BG63489B1 - Метод за инхибиране активацията на cd долу 40 лиганд на гладкомускулни клетки - Google Patents

Метод за инхибиране активацията на cd долу 40 лиганд на гладкомускулни клетки Download PDF

Info

Publication number
BG63489B1
BG63489B1 BG103148A BG10314899A BG63489B1 BG 63489 B1 BG63489 B1 BG 63489B1 BG 103148 A BG103148 A BG 103148A BG 10314899 A BG10314899 A BG 10314899A BG 63489 B1 BG63489 B1 BG 63489B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
cells
smooth muscle
muscle cells
agent
ligand
Prior art date
Application number
BG103148A
Other languages
English (en)
Other versions
BG103148A (bg
Inventor
Michael YELLIN
Seth Lederman
Leonard Chess
Mihail KARPUSAS
David Thomas
Original Assignee
The Trustees Of Columbia University In The City Of New York
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Trustees Of Columbia University In The City Of New York, Biogen, Inc. filed Critical The Trustees Of Columbia University In The City Of New York
Publication of BG103148A publication Critical patent/BG103148A/bg
Publication of BG63489B1 publication Critical patent/BG63489B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до метод, при който активирането с CD40 лиганд (CD40L) на гладкомускулни клетки, носещи по повърхността си CD40, се инхибира in vivo и ex vivo чрез поставяне на клетките в контакт с агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40L и CD40 по повърхността на клетките. Инхибирането in vivo на носещите CD40 гладкомускулни клетки се използва за третиране на заболявания,засягащи гладкомускулните клетки.

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до метод за инхибиране активацията на
CD40 лиганд на гладкомускулни клетки, носещи CD40 по клетъчната повърхност, за лечение на специфични типове заболявания, засягащи гладкомускулни клетки
Предшестващо състояние на техниката
CD40 е молекула на клетъчната повърхност, която се експресира в различни клетки и взаимодейства с един 30 - 33 kDa активационно индуциран противорецептор на CD4+ Т клетките, наречен CD40L. Взаимодействията на CD40L-CD40 са изучени интензивно при взаимодействията между Т клетки и В клетки и са от съществено значение за зависимата от Т клетки диференциация на В клетките и за продукцията на IgG, IgA и IgE. CD40 се експресира също в моноцити, дендритни клетки, епителни клетки, ендотелни клетки и фибробласти. Експресията на CD40 в тези клетки се регулира възходящо в условия in vitro от цитокини и най-много от IFN-γ. Интересен е фактът,че изследвания in vivo демонстрират значителна възходяща регулация на експресията на CD40 при възпалителни състояния като ревматоиден артрит на синовиалната мембрана или псориазисни плаки. Изследвания in vitro, използващи анти- CD40 mAb или CD40L+ клетки показват, че CD40 е функционално експресиран в моноцити, дендритни клетки, епителни клетки, ендотелни клетки и фибропласти.
»
Например, взаимодействия на CD40L-CD40 индуцират моноцитите да секретират про-възпалителни цитокини IL-lot, IL-Ιβ, IL-6 и ТМЕ-а и дендритните клетки да експресират TNF-α. Взаимодействията на CD40LCD40 също стимулират моноцитите и дендритните клетки да секретират хемокинините IL-8 и М1Р1а. Освен това, лигирането на CD40 усилва медиираната с GM-CSF продукция на IL-1 от тимусни епителни клетки. В допълнение, медиираните от CD40L сигнали индуцират моноцитите да секретират IL-10 и азотен окис и увеличават продукцията на фибробластен IL-6. Фибробластите също пролиферират след взаимодействия на CD40L - CD40. Накрая, ендотелните клетки и фибробластите регулират възходящо междуклетъчните адхезионни молекули след лигиране на CD40.
Съдови заболявания като атеросклероза се лекуват с различни лекарства, включително с такива,понижаващи нивото на холестерола, бета-блокери, блокери на калциевите канали и антикоагуланти.
От литературата са известни методи за създаване на представляващи интерес антитела виж. РСТ патентна заявка WO93/09812 А1; Banchereau et al., (Ann, Rev. Immunol., Vol. 12, pp. 881-922, 51994) и Yellin et al., 1995, J. Exp. Med., Vol. 182, pp. 1857 - 1864. В тях обаче не се касае за специфично инхибиране на CD40-CD40 лиганд, нито до методи за лечение на заболявания, засягащи гладкомускулни клетки чрез въвеждане на средство, способно да инхибира активацията с CD40 · лиганд. Също така в горните източници не се твърди, нито предполага за експресия на CD40 по повърхността на специфични типове: гладкомускулни клетки.
Техническа същност на изобретението
Настоящето изобретение предоставя метод за инхибиране активацията чрез CD40 лиганд на гладкомускулни клетки, носещи CD40 по повърхността на клетките.Методът включва поставяне на клетките в контакт с агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40лиганда и CD40 по повърхността на клетките, като агентът е представен в количество,ефективно да инхибира активацията на клетките.
Настоящето изобретение предоставя метод за инхибиране активацията чрез CD40- лиганд на гладкомускулни клетки, носещи CD40 по клетъчната повърхност, характеризиращ се с въвеждане у индивид на агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40 лиганда и CD40 по повърхността на клетките, като агентът е представен в количество, което е ефективно да инхибира активацията на клетките у индивида.
Настоящето изобретение предоставя метод за лечение на пациент със заболяване,засягащо гладкомускулните клетки и характеризиращ се с въвеждане у пациента на един агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 по повърхността на клетките, като агентът е представен в количество, ефективно да инхибира активацията на клетките у индивида и по този начин да се третира заболяването, засягащо гладкомускулните клетки .
Описание на фигурите
Фигура 1А: FACS анализ на човешки аортни гладкомускулни клетки в покой. Пунктираната крива представлява изотипно контролно mAb; прекъснатата крива представлява анти- CD54 mAb; и плътната крива представлява анти-С040 mAb. Тази фигура показва, че гладкомускулните клетки не експресират конститугивно CD40.
Фигура 1В: FACS анализ на човешки аортни гладкомускулни клетки в присъствие на IFN-γ (1000 U/cc) след 72 часа в клетъчна култура. Тази фигура показва възходяща регулация на CD40 експресията в гладкомускулни клетки в отговор на IFN-γ.
Фигура 1С: FACS анализ на човешки аортни гладкомускулни клетки в присъствие на IL-1a (1ng/cc) след 72 часа в клетъчна култура. Не се наблюдава възходяща регулация на CD40 експресията в гладкомускулни клетки.
Фигура 1D: FACS анализ на човешки аортни гладкомускулни клетки в присъствие на TNF-a (200 U/cc) след 72 часа в клетъчна култура. Не се наблюдава възходяща CD40 експресия в гладкомускулната клетка.
Фигури 2A-Y: Атомни координати на кристалната структура на разтворим извънклетъчен фрагмент от човешки CD40L , съдържащ остатъци Gly116-Leu261 ( в Brookhaven Protein Data Bank format). (SEQ ID NO.1).
Фигури 3A-3B: CD40 е експресиран in situ по повърхността на гладкомускулни клетки и макрофаги в лезии на сърдечна трансплантационна атеросклероза. Показани са микрофотографии на двуцветни имунохистохимични изследвания, демонстриращи във фиг. ЗА експресия на CD40 (кафяво оцветяване) върху гладкомускулни клетки (червено оцветяване), и макрофаги (червено оцветяване) на фигура ЗВ у пациент с трансплантационна атеросклероза .
Фигури 4А-4В: Нормална коронарна артерия от пациент с идиопатична кардиомиопатия, оцветена с хематоксилин-еозин (Фиг. 4А) и с анти-СО40 mAb (Фиг. 4В). Фиг. 4А. Забележете отсъствието на задебеляване на интимата или възпалителен инфилтрат. Фиг. 4В: експресията на CD40 е ограничена в ендотелните клетки,покриващи съдовия лумен. Липсва реактивност с едно изотипно-специфично контролно mAb (не е показана). (Фиг.4А, Фиг. 4В х25).
Фигури 5А-5В Фиброатероматозна плака в коронарна артерия от пациент с исхемична кардиомиопатия, оцветена с хематоксилин-еозин (Фиг. 5А) и с анти-СО40 mAb (Фиг.бВ). Фиг. 5А: Фиброзната обвивка, покриваща частично калцифицираната атероматозна сърцевина, съдържа множество възпалителни клетки (стрелки). Фиг. 5В: Повечето от възпалителните клетки във фиброзната обвивка са силно CD40+ (стрелки). Съседните на интимата гладкомускулни клетки и ендотелните клетки са също CD40+. (Фиг. 5А, Фиг. 5В х 25).
Фигури 6А-6С: Ранни лезия на интимата богата на пенести клетки у пациент със заболяване на коронарна артерия^свързано с трансплантат (TCAD). Оцветяване с хематоксилин-еозин (Фиг. 6А) и с анти-С040 mAb (Фиг.бВ, Фиг. 6С). Фиг.бА: Лезията на интимата съдържа множество пенести клетки, макрофаги и гладкомускулни клетки. Фиг. 6В: CD40 е силно експресиран по много от клетките на интимата в тази ранна лезия от TCAD. Фиг. 6С: В частност, пенестите клетки показват силно оцветяване за CD40. (Фиг. 6Ах25, Фиг. 6В х50, Фиг.бС х400).
Фигури 7A-7D: Възпалителен инфилтрат, във фиброзната обвивка на лезията на интимата на естестветата коронарна артерия (native СА), белязан с анти-С0401_ mAb (Фиг. 7А), контролно mAb (Фиг. 7В), анти-СО4 mAb (Фиг. 7С) и анти-С08 mAb (Фиг. 7D). Фиг. 7 А: Характерна цитоплазмена и клетъчно повърхностна CD40L имунореактивност , която е ограничена в лимфоцитите. Фиг. 7В: Същата лезия, оцветена с едно неподходящо, сродно на изотипа контролно mAb , не показва имунооцветяване. Фиг. 7С : Фактически в лезии на естествена СА всички лимфоцити (както и много макрофаги и пенести клетки) са CD4+ ; което насочва, че CD40L* лимфоцитите са CD4+ Т клетки. Фиг. 7D: CD8+ Т-клетките се срещат рядко в плаките на интимата на естествената СА. (Фигури 7А, 7Вх1000, Фигури 7С, 70x400).
Фигури 8А-8С: Дълбоки лимфоидни агрегати в интимата при TCAD белязани с aHTH-CD40L mAb (Фиг. 8А), контролно mAb (Фиг. 8В) и антиCD4 mAb (Фиг. 8С). Фиг. 8А: Повечето от CD4L* клетките при TCAD (стрелки) се откриват в лимфоидни агрегати на интимата и далеч от ендотелната повърхност. Фиг. 8В. Неподходящото, сродно с изотипа контролно mAb, не показва клетъчно оцветяване в такива лимфоидни агрегати на интимата. Фиг. 8С. Същите лимфоидни агрегати на интимата, както по-горе, съдържат почти изключително CD4+ Т клетки, което подсказва, че CD40L се експресира по CD4+ Т клетките в тези лезии . (Фигури 8А-8С х400).
Фигури 9А-9В: Огнище на ендотелит в TCAD, оцветено с анти-СО8 (Фиг.9А) и aHTH-CD40L (Фиг.9В) mAbs. Фиг. 9А: CD8+ Т клетки, прикачени за ендотелните клетки на лумена при TCAD, които са характерни за ендотелит. Повечето от CD8+ Т клетките се намират в? огнища от ендотелит, докато те присъстват нарядко в лимфоидните агрегати на интимата,отдалечени от ендотелната повърхност. Фиг.9В: Възпалителните клетки в огнища от ендотелит са CD40L+. Подобно на това, експресия на CD40L не беше открита по ендотелни клетки. (Фигури 9А-9В х400).
Фигури 10А-10В: Фиг. 10А: Двойно имунобелязане на лезия в интимата на естествени СА с анти-С040 mAb (кафяво) и анти-СО68 mAb (червено), един маркер за макрофаги. Централното натрупване на клетки (стрелки) показва силно оцветяване и за двете - CD40 и CD68. Фиг.10В: Двойно имунобелязане на TCAD с анти-СО40 mAb (кафяво) и mAb срещу анти-гладкомускулен актин (червено) демонстрира CD40+ гладкомускулни клетки (стрелки). CD40 реактивността е ограничена в гладкомускулните клетки на интимата (стрелки), докато миоцитите на медията бяха CD40-. (Фигури 10А-В х400).
Фигури 11A-11D: Серийни срези от нативни СА,демонстриращи микроваскуларизация на интимата,са оцветени с анти-СО34 (Фиг. 11 А), анги-СО40 (Фиг. 11В), анти-1САМ-1 (Фиг. 11С) и анти-VCAM-l (Фиг. 11D) mAbs. Фиг. 11А: Ендотелни клетки на интимата на новообразувани съдове.изявени с CD34 оцветяване. Фиг. 11 В. Новообразувани съдови ендотелни клетки експресират силно CD40. Намиращите се в съседство възпалителни клетки се бележат също за CD40. Фигури 11С, 11D. Огнища от неовасуларизация показват също силна ендотелна реактивност за ICAM-1 (Фиг. 11С), и VCAM-1 (Фиг. 11D). (Фигури 11А11D х400).
Фигури 12А-12С. Двойно имунобелязане на активна възпалителна лезия в интимата на нативни СА с анти-СО40 mAb (кафяво) и на адхезионни молекули (червено) с анти-1САМ-1 mAb (Фиг.12А), антиVCAM-l mAb (Фиг. 12В) и неподходящо контролно mAb (Фиг.12С). Фиг.12А : Фактически всички CD40+ (кафяви) клетки, предимно макрофагн (дълги стрелки) и миоцити на интимата (къси стрелки) са силно реактивни за ICAM-1 (червено). Фиг. 12В: Голям брой CD40+ (кафяви) възпалителни клетки и миоцити на интимата (стрелки) са реактвни също за VCAM-1 (червено). Фиг. 12С: Същата лезия на интимата,белязана двойно за CD40 (кафяво) и неподходящо, сродно на изотипа контролно АЬ вместо анти-1САМ-1 и анти-VCAM-l mAbs (червено). Различава се само кафяво оцветяване и липсва червено, което показва, че при използваните техники липсва интерференция между последователно приложените анти-С040 и анти-ICAM или анти-VCAM mAbs (вж. Материали и Методи) (Фигури 12А-С х400).
Фигура 13: Двойно имунобелязане на лезия в интимата на естествени СА с анти-рбб mAb белязане активира NF-kB (кафяво) и CD40 (червено). Активираният NF-kB беше открит изключително в ядра на CD40+ клетки (стрелки), повечето от които са макрофаги. (х400).
Подробно описание
Настоящето изобретение предоставя един метод за инхибиране активацията с CD40 лиганд на гладкомускулни клетки носещи CD40 по клетъчната повърхност. Методът се характеризира с поставянето на клетките в контакт с агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 от клетъчната повърхност, като агентът е представен в количество ефективно да инхибира активацията на клетките. В едно изпълнение на настоящето изобретение, агентът е способен да инхибира всяко взаимодействие между CD40 лиганд и CD40. “Взаимодействие между CD40 лиганд и CD40 по клетъчната повърхност се отнася за един или повече аспекти, функционални или структурни, на взаимозависимостта CD40-CD40 лиганд. Следователно, в едно изпълнение агентът, който инхибира взаимодействието,може да се свързва конкурентно с CD40 лиганда по начин такъв, че да блокира или намали свързването на CD40 лиганда към клетъчния CD40. В друго изпълнение , един агент, който инхибира взаимодействието може да се свързва с CD40 или CD40 лиганда, по начин,който не инхибира-: свързването на CD40 лиганда с клетъчния CD40, но който повлиява^ клетъчния отговор спрямо свързването на CD40 , като например чрез промяна нивото на обмяна на клетъчния CD40 или на комплекса CD40агент“чрез промяна кинетиката на свързване на CD40 с CD40 лиганда или чрез промяна на нивото или степента на клетъчна активация в отговор на свързването на CD40.
В едно специфично изпълнение СО40-носещите гладкомускулни клетки са гладкомускулни клетки на пикочния мехур, съдови гладкомускулни клетки, бронхиални гладкомускулни клетки, аортни гладкомускулни клетки или гладкомускулни клетки на стомашно-чревния тракт. В други специфични изпълнения гладкомускулните клетки на стомашно-чревния тракт са такива на хранопровода, стомаха или гладкомускулни клетки на червата , включително гладкомускулни клетки на тънките черва или на дебелото черво.
В друго изпълнение на настоящето изобретение, агентът инхибира свързването на CD40 лиганда с CD40 по повърхността на клетките.
В едно изпълнение на настоящето изобретение агентът е белтък.
В друго изпълнение на настоящето изобретение агентът е небелтък. Така както е използван тук, терминът небелтък включва всяко и всички съединения или агенти, които обхващат елементи.различни от простите или конюгираните полипептидни вериги. Това включва елементи като аминокиселини с непептидни връзки, небелтъчни аминокиселини като β, γ или δ аминокиселини, аминокиселини с D конфигурация или други небелтъчни аминокиселини, включително хомоцистеин, хомосерин. цитрулин, орнитин, γ-аминомаслена киселина, канаванин, дженколоза киселина или β-цианоаланин; монозахариди, полизахариди или части от въглехидрати; мастни киселини или части от липиди, части от нуклеотиди, части, съдържащи минерали или други небелтъчни елементи.
В друго изпълнение на настоящето изобретение, агентът е едно пептидомиметично съединение. Пептидомиметичното съединение може да бъде поне отчасти неприродно. . Пептидомиметичното съединение може да бъде малка миметираща молекула. Благодарение на наподобяването съединението може да има повишена стабилност, ефикасност, потентност и бионаличност благодарение на наподобяването Освен това съединението може да е с намалена токсичност. Пептидомиметичното съединение може да има повишена чревно-мукозна проницаемост Съединението може да бъде получено синтетично,« съединението на включва L- D- или неприродни настоящето изобретение може да аминокиселини алфа, алфа-двойнозаместени аминокиселини, N-алкил аминокиселини, млечна киселина (един изоелектронен аналог на аланина). Пептидният скелет на съединението може да има поне една връзка,заместена с PSI- (СН=СН) (Kempf et a. (1991) Inti. J. Peptide and Prot. Res. 38, 237-241). Съединението може освен това да включва трифлуоротирозин, р-СЕ фенилаланин, р-Вг-фенилаланин, поли-1_-пропаргилглицин, поли-D, Lалилглицин или поли-L- алилглицин.
В друго изпълнение на настоящето изобретение, пептидомиметичното съединение , притежаващо биологичната активност за инхибиране взаимодействието между CD40 лиганда и CD40 по клетъчната повърхност може да има една връзка, един пептиден скелет или един аминокиселинен компонент $ заместен с подходящ наподобяващ заместител. Примери за неприродни аминокиселини, които могат да бъдат подходящи наподобяващи аминокиселини, включват β-аланин, L-а-аминомаслена киселина, 1_-у-аминомасленй киселина, L-а-аминоизомаслена киселина, Ь-с-аминокапроева киселина, 7-аминохептаноева киселина, L- аспаргинова киселина, Lглутаминова киселина, цистеин (ацетамидометил), N-s-Boc-N-a-CBZ-Lлизин, N-e-Boc-N-a-Fmoc-L-nM3MH, L-метионин сулфонат (сулфон?), Lнорлевцин, L-норвалин, N-oc-Boc-N-SCBZ-L-ophmtmh, N-5-Boc-N-a-CBZ-Lорнитин, Вос-р-нитро-1_-фенилаланин, Вос-хидроксипролин, Boc-Lтиопролин. (Blondelie, S.E. et al., (1994) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38, 2280-2286.; Pinilla, C., et al. (1995) Peptide science 37, 221-240).
В едно специфично изпълнение, белтъкът включва едно антитяло или част от него, способно да инхибира взаимодействието между CF40 лиганда и CD40 по клетъчната повърхност. Антитялото е моноклонално или поликлонално антитяло. В едно по-специфично изпълнение, моноклоналното антитяло се свързва специфично за епитопа, за който специфично се свързва моноклоналното антитяло 5с8 (АТСС Accession No. НВ 10916). Пример за такова моноклонално антитяло е моноклоналното антитяло 5с8 (Accession No. НВ 10916). В друго изпълнение, антитялото се свързва специфично за CD40. Пример за едно анти-С040 антитяло е моноклоналното анги-човешко CD40, което се предлага от Genzyme Customer Service (Product 803702-01, Cambridge, МА). В друго изпълнение моноклоналното антитяло е едно химерно антитяло, едно приматизирано антитяло, едно хуманизирано антитяло или едно антитяло, включващо CDR област от един човешки индивид и скелета на антитялото от друг човешки индивид.
Смисълът на “химерно, “приматизирано и “хуманизирано антитяло и методите за тяхното получаване са известни за специалистите в тази област. Вж. например РСТ International Publication No. WO 90/07861, публикувана на 26 юли 1990 (Queen, et al.); и Queen et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1989) 86: 10029. Методи за получаване на приматизирани антитела са включени, например в РСТ International Publication No. WO/02108, съответстваща на International Application No. PCT/US92/06194 (Idee. Pharmaceuticals); и в Newman, et al., Biotechnology (1992) 10:1455-1460, която е включена като цитат в настоящата заявка.
Общо, хуманизирано антитяло е антитяло, характеризиращо се с една или повече определящи комплементарността области (CDRs complementarity determining regions) на едно не-човешко антитяло свързано функционално за човешка рамка от регионални сегменти. Могат да присъстват допълнителни остатъци,свързани по избор с нечовешкото антитяло. Обикновено поне една тежка или една лека верига включва не-човешки CDRs. Обикновено, не-човешките CDrs са миши CDRs. Общо, едно приматизирано антитяло е антитяло, характеризиращо се с една или повече определящи комплементарността области (CDRs) на антитяло от вид различен от нечовешкия примат, функционално свързано с рамка от регионални сегменти на един не-човешки примат. По избор могат да присъстват допълнителни остатъци,свързани с вида.от който произлиза CDR. Обикновено поне една тежка или една лека верига включват CDRs на виДч който не е не-човешки примат. Обикновено, CDRs са човешки CDRs. Общо, хи мерно антитяло е едно антитяло, чиито леки и/или тежки вериги съдържат области от различни видове. Например.един или повече променливи (V) регионални сегменти на даден вид могат да бъдат свързани за един или повече константни (С ) регионални сегменти на друг вид. Обикновено химерното антитяло съдържа миши променливи регионални сегменти, свързани с човешки постоянни регионални сегменти, въпреки че други видове бозайници могат да ги използват.
Моноклоналното антитяло 5с8 е получено от хибридомна клетка, която е депозирана на 14 ноември 1991 на American Type Culture 4 Collection ( ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA под защитата на Budapest Treaty for the International Recognition of the * Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure. Хибридомата е под ключов номер ATCC Accesion Number HB 10916.
В едно специфично изпълнение, частта от антитялото се характеризира с областта,определя ща комплементарността или с променливата област на леката или тежката верига. В друго специфично изпълнение, частта от антитялото се характеризира с определяща комплементарността област или с променлива област. В друго специфично изпълнение, частта от антитялото съдържа едно Fab или едно едноверижно антитяло. Едноверижното антитяло е получено от променливи области, свързани чрез белтъчни спейсери в една единична белтъчна верига.
В друго изпълнение белтъкът съдържа разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганда или част от нея, или вариант от нея, способна да инхибира взаимодействието между CD40 лиганда и CD40 по повърхността на клетките; или разтворима извънклетъчна област на CD40 или част от нея или вариант от нея, способна да инхибира взаимодействието между CD40 лиганда и CD40 по клетъчната повърхност. В едно специфично изпълнение, разтворимата извънклетъчна област на CD40 лиганда или CD40 е един мономер. В друго изпълнение разтворимата извънклетъчна област на CD40 е един олигомер.
Вариантите могат да се различават от естествено срещащите се CD40 или CD40 лиганд по аминокиселинна последователност или по начин, който не включва последователност, или и по двата начина. Варианти по аминокиселинна последователност се получават когато една или повече аминокиселини в естествено срещащите се CD40 или CD40 лиганд е заместена с различна естествена аминокиселина, с аминокиселинен дериват или с неприродна аминокиселина. Особено предпочитани варианти включват естествено срещащ се CD40 или CD40 лиганд, или биологично активни фрагменти от естествено срещащи се CD40 и CD40 лиганд, чиито последователности се различават от дивия тип последователност по едно или повече консервативни аминокиселинни замествания, което обикновено има минимално влияние върху вторичната структура и хидрофобната природа на белтъка или пептида. Вариантите могат също да имат последователности, които се различават по едно или повече консервативни аминокиселинни замествания, делеции или инсерции, които не премахват биологичната активност на CD40 или CD40 лиганда. Консервативни замествания обикновено включват замяна на една аминокиселина с друга с подобни характеристики. Такива са заместванията в следните групи: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолевцин; аспаргинова киселина, глутаминова киселина; аспаргин, глутамин; серин, треонин; лизин. аргнин; и фенилаланин, тирозин.
Неполярните (хидрофобни) аминокиселини включват аланин, левцин, изолевцин, валин, пролин, фенилалажн, триптофан и метионин. Полярните неутрални аминокиселини включват глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспаргин и глутамин. Положително натоварените (основни) аминокиселини включват аргинин, лизин и хистидин. Отрицателно натоварените (кисели) аминокиселини включват аспаргинова киселина и глутаминова киселина.
Други консервативни заместители могат да бъдат намерени в Таблица 1, а други са описани от Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).
Таблица 1: Консервативни аминокиселинни замествания
за аминокиселина ПСбд заместване с всяка една от
Аланин А D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Аргинин R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, He, D-lle, Om, D-GIn
Аспаргинова к-на D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Цистеин С D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Глутамин Q D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Глутаминова к-на Е D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn
Глицин G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Изолевцин
D-lle, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Левцин L D-Leu, Vai, D-Val, Met, D-Met
Лизин К D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met D-Met, lie, D-lle, Orm, D-Om
Метионин М D-Met, S-Me-Cys, lie, D-lle, Leu, D-Leu, Vai, D-Val, Norleu
Фенилаланин F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 or 5-phenylproline, cis 3,4 or 5 phenylproline
Пролин Р D-Pro, L-l-thioazolidine-4-carboxilic acid, D- or L-1-oxazolidine-4- carboxylic acid
Серин S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met (0), Vai, D-Val
Треонин Т D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (0), D-Met (O), Vai, D-Val
Тирозин Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Валин V D-Val, Leu, D-Leu, lie, D-lle, Met, D-Met
Други варианти в рамките на изобретението са тези с модификации, които повишават пептидната стабилност. Такива варианти могат да съдържат, например, една или повече непептидни връзки ( които заместват пептидните връзки) в пептидната последователност. Включени са също: варианти, които включват остатъци, различни от естествено срещащите се L-аминокиселини, като D-аминокиселини или несрещащи се в природата или синтетични аминокиселини като бета или гама аминокиселини и циклични варианти. Включването на D вместо L-аминокиселини в полипептида може да повиши неговата резистентност към протеази. Вж. например US 5 219 990.
Пептидите на настоящето изобретение могат също да бъдат модифицирани чрез различни промени като инсерции, делеции и замествания, консервативни или неконсервативни, където такива промени могат да допринесат за известни предимства при тяхното приложение.
В други изпълнения вариантите с аминокиселинни замествания, които са по-малко консервативни, могат също да допринесат за желани деривати, напр. чрез предизвикване на промени в заряда, конформацията и други биологични свойства. Такива замествания могат да включват, напр. заместване на хидрофилен остатък с хидрофобен остатък, заместване на един цистеин или пролин с друг остатък, заместване на един остатък с малка странична верига за остатък, притежаващ обемиста странична верига или заместване на един остатък с положителен заряд с остатък,притежаващ отрицателен заряд. Когато резултатът от дадено заместване не може да се предвиди със сигурност, дериватите могат да бъдат тестирани в съответствие с методите, включени тук за определяне наличието или отсъствието на желаните характеристики.
Варианти, които са в обсега на настоящето изобретение,включват белтъци и пептиди с аминокиселинни последователности ^притежаващи най-малко 80% хомоложност с извънклетъчната област на CD40 или извънклетъчната област на CD40 лиганда. Предпочитателно хомологията на последователността е най-малко 90% или най-малко 95%.
Така както е възможно да се преместят заместителите на скелета, също е възможно да се заместят функционални групи, които декорират скелета с групи, характеризиращи се с подобни свойства. Тези ] > замествания в началото ще бъдат консервативни,т.е. заместващата група ще има приблизително същия размер, форма, хидрофобност и заряд както оригиналната група. Модификации, които не са на последователността,могат да включват, например in vivo или in vitro химична дериватизация на части от естествено срещащите се CD40 или CD40 лиганда, както и промени в ацетилиране, метилиране, фосфорилиране, карбоксилиране или гликозилиране.
В едно следващо изпълнение, белтъкът, включващ извънклетъчната област на CD40 лиганда и CD40 , е модифициран чрез химични модификации, при които се запазва активността. Например белтъците могат да бъдат амидирани, сулфатирани, единично или множествено халогенирани, алкилирани, карбоксилирани или фосфорилирани. Белтъкат може също да бъде единично или множествено ацетилиран, както с една ацетилова група, с фарнезилова част или с една мастна киселина, която може да бъде наситена, мононенаситена или полиненаситена. Мастната киселина може също да бъде единично или множествено флуорирана. Изобретението включва съща метионинови аналози на белтъка, като например метионин сулфон и метионин сулфоксид аналози. Изобретението включва също соли на белтъците, като амониеви соли, включително алкил или арил амониеви соли, сулфат, фосфат, хидрогенфосфат, дихидрогенфосфат, тиосулфат, карбонат, бикарбонат, бензоат. бензсулфонови соли.
Разтворимият, мономерен CD40-L белтък може да включва цялата или част от извънклетъчната област на CD40-L. Извънклетъчната област на CD40-L съдържа домена, който се свързва с CD40. Така, разтворимият CD40-L може да инхибира взаимодействието между CD40L и СЦ40-носещата клетка. Настоящето изобретение предвижда SCD40-L да може да съставлява цялата извънклетъчна област на
CD40-L или на фрагмент или дериват, съдържащ домена, който се свързва с CD40.
Разтворимият CD40 белтък (sCD40) включва извънклетъчната област на CD40. SCD40 инхибира взаимодействието между CD40L и С040-носещите клетки. sCD40 може да бъде в мономерна или олигомерна форма.
В друго изпълнение на настоящето изобретение, белтъкът; характеризиращ се с разтворима извънклетъчна област на CD40 или част от нея, включва освен това една Рс област, слята с извънклетъчната област на CD40 или част нея. В едно специфично изпълнение Fc областта е способна да се свързва с протеин А или протеин G. В друго изпълнение Fc областта включва IgG, IgGi, lgG2, lgG3) lgG4, IgA, lgAb lgA2] IgM, IgD или IgE.
Разтворимият CD40/Fc слет белтък може да бъде получен, като се ? използват конвенционални техники с ензимно срязване и лигиране на». фрагментите от желаните последователности. Подходящи Fc области^ за слетия белтък са Fc области, които могат да се свързват с протеин А-. или протеин G, или такива, които са способни за разпознаване от едно, антитяло, което може да бъде използвано при пречистване или откриване на слетия белтък, характеризиращ се с Fc областта. Например, Fc областта може да включва Fc област от човешки IgG, или миши IgGi. Настоящето изобретение предлага нуклеинова киселина , която кодира слетия белтък CD40/FC
Добре известен е методът за създаване разтворими форми на мембранни молекули с рекомбинантни техники, при които последователностите кодиращи трансмембранни и цитоплазмени домени са делегирани. Вж. общо Hammonds et al. U 8 5 057.417. Освен това добре известни са методи за получаване на sCF40 и CD40/Fc слят белтък Вж. напр РСТ international Publication No WO 93/08207,
Fanslow et al., “Soluble Forms of CD40 Inhibit Biological Responses of Human B Cells”, J, Immunol., vol. 149, pp.655-60 (July 1992).
В едно изпълнение на настоящето изобретение, агентът е подбран чрез метод за скриниране.
В едно специфично изпълнение агентът е подбран чрез един метод за скриниране, характеризиращ се с изолиране на проба от клетки; култивиране на пробата при условия, разрешаващи активацията на С040-носещите клетки; поставяне в контакт на пробата с клетки, експресиращи белтък, който специфично се разпознава от моноклоналното антитяло 5с8 получено с хибридомата с ключов номер АТСС Accession No Η В 10916, или с белтък, който специфично се разпознава от моноклоналното антитяло 5с8 получено с хибридомата с ключов номер АТСС Accession No НВ 10916, и който е ефективен да активира С040-носещите клетки; поставяне в контакт на пробата с известно количество от агент способен да инхибира активацията на С040-носещите клетки ако агентът е способен да инхибира активацията на С040-носещите клетки; и определяне дали клетките експресиращи белтъка, който специфично се разпознава от моноклоналното антитяло 5с8, получен с хибридома с ключов номер АТСС Accession No. НВ 10916, активира CD40 - носещите клетки в присъствието на агента. Клетъчната проба може да бъде изолирана от различни тъкани, включително клетъчни линии в култура или клетки, изолирани от животно, като клетъчна суспенсия от цяла тъкан, клетки, произхождащи от костномозъчна биопсия или клетки изолирани от тъканна течност като кръв или лимфа.
В друго специфично изпълнение, агентът (молекула) е подбран въз основа на тридимензионална структура на разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганда или част от нея, способна да инхибира взаимодействието между CD40 лиганда и CD40 на носещите клетки.
Агентът може да бъде подбран от библиотека с известни агенти, модифициран от известен агент въз основа на тридимензионална структура или планиран и синтезиран de novo въз основа на тридимензионална структура. В специфични изпълнения агентът (молекула) е планиран чрез структурна оптимизация на оловен инхибиторен агент въз основа на тридимензионалната структура на един комплекс от разтворимата извънклетъчна област на CD40 лиганда или част от него с оловния инхибиторен агент. Оловен инхибиторен агент е молекула, която е идентифицирана и която, когато е в контакт с CD40 лиганд, се свързва и образува комплекс с разтворимата извънклетъчна област на CD40 лиганда, CD40, или част от тях, при което намалява способността на комплексирания или свързан CD40 , лиганд или на част от CD40 лиганда да активира С040-носещите клетки. В друго изпълнение, оловният инхибиторен агент може да, реагира чрез взаимодействие или с извънклетъчната област на CD40 ( лиганда, CD40, или в един третичен комплекс и с двата - частта от CD40 лиганда и CD40, като намалява способността на свързаните в комплекс CD40 лиганд-СО40 да активират CD40- носещите клетки. В г методите на изобретението CD40 лигандът може да бъде или разтворим или свързан с клетки, като активирани Т клетки и може да бъде или пълноразмерен нативен CD40 лиганд или части от него. Намалената способност за активация на носещи CD40 клетки може да бъде измерена по различни начини. Един начин да бъде измерена е да се покаже, че CD40 лигандът, в присъствие на инхибитор, предизвиква по-слаба степен на активация на С040-носещите клетки, в сравнение с третирането на клетки при същите условия с подобно количество CD40 лиганд, без инхибитор . Намалена способност за активация на CD40носещи клетки може също да бъде показана с по-високи концентрации на комплекса инхибитор-СО40 лиганд, необходима за получаване на подобна степен на активация на СО40-носещите клетки при сходни условия, в сравнение с несвързания CD40 лиганд. В краен случай, поставеният в контакт с инхибитор CD40 лиганд може да бъде неспособен да активира СО40-носещите клетки в концентрации и при условия, които позволяват активация на тези клетки с несвързан CD40 лиганд или с дадена част от него.
Агентът (молекула) може да бъде подбран чрез изчислителен метод за скриниране, като се използва кристална структура на един разтворим фрагмент от извънклетъчния домен на човешки CD40L > съдържащ остатъците Gly116-Leu261 (SEQ ID N0:1) (sCD40L (116-261)).
Кристалната структура, която може да бъде използвана с метода за скриниране.е определена при 2 А разрешителна способност с метода на молекулно заместване. Накратко, разтворим фрагмент от извънклетъчния домен на човешки CD40 лиганд, съдържащ аминокиселинните остатъци Gly116 до С-крайния остатък Leu261 найнапред беше получен в разтворима форма, след това пречистен и кристализиран. Кристалите са използвани за получаване на дифракционни данни. Молекулно заместване и фин анализ са правени с XPLOR пакет програми и QUANTA (Molecular Simulations, Inc.) Software. В частност, конструиран беше тридимензионален модел на човешки SCD40L, като бе използван миши CD40L модел и QUANTA моделиращ белтъчна хомология софтуер. Този модел е използван като проба за изчисления от кристалографски анализ и беше усъвършенстван с помощта на XPLOR. Този метод за определяне на кристалната структура на SCD40L е описан с повече подробности в Karpusas et al., “2 A cristal structure of an extracellular fragment of human CD40 ligand,” Structure (October 1995) 3 (10) : 1031-1039. Атомните координати на sCD40L (116-261) са представени на Фигури 2A-Y. Методът за скриниране за подбор на даден агент включва изчислителен дизайн на агента и повтаряща се структурна оптимизация, както е описано по-долу.
Агентът може да бъде един инхибитор, подбран като е използван компютъризиран план (дизайн) на агента. При използването на този метод, координатите на SCD40L кристалната структура се прилагат като едно въвеждане за компютърна програма, като DOCK , която извежда списък от молекулни структури, които се очаква, че се свързват с CD40L. Приложението на такива компютърни програми е добре известно. Вж. напр. Kuntz, “Structure-Based Strategies for drug design and discovery, “Science, vol. 257, p. 1078 (1992). Списъкът от молекулни структури може впоследствие да бъде скриниран с биохимични проби за свързване с CD40L. Компетитивен тип биохимични тестове, които са добре известни, могат да бъдат прилагани. Вж. напр. Bajorath et al., “Identification of residues of CD40 and its ligand which are critical for the receptor-ligand interaction, “ Biochemistry, 34, p. 1833 (1995). Структурите, които са открити, че се свързват с CD40L могат да бъдат използвани като агенти за настоящето, изобретение. Агентът може също да бъде модифицирана или планирана молекула, определена чрез структурна оптимизация в цикли . на взаимодействие. Прилагайки този подход, бе открит един нискомолекулен инхибитор на CD40L , като използвайки горния изчислителен подход или друг подход той може да бъде кокристализиран с SCD40L и кристалната структура на комплекса да бъде решена чрез молекулно заместване. Получената информация от молекулно заместване може да бъде използвана за оптимизиране структурата на инхибиторите, чрез разкриване как молекулите взаимодействат с CD40L. Молекулата може да бъде модифицирана за подобряване нейните физикохимични свойства, включително специфичност и афинитет за CD40L.
В едно изпълнение на настоящето изобретение агентът е малка молекула. Както се използва тук в текста, малка молекула е съединение с молекулно тегло между 20 Da и 1 х 106 Da, за предпочитане от 50 Da до 2 kDa.
Настоящето изобретение предоставя също един метод за инхибиране активацията на CD40 лиганд на гладкомускулни клетки» носещи CD40 по клетъчната повърхност на един индивид, характеризиращ се с въвеждане у индивида на агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 на клетъчната повърхност, като агентът е представен в количество, което е ефективно да инхибира активацията на клетките на индивида.
В специфични изпълнения, CD40- носещите гладкомускулни клетки са гладкомускулни клетки на пикочния мехур, съдови гладкомускулни клетки, гладкомускулни клетки на бронхите, аортни гладкомускулни клетки, коронарни гладкомускулни клетки, белодробни гладкомускулни клетки или гладкомускулни клетки на стомашно-чревния тракт. В поспецифични изпълнения, стомашно-чревните гладкомускулни клетки са такива на хранопровода, стомаха или гладкомускулни клетки на червата, включително гладкомускулни клетки на тънките черва и на дебелото черво.
В едно изпълнение на настоящето изобретение агентът инхибира свързването на CD40 лиганд с CD40 по клетъчната повърхност.
В едно изпълнение на настоящето изобретение агентът е белтък. В друго изпълнение на изобретението агентът е небелтък.
В едно специфично изпълнение белтъкът включва едно антитяло - или част от него, способно да инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 по клетъчната повърхност. Антитялото е моноклонално или поликлонаално антитяло. В едно по-специфично изпълнение, моноклоналното антитяло се свързва специфично с епитопа, за който специфично се свързва моноклоналното антитяло 5с8 (ATCC Accession No. НВ 10916). Пример за такова моноклонално антитяло е моноклоналното антитяло 5с8 (ATCC Accession No. НВ 10916). В други изпълнения моноклоналното антитяло е хи мерно антитяло или хуманизирано антитяло.
В едно специфично изпълнение частта от антитялото се характеризира с една определяща комплементарностга област или с променлива област на една лека или тежка верига. В друго специфично изпълнение, частта от антитялото включва една определяща комплементарностга област или една променлива област. В друго специфично изпълнение частта от антитялото се характеризира с едно Fab или едно едноверижно антитяло.
В друго изпълнение, белтъкът включва разтворима извънклетъчна област от CD40 лиганд или част от нея, способна да инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 по клетъчната повърхност . В едно специфично изпълнение разтворимата извънклетъчна област на CD40 лиганда или CD40 е един мономер. В друго изпълнение разтворимата извънклетъчна област на CD40 е един олигомер.
В друго изпълнение на настоящето изобретение, белтъкът, характеризиращ се с разтворима извънклетъчна област на CD40 или част от него, освен това включва една Fc област, слята с извънклетъчната област на CD40 или част от нея. В едно специфично изпълнение Fc областта е способна да се свързва с протеин А или протеин G. В друго специфично изпълнение Fc областта включва IgG, IgGt, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgAt, lgA2, IgM, IgD или IgE.
Често след като са въведени белтъците бързо се елиминират от циркулацията и поради това могат да проявят относително краткотрайна фармакологична активност. Следователно може да се налага често инжектиране на относително високи дози от биоактивни белтъци,за да се поддържа биологична ефикасност. Известно е, че белтъци. модифицирани чрез ковалентно присъединяване на водноразтворими полимери като полиетилен гликол, кополимери на полиетилен гликол и полипропилен гликол, карбоксиметил целулоза, декстран, поливинил алкохол, поливинилпиролидон или полипролин имат значително по-дълъг полуживот в кръвта след интравенозно инжектиране, отколкото съответните немодифицирани белтъци (Abouchowski et al., In: “Enzymes as Drugs, Holcenberg et al., eds. WileyInterscience, New York, NY, 367-383 (1981; Anderson, W.F. (1992) Human Gene Therapy, Science 256:808-813.; Newmark et al., (1982) J.Appl. Biochem. 4:185-189; and Katre et al., Proc. Nat Acad.Sci. USA 84:1487-1491 (1987)). Такива модификации също могат да повишат разтворимостта на белтъците във водни разтвори, да елиминират агрегацията, да повишат физичната и химична стабилност на белтъците и силно да намалят имуногенността и антигенността на белтъка. В резултат желаната /п vivo биологична активност маже да бъде постигната чрез въвеждане на такива полимер-белтък аддукти по-нарядко или при помалки дози отколкото с немодифициран белтък.
Прикачването на полиетилен гликол (PEG) към белтъци е особено полезно тъй като PEG има много ниска токсичност у бозайници (Carpenter et al., 1971). Например един PEG-аддукт към аденозин дезаминаза е утвърден в САЩ за употреба от хора за лечение на тежък комбиниран синдром на имунонедостатъчност (SCID). Второ предимство, което се постига чрез свързването на PEG е това, че ефективно се намалява имуногенността и антигенността на хетероложните белтъци. Например присъединяване на PEG може да бъде полезно при лечение на заболяване у други видове бозайници,без риск да се предизвика тежък имунен отговор. В едно изпълнение на настоящето изобретение , белтъкът маже да бъде предоставян в микроинкапсулирана форма, така че да се намалява или предотвратява имунен отговор срещу белтъка у приемника. Белтъкът може също да се доставя микроинкапсулиран в една мембрана, като липозомата.
Полимери като PEG могат удобно да бъдат прикачвани към един или повече реактивни аминокиселинни остатъци в един белтък, такива като алфа-амино група на аминокрайна аминокиселина, епсилон аминогрупите на страничните вериги на лизин, сулфхидрилните групи на страничните вериги на цистеин, карбоксилните групи на страничните вериги на аспартил и глутамил, алфа-карбоксилната група на карбоксил-крайната аминокиселина, страничните вериги на тирозина или за активирани производни на гликозилните вериги, прикачени за аспаргинови, серинови или треонинови остатъци.
Описани са много активирани форми на PEG,подходящи за директна реакция с белтъци. Подходящи PEG реагенти за реакция с белтъчни аминогрупи включват активни естери на карбоксилна киселина или карбонатни производни, особено тези,при които оставащите групи са N-хидроксисукцинамид, р-нитрофенол, имидазол или 1-хидрокси-2нитробензол-4-сулфонат. PEG производни .съдържащи малеимидо или халоацетил групи,са полезни реагенти за модификации на свободните сулфхидрилни групи на белтъка. Подобно, PEG реагенти,съдържащи аминохидразин или хидрозидни групи са полезни за реакция с алдехиди, генерирани чрез перйодатно окисление на въглехидратните групи в белтъци.
Обектът, който може да бъде третиран с описаните по-горе методи е животно. За предпочитане животното е бозайник. Примери на бозайници, които могат да бъдат третирани. включват , но не се ограничават до човешки индивиди, не-човешки примати, гризачи (включително плъхове, мишки, хамстери и морски свинчета), крава, кон, овца, коза, свиня, куче и котка.
В едно изпълнение на настоящето изобретение, агентът е подбран чрез метод за скриниране.
В едно специфично изпълнение , агентът е подбран чрез метод за скриниране, който се характеризира с изолиране на проба от клетки; култивиране на пробата при условия позволяващи активация на CD40носещите клетки; поставяне в контакт на пробата с клетки, експресиращи белтък, който специфично се разпознава от моноклонално тяло 5с8, получено от хибридома с ключов номер АТСС Accession No НВ 10916 или с белтък, който специфично се разпознава от моноклонално антитяло 5с8 получено от хибридома с ключов номер АТСС Accession No НВ 10916, ефективен да активира СО40-носещите клетки; поставяне в контакт на пробата с известно количество агент, ефективно да инхибира активацията на С040-носещите клетки, ако агентът е способен да инхибира активацията на С040-носещите клетки; и определяне дали кпетките^експресиращи белтъка, който специфично се разпознава от моноклонапното антитяло 5с8, получено от хибридомата с ключов номер АТСС Accession No, НВ 10916 или с белтъка, който специфично се разпознава от моноклонапното антитяло 5с8, получено от хибридома с ключов номер АТСС Accession No. НВ 10916, активира СО40-носещите клетки в присъствието на агента. Клетъчната проба може да бъде изолирана от различни тъкани, включително клетъчни линии в култура или клетки, изолирани от животно, като клетъчна суспензия от цяла тъкан, клетки,произхождащи от костномозъчна биопсия или клетки, изолирани от тъканна течност, -като кръв или лимфа.
В друго специфично изпълнение молекулата (агентът) е подбрана въз основа на тридимензионална структура на разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганд или част от него, способна да инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 по клетъчната повърхност. Молекулата може да бъде подбрана от една библиотека от известни молекули, модифицирани от известна молекула въз основа на тридимензионална структура, или планирана и синтезирана de novo въз основа на тридимензионална структура. В специфични изпълнения агентът или молекулата са планирани чрез структурна оптимизация на един оловен инхибиторен агент въз основа на тридимензионална структура на комплекс от разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганд или част от него с оловния инхибиторен агент.
Метод за третиране
Настоящето изобретение предоставя метод за приложение в индивид, при заболяване,засягащо гладкомускулни клетки, включващ гореописания метод за инхибиране активацията с CD40 лиганд на гладкомускулни клетки,носещи CD40 по клетъчната повърхност, който се характеризира с въвеждане у индивида на един агент, способен да^ инхибира взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 по клетъчната, повърхност, като агентът е представен в количество, ефективно да инхибира активацията на клетките в индивида.
В едно изпълнение на настоящето изобретение заболяването; засягащо гладкомускулни клетки v е съдово заболяване. В едно специфично изпълнение съдовото заболяване е атеросклероза.
В друго изпълнение заболяването.засягащо гладкомискулни клетки,е стомашно-чревно заболяване. В едно специфично изпълнение стомашно-чревното заболяване е подбрано от група,състояща се от смущения в мотилитета -на хранопровода, възпалително чревно заболяване и склеродермия.
В едно изпълнение заболяването,засягащо гладкомускулни клетки,е заболяване на пикочния мехур.
Съединенията на настоящото изобретение могат да бъдат въведени по всякакъв приемлив в медицинската практика начин. Това може да включва инжекции, парентерапни пътища като интравенозно, интрасъдово, интраартериално, подкожно, мускулно, интратуморно и др. както и орално, назално, очно, ректално, топично или инхалационно. Специфично е включено в изобретението също и продължително въвеждане като депо инжекции на разрушаващи се импланти, приложени директно при операция.
Съединенията са въвеждани във всякакви дози на телесно тегло и всякаква честота на дозировката, която съответства на медицинската практика. Приемливи дозировки включват един диапазон от около 0.01 и 200 мд/кд телесно тегло. Предпочитан диапазон на дозировка е между 0.1 и 50 мд/кд. Практически предпочитана е дозировка от около 1 и 30 мд/кд. Дозировката е повтаряна на интервали от ежедневно до всеки следващ месец. Предпочитана схема на дозировка е съединението на изобретението да се въвежда ежедневно първите три дни от лечението, след което съединението се въвежда през 3 седмици, като всяко въвеждане е интравенозно на 5 или 10 мд/кд телесно тегло.. Друга предпочитана схема е да се въвежда съединение на изобретението ежедневно венозно в доза 5 мд/кд телесно тегло за първите три дни от третирането, след това съединението се въвежда подкожно или мускулно всяка седмица по Юмд на индивид. Друга предпочитана схема е да се въвежда единична доза от съединението на изобретението парентерално в доза 20 мд/кд телесно тегло, последвано от въвеждане на съединението подкожно или мускулно всяка седмица в доза 10 мд на индивид.
Съединенията на изобретението могат да бъдат въвеждани като единична дозировка при известни индикации, като предпазване от имунен отговор срещу антиген, спрямо който индивидът е излаган за кратко време 7 като екзогенен антиген, въведен еднократно при лечението. Примери за такъв антиген могат да включват едновременно въвеждане на съединението на изобретението заедно с вектор за генна терапия или терапевтичен агент като антигенно лекарство или кръвен продукт. При индикации, където антигенът хронично присъства, като при контролиране на имунната реакция спрямо трансплантирана тъкан или хронично въвеждани антигенни лекарства, съединенията на изобретението се въвеждат на интервали с продължителност според медицинската индикация, вариращи от дни или седмици до доживотно .
Възпалителните отговори се характеризират със зачервяване, подуване, локална температура и болка, като резултат от капилярна, дилатация, с оток и миграция на фагоцитиращи левкоцити. Възпалението е допълнително определено от Gallin (Chapter 26,. Fundamental Immunology, 2nd Ed., Raven Press, New York, 1989, pp. 721-. 733), което тук е включено като цитат.
Изобретението би могло да бъде по-добре разбрано от следващите Експериментални подробности Специалистът в тази област, обаче може веднага да оцени, че специфичните методи и резултати, които се обсъждат, са само илюстративни за изобретението, както е описано попълно в претенциите, които следват по-нататък.
Експериментални подробности
Примери 1 и 2 по-долу демонстрират, че възпалителни цитокини индуцират гладкомускулни клетки да експресират CD40. Освен това, те показват, че CD40L медиираните сигнали регулират функциите на гладкомускулни клетки.
ПРИМЕР 1
Използван е FACS анализ за изследване дали гладкомускулните клетки експресират CD40. Човешки аортни гладкомускулни клетки са култивирани в &-ямкови платки в М199 среда с добавка на 25% FCS (телешки фетален серум), 5% човешки серум, хепарин 90 pg/ml , ендотелиален растежен фактор 15 цд/т1 и 1% пеницилин-стрептомицин. Хранителната среда е сменяна всеки 2-3 ден и когато клетките са близко до конфлуентност, те са култивирани в присъствие или отсъствие на lFN-γ (1000 U/cc), IL-1a (1 ng/cc или TNF-α (200 U/cc) за 72 часа. Клетките са отделяни и събирани след третиране с трипсинЕДТА и е определяна експресията на CD40 чрез FACS анализ, като са използвани анти-С040 mAb G28.5. Клетките също са оцветявани с едно изотипно негативно контролно mAb, а анти-СО54 (ICAM-1) mAb е използвано като положителна контрола.
Както е представено на фигура 1А гладкомускулните клетки не експресират конститутивно CD40 . IFN-γ за разлика от IL-1 а или TNF-a, регулира възходящо експресията на CD40 в гладкомускулни клетки. (Фигури 1А, 1В и 1С). Тези проучвания показват, че TNF-γ регулира възходящо експресията на CD40 на гладкомускулни клетки от човешка аорта.
ПРИМЕР 2
Изследвана е експресията на CD40 in situ по повърхността на гладкомускулни клетки. Клетки, откриващи се в медната на нормални съдове, които морфологично наподобяват гладкомускулни клетки не реагират с анти-СО40 mAb. Клетки обаче, които морфологично наподобяват гладкомускулни клетки и които се откриват във възпалителни лезии при бързоразвиваща се атеросклероза, свързана с трансплантация, експресират CD40 in situ. Тези изследвания насочват, че възпалителни цитокини ицдуцират гладкомускулни клетки да експресират CD40. Освен това, тези проучвания показват, че медиираните с CD40L сигнали регулират функциите на гладкомускулната клетка.
ПРИМЕР 3
CD40I/CD4* Т клетки и CD40* прицелни клетки се откриват при атеросклероза и заболяване, свързано с коронарна трансплантационна атеросклероза.
Активирани ендотелни клетки (ЕС), макрофаги (Мас) и CD4+ Т клетки са налице рано в лезии от коронарна атеросклероза (СА) и от сърдечна трансплантационна атеросклероза (ТА). Тъй като CD40L е една акгивационно-индуцируема CD4+ молекула по повърхността на Т клетките, която освобождава контакт-зависими активиращи сигнали към CD40+ прицелни клетки, включително Е (възходящо регулирана експресия на ICAM, VCAM и Е-селектин) и Мас (индуцира експресията на N0, TNF-α и IM) ние изследвахме in situ експресията на CD40L и CD40 в СА (п=5) и ТА (п=5). Експресията на CD40L и CD40 е определяна, като са използвани анти-СО401_ гпАЬ 5с8, анти-С040 гпАЬ G28.5 или подходящи контролни mAbs. Замразени срези от нормални коронарни артерии (п=3) не съдържат Т клетки и експресията на CD40 е ограничена в ЕС. За разлика от това, лезии. свързани с СА и ТА съдържат CD40L+CD4+ Т клетки, доказани с имунобелязане на серийни срези. В допълнение на това, експресията на CD40 в замразени срези от пациенти с СА и ТА е подчертано повишена в ЕС, като инфилтрира мононуклеарните клетки, пенестите клтки и гладкомускулни клетки на интимата (SMC). Два имунохистохимични анализа на фиксирана в парафин тъкан и използвайки SC (гладкомускулен актин) или Мас (НАМ-56) специфични маркери потвърждават експресията на CD40 по повърхността на тези клетки. Интересно е, че SMC на интимата, отдалечени от възпалителни клетки и SMC на медната, са CD40+, което насочва, че локалните възпалителни медиатори регулират възходящо експресията на CD40 по SMC in vivo. Възходящата регулация на CD40 и CD40L+CD4+ Т клетки се открива във всички етапи на ТА и е най-силно проявена в ранни лезии на СА, включително мастни елементи. Общо тези изследвания насочват, че CD40L+ Т клетки могат да взаимодействат с CD40* прицелни клетки в СА и ТА и допринасят за патогенезата на тези заболявания, като стимулират продукцията на про възпалителни молекули.
ПРИМЕР 4
CD40 е експресиран по гладкомускулни клетки и макрофаги в лезии на сърдечна трансплантационна атеросклероза.
В условия in situ е изследвана експресията на CD40 в естествена атеросклероза или в атеросклероза,свързана с трансплантант с два цветни имунохистохимични анализа. Проведени са имунохистохимични изследвания с двойно белязане на коронарни артерии, които са фиксирани в 10% буфериран формалин и са включени в парафин. Срезите са депарафинирвани в ксилол, хидратирани са и ендогенната пероксидаза е инхибирана с 1 5% Н2О2 в 80% алкохол. След това срезите са хидролизирани с 0.01% пепсин в HCI (pH 1.5) за 15 мин. при 37°С. След това срезите са промивани с PBS и са инкубирани с 10% конски серум за 20 минути за блокиране на неспецифичното оцветяване. След това анти-СО40 оцветяването е детектирано с Vector ААВС Elite Kit (Vector), последователно използвайки биотинилирано вторично антитяло, авидин-пероксидазен комплекс и 3,3’диаминобензидин като проявител. Наличието на CD40 се открива като кафяво оцветяване. След това срезите са изплаквани с PBS и са блокирани повторно с 10% конски серум. След това срезите са инкубирани за 1 час с mAbs специфични за гладкомускулни клетки (гладкомускулен актин) или макрофаги (НАМ 56). След това първичните антитела са конюгирани с алкална фосфатаза, като е използвана авидин-биотин система (Vector). Използван е Vector Red (Vector) за откриване активността на алкалната фосфатаза и оцветяването дава червена реакция. Така двойнобелязаните клетки се оцветяват в кафяво (CD40) и червено (гладкомускулни клетки или макрофаги). За контрол на интерференция между двете имунохистохимични процедури, използвани за двойнобелязания анализ, серийни срези от всеки вид са оцветявани или за CD40, за гладкомускулен актин или за НАМ 56. Вж. фигури ЗА и ЗВ. Контролните срези показват същото разпределение на имунореактивността за всяко от първичните mAbs , както двойно оцветените срези. ’
ПРИМЕР 5. Разпределение на CD40L и CD40 в естествена коронарна атеросклероза и в сърдечна трансплантационна коронарна атеросклероза: Корелация на CD40 експресията с наличието на междуклетъчни адхезионни молекули, активиран NFкВ и наличие на лимфоцити.
Т клетките играят роля в патогенезата на естествената коронарна атеросклероза (СА) и свързаното с трансплантант заболяване на коронарна артерия (TCAD), обаче механизмите, с които Т клетките взаимодействат с други клетки в тези лезии са напълно неизвестни. CD40L е една активационно-индуцируема CD4* молекула по повърхността на Т клетките, която взаимодейства с CD40+ прицелни клетки, включително макрофаги и ендотелни клетки и индуцира продукцията на про възпалителни молекули, включително ICAM-1 и
VCAM-1. Освен това е известно, че лигирането на CD40 активира транскрипционния фактор NF-kB. За да се проучи дали взаимодействията CD40L-CD40 играят роля в патогенезата на СА или TCAD бяха проведени имунохистохимични изследвания върху експресията на CD40L и CD40 на замразени срези от коронарни артерии, получени от сърдечни алографни реципиенти с СА (п=10) или TCAD (п=9). Използвани са две различни анти-С040!_ mAb и е установено, че експресията на CD40L е ограничена в инфилтриращите лимфоцити в СА и TCAD. Експресията на CD40 е подчертано повишена по повърхността на ендотелните клетки, пенестите клетки, макрофагмте и гладкомускулни клетки при двете заболявания. Двойно имунобелязане показва много CD40+ клетки, коекспресиращи ICAM-1, VCAM-1 или активираната форма на NF-kB. Нивото на експресия на CD40, ICAM-1 и VCAM-1 показва статистически значима корелация с тежестта на заболяването и с количеството лимфоцити в интимата. Общо тези изследвания демонстрират наличието на активирани CD40L+ и CD40+ клетки в лезии при СА и при TCAD и насочват, че медиираните с CD40L взаимодействия с CD40+ макрофаги, пенести клетки, гладкомускулни клетки и/или ендотелни клетки могат да допринасят за патогенезата на тези заболявания.
Няколко вида данни показват, че клетъчно-медиирани имунни механизми допринасят за възпалителните лезии (1-4) , характерни за естествената коронарна атеросклероза (СА) (5-10) и свързаната с тарнсплантант коронарно артериално заболяване (TCAD) (11-13). Например, инфилтриращи интимата Т клетки, които експресират активационни маркери като CD25 и МНС Клас II молекули са налице рано при развитието на съдови лезии и при двете заболявания (5,14). Обикновено се намират активирани макрофапи в лезиите и при двете заболявания, като цитокини,свързани със зависимите от Т клетки имунни отговори, включително IFN-γ, IL-1 и TNF-oc (5-17). Други данни за това, че Т клетките могат да играят патогенетични роли при СА, са свързани с изолирането на CD4+ Т клетъчен клон от човешки фиброатероматозни СА плаки , които пролиферират и секретират INF-γ, когато е налице заедно с окислен LDL (18), основна съставка на лезиите както при естествената СА .така и при TCAD (1,19, 20 ). Освен това, предизвиканите от хиперлипидемия атеросклеротични лезии са намалени при мишки,третирани с анти-СО4 mAbs (21). Подобно на това, съдови лезии при TCAD са значително подобрени, когато алографите са поставени в миши линии, които генетично са дефицитни на Т клетки (13) или са третирани с анти-СО413 или анти-IFN-y mAbs (22). Общо, тези данни определено насочват, че Т клетките и производните на Т клетки ефекторни молекули участвуват в патогенезата на тези заболявания (9, 23, 24).
CD40L е една 30-33 kDa MW повърхностна молекула, експресирана по активирани CD4+ Т клетки, които произвеждат контакт-зависимй сигнали на CD40+ прицелни клетки, като В клетки (25-29). CD40L медиирани сигнали са критично важни при развитието на зависими от Т клетки хуморални имунни отговори in vitro и in vivo (30). Понастоящем е известно, че CD40L-CD40 взаимодействията играят също роля при клетъчно медиираните имунни отговори in vitro и in vivo (31, 32). Интересно е, че макрофагите и ендотелните клетки, клетъчни типове, които са известни,че участват в патогенезата на СА и TCAD , също експресират CD40 (33-37). Освен това, лигирането на CD40 по макрофагите и ендотелните клетки in vitro индуцира продукцията на молекули, които повишават имунните отговори -и/или имат провъзпалителени ефекти. Например, взаимодействията CD40L-CD40 повишават експресията на МНС Клас II и костимулиращата молекула CD86 по макрофаги in vitro (38). Освен това, лигирането на CD40 по макрофаги индуцира продукцията на цитокини (TNF-a, IL-1b, IL-12) , хемокини (IL-8, MIP-1a), азотен окис (NO) чрез индукция на N0 синтаза
2, прокоагулант белтъчен тъканен фактор и металопротеинази на матрикса (33, 34, 39-42). CD40L-CD40 взаимодействията регулират възходящо вътреклетъчните адхезионни молекули CD54 (ICAM-1), CD106 (VCAM-1) и CD62E (Е-селектин) по ендотелните клетки (35-37). Много от ефектите на CD40 лигирането са зависими от активацията на транскрипционния фактор NF-kB (43-45).
Общо всички тези открития допринасят за схващането, че лигирането на CD40 по повърхността на различни прицелни клетки може да увеличи CD4+ Т клетъчно медиираната възпалите лна реакция in vivo. В подкрепа на тази хипотеза, експресията на CD40 е повишена в бъбречни клетки на пациенти с lupus гломерулонефрит, IgA нефропатия и ANCA+ гломерулонефрит и в кожата на пациенти с псориазис (35,46). Освен това, CD40L+ Т клетки инфилтрират бъбреците на пациенти с възпалителни бъбречни заболявания (46). Поради това, че взаимодействията на Т клетки с макрофаги, ендотелни клетки и възможно други клетки, играят роля в патогенезата на СА и TCAD, в настоящето проучване е изследвана експресията на CD40L и CD40 при тези две заболявания,като е използвана имунохистохимия. CD40L е експресиран по повърхността на Т клетки и експресията на CD40 е повишена по ендотелни клетки, гладкомускулни клетки, макрофаги и “пенести клетки в лезии на интимата и при двете заболявания. Освен това, използвайки двойно имунооцветяване е открито, че много CD40+ клетки в тези лезии коекспресират CD54, CD106 и активираната форма на NF-kB.
МЕТОДИ: ЧОВЕШКИ КОРОНАРНИ АРТЕРИИ
Получени са сегменти от главната лява коронарна артерия или проксимална част от лявата предна нисходяща артерия от експлантираните сърца на 23 реципиента с присадени сърца. Девет пациенти се претърпели ретрансплантация, тъй като са развили тежко свързано с трансплантант заболяване на коронарната артерия (TCAD). При тези пациенти преживяването на първия алографт е било за период от 38 до 103 месеца. На десет пациенти са направени алографти поради това, че са развили тежко заболяване на коронарна артерия и исхемична кардиомиопатия. Контролни коронарни артерии без атеросклеротични изменения са получени от експлантираните сърца на 4 пациенти; 3 от тях с идиопатична кардиомиопатия, един със сърдечна саркома. Части от всеки съд са моментално замразени в изопентан при -80°С и са направени серийни срези с дебелина 4 мм на криостат (Reichert Histostat) . Срезите са поставяни върху предметни стъкла^ покрити със сиалин, изсушени са на въздух, фиксирани са в студен ацетон за една минута и в 1:1 смес студен ацетон/хлороформ за следващи 7 минути и са съхранявани на -80°С. По един срез от всяка коронарна артерия е фиксиран в 10% формалин и е оцветяван с хематоксилин-еозин за хистологична оценка. »
ПЪРВИЧНИ АНТИТЕЛА
Ahth-CD40 хибридома G28.5 (lgG1) са закупени от American Type Culture Collection (Rockville, MD). Ahth-CD40L mAb 5C8 (lgG2a) e генерирано както е описано по-рано (28). И двете G28.5 и 5С8 mAbs са пречистени от асцити.като е използвана колона с протеин G (Pharmacia, Piscataway, NJ). Едно допълнително антитяло анти-СО4о!_ mAb (IgG 1) е закупено от Calbiochem (San Diego, СА). Едно IgM анти-СО40 mAb е получено от Catlag (Burlingame, СА) и е използвано за изследвания с двойно имунооцветяване. Моноклонални Abs за CD3, CD4, CD8, CD34, CD68 (Novocastra, Burlingham, СА, всички lgG1) и гладкомускулен актин (SMA) (DAKO, Carpenteria, СА, lgG2a) са .
използвани за диференциране между различни клетъчни типове плаки в интимата, включително Т клетки (CD3, CD4 или CD8), ендотелни клетки (CD34), макрофаги (CD68) и гладкомускулни клетки (SMA). Анти-1САМ-1 (lgG1) и анти-VCAM-l (lgG1) mAbs са закупени от CHEMICON™ (Temecula, СА). Разпределението на активирания NF-kB е показано с рббгпАЬ (lgG3) (BOEHRINGER MANNHEIM™) , който се свързва за един епитоп на р65 субединицата на NF-kB, блокирана от IkB и следователно достъпна когато NF-kB е активиран чрез дисоциация на IkB (47). Изотипни контролни mAb (Морес 21, 22) са получени от SIGMA™ (St.Louis, МО).
ИМУНОХИСТОХИМИ Я
Замразени срези са промивани с буфериран фосфатен физиологичен разтвор (PBS) и ендогенната пероксидаза е инхибирана в 0.5% водороден прекис. Срезите са блокирани” с 10% серум от коза и агрегриано човешко lg (80 mg/ml) в PBS и след това са инкубирани за 1 час с указаното първично mAb или съответното контролно mAb. Използвани са замразени срези от сливици с фоликуларна хиперплазия като положителни контроли за определяне на оптималното разреждане за всяко mAb. Първично mAb, свързано с прицелен антиген е свързвано с белязяно с биотин изотипно специфично анти-мишо lgG1 от коза, lgG2a, lgG3 или IgM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), което след това е конюгирано с комплекси от авидин-биотин-пероксидаза (VECTOR ELITE KIT™, VECTOR™, Brlingham, СА). Пероксидазната активност е определяна с хромогена (червено оцветяване) З-амино-9-етилкарбазол (АЕС , VECTOR™, Buriingham, СА) и срезите допълнително са оцветявани с Mayer’s хематоксилин (SIGMA™, St.Louis, МО).
Използвана е имунохистохимия с двойно белязане за идентифициране на клетъчни типове, които експресират CD40 и за определяне разпределението на CD40 по отношение на ICAM-1, VCAM-1 или активиран NF-kB в атеросклеротични лезии. Всички срези най-напред са имунобелязани с IgM анти-СО40 mAb. Вторичното АЬ е биотинилирано козе анти-мишо IgM, което след това е конюгирано с комплекс от авидин-биотин-пероксидаза. Използваният хромоген за определяне наличието на анти-С040 IgM mAb е 3,3’-диаминобензидин (кафяво). След това срезите са изплаквани обилно и са инкубирани с второ първично mAb прицелно за клетъчно специфичен маркер за гладкомускулни клетки (SMA) или за макрофаги (CD68), левкоцитни адхезионни молекули (ICAM-1, VCAM-1) или активирана форма на NFkB. Всяко от тези втори първични mAbs са или lgG1, lgG2 или lgG3 изотипове. Подходящото изотипно специфично биотинилирано вторично антитяло е прилагано и конюгирано с един авидин-биотиналкална фосфатаза комплекс (VECTOR™, Burlingham, СА). Активността’ на алкалната фосфатаза е изявявана с хромогена Vector Red (VECTOR™, Burlingham, СА). Интерференцията между последователно приложените оцветителни процедури е избягвана,като са използвани4 различни имуноензимни техники (пероксидаза вместо алкалнафосфатаза) и изотипни специфични вторични Abs за всеки прицелен антиген. Освен това, са изготвяни двойно белязани контролни срези, при което едно от двете първични mAbs е замествано с изотипно подобно контролно mAb.
Полуколичествен анализ на лезиите
Степента на атеросклеротичните лезии във всеки срез е оценявана количествено по степента на стеснение на съдовия лумен по скала от 0 до 4, при което 0 означава липса на стеснение, 1 - по-малко от 25%, 2 по-малко от 50%. 3 по-малко от 90% и 4 над 90% стеснение на лумена. Всяка лезия на коронарна артерия също е оценявана за съдържание в интимата на макрофаги, гладкомускулни клетки, пенести клетки, ендотелни клетки (неоваскуларизация) 48 и Т клетки като с 0 е означавана липса на съответния клетъчен тип, 1 - редки изолирани клетки, 2 - малки натрупвания от клетки, 3 - наличие на огнищни плътни агрегати и 4 - плътни агрегати, присъствуващи навсякъде в плаката. Подобно, наличието на CD40, ICAM-1 и VCAM-1 е отчитано по скала от 0 до 4, на която 0 означава отсъствие на съответната молекула, 1 наличие на молекула нарядко в клетки, 2 - наличие на молекулата в помалко от 50%, 3 - по-малко от 90% и 4 - в повече от 90% от всички клетки (49). Поради това, че експресията на CD40L в положителни проби е ограничена до изолирани клетки, нейното наличие не е податливо на количествена оценка.
Статистически анализ
Анализирани са разликите в хистологичните особености измежду групи от проби, като е използван непараметричният метод на KruskalWallis. Връзката между променливите е оценявана с помощта на корелацията на Spearman.
РЕЗУЛТАТИ: Нормални коронарни артерии
Сегменти от коронарни артерии от 4 контролни пациенти не показват заделебяване на интимата или възпаление при оцветяване с хематоксилин-еозин /Н&Е (Фигури 4А-4В). Конкретно, макрофаги, гладкомускулни клетки, пенести клетки или лимфоцити не са открити в интимата и няма имунореактивни клетки спрямо което и да е антиCD40L гпАЬ, използвано в това изследване. CD40 имунореактивност беше налице, ограничена в ендотелните клетки покриващи съдовия лумен на контролните артерии (Фиг 4В). VCAM-1 или активиран NF- кБ не са експресирани в контролните съдове и ICAM-1 е слабо експресиран нарядко в съдови ендотелни клетки.
Хистология на естествена СА и TCAD
В 7 от 10 пациенти с СА, сегменти от коронарна артерия разкриват изпъкнали фиброатероматозни плаки с ексцентрично стесняване, безклетъчна богата на липиди сърцевина, холестеролови натрупвания и покриваща фиброзна капсула. Клетъчността на лезиите беше найголяма в “изпъкналите” области, които съдържат макрофаги и лимфоцити (Фиг. 5А). Има още разпръснати гладкомускулни клетки, макрофаги, пенести клетки и огнища с неоваскуларизация в лезиите на интимата. Плаки от 3 пациента с умерени ранни съдови лезии бяха ексцентрични, малки, богати на макрофаги, “пенести” клетки и лимфоцити.
Лезии на коронарна артерия в 9 пациенти с TCAD показват периферно задебеляване на интимата с подчертано стесняване на лумена (Таблица 2).
Таблица 2; Полуколичествена оценка (скала 0-4) на клетъчния състав на лезии в интимата на естествена коронарна атеросклероза (СА) и сърдечна трансплантационна атеросклероза на коронарна артерия (TCAD) и имунореактивност за CD40, ICAM-1 и УСАМ-1.
Стойностите са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение.
Плака на интимата Контрола (п=4) СА (п=10) TCAD (п=9)
Дебелина 0.3 + 0.5 2.1 + 0.9* 3.1 ±0.8*
CD4+ лимфоцити 0 1.3 ±0.9* 3.2+ 0.8*
CD8+ лимфоцити 0 0.3 + 0.5 2.6 ±1.1*
макрофаги (CD68) 0.5 + 0.6 2.1 +0.8* 3.8 + 0.4*
Пенести клетки 0 1.2 ±0.8* 2.4 +1.3*
Гладкомускулни клетки 0 1.7 + 07 2.9 ±0.8*
Неоваскуларизация 0 1.8 + 0.7* 2.6 ± 0.9*
CD40 0.5 + 0.6 2.2 + 07* 3.3 ±0.9*
ICAM-1 0.5+ 0.6 2.3 ±1.7* 3.6 + 07*
VCAM-1 0.3 + 05 17 + 0.7* 2.9 ±0.9*
*р<0.05 за СА или TCAD спрямо контроли по Kruskal-Wallis тест
Лезиите се състоят от концентрични слоеве гладкомускулни клетки и интестициален матрикс с обилна инфилтрация от макрофаги и лимфоцити заедно с области от неоваскуларизация. в четири коронарни артерии се откриват богати на липиди атероматозни лезии и “пенести” клетки като допълнение на концентричните слоеве от гладкомускулни клетки (Фигури 6А-С). Особености,установени в TCAD лезии са също субендотелни колекции от лимфоцити (“еноделит”) и агрегати от лимфоцити в адвентицията.
Имунохистохимичен анализ на CD40L експресия в СА и TCAD
За разлика от нормалните коронарни артерии, в които няма инфилтриращи лимфоцити или CD40L експресиращи клетки, лезиите при СА и при TCAD съдържат CD40L+ клетки. При естествената атеросклероза, имунооцветяването за CD40L е ограничено в малко количество лимфоцити на интимата. Оцветяването за CD40L обикновено е слабо и се наблюдава или в малки цитоплазмени гранули или по повърхността на клетките (Фигури 7A-D). При естествените СА повечето от лимфоцитите в интимата са CD4+ Т клетки; нарядко се откриват CD8+ Т клетки (Фигури 7A-D). Анализът на серийни срези оцветени с анти-С04 или анти-СО8 mAbs насочва за това, че CD40LT лимфоцитите са първични CD4+ Т клетки. Ендотелни клетки, гладкомускулни клетки, макрофаги и “пенести” клетки не реагират с което и да е aHTM-CD40L mAb, използвано в това изследване. Не се наблюдава оцветяване с изотипни контролни mAbs.
При лезии от TCAD, положителното имунооцветяване за CD40L също е свързано изключително с лимфоцитите (Фигури 8А-С). За разлика от СА, и двете CD8+ и CD4+ Т клетки присъстват в TCAD лезиите. Обаче, CD8+ Т клетки се откриват предимно в субендотелните области на “ендотелит” (Фигури 9А-В), докато CD4+ Т клетки са локализирани в агрегати дълбоко в интимата, която е в съседство с вътрешната еластична мембрана (Фигури 8А-С) и адвентицията на коронарните артерии. Пространствено експресията на CD40L корелира с CD4+ Т клетките в интимата и адвентицията на коронарните артерии с TCAD. Броят на CD40L+ Т клетките е по-голям при TCAD отколкото в лезии на естествени СА. Подобно на СА, ендотелни клетки, гладкомускулни клетки, макрофаги или “пенести” клетки в TCAD лезии не реагират с което и да е анти-С0401_ mAb , използвано в това изследване (Фигури 9А-В). Тези данни показват, че експресиращите CD40L клетки, вроятно CD4+ Т клетки, са налице в лезиите на естествената СА и TCAD.
Имунохистохимичен анализ на CD40 експресия в СА и TCAD
За разлика от слабата експресия на CD40ограничена в ендотелните клетки на лумена на нормални коронарни артерии (Фигури 4А-В), CD40 имунореактивността е повишена и широко разпространена в лезии на естествена СА (Фигури 5А-В). Експресия на CD40 се забелязва по ендотелни клетки, гладкомускулни клетки, макрофаги и “пенести” клетки. Има значително по-голям среден брой CD40 положителни клетки в лезии на интимата на естествена СА отколкото в контролни артерии (2.2 + 0.7 вместо 0.5 + 0.6, Таблица 2). Двойно имунооцветяване с маркери , специфични за макрофаги или гладкомускулни клетки, потвърждава, че тези клетки и “пенести” клетки от двете родословия експресират CD40 (Фигури 10А-В). Интересно е, че CD40* гладкомускулни клетки присъстват в интимата близо' до възпалителни инфилтрати, докато гладкомускулни клетки в артериалната медиа не проявяват положителна имунореактивност за CD40 (Фигури 10А-В) Анализ на серийни срези,оцветени с CD40 или с ендотелния маркер CD34 насс-чват, че ендотелни клетки .покриващи новообразуваните съдове на интимата и съдовете на съдовата адвентиция са също силно CD40+ (Фигури 11A-D).
В артерии от пациенти с TCAD, картината на разпределението на CD40 експресията е подобна на естествената СА. Обаче, средните резултати за CD40 имунореактивността са значително по-високи при TCAD отколкото при естествена СА или при контролни артерии (Таблица 2). Двойно имунооцветяване показва, че гладкомускулните клетки на интимата и макрофаги експресират CD40 (Фигури 10А-В). Освен това пенести клетки (Фигури 6А-В) и ендотелни клетки, покриващи съдовия лумен, новообразувани съдове на интимата и съдове на съдовата адвентиция са подчертано CD40* . Общо тези данни демонстрират, че ендотелни клетки, гладкомускулни клетки и макрофаги експресират CD40 в естествени СА и в TCAD.
Зависимост на CD40 експресията от вътреклетъчни адхезионни молекули и активацията на NF-kB в СА и TCAD лезии.
Макрофаги и ендотелни клетки в СА и TCAD експресират междуклетъчни адхезионни молекули, които регулират придвижването на левкоцитите вътре в лезията. Тъй като лигирането на CD40 индуцира възходяща регулация на вътреклетъчните адхезионни молекули и активиране на NF-kB по клетките in vitro, възниква въпросът дали експресията на CD40 е свързана с ко-експресията на междуклетъчни адхезионни молекули или NF-kB в СА или TCAD лезии. Най-напред беше показано при СА, че ендотелните клетки на лумена проявяват огнищно положително имунооцветяване за ICAM-1 и нарядко ендотелни клетки, експресиращи VCAM-1. За разлика, ендотелните клетки, покриващи новобразуваните съдове на интимата и съдовете на съдовата адвентиция.са силно положителни за ICAM-1 и VCAM-1 (Фигури 11A-D). Гладкомускулни клетки на интимата, макрофаги и “пенести” клетки също са умерено до силно положителни за ICAM-1 и VCAM-1 (Фигури 12А-С). Има значима корелация (р<0.05) между данните за CD40 и тези за ICAM-1 (г=0.85) и VCAM-1 (г=0.72). Броят на лимфоцитите в интимата значимо корелира с данните за CD40 и адхезионните молекули на левкоцитите (Таблица 3).
Таблица 3. Корелация на данните (0-4) за различни типове клетки в лезии на интимата от СА (п=10) или TCAD (п=9) с данни (0-4) за експресията на CD40 и адхезионни молекули (ICAM-1, УСАМ-1). Стойностите са изразени като корелационен коефициент на Spearmen (обхват -1 до 1, с “0” отсъствие на корелация и “-1” или “1” пълна корелация).
Клетъчен тип Група CD40 ICAM-1 VCAM-1
Т-лимфоцити СА 0.78* 0.77* 0.83**
(CD4+ & CD8+) TCAD 0.79* 0.87** 0.77*
Макрофаги СА 0.93*** 0.84** 0.77*
(CD68+) TCAD 0.81** 0.68* 0.55
Пенести клетки СА 0.81** 0.68* 0.36
TCAD 0.44 0.33 0.26
Гладък мускул СА 0.72* 0.81** 0.56
Клетки (SMA) TCAD 0.12 0.38 0.02
Новообразувани съдове СА 0.69* 0.72* 0.53
(CD34+) TCAD 0.85** 0.87** 0.77*
*р< 0.05, ** р<0.01 и *** р<0.001 степен на значимост за Spearmen корелация.
От всички изброени клетъчни типове само стойностите за лимфоцитите на интимата значимо корелират с експресията на CD40 и с количеството ICAM-1 и VCAM-1 в плаките на интимата в СА и в TCAD , което насочва , че лимфоцитите участвуват в индукцията на CD40 и на адхезионни молекули и при двете заболявания. Макрофагите и неоваскуларизацията също показват значима корелация с експресията на CD40 в СА и TCAD.
Двойно имунобелязане на СА лезии с анти-СО40 mAb и анти-ICAM1 mAb или анти-VCAM-l mAb показва, че CD40 е ко-локализиран с тези адхезионни молекули по повърхността на много клетки (Фигури 12А-С). В допълнение, активиран NF-kB (Фиг. 13) се наблюдава в ядра от неоинтимални ендотелни клетки, макрофаги и гладкомускулни клетки, а двойноимунобелязане показва, че много CD40+ клетки също експресират активиран NF-kB.
При TCAD силно положително имунооцветяване за ICAM-1 и VCAM-1 се проявява в ендотелните клетки на лумена, и особено близо до огнища на ендотелит. Ендотелните клетки на новообразувани съдове на интимата и съдове на съдовата адвентиция са силно имунореактивни за ICAM-1 и VCAM-1. Стойностите за имунооцветяване на адхезионни молекули при TCAD са по-високи отколкото при СА или нормални коронарни артерии (Таблица 2). Налице е значима корелация (р<0.05) между стойностите за CD40 и тези за ICAM-1 (р=0.82) и VCAM-1 (г=0.89). Броят на лимфоцитите в интимата също значимо корелира с експресията на CD40, ICAM-1 и VCAM-1 (Таблица 3). Подобно на СА, двуцветни имунохистохимични проучвания показват, че много CD40* клетки в TCAD лезии ко-експресират ICAM-1 или VCAM-1 (Фигури 12А-С). Имунооцветяването за активирана ядрена форма на NF-kB е по-широко разпространено при TCAD отколкото при естествена СА. NF-kB положителни макрофаги и гладкомускулни клетки са CD40+ (Фиг.13). Общо тези изследвания показват, че в лезии от естествена СА и TCAD, CD40 е ко-експресиран в много клетки с междуклетъчни адхезионни молекули и/или NF-kB.
ОБСЪЖДАНЕ
Естествена атеросклероза (СА) и сърдечна трансплантционна атеросклероза (TCAD) са възпалителни заболявания медиирани от комплексни реакции между активирани Т клетки, ендотелни клетки, макрофаги и гладкомускулни клетки (2, 8, 12, 13, 17). Счита се, че Т клетките играят роля в патогенезата на СА и TCAD, обаче механизмите, по които те участвуват в тези процеси не са напълно разкрити (5, 9, 50). Изследвания показват, че CD40L, една активационно индуцируема молекула по повърхността на CD4+ Т клетки, освобождава контакт-зависими активационни сигнали за ендотелните клетки и макрофагите,експресиращи CD40, което води до продукция на про възпалителни молекули, като междуклетъчните адхезионни молекули ICAM-1 и VCAM-1 (31, 32, 35-37) и активация на транскрипционния фактор NF-kB (43-45 in vitro). Интересно е, че TCAD в миши модели е поне отчасти зависим от CD40L-CD40 взаимодействия (51). В проучване на Larson и колеги, aHTH-CD40L mAb терапия подчертано инхибира отхвърлянето на алогенен хетеротоличен трансплантант и частично блокира свързаната с този процес васкулопатия. Нещо повече, при този модел TCAD почти напълно се предотвратява чрез въвеждане на комбинация от aHTH-OD40L mAb и CTLA4-lg слят белтък, една молекула, която блокира Т клетъчно костимулиращите пътища (51). Възможно е взаимодействията CD40LCD40 да участвуват в патогенезата на СА и/или TCAD при хора.
За да се проучи тази хипотеза по-нататък бяха приложени имунохистохимични техники при нормални и атеросклеротични коронарни артерии за изследване експресията и клетъчното разпределение на CD40L и CD40. Нормалните коронарни артерии не съдържат експресиращи CD40L клетки и CD40 имунореактивността е ограничена в ендотелните клетки на лумена на тези съдове. За разлика от тях, CD40L се експресира по лимфоцитите в лезии от естествена СА и TCAD. Намерено беше, че СА лезиите съдържат малко CD8+ Т клетки, докато TCAD лезиите съдържат CD8+ клетки в близост до ендотела на лумена (“енодтелит”) и CD4+ Т клетки дълбоко в интимата и адвентицията. Въз основа на локализацията и на оцветяването на серийни срези с анти-СО4 mAb или анги-СО8 mAb, беше направено заключението, че CD40L4 лимфоцитите най-вероятно са CD4+ Т клетки в лезиите и при двете заболявания. Използвайки две различни aHT-CD40L mAb беше намерено, че CD40L имунореактивността е слаба и е грануларна или цитоплазмена или свързана с клетъчната повърхност. Подобна характеристика на CD40L имунореактивността е наблюдавана в едно изследване на CD40L и CD40 експресията при гломерулонефрит (46). Картината на слабо и често цитоплазмено оцветяване от CD40L експресията във възпалени тъкани може да бъде свързано с преходния характер на CD40L експресията по активирани Т клетки (27-29) и с факта , че ангажирането на CD40 по прицелни клетки индуцира бърза нисходяща модулация на CD40L чрез рецептормедиирана ендоцитоза (52) и отпадане (53). Тези регулаторни механизми вероятно служат да насочат CD40L медиираните сигнални събития към подходящи и сродни прицелни клетки.
Намерено бе, че експресията на CD40 е подчертано повишена по повърхността на много клетки в лезии от двете заболявания. Макрофаги и “пенести” клетки,експресиращи CD40 , бяха особено изявени във възпалителни инфилтрати на “надигнатите” области на богатите на липиди плаки, които е известно, че съдържат плътни възпалителни инфилтрати (54,55). Експресията на CD40 е също повишена в ендотелните клетки на лумена и при двете заболявания и това беше особено проявено при TCAD. Ендотелните клетки на новообразуваните съдове на интимата и съдовете на съдовата адвентиция и при двете заболявания са силно CD40+. CD40 експресиращи гладкомускулни клетки присъстват в интимата както при СА 7 така и при TCAD, обикновено в близост до възпалителни инфилтрати. Интересно е, че гладкомускулните клетки в медната на същите съдове са CD40+. IFN-γ in vitro регулира възходящо CD40 експресията по повърхността на много клетки (33, 35-37, 56), включително гладкомускулни клетки и този ефект се повишава от цитокини като IL-Ιβ и TNF-a(36).
Следователно, подчертано повишената експресия на CD40 по повърхността на много клетъчни типове в тези лезии може да бъде резултат от освобождаване на цитокини от Т клетките на лезиите, от макрофагите и други клетки. Двойно имунооцветяване показва, че много CD40+ клетки също ко-експресират междуклетъчни адхезионни молекули ICAM-1 и VCAM-1, както и активираната форма на NF-kB. Общо настоящото проучване демонстрира наличието на CD40L+ Т клетки и активирани CD40+ прицелни клетки в съдови лезии на естествена СА и от TCAD.
Ранни изследвания показват, че CD40 се експресира по някои епителнокпетъчни тумори и В клетки (57, 58). Наскоро беше отбелязано, че CD40 се експресира конститутивно или индуцира in vitro по повърхността на много клетъчни типове (33-37, 56). Освен това, става все по очевидно, че взаимодействията CD40L-CD40 играят ключова роля при клетъчно-медиираните възпалителни реакции in vivo (31, 32). В това отношение съвременни данни демонстрират in situ CD40L и/или CD40 експресия при човешки възпалителни заболявания (35, 46, 59). Например, CD40 експресията е повишена по повърхността на макрофаги, инфилтриращи мозъка на пациенти с мултиплена склероза (59), по ендотелни клетки на дермата и кератиноцити при псориазис (35) и по много клетки в бъбреците на пациенти с възпалителни гломерулонефрити (46). Освен това възпалителните инфилтрати в мозъка на пациенти с мултиплена склероза (59) и в бъбреците на пациенти с гломерулонефрити (46) съдържат CD40L* Т клетки. Следователно възможно е CD40 експресията да е повишена при много възпалителни заболявания и да представлява молекулен механизъм, който позволява T клетките да освобождават про-възпалителни сигнали към голямо разнообразие от прицелни клетки. В това отношение откритията,представени тук, че CD40 експресията е повишена при СА и TCAD и че CD40L+; инфилтриращи Т клетки са открити в лезиите, служат катодоказателства за хипотезата, че имунно медиирани възпалителни^ реакции играят роля при патогенезата на тези заболявания (5-7, 9, 18,< 21,23,50). «
Наблюдения, отнасящи се до CD40L медиирана активация на ендотелни клетки и макрофаги in vitro и изследвания на CD40L-CD40 взаимодействията при патогенезата на миши модели на TCAD, насочват за възможна патогенетична роля на CD40L-CD40 взаимодействията при СА и TCAD. Например, CD40L медиирани сигнали повишават експресията на ICAM-1 и VCAM-1 по повърхността на ендотелни клетки in vitro (35-37). Тези вътреклетъчни адхезионни молекули, които регулират излизането и задържането на левкоцити във възпалени места,са повишени по повърхността на ендотелните клетки при СА и TCAD и са особено изразени по ендотелните клетки на интимата на новообразуваните съдове и на vasa vasorum (49, 60).
Следователно, представлява интерес фактът,че много CD40+ клетки се откриват в лезии при СА и TCAD (И специално в ендотелни клетки на интимата и на vasa vasorum, ко-експресират ICAM-1 и/или VCAM-1. Известно е, че възходяща регулация на ICAM-1 и VCAM-1 е зависима от активирането на NF-kB (61). В нстоящето изобретение също е демонстрирано, че CD40* макрофаги на интимата, гладкомускулни клетки и ендотелни клетки експресират активираната форма на NF-kB. Тези изследвания насочват, че CD40L+ CD4+ Т клетки могат да индуцират възходяща регулация на междуклетъчните адхезионни молекули по повърхността на CD40+ прицелни клетки при СА и TCAD, възможно, частично чрез активиране на NF-kB.
CD40L медиираните сигнали също индуцират ендотелните клетки да секретират IL-6 и IL-8 (62) и стимулират прокоагулантна повърхност чрез повишаване на тъканния фактор и понижаване експресията на тромбомодулина. По отношение на макрофагите, CD40L-CD40 взаимодействията индуцират тези клетки да секретират провъзпалителни цитокини (IL-Ιβ, IL-6 и TNF-α), хемокини, металопротеинази на матрикса и експресират тъканен фактор in vitro (33, 34, 38, 41, 42). Всички тези про възпалителни молекули вероятно играят роля в патогенезата на СА и TCAD (10,17, 63-66). Лигирането на CD40 по повърхността на макрофаги индуцира също продукция на N0 (39, 40). Интересно е, че блокирането на CD40L-CD40 взаимодействията в миши модели на TCAD е свързано с понижена експресия на iNOS и намаление на TCAD лезиите (51). Демонстрирано бе, че iNOS се експресира в лезии при СА (67, 68), при отхвърляне на сърдечен алографт (69, 70) и TCAD (71, 72). CD40L медиирани сигнали могат да участвуват в стимулиране продукцията на всяка от тези молекули при СА или TCAD. CD40L-CD40 взаимодействията имат ясни про възпалителни ефекти при миши модели на TCAD (51), както и при индуциран с колаген артрит (73), лупус-подобен гломерулонефрит (74) и експериментален алергичен енцефаломиелит (59).
Проведено е изследване (62) върху експресията на CD40L и CD40 при човешка каротидна атеросклероза. Открито е, че CD40 е възходящо регулиран в лезии и има широко клетъчно разпространение. Съобщено е, че CD40L е нашироко експресиран върху гладкомускулни клетки, ендотелни клетки и макрофаги в атеросклеротични лезии, докато в настоящето проучване, използувайки две различни антиCD40L mAbs, експресията на CD40L е ограничена в Т клетките. Тук не се наблюдава in situ експресия на CD40L по макрофаги, ендотелни клетки или гладкомускулни клетки и при двете заболявания. Подобно на това, CD40L имунореактивност се открива ограничена в Т клетки при други възпалителни заболявания, включително гломерулонефрит (46), ревматоиден артрит и хроничен синуит. В допълнение на това, Gerritse. et al. съобщават, че CD40L експресията е ограничена в CD4+ Т клетки^ в плаки от мултиплена склероза (59). Различията между представените тук резултати и тези на Mach и колеги, понастоящем са не изяснени,, но може да са свързани с минимални разлики в имунохистохимичните техники или в характера на лезиите.
СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛИ: Yellin,Michael J.
Lederman, Seth
Chess, Leonard
Karpusas, Mihail N. Thomas, David W.
(ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ТЕРАПЕВТИЧНИ ПРИЛОЖЕНИ Я НА Т-ВАМ (CD40L) ТЕХНОЛОГИ Я ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ЗАБОЛ ЯВАНИ Я ЗАС ЯГАЩИ ГЛАДКОМУСКУЛНИ КЛЕТКИ (iii) НОМЕР НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 1 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИ Я (A) АДРЕСАНТ: Cooper & Dunham LLP (B) УЛИЦА: 1185 Avenue of the Americas (C) ГРАД: New York (О)ЩАТ: New York (E) СТРАНА: USA (F) КОД: 10036 (v) ФОРМА ЗА ЧЕТЕНЕ НА КОМПЮТЕР:
(A) СРЕДЕН ТИП: Floppy disk (B) КОМПЮТЕР: IBM PC compatible (C) ОПЕРИРАЩА. СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) СОФТУЕР: Patent in Release #1.0, Version#1.30 (vi) ДАННИ ЗА HACTO ЯЩАТА ЗА ЯВКА:
(А) НОМЕР НА ЗА ЯВКАТА: да се определи ! В) ДАТА НА ПРЕДСТАВ Я-IE: настояща (С) КЛАСИФИКАЦИ Я (viii) АДВОКАТ/АГЕНТ ИНФОРМАЦИ Я (A) ИМЕ: White Esq., John Р.
(B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 28,678 (C) НОМЕР ЗА СПРАВКА/ СПИСЪК: 48559/JPW/JML (ix) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИ Я (A) ТЕЛЕФОН: (212)278-0400 (B) ТЕЛЕФАКС: (212) 391-0525 (2) ИНФОРМАЦИ Я ЗА SEQ ID N0: 1:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 146 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ТОПОЛОГИ Я линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (iii) ХИПОТЕТИЧНА: НЕ (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID МО: 1:
Ser Lvs Thr Thr Ser Vai beu Glr.
Met Ser ASn 35 Asn Leu Vai Thr Leu 40 Glu Asn Gly Lys Gin 45 Leu Thr Vai
Lys Arg 50 Gin Gly Leu Tyr Tyr 55 He Tyr Ala Gin Vai 60 Thr Phe cys Ser
Asn 65 Arg Glu Ala Ser Ser 70 Gin Ala Pro Phe lie 75 Ala Ser Leu Cys Leu 80
Lys Ser Pro Gly Arg 85 Phe Glu Arg lie Leu SO Leu Arg Ala Ala Asn 95 Thr
His Ser Ser Ala 100 Lys Pro Cys Gly Glr. 1C5 Gin Ser He His Leu 110 Gly Gly
Vai Phe Glu 115 Leu Gin Pro Gly Ala 120 Ser Vai Phe Vai Asn 125 Vai Thr Asp
Pro Ser 130 Gin Vai Ser His Gly 135 Thr Gly Thr Ser 140 Phe Gly Leu Leu
Lvs Leu

Claims (41)

1. Метод за инхибиране активацията на CD40 лиганд на гладкомускулни клетки, характеризиращ се с това, че експресирани CD40 по повърхността на специфични типове гладкомускулни клетки се поставят в контакт с агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40 лиганда и CD40, където споменатите СО40-носещи клетки са гладкомускулни клетки на пикочния мехур, на съдовете, на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, на белия дроб или на стомашночревния тракт.
2. Метод за инхибиране активацията на CD40 лиганда характеризиращ се с това, че гладкомускулни клетки, носещи на повърхността си CD40, контактуват in vitro с агент, способен да инхибира взаимодействието между CD40 лиганда и CD40, където споменатите гладкомускулни клетки са на пикочния мехур, на съдовете, на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, на белия дроб или на стомашночревния тракт.
3. Метод, съгласно претенция 1 или 2, при който споменатите стомашночревни гладкомускулни клетки са на хранопровода, стомашни, гладкомускулни клетки на червата или на тънките черва.
4. Методът, съгласно претенции 1 или 2, където споменатият агент специфично инхибира свързването на CD40 лиганда с CD40 на споменатите гладкомускулни клетки.
5. Методът, съгласно претенции 1 или 2, където споменатият агент се свързва специфично за епитопа, за който моноклоналното антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No. НВ 10916, се свързва специфично.
6. Методът, съгласно претенции 1 или 2 , където споменатият агент се свързва специфично с CD40.
7. Методът, съгласно претенция 1 или 2, където споменатият агент е подбран от група , състояща се от : белтъци, небелтъци и пептидомиметични съединения.
8. Методът, съгласно претенция 7, където споменатият белтък включва едно антитяло или част от него.
9. Методът, съгласно претенция 8, където споменатото антитяло е подбрано от група, състояща се от: моноклонални антитела, поликлонални антитела, химерни антитела, хуманизирани антитела,
- приматизирани антитела и антитела, включващи една CDR област от един човешки индивид и едно антитяло - скелет от втори човешки индивид.
10. Методът, съгласно претенция 9, където споменатото антитяло е моноклонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No. НВ 10916.
11. Методът, съгласно претенция 7, където споменатият белтък се характеризира с една извънклетъчна област на CD40 лиганда, или варианти от нея, включваща консервативни заместители или части от тях, или една разтворима извънклетъчна област от CD40, или варианти от нея, включващи консервативни заместители или части от тях.
12. Методът, съгласно претенция 11, където споменатата разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганда или CD40 е един мономер или олигомер.
13. Методът, съгласно претенция 11, където споменатата извънклетъчна област на CD40 или част от нея, освен това се характеризира с една Fc област, слята с извънклетъчната област на CD40 или част от нея или на CD40 лиганда, или част от него.
14. Методът, съгласно претенции 1 или 2, където споменатият агент е подбран или плануван чрез структурна оптимизация на един оловен инхибиторен агент, основан на тридимензионалната структура на един комплекс на разтворимата извънклетъчна област от CD40 или част от нея с оловния инхибиторен агент.
15. Методът, съгласно претенции 1 или 2 , където споменатият агент инхибира специфично клетъчната активация чрез CD40 лиганд на CD40- носещите гладкомускулни клетки, които са включени в зависимо от гладкомускулните клетки заболяване.
16. Методът, съгласно претенция 15, където споменатото зависимо от гладкомускулните клетки заболяване е подбрано от група, състояща се от: съдово заболяване, заболяване на пикочния мехур и стомашно-чревно заболяване.
17. Методът, съгласно претенция 16, където споменатото стомашночревно заболяване е подбрано от група, състоя ща се от: смущения в мотилитета на хранопровода, възпалително заболяване на червата и склеродермия.
18. Методът, съгласно претенция 16, където споменатото съдово заболяване е атеросклероза.
19. Методът, съгласно претенция 1 или 2, където споменатият агент е подбран чрез скрининг метод, включващ следните етапи:
(а) изолиране на проба от гладкомускулни клетки, като споменатите гладкомускулни’клетки са гладкомускулни клетки на пикочния мехур, съдови гладкомускулни клетки, гладкомускулни клетки на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, белодробни гладкомускулни клетки или гладкомускулни клетки на стомашно-чревния тракт ;
(в) култивиране на споменатата проба при условия, позволяващи активация на тези гладкомускулни клетки в пробата, които са CD40- носещи клетки;
(с) Поставяне споменатата проба в контакт с клетки, експресиращи белтък, който специфично се разпознава от моноклоналното антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No.HB 10916, или поставяне на споменатата проба в контакт с белтък, който се разпознава специфично от моноклонално антитяло, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No.HB 10916, като споменатите клетки или белтък са ефективни да активират СО40-носещите гладкомускулни , клетки.
(d) поставяне в контакт на споменатата проба с известно « количество от агента, което е ефективно да инхибира активацията на СО40-носещите гладкомускулни клетки, ако споменатият агент е способен да инхибира CD40-CD40L зависимата активация на С040-носещите гладкомускулни клетки; и (e) определяне, дали клетките, експресиращи белтъка, който се разпознава специфично от моноклоналното антитяло 5с8, получено с хибродома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No. НВ 10916, или белтъкът, който се разпознава специфично от моноклоналното антитяло 5с8, получено с хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916, активира CD40 носещата гладкомускулна клетка в присъствие на агента.
20. Метод, съгласно претенция 19, където споменатата проба от гладкомускулни клетки е подбрана от групата,състояща се от: клетъчни линии в култура, клетки,изолирани от животно, клетки,изолирани от цяла тъкан, клетки ? произхождащи от костномозъчна биопсия, и клетки, изолирани от телесна течност.
21. Използване на агент, инхибиращ взаимодействието между CD40 лиганд и CD40 като лакерствено средство за инхибиране активацията на CD40 лиганд на клетки,носещи CD40 по клетъчната повърхност, където споменатите С040-носещи клетки са гладкомускулни клетки на пикочния мехур, на съдовете, на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, на белия дроб или на стомашночревния тракт.
22. Използване съгласно претенция 21, където споменатите стомашночревни гладкомускулни клетки са на хранопровода, стомашни, гладкомускулни клетки на червата или на тънките черва.
23. Използване съгласно претенция 21, където споменатиятагент инхибира специфично свързването на на CD40 лиганда с CD40 по повърхността на споменатите гладкомускулни клетки.
24. Използване съгласно претенция 21, където споменатиятагент свързва специфично епитопа,за който моноклоналното антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916, се свързва специфично.
25. Използване съгласно претенция 21, където споменатиятагент се свързва специфично с CD40.
26. Използване съгласно претенция 21, където споменатиятагент е подбран от група,състояща се от: белтъци, небелтьци и пептидомиметични съединения.
27. Използване съгласно претенция 21, където споменатиятбелтък включва едно антитяло или част от него.
28. Използване съгласно претенция 27, където споменатото антитяло е подбрано от група,състояща се от: моноклонални антитела, поликлонални антитела, химерни антитела, хуманизирани антитела, приматизирани антитела и антитела, които включват една CDR област от човешки индивид и едно антитяло-скелет от втори човешки индивид.
29. Използване съгласно претенция 28, където споменатото моноклонално антитяло е моноклонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916.
30. Използване съгласно претенция 26, където споменатият белтък се характеризира с една разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганда, или варианти от него, включително консервативни заместители или части от тях, или една разтворима извънклетъчна област на CD40, или варианти от нея, включително консервативни заместители или части от тях.
31. Използване съгласно претенция 30, където споменатата разтворима извънклетъчна област на CD40 лиганда или CD40 е мономер или олигомер.
32. Използване съгласно претенция 30, където споменатата разтворима извънклетъчна област на CD40 или част от нея, включва освен това една Fc област, слята с извънклетъчната област на CD40 или част от нея или CD40 лиганда или част от него.
33. Използване съгласно претенция 21, където споменатиягагент е подбран или планиран чрез структурна оптимизация на един оловен инхибиторен агент въз основа на тридименсионална структура на комплекс от разтворимата извънклетъчна CD40 област или на част от нея с оловния инхибиторен агент.
34. Използване съгласно претенция 21, където споменатиягагент инхибира специфично клетъчната активация чрез CD40 лиганд на CD40 носещите гладкомускулни клетки, които са включени в зависимост от гладкомускулните клетки заболяване.
35. Използване съгласно претенция 34, където зависимото от гладкомускулните клетки заболяване е подбрано от група, състоя ща се от: съдово заболяване, заболяване на пикочния мехур и стомашно-чревно заболяване.
36. Използване съгласно претенция 35, където споменатото стомашно-чревно заболяване е подбрано от група, състояща се от смущения в мотилитета на хранопровода, възпалително заболяване на червата и склеродермия.
37. Използване съгласно претенция 35, където споменатото съдово заболяване е атеросклероза.
38. Използване съгласно претенция 21, където споменатият агент е подбран чрез скрининг метод, характеризиращ се с етапите:
(a) изолиране на проба от гладкомускулни клетки, като споменатите гладкомускулни клетки са на пикочния мехур, на съдовете, на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, на белия дроб или на стомашночревния тракт.
(b) култивиране на споменатата проба при условия,позволяващи активирането на гладкомускулните клетки в пробата, които са CD40носещи клетки;
(c) поставяне в контакт на споменатата проба с клетки, експресиращи белтък, който се разпознава специфично от моноклоналното антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916, или поставяне в контакт на споменатата проба с белтък, който се разпознава специфично от моноклонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916, като споменатите клетки или белтък са ефективни да активират С040-носещи клетки;
(d) поставяне в контакт на споменатата проба с известно количество от агента, което ефективно инхибира активацията на CD40носещи гладкомускулни клетки, ако споменатият агент е способен да инхибира CD40 - CD40L зависимата активация на СО40-носещи гладкомускулни клетки и (е) определяне дали клетките,експресиращи белтъка, който се разпознава специфично от моноклонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No НВ 10916, или белтъка, който се разпознава специфично от моноклонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No НВ 10916, активират С040-носещите гладкомускулни клетки в присъствието на агента.
39. Метод за подбор на агент, способен да инхибира взаимодействието с гладкомускулни клетки, като споменатите гладкомускулни клетки са на пикочния мехур, на съдовете, на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, на белия дроб или на стомашночревния тракт, носещи CD40 по клетъчната повърхност, чрез скрининг метод, характеризиращ се с етапите:
(a) изолиране на проба от гладкомускулни клетки, като споменатите гладкомускулни клетки са на пикочния мехур, на съдовете, на аортата, коронарни гладкомускулни клетки, на белия дроб или на стомашночревния тракт.
(b) култивиране на споменатата проба при условия, позволяващи активирането на клетките в пробата, които са С040-носещи гладкомускулни клетки;
(c) поставяне в контакт на споменатата проба с клетки, експресиращи белтък, който се разпознава специфично от моноклоналното антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No НВ 10916, или поставяне в контакт на споменатата проба с белтък, който се разпознава специфично от моноклонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916, като споменатите клетки или белтък са ефективни да активират С040-носещи гладкомускулни клетки;
(d) поставяне в контакт на споменатата проба с известно количество от агента, което ефективно инхибира активацията на CD40носещи гладкомускулни клетки, ако споменатият агент е способен да инхибира CD40 - CD40L зависимата активация на СО40-носещи гладкомускулни клетки и (e) определяне дали клетките, експресиращи белтъка, който се разпознава специфично от монокпонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер ATCC Accession No НВ 10916, или белтъкът, който се разпознава специфично от монокпонално антитяло 5с8, получено от хибридома, притежаваща ключов номер АТСС Accession No НВ 10916, активират С040-носещите гладкомускулни клетки в присъствието на агента.
40. Използване, съгласно претенция 38, където споменатата проба гладкомускулни клетки е подбрана от групата,състояща се от: клетъчни линии в култура, клетки,изолирани от животно, клетки,изолирани от цяла тъкан, клетки, произхождащи от костномозъчна биопсия , и клетки, изолирани от телесна течност.
41. Метод, съгласно претенция 39, където споменатата проба гладкомускулни клетки е подбрана от групата .състояща се от: клетъчни линии в култура, клетки,изолирани от животно, клетки,изолирани от цяла тъкан, клетки, произхождащи от костномозъчна биопсия и клетки, изолирани от телесна течност.
BG103148A 1996-07-08 1999-02-04 Метод за инхибиране активацията на cd долу 40 лиганд на гладкомускулни клетки BG63489B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67773096A 1996-07-08 1996-07-08
PCT/US1997/012925 WO1998001145A1 (en) 1996-07-08 1997-07-03 Therapeutic applications of t-bam (cd40l) technology to treat diseases involving smooth muscle cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG103148A BG103148A (bg) 1999-10-29
BG63489B1 true BG63489B1 (bg) 2002-03-29

Family

ID=24719894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG103148A BG63489B1 (bg) 1996-07-08 1999-02-04 Метод за инхибиране активацията на cd долу 40 лиганд на гладкомускулни клетки

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20030219437A1 (bg)
EP (1) EP0956030A4 (bg)
JP (1) JP2000515507A (bg)
CN (1) CN1242809C (bg)
AU (1) AU731299B2 (bg)
BG (1) BG63489B1 (bg)
BR (1) BR9710264A (bg)
CA (1) CA2259962C (bg)
CZ (1) CZ297300B6 (bg)
EA (1) EA004401B1 (bg)
EE (1) EE9900010A (bg)
HU (1) HUP9904669A3 (bg)
IL (1) IL127884A0 (bg)
IS (1) IS4935A (bg)
NO (1) NO990019L (bg)
NZ (1) NZ333602A (bg)
PL (1) PL188408B1 (bg)
SK (1) SK499A3 (bg)
TR (1) TR199900029T2 (bg)
WO (1) WO1998001145A1 (bg)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230192875A1 (en) * 2016-11-11 2023-06-22 Kumho Ht, Inc. Antibody binding specifically to cd40 and use thereof

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6797263B2 (en) 2000-05-12 2004-09-28 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for achieving immune suppression
US20020173053A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-21 Bassam Damaj Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
UY32802A (es) * 2009-07-23 2011-01-31 Provimi Holding B V Composiciones para reducir la metanogénesis gastrointestinal en rumiantes
WO2017197231A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Medimmune, Llc Cd40l-fc fusion polypeptides and methods of use thereof
US11793854B2 (en) 2019-03-21 2023-10-24 Op-T Llc Methods for reducing symptoms of multiple sclerosis using a six-amino acid long peptide that inhibits CD40-CD150 interaction

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
IL104684A0 (en) * 1992-02-14 1993-06-10 Bristol Myers Squibb Co The cd40cr receptor and ligands therefor
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6340459B1 (en) * 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US6822070B2 (en) * 1996-03-11 2004-11-23 David Baltimore Truncated CRAF1 inhibits CD40 signaling

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230192875A1 (en) * 2016-11-11 2023-06-22 Kumho Ht, Inc. Antibody binding specifically to cd40 and use thereof
US11905331B2 (en) * 2016-11-11 2024-02-20 Kumho Ht, Inc. Antibody binding specifically to CD40 and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9904669A2 (hu) 2000-05-28
JP2000515507A (ja) 2000-11-21
CA2259962C (en) 2002-01-22
US20030219437A1 (en) 2003-11-27
CN1227494A (zh) 1999-09-01
IL127884A0 (en) 1999-10-28
IS4935A (is) 1998-12-23
NO990019L (no) 1999-03-08
NZ333602A (en) 2000-06-23
PL331104A1 (en) 1999-06-21
TR199900029T2 (xx) 1999-04-21
AU4229297A (en) 1998-02-02
EA199900091A1 (ru) 1999-08-26
CZ2699A3 (cs) 1999-05-12
BR9710264A (pt) 1999-08-10
AU731299B2 (en) 2001-03-29
EP0956030A1 (en) 1999-11-17
EP0956030A4 (en) 2001-11-28
CN1242809C (zh) 2006-02-22
SK499A3 (en) 1999-08-06
EA004401B1 (ru) 2004-04-29
CZ297300B6 (cs) 2006-11-15
US20080050369A1 (en) 2008-02-28
BG103148A (bg) 1999-10-29
PL188408B1 (pl) 2005-01-31
EE9900010A (et) 1999-06-15
HUP9904669A3 (en) 2001-06-28
NO990019D0 (no) 1999-01-04
WO1998001145A1 (en) 1998-01-15
CA2259962A1 (en) 1998-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU709550B2 (en) Thereapeutic applications for the anti-T-bam (CD40-L) monoclonal antibody 5c8
CA2257247C (en) Novel protein binding to osteoclastogenesis inhibitory factor and process for producing the same
RU2192281C2 (ru) Способы и композиции для иммуномодуляции
US20030026803A1 (en) Compositions for inhibiting macrophage activity
EP3275898A1 (en) Therapeutic agent for autoimmune diseases or allergy, and method for screening for the therapeutic agent
US20080050369A1 (en) Therapeutic applications of T-BAM (CD40L) technology to treat diseases involving smooth muscle cells
CA2585156A1 (en) Duffy antigen receptor for chemokines and use thereof
CN103619874A (zh) 可溶性整联蛋白α4突变体
WO1998051346A1 (en) Human tumor necrosis factor receptor-like 2 (tr2) antibodies
EP1871419A2 (en) Methods of treating graft versus host disease
KR100478322B1 (ko) 평활근세포와관련된질병을치료하기위한t－bam(cd４０l)기법의치료적용도
CA2243531A1 (en) Therapeutic applications of t-bam (cd40-l) technology to treat inflammatory kidney diseases______________________________________
WO1997026000A9 (en) Therapeutic applications of t-bam (cd40-l) technology to treat inflammatory kidney diseases______________________________________
US20050118166A1 (en) Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-1) monoclonal antibody 5C8
US20020102258A1 (en) Human tumor necrosis factor receptor-like 2 (TR2) antibodies
MXPA98004342A (en) Therapeutic applications for the monoclonal antibody 5c8 anti-t-bam (cd40