CZ297300B6 - Lécivo, které obsahuje protilátku inhibující vazbu ligandu CD40 na CD40 a je urcené k lécení nemocízávislých na bunkách hladkého svalstva - Google Patents

Abstract

Aktivace ligandem CD40 (CD40L) u bunek hladkého svalstva nesoucích na povrchu CD40 je inhibována invivo a ex vivo tím, ze se bunky privedou do kontaktu s protilátkou, která inhibuje interakci mezi CD40L a CD40 na bunkách. Inhibice in vivo bunek hladkého svalstva nesoucích CD40 je mozné vyuzít pro lécení nemocí závislých na bunkách hladkého svalstva. Vynález proto poskytuje lécivo, které obsahujeprotilátku nebo cást protilátky, která specifickyinhibuje vazbu ligandu CD40 na CD40, a které je urceno k lécení nemoci závislé na bunkách hladkého svalstva vybrané ze skupiny sestávající z nemocí gastrointestinálního traktu, nemocí mocového mechýre a cévních nemocí.

Description

Tato přihláška si nárokuje prioritu patentové přihlášky Spojených Států 08/677 730, podané 8. července 1996, na jejíž obsah se tímto odkazujeme.

Předkládaný vynález byl učiněn s podporou vládních grantů NIH č. K08-AR-01904, RO1CA55713, RO1-AI-28367, RO1-AI-14969, HL21006, HL42833, HL50629 a RO1-AI-14969 (Department of Health and Human Services). Tudíž má vláda Spojených Států na tento vynález určitá práva.

V přihlášce jsou v závorkách uváděny různé odkazy. Přínos těchto publikací je zahrnut do přihlášky, aby byl úplněji popsán dosavadní stav techniky, kterého se přihláška týká. Plné bibliografické údaje o těchto citovaných publikacích lze najít buďto přímo v textu, nebojsou uvedeny na konci popisu v seznamu pod příslušným číslem.

Dosavadní stav techniky

CD40 je molekula vyskytující se na buněčném povrchu, je exprimována na celé řadě buněk a interaguje s příslušným protireceptorem CD4⁺ T buněk nazývaným CD40L (ligand CD40) o velikosti 30-33 kD, který je indukován aktivací. Interakce CD40L-CD40 byly obsáhle studovány v buněčných interakcích T a B buněk a jsou podstatné pro buněčnou diferenciaci B buňky závislou na T buňce, a také pro produkci IgG, IgA a IgE. CD40 je také exprimován na monocytech, dendritických buňkách, epitelových buňkách, endotelových buňkách a fíbroblastech. Exprese CD40 na těchto buňkách je aktivována in vitro cytokiny, nej významněji IFN-γ. Je zajímavé, že studie in vivo dokázaly výrazně zvýšenou regulaci exprese CD40 na místech zánětu, jako je např. synoviální membrána u revmatoidní artritidy nebo psoriatická ložiska. Studie in vitro využívající monoklonální protilátky (mAb) anti-CD40 nebo buňky CD40L⁺ dokazují, že CD40 je funkčně exprimován na monocytech, dendritických buňkách, epitelových buňkách, endotelových buňkách a fíbroblastech.

Například interakce CD40L-CD40 indukují monocyty, aby secernovaly prozánětlivé cytokiny IL-Ia, IL-Ιβ, IL-6 a TNF-α, a dendritické buňky, aby secernovaly TNF-α. Interakce CD40LCD40 také podporují monocyty a dendritické buňky, aby secernovaly chemokiny IL-8 a ΜΙΡΙα. Kromě toho, vazba CD40 zvyšuje produkci IL-1 zprostředkovanou GM-CSF epitelovými buňkami thymu. Navíc signály zprostředkované CD40L indukují monocyty, aby secernovaly IL-10 a oxid dusnatý, a zesilují produkci IL-6 fíbroblasty. Fibroblasty také proliferují po interakcích CD40L-CD40. A konečně endotelové buňky a fíbroblasty aktivují intercelulámí adhezivní molekuly po vazbě CD40.

Vaskulámí nemoci, jako je ateroskleróza, jsou léčeny celou řadou léků, včetně léků snižujících hladinu cholesterolu, beta-blokátorů, blokátorů kalciového kanálu a antikoagulačních léků. Nyní se ukazuje, že buňky hladkého svalstva jsou schopné exprimovat CD40. To poskytuje základ pro léčbu vaskulárních onemocnění inhibicí interakci mezi CD40 a ligandem CD40 (také známým jako T-BAM, 5c8 Ag, gp39 a TRAP). Další nemoci postihující hladké svalstvo jsou také léčeny inhibicí interakcí CD40-CD40L.

Evropská patentová přihláška 555 880 se týká antagonistů CD40CR (ligand CD40), včetně monoklonální protilátky MR1, ajejich použití k potlačení alergií a autoimunitních nemocí.

Mezinárodní patentová přihláška PCT publikovaná jako WO 93/09 812 se týká monoklonální protilátky 5c8 namířené proti ligandu CD40 a použití této protilátky při léčení odvržení štěpu při

-1 CZ 297300 B6 transplantacích, autoimunitních reakcí a nemocí, autoimunitních projevů infekčních nemocí, alergických reakcí a zánětlivých onemocnění.

Předkládaný vynález v jednom ze svých provedení poskytuje výhodné formulace protilátky ligandů CD40 nebo její části se specifickým dávkovacím režimem, které jsou užitečné při léčení nemocí závislých na buňkách hladkého svalstva.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsob, jak inhibovat aktivaci buněk hladkého svalstva, které na svém povrchu nesou CD40, ligandem CD40, přičemž tento způsob zahrnuje kontakt buněk s přípravkem schopným inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, když je přípravek přítomný v množství, které účinně inhibuje aktivaci buněk.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob, jak inhibovat aktivaci buněk hladkého svalstva, které na svém povrchu nesou CD40, ligandem CD40, u pacienta, přičemž tento způsob zahrnuje podávání přípravku, který je schopný inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, pacientovi, a přípravek se podává v množství účinném pro inhibici aktivace buněk pacienta.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob léčení pacienta s nemocí závislou na buňkách hladkého svalstva, tento způsob zahrnuje podávání přípravku, který je schopný inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, pacientovi, v množství účinném inhibovat aktivaci buněk u pacienta, a tím je léčena nemoc závislá na buňkách hladkého svalstva.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek IA: Analýza klidových buněk hladkého svalstva lidské aorty pomocí průtokové cytometrie (FACS). Tečkovaná čára představuje izotypovou kontrolní protilátku, přerušovaná čára představuje anti-CD54 mAb a plná čára představuje anti-CD40 mAb. Tento obrázek ukazuje, že buňky hladkého svalstva neexprimují konstitutivně CD40.

Obrázek IB: FACS analýza buněk hladkého svalstva lidské aorty v přítomnosti IFN-γ (1000 U/cm³) po 72 hodinách tkáňové kultury. Tento obrázek ukazuje aktivaci exprese CD40 buňkami hladkého svalstva jako odpověď na IFN-γ.

Obrázek 1C: FACS analýza buněk hladkého svalstva lidské aorty v přítomnosti IL-la (1 ng/cm³) po 72 hodinách tkáňové kultury. Aktivace exprese CD40 buňkami hladkého svalstva nebyla pozorována.

Obrázek ID: FACS analýza buněk hladkého svalstva lidské aorty v přítomnosti TNF-a (200 U/cm³) po 72 hodinách tkáňové kultury. Aktivace exprese CD40 buňkami hladkého svalstva nebyla pozorována.

Obrázky 2A až 2Y: Souřadnice atomární krystalové struktury rozpustného extracelulámího fragmentu lidského CD40L obsahující zbytky Glyn_n6-Leu26i (ve formátu dle Brookhaven Protein Data Bank), (viz sekvence id. č. 1).

Obrázky 3A a 3B: CD40 je exprimován in šitu na buňkách hladkého svalstva a makrofázích v lézích aterosklerózy po transplantaci. Jsou ukázány mikrofotografie studií dvoubarevné imunohistochemické studie ukazující expresi CD40 (hnědé značení) na buňkách hladkého svalstva (červené značení) na obrázku 3A a makrofágů (červené značení) na obrázku 3B u pacienta s aterosklerózou po transplantaci.

-2CZ 297300 B6

Obrázky 4A a 4B: Normální koronární arterie pacienta s idiopatickou kardiomyopatií, obarveno hematoxylinem a eosinem (obr. 4A) a mAb anti-CD40 (obr. 4B).

Obr. 4A: Za povšimnutí stojí chybění ztluštění intimy nebo zánětlivého infíltrátu.

Obr. 4B: Exprese CD40 je omezena na endotelové buňky lemující vaskulámí lumen. Nebyla žádná reaktivita s izotypovou specifickou kontrolní mAb (neukázáno). (Obr. 4A, obr. 4B x25).

Obrázky 5A a 5B: Fibroateromatózní pláty v koronární arterii pacienta s ischemickou kardiomyopatií obarvené hematoxylinem a cosinem (obr. 5A) a mAb anti-CD40 (obr. 5B).

Obr. 5A: Fibrózní kryt překrývající částečně kalcifikované ateromatózní jádro obsahuje četné zánětlivé buňky (šipky).

Obr. 5B: Většina zánětlivých buněk ve fibrózním krytu jsou silně CD40⁺ (šipky). Sousední buňky hladkého svalstva intimy a endotelové buňky jsou také CD40⁺ (Obr. 5A, obr. 5B x25).

Obrázky 6A až 6C: Časná intimální leze bohatá na pěnové buňky u pacienta s ischemickou chorobou srdeční po transplantaci srdce (TCAD) obarvená hematoxylinem a cosinem (obr. 6A) a mAb anti-CD40 (obr. 6B, obr. 6C).

Obr. 6A: Intimální léze obsahuje četné pěnové buňky, makrofágy a buňky hladkého svalstva.

Obr. 6B: CD40 je silně exprimován na mnoha buňkách intimy v této časné lézi u TCAD.

Obr. 6C: zejména pěnové buňky ukazovaly hojné značení na CD40. (Obr. 6A x25, obr. 6B x50, obr. 6C x400).

Obrázky 7A až 7D: Zánětlivý infiltrát přítomný ve fibrózním krytu intimální léze u nativní CA značený mAb anti-CD40L (obr. 7A), kontrolní mAb (obr. 7B), mAb anti-CD4 (obr. 7C) a mAb anti-CD8 (obr. 7D).

Obr. 7A: Charakteristická cytoplazmatická imunoreaktivita a imunoreaktivita buněčného povrchu pro CD40L, která je omezena na lymfocyty.

Obr. 7B: Stejná léze označená kontrolní mAb irelevantního souhlasného izotypu nevykazovala žádné imunologické značení.

Obr. 7C: Fakticky všechny lymfocyty v nativních CA lézích (a také mnoho makrofágů a pěnových buněk) byly CD4⁺, což svědčí pro to, že CD40L⁺ lymfocyty jsou CD4⁺ T buňky.

Obr. 7D: CD8⁺ T buňky jsou v intimálních plácích nativní CA ojedinělé. (Obr. 7A, 7B xlOOO, obr. 7C, 7D x400).

Obrázky 8A a 8B: Hluboké intimální lymfoidní agregáty u TCAD značené mAb anti-CD40L (obr. 8A), kontrolní mAb (obr. 8B) a mAb anti-CD4 (obr. 8C).

Obr. 8A: Většina CD40L⁺ buněk u TCAD (šipky) byla nalezena v lymfoidních agregátech v intimě a daleko od endotelového povrchu.

Obr. 8B: V těchto intimálních lymfoidních agregátech neukazovala kontrolní mAb irelevantního souhlasného izotypu žádné buněčné značení.

-3 CZ 297300 B6

Obr. 8C: Tytéž intimální lymfoidní agregáty jako výše obsahovaly téměř výlučně CD4⁺ T buňky, což svědčí pro to, že CD40L jev těchto lézích exprimován na CD4⁺ T buňkách, (obr. 8A-8C x400).

Obrázky 9A a 9B: Ložisko zánětu endotelu (endotelitis) u TCAD značené mAb anti-CD8 (obr. 9A) a anti-CD40L (obr. 9B).

Obr. 9A: CD8⁺ T buňky přichycené k endotelovým buňkám lumina u TCAD charakteristické pro zánět endotelu. Většina CD8⁺ T buněk byla přítomna v ložiscích zánětu endotelu, zatímco v intimálních lymfoidních agregátech daleko od endotelového povrchu byly ojedinělé.

Obr 9B: zánětlivé buňky v ložiscích zánětu endotelu jsou CD40L⁺. Podobně nebyla na endotelových buňkách detekována exprese CD40L. (Obr. 9A-9B x400).

Obrázky 10A a 10B: Obr. 10A: dvojité imunologické značení intimální léze u nativní CA s mAb anti-CD40 (hnědě) a mAb anti-CD68 (červeně), markér pro makrofágy. Centrální shluk buněk (šipky) ukazuje silné značení pro CD40 a CD68.

Obr. 10B: dvojité imunologické značení TCAD s mAb anti-CD40 (hnědě) a proti aktinu hladkého svalstva (červeně) ukazuje buňky hladkého svalstva CD40⁺ (šipky). Reaktivita CD40 je omezena na buňky hladkého svalstva intimy (šipky), zatímco myocyty medie byly CD40-. (Obr. 10A-B x400).

Obrázky 11A až 1 ID: Sériové řezy nativní CA demonstrující intimální neovaskularizaci a označené mAb anti-CD34 (obr. 11 A), anti-CD40 (obr. 11B), anti-ICAM-1 (obr. 11C), a antiVCAM-1 (obr. 1 ID).

Obr. 11A: Endotelové buňky novotvořených cév intimy zdůrazněné značením na CD34.

Obr. 11B: Endotelové buňky intimální neovaskularizace silně exprimují CD40. Sousední zánětlivé buňky jsou také značené CD40.

Obr. 11C a 11D: Ložiska neovaskularizace také ukazují silnou reaktivitu endotelu pro ICAM-1 (obr. 11C) a VCAM-1 (obr. 1 ID). (Obr. 11A-1 ID x400).

Obrázky 12A až 12C: Dvojité imunologické značení aktivně zanícené intimální léze nativní CA s mAb anti-CD40 (hnědě) a mAb proti adhezivním molekulám (červeně) anti-ICAM-1 (obr. 12A), anti-VCAM-1 (obr. 12B) a irelevantní kontrolní mAb (obr. 12C).

Obr. 12A: V podstatě všechny CD40⁺ (hnědě) buňky, převážně makrofágy (dlouhé šipky) a myocyty intimy (krátké šipky), jsou silně reaktivní na ICAM-1 (červeně).

Obr. 12B: Velký počet CD40⁺ (hnědě) zánětlivých buněk a myocytů intimy (šipky) jsou také reaktivní na VCAM-1 (červeně).

Obr. 12C: Tytéž intimální léze dvojitě značené na CD40 (hnědě) a irelevantní kontrolní Ab souhlasného izotypu nahrazující mAb anti-ICAM-1 a anti-VCAM-1 (červeně). Lze rozeznat pouze hnědé a nikoliv červené značení, což naznačuje nepřítomnost interference detekční techniky pro postupně aplikované mAb anti-CD40 a anti-ICAM nebo anti-VCAM (podrobněji viz Materiál a metody). (Obr. 12A-C x400).

Obrázek 13: Dvojité imunologické značení intimální léze nativní CA s mAb anti-p65 značící aktivovaný NF-κΒ (hnědě) a CD40 (červeně). Aktivovaný NF-κΒ byl rozpoznán výlučně v jádrech buněk CD40⁺ (šipky), většina z nich jsou makrofágy. (x400).

-4CZ 297300 B6

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsob, jak inhibovat ligandem CD40 aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40 na svém povrchu. Tento způsob zahrnuje kontakt buněk s přípravkem schopným inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 ha buňkách, přičemž přípravek je přítomný v množství, které je účinné pro inhibici aktivace buněk. V jednom provedení předkládaného vynálezu je přípravek schopný inhibovat jakoukoliv interakci mezi ligandem CD40 a CD40. Interakce mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách se týká jednoho nebo více aspektů, funkčních nebo strukturálních, vzájemného vztahu CD40-ligand CD40. Proto se může v jednom provedení přípravek, který inhibuje interakci, kompetitivně vázat na ligand CD40 tak, že blokuje nebo zmenšuje vazbu ligandu CD40 na buněčný CD40. V jiném provedení se může přípravek, který inhibuje interakci, spojovat s CD40 nebo ligandem CD40 způsobem, který neinhibuje vazbu ligandu CD40 na buněčný CD40, ale který má vliv na buněčnou odpověď na vazbu CD40, jako je změna rychlosti metabolického obratu buněčného CD40 nebo komplexu CD40-přípravek, změnou vazebné kinetiky CD40 s ligandem CD40, nebo změnou rychlosti nebo rozsahu buněčné aktivace jako odpověď na vazbu CD40.

Ve specifickém provedení předkládaného vynálezu buňky hladkého svalstva nesoucí CD40 jsou buňky hladkého svalstva močového měchýře, buňky hladkého svalstva cév, buňky hladkého svalstva bronchů, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterií, buňky hladkého svalstva pulmonálních žil nebo buňky hladkého svalstva gastrointestinálního traktu. Ve specifičtějších provedeních jsou buňky hladkého svalstva gastrointestinálního traktu buňky hladkého svalstva jícnu, žaludku nebo střev, včetně buněk hladkého svalstva tenkého nebo tlustého střeva.

V provedení předkládaného vynálezu přípravek inhibuje vazbu ligandu CD40 na CD40 na buňkách.

V provedení předkládaného vynálezu je přípravek protein.

V dalším provedení předkládaného vynálezu je přípravek neproteinové povahy. Termín neproteinový se v tomto popisu používá tak, že zahrnuje jakékoliv sloučeniny nebo přípravky, které obsahují prvky jiné než jednoduché či konjugované polypeptidové řetězce. To zahrnuje prvky, jako jsou aminokyseliny mající jiné než peptidové vazby, neproteinové aminokyseliny, jako jsou β, γ nebo δ aminokyseliny, aminokyseliny v D konfiguraci, nebo jiné neproteinové (které nejsou běžnou součástí proteinů) aminokyseliny včetně homocysteinu, homoserinu, citrulinu, omithinu, γ-aminomáselné kyseliny, kanavaninu, kyseliny djenkolové, nebo β-kyanoalaninu, monosacharidů, polysacharidů nebo dalších cukerných skupin, mastných kyselin nebo lipidových skupin, nukleotidových skupin, minerálních skupin nebo dalších neproteinových prvků.

V dalším provedení předkládaného vynálezu je přípravek peptidomimetická sloučenina. Peptidomimetická sloučenina může být alespoň částečně nepřirozená. Peptidomimetická sloučenina může být malá molekula mimetika. Sloučenina může mít zvýšenou stabilitu, účinnost, potenciál a biologickou dostupnost danou mimetikem. Dále může mít sloučenina sníženou toxicitu. Peptidomimetická sloučenina může mít zvýšenou permeabilitu pro střevní sliznici. Sloučenina může být připravena synteticky. Sloučenina podle předkládaného vynálezu může zahrnovat L-, Dnebo aminokyseliny nevyskytující se přirozeně, alfa-, alfa-disubstituované aminokyseliny, Nalkylaminokyseliny, kyselinu mléčnou (isoelektrický analog alaninu). Peptidová kostra sloučeniny může mít alespoň jednu vazbu nahrazenou PSf-[CH=CH] (Kempf et al., Intl. J. Peptide and Prot. Res. 38, 237-241, 1991). Sloučenina může dále zahrnovat trifluorotyrosin, p-Cl-fenylalanin, p-Br-fenylalanin, poly-L-propargylglycin, poly-D,L-allylglycin nebo poly-L-allylglycin.

V dalším provedení předkládaného vynálezu peptidomimetická sloučenina, která má biologickou aktivitu pro inhibici interakce mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, může mít vazbu, peptidovou kostru nebo aminokyselinovou složku nahrazenou vhodným mimetikem. Příklady amino

-5CZ 297300 B6 kyselin nevyskytujících se přirozeně, které mohou být vhodnými aminokyselinovými mimetiky, zahrnují β-alanin, L-a-aminomáselnou kyselinu, L-y-aminomáselnou kyselinu, L-a-aminoisomáselnou kyselinu, L-s-aminokapronovou kyselinu, 7-aminoheptanovou kyselinu, L-asparagovou kyselinu, L-glutamovou kyselinu, cystein (acetamidometyl), Α-ε-Boc-N-a-CBZ-L-lysin, Ν-ε-Boc-N-a-Fmoc-L-lysin, L-methioninsulfon, L-norleucin, L-norvalin, N-oc-Boc-N5CBZ-L-omitin, Ν-δ-Boc-N-a-CBZ-L-omitin, Boc-p-nitro-L-fenylalanin, Boc-hydroxyprolin, Boc-L-thioprolin (Blondelle, S.E. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 2 280-2 286, 1994, Pinilla, C., et al., Peptide Science, 37, 221-240, 1995).

Ve specifickém provedení předkládaného vynálezu protein představuje protilátku nebo její část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Protilátka je monoklonální nebo polyklonální protilátka. Ve specifičtějším provedení se monoklonální protilátka specificky váže na epitop, ke kterému se specificky váže monoklonální protilátka 5c8 (přístupové č. ATCC HB 10916). Příklad takové monoklonální protilátky je monoklonální protilátka 5c8 (přístupové č. ATCC HB 10916). V dalším provedení vynálezu se protilátka specificky váže na CD40. Příklad protilátky anti-CD40 je monoklonální myší anti-lidská CD40, dostupná od Genzyme Customer Service (produkt č. 80-3 702-01, Cambridge, MA, USA). V dalších provedeních vynálezu je monoklonální protilátka chimérická protilátka, primatizovaná protilátka, humanizovaná protilátka nebo protilátka, která obsahuje oblast CDR jednoho člověka a protílátkovou kostru druhého člověka.

Pojmy chimérická, primatizovaná a humanizovaná protilátka a způsoby, jak takové protilátky vytvářet, jsou odborníkům dobře známy. Viz například publikaci mezinárodní přihlášky PCT WO 90/07 861, publikovanou 26. července, 1990, (Queen et al.) a Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10 029, 1989. Způsoby přípravy primatizovaných protilátek jsou popsány například v mezinárodní přihlášce PCT č. WO —/02108, odpovídající mezinárodní přihlášce PCT/US92/06194 (Idec Pharmaceuticals) a v publikaci Newman et al.(Biotechnology, 10,1 4551 460, 1992), které jsou zahrnuty v odkazech této přihlášky.

Obecně humanizovaná protilátka je protilátka obsahující jednu nebo více oblastí určujících komplementaritu (complementarity determining region, CDR) z protilátky jiné než lidské, které jsou funkčně spojeny se segmenty kostry (rámce) lidské protilátky. Volitelně mohou být přítomny další zbytky spojené s protilátkou jinou než lidského původu. Typicky alespoň jeden těžký řetězec nebo jeden lehký řetězec protilátky obsahuje CDR jiného než lidského původu. Typicky CDR jiného než lidského původu jsou myší CDR. Obecně primatizovaná protilátka je protilátka obsahující jednu nebo více oblasti určujících komplementaritu (CDR) z protilátky druhu jiného než primáta jiného než lidského původu, která je funkčně spojena se segmenty kostry protilátky primáta jiného než lidského původu. Volitelně mohou být přítomny další zbytky spojené s druhem, ze kterého pochází CDR. Typicky alespoň jeden těžký řetězec nebo jeden lehký řetězec protilátky obsahuje CDR druhu, který není primát jiného než lidského původu. Typicky CDR jsou lidské CDR. Obecně chimérická protilátka je protilátka, jejíž lehké a/nebo těžké řetězce obsahují úseky protilátek z různých druhů. Například jeden nebo více segmentů variabilní (V) oblasti jednoho druhu mohou být spojeny s jedním nebo více segmenty konstantní (C) oblasti jiných druhů. Typicky chimérická protilátka obsahuje segmenty variabilní oblasti myši připojené k segmentům lidské konstantní oblasti, ačkoliv mohou být použity protilátky i z dalších druhů savců.

Monoklonální protilátka 5c8 je produkována hybridomovými buňkami, které byly uloženy 14. listopadu 1991 v Americké sbírce buněčných kultur (Američan Type Culture Collection (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, USA) podle Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účely patentového řízení. Hybridomu bylo přiřazeno přístupové číslo ATCC HB 10 916.

Ve specifickém provedení vynálezu část protilátky obsahuje oblast určující komplementaritu nebo variabilní oblast lehkého či těžkého řetězce. V dalším specifickém provedení část protilátky obsahuje oblast určující komplementaritu nebo variabilní oblast. V dalším specifickém provedení

-6CZ 297300 B6 vynálezu část protilátky obsahuje Fab nebo protilátku jednoduchého řetězce. Protilátka jednoduchého řetězce je vytvořena z variabilních oblastí spojených proteinovými spojkami do jednoho proteinového řetězce.

V dalším provedení předkládaného vynálezu protein obsahuje rozpustnou extracelulámí oblast ligandu CD40, nebo jeho část, nebo jeho variantu, schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, nebo rozpustnou extracelulámí oblast CD40, nebo jeho část, nebo jeho variantu, schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Ve specifickém provedení vynálezu je rozpustná extracelulámí oblast ligandu CD40 nebo CD40 monomer. V dalším provedení je rozpustná extracelulámí oblast CD40 oligomer.

Varianty se mohou od přirozeně se vyskytujícího CD40 nebo ligandu CD40 lišit v aminokyselinové sekvenci nebo způsoby, které se netýkají sekvence, nebo platí obě možnosti. Varianty v aminokyselinové sekvenci jsou tvořeny, když je jedna nebo více aminokyselin v přirozeně se vyskytujícím CD40 nebo ligandu CD40 nahrazena odlišnou přirozenou aminokyselinou, aminokyselinovým derivátem nebo aminokyselinou, která se přirozeně nevykytuje. Obzvláště výhodné varianty zahrnují zejména přirozeně se vyskytující CD40 nebo ligand CD40, nebo biologicky aktivní fragmenty přirozeně se vyskytujícího CD40 nebo ligandu CD40, jejichž sekvence se liší od sekvence divokého typu substitucemi jedné nebo více konzervativních aminokyselin, které typicky mají minimální vliv na sekundární strukturu a hydrofobní povahu proteinu nebo peptidu. Varianty mohou mít také sekvence, které se liší substitucemi jedné nebo více nekonzervativních aminokyselin, delecemi, nebo inzercemi, které neruší biologickou aktivitu CD40 nebo ligandu CD40. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce jedné aminokyseliny druhou s podobnými vlastnostmi, jako jsou substituce v následujících skupinách: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin; kyselina asparagová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; a fenylalanin, tyrosín. Nepolární (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin, polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrosín, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou.

Další konzervativní substituce, kterých je možno použít, jsou uvedeny v tab. 1 a ještě další jsou popsány Dayhoffem v Atlas of Protein Seqence a Structure (1988).

Tabulka 1

Záměny konzervativních aminokyselin

Aminokyselinu	kód	Nahraď s jakoukoliv z
Alanin	A	D-Ala, Gly, beta-Alfa, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Orn
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Aspartová k.	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Glutamová k.	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Isoleucin	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Om
Methionin	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu

-7CZ 297300 B6

Fenylalan	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D—Trp, Trans 3,4 nebo 5-fenylprolin, cis 3,4 nebo 5 fenylprolin
Prolin	P	D-Pro, L-l-thioazolidin-4-karboxylová D- nebo L-l-oxazolidin-4karboxylová kyselina
Serin	s	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met (O), Val, D-Val
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O) D-Met (O), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	v	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

Další varianty sloučeniny podle vynálezu jsou takové modifikace, které zvyšují peptidovou stabilitu. Tyto varianty mohou obsahovat například jednu nebo více vazeb jiných než peptidových (které nahrazují peptidové vazby) v peptidové sekvenci. Patří sem také varianty, které obsahují zbytky jiných než přirozeně se vyskytujících L-aminokyselin, jako jsou D-aminokyseliny nebo nepřirozeně se vyskytující nebo syntetické aminokyseliny, jako jsou β- nebo γ-aminokyseliny a cyklické varianty. Inkorporace D- místo L-aminokyselin do polypeptidu může zvýšit jeho rezistenci k proteázám. Viz např. patent Spojených států US 5 219 990.

Peptidy podle tohoto vynálezu mohou být také modifikovány různými změnami, jako jsou inzerce, delece a substituce, buď konzervativní, nebo nekonzervativní, tam, kde rakové změny mohou při použití poskytnout určité výhody.

V dalších provedeních mohou mít varianty se substitucemi aminokyselin, které jsou méně konzervativní, také za následek požadované deriváty, např. způsobením změn v náboji, konformaci a dalších biologických vlastnostech. Takové substituce by zahrnovaly například substituce hydrofilního zbytku zbytkem hydrofobním, substituce cysteinu nebo prolinu jiným zbytkem, substituce zbytku majícího malý postranní řetězec zbytkem majícím rozsáhlý postranní řetězec nebo substituce zbytku majícího čistý pozitivní náboj zbytkem majícím čistý negativní náboj. Nemůže-li být výsledek dané substituce s jistotou předpovězen, deriváty mohou být snadno testovány podle způsobů v této přihlášce popsaných, aby se určilo, zda mají nebo nemají požadované vlastnosti.

Varianty v rozsahu vynálezu zahrnují proteiny a peptidy s aminokyselinovou sekvencí, které mají alespoň 80 % homologie s extracelulámí oblastí CD40 nebo extracelulámí oblastí ligandů CD40. Výhodněji je sekvenční homologie alespoň 90 %, nebo ještě výhodněji alespoň 95 %.

Jako je možné nahradit substituenty kostry, je také možné substituovat funkční skupiny, které rozšiřují skelet, a sice skupinami charakterizovanými podobnými vlastnostmi. Tyto substituce budou zpočátku konzervativní, tj. náhradní skupina bude mít přibližně stejnou velikost, tvar, hydrofobičnost a náboj, jako původní skupina. Nesekvenční modifikace mohou zahrnovat například in vivo nebo in vitro chemickou derivatizaci částí přirozeně se vyskytujícího CD40 nebo ligandů CD40, a také změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.

V dalším provedení je protein, zahrnující extracelulámí oblast ligandů CD40 a CD40, modifikován chemickými modifikacemi, ve kterých je zachována jeho aktivita. Například proteiny mohou být amidovány, sulfatovány, jednoduše nebo několikanásobně halogenovaný, alkylovány, karboxylovány nebo fosforylovány. Protein může také být jednoduše .nebo několikanásobně acylován, jako s acetylovou skupinou, se skupinou famesylu nebo s mastnou kyselinou, která může být saturovaná nebo jednonásobně či vícenásobně nestaurovaná. Mastná kyselina může být také jednoduše nebo několikanásobně fluorovaná. Vynález také zahrnuje methioninové analogy proteinu, například sulfonové a sulfoxidové analogy methioninu. Vynález také zahrnuje soli proteinů, jako jsou soli amoniové, včetně alkylamoniových nebo arylamoniových solí, a dále soli jako síran, hydrosíran, fosforečnan, hydrofosforečnan, dihydrofosforečnan, thiosíran, uhličitan, hydrogenuhličitan, benzoát, sulfonát, thiosulfonát, mezylát, etylsulfonát a benzensulfonát.

-8CZ 297300 B6

Rozpustný monomerní protein CD40-L může obsahovat celou nebo část extracelulámí oblasti CD40-L. Extracelulámí oblast CD40-L obsahuje doménu, která se váže na CD40. Tedy rozpustný CD40-L může inhibovat interakci mezi CD40L a buňkou nesoucí CD40. Tento vynález předpokládá, že SCD40-L (rozpustný CD40-L) může tvořit celou extracelulámí oblast CD40-L, nebo fragment nebo derivát obsahující doménu, která váže CD40.

Rozpustný protein CD40 (sCD40) obsahuje extracelulámí oblast CD40. sCD40 inhibuje interakci mezi CD40L a buňkami nesoucí CD40. sCD40 může být v monomerní nebo oligomemí formě.

V dalším provedení předkládaného vynálezu protein, obsahující rozpustnou extracelulámí oblast CD40 nebo její část, dále obsahuje oblast Fc fúzovanou k extracelulámí oblasti CD40 nebo jeho části. Ve specifickém provedení je oblast Fc schopna vazby k proteinu A nebo proteinu G.

V dalším provedení oblast Fc obsahuje IgG, IgGi, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgA_b IgA₂, IgM, IgD nebo IgE.

Rozpustný fúzní protein CD40/Fc může být připraven za použití obvyklých technik enzymového štěpení a ligace fragmentů ze žádoucích sekvenci. Vhodné oblasti Fc pro fúzní protein jsou oblasti Fc, které se můžou vázat na protein A nebo protein G, nebo které jsou způsobilé k tomu být rozeznávány protilátkou, která může být použita při purifikaci nebo detekci fúzního proteinu obsahujícího oblast Fc. Například oblast Fc může zahrnovat oblast Fc lidského IgGi nebo myšího IgG]. Předkládaný vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein CD40/Fc.

Způsob přípravy rozpustných forem membránových molekul rekombinantními technikami, při kterých jsou sekvence kódující transmembránové a cytoplazmatické domény deletovány, je dobře znám. Viz obecně Hammonds et al., patent US 5 057 417. Kromě toho jsou známy způsoby přípravy fúzního proteinu sCD40 a CD40/Fc. Viz např. mezinárodní přihláška PCT WO 93/08 207, a také Fanslow et al., Soluble Forms of CD40 Inhibit Biologie Responses of Human B Cells, J. Immunol., díl 149, ss. 655-60, červenec 1992.

V provedení předkládaného vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou.

Ve specifickém provedení vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou, která obsahuje izolaci vzorku buněk, kultivaci vzorku za podmínek umožňujících aktivaci buněk nesoucích CD40, kontakt vzorku s buňkami exprimujícími protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, účinným aktivovat buňky nesoucí CD40, kontakt vzorku s množstvím přípravku účinným inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, jestliže je přípravek schopný inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, a určení, zda buňky exprimující protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, aktivují buňky nesoucí CD40 v přítomnosti přípravku. Buněčný vzorek může být izolován z různých tkání, včetně buněčných linií v tkáňových kulturách, nebo buněk izolovaných ze zvířete, jako jsou rozptýlené buňky z pevné tkáně, buňky pocházející z biopsie kostní dřeně, nebo buňky izolované z tělesné tekutiny, jako je krev nebo lymfatická tekutina.

V dalším specifickém provedení vynálezu je přípravek (molekula) vybrána na základě trojrozměrné struktury rozpustné extracelulámí oblasti ligandu CD40 nebo její části schopné inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Přípravek může být vybrán z knihovny známých přípravků, modifikován ze známého přípravku na základě trojrozměrné struktury nebo navržen a syntetizován de novo na základě trojrozměrné struktury. Ve specifických provedeních vynálezu je přípravek (molekula) navržen strukturální optimalizací základního (vedoucího) inhibičního přípravku na podkladě trojrozměrné struktury komplexu rozpustné extracelulámí oblasti

-9CZ 297300 B6 ligandu CD40 nebo jeho části se základním inhibičním přípravkem. Základní inhibiční přípravek je molekula, která se pozná tak, že je-li v kontaktu s ligandem CD40, naváže se a vytvoří komplex s rozpustnou extracelulámí oblasti ligandu CD40, CD40, nebo její částí, a tím snižuje schopnost komplexního nebo navázaného ligandu CD40 nebo části ligandu CD40 aktivovat buňky nesoucí CD40. V dalším provedení vynálezu může základní inhibiční přípravek působit prostřednictvím interakce buď s extracelulámí oblasti ligandu CD40, CD40, nebo v terciárním komplexu jak s části ligandu CD40, tak s CD40, a tím snižovat schopnost komplexu ligandu CD40-CD40 aktivovat buňky nesoucí CD40. Ve způsobech podle předkládaného vynálezu může být ligand CD40 buď rozpustný, nebo navázaný na buňky, jako jsou aktivované T buňky, a může být buď nezkrácený nativní ligand CD40 nebo jeho části. Snížená schopnost aktivovat buňky nesoucí CD40 se může měřit různými způsoby. Jeden způsob, jak se může měřit, je prokázat, že ligand CD40 v přítomnosti inhibitoru způsobí menší stupeň aktivace buněk nesoucích CD40 ve srovnání s působením podobného množství ligandu CD40 na buňky bez inhibitoru za podobných podmínek. Snížená schopnost aktivovat buňky nesoucí CD40 může být také indikována vyšší koncentraci komplexu inhibitoru-ligand CD40, která je vyžadována pro tvorbu podobného stupně aktivace buněk nesoucích CD40 při srovnání s nenavázaným ligandem CD40 za podobných podmínek. V krajnosti může být ligand CD40 kontaktovaný inhibitorem neschopný aktivovat buňky nesoucí CD40 v koncentracích a za podmínek, které umožňují aktivaci těchto buněk nenavázaným ligandem CD40 nebo jeho danou částí.

Přípravek (molekula) může být vybrán výpočtovou testovací metodou na základě krystalické struktury rozpustného fragmentu extracelulámí domény lidského CD40L obsahujícího zbytky Glyn6-LeU26i (sekvence s id. č. 1) (sCD40L 116-261).

Krystalická struktura vhodná pro použití při testování byla určena v rozlišovací schopnosti 2 A metodou molekulové náhrady. V krátkosti se jednalo o to, že rozpustný fragment extracelulámí domény lidského ligandu CD40, obsahující aminokyselinové zbytky Glyn₆ až k zbytku Leu₂6i na C-koncové části, byl poprvé vytvořen v rozpustné formě, poté purifíkován a krystalizován. Krystaly byly použity pro sběr difrakčních dat. Nahrazování molekul a upřesňování se provádělo s programy XPLOR a QUANTA (Molecular Simulations, lne.). Konkrétně, zkonstruoval se trojrozměrný model lidského sCD40L za použití myšího modelu CD40L pomocí programu QUANTA modelujícího proteinovou homologii. Tento model se použil jako sonda pro kalkulace krystalografické analýzy a upřesnil za použití XPLOR. Tato metoda určování krystalické struktury sCD40L je detailněji popsána v Karpusas et al., 2 Á crystal structure of an extracellular fragment of human CD40 ligand, Structure, 3(10), 1 031-1 039, říjen 1995. Atomové souřadnice sCD40L (116-261) jsou v této přihlášce uvedeny na obrázcích 2A-Y. Testovací metoda pro výběr přípravku zahrnuje výpočtový návrh přípravku a opakovanou optimalizaci struktury, jak bude dále popsáno.

Přípravek může být inhibitor vybraný za použití výpočtového návrhu přípravku. Při použití této metody, jsou použity souřadnice krystalické struktury sCD40L jako vstup pro počítačový program, jako je DOCK, jehož výstupem je seznam molekulových struktur, u kterých se očekává vazba k CD40L. Použití takových počítačových programů je odborníkovi dobře známo. Viz např. Kuntz, Structure-Based Strategies for drug design and discovery. Science, díl 257, s. 1 078, 1992. Seznam molekulových struktur může být poté testován biochemickými testy na vazbu CD40L. Mohou být použity biochemické testy kompetitivního typu, které jsou v oboru dobře známy. Viz např. Bajorath et al., Identification of residues of CD40 and its ligand which are critical for the receptor-ligand interaction, Biochemistry, 34, s. 1 833, 1995. Struktury, u kterých se zjistilo, že se vážou k CD40L, mohou být tedy použity jako přípravky podle předkládaného vynálezu. Přípravek může také být modifikovaná nebo navržená molekula, určená interaktivními cykly strukturální optimalizace. Za použití tohoto přístupu může být malá molekula inhibitoru CD40L, nalezená za použití výše uvedeného výpočtového přístupu nebo jiného přístupu, společně krystalizována s sCD40L a krystalická struktura komplexu může být řešena nahrazováním molekul. Informace získaná prostřednictvím molekulového nahrazování může být použita pro optimalizaci struktury inhibitorů tak, že vede k objasnění toho, jak molekuly interagují

-10CZ 297300 B6 s CD40L. Molekula může být modifikována, aby se zlepšily její fyzikálněchemické vlastnosti, včetně specifity a afinity pro CD40L.

V provedení tohoto vynálezu je přípravek malá molekula. Malá molekula je v tomto popise vynálezu sloučenina mající molekulovou hmotnost mezi 20 D a IxlO⁶ D, výhodně od 50 D do 2 kD.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob, jak inhibovat aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40 na povrchu buněk ligandem CD40, u pacienta, přičemž tento způsob zahrnuje podávání pacientovi přípravku schopného inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, přičemž přípravek je přítomný v množství, které účinně inhibuje aktivaci buněk pacienta.

Ve specifickém provedení vynálezu buňky hladkého svalstva nesoucí CD40 jsou buňky hladkého svalstva měchýře, buňky hladkého svalstva cév, buňky hladkého svalstva bronchů, buňky hladkého svalstva aorty, buňky hladkého svalstva koronárních arterií, buňky hladkého svalstva pulmonálních žil nebo buňky hladkého svalstva gastrointestinálního traktu. Ve specifičtějších provedeních vynálezu jsou buňky hladkého svalstva gastrointestinálního traktu buňky hladkého svalstva jícnu, žaludku nebo střev, včetně buněk hladkého svalstva tenkého nebo tlustého střeva.

V provedení předkládaného vynálezu přípravek inhibuje vazbu ligandu CD40 na CD40 na buňkách.

V provedeni předkládaného vynálezu je přípravek protein. V dalším provedení vynálezu je přípravek neproteinové povahy.

Ve specifickém provedení vynálezu protein zahrnuje protilátku nebo její část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Protilátka je monoklonální nebo polyklonální protilátka. Ve specifičtějším provedení vynálezu se monoklonální protilátka specificky váže na epitop, ke kterému se specificky váže monoklonální protilátka 5c8 (přístupové č. ATCC HB 10 916). Příklad takové monoklonální protilátky je monoklonální protilátka 5c8 (přístupové č. ATCC HB 10 916). V dalších provedeních vynálezu je monoklonální protilátka chimérická nebo humanizovaná protilátka.

Ve specifickém provedení vynálezu část protilátky obsahuje oblast určující komplementaritu nebo variabilní oblast lehkého či těžkého řetězce. V dalším specifickém provedení vynálezu část protilátky obsahuje oblast určující komplementaritu nebo variabilní oblast. V dalším specifickém provedeni část protilátky obsahuje Fab nebo jednoduchý řetězec protilátky.

V dalším provedení vynálezu protein obsahuje rozpustnou extracelulámí oblast ligandu CD40 nebo jeho část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách, nebo rozpustnou extracelulámí oblast CD40 nebo jeho část schopnou inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Ve specifickém provedení vynálezu je rozpustná extracelulámí oblast ligandu CD40 nebo CD40 monomer. V dalším provedení rozpustná extracelulámí oblast CD40 je oligomer.

V dalším provedení předkládaného vynálezu protein obsahující rozpustnou extracelulámí oblast CD40 nebo její část dále obsahuje oblast Fc fúzovanou k extracelulámí oblasti CD40 nebo její části. Ve specifickém provedení vynálezu je oblast Fc schopna vazby k proteinu A nebo proteinu G. V dalším provedení oblast Fc obsahuje IgG, IgG_b IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgA_b IgÁ₂, IgM, IgD nebo IgE.

Jsou-li podávány, jsou proteiny často rychle odstraněny z oběhu, a mohou tudíž vyvolat pouze relativně krátkodobý farmakologický účinek. Následkem toho mohou být vyžadovány pro udržení léčebného účinku časté injekce relativně velkých dávek biologicky aktivních proteinů. O proteinech modifikovaných kovalentním připojením ve vodě rozpustných polymerů, jako je poly

-11 CZ 297300 B6 etylenglykol, kopolymerů polyetylenglykolu a polypropylenglykolu, karboxymetylcelulózy, dextranu, polyvinylalkoholu, polyvinylpyrolidonu nebo polyprolinu, je známo, že projevují podstatně delší poločasy po intravenózní injekci v séru, než projevují odpovídající nemodifikované proteiny (Abuchowski et al., v: Enzymes as Drugs, Holcenberg et al., eds. Wiley-Interscience, New York, NY, 367-383, 1981, Anderson, W.F., Human Gene Therapy, Science, 256, 808-813, 1992, Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4, 185-189, 1982, a Katre et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1 487-1 491, 1987). Takové modifikace mohou také zvýšit rozpustnost proteinu ve vodných roztocích, eliminovat agregaci, zvýšit fyzikální a chemickou stabilitu proteinu, a značně snížit imunogenní a antigenní působení proteinu. Výsledkem je, že u takových adičních sloučenin polymer-protein se dosáhne požadované biologické aktivity in vivo méně častým podáváním, nebo v nižších dávkách, než při použití nemodifikovaného proteinu.

Připojení polyetylenglykolu (PEG) k proteinům je užitečné obzvláště proto, že PEG je pro savce velmi málo toxický (Carpenter et al., 1971). Například adiční sloučenina PEG-adenosindeamináza byla ve Spojených Státech schválena pro použití u lidí pro léčbu vážného kombinovaného imunodeficitního syndromu. Druhá výhoda poskytnutá konjugací PEG je, že, účinně snižuje imunogenní a antigenní působení heterologních proteinů. Například adiční sloučenina PEG-lidský protein může být použitelná pro léčení nemoci u dalších druhů savců bez rizika vyvolání vážné imunitní odpovědi. V jednom provedení tohoto vynálezu může být protein podáván v mikroopouzdře (microencapsulation device), aby se snížilo riziko nebo zabránilo imunitní odpovědi hostitele proti proteinu. Protein může být také podáván v membránovém mikroopouzdře jako je lipozom.

Polymery, jako je PEG, mohou být pohodlně připojeny k jednomu nebo více reaktivním aminokyselinovým zbytkům v proteinu, jako například α-aminoskupina aminokyseliny N-koncové části, ε-aminoskupiny lysinových postranních řetězců, sulfhydrylové skupiny cysteinových postranních řetězců, karboxylové skupiny asparagylových a glutamylových postranních řetězců, α-karboxylová skupina aminokyseliny C-koncové části, tyrosinové postranní řetězce, nebo aktivované deriváty glykosylových řetězců připojené k určitým asparaginovým, serinovým nebo threoninovým zbytkům.

Byly popsány četné aktivované formy PEG vhodné pro přímou reakci s proteiny. Použitelné PEG reagencie pro reakci s proteinovými aminoskupinami zahrnují aktivní estery karboxylové kyseliny nebo uhličitanové deriváty, zejména ty, ve kterých výchozí skupiny jsou N-hydroxysukcinimid, p-nitrofenol, imidazol nebo l-hydroxy-2-nitrobenzen-4-sulfonát. Deriváty PEG obsahující maleimidové nebo haloacetylové skupiny jsou použitelné reagencie pro modifikaci proteinových volných sulfhydrylových skupin. Podobně PEG reagencie obsahující aminohydrazinové nebo hydrazinové skupiny jsou použitelné pro reakci s aldehydy vzniklými jodistanovou oxidací uhličitanových skupin v proteinech.

Subjekt, který může být léčen popsanými způsoby, je zvíře. Výhodně je zvířetem savec. Příklady savců, které mohou být léčeny zahrnují, ale nejsou omezeny na, lidi, primáty jiného než lidského původu, hlodavce (včetně krys, myši, křečků a morčat), krávu, koně, ovci, kozu, prase, psa a kočku.

V provedení vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou.

Ve specifickém provedení vynálezu je přípravek vybrán testovací metodou, která obsahuje izolaci vzorku buněk, kultivaci vzorku za podmínek umožňujících aktivaci buněk nesoucích CD40, kontakt vzorku s buňkami exprimujícími protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, účinným aktivovat buňky nesoucí CD40, kontakt vzorku s množstvím přípravku účinným inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, jestliže je přípravek schopný inhibovat aktivaci buněk nesoucích CD40, a určení, zda buňky exprimující

- 12CZ 297300 B6 protein, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, nebo s proteinem, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 5c8 produkovanou hybridomem majícím přístupové č. ATCC HB 10 916, aktivují buňky nesoucí CD40 v přítomnosti přípravku. Buněčný vzorek může být izolován z různých tkání, včetně buněčných linií v tkáňových kulturách, nebo buněk izolovaných ze zvířete, jako jsou rozptýlené buňky z pevné tkáně, buňky pocházející z biopsie kostní dřeně, nebo buňky izolované z tělesné tekutiny, jako je krev nebo lymfatická tekutina.

V dalším specifickém provedení vynálezu je molekula (přípravek) vybrána na základě trojrozměrné struktury rozpustné extracelulámí oblasti ligandu CD40 nebo její části schopné inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách. Molekula může být vybrána z knihovny známých molekul, modifikována ze známé molekuly na základě trojrozměrné struktury nebo navržena a syntetizována de novo na základě trojrozměrné struktury. Ve specifických provedeních vynálezu jsou přípravek nebo molekula navrženy strukturální optimalizaci základního inhibičního přípravku na základě trojrozměrné struktury komplexu rozpustné extracelulámí oblasti ligandu CD40 nebo jeho části se základním inhibičním přípravkem.

Způsob léčení

Předkládaný vynález poskytuje způsob léčení nemoci závislé na buňkách hladkého svalstva u subjektu. Způsob léčení obsahuje výše popsaný způsob, jak inhibovat aktivaci buněk hladkého svalstva nesoucích CD40 na svém povrchu ligandem CD40, což spočívá v podávání přípravku schopného inhibovat interakci mezi ligandem CD40 a CD40 na buňkách subjektu, přičemž přípravek je podáván v množství, které účinně inhibuje aktivaci buněk u subjektu.

V provedení vynálezu je nemocí závislou na buňkách hladkého svalstva cévní nemoc. Ve specifickém provedení vynálezu je cévní nemocí ateroskleróza.

V dalším provedení vynálezu je nemocí závislou na buňkách hladkého svalstva nemoc gastrointestinálního traktu. Ve specifickém provedení vynálezu je nemoc gastrointestinálního traktu vybrána ze skupiny obsahující poruchy motility jícnu, zánětlivé střevní nemoci a sklerodermie.

V provedení vynálezu je nemoci závislou na buňkách hladkého svalstva onemocnění měchýře.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány jakýmkoliv způsobem, který je lékařsky přijatelný. To může zahrnovat injekce parenterálními cestami, jako je intravenózní, intravaskulární, intraarteriální, subkutánní, intramuskulámí, intratumorová, intraperitoneální, intraventrikulární, intraepidurální, nebo další, a také perorální, nazální, oftalmická, rektální, topická nebo inhalační. Podávání s prodlouženým uvolňováním je ve vynálezu také specificky zahrnuto způsobem jako jsou depotní injekce rozpadavých implantátů aplikovaných přímo během chirurgického výkonu.

Sloučeniny jsou podávány v jakékoliv dávce na kg tělesné hmotnosti a při jakékoliv četnosti dávkování, jaké jsou lékařsky přijatelné. Přijatelné dávkování zahrnuje rozmezí mezi asi 0,01 až 200 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta. Výhodné rozmezí dávkování je mezi asi 0,1 a 50 mg/kg. Obzvláště výhodná je dávka mezi asi 1 a 30 mg/kg. Dávkování se opakuje v intervalech v rozmezí od každého dne po každý, druhý měsíc. Jeden výhodný dávkovači režim je podávat sloučeninu vynálezu denně první tři dny léčení, po kterých je sloučenina podávána každé 3 týdny, přičemž každé podávání je intravenózní v dávce 5 nebo 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Další výhodný režim je podávat sloučeninu podle vynálezu denně intravenózně v dávce 5 mg/kg tělesné hmotnosti po první tři dny léčby, po kterých je sloučenina podávána subjektu subkutánně nebo intramuskulámě každý týden v dávce 10 mg. Další výhodný režim je podávat jednu dávku sloučeniny vynálezu parenterálně v dávce 20 mg/kg tělesné hmotnosti, což je následováno podáváním sloučeniny subjektu subkutánně nebo intramuskulámě každý týden v dávce 10 mg.

-13 CZ 297300 B6

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány jako jedna dávka pro určité indikace, jako je prevence imunitní odpovědi na antigen, kterému je subjekt vystaven krátkou dobu, např. exogenní antigen, podaný jeden den léčby. Příklady takových antigenů by zahrnuly společné podávání sloučeniny vynálezu spolu s vektorem genové terapie, nebo léčebným přípravkem, jako je antigenní farmaceutický nebo krevní produkt. V indikacích, kde je antigen přítomný chronicky, jako je kontrola imunitní reakce na transplantovanou tkáň nebo na chronicky podávaná antigenní léčiva, jsou sloučeniny vynálezu podávány v intervalech po tak dlouhou dobu, jak je lékařsky indikováno, v rozmezí od dnů nebo týdnů až doživotně.

Zánětlivé odpovědi jsou charakterizovány zarudnutím, otokem, horkostí a bolesti, jako následky kapilární dilatace s otokem a migrací fagocytujících leukocytů. Zánět je dále definován Gallinem (kapitola 26, Fundamental Immunology, 2. vyd., Raven Press, New York, s. 721-733, 1989), což je zahrnuto v odkazech.

Pro lepší porozumění vynálezu uvádíme v následujících příkladech řadu experimentálních detailů. Avšak odborníkovi je zřejmé, že uváděné specifické metody a výsledky pouze ilustrují vynález, který je plně popsán v patentových nárocích, které poté následují.

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1 a 2

Příklady 1 a 2 dále uvedené demonstrují, že zánětlivé cytokiny vyvolávají u buněk hladkého svalstva expresi CD40. Kromě toho dokazují, že signály zprostředkované CD40L regulují funkce hladkého svalstva.

Příklad 1

Pro zjištění, zda buňky hladkého svalstva exprimují CD40, byla použita analýza FACS. Na 6 jamkových destičkách se kultivovaly buňky hladkého svalstva lidské aorty v živném médiu M199 doplněném 25 % FCS, 5 % lidským sérem, heparinem 90 pg/ml, růstovým faktorem endotelových buněk 15 μg/ml, a 1 % penicilinem-streptomycinem. Média se měnila každé 2 až 3 dny a když byly buňky blízko konfluenci, byly 72 hodin pěstovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti IFN-γ (1000 U/cm³), IL-la (1 ng/cm³) nebo TNF-a (200U/cm³). Buňky se sbíraly ošetřením trypsin-EDTA a exprese CD40 se určovala ,analýzou FACS pomoci mAb anti-CD40 G28.5. Buňky byly také označeny izotypovou negativní kontrolní mAb a jako pozitivní kontrola byla použita mAb anti-CD54 (ICAM-1).

Buňky hladkého svalstva neexprimují konstitutivně CD40, jak je ukázáno na obrázku IA. Avšak IFN-γ na rozdíl od IL-Ια nebo TNF-a vyvolává expresi CD40 buňkami hladkého svalstva (obrázky 1 A, 1B a 1C). Tyto studie dokazují, že IFN-γ vyvolává expresi CD40 na buňkách hladkého svalstva lidské aorty.

Příklad 2

Exprese CD40 na buňce hladkého svalstva byla vyšetřována in šitu. Buňky nalezené v médii normálních cév, které jsou morfologicky podobné buňkám hladkého svalstva, nereagují s mAb anti-CD40. Avšak buňky, které se morfologicky podobají buňkám hladkého svalstva, nalezené v zánětlivých lezích u akcelerované aterosklerózy po transplantaci, exprimují CD40 in šitu. Tyto studie svědčí pro to, že zánětlivé cytokiny indukují buňky hladkého svalstva, aby exprimovaly

-14CZ 297300 B6

CD40. Kromě toho tyto studie dokazují, že signály zprostředkované CD40L regulují funkce buněk hladkého svalstva.

Příklad 3

CD40L⁺ CD4⁺ T buňky a CD40⁺ cílové buňky jsou přítomné u aterosklerózy a ischemické choroby srdeční po transplantaci srdce.

Aktivované endotelové buňky (EC), makrofágy (Mac) a CD4⁺ T buňky jsou přítomné časně v lézích koronární aterosklerózy (CA) a aterosklerózy po transplantaci srdce (TA). Protože CD40L je CD4⁺ povrchová molekula T buňky indukovaná aktivací, která přenáší aktivační signály závislé na kontaktu CD40⁺ cílovým buňkám, včetně EC (vyvolaná exprese ICAM, VCAM a Eselektinu) a Mac (indukuje tvorbu NO, TNF-α a IL-1), zkoumali jsme in šitu expresi CD40L a CD40 u CA (n=5) a TA (n=5). Exprese CD40L a CD40 se určovala za použití mAb antiCD40L 5c8, mAb anti-CD40 G28.5 nebo příslušných kontrolních mAb. Zmrazené řezy normálních koronárních arterii (n=3) neobsahují T buňky a exprese CD40 je omezena na EC. Na rozdíl od toho léze spojené s CA a TA obsahují CD40L⁺ CD4⁺ T buňky, jak bylo určeno imunologickým značením sériových řezů. Kromě toho exprese CD40 na zmrazených řezech od pacientů s CA a TA je výrazně zvýšena na EC, infiltrujících mononukleámích buňkách, pěnových buňkách a buňkách hladkého svalstva intimy (SMC). Dvoubarevná imunohistochemická analýza (tj. s dvojím značením) tkáně fixované v parafínu za použití specifických markérů pro SMC (aktin hladkého svalstva) nebo Mac (HAM-56) potvrdila expresi CD40 na těchto buňkách. Je zajímavé, že SMC intimy vzdálené zánětlivým buňkám a SMC médie jsou CD40”, což svědčí pro to, že místní zánětlivé mediátory vyvolávají expresi CD40 na SMC in vivo. Aktivace CD40 a CD40L⁺ CD4⁺ T buněk byla zjištěna ve všech stádiích TA a byla nejpatmější v časných lézích CA, včetně lipidových proužků. Úhrnem tyto studie svědčí pro to, že CD40L⁺ T buňky mohou interagovat s CD40⁺ cílovými buňkami u CA a TA a přispět k patogenezi těchto nemocí podporováním tvorby prozánětlivých molekul.

Příklad 4

CD40 je exprimován na buňkách hladkého svalstva a makrofázích v lézích aterosklerózy po transplantaci

Exprese CD40 in šitu u nativní aterosklerózy nebo aterosklerózy po transplantaci byla studována dvoubarevnou imunohistochemickou analýzou. Studie s dvojitým imunohistochemickým značením se prováděly na koronárních arteriích, které byly fixovány v 10 % pufrovaném formalinu a zality parafínem. Parafín se z řezů odstranil xylenem, řezy se hydratovaly a endogenní peroxidáza se utlumila 1,5 % H₂O v 80 % alkoholu. Řezy byly poté ošetřeny 0,01 % pepsinem v HC1 (pH 1,5) 15 minut ve 37 °C. Poté se řezy propláchly PBS a inkubovaly s 10 % koňským sérem 20 minut, aby se blokovalo nespecifické značení. Poté se detekovalo anti-CD40 značení pomocí soupravy Vector ABC Elitě Kit (Vector) používající postupně biotinylovanou sekundární protilátku, komplex avidin-peroxidáza a jako vývojku 3,3' diaminobenzidin. Výskyt CD40 byl pozorován jako hnědé značení. Nato byly řezy opláchnuty PBS a opět blokovány 10 % koňským sérem. Řezy se pak inkubovaly po dobu jedné hodiny s mAb specifickou pro buňky hladkého svalstva (aktin hladkého svalstva) nebo pro makrofágy (HAM 56). Primární protilátky se poté konjugovaly s alkalickou fosfatázou za použití systému avidin-biotin (Vector). Pro detekci aktivity alkalické fosfatázy byl použit vektor Red (Vector) a reakce poskytla červené značení. Proto dvojitě značené buňky vykazovaly hnědé (CD40) a červené (buňky hladkého svalstva nebo makrofágy) značení. Pro kontrolu interference mezi těmito dvěma imunohistochemickými postupy použitými pro analýzu dvojitým značením byly sériové řezy každého vzorku značeny také buď na CD40 aktin hladkého svalstva, nebo HAM 56. Viz obrázky 3A a 3B. Kontrolní řezy

- 15 CZ 297300 B6 vykazovaly stejnou distribuci imunoreaktivity pro každou z primárních mAb jako dvojitě označené řezy.

Příklad 5

Distribuce CD40L a CD40 u nativní koronární aterosklerózy a ischemické chorobě srdeční po transplantaci srdce: korelace exprese CD40 s výskytem intercelulámích adhezivních molekul, aktivovaného NF-κΒ a výskytem T lymfocytů

T buňky hrají roli v patogenezi nativní koronární aterosklerózy (CA) a ischemické choroby srdeční po transplantaci srdce (TCAD), avšak mechanismus, kterým T buňky interagují s dalšími buňkami v těchto lézích, není plně znám. CD40L je povrchová molekula CD4⁺ T buňky indukovaná aktivací, která interaguje s CD40⁺ cílovými buňkami, včetně makrofágů a endotelových buněk, a indukuje tvorbu prozánětlivých molekul, včetně ICAM-1 a VCAM-1. Kromě toho je známo, že vazba CD40 aktivuje transkripční faktor NF-κΒ. Aby se zjistilo, zda interakce CD40L-CD40 mohou hrát roli v patogenezi CA nebo TCAD, prováděla se imunohistochemické studie exprese CD40L a CD40 na zmrazených řezech koronárních arterii získaných od příjemců srdečního aloštěpu s CA (n=10) nebo TCAD (n=9). Za použití dvou různých mAb anti-CD40L bylo nalezeno, že exprese CD40L byla u CA a TCAD omezena na infiltruj ící lymfocyty. Exprese CD40 byla výrazně aktivována na endotelových buňkách intimy, pěnových buňkách, makrofázích a buňkách hladkého svalstva u obou nemocí. Dvojité imunologické značení prokázalo, že mnoho CD40⁺ buněk exprimovalo společně ICAM-1, VCAM-1 nebo aktivovanou formu NFkB. Rozsah exprese CD40, ICAM-1 a VCAM-1 vykazoval statisticky významnou korelaci s vážností onemocnění a množstvím intimálních lymfocytů. Tyto studie úhrnem dokazují výskyt aktivovaných buněk CD40L a CD40⁺ u obou lézí, CA i TCAD, a svědčí pro to, že CD40L zprostředkovaná interakce s CD40⁺ makrofágy, pěnovými buňkami, buňkami hladkého svalstva a/nebo endotelovými buňkami muže přispět k patogenezi těchto nemocí.

Několik linií důkazů naznačuje, íe imunitní mechanismy zprostředkované buňkami přispívají kzánětlivým lézím (1-4) charak eristickým pro nativní koronární aterosklerózu (CA) (5-10) aischemickou chorobu srdeční p< transplantaci srdce (TCAD) (11-13). Například infíltrující T buňky intimy exprimující aktivači í markéry, jako jsou CD25 a molekuly MHC II. třídy, jsou přítomné časně při vývoji vaskulán ích lézí u obou nemocí (5, 14). Aktivované makrofágy jsou obecně nalézány v lézích u obou r smočí, stejně jako cytokiny spojené s imunitní odpovědí závislou na T buňkách, včetně IFN-γ, I ^-1 a TNF-a (5-17). Jako další důkaz, že T buňky mohou hrát patogenní roli u CA, byly izolová: ý CD4⁺ T buněčné klony z lidských fíbroateromatózních plátů u CA, které proliferují a sečemi |í IFN-γ, jsou-li přivedeny do kontaktu s oxidovanými LDL (18), hlavní složkou lézí u obou n imocí, nativní CA a TCAD (1, 19, 20). Kromě toho, hyperlipidémií vyvolané aterosklerotické ! íze jsou redukované u myší ošetřených mAb anti-CD4 (21). Podobně vaskulární léze u TCAD >e významně zlepší, když jsou kmenům myší geneticky deficitních v T buňkách (13) transplai továny aloštěpy, nebo jsou tyto kmeny ošetřeny mAb antiCD413 nebo anti-IFN-γ (22). Úhi íiem tato data silně svědčí pro to, že v patogenezi těchto nemocí jsou zapojeny T buňky a také eí šktorové molekuly pocházející z T buněk (9, 23, 24).

CD40L je povrchová, molekula o nolekulové hmotnosti 30-33 kD exprimovaná na aktivovaných CD4⁺ T buňkách, která přináší sig lály závislé na kontaktu k CD40⁺ cílovým buňkám, jako jsou B buňky (25-29). CD40L zprostřed] ovane signály jsou kriticky důležité ve vývoji humorální imunitní odpovědi in vitro a in vivo z ivislé na T buňkách (30). Není známo, zda interakce CD40LCD40 hrají také roli v imunitní ( dpovědi in vitro a in vivo zprostředkované buňkami (31, 32). Je zajímavé, že makrofágy a end< tělové buňky, buněčné typy, o nichž je známo, že se účastní patogeneze CA a TCAD, také exj rimují CD40 (33-37). Kromě toho vazba CD40 na makrofágy a endotelové buňky in vitro vyvc lává tvorbu molekul, které zesilují imunitní odpovědi a/nebo mají prozánětlivé účinky. Napříkl id interakce CD40L-CD40 vyvolávají expresi molekuly MHC

-16CZ 297300 B6

II. třídy a společné stimulační molekuly CD86 na makrofázích in vitro (38). Kromě toho vazba CD40 na makrofágy vyvolává tvorbu cytokinů (TNF-a, IL-Ιβ, IL-12), chemokinů (IL-8, MIPla), oxidu dusnatého (NO) prostřednictvím indukce NO-syntetázy 2, prokoagulačního proteinového tkáňového faktoru a metaloproteináz mezibuněčné hmoty (33, 34, 39-42). Interakce CD40L-CD40 aktivují intercelulární adhezivní molekuly CD54 (ICAM-1), CD106 (VACM-1) aCD62E (E-selektin) na endotelových buňkách (35-37). Mnoho účinků vazby CD40 závisí na aktivaci transkripčního faktoru NF-kB (43-45).

Tyto nálezy společně nasvědčují představě, že vazba CD40 na celou řadu cílových buněk může zesilovat CD4⁺ T buňkami zprostředkovanou zánětlivou reakci in vivo. Tuto hypotézu podporuje aktivace exprese CD40 v ledvinách pacientů s lupoidní glomerulonefritidou, nefropatií IgA a glomerulonefritidou ANCA⁺ a v kůži pacientů s psoriázou (35, 46). Kromě toho CD40L⁺ T buňky infiltrují ledviny pacientů se zánětlivými renálními nemocemi (46). Protože interakce T buněk s makrofágy, endotelovými buňkami a možná dalšími buňkami hraje roli v patogenezi CA a TCAD, je v současné studii zkoumána exprese CD40L a CD40 u těchto dvou nemocí za použití imunohistochemických metod. CD40L je exprimován na T buňkách a exprese CD40 je aktivována na endotelových buňkách, buňkách hladkého svalstva, makrofázích a pěnových buňkách v intimálních lézích u obou nemocí. Kromě toho, při použití dvojitého imunologického značení bylo nalezeno, že mnoho CD40⁺ buněk v těchto lézích exprimuje společně CD54, CD106 a aktivovanou formu NF-kB.

Popis použitých metod

Lidské koronární arterie

Z explantovaných srdcí 23 příjemců srdečního aloštěpu se získaly segmenty levé koronární arterie nebo proximální části rámus interventricularis anterior. Devět pacientů podstoupilo retransplantaci, protože se u nich vyvinula těžká ischemická choroba srdeční po transplantaci srdce (TCAD). U těchto pacientů bylo přežití prvního aloštěpu v rozmezí mezi 38 a 103 měsíci. Deset pacientů obdrželo srdeční aloštěpy, protože se u nich vyvinula těžká ischemická choroba srdeční a ischemická kardiomyopatie. Kontrolní koronární arterie bez aterosklerotických změn byly získány z explantovaných srdcí 4 pacientů, 3 měli idiopatickou kardiomyopatii a jeden srdeční sarkom. Části každé cévy byly rychle zmraženy v izopentanu v -80 °C a na kryostatu (Reichert Histostat) se řezaly sériové řezy v tloušťce 4 mm. Řezy byly upevněny na podložních sklíčkách potažených sialinem, sušeny na vzduchu, 1 minutu fixovány ve studeném acetonu, dalších 7 minut ve směsi studený aceton/chloroform 1:1a uskladněny v -80 °C. Jeden řez z každé koronární arterie byl fixován v 10 % formalinu a obarven hematoxylinem a cosinem pro histologické vyhodnocení.

Primární protilátky

Anti-CD40 z hybridomu G28.5 (IgGl) byla získána ze Sbírky buněčných kultur (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD). Protilátka mAb anti-CD40L 5C8 (IgG2a) byla připravena jak již bylo popsáno (28). Obě mAb G28.5 a 5C8 byly purifikovány z ascitu za použití kolony pro protein G (Pharmacia, Piscataway, NJ). Další mAb anti-CD40L (IgGl) byla získána od firmy Calbiochem (San Diego, CA). Od firmy Caltag (Buriingame, CA) byla získána IgM mAb antiCD40 a byla použita pro studie s dvojitým imunologickým značením. Monoklonální Ab proti CD3, CD4, CD8, CD34, CD68 (Novocastra, Burlingham, CA, všechny IgGl) a proti aktinu buněk hladkého svalstva (SMA) (DAKO, Carpinteria, ČA, IgG2a) byly použity pro rozlišení různých buněčných typů v intimálních plácích, včetně T buněk (CD3, CD4 nebo CD8), endotelových buněk (CD34), makrofágů (CD68) a buněk hladkého svalstva (SMA). mAb anti-ICAM-1 (IgGl) a anti-VCAM-1 (IgGl) byly získány od CHEMICON™ (Temecula, CA). Distribuce aktivovaného NF-κΒ se detekovala pomocí mAb p65 (IgG3) (BOEHRINGER MANNHEIM™), která se váže na epitop podjednotky p65 NF-κΒ blokovaný IkB, tento epitop je pak přístupný

-17CZ 297300 B6 pouze, když je NF-κΒ aktivován disociací IKB (47). Isotypová kontrolní mAb (Mopec 21, 22) byla získána od SIGMA™ (St. Louis, MO).

Imunohistochemická metoda

Zmrazené řezy byly promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnany (PBS) a endogenní peroxidáza se utlumila 0,5% peroxidem vodíku. Řezy byly blokovány 10% kozím sérem a agregovaným lidským Ig (80 mg/ml) v PBS, a poté byly jednu hodinu inkubovány s indikovanou primární mAb nebo odpovídající kontrolní mAb. Jako pozitivní kontroly pro určení optimálního ředění každé mAb byly použity zmrazené řezy tonzil s folikulární hyperpiazií. Primární mAb navázaná na cílový antigen byla spojena s biotinem značeným, izotypově specifickým kozím anti-myším IgGl, IgG2a, IgG3 nebo IgM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), který byl poté konjugován s komplexy avidin-biotin-peroxidáza (VECTOR ELITE KIT™, VECTOR™, Burlingham, CA). Peroxidázová aktivita se detekovala chromogenem (červeně) 3amino-9-etylkarbazolem (AEC, VECTOR™, Burlingham, CA) a řezy byly kontrastně nabarveny Mayerovým hematoxylinem (SIGMA™, St. Louis, MO).

Imunohistochemické vyšetření s dvojitým značením bylo použito pro identifikaci buněčných typů exprimujících CD40 a pro analýzu distribuce CD40 ve vztahu k ICAM-1, VCAM-1 nebo aktivovanému NF-κΒ v aterosklerotických lezích. Všechny řezy byly nejdříve imunologicky značeny mAb IgM anti-CD40. Sekundární Ab byl biotinylovaný kozí anti-myší IgM, který byl poté konjugován s komplexem avidin-biotin-peroxidáza. Chromogen použitý pro detekci výskytu mAb anti-CD40 IgM byl 3,3' diaminobenzidin (hnědý). Řezy byly poté důkladně promyty a inkubovány s druhou primární mAb, která označovala buď buněčně specifický markér pro buňky hladkého svalstva (SMA), nebo makrofágy (CD68), leukocytámí adhezivní molekuly (ICAM1, VCAM-1) nebo aktivovanou formu NF-κΒ. Všechny tyto druhé primární mAb byly isotypu buď IgGl, IgG2a nebo IgG3. Byla aplikována příslušná isotypově specifická biotinylovaná sekundární protilátka a konjugována s komplexem avidin-biotin-alkalická fosfatáza (VECTOR™, Burlingham, CA). Aktivita alkalické fosfatázy se prokazovala chromogenem Vector Red (VECTOR™, Burlingham, CA). Interferenci mezi postupně aplikovanými značícími postupy bylo zabráněno použitím různých imunoenzymatických technik (peroxidáza a alkalická fosfatáza) a izotypově specifickou sekundární Ab pro každý cílový antigen. Kromě toho byly připraveny dvojitě značené kontrolní řezy, ve kterých jedna ze dvou primárních mAb byla nahrazena isofypově souhlasnou kontrolní mAb.

Semikvantitativní analýza lézí

Rozsah aterosklerotických lézí byl kvantifikován v každém řezu stupněm zúžení vaskulámího lumina ve škále od 0 do 4, ve které 0 znamenala žádné zúžení, 1 méně než 25 %, 2 méně než 50 %, 3 méně než 90 % a 4 přes 90 % zúžení lumina. Každá léze koronární arterie byla také hodnocena na obsah intimálních makrofágů, buněk hladkého svalstva, pěnových buněk, endotelových buněk (neovaskularizace) (48) a T buněk, kdy 0 znamenala nepřítomnost příslušného buněčného typu, 1 ojedinělé izolované buňky, 2 malé soubory buněk, 3 výskyt ložiskových denzních agregátů a 4 denzní agregáty přítomné v celém plátu. Podobně byl ve škále od 0 do 4 hodnocen výskyt CD40, ICAM-1 a VCAM-1, kdy 0 znamenala nepřítomnost příslušné molekuly, 1 její výskyt na ojedinělých buňkách, 2 výskyt na méně než 50 %, 3 na méně než 90 % a 4 na více 90 % ze všech buněk (49). Protože exprese CD40L v pozitivních vzorcích byla omezena na izolované buňky, nebyl jeho výskyt přístupný kvantitativnímu hodnocení.

Statistická analýza

Rozdíly v histologickém hodnocení mezi skupinami vzorků byly analyzovány za použití neparametrického Kruskal-Wallisova testu. Závislost mezi proměnnými byla stanovena za použití Spearmanovy korelace.

-18CZ 297300 B6

Výsledky

Normální koronární arterie

Segmenty koronární arterie čtyř kontrolních pacientů nejevily žádné ztluštění intimy nebo zánět, jak bylo dokázáno barvením hematoxylinem a eosinem (obrázky 4A-4B). Specificky, makrofágy, buňky hladkého svalstva, pěnové buňky nebo lymfocyty nebyly v intimě přítomné a buňky nebyly imunoreaktivní ani s jednou mAb anti-CD40L použitou v této studii. Imunoreaktivita CD40 byla přítomna a ohraničena na endotelové buňky lemující cévní lumen kontrolních arterií (obr. 4B). Buňky kontrolních cév neexprimovaly VCAM-1 nebo aktivovaný NF-κΒ a ojedinělé vaskulární endotelové buňky slabě exprimovaly ICAM-1.

Histologie nativní CA a TCAD

U 7 z 10 pacientů s CA byly v segmentech koronární arterie nalezeny vystupující fibroateromatózní pláty s excentrickým zúžením, bezbuněčným centrem bohatým na lipidy, štěrbinami s cholesterolem a překrývajícím fibrózním krytem. Buněčnost leží byla největší v raménkových oblastech, které obsahovaly makrofágy a lymfocyty (obr. 5A). V intimálních lézích byly také roztroušené buňky hladkého svalstva, makrofágy, pěnové buňky a ložiska neovaskularizace. Pláty u 3 pacientů s mírnými, časnými vaskulámími lóžemi, byly excentrické, malé, bohaté na makrofágy, pěnové buňky a lymfocyty.

Léze koronárních arterií u 9 pacientů s TCAD projevovaly obvodové ztluštění intimy se značným zúžením lumina (viz tabulka 2).

Tabulka 2

Semikvantitativní vyhodnocení (škála 0-4) buněčného složení intimální léze u nativní koronární aterosklerózy (CA) a ischemické choroby srdeční po transplantaci srdce (TCAD) a imunoreaktivity pro CD40, ICAM-1 a VCAM-1. Hodnoty jsou vyjádřené jako průměr + standardní odchylka.

Intimální plát	Kontrola (n=4)	CA (n=10)	TCAD (n=9)
Tloušťka	0,3 ± 0,5	2,1 ±0,9*	3,1 ±0,8*
CD4+ lymfocyty	0	1,3 ± 0,9*	3,2 ±0,8*
CD8+ lymfocyty	0	0,3 ± 0,5	2,6± 1,1*
Makrofágy (CD68)	0,5 ± 0,6	2,1 ±0,8*	3,8 ± 0,4*
Pěnové buňky	0	1,2 ±0,8*	2,4 ± 1,3*
Buňky hladkého svalstva	0,8 ± 1	1,7 ±0,7	2,9 ± 0,8*
Neovaskularizace	0	1,8 ±0,7*	2,6 ± 0,9*
CD40	0,5 ± 0,6	2,2 ± 0,7*	3,3 ± 0,9*
ICAM-1	0,5 ± 0,6	2,3 ± 1,7*	3,6 ±0,7*
VCAM-1	0,3 ± 0,5	1,7 ±0,7*	2,9 ± 0,9*

* p 0,05 pro CA nebo TCAD proti kontrolám Kruskal-Wallisovým testem

Léze byly složeny z koncentrických vrstev buněk hladkého svalstva a mezibuněčné hmoty a byla zde nadměrná infiltrace makrofágů a lymfocytů spolu s oblastmi neovaskularizace. Ve 4 koronárních arteriích byly vedle koncentrických vrstev buněk hladkého svalstva rozpoznány ateromatózní léze bohaté na lipidy a pěnové buňky (obr. 6A-C). Charakteristickými rysy pozorovanými u lézí TCAD bylo také subendotelové nahromadění lymfocytů (endotelitida) a agregáty lymfocytů v adventicii.

-19CZ 297300 B6

Imunohistochemická analýza exprese CD40L u CA a TCAD

Značným rozdílem od normálních koronárních arterií, které jsou bez infiltruj ících lymfocytů nebo buněk exprimujících CD40L, je, že obě léze, CA i TCAD, obsahují buňky CD40L⁺. U nativní aterosklerózy bylo imunologické značení pozitivní na CD40L omezeno na menšinu lymfocytů intimy. Značení CD40L bylo obvykle slabé a pozorováno buď v malých cytoplazmatických granulích, nebo na povrchu buněk (obr. 7A-D). U nativní CA většina intimálních lymfocytů byly CD4⁺ T buňky, CD8⁺ T buňky byly přítomny pouze ojediněle (obr. 7A-D). Analýza sériových řezů označených s mAb anti-CD4 nebo anti-CD8 svědčí pro to, že CD40L⁺ lymfocyty byly primárně CD4⁺ T buňky. Endotelové buňky, buňky hladkého svalstva, makrofágy a pěnové buňky nereagovaly s žádnou mAb anti-CD40L použitou v této studii. U isotypových kontrolních mAb nebylo pozorováno žádné značení.

U lézí TCAD bylo pozitivní imunologické značení na CD40L také spojeno výlučně s lymfocyty (obr. 8A-C). Na rozdíl od CA, byly u lézí TCAD přítomné jak CD8⁺ tak CD4⁺ T buňky. Avšak CD8⁺ T buňky se nacházely převážně v subendotelových oblastech endotelitidy (obr. 8A-C), zatímco CD4⁺ T buňky byly lokalizovány v agregátech hlouběji v intimě přilehlé k vnitřní elastické membráně (obr. 8A-C) a adventicii koronárních arterií. Exprese CD40L korelovala prostorově s CD4⁺ T buňkami v intimě a adventicii koronárních arterií u TCAD. Počet CD40L⁺ T buněk byl vyšší u TCAD lézí než u nativních CA lézí. Podobně jako u CA, endotelové buňky, buňky hladkého svalstva, makrofágy nebo pěnové buňky u lézí TCAD nereagovaly s žádnou mAb anti-CD40L použitou v této studii (obr. 9A-B). Tato data naznačují, že CD40L exprimující buňky, pravděpodobně CD4⁺ T buňky, jsou přítomné v lézích nativní CA a TCAD.

Imunohistochemická analýza exprese CD40 u CA a TCAD

Na rozdíl od slabé exprese CD40 omezené na endotelové buňky lumina u normálních koronárních arterií (obr. 4A-B), CD40 imunoreaktivita byla aktivována a široce rozšířena v lézích nativní CA (obr. 5A-B). Exprese CD40 byla zaznamenána v endotelových buňkách, buňkách hladkého svalstva, makrofázích a pěnových buňkách. V intimálních lézích nativní CA byl významně vyšší průměrný počet CD40 pozitivních buněk než v kontrolních arteriích (2,2 + 0,7 proti 0,5 + 0,6, tabulka 2). Dvojí imunologické značení specifickými markéry pro makrofágy nebo buňky hladkého svalstva potvrdilo, že tyto buňky a pěnové buňky obou linií exprimují CD40 (obr. 10A-B). Je zajímavé, že CD40⁺ buňky hladkého svalstva byly přítomné v intimě blízko zánětlivých infiltrátů, zatímco buňky hladkého svalstva v médii arterií nevykazovaly pozitivní imuno-reaktivitu pro CD40 (obr. 10A-B). Analýza sériových řezů označených CD40 nebo endotelovým markérem CD34 svědčí pro to, že endotelové buňky lemující novotvořené cévy intimy a vasa vasorum adventicie byly také silně CD40⁺ (obr. 11A-D).

V arteriích pacientů s TCAD byl model distribuce exprese CD40 podobný jako u nativní CA. Avšak průměrné hodnocení CD40 imunoreaktivity bylo významně vyšší u TCAD než u nativní CA nebo kontrolních arterií (tabulka 2). Dvojité imunologické značení ukázalo, že buňky hladkého svalstva intimy a makrofágy exprimují CD40 (obr. 10A-B). Kromě toho pěnové buňky (obr. 6A-B) a endotelové buňky lemující vaskulámí lumen, novotvořené cévy intimy a vasa vasorum adventicie byly výrazně CD40⁺. Tato data společně dokazují, že endotelové buňky, buňky hladkého svalstva a makrofágy exprimují CD40 jak u nativní CA, tak u TCAD.

Vztah exprese CD40 a intercelulámím adhezivním molekulám a aktivaci NF-κΒ u lézí CA a TCAD.

Makrofágy a endotelové buňky u CA a TCAD exprimují intercelulámí adhezivní molekuly, které regulují vcestování leukocytů do lézí. Protože vazba CD40 vyvolává aktivaci intercelulárních adhezivních molekul a aktivaci NF-κΒ na buňkách in vitro, bylo otázkou, zda exprese CD40 byla spojena se společnou expresí intercelulárních adhezivních molekul nebo NF-κΒ u lézí CA nebo TCAD. Nejdříve bylo dokázáno u nativní CA, že endotelové buňky lumina projevují ložis

-20CZ 297300 B6 kové pozitivní imunologické značení na ICAM-1, s ojedinělými endotelovými buňkami exprimujícími VACM-1. Na rozdíl od toho, endotelové buňky lemující novotvořené cévy intimy &vasa vasorum adventicie byly na ICAM-1 a VCAM-1 silně pozitivní (obr. 11A-D). Buňky hladkého svalstva intimy, makrofágy a pěnové buňky byly také mírně až silně pozitivní na ICAM-1 a VCAM-1 (obr. 12A-C). Mezi hodnocením CD40 a hodnocením ICAM-1 (r = 0,85) a VCAM-1 (r - 0,72) byla významná korelace (p < 0,05). Počet lymfocytů intimy významně koreloval s hodnocením pro CD40 a leukocytámí adhezivní molekuly (viz tabulka 3).

Tabulka 3

Korelace hodnocení (0-4) pro různé buněčné typy intimálních lézí u CA (n=10) nebo TCAD (n=9) s hodnocením (0-4) pro expresi CD40 a adhezivních molekul (ICAM-1, VCAM-1). Hodnoty jsou vyjádřeny jako Spearmanův korelační koeficient (rozmezí -1 až 1, přičemž 0 je žádná korelace, a -1 nebo 1 dokonalá korelace).

Buněčný typ	Skupina	CD40	ICAM-1	VCAM-1
T lymfocyty (CD4+ a CD8+)	CA	0,78*	0,77*	0,83**
TCAD	0,79*	0,87**	0,77*
Makrofágy (CD68+)	CA	0,93***	0,84**	0,77*
TCAD	0,81**	0,68*	0,55
Pěnové buňky	CA	0,81**	0,68*	0,36
TCAD	0,44	0,33	0,26
Buňky hladkého svalstva (SMA+)	CA	0,72*	0,81**	0,56
TCAD	0,12	0,38	0,02
Novotvořené cévy (CD34+)	CA	0,69*	0,72*	0,53
TCAD	0,85**	0,87**	0,77*

*p < 0,05, **p <0,01 a ***p < 0,001 - hladina významnosti pro Spearmanovu korelaci.

Ze všech uvedených buněčných typů pouze hodnocení intimálních lymfocytů významně korelovalo s expresí CD40, a rozsah ICAM-1 a VCAM-1 v intimálních plátech jak u CA, tak u TCAD nasvědčoval tomu, že lymfocyty jsou zapojeny v indukci CD40 a adhezivních molekul u obou nemocí. Makrofágy a neovaskularizace také vykazovaly významnou korelaci s expresi CD40 u CA a TCAD.

Dvojité imunologické značení lézí CA s mAb anti-CD40 a anti-ICAM-1 nebo anti-VCAM-1 ukázalo, že CD40 byly lokalizovány společně s těmito adhezivními molekulami na mnoha buňkách (obr. 12A-C). Kromě toho, v jádrech neointimálních endotelových buněk, makrofázích a buňkách hladkého svalstva byl pozorován aktivovaný NF-κΒ (obr. 13) a dvojité imunologické značení prokázalo, že mnoho CD40⁺ buněk také exprimovalo aktivovaný NF-κΒ.

U TCAD bylo přítomné silně pozitivní imunologické značení na ICAM-1 a VCAM-1 v endotelových buňkách lumina, zejména v těch, které byly blízko ložiskům endotelitidy. Endotelové buňky intimálních novotvořených cév vosa vasorum adventicie byly silně imunoreaktivní na ICAM-1 a VCAM-1. Hodnocení imunologického značení adhezivních molekul u TCAD bylo vyšší než u CA nebo normálních koronárních arterii (tabulka 2). Byla významná korelace (p < 0,05) mezi hodnocením CD40 a hodnocením ICAM-1 (r - 0,82) a VCAM-1 (r = 0,89). Počet intimálních lymfocytů také koreloval významně s expresi CD40, ICAM-1 a VCAM-1 (tabulka 3). Podobně jako u CA, dvoubarevné imunohistochemické studie dokázaly, že mnoho CD40⁺ buněk u leží TCAD exprimuje společně ICAM-1 nebo VCAM-1 (obr. 12A-C). Imunologické značení na aktivovanou jadernou formu NF-κΒ bylo šířeji rozprostřeno u TCAD než u nativní CA. NF-κΒ pozitivní makrofágy a buňky hladkého svalstva byly shodně CD40⁺

-21 CZ 297300 B6 (obr. 13). Tyto studie společně dokazují, že v lezích jak nativní CA, tak TCAD, je CD40 společně exprimován na mnoha buňkách s intercelulámími adhezivními molekulami a/nebo NF-kB.

Diskuse

Nativní ateroskleróza (CA) a ateroskleróza po transplantaci (TCAD) jsou zánětlivé nemoci zprostředkované složitými interakcemi mezi aktivovanými T buňkami, endotelovými buňkami, makrofágy a buňkami hladkého svalstva (2, 8, 12, 13, 17). Má se za to, že T buňky hrají roli v patogenezi CA a TCAD, ale mechanismus, kterým se zapojují do těchto procesů, není plně znám (5, 9, 50). Studie ukázaly, že CD40L, povrchová molekula CD4⁺ T buňky indukovaná aktivací, přináší aktivační signály závislé na kontaktu k endotelovým buňkám a makrofágům exprimujícím CD40, což má za následek tvorbu prozánětlivých molekul, jako jsou intercelulámí adhezivní molekuly ICAM-1 a VCAM-1 (31, 32, 35-37) a aktivaci transkripčního aktivačního faktoru NF-kB (43-45, in vitro). Je zajímavé, že TCAD na myších modelech je alespoň částečně závislá na interakcích CD40L-CD40 (51). Ve studii Larsona a kolegů léčba mAb anti-CD40L výrazně inhibovala rejekci alogenního heterotopického transplantátu a částečně blokovala přidruženou vaskulopatii. Kromě toho, TCAD u tohoto modelu bylo téměř kompletně zabráněno podáváním kombinace mAb anti-CD40L a fúzního proteinu CTLA4-Ig, molekuly, která blokuje společné stimulující dráhy T buňky (51). Je možné, že interakce CD40L-CD40 se mohou podílet v patogeneze CA a/nebo TCAD u lidí.

Pro další zkoumání této hypotézy byly na normální a aterosklerotické koronární arterie použity další imuno-histochemické techniky, aby bylo možné studovat expresi a buněčnou distribuci CD40L a CD40. Normální koronární arterie neobsahují buňky exprimující CD40L a CD40 imunoreaktivita byla u těchto cév omezena na endotelové buňky lumina. Na rozdíl od toho, CD40L je exprimován na lymfocytech v lézích jak nativní CA, tak TCAD. Bylo nalezeno, že léze CA obsahovaly málo CD8⁺ T buněk, zatímco léze TCAD obsahovaly CD8⁺ T buňky v těsné blízkosti endotelu lumina (endotelitis) a CD4⁺ T buňky hlouběji v intimě a adventicii. Na základě lokalizace a značení sériových řezů mAb anti-CD4 nebo anti-CD8 bylo uzavřeno, že lymfocyty CD40L⁺ jsou nej pravděpodobněji CD4⁺ T buňky v lézích u obou nemocí. Za použití dvou odlišných mAb anti-CD40L bylo zjištěno, že CD40L imunoreaktivita byla slabá a nebyla spojená ani s granuly či cytoplazmou nebo buněčným povrchem. Podobný model CD40L imunoreaktivity byl pozorován ve studii exprese CD40L a CD40 u glomerulonefritidy (46). To, že je model značení exprese CD40 v zánětlivých tkáních slabý a často cytoplazmatický, se může vztahovat k přechodné povaze exprese CD40 na aktivovaných T buňkách (27-29) a faktu, že obsazení CD40 na cílových buňkách vyvolává rychlé utlumení CD40L endocytózou zprostředkovanou receptorem (52) a opadáváním receptorů (53). Tyto regulační mechanismy pravděpodobně slouží k zaměření signálů zprostředkovaných CD40L na příslušné rozpoznávané cílové buňky.

Bylo zjištěno, že exprese CD40 byla výrazně aktivována na mnoha buňkách v lézích u obou nemocí. Makrofágy a pěnové buňky exprimující CD40 byly obzvláště nápadné v zánětlivém infiltrátu raménkových oblastí plátů bohatých na lipidy, o nichž je známo, že obsahují denzní zánětlivé infíltráty (54, 55). Exprese CD40 byla také aktivována na endotelových buňkách lumina u obou nemocí, což bylo nápadné zejména u TCAD. Endotelové buňky novotvořených cév intimy a vasa vasorum adventicie byly u obou nemocí silně CD40⁺. Buňky hladkého svalstva exprimující CD40 se vyskytovaly v intimě obou CA a TCAD, obvykle v těsné blízkosti zánětlivých infiltrátu. Je zajímavé, že buňky hladkého svalstva v médii stejných cév byly hodnoceny jako CD40-. IFN-γ vyvolával expresi CD40 na mnoha buňkách in vitro (33, 35-37, 56) včetně buněk hladkého svalstva, a tento účinek je zesílen cytokiny, jako je IL-Ιβ a TNF-a (36). Proto výrazná aktivace CD40 exprese na mnoha buněčných typech u těchto lézí může být následek uvolnění cytokinů T buňkami, makrofágy a dalšími buňkami léze. Dvojité imunologické značení ukázalo, že mnoho CD40⁺ buněk také současně exprimuje intercelulámí adhezivní molekuly ICAM-1 a VCAM-1, a také aktivovanou formu NF-κΒ. Současná studie zároveň dokazuje přítomnost CD40L⁺ T buněk a aktivovaných CD40⁺ cílových buněk ve vaskulámích lézích nativní CA a TCAD.

-22CZ 297300 B6

Dřívější studie ukázaly, že CD40 byl exprímován na některých nádorech epitelových buněk a B buňkách (57, 58). Nověji bylo zaznamenáno, že CD40 je konstitutivně exprímován nebo indukovatelný na mnoha buněčných typech in vitro (33-37, 56). Dále je stále více zřejmé, že interakce CD40L-CD40 mají klíčovou úlohu v zánětlivých reakcích zprostředkovaných buňkami in vivo (31, 32). V tomto ohledu současné publikace demonstrují in šitu CD40L a/nebo CD40 expresi u lidských zánětlivých nemocí (35, 46, 59). Například exprese CD40 je aktivována na makrofázích infiltrujících mozky pacientů se sclerosis multiplex (59), na kožních endotelových buňkách a keratinocytech u psoriázy (35), a na mnoha buňkách v ledvinách pacientů se zánětlivými glomerulonefritidami (46). Mimoto zánětlivé infíltráty v mozcích pacientů se sclerosis multiplex (59) a v ledvinách pacientů se zánětlivými glomerulonefritidami (46) obsahují CD40L⁺ T buňky. Je proto pravděpodobné, že exprese CD40 je aktivována u mnoha zánětlivých nemocí a představuje molekulární mechanismus, který umožňuje T buňkám přenášet prozánětlivé signály k celé řadě cílových buněk. Z tohoto zřetele nálezy zde prezentované, že exprese CD40 je aktivována u CA a TCAD, a že CD40L⁺ infíltrující T buňky jsou nalézány v lézích, slouží jako důkaz hypotézy, že imunitně zprostředkované zánětlivé reakce hrají roli v patogenezi těchto nemocí (57, 9, 18,21,23,50).

Pozorování týkající se CD40L zprostředkované aktivace endotelových buněk a makrofágů in vitro a studie interakcí CD40L-CD40 v patogenezi TCAD na myších modelech, svědčí pro možnou patogenní úlohu interakcí CD40L-CD40 u CA a TCAD. Například CD40L zprostředkované signály aktivují expresi ICAM-1 a VCAM-1 na endotelových buňkách, in vitro (35-37). Tyto intercelulární adhezivní molekuly, které regulují odchod a retenci leukocytů na zánětlivých místech, jsou aktivovány na endotelových buňkách u CA a TCAD a jsou významné zejména na endotelových buňkách novotvořených cév intimy a vasa vasorum (49, 60). Proto je zajímavé, že v lézích CA a TCAD bylo nalezeno mnoho CD40⁺ buněk, a zejména endotelových buněk intimy a vasa vasorum, které exprimují současně ICAM-1 a/nebo VCAM-1. Je známo, že aktivace ICAM-1 a VCAM-1 je závislá na aktivaci NF-kB (61). V předkládané studii bylo také dokázáno, že CD40⁺ intimální makrofágy, buňky hladkého svalstva a endotelové buňky exprimují aktivovanou formu NF-κΒ. Tyto studie svědčí pro to, že CD40L⁺ CD4⁺ T buňky mohou vyvolat aktivaci intercelulárních adhezivních molekul na CD40⁺ cílových buňkách u CA a TCAD, částečně možná aktivací NF-kB.

Signály zprostředkované CD40L také vyvolávají u endotelových buněk sekreci IL-6 a IL-8 (62) a podněcují prokoagulační povrch aktivací tkáňového faktoru a utlumením exprese trombomodulinu. S ohledem na makrofágy, interakce CD40L-CD40 vyvolávají u těchto buněk sekreci prozánětlivých cytokinů (IL-la, IL-Ιβ, IL-6 TNF-α), chemokinů, metaloproteináz mezibuněčné hmoty a exprimují tkáňový faktor in vitro (33, 34, 38, 41, 42). Všechny tyto prozánětlivé molekuly mají pravděpodobně úlohu v patogenezi CA a TCAD (10, 17, 63-66). Vazba CD40 na makrofágy také vyvolává tvorbu NO (39, 40). Je zajímavé, že blokování interakci CD40L-CD40 u myších modelů TCAD je spojeno s utlumením exprese iNOS a redukcí TCAD lézí (51). Bylo dokázáno, že iNOS je exprímován v lézích CA (67, 68), rejekci srdečního aloštěpu (69, 70) a TCAD (71, 72). Signály zprostředkované CD40L mohou být zapojeny v podpoře tvorby jakékoliv z těchto molekul u CA nebo TCAD. Interakce CD40L-CD40 mají jasně prozánětlivé účinky u myších modelů TCAD (51), a také u artritidy indukované kolagenem (73), glomerulonefritidy podobné lupoidní glomerulonefritidě (74) a experimentální alergické encefalomyelitidy (59).

Zkoumala se také exprese CD40L a CD40 (62) u aterosklerózy karotid u lidí. Bylo zjištěno, že CD40 byl v lézích aktivován a měl rozsáhlou buněčnou distribuci. Bylo publikováno, že CD40L je široce exprímován na buňkách hladkého svalstva, endotelových buňkách a makrofázích u aterosklerotických lézí, zatímco v předkládané studii za použití dvou různých mAb anti-CD40L, byla exprese CD40L omezena na T buňky. U žádné nemoci nebyla pozorována in šitu exprese CD40L na makrofázích, endotelových buňkách nebo buňkách hladkého svalstva. Podobně bylo také zjištěno, že CD40L imunoreaktivita je omezena na T buňky u jiných zánětlivých nemocí, včetně glomerulonefritidy (46), revmatoidní artritidy a chronické sinusitidy. Navíc Gerritse et al.

-23 CZ 297300 B6 publikovali, že exprese CD40L byla omezena na CD4⁺ T buňky v ložiscích u scierosis multiplex (59). Nesrovnalosti mezi výsledky zde uvedenými a výsledky Macha a kolegů jsou v současné době nejasné, ale mohou se týkat jemných odchylek v imunohistochemických technikách nebo v povaze lézí.

Seznam citované literatury

References

1. Nilsson, J. 1993. Transplant Proč. 25:2 063-2 064.

2. Munro, J , and R. Cotran. 1988. Lab Invest. 58:249-261.

3. Cramer, D., et al. 1992. J Heart Lung Transplant. 11:458-466.

4. Billingham, M. 1992. J Heart Lung Transplant. 11 :S38-S44.

5. Zhou, X., et al. 1996. Am J Pathol. 149:359-366.

6. Wick, G., et al. 1995. Immunol. Today. 16:27-33.

7. Stemme, S., et al. 1992. Arteriosclerosis and Thrombo. 12:206-211.

8. Ross, R. 1993. Nátuře. 362:801-809.

9. Lichtman, A., et al. 1996. Am J Pathol. 149:351-357.

10. Kishikawa, H., et al. 1993. Virchows Arch. 423:433-442.

11. Krensky, A. 1994. Kidney Int. 45:50S-56S.

12. Salomon, R., et al. 1991. Am J Pathol. 138:791-798.

13. Shi, C., et al. 1996. Proč Nati Acad Sci, USA. 93:4 051^1 056.

14. Jonasson, L., et al. 1985. J Clin Invest. 76:125-131.

15. Russell, P. S., et al. 1994. Am. J. Pathol. 25 144:260-274.

16. Moyer, C., et al. 1992. J Pathol. 138:951-960.

17. Libby, P., and Z. Gallis. 1995. Ann NY Acad Sci. 748:158-168.

18. Stemme, S., et al. 1995. Proč Nati Acad Sci, USA. 30 92:3 893-3 897.

19. Witztum, J., and D. Steinberg. 1991. J Clin Invest. 88:1 785-1 792.

20. de Lorgeril, M., et al. 1993. Am Heart J. 125:974-980.

21. Emeson, E., et al. 1996. Am J Pathol. 149:675-685.

22. Russell, P., et al. 1994. Transplantation. 57:1 367-1 371.

23. Russell, M„ et al. 1996. J Clin Invest. 97:833-838.

24. Hancock, W„ et al. 1996. Proč Nati Acad Sci. 93:13 967-13 972.

25. Graf, D., et al. 1992. Eur J Immunol. 22:3191-3194.

26. Armitage, R. J., et al. 1992. Nátuře. 357 (6373):80-2.

27. Lané, P., et al. 1992. Eur J Immunol. 22:2 573-2 578.

28. Lederman, S., et al. 1992. J Exp Med. 175 (4): 1 091-101.

29. Noelle, R. et al. 1992. Proč Nati Acad Sci USA. 89:6 550-6 554.

30. Banchereau, J., et al. 1994. Annu. Rev. Immunol. 12:881-922.

31. Noelle, R. 1996. Immunity. 4:415-419.

32. Stout, R., and J. Suttles. 1996. Immunol Today. 17:487-492.

33. Alderson, M. R., et al. 1993. J Exp Med. 178 (2) :669-74.

34. Caux, C., et al. 1994. J. Exp. Med. 180:1 263-1 272.

35. Hollenbaugh, D., et al. 1995. J. Exp. Med. 182:33 40.

-24CZ 297300 B6

36. Karmann, K., et al. 1995. Proč Nati Acad Sci, USA. 92 :4 342-4 346.

37. Yellin, M. J., et al. 1995. J. Exp. Med. 182:1 857-1 864.

38. Kiener, P., et al. 1995. J Immunol. 155:4 917-4 925.

39. Stout, R., et al. 1996. J Immunol. 156:8-11.

40. Tian, L., et al. 1995. Eur J Immunol. 25:306-309.

41. Pradier, O., et al, 1996. Eur J Immunol. 26:3 048-3 054.

42. Malik, N., et al. 1996. J Immunol. 156:3 952-3 960.

43. Berberich, I., et al. 1994. J Immunol. 153:4 357-4 366.

44. Hess, S., et al. 1995. J Immunol. 155:4 588 4 595.

45. Karmann, K., et al. 1996. J Exp Med. 184:173-182.

46. Yellin, M., et al. 1997. Arthritis Rheum. 40:124-134.

47. Brand, K., et al. 1996. J Clin Invest. 97:1 715-1 722.

48. Kuamamoto, M., et al. 1995. Human Path. 26:450—456.

49. O'Brien, K., et al. 1996. Circulation. 93: 672-682.

50. Haraoka, S., et al. 1995. Virchows Arch. 426:307-315.

51. Larsen, C., et al. 1996. Nátuře. 381:434-438.

52. Yellin, M. J„ et al. 1994. J Immunol. 152 (2):598-608.

53. Graf, D., et al. 1995. Eur J Immunol. 25:1 749-1 754.

54. Bjoerkerud, S., and B. Bjoerkerud. 1996. Am J Pathol. 149:367-380.

55. van der Wal, A., et al. 1994. Circulation. 89:36-44.

56. Yellin, M. J., et al. 1995. J. Leuk. Biol. 58:209-216.

57. Pauli, S., et al. 1985. Cancer Immunol. Immunother. 20:23-28.

58. Clark, E. A., and J. A. Ledbetter. 1986. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 83:4 494-4 498.

59. Gerritse, K.. et al. 1996. Proč. Nati. Acad. Sci. 93:2 499-2 504.

60. Davies, M., et al. 1993. J Pathol. 171:223-229.

61. Collins, T., et al. 1995. FASEB J. 9:899-909.

62. Mach, F., et al. 1997. Proč Nati Acad Sci, USA. 94:1 931-1 936.

63. Berliner, J., et al. 1995. Circulation. 91:2 488-2 496.

64. Libby, P., et al. 1995. J Cardiovasc Pharm. 25 Suppl 2:S9-12.

65. Li, Z., et al. 1996. Am J Path. 148:121-128.

66. Galis, Z., et al. 1994. J Clin Invest. 94:2 493-2 503.

67. Buttery, L., et al. 1996. Lab. Invest. 75:77-85.

68. Aji, W., et al. 1997. Circulation. 95:430-437.

69. Yang, X., et al. 1994. J Clin Invest. 94:714-721.

70. Worrall, N., et al. 1995. J Exp Med. 181:63-70.

71. Russell, M., et al. 1995. Circulation. 92:457-464.

72. Akyurek, L., et al. 1996. Am J Pathol. 149:1 891-1 990.

73. Durie, F. H., et al. 1993. Science. 261:1 328-1 330.

74. Mohan, C., et al. 1995. J Immunol. 154:1 470-1 480.

-25 CZ 297300 B6

Seznam sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 146 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) Typ Molekuly: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

Gly

Asp

Gin

Asn

Gin Zle

Ala

&

His 10

Val

• ' β

Set

- GT

li Ala Ser 15

Ser

Lys

TU

V- 20

Ser

Val Leu

Gin

**>*»<>* 25*

- Ala

G.ll

: Lvs

; Gly Ty 3 0

r Ty

r Thr

Men

Ser

Asn 3 5

Asn

Leu

Val Thr

Leu 4 0

Glu

Asn

Gly

Lys

Gin 45

Leu

tHit

Vál

Lvs

Arg 5 0

Gin

Gly

Leu

Tyr Tyr 5.5

Zle

Tyr

* > cl

Gin

Val 6 0

Thr

Phe

Cvs

Ser

Asn £5

Arg

Glu

Ala

Ser

Ser Gin 70

Ala

Pro

Phe

Ile 75

AJ. <a

Ser

Leu

Cys

Leu 6 0

Lys

Ser

Pro

Gly

Arg es

Phe Glu

Arg

Zle

Leu SO

Leu

Arg

Ala

Ala

Asn 35

Thr

His

Ser

Ser

Ala 100

Lys

Pro Cys

Gly

Gin 105

Gin :

Ser

Zle

His

Leu 11 c

Gly

Gly

Val

Pne

Glu 115

Leu

Gin

Pro Gly

* 1 — A-LŮ 120

Ser

val

Phe

V čL —

Asn 125

Val

•Tílr

Asp

Pro

Ser

Gin

Val

Ser

His Gly

Thr

Gly

Phe

Thr

Ser

Phe

Gly

Leu

Leu

130 135 140

Lvs Leu

145

-26CZ 297300 B6

Claims (10)

1. Použití protilátky nebo části protilátky, která specificky inhibuje vazbu ligandu CD40 na CD40 na povrchu buněk hladkého svalstva, a která se váže na antigen, který váže monoklonální protilátka 5c8, produkovaná hybridomem ATCC č. HB10 916, pro přípravu léčiva k léčení nemoci závislé na buňkách hladkého svalstva vybrané ze skupiny sestávající z nemoci gastrointestinálního traktu, nemocí močového měchýře a cévních nemocí, přičemž léčivo je formulováno pro podávání v dávkách od 0,01 do 200 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.

2. Použití podle nároku 1, kde léčivo je formulováno pro podávání v dávkách od 0,01 do 50 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.

3. Použití podle nároku 1, kde léčivo je formulováno pro podávání v dávkách od 0,01 do 30 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.

4. Použití podle nároku 1, kde buňky hladkého svalstva jsou vybrány ze skupiny sestávající z buněk hladkého svalstva močového měchýře, buněk hladkého svalstva cév, buněk hladkého svalstva aorty, buněk hladkého svalstva koronárních cév, buňky hladkého svalstva pulmonálních cév a buňky hladkého svalstva gastro-intestinálního traktu.

5. Použití podle nároku 4, kde buňky hladkého svalstva jsou vybrány ze skupiny sestávající z buněk hladkého svalstva jícnu, buněk hladkého svalstva žaludku, buněk hladkého svalstva tenkého střeva a buněk hladkého svalstva tlustého střeva.

6. Použití podle nároku 1, kde nemoc gastro-intestinálního traktu je vybrána ze skupiny sestávající ze zánětlivé střevní nemoci, dysmotility jícnu a sklerodermie.

7. Použití podle nároku 1, kde protilátka je vybrána ze skupiny sestávající z monoklonálních protilátek, polyklonálních protilátek, chimérických protilátek, humanizovaných protilátek, primatizovaných protilátek a protilátek obsahujících oblast CDR jednoho člověka a kostru protilátky jiného člověka.

8. Použití podle nároku 1, kde část protilátky je vybrána ze skupiny sestávající z úseku CDR, úseku CDR lehkého řetězce nebo úseku CDR těžkého řetězce, variabilního úseku, Fab a jednořetězcové protilátky.

9. Použití podle nároku 7 nebo 8, kde se monoklonální protilátka váže na epitop, na který se specificky váže monoklonální protilátka 5c8, produkovaná hybridomem ATCC č. HB10 916.

10. Použití podle nároku 7 nebo 8, kde monoklonální protilátka je monoklonální protilátka 5c8 produkovaná hybridomem ATCC č. HB 10 916.