序列不同它们通常对蛋白质或肽的二级结构和疏水性具有最小的影响。变异体还可具有因一个或多个非保守氨基酸的取代，缺失或插入而不同的序列，其不影响CD40或CD40配体生物活性。保守取代通常包括用具有类似特性的氨基酸取代另一个氨基酸，例如下面组中的取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷胺酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸和苯丙氨酸，酪氨酸。非极性氨基酸(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
可从表1中看到其他保守取代，且其它的见Dayhoff在蛋白质序列和结构图谱中(1988)描述。
表1：保守氨基酸取代
氨基酸 代码 用下面任一氨基酸取代
丙氨酸 A D-Ala,Gly,β-Ala,L-Cys,D-Cys
精氨酸 R D-Arg,Lys,homo-Arg,D-homo-Arg,Met,D-Met,Ile,D-Ile,Orn,D-Orn
天冬酰胺 N D-Asn,Asp,D-Asp,Glu,D-Glu,Gln,D-Gln
天冬氨酸 D D-Asp,D-Asn,Asn,Glu,D-Glu,Gln,D-Gln
半胱氨酸 C D-Cys,S-Me-Cys,Met,D-Met,Thr,D-Thr
谷氨酰胺 Q D-Gln,Asn,D-Asn,Glu,D-Glu,Asp,D-Asp
谷氨酸 E D-Glu,D-Asp,Asp,Asn,D-Asn,Gln,D-Gln
甘氨酸 G Ala,D-Ala,Pro,D-Pro,Beta-Ala,Acp
异亮氨酸 I D-Ile,Val,D-Val,Leu,D-Leu,Met,D-Met
亮氨酸 L D-Leu,Val,D-Val,Met,D-Met
赖氨酸 K D-Lys,Arg,D-Arg,homo-Arg,D-homo-Arg,Met,D-Met,Ile,D-Ile,Orn,D-Orn
甲硫氨酸 M D-Met,S-Me-Cys,Ile,D-Ile,Leu,D-Leu,Val,D-Val,正亮氨酸
苯丙氨酸 F D-Phe,Tyr,D-Thr,L-Dopa,His,D-His,Trp,D-rp，反3,4或5-苯基脯氨酸，顺3,4或5苯基脯氨酸
脯氨酸 P D-Pro,L-I-硫代噁唑烷-4-羧酸，D-或L-1-噁唑烷-4-羧酸
丝氨酸 S D-Ser,Thr,D-Thr,allo-Thr,Met,D-Met,Met(O),D-Met(O),Val,D-Val
苏氨酸 T D-Thr,Ser,D-Ser,allo-Thr,Met,D-Met,Met(O),D-Met(O),Val,D-Val
酪氨酸 Y D-Thr,Phe,D-Phe,L-Dopa,His,D-His
缬氨酸 V  D-Val,Leu,D-Leu,Ile,D-Ile,Met,D-Met
本发明的其他变异体为具有增加肽稳定性的修饰的那些。该变异体在肽序列中可包含，例如一个或多个非肽键(它代替肽键)。还包括：包含非天然存在的L-氨基酸残基的变异体，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸和环状变异体。用D-氨基酸代替L-氨基酸掺入到多肽中可增加其对蛋白酶的耐受。参见如美国专利5,219,990。
本发明肽也可通过各种保守或非保守的变化，如插入，缺失和取代来修饰，其中这些变化可在它们的应用中提供一些优点。
在其他具体实施方案中，具有保守性较少的氨基酸取代的变异体也可通过如电荷，构型和其他生物特性的改变来产生所需的衍生物。这些取代包括如亲水性残基取代疏水性残基，半胱氨酸或脯氨酸取代其他残基，具有小侧链的残基取代具有大侧链的残基或带净正电的残基取代带净负电的残基。当取代结果不能被肯定地预测时，根据本文公开的方法可容易地分析该衍生物以确定所需特性的存在与否。
本发明范围中的变异体包括具有与CD40的细胞外区或CD40配体的细胞外区具有至少80％同源性的氨基酸序列的蛋白质和肽。较优选，序列同源性为至少90％，或至少95％。
正如可代替支架的组成一样，也可取代功能性基团，其中该功能性基团可用类似特征的基团修饰支架。这些取代开始是保守的，即该替代基团将具有与原来基团差不多的相同大小，形状，疏水性和电荷。非序列修饰可包括：例如对天然存在的CD40或CD40配体的某部分的体内或体外化学修饰，以及乙酰化，甲基化，磷酰化，羧化或糖基化修饰。
在另一个具体实施方案中，包括CD40配体和CD40细胞外区的蛋白质被化学修饰所修饰，其中活性被保留。例如，蛋白质可被酰胺化，硫酸化，单或多卤代，烷基化，羧化或磷酸化。蛋白质也可被如乙酰基，法呢基部分，或饱和，单不饱和或多不饱和脂肪酸单和多酰化。脂肪酸也可被单或多氟化。本发明还包括蛋白质的甲硫氨酸类似物，例如甲硫氨酸砜和甲硫氨酸亚砜类似物。本发明还包括蛋白质的盐，如铵盐，包括烷基或芳基铵盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、硫代硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、苯甲酸盐、磺酸盐、硫代磺酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐和苯磺酸盐。
可溶性单体CD40-L蛋白可包括CD40-L细胞外区的全部或一部分。CD40-L的细胞外区包含与CD40结合的区域。因此，可溶性的CD40-L可抑制CD40L与含有CD40的细胞的相互作用。本发明预测sCD40-L可构成含与CD40结合的区域的CD40-L或片段或衍生物的完整细胞外区。
可溶性CD40蛋白(sCD40)包含CD40的细胞外区。sCD40抑制CD40L与含有CD40细胞的相互作用。sCD40可为单体或寡聚体形式。
在本发明的另一个具体实施方案中，包含CD40的可溶性细胞外区或其一部分的蛋白进一步包含与CD40的细胞外区或其一部分融合的Fc区。在一个具体的实施方案中，Fc区能与蛋白A或蛋白G结合。在另一个具体实施方案中，Fc区包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。
可使用常规的酶方法，通过切断和连接来自所需序列的片段来制备可溶性CD40/Fc融合蛋白。融合蛋白适宜的Fc区为可与蛋白A或蛋白G结合，或能被可用于纯化或检测包含Fc区的融合蛋白中的抗体识别的Fc区。例如，Fc区可包括人IgG1或鼠IgG1的Fc区。本发明还提供编码CD40/Fc融合蛋白的核酸分子。
已熟知通过重组方法产生可溶形式的膜分子的方法，其中缺失编码跨膜和胞质区的序列。通常参见Hammonds等，美国专利号5,057,417。此外，已熟知制备sCD40和CD40/Fc融合蛋白的方法。参见如PCT国际申请No.WO93/08207；Fanslow等“可溶形式的CD40抑制人B细胞的生物应答”，免疫学杂志，149卷，pp655-60(1922年7月)。
在本发明的一个具体实施方案中，该物质通过筛选方法来选择。
在一个具体实施方案中，该物质用筛选方法选择，它包括分离细胞样品；在允许含有CD40的细胞活化的条件下培养样品；将样品与有效活化含有CD40细胞的表达被由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白，或与有效活化含有CD40细胞被具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白接触；如果物质能抑制含有CD40细胞活化，则将样品与有效量的抑制含有CD40细胞活化的物质接触；并测定在存在该物质时，表达被由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别蛋白的细胞，或被具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白是否活化含有CD40细胞。细胞样品可从不同组织中分离，包括培养物中的细胞系或从动物中分离的细胞，如来自固体组织的分散细胞、来自骨髓活体的细胞，或从如血液或淋巴液的体液中分离的细胞。
在另一个具体实施方案中，根据能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的CD40配体的可溶性细胞外区或其一部分的三维结构来选择物质(分子)。该物质可从已知物质库中选择，或根据三维结构从已知物质修饰而来，或根据三维结构从头设计或合成。在一个具体实施方案中，根据CD40配体的可溶性细胞外区或其一部分与先导抑制剂的复合物的三维结构，通过先导抑制剂的结构最优化设计该物质(分子)。先导抑制剂为已被鉴定的分子，其中当与CD40配体接触时，它与CD40配体，CD40或其一部分的可溶性细胞外区结合或复合，从而降低复合或结合的CD40配体或CD40配体的一部分活化含有CD40细胞的能力。在另一个具体实施方案中，先导抑制剂可通过与CD40配体或CD40的细胞外区，或在三级复合物中与CD40配体和CD40的一部分相互作用，从中降低复合的CD40配体-CD40活化含有CD40细胞的能力。在本发明的方法中，CD40配体可为可溶性的或与细胞结合，如活化的T细胞，并可为足够长度的天然CD40配体或其一部分。可以不同方式测定降低的活化含有CD40细胞的能力。一种可测定它的方法为通过与在类似条件下，不存在抑制剂时，用相似量的CD40配体处理细胞比较，显示在存在抑制剂时，CD40配体产生的含有CD40细胞的活化程度降低。活化含有CD40细胞的能力降低也可通过与未结合的CD40配体比较，在类似条件下产生类似程度的含有CD40细胞的活化所需的更高浓度的抑制剂-CD40配体复合物来说明。极端地，在允许通过未结合的CD40配体或其指定部分活化这些细胞的浓度和条件下，与抑制剂接触的CD40配体可能不能活化含有CD40的细胞。
可通过计算机筛选法，使用包含残基Gly116-Leu261的人CD40L(sCD40L(116-261))的细胞外区的可溶性片段晶体结构来选择物质(分子)。
已通过分子置换法，以2A的分辨率确定了筛选法中使用的晶体结构。简单地说，首先制备可溶性形式的包含氨基酸残基Gly116至C末端残基Leu 261的人CD40配体的细胞外区的可溶性片段，接着纯化和结晶。晶体被用来收集衍射数据。用XPLOR程序包和QUANTA(分子模拟公司)软件进行分子置换和精制。尤其是，使用鼠CD40L模型，用QUANTA蛋白质同源性模型软件构建人sCD40L的三维模型。该模型被用作用于晶体学分析计算的探针并使用XPLOR精制。确定sCD40L的晶体结构的方法更详细地描述在Karpusas等“人CD40配体的细胞外区的2晶体结构”，结构(1995,10)3(10):1031-1039。sCD40L(116-261)的原子坐标提供在图2A-Y中。用于选择物质的筛选方法包括如下所述的计算机药物设计和迭代结构最优化。
物质可为使用计算机药物设计选择的抑制剂。使用该方法，sCD40L的晶体结构坐标被用作如DOCK的计算机程序的输入数据，它输出一系列预期与CD40L结合的分子结构。该计算机程序的使用已为熟知。参见如Kuntz“基于结构的用于药物设计和发现的策略”，科学，257卷，p1078(1992)。接着可通过对CD40L结合的生化分析筛选分子结构表。可使用熟知的竞争类型的生化分析。参见如Baiorath等“对于受体-配体相互作用至关重要的CD40和其配体的残基的鉴定”生物化学，34,p1833(1995)。因此，被发现与CD40L结合的结构可用作本发明的物质。由结构最优化的相互作用循环所证实，该物质也可为被修饰或设计的分子。使用该方法，使用上述计算机程序和其他方法找到的CD40L的小分子抑制剂可与sCD40L一起共结晶，且该复合物的晶体结构可通过分子置换解决。通过分子置换揭示的信息可通过探明分子如何与CD40L相互作用而被用来最优化抑制剂的结构。该分子可被修饰以改善其理化性质，包括对CD40L的特异性和亲和性。
在本发明的一个具体实施方案中，物质为小分子。如本文所采用的，小分子为具有20Da-1×106Da，优选50Da-2KDa分子量的化合物。
本发明还提供一种在宿主中，抑制细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD40配体活化的方法，包括对宿主施用能抑制CD40配体与细胞表面的CD40的相互作用的物质，其中该物质以有效抑制宿主中细胞活化的量存在。
在具体的实施方案中，含有CD40的平滑肌细胞为膀胱平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、支气管平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞、肺平滑肌细胞或胃肠道平滑肌细胞。在更具体的实施方案中，胃肠道平滑肌细胞为食管、胃或肠道平滑肌细胞，包括小肠或大肠(肠)平滑肌细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，该物质抑制CD40配体与细胞上CD40的结合。
在本发明的一个具体实施方案中，该物质为蛋白质。在本发明的另一个具体实施方案中，该物质为非蛋白质。
在一个具体的实施方案中，蛋白质包括能抑制CD40配体与细胞上面的CD40相互作用的抗体或其一部分。抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在一个更具体的实施方案中，单克隆抗体特异性地与单克隆抗体5c8(ATCC登记号为HB10916)特异性与表位结合的表位结合。该单克隆抗体的一个实例为单克隆抗体5c8(ATCC登记号为HB10916)。在另一个具体实施方案中，单克隆抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
在一个具体的实施方案中，抗体的一部分包含轻链或重链的互补决定区或可变区。在另一个具体实施方案中，抗体的该部分包括互补决定区或可变区。在另一个具体实施方案中，抗体的该部分包含F抗体或单链抗体。
在另一个具体实施方案中，蛋白质包含能抑制CD40配体与细胞上CD40相互作用的CD40配体可溶性细胞外区或其一部分；或能抑制CD40配体与细胞上CD40相互作用的CD40的可溶性细胞外区或其一部分。在一个具体的实施方案中，CD40配体或CD40的可溶性细胞外区为单体。在另一个具体实施方案中，CD40的可溶性细胞外区为寡聚体。
在本发明的另一个具体实施方案中，包含CD40的可溶性细胞外区或其一部分的蛋白进一步包含与CD40细胞外区或其一部分融合的Fc区。在一个具体的实施方案中，Fc区能与蛋白A或蛋白G的结合。在另一个具体实施方案中，Fc区包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。
当给药时，蛋白质通常迅速地被从循环中清除，从而产生相对短寿命的药物学活性。结果，需要经常注射相对大剂量的生物活性蛋白以维持治疗功效。通过与如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸的水溶性聚合物的共价连接而修饰的蛋白已知在静脉注射后从实质上显示比相应的未修饰的蛋白更长的血液半衰期(抗体uchowski等，在“作为药物的酶”，Holcenberg等编Wiley-Interscience，纽约，NY,367-383(1981；Anderson,W.F.(1992)人基因治疗科学256:808-813；Newmark等(1982)应用生物化学杂志4:185-189；和Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:1487-1491(1987))。这些修饰还可增加蛋白质在水溶液中的溶解性，消除聚集，增加蛋白质的物理和化学稳定性以及大大降低蛋白质的免疫原性和抗原性。结果，通过比未修饰蛋白更少次或更低剂量地给药该聚合物-蛋白质加合物可获得所需的体内生物学活性。
由于PEG在哺乳动物中具有非常低的毒性，所以将聚乙二醇与蛋白质相连尤其有用(Carpenter等1971)。例如，在美国，腺苷脱氨酶的PEG加合物已被批准用于人类治疗严重的混合型的免疫缺乏综合症。PEG结合物提供的第二个优点是有效降低异源蛋白质的免疫原性和抗原性。例如，人蛋白质的PEG加合物可用于治疗其他哺乳动物种类的疾病而不具有引发严重免疫应答的危险。在本发明的一个具体实施方案中，可以微囊化手段递送蛋白质以降低或防止抗蛋白质的宿主免疫应答。还可以微胶囊化在膜中的形式递送蛋白质，如脂质体的形式。
可方便地将聚合物如PEG与蛋白质中的一个或多个活性氨基酸残基相连，如氨基末端氨基酸的α-氨基、赖氨基侧链的ε-氨基、半胱氨酸侧链的巯基、天冬氨酰和谷氨酰侧链的羧基、C末端氨基酸的α-羧基、酪氨基侧链，或与跟一些天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基相连的糖基链的活化衍生物连接。
已描述了许多适宜于与蛋白质直接反应的PEG活化形式。可用于与蛋白质氨基基团反应的PEG试剂包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，尤其是其中离去基团为N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、咪唑或1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸盐的那些。含有马来酰亚胺基或卤代乙酰基基团的PEG衍生物为可用于无巯基基团蛋白质修饰的试剂。同样，含有氨基肼或酰肼基团的PEG试剂可用于与由蛋白质糖类基团的高碘酸氧化产生的醛反应。
可用上述方法治疗的宿主为动物。优选该动物为哺乳动物。可被治疗的哺乳动物的实例包括，但不局限于人、非人灵长类、啮齿类(包括大鼠、小鼠、苍鼠和豚鼠)，牛、马、羊、猪、狗和猫。
在本发明的一个具体实施方案中，用筛选法选择物质。
在一个具体实施方案中，用筛选法选择该物质，它包括分离细胞样品；在允许含有CD40的细胞活化的条件下培养样品；将样品与有效活化含有CD40细胞的表达被具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白的细胞，或与有效活化含CD40细胞的且被具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白接触；如果物质能抑制含有CD40细胞活化，则将样品与有效量的抑制含有CD40细胞活化的物质接触；并测定在存在该物质时，表达被具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白的细胞，或被具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白是否活化含有CD40细胞。细胞样品可从不同组织中分离，包括培养物中的细胞系或从动物中分离的细胞，如来自固体组织的分散细胞、来自骨髓活体的细胞，或从如血液或淋巴液的体液中分离的细胞。
在另一个具体实施方案中，根据能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的CD40配体的可溶性细胞外区或其一部分的三维结构来选择物质(分子)。该分子可从已知分子库中选择，或根据三维结构从已知分子修饰而来，或根据三维结构从头设计或合成。在一个具体实施方案中，根据CD40配体的可溶性细胞外区或其一部分与先导抑制剂的复合物的三维结构，通过先导抑制剂的结构最优化设计该物质(分子)。治疗方法
本发明提供一种包括上述抑制在细胞表面含有CD40的平滑肌细胞的CD40配体活化的方法的治疗宿主平滑肌细胞依赖疾病的方法，包括给予宿主能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质，其中该物质以有效抑制宿主细胞活化的量存在。
在本发明的一个具体实施方案中，平滑肌细胞依赖疾病为血管病。在一个特定的具体实施方案中，血管病为动物粥样硬化。
在另一个具体实施方案中，平滑肌细胞依赖疾病为胃肠道疾病。在一个特定的具体实施方案中，胃肠道疾病选自食管异常游动性、炎症性肠道疾病和硬皮病。
在一个具体实施方案中，平滑肌细胞依赖疾病为膀胱疾病。
可用医学上可接受的任何方式给药予本发明化合物。这包括注射，胃肠外途径，如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌肉内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内或其他方式以及口、鼻、眼、直肠、局部或吸入。持续释放给药也特定地包括在本发明中，将这些方式作为外科手术中直接运用的对易受侵蚀的移植物的给药注射。
以医学上可接受的任何剂量/体重和任何剂量频率给予化合物。可接受的剂量包括约0.01-200mg/Kg宿主体重的范围。优选的剂量范围为约0.1-50mg/Kg之间。尤其优选的是约1-30mg/Kg之间的剂量。以每天至个月的间隔重复该剂量。一个优选的给药方案是在治疗的开始3天每天给予本发明化合物，此后每3周给予化合物，其中每次为静脉给药5或10mg/Kg。另一个优选的方案为治疗的开始3天每天静脉内给药5mg/Kg本发明化合物，此后每周以10mg/宿主经皮下或肌肉内给药化合物。另一个优选的方案为以20mg/Kg体重经胃肠外给予单剂的本发明的化合物，接着每周以10mg/宿主经皮下或肌肉内给予化合物。
可以单剂的形式给药本发明的化合物以用于某些适应症，如防止宿主短时间暴露于抗原产生的抗原的免疫应答，如在治疗的某一天给予的外源抗原。该抗原的实例包括同时给予本发明化合物和基因治疗载体或治疗剂，如抗原药物或血液产品。在抗原缓慢出现的适应症中，如在控制对移植组织或缓慢给药的抗原药物的免疫反应中，以一定的间隔，在如医学上指示的从数天，数星期至宿主终身的时间内给予本发明化合物。
由于伴随有水肿的毛细血管扩张和吞噬白细胞的迁移的结果，炎症反应的特征表现为发红、肿胀、发热和疼痛。炎症进一步由Gallin定义(第26章，基础免疫学，第二版，Raven出版，纽约，1989,pp721-733)，其被本文引作参考。
从下面的实验详述中将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员容易理解如后面权利要求中更全面描述的，所讨论的具体的方法和结果仅仅只是说明本发明。实验详述
下面的实施例1和2证实炎症细胞因子诱导平滑肌细胞表达CD40。而且，它们表明CD40介导的信号调节平滑肌细胞的功能。实施例1
FACS被用来研究是否平滑肌细胞表达CD40。在6孔平板中，将人主动脉平滑肌培养在补充有25％FCS,5％人血清，肝素90ug/ml，内皮细胞生长因子15ug/ml和1％青霉素-链霉素的M199培养基中。每2-3天更换培养基，并且当细胞接近铺满时，在存在或不存在IFN-γ(1000U/cc),IL-1α(1ng/cc)或TNF-α(200U/cc)下，将它们培养72小时。用胰蛋白酶-EDTA处理收集细胞，并使用抗CD40单克隆抗体G28.5，通过FACS分析测定CD40的表达。还用同型阴性对照单克隆抗体将细胞染色，并使用抗-CD54(ICAM-1)单克隆抗体作为阳性对照。
如图1A所证实，平滑肌细胞不组成性地表达CD40。然而，与IL-1α或TNF-α相反，IFN-γ正调节平滑肌细胞的CD40的表达(图1A,1B和1C)。这些研究证明IFN-γ正调节人主动脉平滑肌中的CD40的表达。实施例2
就地测定平滑肌细胞的CD40的表达。在正常血管的培养基中发现的形态学上与平滑肌细胞相似的细胞不与抗CD40单克隆抗体反应。然而，在与移植相关的加速动脉粥样硬化的炎症损伤中发现的在形态学上与平滑肌细胞相似的细胞原位表达CD40。这些研究表明炎症细胞因子诱导平滑肌细胞表达CD40。而且，这些研究证实CD40L介导的信号调节平滑肌细胞的功能。实施例3
CD40L+CD40+T细胞和CD40+靶细胞出现在动脉粥样硬化和移植冠状动脉疾病中
活化的内皮细胞(EC)，巨噬细胞(Mac)和CD4+T细胞早期出现在冠状动脉粥样硬化(CA)和心移植动脉粥样硬化(TA)的损伤中。由于CD40L为一种将接触依赖活化信号递送到CD40+靶细胞的活化诱导的CD4+T细胞表面因子，因此我们研究了在CA(n=5)和TA(n=5)中的原位CD40L和CD40表达，其中CD40+靶细胞包括EC(正调节ICAM、VCAM和E-选择表达)和Mac(诱导NO,TNF-α和IL-1的产生)。使用抗CD40L单克隆抗体5C8，抗CD40单克隆抗体G28.5或适宜的对照单克隆抗体测定CD40L和CD40的表达。正常冠状动脉的冷冻切片(n=3)不含有T细胞，CD40的表达局限于EC。相反，如通过对连续切片的免疫标记所证实的，与CA和TA相关的损伤含有CD40L+CD4+T细胞。另外，来自患有CA和TA的病人的冰冻切片中，CD40的表达在内皮细胞、侵染单核细胞、泡沫细胞和内膜平滑肌细胞(SMC)中明显被正调节。使用SMC(平滑肌肌动蛋白)或Mac(HAM-56)特异性标记物对石蜡固定组织的二色免疫组织化学分析证实了这些细胞中的CD40表达。令人感兴趣的是，远离炎症细胞的内膜SMC和中膜SMC为CD40+，表明在体内局部炎症介导物正调节SMC中CD40的表达。在TA的所有阶段发现CD40正调节和CD40L+CD4+T细胞，并在CA的早期损伤包括脂肪条斑中最显著。总之，这些研究表明CD40L+T细胞可与CA和TA中的CD40+靶细胞相互作用，并通过促进炎症原分子的产生导致这些疾病的发病。实施例4:CD40在移植动脉粥样硬化损伤中的平滑肌细胞和巨噬细胞中表达
用二色免疫组织化学分析研究在自然动脉粥样硬化或与移植相关的动脉粥样硬化中的CD40的原位表达。对被固定在10％福尔马林缓冲液并被用石蜡包埋的冠状动脉中进行双标记免疫组织化学分析。将切片在二甲苯中脱蜡，水合，并用1/5％H2O2的80％乙醇溶液淬灭内源过氧化物酶。接着在37℃下，将切片用0.01％胃蛋白酶的盐酸溶液(pH1.5)消化15分钟。然后，将切片用PBS漂洗，与10％马血清一起保温20分钟以阻止非特异性染色。利用Vector ABC Elite盒(Vector)，依次使用生物素标记的第二抗体、亲和素-过氧化物酶复合物和3,3’二氨基联苯作为显影剂检测抗CD40染色。观察到CD40的存在为褐色染色。此后，将切片用PBS漂洗，再用10％马血清阻断。将切片与对平滑肌细胞(平滑肌肌动蛋白)或巨噬细胞(HAM 56)特异性的单克隆抗体一起保温1小时。使用亲和素-生物素体系(Vector)将一抗与碱性磷酸酶共轭。Vector Red(Vector)被用来检测碱性磷酸酶活性和产生红色反应的染色。因此，双标记细胞被染成褐色(CD40)和红色(平滑肌细胞或巨噬细胞)。为了控制用于双重标记分析的两种免疫组织化学方法之间的干扰，还对各样品的连续切片的CD40、平滑肌肌动蛋白或HAM56进行染色。参见图3A和3B。对照切片显示出相同的每个第一单克隆抗体与双染色切片相的免疫活性分布。实施例5：在自发冠状动脉粥样硬化和与移植相关的冠状动脉疾病中的CD40L和CD40的分布：CD40的表达与细胞间粘附分子，活化的NF-KB和T淋巴细胞之间的相互关系
T细胞在自发冠状动脉粥样硬化(CA)和与移植相关的冠状动脉疾病(TCAD)的发病中起作用，然而，对在这些损伤中T细胞与其他细胞相互作用机理了解不甚全面。CD40L是一种与包括巨噬细胞和内皮细胞的CD40+靶细胞相互作用的活化诱导的CD4+T细胞表面分子，并诱导包括ICAM-1和VCAM-1的促炎症分子的产生。而且，已知CD40的连接活化转录因子NF-KB。为了研究CD40L-CD40相互作用是否可能在CA或TCAD的发病中起作用，在从患有CA(n=10)或TCAD(n=9)的心脏异源移植受体获得的冠状动脉的冷冻切片中进行CD40L和CD40表达的免疫组织化学研究。使用两种不同的抗CD40L单克隆抗体，发现CD40L的表达局限在CA和TCAD的侵染淋巴细胞中。在两种疾病中的内膜内皮细胞、泡沫细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞中CD40的表达被显著地正调节。双重免疫标记证明许多CD40+细胞共表达ICAM-1、VCAM-1或活性形式的NF-KB。CD40、ICAM-1和VCAM-1表达的程度表明了与疾病的严重性和内膜淋巴细胞量的统计显著相关性。这些研究在一起证明了在CA和TCAD损伤中活化的CD40L+和CD40+细胞的存在，并表明CD40L介导与CD40+巨噬细胞、泡沫细胞、平滑肌细胞和/或内皮细胞的相互作用可导致这些疾病的发病。
一些方面的证据说明细胞介导的免疫机理导致自发冠状动脉粥样硬化(CA)(5-10)和与移植相关的冠状动脉疾病(TCAD)(11-13)特有的炎症损伤(1-4)。例如，表达如CD25和MHCⅡ型分子的活化标记的侵染内膜T细胞早期出现在这两种疾病的血管损伤进展中(5,14)。通常在这两种疾病的损伤中发现活化的巨噬细胞，它们为与T细胞依赖性免疫应答相关的细胞因子，包括IFN-γ、IL-1和TNF-α(5-17)。由于进一步的证据表明T细胞可在CA中起着致病作用，已从人纤维粥样硬化CA斑点中分离了CD4+T细胞克隆，其中当存在自发CA和TCAD损伤的主要组成的氧化的LDL(18)时，人纤维粥样硬化的斑点增殖并分泌IFN-γ(1,19,20)。而且，在用抗CD4单克隆抗体的小鼠中高脂血诱导的动脉粥样硬化损伤减少(21)。类似的，当异源移植安排在T细胞遗传缺失的小鼠品种中(13)或用抗CD413或抗IFN-γ单克隆抗体处理时(22),TCAD的血管损伤显著改善。这些数据在一起有利地说明T细胞和T细胞衍生效应分子参与这些疾病的发病。
CD40L是一种在将接触依赖信号递送到如B细胞(25-29)的CD40+靶细胞的活化CD4+T细胞中表达的30-33kDa分子量的表面分子。CD40L介导的信号在体外和体内T细胞依赖激素免疫应答的过程中极其重要(30)。目前已知CD40L-CD40相互作用还在体外和体内细胞介导的免疫应答中起作用(31,32)。令人感兴趣的是，已知参与CA和TCAD的发病的细胞类型的巨噬细胞和内皮细胞也表达CD40(33-37)。而且，在体外，巨噬细胞和内皮细胞中的CD40的连接诱导增强免疫应答和/或促炎症作用的分子产生。例如，在体外，CD40L-CD40相互作用正调节巨噬细胞中MHCⅡ型和共同刺激分子CD86的表达(38)。而且，巨噬细胞中CD40的连接通过诱导NO合成2，促凝血剂蛋白组织因子和基质金属蛋白酶来诱导细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-12)、化学因子(IL-8、MIP-1α)、氧化氮(NO)的产生(33,34,39-42)。在内皮细胞中，CD40L-CD40相互作用正调节胞间粘附分子CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM-1)和CD62E(E-选择蛋白)(35-37)。CD40连接的多种作用效果取决于转录因子NF-kB的活化(43-45)。
这些结果在一起表明这样一种想法，即在体内各种靶细胞中的CD40的连接可影响CD4+T细胞介导的炎症反应。支持这种假设的是，在患有狼疮性肾小球肾炎、IgA肾病和ANCA+T细胞肾小球肾炎的病人的肾以及在患有牛皮癣的病人的皮肤中CD40的表达被正调节(35,46)。而且，CD40L+T细胞侵染患有炎症性肾疾病的病人的肾(46)。由于T细胞与巨噬细胞、内皮细胞和可能的其他细胞的相互作用在CA和TCAD的发病中起作用，因此，在本次研究中，使用免疫组织化学研究CD40L和CD40在这两种疾病中的表达。CD40L在T细胞中表达，且CD40的表达在这两种疾病的内膜损伤中的内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和“泡沫”细胞中被正调节。而且，使用双重免疫染色发现这些损伤中的许多CD40+细胞共表达CD54、CD106和活性形式的NF-kB。方法：人冠状动脉
从23个心脏异源移植受体的外植心脏获得左主冠状动脉的节段或左前下动脉的近端部分。由于他们已发展成严重的与移植相关的冠状动脉疾病(TCAD)，因此9位病人进行重新移植。在这些病人中，第一次异源移植的存活期在38至103个月之间变化。因为他们已发展成严重的冠状动脉疾病和局部缺血性心肌病，所以10位病人接受了心脏异源移植。从4位病人的外植心脏获得没有动脉粥样硬化变化的对照冠状动脉；其中3位患有自发性心肌病，1位患有心脏肉瘤。-80℃下，将各血管段骤冻在异戊烷中，在恒冷切片机(Reichert Histostat)中以4mm的厚度进行连续切片。将切片粘贴在唾液酸覆盖的载玻片上，空气干燥，在冷丙酮中固定1分钟，在1∶1冷丙酮/氯仿混合物中再固定7分钟，贮藏于-80℃下。将来自各冠状动脉的一个切片固定在10％福尔马林中，用苏木精和伊红染色用于组织学评价。一抗
抗CD40杂交瘤G28.5(IgG1)从美国典型培养物中心(Rockville,MD)购得。如前所述产生抗CD40L单克隆抗体5C8(IgG2a)。使用蛋白G柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)从腹水中纯化G28.5和5C8单克隆抗体。另外的抗CD40L单克隆抗体(IgG1)购自Calbiochem(SanDiego,CA)。IgM抗CD40单克隆抗体从Caltag(Burlingame,CA)获得，并用于双重免疫染色研究。CD3、CD4、CD8、CD34、CD68(Novocastra,Burlingham,CA，所有IgG1)和平滑肌肌动蛋白(SMA)(DAKO,Carpinteria,CA,IgG2a)的单克隆抗体被用来区分内膜斑点的各种细胞类型，包括T细胞(CD3、CD4或CD8)、内皮细胞(CD34)、巨噬细胞(CD68)和平滑肌细胞(SMA)。抗ICAM-1(IgG1)和抗VCAM-1(IgG1)单克隆抗体从CHEMICONTM(Temecula,CA)购得。用与被IKB阻断的NF-KB的p65亚单位中的表位结合的p65单克隆抗体(IgG3)(BOEHRINGER MANNHEIMTM)证明活化的NF-KB的分布，因此仅当通过解离IKB来活化NF-KB时才可达到(47)。同型对照单克隆抗体(Mopec21,22)从SIGMAQTM(St.Louis,MO)获得。免疫组织化学
用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗冰冻切片并将内源过氧化物酶猝灭在0.5％的过氧化氢中。将切片用10％山羊血清和聚集的人Ig(80mg/ml)的PBS溶液“阻断”，接着与所述第一单克隆抗体或各自对照单克隆抗体一起保温一小时。带有滤泡增生的扁桃体的冰冻切片被用作阳性对照以确定各单克隆抗体的最佳稀释度。将与靶抗原结合的第一单克隆抗体与生物素标记的同型特异性山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG3或IgM(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)相连，然后共轭成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(VECTOR ELITE KITTM,VECTORTM,Burlingham,CA)。用显色剂(红色)3-氨基-9-乙基咔唑(AEC,VECTORTM,Burlingham,CA)检测过氧化物酶活性，将切片用Mayer氏苏木精复染(SIGMATM,St.Louis,MO)。
用双标记免疫组织化学来鉴定表达CD40的细胞类型以及确定在动脉粥样硬化损伤中相对于ICAM-1、VCAM-1或活化的NF-KB的CD40的分布。首先将所有切片用IgM抗CD40单克隆抗体进行免疫标记。二抗是随后与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物共轭的生物素化的山羊抗小鼠IgM。用来检测抗CD40 IgM单克隆抗体的存在的显色剂是3,3’二氨基联苯胺(褐色)。然后，充分漂洗切片，与靶向用于平滑肌细胞(SMA)或巨噬细胞(CD68)、白细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)或活化形式的NF-KB的细胞特异性标记的第二初级单克隆抗体一起保温。所有第二初级单克隆抗体为IgG1、IgG2a或IgG3同型。使用适宜的同型特异性生物素化的二抗并将其与亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物(VECTORTM,Burlingham,CA)结合。用显色剂Vector Red(VECTORTM,Burlingham,CA)证明碱性磷酸酶活性。通过使用不同的免疫酶技术(过氧化物酶对碱性磷酸酶)和各种靶抗原的同型特异性二抗可避免依次使用的染色方法之间的干扰。而且，制备双标记对照切片，其中两种一级单克隆抗体中的一种被同型匹配的对照单克隆抗体替代。损伤的半定量分析
通过以0-4等级定义血管腔狭窄的程度来定量各切片中动脉粥样硬化损伤的程度，其中0代表无狭窄，1代表小于25％,2代表小于50％,3代表小于90％,4代表大于90％的腔狭窄。还统计每个冠状动脉损伤的内膜巨噬细胞、平滑肌细胞、泡沫细胞、内皮细胞(新血管化)48和T细胞的含量，其中0代表不存在各种细胞类型，1代表很少量分出的细胞，2代表少量细胞，3代表存在集中密度的聚集物，4代表遍及整个斑点中的浓密的聚集物。类似的，以0-4的等级统计CD40、ICAM-1和VCAM-1的存在，其中0代表不存在各种分子，1代表其存在于极少细胞中，2,3和4分别代表其存在于少于50％,90％和大于90％的细胞中(49)。由于阳性样品中的CD40L的表达局限于分离的细胞中，因此，其存在对于定量评价是不适合的。统计学分析
使用非参数Kruskal Wallis法分析各组样品组织学记分的差别。使用Spearman氏相关性评价可变量之间的关系。结果：正常冠状动脉
如H$E染色所证实(图4A-4B)，来自4位对照病人的冠状动脉片段未显示出浓密增厚或炎症。具体讲，巨噬细胞、平滑肌细胞、泡沫细胞或淋巴细胞未存在于内膜中，并且没有细胞与本研究中所采用的任一抗CD40L单克隆抗体发生免疫反应。存在CD40免疫反应性，并局限在沿对照动脉的血管腔排列的内皮细胞中(图4B)。在对照血管中不表达VCAM-1或活化的NF-KB，并且ICAM-1在极少量的血管内皮细胞中有弱表达。自发CA和TCAD的组织学
在10位患有CA的7位中，冠状动脉片段显示出具有偏心狭窄，非细胞脂富集核心，胆固醇裂和重叠的纤维帽的凸起的动脉粥样硬化斑点。损伤的多孔性在含有巨噬细胞和淋巴细胞的“臂”区最大(图5A)。在内膜损伤中还分散有平滑肌细胞、巨噬细胞、泡沫细胞和新血管形成的病灶。患有中度早期血管损伤的3位病人的斑点为偏心小型的，并富含巨噬细胞、“泡沫”细胞和淋巴细胞。
9位患有TCAD的病人的冠状动脉损伤表明内膜随着腔的明显狭窄而纤维状增厚(表2)。
表2：自发冠状动脉粥样硬化(CA)和移植冠状动脉疾病(TCAD)的内膜损伤中的细胞组成和对CD40、ICAM-1和VCAM-1的免疫反应性的半定量评价(等级0-4)。值以平均值+标准偏差表示。
    内膜斑点     对照(n=4)     CA(n=10)     TCAD(n=9)
    厚度     0.3±0.5     2.1±0.9*     3.1±0.8*
    CD4+淋巴细胞     0     1.3±0.9*     3.2±0.8*
    CD8+淋巴细胞     0     0.3±0.5*     2.6±1.1*
    巨噬细胞(CD68)     0.5±0.6     2.1±0.8*     3.8±0.4*
    泡沫细胞     0     1.2±0.8*     2.4±1.3*
    平滑肌细胞     0.8±1     1.7±0.7     2.9±0.8*
    新血管形成     0     1.8±0.7*     2.6±0.9*
    CD40     0.5±0.6     2.2±0.7*     3.3±0.9*
    ICAM-1     0.5±0.6     2.3±1.7*     3.6±0.7*
    VCAM-1     0.3±0.5     1.7±0.7*     2.9±0.9*
*通过Kruskal-Wallis试验，p,0.05,CA或TCAD与对照比较
损伤由平滑肌细胞和间质基质的同心层组成，并且沿着新血管形成区域有大量的巨噬细胞和淋巴细胞的侵蚀。在4个冠状动脉中，除平滑肌细胞的同心层外，还观察到富含脂质的动脉粥样硬化损伤和“泡沫”细胞(图6A-C)。淋巴细胞的内皮下集中(“内皮炎”)和淋巴细胞在外膜的聚集也是在TCAD损伤中注意到的特征。CA和TCAD中CD40L表达的免疫组织化学分析
与缺乏侵染淋巴细胞或CD40L表达细胞的正常冠状动脉明显相反，CA和TCAD损伤含有CD40L+细胞。在自发动脉粥样硬化中，CD40L的阳性免疫染色局限于少数内膜淋巴细胞中。CD40L染色通常很弱，并在小的胞质颗粒或在细胞表面被观察到(图7A-D)。在自发CA中，大多数内膜淋巴细胞为CD4+T细胞；仅存在极少CD8+T细胞(图7A-D)。用抗CD4或抗CD8单克隆染色的连续切片的分析表明CD40L+淋巴细胞主要为CD4+T细胞。内皮细胞，平滑肌细胞，巨噬细胞和“泡沫”细胞不与本研究所采用的任何一种抗CD40L单克隆抗体反应。用同型对照单克隆抗体未观察到染色。
在TCAD损伤中，CD40L的阳性免疫染色也仅仅与淋巴细胞相关(图8A-C)。与CA相反，CD8+和CD4+T细胞均存在于TCAD损伤中。然而，CD8+T细胞主要在“内皮炎”的内皮下区域发现(图9A-B)，而CD4+T细胞集中在与内弹性膜相邻的内膜深处(图8A-C)以及冠状动脉外膜的聚集物中。CD40L的表达在空间上与患有TCAD的冠状动脉的内膜和外膜中的CD4+T细胞相关。TCAD中的CD40L+T细胞的数目高于自发CA损伤中的。类似于CA,TCAD损伤中的内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和“泡沫”细胞不与本研究中采用的任一抗CD40L单克隆抗体反应(图9A-B)。这些数据表明可能为CD4+T细胞的CD40L表达细胞存在于自发CA和TCAD的损伤中。CA和TCAD中CD40表达的免疫组织化学分析
与局限在正常冠状动脉中的腔内皮细胞的弱CD40表达相反(图4A-B),CD40免疫反应性在自发CA的损伤中被正调节，并广泛分布(图5A-B)。在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和“泡沫”细胞中观察到CD40的表达。在自然CA的内膜损伤中CD40阳性细胞的平均数目明显高于对照动脉(2.2+0.7对0.5+0.6，表2)。用巨噬细胞或平滑肌细胞特异性标记的双重免疫染色证实两种谱系的这些细胞和“泡沫”细胞表达CD40(图10A-B)。令人感兴趣的是，CD40+平滑肌细胞存在于靠近炎症侵染的内膜中，而动脉基质中的平滑肌细胞未显示出对CD40的阳性免疫反应性(图10A-B)。对用CD40或内皮标记物CD34染色的连续切片的分析表明沿内膜新血管和外膜血管排列的内皮细胞也为强的CD40+(图11A-D)。
在来自患有TCAD的病人的动脉中，CD40表达的分布图类似于自发CA。然而，TCAD中的CD40免疫反应性的平均值明显高于自然CA或对照动脉(表2)。双重免疫染色表明内膜平滑肌细胞和巨噬细胞表达CD40(图10A-B)。而且，沿血管腔、内膜新血管和外膜血管排列的泡沫细胞(图6A-B)和内皮细胞明显地为CD40+。这些数据结合在一起证明在自发CA和TCAD中内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞表达CD40。在CA和TCAD损伤中CD40的表达与胞间粘附分子和NF-KB的活化的关系
CA和TCAD中的巨噬细胞和内皮细胞表达调节将淋巴细胞运输到损伤的胞间粘附分子。由于在体外CD40的连接诱导细胞中胞间粘附分子的正调节和NF-KB的活化，因此人们关注CD40的表达是否与CA或TCAD损伤中的胞间粘附分子或NF-KB的共表达相关。首先在自发CA中证明腔内皮细胞显示出对带有极少表达VLAM-1的内皮细胞的ICAM-1的病灶阳性免疫染色。相反，沿内膜新血管和外膜血管排列的内皮细胞对ICAM-1和VCAM-1为强阳性(图11A-D)。内膜平滑肌细胞、巨噬细胞和“泡沫”细胞对ICAM-1和VCAM-1也为中等强阳性(图12A-C)。在CD40值与ICAM-1(r=0.85)和VCAM-1(r=0.72)的那些值之间具有显著的相关性(p＜0.05)。内膜淋巴细胞的数目与CD40和白细胞粘附分子的值显著相关(表3)。表3:CA(n=10)或TCAD(n=9)的内膜损伤的各种细胞类型的值(0-4)与CD40和粘附分子(ICAM-1,VCAM-1)的表达值(0-4)的相关性。值以Spearmen相关性系数表示(范围为-1至1，其中“0”为不相关，“-1”或“1”为极为相关)。
    细胞类型     组别     CD40     ICAM-1     VCAM-1
    T-淋巴细胞     CA     0.78*     0.77*     0.83**
   (CD4+&CD8+)     TCAD     0.79*     0.87**     0.77*
    巨噬细胞     CA     0.93***     0.84**     0.77*
    (CD68+)     TCAD     0.81**     0.68*     0.55
    泡沫细胞     CA     0.81**     0.68*     0.36
    TCAD     0.44     0.33     0.26
    平滑肌     CA     0.72*     0.81**     0.56
    细胞(SMA+)     TCAD     0.12     0.38     0.02
    新血管     CA     0.69*     0.72*     0.53
    (CD34+)     TCAD     0.85**     0.87**     0.77*
*p＜0.05,**p＜0.01和***p＜0.001,Spearman相关显著性水平
在所有所列细胞类型中，只有内膜淋巴细胞的值与CA和TCAD中的内膜斑点中的CD40的表达和ICAM-1和VCAM-1的程度显著相关，这表明淋巴细胞参与这两种疾病中的CD40和粘附分子的诱导。在CA和TCAD中，巨噬细胞和新血管形成也显示出与CD表达的显著的相关性。
用抗CD40单克隆抗体和抗ICAM-1单克隆抗体或抗VCAM-1单克隆抗体的对CA损伤的双重免疫染色表明CD40和这些粘附分子共存在于许多细胞中(图1A-C)。此外，在新内膜内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞的核中观察到活化的NF-KB(图13)，并且双重免疫标记证明许多CD40+细胞也表达活化的NF-KB。
在TCAD中，对ICAM-1和VCAM-1的强阳性免疫染色存在于腔内皮细胞中，尤其是靠近内皮炎病灶的那些中。内膜新血管外膜血管的内皮细胞对ICAM-1和VCAM-1为强免疫反应性。TCAD中的粘附分子的免疫染色值高于CA或正常冠状动脉(表2)。在CD40值与ICAM-1值(r=0.82)和VCAM-1值(r=0.89)之间具有显著的相关性(p＜0.05)。内膜淋巴细胞的数目也与CD40、ICAM-1和VCAM-1的表达显著相关(表3)。类似于CA，双色免疫组织化学研究证明TCAD损伤中的许多CD40+细胞共表达ICAM-1或VCAM-1(图12A-C)。与自发CA比较，活化的核类型的NF-KB的免疫染色更广泛地分布于TCAD中。NF-KB阳性巨噬细胞和平滑肌细胞一致为CD40+(图13)。这些数据一起证实在自发CA和TCAD的损伤中，CD40和胞间粘附分子和/或NF-KB在许多细胞中共表达。讨论
自然动脉粥样硬化(CA)和与移植相关的动脉粥样硬化(TCAD)为由活化T细胞，内皮细胞，巨噬细胞和平滑肌细胞之间复杂的相互作用介导的炎症性疾病(2,8,12,13,17)。T细胞被认为在CA和TCAD的发病中起作用，然而，对它们参与这些过程的机理还未充分了解(5,9,50)。研究表明为活化诱导的CD4+T细胞表面分子的CD40L将接触依赖活化信号递送到表达CD40的内皮细胞和巨噬细胞中，这将导致促炎症分子的产生，如胞间粘附分子ICAM-1和VCAM-1(31,32,35-37)和转录活化因子NF-KB的活化(43-45，体外)。令人感兴趣的是，鼠模型中的TCAD至少部分依赖于CD40L-CD40相互作用(51)。在Larson和其同事的研究中，抗CD40L单克隆抗体治疗明显抑制异源异位移植排斥和部分阻断相关的血管病。而且，通过给予抗CD40L单克隆抗体和阻断T细胞助刺激途径的CTLA4-Ig融合蛋白质(为分子)的混合物可几乎完全防止了该模型中的TCAD(51)。CD40L-CD40相互作用可能参与了人CA和/或TCAD的发病中。
为了证实这种假设，进一步将免疫这种化学方法用于正常和动脉粥样硬化的冠状动脉中以研究CD40L和CD40的表达和细胞分布。正常冠状动脉不含有CD40L表达细胞，CD40免疫反应性局限于这些血管中的腔内皮细胞中。相反，CD40L在自发CA和TCAD的损伤中的淋巴细胞中表达。发现CA损伤含有少数CD8+T细胞，而TCAD损伤在内膜和外膜较深处的腔内皮(“内皮炎”)和CD4+T细胞附近含有CD8+T细胞。根据用抗CD40单克隆抗体或抗CD8单克隆抗体的定位和染色，推出在两种疾病的损伤中CD40L+淋巴细胞几乎类似于CD4+T细胞。使用两种不同的抗CD40L单克隆抗体，发现CD40L免疫反应性弱，且与颗粒和胞质或细胞表面相关。在肾小球肾炎中的CD40L和CD40表达的研究中观察到相似类型的CD40L免疫反应性(46)。炎症组织中CD40L表达的微弱常见的胞质染色类型可能与活化T细胞的CD40L表达的暂时性(27-29)和靶细胞中的CD40的参与通过受体介导的胞吞作用(52)和释放作用(53)诱导CD40L的负调节的这一事实相关。这些调节机理可能起着将CD40L介导的信号事件集中于适宜的相关靶细胞中的作用。
发现在两种疾病损伤中CD40表达在许多细胞中明显被正调节。表达CD40的巨噬细胞和“泡沫”细胞在富含脂质斑点的“臂”区的炎症侵染中尤其突出，其中这些斑点已知含有浓密的炎症渗液(54,55)。在两种疾病的腔内皮细胞中CD40表达也被正调节，这在TCAD中尤其突出。两种疾病中的内膜新血管和外膜血管内皮细胞为强CD40+。表达CD40的平滑肌细胞存在于CA和TCAD的内膜中，通常在炎症渗液附近。令人感兴趣的是，相同血管基质中的平滑肌细胞为CD40-。在体外，IFN-γ正调节包括平滑肌细胞在内的许多细胞中的CD40的表达，并且如IL-1β和TNF-α的细胞因子增强这种作用(36)。因此，这些损伤中的许多细胞类型中CD40表达的明显正调节可能是由损伤T细胞，巨噬细胞和其他细胞释放细胞因子的结果。双重免疫染色表明许多CD40+细胞也共表达胞间粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及活化形式的NF-KB。总之，本研究证实了在自发CA和TCAD的血管损伤中CD40L+T细胞和活化的CD40+靶细胞的存在。
早期研究表明CD40在一些上皮细胞肿瘤和B细胞中表达(57,58)。最近已注意到在体外在许多细胞类型中CD40被组成性地表达或可诱导(33-37,56)。而且，日趋证实在体内，C40L-CD40相互作用在细胞介导的炎症反应中起着关键作用(31,32)。在这方面，最近报导证明了人炎症疾病中的原位CD40L和/或CD40表达(35,46,59)。例如，在侵染患有多发性硬化病人的脑的巨噬细胞中(59)，牛皮癣皮肤内皮细胞和角质细胞中(35)以及患有炎症性肾小球性肾炎病人的肾脏中的许多细胞中(46),CD40表达被正调节。而且，在患有多发性硬化的病人的脑中(59)以及患有炎症性肾小球性肾炎的病人肾脏中(46)的炎性渗液含有CD40L+T细胞。因此有可能在许多炎性疾病中CD40的表达被正调节，并且代表一种允许T细胞将炎症原信号递送到多种靶细胞中的分子机理。在这方面，这里提供的研究结果，即在CA和TCAD中CD40表达被正调节以及在损伤中发现CD40L+侵染T细胞作为在免疫介导的炎症反应的证据在这些疾病的发病中起作用(5-7,9,18,21,23,50)。
有关在体外CD40L介导的内皮细胞和巨噬细胞的活化的观察以及在TCAD鼠模型发病中的CD40L-CD40相互作用研究表明了CD40L-CD40相互作用在CA和TCAD中的可能的致病作用。例如，在体外，CD40L介导的信号正调节内皮细胞中的ICAM-1和VCAM-1的表达(35-37)。调节炎症位点的白细胞的超常状态和滞留的这些胞间粘附分子在CA和TCAD内皮细胞中被正调节，并在内膜新血管和血管内皮细胞中尤其突出(49,60)。因此，令人感兴趣的是，在CA和TCAD中发现了许多CD40+细胞，尤其是内膜和血管内皮细胞共表达ICAM-1和/或VCAM-1。已知ICAM-1和VCAM-1的正调节依赖于NF-KB的活化(61)。在本发明中，还证明了CD40+内膜巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞表达活性形式的NF-KB。这些研究表明CD40L+CD4+T细胞可部分通过活化NF-KB来诱导CA和TCAD中CD40+靶细胞上的胞间粘附分子的正调节。
CD40L介导的信号还诱导内皮细胞分泌IL-6和IL-8(62)并通过正调节组织因子和负调节凝血调节蛋白的表达启动前凝血剂表面。在体外，对于巨噬细胞，CD40L-CD40相互作用诱导这些细胞分泌炎症原细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α)、化学因子、基质金属蛋白酶和表达组织因子(33,34,38,41,42)。所有这些炎症原分子可能在CA和TCAD的发病中起作用(10,17,63-66)。巨噬细胞中的CD40的连接也诱导NO的产生(39,40)。令人感兴趣的是，在TCAD的鼠模型中阻断CD40L-CD40相互作用与iNOS表达的负调节和TCAD损伤的减少相关(51)。证明了iNOS在CA(67,68)，心脏异源移植排斥(69,70)和TCAD(71,72)损伤中表达。CD40L介导的信号可能参与促进CA或TCAD中任何分子的产生。CD40L-CD40相互作用显然在TCAD(51)以及胶原蛋白诱导的关节炎(73)、狼疮样肾小球性肾炎(74)和实验变态性脑脊髓炎(59)的鼠模型中明显具有炎症原作用。
进行了人颈动脉动脉粥样硬化中的CD40L和CD40的表达的研究(62)。发现在损伤中CD40被正调节并具有广泛的细胞分布。CD40L被报导广泛地在动脉粥样硬化损伤中的平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中表达，而在使用两个不同的抗CD40L单克隆抗体分本研究中，CD40L表达局限于T细胞。这里在任一疾病中的巨噬细胞、内皮细胞或平滑肌细胞中未观察到原位CD40L表达。类似的，发现在其他炎症疾病中，CD40L免疫反应性局限于T细胞，其中炎症疾病包括肾小球性肾炎(46)、类风湿性关节炎和慢性肠炎。另外，Gerritse等报导在多发性硬化斑点中CD40L的表达局限于CD4+T细胞(59)。这里的结果与Mach和同事的结果之间的差异目前不清楚，但可能与免疫组织化学方法或损伤性质的细微不同有关。参考文献1．Nilsson,J.1993移植方法25:2063-2064。2．Munro,J.和R.Cotran.1988实验室研究58:249-261。3．Cramer,D.等1992心肺移植杂志11:458-466。4．Billingham,M.1992心肺移植杂志11:S38-S44。5．Zhou,X.等1996.美国病理学杂志149:359-366。6．Wick,G.等1995.今日免疫学16:27-33。7．Stemme,S.等1992.动脉粥样硬化和血栓形成12:206-211。8．Ross,R.1993自然362:801-809。9．Lichtman,A.等1996美国病理学杂志149:351-357。10．Kishikawa,H.等1993 Virchows考古学423:433-442。11．Krensky,A.1994肾脏研究45；50S-56S。12．Salomon,R.等1991美国病理学杂志138:791-798。13．Shi,C.等1996.Proc Natl Acad Sci,USA.93:4051-4056。14．Jonasson,L.等1985.临床研究杂志76:125-131。15．Russell,P.S.等1994.美国病理学杂志144:260-274。16．Moyer,C.等1992.病理学杂志138:951-960。17．Libby,P.和Z.Gallis 1995.Ann NY Acad Sci 748:158-168.18．Stemme,S.等1995.Proc Natl Acad Sci,USA.92:3893-3897。19．Witztum,J.和D.Steinberg 1991临床研究杂志88:1785-1792。20．de Lorgeril,M.等1993.美国心脏杂志125:974-980。21．Emeson,E.等1996.美国病理学杂志149:675-685。22．Russell,P.等1994.移植57:1367-1371。23．Russell,M.等1996.临床研究杂志97:833-838。24．Hancock,W.等1996.Proc Natl Acad Sci 93:13967-13972。25．Graf,D.等1992.欧洲免疫学杂志22:3191-3194。26．Armitage,R.J.等1992.自然357(6373):80-2。27．Lane,P.等1992.欧洲免疫学杂志22:2573-2578。28．Lederman,S.等1992.实验医学杂志175(4):1091-101。29．Noelle,R.等1992.Proc Natl Acad Sci USA.89:6550-6554。30．Banchereau,J.等1994.免疫学年述12:881-922。31．Noelle,R.1996.免疫4:415-419。32．Stout,R.和J.Suttles 1996.今日免疫学17:487-492。33．Alderson,M.R.等1993.实验医学杂志178(2)；669-74。34．Caux,C.等1994.实验医学杂志180:1263-1272。35．Hollenbaugh,D.等1995.实验医学杂志182:33-40。36．Karmann,K.等1995.Proc Natl Acad Sci,USA.92:4342-4346。37．Yellin,M.J.等1995.实验医学杂志182:1857-1864。38．Kiener,P.等1995.免疫学杂志155:4917-4925。39．Stout,R.等1996.免疫学杂志156:8-11。40．Tian,L.等1995.欧洲免疫学杂志25:306-309。41．Pardier,O.等1996.欧洲免疫学杂志26:3048-3054。42．Malik,N.等1996.免疫学杂志156:3952-3960。43．Berberich,I.等1994.免疫学杂志153:4357-4366。44．Hess,S.等1995.免疫学杂志155:4588-4595。45．Karmann,K.等1996.实验医学杂志184:173-182。46．Yellin,M.等1997.风湿性关节炎40:124-34。47．Brand,K.等1996.临床研究杂志97:1715-1722。48．Kuamamoto,M.等1995.人类病理学26:450-456。49．O’Brien,K.等1996.循环93；672-682。50．Haraoka,S.等1995.Virchows关节炎426:307-315。51．Larsen,C.等1996.自然381:434-438。52．Yellin,M.J.等1994.免疫学杂志152(2):598-608。53．Graf,D.等1995.欧洲免疫学杂志25:1749-1754。54．Bioerkerud,S.和B.Bjoerkerud 1996.美国病理学杂志149:367-380。55．van der Wal,A.等1994.循环89:36-44。56．Yllin,M.J.等1995.白细胞生物学杂志58:209-216。57．Pauli,S.等1985.癌症免疫学与免疫治疗20:23-28。58．Clark,E.A.和J.A.Ledbetter1986.Proc Natl Acad Sci。USA.83:4494-4498。59．Gerritse,K.等1996.Proc Natl Acad Sci.93:2499-2504。60．Davies,M.等1993.病理学杂志171:223-229。61．Collins,T.等1995.FASEB J.9:899-909。62．Mach,F.等1997 Proc Natl Acad Sci,USA.94:1931-1936。63．Berliner,J.等1995循环91:2488-2496。64．Libby,P.等1995心血管药物25增订版2:S9-12。65．Li,Z.等1996美国病理学杂志148:121-128。66．Galis,Z.等1994.临床研究杂志94:2493-2503。67．Buttery,L.等1996.实验室研究75:77-85。68．Aji,W.等1997.循环95:430-437。69．Yang,X.等1994.临床研究杂志94:714-721。70．Worrall,N.等1995.实验医学杂志181:63-70。71．Russell,M.等1995.循环92:457-464。72．Akyurek,L.等1996.美国病理学杂志149；1891-1990。73．Durie,F.H.等1993.科学261:1328-1330。74．Mohan,C.等1995.免疫学杂志154:1470-1480。
        序列表
(1)一般信息：
  (ⅰ)申请人：Yellin,Michalel J.
        Lederman,Seth
        Chess,Leonard
        Karpusas,Mihail N.
        Thomas,David W.
  (ⅱ)发明题目：T-BAM(CD40L)技术在治疗涉及平滑肌细胞的疾病中的治疗应用
  (ⅲ)序列数目：1
  (ⅳ)通讯地址：
    (A)地址：Cooper & unham LLP
    (B)街道：1185 Avenue of the Americas
    (C)城市：纽约
    (D)州：纽约
    (E)国家：USA
    (F)邮编：10036
  (ⅴ)计算机可读形式：
    (A)介面类型：Floppy disk
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30
  (ⅵ)本申请数据：
    (A)申请号：仍然未知
    (B)申请日：同此附上
    (C)分类：
  (ⅷ)代理人信息：
    (A)姓名：White Esq.,John P.
    (B)登记号：28,678
    (C)参考/记录号：48559/JPW/JML
  (ⅸ)通讯信息：
    (A)电话：(212)278-0400
    (B)传真：(212)391-0525
(2)SEQ ID NO:1的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：146氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ⅱ)分子类型：蛋白质
  (ⅲ)假设：无
  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser1               5                    10                 15Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
        20                  25                  30Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
    35                  40                  45Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
50                  55                  60Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu65                  70                  75                  80Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
            85                  90                  95His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
        100                 105                 110Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
    115                 120                 125Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
130                 135                 140Lys Leu145

Claims (70)

1．一种抑制在细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD40配体活化的方法，包括将细胞与能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质接触，其中该物质以有效抑制该细胞活化的量存在。
2．权利要求1的方法，其中平滑肌细胞为膀胱平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、支气管平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞、肺平滑肌细胞或胃肠道平滑肌细胞。
3．权利要求2的方法，其中胃肠道平滑肌细胞为食管平滑肌细胞、胃平滑肌细胞，小肠平滑肌细胞或大肠平滑肌细胞。
4．权利要求1的方法，其中该物质抑制CD40配体与细胞上的CD40结合。
5．权利要求1的方法，其中该物质为蛋白质。
6．权利要求5的方法，其中蛋白质包括抗体或其一部分。
7．权利要求6的方法，其中抗体为单克隆抗体。
8．权利要求7的方法，其中单克隆抗体特异性地与单克隆抗体5c8(ATCC保藏登记号为HB10916)特异性结合的表位结合。
9．权利要求8的方法，其中单克隆抗体为单克隆抗体5c8(ATCC保藏登记号为HB10916)。
10．权利要求7的方法，其中单克隆抗体特异性地与CD40结合。
11．权利要求10的方法，其中抗体为人源化，嵌合或灵长类源化的抗体。
12．权利要求7的方法，其中单克隆抗体为嵌合抗体。
13．权利要求7的方法，其中单克隆抗体为人源化抗体。
14．权利要求6的方法，其中抗体的一部分包含轻链或重链的互补决定区或可变区。
15．权利要求6的方法，其中抗体的一部分包含互补决定区或可变区。
16．权利要求15的方法，其中抗体的一部分包含Fab或单链抗体。
17．权利要求5的方法，其中蛋白质包括CD40配体的可溶性细胞外区或其包含保守置换的变异体或其一部分；或CD40的可溶性细胞外区或其包含保守置换的变异体或其一部分。
18．权利要求17的方法，其中CD40配体或CD40的可溶性细胞外区为单体。
19．权利要求17的方法，其中CD40的可溶性细胞外区为寡聚体。
20．权利要求17的方法，其中包含CD40或其一部分或CD40配体或其一部分的可溶性细胞外区的蛋白质进一步包含与CD40或其一部分或CD40配体或其一部分融合的Fc区。
21．权利要求20的方法，其中Fc区能与蛋白A或蛋白G结合。
22．权利要求21的方法，其中Fc区包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE或其亚类。
23．权利要求22的方法，其中IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA为IgA1或IgA2。
24．权利要求1的方法，其中物质为非蛋白质。
25．权利要求1的方法，其中物质选自已知物质库。
26．权利要求1的方法，其中物质从已知物质修饰而来。
27．权利要求26的方法，其中根据CD40配体的可溶性细胞外区或其一部分与先导抑制剂的复合物的三维结构，通过先导抑制剂的结构最优化来设计被修饰的物质。
28．权利要求1的方法，其中物质通过筛选方法选择，它包括：
分离细胞样品；
在允许含有CD40的细胞活化的条件下培养样品；
将样品与有效活化含有CD40细胞的表达被由具有ATCC登记号HB 10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白的细胞，或有效活化含有CD40细胞且被由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白接触；
如果物质能抑制含有CD40细胞活化，则将样品与有效量的抑制含有CD40细胞活化的物质接触；和
测定在存在该物质时，表达由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白的细胞，或由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白是否活化含有CD40细胞。
29．权利要求28的方法，其中物质选自已知物质库。
30．权利要求29的方法，其中已知物质为非蛋白物质。
31．一种在个体中抑制细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD配体活化的方法，包括给予宿主能抑制CD40配体与细胞表面的CD40相互作用的物质，其中该物质以在宿主中有效抑制该细胞活化的量存在。
32．权利要求31的方法，其中平滑肌细胞为膀胱平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、支气管平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞、肺平滑肌细胞或胃肠道平滑肌细胞。
33．权利要求32的方法，其中胃肠道平滑肌细胞为食管平滑肌细胞、胃平滑肌细胞，小肠平滑肌细胞或大肠平滑肌细胞。
34．权利要求31的方法，其中该物质抑制细胞中CD40配体与CD40结合。
35．权利要求31的方法，其中该物质为蛋白质。
36．权利要求35的方法，其中蛋白质包括抗体或其一部分。
37．权利要求36的方法，其中抗体为单克隆抗体。
38．权利要求37的方法，其中单克隆抗体特异性地与单克隆抗体5c8(ATCC保藏登记号为HB10916)特异性结合的表位结合。
39．权利要求38的方法，其中单克隆抗体为单克隆抗体5c8(ATCC保藏登记号为HB10916)。
40．权利要求37的方法，其中单克隆抗体特异性地与CD40结合。
41．权利要求40的方法，其中抗体为人源化，嵌合或灵长类源化的抗体。
42．权利要求37的方法，其中单克隆抗体为嵌合抗体。
43．权利要求37的方法，其中单克隆抗体为人源化抗体。
44．权利要求36的方法，其中抗体的一部分包含轻链或重链的互补决定区或可变区。
45．权利要求36的方法，其中抗体的一部分包含互补决定区或可变区。
46．权利要求45的方法，其中抗体的一部分包含F抗体或单链抗体。
47．权利要求31的方法，其中为哺乳动物。
48．权利要求47的方法，其中哺乳动物为啮齿类。
49．权利要求47的方法，其中哺乳动物为人。
50．权利要求31的方法，包括蛋白质包含CD40配体的可溶性细胞外区或其包含保守置换的变异体或其一部分；或CD40的可溶性细胞外区或其包含保守置换的变异体或其一部分。
51．权利要求50的方法，其中CD40配体或CD40的可溶性细胞外区为单体。
52．权利要求50的方法，其中CD40的可溶性细胞外区为寡聚体。
53．权利要求50的方法，其中包含CD40或其一部分或CD40配体或其一部分的可溶性细胞外区的蛋白质进一步包含与CD40或其一部分或CD40配体或其一部分融合的Fc区。
54．权利要求53的方法，其中Fc区能与蛋白A或蛋白G结合。
55．权利要求53的方法，其中Fc区包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE或其亚类。
56．权利要求55的方法，其中IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA为IgA1或IgA2。
57．权利要求31的方法，其中物质为非蛋白质。
58．权利要求57的方法，其中物质为小分子。
59．权利要求31的方法，其中物质选自已知物质库。
60．权利要求31的方法，其中物质从已知物质修饰而来。
61．权利要求60的方法，其中根据CD40配体的可溶性细胞外区或其一部分与先导抑制剂的复合物的三维结构，通过先导抑制剂的结构最优化来设计被修饰的物质。
62．权利要求31的方法，其中物质通过筛选方法选择，该方法包括：
分离细胞样品；
在允许含有CD40的细胞活化的条件下培养样品；
将样品与有效活化含有CD40细胞的表达被由具有ATCC登记号HB 10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白的细胞，或有效活化含CD40细胞且被由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白接触；
如果物质能抑制含有CD40细胞活化，则将样品与有效量的抑制含有CD40细胞活化的物质接触；和
测定在存在该物质时，表达被由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白的细胞，或被由具有ATCC登记号HB10916的杂交瘤产生的单克隆抗体5c8特异性识别的蛋白是否活化含有CD40细胞。
63．权利要求62的方法，其中物质选自已知物质库。
64．权利要求63的方法，其中已知物质为非蛋白物质。
65．一种治疗个体平滑肌细胞依赖疾病的方法，包括根据权利要求31的方法抑制细胞表面具有CD40的平滑肌细胞的CD配体的活化。
66．权利要求65的方法，其中平滑肌细胞依赖疾病为血管病。
67．权利要求66的方法，其中血管疾病为动脉粥样硬化。
68．权利要求65的方法，其中平滑肌依赖疾病为胃肠道疾病。
69．权利要求68的方法，其中胃肠道疾病选自食管异常游动性、炎性肠疾病和硬皮病。
70．权利要求65的方法，其中平滑肌依赖疾病为膀胱疾病。
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