CZ300364B6 - Farmaceutický prípravek obsahující polypeptid BCMA nebo protilátku proti tomuto polypeptidu - Google Patents

Farmaceutický prípravek obsahující polypeptid BCMA nebo protilátku proti tomuto polypeptidu Download PDF

Info

Publication number
CZ300364B6
CZ300364B6 CZ20020579A CZ2002579A CZ300364B6 CZ 300364 B6 CZ300364 B6 CZ 300364B6 CZ 20020579 A CZ20020579 A CZ 20020579A CZ 2002579 A CZ2002579 A CZ 2002579A CZ 300364 B6 CZ300364 B6 CZ 300364B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
baff
cells
amino acid
polypeptide
mice
Prior art date
Application number
CZ20020579A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2002579A3 (cs
Inventor
Mackay@Fabienne
Browning@Jeffrey
Ambrose@Christine
Tschopp@Jurg
Schneider@Pascal
Thompson@Jeffrey
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Apotech R & D S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27386828&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ300364(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., Apotech R & D S. A. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ2002579A3 publication Critical patent/CZ2002579A3/cs
Publication of CZ300364B6 publication Critical patent/CZ300364B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

Rešení se týká polypeptidu BCMA, receptoru BAFF (faktor aktivující B lymfocyty patrící do rodiny nádorového nekrotického faktoru, TNF) nebo protilátky proti tomuto polypeptidu. Polypeptid nebo protilátka se užívají jako lécivo, zejména pro lécení autoimunitních poruch, lymfoproliferativních poruch B lymfocytu nebo zánetu u savcu.

Description

Farmaceutický přípravek obsahující polypeptid BCMA nebo protilátku proti tomuto polypeptidu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká polypeptidu BAFF-R, receptoru k BAFF (faktor aktivující B lymfocyty patřící do rodiny nádorového nekrotického faktoru (TNF)), a činidel blokujících tento receptor, pro použití ke stimulaci nebo inhibici exprese B lymfocytů imunoglobulinů. Tento receptor má protinádorové imunoregulační využití a také využití k léčení imunosupresivních onemocnění jako je např. HIV.,Kromě toho tento receptor, jeho blokující činidla hrají roli při rozvoji hypertenze příbuzných nemocí. Navíc buňky transfekované genem pro tento receptor mohou být využity při léčení nemocí jako jsou nádory, lymfomy, autoimunitní onemocnění nebo dědičné choroby související s B lymfocyty. Blokující činidla, jako jsou např. rekombinantní varianty nebo protilátky specifické k receptoru, mají také využití pro imunoregulaci. Použití receptor pro BAFF jakožto stimulátoru B lymfocytů při léčení nemocí s potlačenou imunitou se týká také použití u pacientů, kteří prodělali orgánovou transplantaci (např. transplantaci kostní dřeně) také použití ke stimulaci tvorby B lymfocytů u pacientů zotavujících se po léčení rakoviny. Také se týká použití receptoru pro BAFF jako adjuvans a/nebo kostimulátořu pro zvýšení nebo obnovu hladiny B lymfocytů ná přibližně normální úroveň. Rozpustné formy receptoru pro BAFF, které blokují funkci B lymfocytů, mohou být také využity k inhibici nemocí zprostředkovaných B lymfocyty.
Dosavadní stav techniky
Předkládaný vynález se týká nového receptoru z rodiny TNF, který byl označen BAFF-R (nebo „BCMA“).
Rodina TNF se skládá z dvojic ligandů jejich specifických receptorů, které bývají označovány jako ligandy rodiny TNF receptory rodiny TNF (Bazzoni Beutler, 1996, Aggarwal Natarajan, 1996). Tato rodina se podílí na regulaci imunitního systému možná u jiných „neimunitních“ systémů. Jde často o regulaci typu „hlavního přepínače“, kdy signalizace typu TNF může vést k mnoha různým následným událostem, jejichž typickým příkladem je právě TNF. TNF může např. iniciovat obecnou obrannou zánětlivou reakci organismu v reakci na cizorodou látku, která zahrnuje pozměněnou prezentaci adhezivních molekul zúčastněných v „cell trafficking“, produkci chemokinů, které směřují specifické buňky do specifických kompartmentů, ve specifickém instruování („priming“) různých efektorových buněk. Tudíž regulace těchto metabolických drah má jistě i klinický potenciál.
Má se za to, že indukce různých typů buněčných odpovědí zprostředkovaných cytokiny z rodiny TNF je iniciována jejich navázáním na specifické buněčné receptory. Byly identifikovány přinejmenším dva odlišné TNF receptory velikosti přibližně 55 kDa (TNFR1) 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 (1989), Brockhaus et al., PNAS, 87: 31273131 (1990)]. Sgeny pro oba receptory TNF je spojen významný polymorfismus. Oba TNFR sdílejí typickou strukturu receptor na buněčném povrchu, tj. obsahují extracelulární, transmembránovou intracelulámí doménu. Extracelulární část TNFR typu 1 i 2 obsahuje repetitivní profil aminokyselinových sekvencí čtyřech domén bohatých na cystein (CDR), Podobný repetitivní profil CDR se vyskytuje i u několika jiných proteinů na buněčném povrchu jako je např. receptor nervového růstového faktoru p75 nebo antigen CD-40 B lymfocytů. TNF receptory jsou významnými nástroji k vyhledávání metabolických signalizačních drah, neboť mohou být snadno upraveny na imunoglobulínové fúzní proteiny, které mají dlouhý poločas v séru. Dimerní rozpustné formy mohou být inhibitory událostí zprostředkovaných jak přirozenými secernovanými nebo povrchově vázanými ligandy. Tyto fúzní proteiny, tím, že se naváží na ligandy, zabrání ligandům v interakci s receptory asociovanými s buňkami, tím inhibují navazující signalizaci.
Tyto fúzní proteiny receptor-Ig jsou užitečné nejen z experimentálního hlediska, ale byly úspěš- 1 CZ 300364 B6 ně využity i klinicky, tak např. TNF-R-Ig byl úspěšně užit k léčení zánětlivé nemoci střev, revmatoidní artritidy nebo akutního klinického syndromu, který doprovází podávání OKT3 (Eason et al., 1996, Feldman et al., 1997, dan Dullemen et al., 1995), Lze očekávat, že cílené ovlivnění mnoha událostí zprostředkovaných signalizací za účasti receptoru TNF rodiny by se mohlo využít při léčení poruch imunity také mnoha nemocí, které mají patologické následky zahrnující imunitní systém. Tak např. rozpustná forma v současnosti popsaného receptoru, osteoprotegerinu, blokuje ztráty kostní hmoty, takže je vidět, že události řízené signalizací zahrnující receptory TNF rodiny se neomezují jen na regulaci imunitního systému. Protilátky k receptorům mohou blokovat vazbu ligandů tudíž mít také klinické využití. Takové protilátky mají často velmi io dlouhou životnost jsou tudíž výhodnější než rozpustné fúzní proteiny receptor-íg, které mají v krvi kratší poločas.
I když inhibice receptorem zprostředkované metabolieké dráhy představuje nyní nej užívanější terapeutickou aplikaci receptoru, byla to původně aktivace TNF receptoru, která se jevila jako klinicky slibná (Aggarwal Natarajan, 1996). Aktivace TNF receptorů může iniciovat buněčnou smrt cílových buněk tudíž aplikace u nádorů byla stále je atraktivní (Eggermont et al., 1996). Receptor může být aktivován buďto podání ligandů, tj. využitím přirozené cesty, nebo podáním protilátek, které se naváží (zesíténím) na receptor. Protilátky mohou být výhodné např. při léčení rakoviny, neboť mohou přežívat v křvi delší dobu na rozdíl od ligandů, které mají v krvi zpra20 vidla kratší životnost. Agonistické protilátky jsou užitečné přípravky k léčení rakoviny, neboť receptory mohou být exprimovány v nádorech selektivněji, nebo mohou signalizovat pouze buněčnou smrt nebo diferenciaci u nádorových buněk. Podobně mnohé pozitivní imunologické události jsou zprostředkovány receptory rodiny TNF, např. zánětlivá reakce hostitele, tvorba protilátek apod., tudíž agonistické protilátky mohou být užitečné i v jiných než onkologických aplikacích.
Paradoxně i inhibice metabolické/signální dráhy může být klinicky prospěšná při léčení nádorů. Tak např. ligand Fas je exprimován v některých nádorech tato exprese vede k odumření Faspozitivních lymfocytů, což umožňuje, že nádor se vyhne imunitnímu systému. V takovém případě by inhibice systému Fas dovolila, aby imunitní systém reagoval na nádor jiným způsobem (Green Ware, 1997).
Podstata vynálezu
Původci identifikovali klon cDNA kódující polypeptid, označovaný v předkládané přihlášce „BAFF-R“ nebo „BCMA“, který váže nádorový nekrotický faktor BAFF, cožje faktor patřící do rodiny TNF aktivující B lymfocyty. BAFF je molekula shodná s molekulou již dříve popsanou v dokumentu WO/9912964, který je celý zahrnut formou odkazu.
V jednom provedení se vynález týká BAFF-R pro použití k léčení. Sem patří použití k inhibiei růstu B lymfocytů, růstu zrání B lymfocytů indukovaného dendrítickými buňkami, produkce imunoglobulinů u zvířat. Dále sem patří také použití ke stimulaci růstu B lymfocytů, k růstu zrání B lymfocytů indukovaného dendrítickými buňkami, produkce imunoglobulinů u zvířat, nebo spo45 léčně s anti-T protilátkou, CD40 ligandem nebo anti-CD40 ligandem ke kostimulaci růstu B lymfocytů, k růstu zrání B lymfocytů indukovaného dendrítickými buňkami, produkce imunoglobulinů u zvířat.
V jiném provedení vynález poskytuje BAFF-R pro použití k léčení auto imunitních onemocnění, hypertenze, kardiovaskulárních nemocí, renálních poruch, lymfoproliferativních onemocnění B lymfocytů, imunosupresivních onemocnění, orgánových transplantací HIV. Vynález se také týká použití činidel k léčení, potlačení nebo změně imunitní reakce, která zahrnuje signální dráhu mezi BAFF-R jeho ligandem, inhibice zánětů užitím protilátek specifických pro BAFF-R nebo jeho epitop.
-2CZ 300364 B6
Při léčebném využití vynálezu se podává terapeuticky účinné množství polypeptidu BAFF-R, chimérické molekuly obsahující potypeptid BAFF-R fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí nebo homolog protilátky anti-BAFF-R.
Jiné provedení vynálezu se týká farmaceutického přípravku, který obsahuje polypeptid BAFF-R a farmaceuticky přijatelný excipient.
Další provedení vynálezu poskytuje chimérickou molekulu, která obsahuje polypeptid BAFF-R fúzovaný s heterologním polypeptidem nebo aminokyselinovou sekvencí. Příkladem takové chimérické molekuly je molekula obsahující BAFF-R fúzovaný s úsekem Fc imunoglobulinu nebo se sekvencí značícího (tag) epitopu.
Ještě další provedení vynálezu poskytuje protilátku, která se specificky váže na polypeptid BAFF-R. Tato protilátka je případně monoklonální protilátka.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek ! ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKVENCE ID. Č, 2) cDNA humánního
BAFF-R (BCMA) zní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEKVENCE ID. Č. 1). Potenciální počátek translace je buďto nukleotid 219, nebo 228; doména bohatá na cystein (CRD) zahrnuje nukleotidy 240 až 341 ze SEKVENCE ÍD. Č. 2 (aminokyselinové zbytky 8-41 SEKVENCE ID. Č. 1); potenciální transmembránový úsek představují nukleotidy 375 až 459 SEKVENCE ID. Č. 2.
Obrázek 2 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKVENCE ID. Č. 4) z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEKVENCE ID. Č. 3) pJST538, plazmid kódující BAFF-R-Fc: nukleotidy 1-69, myší IgG-kappa signální sekvence; nukleotidy 70-222, BAFF-R (nukleotidy 1 až 153); nukleotidy 223 až 906; humánní IgG.
Obrázek 3 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny plazmidu pJST535, kódujícího úplný humánní BAFF-R odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
Obrázek 4 ukazuje strukturní srovnání mezi TNF-R55 a BAFF-R.
Obrázek 5 ukazuje buňky 293EBNA transfekované buďto (a) CH269 (1,0 pg) nebo (b) pJST535 (0,1 pg), plazmidem exprimujícím úplný BAFF-R, a obarvené 0,5 pg/ml flag-hBAFF v testu na mikrodestičče.
Obrázek 6(a) ukazuje FACS pokrytí buněk 293EBNA transfekovaných pJST535 a obarvených následovně: bez ligandu (černý histogram), 1 pg/ml flag-hCD40L (růžový) nebo flaghBAFF (zelený). Všechny vzorky pak byly barveny pomocí anti-flag M2 následované oslím anti-myším IgG jak je popsáno v příkladu 2.
Obrázek 6(b) ukazuje FACS histogramy se statistickými daty z téhož experimentu. Barvení bylo následující: (1) nebarveno, (2) jen 7AAD, (3) 2. Krok a jen 7AAD, (4) 9 pg/ml flag-hBAFF, (5) 3 pg/ml flag-hBAFF, (6) 1 pg/ml flag-hBAFF, (7) 0,33 pg/ml flag-hBAFF, (8) 0,11 pg/ml flaghBAFF, (9) flag-hCD40L 1 pg/ml.
Obrázek 7 ukazuje imunoprecipitace BAFF-R-Fc jak bylo popsáno v příkladu 4. Standardní molekulových hmotností vkDa je uveden na obrázku vlevo. Dráha (1) 12,5 ng flag-hTWEAK, (2) 12,5 ng flag-hBAFF, (3) imunoprecipitace flag-hBAFF s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (4) imunoprecipitace flaghTWEAK s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (5) imunoprecipitace bez ligandu s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (6) imunoprecipitace
-3 CZ 300364 B6 flaghBAFF s 0,5 ml upraveného média z netransfekovaných 293EBNA, (7) imunoprecipitace flag-hTWEAK s 0,5 ml upraveného média z netransfekovaných 293EBNA.
Obrázek 8 ukazuje vynesení výsledků z proliferačního testu splenocytů, kde jsou impulzy za 5 minutu (CPM) aktivity inkorporované do myších splenocytů vyneseny proti množství přidaného humánního BAFF (pg/ml).
Obrázek 9 ukazuje vynesení výsledků BAFF blokovacího testu, kterým byly analyzována vazba BAFF na buňky Ráji, kde MFI (průměrná intenzita fluorescence) je vynesena proti množství io R:hIgGI (ng/ml).
Obrázek 10(a) ukazuje vynesení exprese IgM proti CD1 ve FACS analýze pro Baff Tg myš, která dostala injekci h-Ig (střední panel) nebo hBCMA-Ig (spodní panel) a pro kontrolní myši divokého typu, které dostaly injekci PBS (horní panel), jak je popsáno v příkladu 11.
Obrázek 10(b) ukazuje vynesení exprese CD21 proti IgM ve FACS analýze, při vymezení vstupu pro IgD pozitivní populace u Baff Tg myší, které dostaly injekci h-íg (střední panel) nebo hBCMA-lg (spodní panel) a pro kontrolní myši divokého typu, které dostaly injekci PBS (horní panel), jak je popsáno v příkladu 11.
Obrázek 10(c.) ukazuje vynesení exprese CD21 proti IgM vé FACS analýze, při vymezení vstupu pro IgD pozitivní populace u Baff Tg myší, které dostaly injekci h-Ig (střední panel) nebo hBCMA-Ig (spodní panel) a pro kontrolní myši divokého typu, které dostaly injekci PBS (horní panel), jak je popsáno v příkladu 11:
Obrázek 11 ukazuje hmotnosti sleziny všech skupin Baff Tg myší (hmotnost je uvedena v mg +/směrodatná odchylka).
Obrázek 12 ukazuje vynesení proteinurie (mg/dL) proti počtu injekcí u Baff Tg myší, kterým byl 30 podáván PBS, hlg, hBCMA-Ig a u kontrolních myší.
Obrázek 13 ukazuje vynesení průměrné hodnoty průměrného arteriálního tlaku (mmHg) u Baff Tg myší a kontrolních myší divokého typu.
Obrázek 14 ukazuje vynesení průměrného individuálního arteriálního tlaku (mmHg) u Baff Tg myší a kontrolních myší divokého typu.
Obrázek 15 ukazuje sloupcový graf procenta myší SNTF1, u kterých se projevila silná nefritida po podávání BAFF-R-Ig (BCMA-lg), HulgG nebo PBS.
Obrázek 16 ukazuje celkový počet CDllc+ DC buněk (v milionech) u myší, kterým bylo podáváno in vivo 20 pg BCMA-lg, 50 pg BCMA-lg, HulgG nebo PBS. Vyšetřované buněčné populace CD 1 lc+ DC byly: (1) CD8a- CD4-, (2) CD8a+ CD4-, and (3) CD8a-CD4+.
Definice
Termíny „BAFF-R“ a „BCMA“ užívané v popisu zahrnují nativní sekvence BAFF-R a varianty BAFF-R (které budou dále definovány). BAFF-R lze izolovat z různých zdrojů, jako např. z různých typů myších nebo humánních tkání nebo z dalších zdrojů, nebo může být připraven rekombinantními metodami nebo synteticky.
Termín „nativní sekvence BAFF-R“ označuje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci jako BAFF-R pocházející z přírody. Taková nativní sekvence BAFF-R může být získána izolací z přírody nebo může být připraven rekombinantními metodami nebo synteticky. Patří sem také přirozeně se vyskytující zkrácené nebo secemované formy BAFF-R (např. rozpustné formy
-4CZ 300364 B6 obsahující např. sekvence extracelulámí domény), přirozeně se vyskytující varianty (např. alternativně sestřižené formy) a přirozeně se vyskytující alelické varianty BAFF-R. V jednom provedení vynálezu je nativní sekvence BAFF-R zralá nebo úplná nativní sekvence polypeptidů BAFF-R obsahující aminokyseliny 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo fragment této sekvence.
Termín „extracelulámí doména BAFF-R“ nebo zkráceně „BAFF-R ECD“ označuje formu BAFF-R, která je v podstatě bez transmembránové a cytoplazmatické domény BAFF-R. Obvykle, extracelulámí doména BAFF-R obsahuje méně než 1 % těchto transmembránových a ío cytoplazmatických domén, výhodně obsahuje méně než 0,5 % těchto domén. Případně BAFF-R
ECD obsahuje aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze SEKVENCE ID. Č. 1, nebo aminokyselinové zbytky 4 až 51 ze SEKVENCE ID. Č. 1, nebo aminokyselinové zbytky 1 až 53 ze SEKVENCE ID. Č 1. Ve výhodném provedení vynálezu BAFF-R ECD obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. Č 1. V dalším výhodném provedení BAFF-R ECD obsahuje amino15 kyselinové zbytky 1 až 50 ze SEKVENCE ID. Č. 1. Odborníkovi je zřejmé, že transmembránová doména polypeptidů BAFF-R podle vynálezu je identifikována na základě kritérií rutinně užívaných v oboru pro identifikaci tohoto typu hydrofobní domény. Přesné hranice transmembránové domény mohou být různé, ale s velkou pravděpodobností se neliší o více než 5 aminokyseliny na každém konci domény zde specificky uvedené. Takže BAFF-R ECD případně obsahuje aminokyseliny 8-41 (SEKVENCE ID. Č. 1).
Termín „varianta BAFF-R“ označuje aktivní BAFF-R jak je definován dále mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí BAFF-R uvedenou zde jako SEKVENCE ID. C. I pro úplnou nativní sekvenci BAFF-R nebo sekvenci
BAFF-R ECD. K variantám BAFF-R patří např. polypeptidy BAFF-R, kde je přidán nebo odstraněn jeden nebo více aminokyselinových zbytků na N-konci nebo C-konci SEKVENCE ID. Č. 1. Obvykle má varianta BAFF-R alespoň 80% nebo 85% aminokyselinovou sekvenční identitu, výhodněji alespoň 90% aminokyselinovou sekvenční identitu, a nejvýhodněji alespoň 95% aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovou SEKVENCE ID. Č. 1.
„Procenta (%) aminokyselinové sekvenční identity“ vzhledem k sekvencím BAFF-R zde popsaným jsou definováno jako procenta aminokyselinových zbytků v kandidátní sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky v sekvenci BAFF-R po srovnání sekvencí („aligning“) a případném vložení mezer, pokud je to nezbytné pro dosažení maximálního procenta sekvenční identity, přičemž konzervativní substituce se nepovažují za součást sekvenční identity. Srovnání sekvencí pro účely stanovení procenta aminokyselinové sekvenční identity lze provést různými způsoby, které jsou odborníkům známy, např. užitím veřejně dostupných počítačových programů ' jako'je BLAST, ALIGN nebo Megalign (DNASTAR) software. Odborník je schopen určit vhodné parametry pro vyhodnocení srovnání sekvencí a vhodný algoritmus pro dosažení nej40 lepšího srovnání celé délky srovnávaných sekvencí.
Termín „označený epitop“ („epitope tagged“) užívané v popisu chimérického polypeptidů obsahujícího BAFF-R, nebo sekvence jeho domén, fúzovaný se „značkovacím polypeptidem“ („tag polypeptide“). Značkovací polypeptid („tag polypeptide“) je polypeptid obsahující dostatek ami45 nokyselin na to, aby poskytl epitop, proti kterému může být připravena protilátka, nebo který lze identifikovat jiným činidlem, přičemž je dostatečně krátký, aby nenarušoval aktivitu BAFF-R. Značkovací polypeptid musí být také dostatečně unikátní, aby protilátka v podstatě nemohla zkříženě reagovat sjinými epitopy. Vhodný značkovací polypeptid obecně obsahuje alespoň 6 aminokyselinových zbytků, obvykle 8 až 50 aminokyselinových zbytků (výhodně přibližně 10 až
20 aminokyselinových zbytků).
Termín „izolovaný“, pokud jde o polypeptidy zde popsané, označuje polypeptid, který byl identifikován a separován a/nebo izolován ze svého přirozeného prostředí. Kontaminující složky v jeho přirozeném prostředí jsou takové materiály, které by rušily diagnostické nebo terapeutické využití polypeptidů a zahrnují enzymy, hormony, a další proteinové nebo neproteinové soluty.
-5CZ 300364 B6
Ve výhodném provedeni vynálezu je polypeptid purifikován (1) do stupně postačujícího k získání alespoň 15 zbytků N-konce nebo interní aminokyselinové sekvence pomocí rotačního sekvenčního zařízení („spinning cup sequenator“), nebo (2) do homogenity užitím SDS-PAGE za redukujících nebo neredukujících podmínek a pomocí barvení Coomassie modří nebo výhodně stříbrem. K izolovaným polypeptidům patří polypeptidy in šitu v rekombinantních buňkách, kde je nepřítomna alespoň jedna složka přirozeného prostředí BAFF-R. Obvykle je však izolovaný polypeptid připraven alespoň jedním purifikačním krokem.
Termín „protilátka“ se v předkládaném popisu užívá v nejširším smyslu a specificky zahrnuje io jednoduché BAFF-R monoklonální protilátky (včetně agonistických, antagonistických a neutralizačních protilátek) a anti-BAFF-R protilátkové přípravky s polyepitopickou specifickou.
Termín „monoklonální protilátka“ označuje protilátky získané z populace v podstatě homogenních protilátek, tj. individuální protilátky tvořící populaci jsou identické s výjimkou možných přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny ve velmi malém počtu.
15
Termín „purifikovaný preparát“ nebo „v podstatě čistý preparát“ polypeptidu označuje polypeptid, který byl separován od jiných proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se přirozeně vyskytuje. Výhodně je polypeptid také separován od ostatních substancí jako jsou např. protilátky, nosiče apod., které byly užity k purifikaci.
Termíny „léčení“, „ošetřování“ a „terapie“ se užívají ve smyslu léčebného, profylaktického a preventivního působení.
Termíny „peptidy“, „proteiny a „polypeptidy“ jsou v popisu užívány zcela zaměnitelně.
Termín „biologicky aktivní“ znamená v případě proteinu, že má in vivo nebo in vitro aktivitu, která působí přímo nebo nepřímo. Biologicky aktivní fragmenty BAFF-R mají např. 70% aminokyselinovou homologii s aktivním místem reeeptoru, výhodněji alespoň 80%, a nejvýhodněji alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie vzhledem k reeeptoru je definována jako pro30 cento aminokyselinových zbytků v kandidátní sekvenci, které jsou identické se zbytky BAFF-R v SEKVENCI ID. C. 1, nebo které jsou identické s aminokyselinovými zbytky definované části SEKVENCE ID. Č. 1.
Termín „savec“ označuje jakékoliv zvíře klasifikované jako savec, jako je např. kráva, kůň, pes, myš a kočka, včetně člověka. Ve výhodném provedení vynálezu je savec člověk.
Při realizaci předkládaného vynálezu bylo využito, pokud není výslovně uvedeno jinak, standardních postupů buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, transgenní biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA a imunologie, která jsou odborníkům známy. Tyto metody jsou dostatečně popsány v odborné literatuře.
Dále se popis týká výhodných provedení vynálezu. Vynález BAFF-R a molekul příbuzných BAFF-R pro použití k ovlivnění růstu a zrání B lymfocytů a sekrece imunoglobulinu. Vynález se dále týká BAFF-R a molekul příbuzných BAFF-R pro použití k ovlivnění reakce imunitního systému, což je nutné při onemocněních souvisejících s imunitním systémem. Navíc se vynález týká léčení rakoviny a poruch imunity, kdy se při genové terapii užívá gen BAFF-R nebo gen příbuzný BAFF-R.
BAFF-R a jeho homology produkované hostitelem transformovaným sekvencí podle vynálezu, a také nativní BAFF-R purifikovaný odborníkovi známým způsobem, nebo připravený ze známé aminokyselinové sekvence, jsou užitečné při mnoha aplikacích jako jsou např. protirakovinné, protinádorové a imunoregulační aplikace. Jsou užitečné také při léčení dalších nemoci.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití polypeptidu kódovaného izolovanou nukleo55 vou kyselinou kódující BAFF-R při „antisense“ terapii. Termín „antisense“ terapie označuje
- 6 CZ 300364 B6 podávání nebo in šitu vytváření oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují v buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný ligand, takže inhibuj ΐ expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují jeho transkripci a/nebo translaci. Vazba se může uskutečnit na základě konvenční komplementarity bází nebo např. v případě vazby na dvojšroubovici DNA prostřednictvím specifických interakcí v hlavním zářezu dvoj šroubovice. Obecně se „antisense“ terapie týká celé řady různých metod v oboru užívaných, a v podstatě zahrnuje veškerou terapii založenou na specifické vazba k oligonukleotidovým sekvencím.
Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu může být podáván ve formě expresního io plazmidu, který po transkripci v buňce vede k tvorbě RNA, která je komplementární k alespoň části buněčné mRNA kódující BAFF-ligand. Alternativně, antisense konstrukt je oligonukleotidová sonda připravená ex vivo. Takové oligonukleotidové sondy jsou výhodně modifikovány na oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám a jsou tudíž stabilní in vivo.
Příklady molekul nukleové kyseliny pro použití jako antisense oligonukleotidy jsou fosforamidá15 tové, fosforothioátové a methylfosfonátové analogy DNA (viz např, patentové dokumenty US 5 176 996;'US 5 264 564; US 5 256 775). Navíc obecné principy konstrukce oligomerů užitečných pro antisense terapii byly přehledně popsány např. V publikacích Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659-2668, které jsou zahrnuty formou odkazu.
BAFF-R podle předkládaného vynálezu je, jak již bylo uvedeno výše, člen rodiny receptorů TNF. Tento protein, jeho fragmenty nebo homology mají proti široké terapeutické a diagnostické aplikace.
Polypeptidy podle vynálezu specificky interagují s BAFF, polypeptidem dříve popsaným v paten25 tové přihlášce WO99/12964, kteráje zahrnuta formou odkazu. Zde popsané peptidy a způsoby umožňují identifikovat molekuly, které specificky interagují s BAFF-R nebo jeho fragmentem.
Některá provedení předkládaného vynálezu se týkají použití peptidů odvozených z BAFF-R, které mají schopnost vázat se na BAFF. Fragmenty BAFF-R mohou být připraveny různými způsoby, např, rekombínantní technikou, využitím PCR, proteolytíckým štěpením nebo chemickou syntézou. Interní nebo terminální fragmenty polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo více nukleotidů z jednoho nebo obou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Exprese takto mutované DNA poskytuje polypeptidové fragmenty.
Chimérické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy. Podle vynálezu se zamýšlí použití chimérických molekul obsahujících BAFF-R polypeptid (nebo jeho variant) fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí, jako je např. IgG Fc doména imunoglobulinu. Výhodně jsou takové chimérické molekuly rozpustné a obsahují rozpustný polypeptid BAFF-R. Ve výhodném provedení chimérická molekula obsahuje aminokyselinové zbytky I až 50 ze SEKVENCE ID. C. 1 fúzované s doménou Fc.
Polypeptidové fragmenty mohou být také připraveny chemickou syntézou užitím postupů, které jsou odborníkům známy, jako je např. obvyklá Merrifieldova metoda chemické syntézy na pevné fázi užívající f-moc nebo t-boc. Tak např. peptidy a DNA sekvence mohou být libovolně rozděleny na fragmenty požadované délky bez překrývání nebo ne překrývající se fragmenty požadované délky. Tyto metody budou níže podrobněji popsány.
Příprava rozpustných forem BAFF-R
Rozpustné formy BAFF-R jsou často signálně účinné a tudíž mohou být podávány jako léčiva, která napodobují přírodní membránové formy. Je možné, že BAFF-R podle vynálezu jsou v přírodě secemovány jako rozpustné cytokiny, avšak v případě, že ne, je možné podpořit sekreci tím, žé se gen upraví metodami genového inženýrství. Pro vytvoření rozpustné secemované formy BAFF-R by se odstranil na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky tzv. stonku, a nahradily by se vedoucí sekvencí („leader“) typu I, alternativně typu II, která
-7CZ 300364 B6 by umožnila účinné proteolytické štěpení ve zvoleném expresním systému. Odborník může měnit rozsah ponechané stonkové oblasti v konstruktu pro sekreci, aby optimalizoval jak vazebné vlastnosti k ligandů, tak i účinnost sekrece. Tak např. konstrukty obsahující všechny možné délky stonku, tj. sekvence zkrácené na N-konci, se mohou připravit tak, že vzniknou proteiny, které začínají aminokyselinou l až 51. Výsledkem takové analýzy je pak stanovení optimální délky stonkového úseku.
Ve výhodném provedení vynálezu rozpustný BAFF-R polypeptid je izolovaná nativní sekvence BAFF-R polypeptidu obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo io fragment této sekvence; izolovaný BAFF-R polypeptid mající alespoň 80% (a výhodněji 90%) aminokyselinovou sekvenční identitu s nativní sekvencí BAFF-R polypeptidu obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. C. 1 nebo fragment této sekvence; izolovaný BAFF-R polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze SEKVENCE ID.
Č. 1 nebo fragment této sekvence, a izolovaná nativní sekvence polypeptidu BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 50 ze SEKVENCE ID, Č. 1 a nebo fragment této sekvence.
Příprava protilátek reaktivních s BAFF-R
Předkládaný vynález se týká také protilátek, které specificky reagují s BAFF-R nebo jeho koreceptory. Anti-protein/anti-peptidové anitsérum nebo monoklonální protilátky se připravují standardními postupy (viz např. Antibodies: Laboratory Manual ed. by Harlow and Lané (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Savci jako např. myš, křeček nebo králík, se imunizují imunogenní formou peptidu. K postupům, kterým se proteinu nebo peptidu udělí imunogenicita patří konjugace s nosičem a další metody, kteréjsou odborníkům známy.
Imunogenní část BAFF-R nebo jeho koreceptorů se podává společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat měřením titru protilátek v plazmě nebo v séru. Pro stanovení hladiny protilátek lze využít standardní postup ELISA nebo jiný formám imunotestu s imunogenem jakožto antigenem.
Protilátky ve výhodném provedení vynálezu jsou protilátky imunospecifické pro antigenní determinanty BAFF-R nebo jeho koreceptorů, např, antigenní determinanty polypeptidu SEKVENCE ID. Č. 1, nebo blízce příbuzného homologu humánní nebo jiného savčího původu (např. se 70, 80 nebo 90% homologii, výhodněji s alespoň 95% homologii). V dalším výhodném provedení vynálezu protilátky antíBAFF-R nebo anti-BAFF-koreceptor v podstatě zkříženě nereagují (tj.
reagují jen specificky) s proteinem, který je méně nežz 80 % homologní se SEKVENCÍ ID. Č. 1; výhodně méně než z 90 % homologní se SEKVENCÍ ID. Č. 1; a nejvýhodněji méně než z 95 % homologní se SEKVENCÍ ID. Č. 1. Výrazem „v podstatě zkříženě nereaguji“ se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu, která představuje méně než 10 %, výhodněji méně než 5 %, a ještě výhodněji méně než 1 % vazebné afinity k proteinu
SEKVENCEID. Č. 1.
Termín „protilátka“ jak je užíván v předkládaném vynálezu zahrnuje také protilátkové fragmenty, které specificky reagují s BAFF-R, nebo jeho koreceptory. Protilátky lze fragmentovat konvenčními metodami, které jsou odborníkům známé, a pak testovat užitečnost fragmentů stejným způsobem, který byl výše popsán pro celé protilátky. Tak např. fragmenty F(ab')2 se připravují působením pepsinu na protilátku. Vzniklé fragmenty F(ab')2 mohou být ještě ošetřeny tak, že se redukují disulfidické můstky a vzniknou fragmenty Fab'. K protilátkám podle vynálezu patří také biospecifícké a chimérické molekuly mající aktivitu anti-BAFF-R nebo anti-BAFFkoreceptoru. Jak monoklonální, tak i polyklonální protilátky (Ab) namířené proti BAFF-R, a jeho koreceptorům, a také protilátkové fragmenty, jako je např. Fab' a F(ab')2, mohou být použity pro blokování působení BAFF-R a jeho případných koreceptorů.
Různé formy protilátek mohou být připraveny užitím standardních technik rekombinantní DNA (Winter and Milstein, Nátuře 349: 293-299 (1991);, vloženo formou odkazu). Tak např. se mohou
-8CZ 300364 B6 zkonstruovat chimérické protilátky, kde doména vázající antigen ze zvířecí protilátky je spojena s humánní konstantní doménou (viz např. Cabilly et al., Patent US 4 816 567, vloženo formou odkazu). Chimérické protilátky mohou redukovat pozorovanou imunogenní reakci vyvolanou normálními zvířecími protilátkami při klinickém použití u lidí.
Navíc mohou být synteticky připraveny rekombinantní „humanizované protilátky“, které rozpoznávají BAFF-R nebo jeho koreceptory. Humanizované protilátky jsou chiméry, které obsahují většinu sekvencí humánního IgG, do kterých byly vloženy úseky zodpovědné za specifickou vazbu antigenu.’
Požadovaným antigenem se imunizují zvířata, izolují se z nich odpovídající protilátky a vyjmou se části sekvencí variabilních úseků zodpovědné za specifickou vazbu antigenu. Úseky vázající antigen pocházející ze zvířete se pak klonují do odpovídajícího místa genu pro humánní protilátku, ze kterého byly úseky pro vazbu antigenu odstraněny. Humanizované protilátky minimali15 zují použití heterologních (mezidruhových) sekvencí v humánních protilátkách a tudíž je menší pravděpodobnost, že vyvolají imunitní reakci u léčeného pacienta.
Konstrukci různých tříd rekombinantních protilátek lze také provést přípravou chimérických nebo humanizovaných protilátek obsahujících variabilní domény a humánní konstantní domény (CHI, CH2, CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Tak např. protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen mohou být rekombinantně připraveny klonováním vazebných míst pro antigen do vektoru nesoucího úseky humánních konstantních řetězců (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177: 1439-1450 (1993), zahrnuto formou odkazu).
Navíc mohou být ke změně vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny užity standardní metody rekombinantní DNA, kterými se změní aminokyselinové zbytky v sousedství míst vázajících antigen. Vazebná afinita humanizovaných protilátek k antigenu může být zvýšena mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989), zahrnuto formou odkazu).
Příprava analogů: příprava změněných sekvencí DNA a peptidů
Analogy BAFF-R se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího BAFF-R v aminokyselinové sekvenci, nebo způsobem, který se netýká sekvence, nebo oběma způsoby. Kjiným než sekvenčním (nesekvenčním) modifikacím patří in vivo- nebo in vitro chemická derivatizace
BAFF-R. K nesekvenčním modifikacím tedy patří, aniž by však výčet byl omezující, změny v acetylaci, methylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.
K výhodným analogům patří BAFF-R a jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 1 jednou nebo více konzervativními ami40 nokyselinovými substitucemi, nebo jednou nebo více nekonzervativními aminokyselinovými substitucemi, delecemi nebo inzercemi, které neruší aktivitu BAFF-ligandu. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou, která má podobné vlastnosti, např. substituce v rámci následujících skupin aminokyselin: valin - glycin; glycin alanin; valin - isolecuin - leucin; kyselina asparagová - kyselina glutamová; asparagin - glu45 tamin; serin - threonin; lysin - arginin; a fenylalanin - tyrosin.
Využití vynálezu
Úplný gen BAFF-R (SEKVENCE ID. Č. 2) nebo jeho část mohou být užity jako hybridizační sondy pro cDNA knihovny, např, k izolaci dalších genů, které mají požadovanou sekvenční identitu se sekvencí BAFF-R popsanou zde jako SEKVENCE ÍD. Č. 2. Nukleotidové sekvence kódující BAFF-R mohou být také užity ke konstrukci hybridizačních sond pro mapování genů, které kóduj ící BAFF-R a pro genetické analýzy jedinců s genetickými poruchami.
-9CZ 300364 B6
Lze navrhnout testy pro screening sloučenin, které napodobují biologickou aktivitu BAFF-R.
K. takovým, screeningovým metodám patří testy, které umožňují vysokokapacitní screening chemických knihoven a jsou tudíž zvláště vhodné k identifikaci malých molekul jakožto kandidátních léčiv. K uvažovaným malým molekulám patří syntetické organické nebo anorganické sloučeniny. Nukleové kyseliny kódující BAFF-R nebo jeho modifikované formy se mohou také užít pro přípravu transgenníeh zvířat nebo zvířat s vyřazenou funkcí daného genu („knock out“), která jsou zase užitečná při sereeningu a vývoji terapeuticky užitečných agens.
Jedno provedení vynálezu se týká stimulace růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů io indukovaného dendritickými buňkami nebo produkce imunoglobulinu u zvířat užitím polypeptidu BAFF-R, a nebo kostimulace růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami nebo produkce imunoglobulinu u zvířat užitím polypeptidu BAFF-R a anti-T protilátek, CD40 ligandu nebo anti-CD40 ligandu, Týká se také inhibice růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami nebo produkce imunoglobulinu u zvířat užitím polypeptidu BAFF-R.
V jiném provedení se vynález týká BAFF-R pro použití k léčení autoimunitních poruch, hypertenze, kardiovaskulárních onemocnění, onemocnění ledvin, lymfoproliferativních onemocnění B lymfocytů, imunosupresivních onemocnění, transplantací orgánů, zánětlivých onemocnění a také HIV. Patří sem i použití jakožto činidla k léčení, potlačení nebo změně imunitní reakce na které se podílí signální dráha mezi BAFF-R ajeho ligandem.
V jiném provedení vynálezu poskytuje farmaceutický přípravek obsahující polypeptid BAFF-R a farmaceuticky přijatelné excipienty. K vhodným nosičům pro polypeptid BAFF-R a jeho pří25 pravky patří např. excipienty popsané, v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences (16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.) Typicky se užívá vhodné množství farmaceuticky přijatelné soli, aby byl přípravek isotonický. K příkladům vhodných nosičů patří pufry jako roztoky solí, Ringerův roztok a roztok dextrózy. pH roztoku je výhodně 5 až 8, výhodněji 7,4 až 7,8. K dalším vhodným nosičům patří prostředky pro prodloužené/řízené uvolňování léčiva jako je semipermeabilní matrix zpěvných hydrofobních polymerů, která je např. ve formě liposomů, Filmů nebo mikročástic. Odborníkovi je zřejmé, že některé nosiče mohou být výhodnější v závislosti na určitém způsobu podávání koncentraci podávaného polypeptidu BAFF-R.
Podávání přípravků podle vynálezu se provádí např. injekcí (např. intravenózní, intraperitoneální, subkutánní, intramuskulámí) nebo jinými způsoby jako je např. infúze, která zajistí podání v účinné formě do krevního oběhu.
Při realizaci předkládaného vynálezu byly užity, pokud není výslovně uvedeno jinak, standardní postupy buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, transgenní biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA a imunologie, která jsou odborníkům známy. Tyto metody jsou dostatečně popsány v odborné literatuře, viz např. Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; Patent US 4 683 1.95 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and
S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; Praetical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academie Press, New York; Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos, eds.), 1.987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes
I—IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
- 10CZ 300364 B6
Pro ilustraci vynálezu jsou uvedeny následující příklady, které však žádným způsobem neomezují rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Detekce BAFF vazby k BAFF-R s použitím testu v destičkovém formátu
V tomto příkladu je popsána vazba BAFF k transfekovaným buňkám BAFF-R s použitím testu io v destičkovém formátu (destičkového testu).
Kompletní humánní BAFF-R by! vytvořen z BJAB polyA+ RNA s použitím soupravy „Superscriptll preamplification kit“ (Life Technologies) k vytvoření cDNA templátu a amplifikován sPful s použitím primerů komplementárních k 5' a 3' kódujícím sekvencím BAFF-R. is PCR produkt byl klonován do CH269, derivátu pCEP4 (Invitrogen). Výsledný klon byl nazván pJST535. Humánní buňky embryonálních ledvin obsahující gen EBNA-1 (293EBNA) byly vysety na destičky se 6 jamkami potaženými fibronektinem a transfekovány lipofektaminem (Life Technologies) s buď pJST535 v různých ředěních, nebo CH269 jako kontrolu pozadí. 48 hodin po transfekci byly transfekované buňky testovány na schopnost vázat rozpustný FLAG20 hBAFF (aminokyseliny L83-L285) tak, jak je uvedeno dále. Všechny inkubace’byly prováděny při teplotě místnosti. Kondicionovaná média byla odsáta z jamek a buňky byly promyty pufrem BHA (20mM HEPES pH 7,0, 0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN3) a inkubovány s 0,5 pg/ml FLAGhBAFF naředěným v PBS obsahujícím lmM MgCl2, lmM CaCl2 a 0,1% NaN3. Po 1 hodině inkubace byl roztok BAFF odstraněn a buňky byly promyty BHA. Buňky pak byly inkubovány po dobu 30 minut v roztoku PBS obsahujícím anti-FLAG monoklonální protilátku v koncentraci 1 pg/ml, M2 (Sigma). Tento roztok byl odsát a buňky byly promyty BHA. Buňky byly poté inkubovány po dobu 30 minut v 1:3000 ředění kozího proti-myšího IgG F(ab')2 (Jackson ImunoResearch) konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Tento roztok byl odsát a buňky byly promyty BHA. Aby se snížilo množství značeného pozadí způsobené endogenní alkalickou fosfatázou, byly buňky inkubovány po dobu 15 minut ve 2,5mM levamisolu (Vektor Laboratories) ředěném v lOOmM NaCI, lOOmM Tris—Cl pH 9,5 a 5mM MgCl2. Pro chromogenní detekci alkalické fosfatázy byl roztok inhibitoru odsát a buňky byly inkubovány s roztokem barviva „fast red“ a naftolfosfátu (Pierce). Značení bylo pozorováno a fotografováno v mikroskopu při malém zvětšení.'
Ukládání barviva „fast red“ bylo pozorováno u všech jamek transfekovaných s plazmidem exprimujícím BAFF-R, pJST535. Četnost signálu se snižovala, jak klesalo množství plazmidů transfekováného do buněk. V buňkách transfekovaných kontrolním expresním vektorem, CH269, nebylo pozorováno žádné značení. V transfekovaných buňkách také nebylo pozorováno žádné značení, když byl FLAG-hBAFF vypuštěn ze značícího protokolu nebo když byl FLAG-hBAFF nahrazen jiným členem rodiny ligandu TNF, FLAG-značený L1GHT. Tudíž BAFF značení buněk transfekovaných BAFF-R je specifické.
Příklad 2
FACS analýza vazby BAFF k buňkám transfekovaným BAFF-R
Tento příklad popisuje detekci vazby BAFF k transfekovaným buňkám BAFF-R s použitím FACS analýzy.
Plazmid kódující kompletní BAFF-R, pJST535, byl transfekován do buněk 293EBNA s použitím soupravy FuGeneó (Boehringer Mannheim). 24 nebo 48 hodin po transfekci byly buňky odstraněny z destiček s použitím 5mM EDTA v PBS a počítány. Buňky byty promyty dvakrát
-11 CZ 300364 B6 pufrem FACS (PBS obsahující 10% fetální bovinní sérum, 0,1% NaNi a 10 pg/ml hlgG (Jackson ImunoResearch), a poté bylo inkubováno 2,5 x I O5 buněk po dobu 1 hodiny na ledu s FLAGhBAFF naředěným ve FACS pufru v koncentraci v rozmezí od 9 do 0,037 pg/ml. Buňky byly promyty FACS pufrem a inkubovány s anti-FLAG monoklonální protilátkou,.M2, v koncentraci
5 pg/ml po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly promyty FACS pufrem a inkubovány po dobu minut na ledu v roztoku obsahujícím 1:100 ředění oslího protimyšího IgG F(ab')2 konjugovaného s R-fykoerythrinem a 10 pg/ml 7-AAD. Poté, co byly buňky promyty FACS pufrem, byly resuspendovány ve FACS pufru obsahujícím 1% paraformaldehyd. Následovala FACS analýza, kdy byly 7-AAD pozitivní (mrtvé) buňky vyloučeny.
io
Výsledky FACS analýzy ukázaly, že frakce buněk, které byly transfekovány BAFF-R, jsou schopné vázat BAFF. Při BAFF koncentraci 9 pg/ml, přibližně 28 % buněk váže BAFF při průměrné intenzitě fluorescence (MFI) 366. Při použití samotné PE-značené oslí proti-myší reagencie posun buněk významný. Pouze 1,3 % buněk mělo MFI 23,5, přičemž průměr ze všech buněk byl 5,5. Signál buněk transfekováných BAFF-R se snižoval s klesajícím množstvím BAFF. V koncentraci 100 ng/m! mělo 8,76 % buněk MFI 78,9.
Příklad 3
FACS analýza interakce BAFF/BAFF-R včetně GFP markéru
V tomto příkladu je popsána schopnost BAFF vázat se na buňky transfekované společně (kotransfekované) BAFFR a GFP reportérovým plazmidem.
Buňky 293EBNA byly transfekovány pJST535 a GFP reportérovým plazmidem, jak bylo popsáno v příkladu 2. Reportérový plazmid kóduje GFP molekulu ukotvenou v membráně. S použitím ko-transfekce dvou plazmidů analyzovali původci procento transfekovaných buněk, které byly schopné vazby BAFF. Buňky byly odstraněny z destiček a podrobeny BAFF vazbě a detekci, jak bylo popsáno v příkladu 2. Opět byla zahrnuta 7-AAD, aby se odečetly mrtvé buňky. Vzorky byly analyzovány FACS a vyneseny do grafu. Pravý horní kvadrant představuje buňky s navázaným BAFF (fykoerythrin pozitivní) a exprimující GFP.
Ačkoliv se zdá, že ne všechny GFP transfekované buňky váží BAFF, existuje významná frakce buněk v pravém horním kvadrantu ve srovnání s kontrolami. 33 % transfekovaných buněk jsou v pravém horním kvadrantu ve srovnání s 8 %. Je možné, že je nezbytný určitý stupeň exprese
BAFF-R, aby se projevila vazba BAFF k buňkám. Je také možné, že je nezbytný ko-receptor je pro interakci s vysokou afinitou a že tento receptor je na buňkách 293EBNA limitující.
Příklad 4
Imunoprecipitace FLAG-hBAFF fúze BAFF-R-Fc
Tento příklad popisuje specifickou interakci FLAG-hBAFF s BAFF-R-Fc, molekulou složenou z domény bohaté na cystein (CRD) BAFF-R fúzované k Fc doméně humánního IgG 1.
CRD BAFF-R byly vytvořeny pomocí RT-PCR z BJAB polyA+ RNA jako v příkladu 1 s použi45 tím jako 3' primerů oligonukleotidu komplementárního k nukleotidům 132-152 z hBAFF-R kódující sekvence. Výsledný PCR fragment byl klonován do CH269 po směru od myší IgGkappa signální sekvence a v protisměru od Fc skupiny humánního IgG. Tento konstrukt byl nazván pJST538. Konstrukt pJST538 nebo CH269 byly transfekovány do 293EBNA prostřednictvím lipofektaminu. Kondicionovaná média a buněčné extrakty byly sklizeny
20 hodin po transfekci, Buňky byly solubilizovány ve 20mM Tris pH7,5/50mM NaCl/0,5%
NP40/0,5% deoxycholové kyselině a debris odstraněno stočením. Alikvot kondicionovaného média a buněčné extrakty byly spojeny se stejným objemem redukčního pufru 2x SDS, povařeny a podrobeny SDS-PAGE a Western přenosu. Aby se ověřila exprese, byla membrána zkoušena
-12CZ 300364 B6 v 1:3000 ředění myšího anti-humánního IgG konjugovaného s křenovou peroxidázou (HRP) v 5% odtučněném sušeném mléce v TBST při teplotě místnosti po dobu 30 minut a promyta TBST. Membrány (bloty) byly vyvolány ECL (Amersham) a exponovány na film.
Imunoprecipitace byly prováděny inkubací 25 ng buď FLAG-hBAFF, nebo FLAG-hTWEAK s0,5 ml kondicionovaného média z293EBNA transfekováných buď pJST538, nebo CH269 ve °C po dobu 1 hodiny s třepáním, a pak následovalo přidání of 30 μΐ ProteinA-Sepharose (Pharmacia) a pokračovalo třepání přes noc. ProteinA-Sepharose perličky byly promyty dvakrát s PBS a resuspendovány ve vzorku redukčního pufru 2xSDS. Po SDS-PAGE a Western přenosu io byly bloty inkubovány s anti-FLAG monoklonální protilátkou M2 (Sigma) v koncentraci pg/ml v 5% odtučněném sušeném mléce v TBST při teplotě místnosti po dobu I hodiny. Bloty byly promyty TBST a inkubovány s 1:3000 ředění kozího proti-myšího IgG konjugátu s HRP (Jackson ImunoResearch) v 5% odtučněném sušeném mléce v TBST při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Bloty byly vyvolány BCL (Amersham) a exponovány na film.
Po transfekci pJST538 do buněk 293EBNA byla detekována exprese protein o velikosti přibližně 43kD jak v buněčném extraktu, tak v kondicionovaném médiu analýzou Western blotu s myším anti-humánním IgG (Jackson ImunoResearch), což ukazovalo, že fúze BAFF-R-Fc byla účinně exprimován a a sekreto ván a.
Při imunoprecipitacích byl pozorován pás pouze jako výsledek inkubace BAFF-R-Fc a FLAGhBAFF. Tento pás se pohyboval společně s přímo naneseným vzorkem FLAG-hBAFF. Žádná další dráha nevytvořila signál, což ukázalo, že interakce mezi BAFF-R-Fc a FLAG-hBAFF je specifická.
Příklad 5
Vytvoření rozpustných forem receptoru
Aby se vytvořil inhibitor receptoru pro použití u člověka, je nutná cDNA sekvence extracelulární domény humánního receptoru. Jestliže je známa myší forma, je prováděn screening humánních cDNA knihoven s použitím myší cDNA sekvence a v této oblasti jsou tyto manipulace prováděny rutinně. S humánní cDNA sekvencí lze navrhnout oligonukleotidové primery, aby se pomocí PCR amplifikovala extracelulární doména receptoru bez transmembránových a intracelulámích domén. Typicky je zahrnuta většina aminokyselin mezi „TNF doménou“ spojenou s posledním disulfidickým můstkem a transmem bráno vou doménou. Lze měnit množství „stonkových“ oblastí zahrnutých pro optimalizaci potence výsledného rozpustného receptoru. Tento amplifikovaný úsek je upraven metodami genetického inženýrství tak, aby zahrnoval vhodná restrikční místa pro klonování do různých vektorů pro vytváření fúzní chiméry s C-koncem Ig. Nebo lze vložit stop signál na 3' konec a vytvořit rozpustnou formu receptoru bez pokusu použít přístup s fúzní chimérou Ig. Výsledné vektory mohou být exprimovány ve většině systémů používaných v biotechnologiích včetně kvasinek, hmyzích buněk, bakterií a savčích buněk, a pro všechny typy exprese existují příklady. Různé humánní Fc domény mohou být připojeny, aby se optimalizovaly nebo eliminovaly interakce FcRa komplementu, je-li to žádoucí. Nebo mohou být použity mutované formy těchto Fc domén, aby byly selektivně odstraněny interakce FcR nebo komple45 mentu, či připojení sacharidů N-připojených k Fc doméně, což má určité výhody.
Příklad 6
Příprava agonistických nebo antagonistických protilátek
Výše popsané rozpustné formy receptoru mohou být použity pro imunizaci myší a pro vytváření monoklonálních protilátek (mAbs) obvyklými metodami. Výsledné mAbs, které jsou identifikovány pomocí metod ELISA, mohou být dále podrobeny screeningu na to, zda mají agonistickou aktivitu, a to buď jako rozpustné protilátky, nebo imobilizovány na umělé hmotě v různých in
- 13CZ 300364 B6 vitro buněčných testech. Často usmrcení buněčné linie HT29 je obvyklý systém, který je citlivý na signalizaci prostřednictvím mnoha TNF receptoru. Jestliže tato linie nemá zkoumaný receptor, může být tento kompletní receptor stabilně transfekován do linie HT29, aby se umožnilo fungování cytotoxlckého testu. Nebo mohou být tyto buňky použity v přístroji Cytosensor, aby se určilo, zda aktivace receptoru může vyvolat změnu pH, která je indikátorem signálního jevu. Rodina TNF receptorů v tomto uspořádání signalizuje dobře a tato metoda nevyžaduje znalost aktuálních biologických jevů spuštěných receptorem. Agonistické mAbs mohou být „humanizované“ pro klinické použití. Tento postup může být také použit pro charakterizaci antagonistických mAbs. Pro tyto mAbs je charakteristický nedostatek agonistické aktivity a schopnost inhibovat interakce receptoru-ligandu, jak monitorováno technikami ELISA, technikou klasické vazby nebo metodou BIAcore. Konečně, indukce sekrece chemokinů různými buňkami jako reakce na agonistickou protilátku může tvořit základ pro screeningovou metodu (test).
Příklad 7
Screening inhibitorů interakce receptor-ligand
S použitím fúzního proteinu receptor-Ig, lze provádět screening kombinačních knihoven na molekuly, které mohou vázat přímo receptor. Tyto molekuly mohou být poté testovány v testech ELISA s použitím fúzního proteinu receptoru-Ig a rozpustné formy ligandů na schopnost inhibovat interakce receptor-ligand. Tato ELISA může být použita přímo k provádění screeningu různých knihoven s přírodními produkt apod. na inhibiční sloučeniny. Receptor může být transfekován do buněčné linie, jako je například linie HT29, aby vznikl biologický test (v tomto případě cytotoxický), který pak vytvoří test vhodný pro screening.
Příklad 8
BAFF-R-lgG vyvolává snížení počtu B lymfocýtů u normálních myší
Osm týdnů staré samice myší BALB/c byly zakoupeny od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Myši (3/skupina) dostaly i.p. bud1 PBS, 400 pg fúzního proteinu humánního BAFF-R30 hulgG 1. (hBAFF-R-Ig) (dodávaný firmou Teresa Cachero, Biogen), nebo 400 pg purifikovaného humánního IgG (HulgG) (Sandoz, Bazilej, Švýcarsko) ve dnech -8, -5, -l a +2. Myši dostaly 100 pl 10% ovčích červených krvinek (SRBC) (Colorado Sérum Company, Denver, CO) v den 0.
V čase utracení zvířat byla odebírána krev prostřednictvím punkce srdce do zkumavek obsa35 hujících EDTA a červené krvinky byly lyžovány v hypotonickém pufru. Krev byla také odebírána bez EDTA pro'sérové preparáty. Jednoduché buněčné suspenze byly připraveny ze slezin a mezenterických lymfatických uzlin (MLN) a červené krvinky byly lyžovány v hypotonickém pufru. Byla prováděna průtoková cytometrie s použitím PE-konjugované anti-CD45R/B220, anti-syndekan/CD138 a anti-B7.2 a FITC-konjugovaného anti-IgM a anti-CD45R/B220. Všech mAbs byly zakoupeny od firmy Pharmingen (San Diego, CA). Stručně, Fc receptory byly blokovány přípravkem „Fc Block“ (Pharmingen) v koncentraci 10 pg/ml po dobu 15 minut na ledu, pak následovalo přidání PE- a FITC-konjugovaných mAbs a byly inkubovány na ledu po dobu 20 až 30 minut. Buňky byly lx promyty a suspendovány v 0,5% paraformaldehydu. Data fluorescence buněk byla získána na průtokovém cytometru FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose,
CA) a analyzována s použitím softwaru CELLQuest™ (Becton Dickinson).
Po ošetření s hBAFF-R-íg nastala přibližně 50% redukce počtu B lymfocytů v periferní krvi a ve vyšetřených periferních lymfatických orgánech. B220tl'eh IgMlow B lymfocyty odpovídaly za
23,4 % a 21,5 % buněk u myší ošetřených PBS a HulgG, v daném pořadí, zatímco tato populace představovala pouze 9,9 % buněk u myší ošetřených hBAFF-R-íg. Počet plazmatických buněk (syndekan/CD138+) také lehce poklesl, s 5,7 % a 4,8 % přítomnými v krvi myší ošetřených PBS a myší ošetřených HulgG, v daném pořadí, ve srovnání s 3,9 % u myší ošetřených hBAFF-R-Ig.
- 14CZ 300364 B6
B7.2 molekula byla zvýšena na 3,1 % a 4,5 % B220+ buněk u myší ošetřených PBS a myší ošetřených HulgG, v daném pořadí, ve srovnání s 1,9 % u myší ošetřených hBAFF-R-Ig.
B220h'eh B lymfocyty ve slezině byly výrazně redukovány u myší ošetřených hBAFF-R-Ig, 5 představovaly 18,8 %, ve srovnání s 36,7 % a 40 % u myší ošetřených PBS a HulaG, v daném pořadí. Tento pokles byl pozorován u obou subpopulací, IgMh'gh a IgM,°’ (viz tabulka 8A). Žádná změna nebyla pozorovaná v nově vytvořeném kompartmentu B lymfocytů ve slezině, B220|OW
IgMh'sl1 (data nejsou ukázána). Počet plazmatických buněk (syndekan/CD138+) také lehce poklesl s 3,3 % a 3,4 % přítomnými ve slezině myší ošetřených PBS a myší ošetřených HulgG, v daném io pořadí, ve srovnání s 2,4 % u myší ošetřených hBAFF-R-Ig.
MLN projevovaly pokles B220+ B lymfocytů. s 14,1 % přítomnými u myší ošetřených hBAFFRIg ve srovnání s 26,7 % a 35,8 % u myší ošetřených PBS a myší ošetřených HuígG, v daném pořadí, Data jsou shrnuta v tabulce 8A.
Tabulka 8A
Populace B lymfocytů u myší1 ošetřených hBAFF-R-íg, PBS a HuígG
Krev PBS B220hish IgMlow 23,4 + 5,7 Syndekan 5,7 ± 1,5 B7.2/B220low 3,1 + 0,5
HuígG 21,5 ± 4,5 4,8 ± .0,9 4,5 ± 1,0
HBAFF-R-Ig 9,9 ± 1,8 3,9 ± 0,6 1,9 ± 0,5
Slezina PBS B220hÍ3h IgMl0W 27,8 ±1,6 B220high IgM+ 11,9 + 1,6 Syndekan 3,3 i 0,8
HuígG 30,5 + 2 11,8 ± 1,0 3,4 ±0,7
HBAFF-R-Ig ÍO,6 ± 0,2 8,4 ± 0,2 2,4 ± 0,2
MLN PBS B220+ 26,7
HuígG 35,8 + 3,3
HBAFF-R-Ig 14,1 ±5,9
myši byly ošetřeny tak, jak bylo popsáno v Části Materiál a metody a data jsou udána jako procento ± směrodatná odchylka
Snížené procento B7.2+ B lymfocytů v krvi a plazmatických buněk v krvi a slezinách u myší ošetřených hBAFF-R-Ig po imunizaci s SRBCs svědčí pro to, že existuje inhibice aktivace a/nebo maturace B lymfocytů a potenciálně zvýšená eliminace aktivovaných B lymfocytů. Velmi malé procento antigenně specifických B lymfocytů bylo aktivováno a odpovídalo na nějaký antigen, v tomto případě SRBC. Protože ošetření hBAFF-R-Ig mělo za následek takovou dramatickou redukci procenta B lymfocytů ve všech vyšetřovaných tkáních, -50 %, zdá se, že aktivita hBAFF-R-Ig také cílí na klidové, zralé B lymfocyty.
Předpokládá se tedy, že fúzní protein BAFF-R může být použit jako léčivo s klinickou aplikací u nemocí zprostředkovaných B lymfocyty. K těmto nemocem patří ty, které jsou autoímunitní povahy, jako je například systémový lupus erythematosus, myasthenia gravis, autoímunitní hemolytická anémie, idiopatická trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteriitis nodosa a rychlá progresivní glomerulonefritida. Léčivo je také použitelné u chorob plazmatických buněk, jako je
- 15CZ 300364 B6 například mnohočetný myelom, Waldenstromova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární amyloidóza nebo amyloidóza, sdružená s imunocyty a idiopatická monoklonální gamapatie (MGUS). Onkologické cíle zahrnují karcinomy, leukémie a lymfomy pocházející z B lymfocytů.
.
Příklad 9
Blokování proliferace B lymfocytů indukované BAFF in vitro použitím rozpustného BAFF-R
V tomto příkladu původci prokázali, že rozpustný fúzní protein BAFF-R:hIgGl je schopný io blokovat proliferaci B lymfocytů indukovanou BAFF v myších splenocytech.
Myší spíenocyty (5 x 105 buněk/ml) z myší Balb/c byly izolovány á pěstovány na 96 jamkových destičkách ve 100 μΙ RPM1 (Life Technologies) doplněném 10% fetálním telecím sérem (JRH), 2mM glutaminem, 100 jednotkami/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu (Life Techno15 logies). Pak byla přidána různá množství humánního BAFF, humánního BAFF-R:hIgGl v koncentraci 10pg/m! nebo humánního Ig, jakož i ΙΟμβ/πιΙ anti-myšího povrchového těžkého řetězce μ (Jackson ImunoResearch). Po 48 hodinách v tkáňové kultuře ve 37 °C byl buňkám podán impulz po dobu 24 hodin 1 pCi/jamku [methyl-3H]thymidinu (DupontNEN) a buňky byly , sklizeny s použitím přístroje na sklízení buněk Tomtec (Orange, CT). Radioaktivita byla měřena scintilačním počítačem pro kapaliny Betaplate (Pharmacia Bioteeh).
Obrázek 8 ukazuje výsledky test proliferace splenocytů. Jsou ukázány impulzy za minutu (CPM) inkorporované do myších splenocytů oproti množství přidaného humánního BAFF. Stupeň anti-μ nebo fúzního proteinu nebo kontrolního hlgG je udržován v konstantní koncentraci
10 pg/ml. Plné čtverečky představují stupeň proliferace indukované samotným BAFF. Plná kolečka představují proliferaci buněk s BAFF a anti-μ. Křivka s prázdnými trojúhelníčky představuje inhibiei pozorovanou, když je přidán BAFF-R:hIgGlBAFF s anti-μ plus BAFFRihlgGl. Prázdný kosočtverec představuje inhibiei pozorovanou při použití kontrolního humánního Ig.
Přidání BAFF plus anti-μ má za následek proliferaci myších splenocytů in vitro. Hladina 3H thymidinu inkorporovaného do buněk je významně vyšší než hladina získaná, když je ke splenocytům přidán buď samotný BAFF, nebo samotná anti-μ. Ošetření splenocytů se samotným BAFF má za následek inkorporací 3H thymidinu pouze při velmi vysokých koncentracích.
Přidání samotného anti-μ nemá za následek proliferaci. Když byl přidán kontrolní humánní Ig v koncentraci 10 pg/ml ke splenocytům se stoupajícím množstvím BAFF a anti-μ v koncentraci 10 pg/ml, nastal mírný pokles stupně proliferace. Na rozdíl od toho, když byl do testu přidán fúzní protein humánní BAFF-R:hlgGl v koncentraci 10pg/ml za stejných podmínek, rozsah proliferace byl redukován na stupeň pozorovaný pro ošetření samotným BAFF. To ukazuje, že fúzní protein BAFF-R:hlgGl je schopen inhibovat proliferaci splenocytů indukovanou BAFF a anti-μ.
Příklad 10
Blokáda vazby BAFF k buňkám Ráji použitím BAFF-R:hIgGl
V tomto příkladu je popsána preinkubace BAFF s fúzním proteine BAFF-R:hlgGl, která má za následek redukci BAFF vazby k buněčné linii Ráji lymfomu z B lymfocytů.
V tomto FACS testu bylo 200 ng/ml FLAG-značeného („FLAG-tagged“) humánního BAFF preinkubovaného buď s humánním BAFF-R:hIgGl, nebo humánním LTpR:htgGl ve dvojkových ředěních v rozmezí od 20 pg/ml do 39 ng/ml nebo bez fúzního proteinu po dobu 30 minut na ledu. Inkubace byly prováděny ve FACS pufru obsahujícím PBS bez Ca2+ nebo Mg2+ a 10%
-16CZ 300364 B6
FCS (JRH) a 0,05% azid sodný. Po preinkubaci byla směs BAFF-fúzního proteinu přidána k 5 x 106 Ráji (ATCC) buněk/ml. Tato inkubace probíhala po dobu 30 minut na ledu a buňky byly poté promyty 2 ml FACS pufru ve 4 °C. Aby se detekoval navázaný BAFF, byla k buňkám přidána anti-FLAG protilátka M2 (Sigma) v koncentraci 5 μ§/ηιΙ a inkubována po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly opět promyty, jak uvedeno výše, a poté byly inkubovány s 1:100 ředěním oslího proti-myšího Ig (Jackson ImunoResearch) konjugovaného s PE po dobu 30 minut na ledu. Pak byly buňky opět promyty FACS pufrem, byly fixovány 1% paraformaldehydem a odečítány přístrojem FACS® (Becton Díckinson a Co.) io Obrázek 9 ukazuje výsledky BAFF blokujícího testu. Jsou ukázány MFI (průměr intenzity fluorescence) údaje, které jsou výsledkem analýzy FACS® vyšetřující vazbu BAFF k buňkám Ráji. Plné čtverečky představují data, kdy humánní BAFF-R:hIgGI byla preinkubována s BAFF před vazbou k buňkám. Kroužky ukazují křivku, která je důsledkem přidání nespecifického fúzního proteinu, humánního LT3R:hIgGl, k BAFF. Osa x představuje množství fúzního proteinu přidaného k BAFF v koncentraci 200 ng/ml před inkubací s buňkami.
Když nebyl s humánním BAFF preinkubován žádný fúzní protein, průměrná intenzita fluorescence (MFI) vzorku byla 80. Když byl s BAFF preinkubován humánní LTpR:hIgGl, dokonce i v koncentraci 20 μg/ml, detekce vazby BAFF k buňkám Ráji byla nezměněna. Když byl ale s BAFF preinkubován humánní BAFF-R:hlgGl, nastalo podstatné snížení MFI, až k 20-25, dokonce i při koncentraci fúzního proteinu 625 ng/ml. Pozadí MFI pro tento pokus bylo 7, BAFF-R:hIgG I je tedy velmi účinný při blokování vazby BAFF k B lymfocytům Ráji.
Příklad 11
BAFF-R-lgG zmírňuje autoimunitní chorobu typu lupus u transgenních myší
Tento příklad popisuje účinek BAFF-R-Ig na snížení počtu periferních B lymfocytů a inhibici rozvoje splenomegalie a nefritidy.
V pokuse byly použity pět měsíců staré BAFF transgenní (Tg) myši (C57BL/6) a věkově srovnatelné kontrolní myši. U BAFF Tg myší se manifestovaly onemocnění lymfocytů a autoimunitní fenotyp podobný k systémovému lupus erythematosus (Mackay et al., 1999). Tento fenotyp zahrnuje zvýšení periferních populací B lymfocytů včetně přechodné 1 (TI) a 2 (T2), zralé (M), marginální zóny (MZ) a B lymfocytů CDl, sh/IgMhlgh.
Myši dostaly i.p. PBS, 400 μg puntíkovaného humánního IgG (hlg) (Sandoz, Bazilej, Švýcarsko) (3/skupina) nebo 400 μg fúzního proteinu humánního BAFF-R-hulgGl pocházejícího z buněk CHO (hBCMA-Ig) (2/skupina) ve dnech 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35 a byly utraceny v den 40.
V čase utracení zvířat byla zvážena slezina a byly připraveny jednoduché buněčné suspenze po lýzi červených krvinek v hypotonickém pufru. Byla prováděna průtoková cytometrie s použitím FITC-konjugované anti^CD21/CD35, PE-konjugované anti-IgD a antiCDl, anti-CD45R/B220 konjugované s Cychrome a anti-IgM konjugované s biotinem. Všechny mAbs byly zakoupeny od firmy Pharmingen (San Diego, CA). Stručně, Fc receptory byly blokovány činidlem „Fc
Block“ (Pharmingen) v koncentraci 10 pg/ml po dobu 10 minut na ledu, pak následovalo přidání mAbs konjugovaných s biotinem po dobu 30 minut na ledu, buňky byly Ix promyty, pak následovalo přidání Abs konjugovaných s FITC, PE, Cychrome, streptavidin APC a FcBlock v koncentraci 10 pg/ml. Buňky byly inkubovány po dobu 30 minut na ledu, Ix promyty a suspendovány v 0,5% paraformaldehydu. Data fluorescence buněk byla získána na přístroji FACSCalibur (průtokový cytometr, Becton Dickinson, San Jose, CA) a analyzována s použitím softwaru CELLQuest (Becton Dickinson).
- 17CZ 300364 B6
Výskyt proteinů v moči myší byl měřen s použitím reagenČních proužků Multistix 10 SG pro analýzu moči (Bayer Corp., Diagnostics Division).
Výsledky jsou ukázány v tabulkách 1 IA a 11B níže.
Tabulka 11A
Analýza splenocytů ve 3 měsících
Celkový počet buněk na slezinu (x 106)
TI T2 MZ Zralé
Myši BAFF Tg
816E23 9,4 18 9 91
816E33 14 30 19 170
816E99 14 24 19 150
Průměr ’ 13 +/- 2,6 24 +/- 6 16 +/- 5,7 140 +/- 41
Kontrolní myši
816E2 5,3 5,8 3,1 73
816E4 2,4 3,7 1,9 44
Průměr 3,9 + /- 2 4,8 +/- 1,5 2,4 +/- 1 59 +/- 20
io
Sleziny myší Baff Tg starých 3 měsíce (n=3) a věkově srovnatelných kontrolních myší (n=2) byly izolovány a podrobeny analýzám FACS tak, jak bylo popsáno v části Materiál a metody. TI, T2, M a MZ buňky byly definovány expresí následujících povrchových markérů (hi:high vysoký, lo:low - nízký, intintermediate - střední):
TI:lgD , lgMhisl\CD2l'°
MZ:IgD, IgM“ CD21 T2:IgD+, IgMhí,CD21hi .
M:IgD+, IgM10, CD21ínt
Tabulka 11B
Analýza splenocytů ve 10 měsících
Celkový počet buněk na slezinu (xlO6)
TI T2 MZ Zralé
Myši BAFF Tg
802-39 13 100 34 630
823-3-11 7,5 43 6,6 200
823-3-13 3,1 50 15 180
Průměr 7,9 4 •Z- 4,9 64 +/- 30 19 +/- 10 340 +/- 250
Kontrolní myši
823-3-22 o,7 6,5 1,4 56
802-64 0,28 5,4 1,3 38
823-14-13 0,45 3,4 0,16 38
Průměr 0,48 +/- 0,21 5,1 +/- 1*5 0,95 +/- 0,65 44 +/- 10
-18CZ 300364 B6
Myši BaffTf staré 10 měsíců (n=3) a věkově srovnatelné kontrolní myši (n=3) byly podrobeny analýzám FACS tak, jak bylo popsáno v tabulce 1.
Po podávání hBAFF-R-Ig myším BAFF Tg byly významně redukovány populace Tl, T2, M, MZ a CDlh,gh/IgMhigh B lymfocytů ve slezině, ve srovnání s myšmi Baff Tg ošetřenými PBS a hlg, celkové počty Tl, T2, Μ, MZ a CDl1 gh/ígMt Bh B lymfocytů byly redukovány na počet podobný nebo nižší než u kontrolních myší ošetřených PBS (Fig. 10a, 10b, 10c).
ío BAFF-R-Ig ošetření myší Baff Tg mělo za následek zmírnění auto imunitního onemocnění zprostředkovaného Baff, jak bylo prokázáno pozorováním, že myši ošetřené BAFF-R měly sleziny normální velikosti, zatímco u kontrolně ošetřených myší Baff Tg byla prokázána splenomegalie (obr. 11), Kromě toho byt u myší ošetřených BAFF-R-Ig inhibován rozvoj proteínurie, indikátoru renální dysfunkce, zatímco u kontroly ošetřených myší Baff Tg se rozvinula nefritida, jak bylo zjišťováno zvýšením stupně proteínurie (viz obr. 12).
Myši transgenní v Baff měly vysoce zvýšené pocty periferních B lymfocytů a další analýzy těchto myší odhalily zvýšení převážně subpopulací Tl, T2 a MZ B lymfocytů. Přechodný stupeň vývoje B lymfocytů (Tl a T2) je kontrolní bod, kdy jsou autoreaktivní B lymfocyty pravdě20 podobně odstraněny. CDlh'6h/IgM1”eh2B lymfocyty, které mají tendenci usadit se v marginální zóně, byly také u myší Baff Tg vysoce zvýšené. Bylo ukázáno, že tato poslední populace B lymfocytů byla hlavní zdroj produkce autoprotilátek u lupoidních myší NZB/NZW. Ošetření myší Baff Tg s BÁFF-R-Ig mělo za následek redukci populací Tl, T2, MZ a CDlhl B lymfocytů na počet podobný nebo nižší než počet nalezený u kontrolních myší divokého typu.
BAFF-R-Ig způsobil snížení počtu periferních B lymfocytů a inhibovat rozvoj splenomegalie a nefritidy. Tudíž, kromě jeho použitelností u systémového lupus erythematosus a lupusové nefritidy, účinek BAFF-R-lg je také užitečný u B nemocí zprostředkovaných B lymfocyty, které jsou autoimunitní povahy, jako je například systémový lupus erythematosus, myasthenia gravis,
30. autoimunitní hemolytická anemie, idiopatícká trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenérova granulomatóza, polyarteriitis nodosa a rychlá progresivní glomerulonefritida. Léčivo je také použitelné u chorob plazmatických buněk, jako je například mnohočetný myelom, Waldenstrómova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární amyloidóza nebo amyloidóza sdružená s imunocyty a idiopatícká monoklonální gamapatie (MGUS). Onkologické cíle zahrnují karcinomy, leukémie a lymfomy pocházej ící z B lymfocytů.
Příklad 12
Průměrný arteriální tlak u BAFF transgenních myší
Tento experiment popisuje měření krevního tlaku u BAFF transgenních myší. Pozorování učiněná v průběhu vyhodnocování fenotypu BAFF transgenních myší ukazovala na potenciální hypertenzi u myší.
Baff Tg myši popsané již výše byly podrobeny anestezi ketaminem. Levá karotida byla incizí na krku obnažena. Do karotidy byl vložen katétr pro měření krevního tlaku a srdeční činnosti. Katétr byl spojen se tlakovým snímačem a krevní tlak byl měřen pomocí Gouldova datasběrného systému a Gouldova polygrafii (Po-Ne-Mah Data Acquisition systém and Gould polygraph). Z průběhu tlakových vln byl určen systolický tlak, diastolický tlak, průměrný tlak a srdeční frekvence. Byly užity dvě skupiny myší: BAFF transgenní myši (n=8) a kontrolní myši divokého typu (n=9).
Obrázek 1.3 ukazuje průměry z hodnot průměrných arteriálních tlaků, MAP (v mmHg) pro dvě skupiny myší. Jak je ukázáno, BAFF transgenní myší měly průměrný MAP 102 ± 8 mmHg.
-19CZ 300364 B6
Kontrolní myši měly průměrný MAP 92 ± 6mmHg. Takže BAFF myši vykazovaly 10 mmHg zvýšení ve srovnání s kontrolními zvířaty, i když tento rozdíl nebyl statisticky průkazný (ANOVA).
Podrobnější analýza těchto dat je uvedena na obrázku 14, kde jsou uvedeny výsledky měření jednotlivých zvířat. U kontrolních'myší divokého typu (BAFF-) distribuce hodnot vykazuje typické binomické rozdělení. Naproti tomu tlaky u BAFF transgenních myší (BAFF+) jeví distribuci do dvou skupin, jedna skupina v rozmezí 120 až 130 mmHg a druhá skupina v rozmezí 80 až 90 mmHg.
Jako populace mají BAFF transgenní myší tendenci k hypertenzi ve srovnání s negativními kontrolními myšmi.
Analýza individuálních hodnot arteriálního tlaku ukázala, že tlak dělí. BAFF transgenní myši na dvě subpopulace, jednu s vysokým krevním tlakem a druhou s normálním krevním tlakem. Podávání rozpustného BAFF-R, fúzního proteinu nebo homologu protilátky může zmírnit účinky hypertenze.
Příklad 13
Léčení myší SNFt sjiž rozvinutou nemocí podáváním BAFF-R-Ig zpomaluje progresi silné nefritidy
Samice myší (SWR x NZB)F1 (SNFi) náchylné klupusu ve stáří 21 týdnů vykazující příznaky mírné nefritidy (proteinurie 30 až 100 mg/dl), dostávaly po dobu 8 týdnů jedenkrát týdně i.p.
injekci 200 pg fúzního proteinu humánního BAFF-R-hulgGI (hBCMA-Ig), humánní IgG (HulgG) (Sandoz) nebo 200 μΙ PBS.
Moč každé myší byla monitorována týdně na proteinurii pomocí zařízení Albustix (Bayer Corp., Terrytown, NY). Proteinurie vyšší než 100 mg/dl byla hodnocena jako závažná nefritida. BAFF30 R-Ig byl produkován vtranzientně transfekovaných buňkách EBNA 293. Upravené médium z buněk 293 expritnujících hBCMA-Ig bylo naneseno na proteinovou kolonu. Protein byl eluován užitím pufru obsahujícího 25 mM fosfát, 100 mM NaCI, pH 2,8, po neutralizaci 1/20 objemu 0,5 M NaPCb pH 8,6. Frakce vybrané na základě měření OD280 byly analyzovány SDSPAGE v redukujících a neredukujících podmínkách a dále Western bloty, aby byl identifikován puřifikovaný protein.
Tři týdny po ukončení léčení 50 % myší léčených BAFF-R-lg vykazovalo závažnou néfritidu, ve srovnání se 75 a 87,5 % myší, které dostaly HulgG a PBS (viz obrázek 15). Tato data ukazují, že rozpustný BAFF receptor, BCMA-Ig, působí tak, že blokuje autoimunitní nemoc zprostředkova40 nou B lymfocyty jako je lupusová nefritida, což vede ke značnému zpomalení progrese nemoci.
Příklad 14
Podávání BAFF-R-Ig normálním myším vede ke snížení počtu dendritických buněk (DC) ve slezině a atypické lokalizaci ve slezině
Samice sedm týdnů starých myší BALB/c (3/skupina) dostávaly 1. x týdně po dobu 4 týdnů i.p, injekci 20 nebo 50 pg humánního BAFF-R-IgGI (hBCMA-Ig), 50 pg humánního IgG (HulgG) nebo 100 μ PBS. Fúzní protein hBCMA-Ig byl purifikován ze supernatantu kultury trvale transfekovaných buněk. Sleziny byly získány 8 dnů po poslední injekci a ošetřeny kolagenázou (Sigma, katalog, č. C-5138) 1 hodinu při 37 °C. Byla připravena suspenze jednotlivých buněk, červené krvinky (RBC) byly lyžovány v hypotonickém pufru a buňky byly opláchnuty 3x v PBS. Splenocyty byly připraveny pro průtokovou cytometrickou analýzu obarvením pomocí anti-20CZ 300364 B6
CD1 lc-biotinu následovaném streptavidin-APC, anti-CD8a-cychrom a anti-CD4-FITC pro vyhodnocení populací DC.
V odděleném experimentu samice myší BALB/C (N=3) dostávaly po 4 týdny 1 x za týden i.p. 5 injekci 100 pg hBCMA-Ig, pak byly odebrány sleziny a bleskově zamraženy v OCT užitím
2-methylbutanu zmraženém na CO2. Byly připraveny kryořezy a fixovány v acetonu. Řezy byly inkubovány s anti-CDllc-biotinem následovaným streptavidin-AP a substrátem BCIP (Pierce) pro vizualizaci DC, monoklonální protilátkou MOMA-1 následovanou anti-potkanní IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) a substrátem 3,3'-diaminobenzidinem (Sigma, St. Louis MO, io katalog, č. D-1293) pro vizualizaci metalofilních makrofágů, a anti-CD35-biotinem následovaným streptavidin-AP a substrátem (Alkaline Phosphatase Substráte Kit I, Vector, katalog, č. SK5100) pro vizualizaci folikulárních dendritických buněk (FDC).
Myši in vivo léčeny podáváním 20 nebo 50 pg BCMA-Ig 1 x týdně po dobu 4 týdnů vykazovaly ís významné snížení (p<0,05 ve Studentově t-testu) počtu slezinných CDllc+ DC ve srovnání s kontrolami, kterým se podával HulgG nebo PBS. Toto snížení bylo pozorováno u všech zkoumaných populací CDllc+ DC: CD8a-CD4-, CDB8+ CD4-, a CD8a-CD4+ (viz obrázek
16, tabulka 14A).
Tabulka 14A
Podávání BAFF-R-Ig vede ke snížení počtu DC ve slezině
PBS HulgG· 20 pg BCMA-Ig. 50 pg BCMA-Ig
Průměrný počet CD11+ DC (xlO6) ± směrodat. odchylka
CD8a-CD4- 0,81 ± 0,15 0,49 ± 0,07 0,26 ± 0,04 0,35 + 0,05
CD8a+CD4- 0,36 ± 0,02 0,35 ± 0,07 0,16 + 0,02 0,2 ± 0,02
CD8a-CD4+· 0,92 ± 0,02 0,84 ± 0,15 0,4 ± 0,06 0,55 ± 0,04
Tento pokles slezinných DC, což jsou kritické buňky prezentující antigen, má dopad na aktivaci
B lymfocytů, jejich zrání a celkovou humorální imunitu.
Zmražené řezy ze sleziny myší byly připraveny jak bylo popsáno v části Materiály a metody. Myši léčené BCMA-Ig vykazovaly atypický profil usazování DC, když byly vzorky obarveny anti-CDl lc, DC jsou normálně lokalizovány uvnitř oblastí T lymfocytů v bílé dřeni a marginální zóně, s tím, že k jejich koncentraci dochází v můstkových kanálcích marginální zóny. Avšak bylo zjištěno, že DC z myší léčených BCMA-Ig se vyskytují podél hranice marginální zóny a jen několik málo bylo schopno migrovat hlouběji do bílé dřeně (data nejsou uvedena). Tudíž blokování interakce BAFF/BAFF-R užitím rozpustného receptoru BAFF se zdá narušovat profil osidlování DC, což zřejmě ovlivňuje jejich schopnost fungovat jako buňky prezentující antigen, a tudíž má důsledky pro aktivaci a zrání B lymfocytů a také humorální imunitu. Navíc sleziny myší léčených BCMA-Ig postrádají CD35+ FDC, jak bylo zjištěno imunohistochemickou analýzou (data neuvedena). Jelikož funkcí FDC je prezentovat antigen B-lymfocytům v germinálních centrech (GC), nedostatek těchto buněk může mít škodlivý účinek na strukturu GC a afinitní zrání B lymfocytů.
Odborníkovi je jasné, že jsou možné různé modifikace a varianty polypeptidů, přípravků a způsobů podle vynálezu, avšak v rámci shodné vynálezecké myšlenky předloženého vynálezu, I tyto případné modifikace a varianty spadají do rozsahu vynálezu, který je definován připojenými patentovými nároky a jejich ekvivalenty.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. (a) Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 80% identitu se sekvencí znázorněnou zde jako aminokyselina 1 až aminokyselina 51 v SEKVENCI ID. C. 1, (b) protilátka namířená proti SEKVENCI ID. Č. 1, (c) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je zde znázorněna od aminokyseliny 8 do aminokyseliny 41 v SEKVENCI ID. Č. 1, io pro použití jako léčivo.
  2. 2. Použití (a) polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 80% identitu se sekvencí znázorněnou zde jako aminokysel ina 1 až aminokyselina 51 v SEKVENCI ID. C. 1,
    15 (b) protilátky namířené proti SEKVENCI ID. Č. 1, (c) polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která je zde znázorněna od aminokyseliny 8 do aminokyseliny 41 v SEKVENCI ID. Č. 1, , pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení autoimunitních poruch, lymfoproliferativních poruch B lymfocytů nebo zánětů u savců.
  3. 3. Použití podle nároku 2, kdy polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 80% identitu se sekvencí od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 51 ze SEKVENCE ID.
    v
    C. 1.
    25
  4. 4. Použití podle nároku 2 nebo 3, kdy polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 51 ze SEKVENCE ID, Č. 1.
  5. 5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4, kdy polypeptid dále obsahuje Fc doménu imunoglobulinu.
  6. 6. Použití podle nároku 5, kdy imunoglobulin je IgG.
  7. 7. Použití podle nároku 6, kdy imunoglobulin je lidský.
    35
  8. 8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, kdy farmaceutická kompozice inhibuje růst B lymfocytů u savců.
  9. 9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, kdy farmaceutická kompozice inhibuje produkci imunoglobulinu u savců.
  10. 10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, kdy farmaceutická kompozice inhibuje růst B lymfocytů indukovaný dendritickými buňkami u savců.
  11. 11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 10, kdy savec je člověk.
CZ20020579A 1999-08-17 2000-08-16 Farmaceutický prípravek obsahující polypeptid BCMA nebo protilátku proti tomuto polypeptidu CZ300364B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14937899P 1999-08-17 1999-08-17
US18168400P 2000-02-11 2000-02-11
US18353600P 2000-02-18 2000-02-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2002579A3 CZ2002579A3 (cs) 2002-05-15
CZ300364B6 true CZ300364B6 (cs) 2009-04-29

Family

ID=27386828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20020579A CZ300364B6 (cs) 1999-08-17 2000-08-16 Farmaceutický prípravek obsahující polypeptid BCMA nebo protilátku proti tomuto polypeptidu

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7083785B2 (cs)
EP (3) EP2314694A3 (cs)
JP (4) JP4787439B2 (cs)
KR (2) KR100897082B1 (cs)
CN (1) CN100447244C (cs)
AT (1) ATE360693T1 (cs)
AU (1) AU780240B2 (cs)
BG (1) BG106519A (cs)
BR (2) BR0013391A (cs)
CA (1) CA2383154C (cs)
CZ (1) CZ300364B6 (cs)
DE (1) DE60034579T3 (cs)
DK (1) DK1210425T4 (cs)
EA (1) EA004635B1 (cs)
EE (1) EE05673B1 (cs)
GE (1) GEP20053685B (cs)
HK (1) HK1043608B (cs)
HU (3) HU230583B1 (cs)
IL (3) IL148089A0 (cs)
IS (1) IS2955B (cs)
MX (1) MXPA02001665A (cs)
NO (2) NO331410B1 (cs)
NZ (1) NZ517782A (cs)
PL (2) PL207501B1 (cs)
RS (1) RS51157B (cs)
SK (2) SK288287B6 (cs)
TR (1) TR200201063T2 (cs)
UA (1) UA75049C2 (cs)
WO (1) WO2001012812A2 (cs)

Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) * 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
WO2000068378A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EE05673B1 (et) 1999-08-17 2013-08-15 Biogen, Inc. BAFF-retseptor (BCMA), immunoregulatoorne agens
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
PT1255558E (pt) * 2000-02-16 2006-11-30 Genentech Inc Anticorpos anti-april e células hibridoma
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7371388B1 (en) * 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
CA2408617A1 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
ATE494304T1 (de) 2000-06-16 2011-01-15 Human Genome Sciences Inc Immunspezifisch bindende antikörper gegen blys
US7879328B2 (en) * 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
MXPA03010687A (es) 2001-05-24 2004-07-01 Zymogentetics Inc Proteinas de fusion de taci-inmunoglobulina.
CN1636067A (zh) * 2001-08-03 2005-07-06 杰南技术公司 TACls和BR3多肽及其用途
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
BR0313033A (pt) * 2002-07-25 2007-07-10 Genentech Inc anticorpos, anticorpos monoclonais, linhagens de células de hibridoma, anticorpos receptores de anti-taci isolados, anticorpos anti -taci, métodos de modulação da atividade biológica
CA2520097C (en) 2003-03-28 2014-10-07 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
MXPA05013117A (es) * 2003-06-05 2006-03-17 Genentech Inc Terapia de combinacion para trastornos de celulas-b.
WO2005042009A1 (en) 2003-10-20 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. Therapeutic regimens for baff antagonists
JP2008505607A (ja) * 2004-01-29 2008-02-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂｃｍａの細胞外ドメインの変異体とその使用法
WO2006052493A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 Genentech, Inc. Polypeptides that bind baff and/or april
EP1836224A1 (en) 2004-12-23 2007-09-26 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
EP1855711B1 (en) * 2005-01-28 2009-06-17 Biogen Idec MA Inc. USE OF BAFF TO TREAT Th2-MEDIATED CONDITIONS
US8808696B2 (en) 2005-08-09 2014-08-19 Ares Trading S.A. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules
JP2009507777A (ja) 2005-08-09 2009-02-26 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合分子を用いたＢ細胞性腫瘍の処置方法
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
EP1933873A4 (en) * 2005-10-13 2009-12-02 Human Genome Sciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PATIENTS WITH POSITIVE DISEASES FOR SELF-ANTIBODIES
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
WO2007062090A2 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
MX2008014365A (es) 2006-05-15 2008-11-27 Ares Trading Sa Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias utilizando una molecula de fusion del activador de transmembrana-inmunoglobulina.
EP2315780B8 (en) 2008-07-17 2015-09-23 Novartis AG Compositions and methods of use for therapeutic antibodies
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
EP2396035A4 (en) * 2009-02-12 2012-09-12 Human Genome Sciences Inc USE OF ANTAGONISTS OF PROTEIN STIMULATING LYMPHOCYTES B TO PROMOTE GRAFT TOLERANCE
KR101589785B1 (ko) * 2009-03-10 2016-01-28 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 항-ｂｃｍａ 항체
IN2012DN02485A (cs) 2009-09-03 2015-08-28 Hoffmann La Roche
CN101781680B (zh) * 2009-10-19 2012-05-09 南通大学附属医院 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法
WO2011108008A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Transgene Biotek Ltd. Antibody for targeted induction of apoptosis, cdc and adcc mediated killing of cancer cells, tbl-cln1
BR112013021725A2 (pt) 2011-02-28 2016-11-01 Genentech Inc marcadores biológicos e métodos para prever resposta aos antagonistas de células b
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
US20140105915A1 (en) * 2011-05-27 2014-04-17 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) - binding proteins
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
JP2015506950A (ja) 2012-01-31 2015-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｇ−ｅｍ１’抗体およびそれを用いる方法
WO2015100246A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
BR112016018100A2 (pt) 2014-02-07 2018-02-20 Univ Mcmaster acoplador antigênico de células t trifuncional, métodos e usos do mesmo
CN106163547A (zh) 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
KR20250067191A (ko) 2014-09-17 2025-05-14 노파르티스 아게 입양 면역요법을 위한 키메라 수용체에 의한 세포독성 세포의 표적화
SI3226897T1 (sl) 2014-12-05 2021-08-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Protitelesa, ki ciljajo na B-celični maturacijski antigen, in postopki uporabe
SG11201704549UA (en) 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
EP3283520B1 (en) 2015-04-13 2020-05-06 Pfizer Inc Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
DK3988117T3 (da) 2015-04-13 2025-01-20 Pfizer Terapeutiske antistoffer og deres anvendelser
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
FI3380620T3 (fi) 2015-11-23 2024-08-01 Novartis Ag Optimoituja lentiviruksen siirtovektoreita ja niiden käyttötapoja
WO2017114497A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
CN116063503A (zh) 2016-02-17 2023-05-05 思进股份有限公司 Bcma抗体和其用以治疗癌症和免疫病症的用途
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
EP3464374B1 (en) 2016-06-06 2025-08-06 City of Hope Baff-r antibodies and uses thereof
CA3029209A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
KR20250088655A (ko) 2016-09-14 2025-06-17 테네오원, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
IL317134A (en) 2016-12-21 2025-01-01 Teneobio Inc An antibody containing only heavy chains that binds a human B-cell maturation antigen, a pharmaceutical composition containing the same, its use in the treatment of B-cell disorders and a method for its preparation
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
IL270415B2 (en) 2017-05-12 2024-08-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
KR102742528B1 (ko) 2017-06-20 2024-12-16 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
AU2018301393B2 (en) 2017-07-11 2025-02-27 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human CD137 and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
WO2019071358A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University Y182T MUTATION T CELL ANTIGEN COUPLEUR AND METHODS AND USES THEREOF
MX2020004013A (es) 2017-10-18 2021-01-08 Novartis Ag Composiciones y metodos para la degradacion selectiva de proteinas.
WO2019081983A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Novartis Ag CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
SG11202003501XA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
CN111902159A (zh) 2017-11-01 2020-11-06 朱诺治疗学股份有限公司 对b细胞成熟抗原（bcma）具有特异性的嵌合抗原受体
CA3080395A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
AU2018369883A1 (en) 2017-11-15 2020-05-28 Novartis Ag BCMA-targeting chimeric antigen receptor, CD19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
WO2019100052A2 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
EP3717907A1 (en) 2017-11-30 2020-10-07 Novartis AG Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
TW201930591A (zh) 2018-01-08 2019-08-01 瑞士商諾華公司 用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強rna
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
EP3746116A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Novartis AG Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019213282A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
SG11202011080QA (en) 2018-05-11 2020-12-30 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US11492409B2 (en) 2018-06-01 2022-11-08 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
KR20210020932A (ko) 2018-06-13 2021-02-24 노파르티스 아게 Bcma 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
JP7554742B2 (ja) 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
MX2021000532A (es) 2018-07-19 2021-04-12 Regeneron Pharma Receptores antigénicos quiméricos con especificidad para bcma y usos de estos.
AU2019331496A1 (en) 2018-08-31 2021-03-18 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
ES3032659T3 (en) 2019-02-15 2025-07-23 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
SG11202107825WA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
SG11202111027WA (en) 2019-04-05 2021-11-29 Teneobio Inc Heavy chain antibodies binding to psma
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
JP2022531185A (ja) 2019-04-30 2022-07-06 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 遺伝子改変ｔ細胞を標的化するｃｄ１９を使用するｂ細胞悪性病変の同種細胞療法
MY209533A (en) 2019-05-21 2025-07-17 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
JOP20210323A1 (ar) 2019-06-14 2023-01-30 Teneobio Inc ارتباط أجسام مضادة ثقيلة السلسلة ومتعددة النوعية بـ cd22 وcd3
US20220257796A1 (en) 2019-07-02 2022-08-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
AU2020393912A1 (en) 2019-11-26 2022-06-09 Novartis Ag Chimeric antigen receptors binding BCMA and CD19 and uses thereof
BR112022011998A2 (pt) 2019-12-20 2022-08-30 Novartis Ag Usos de anticorpos anti-tgfss e inibidores de checkpoint para o tratamento de doenças proliferativas
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
IL295604A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
KR20250007022A (ko) 2020-04-29 2025-01-13 테네오원, 인코포레이티드 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 다중특이적 중쇄 항체
WO2021252920A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
KR20230027056A (ko) 2020-06-23 2023-02-27 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CA3189154A1 (en) * 2020-08-12 2022-02-17 Amato J. Giaccia Sbcma variants and fc fusion proteins thereof
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
GB2623199A (en) 2021-04-08 2024-04-10 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules binding to TCR and uses thereof
AR125468A1 (es) 2021-04-27 2023-07-19 Novartis Ag Sistema de producción de vectores virales
AU2022283819A1 (en) 2021-06-01 2024-01-04 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
JP2024529128A (ja) 2021-08-11 2024-08-01 アクソ バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド ｓＢＣＭＡバリアント及びそのＦＣ融合タンパク質を使用するＩｇＡ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＧの産生を低減する方法
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
CN120112650A (zh) 2022-10-26 2025-06-06 诺华股份有限公司 慢病毒配制品
US12173081B2 (en) 2023-03-21 2024-12-24 Biograph 55, Inc. CD19/CD38 multispecific antibodies
WO2024243441A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Kumquat Biosciences Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043032A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
DK0897390T3 (da) 1996-03-14 2004-03-08 Human Genome Sciences Inc Human tumornekrosefaktor-delta og -epsilon
AU731553B2 (en) 1996-10-25 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine alpha
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
EP0975754B2 (en) 1997-04-16 2016-01-06 Amgen Inc., Osteoprotegerin binding proteins and their receptors
IL133316A0 (en) 1997-06-06 2001-04-30 Regeneron Pharma Ntn-2 member of tnf ligand family
EP1012292A1 (en) 1997-06-06 2000-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
HUP0004034A3 (en) 1997-09-12 2002-08-28 Apotech R & D Sa Kay - a novel immune system protein
TR200000669T2 (tr) * 1997-09-12 2000-08-21 Apotech R & D Sa Büyüme etkinliğine sahip yeni bir protein-APRIL.
WO1999013078A1 (en) 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. Cysteine rich receptors-train
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6297367B1 (en) 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
DE69921718T2 (de) * 1998-04-01 2005-12-22 Solvay Solexis, Inc., Wilmington Verträgliche Mischungen aus Polyvinylidenfluorid und aromatischem Polyimid
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
CZ303272B6 (cs) † 1999-01-07 2012-07-11 Zymogenetics, Inc. Farmaceutický prostredek obsahující fúzní protein, izolovaná molekula polynukleotidu, expresní vektor, kultivovaná bunka, zpusob prípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
AU3380200A (en) 1999-02-24 2000-09-14 General Hospital Corporation, The Method for cloning signal transduction intermediates
AU3633000A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EE05673B1 (et) 1999-08-17 2013-08-15 Biogen, Inc. BAFF-retseptor (BCMA), immunoregulatoorne agens
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
CA2399387C (en) 2000-02-11 2015-11-03 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
PT1255558E (pt) † 2000-02-16 2006-11-30 Genentech Inc Anticorpos anti-april e células hibridoma
US20040013674A1 (en) 2001-04-27 2004-01-22 Christine Ambrose Taci as an anti-tumor agent
CA2408617A1 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
ATE494304T1 (de) 2000-06-16 2011-01-15 Human Genome Sciences Inc Immunspezifisch bindende antikörper gegen blys
CA2419661A1 (en) 2000-08-15 2002-03-07 Guo-Liang Yu Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
WO2003072713A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
US7083735B2 (en) 2003-09-03 2006-08-01 Laing David A High debris content strainer
US20140105915A1 (en) 2011-05-27 2014-04-17 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) - binding proteins
FR3005792B1 (fr) 2013-05-16 2017-12-29 Parknplug Procede de gestion dynamique et previsionnel du rechargement electrique de batteries

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043032A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gross J.A. et al.: "TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease", Nature, Vol. 404 (6781), 995-999, 27.4.2000 *
Marie-Pierre Gras et al.: "BCMAp: an integral membrane protein in the Golgi apparatus of human mature B lymphocytes", International Immunology, Vol.7(7), 1093-1106, 1995 *
Schneider P. et al.: "BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates B cell growth ", J. Exp. Med., Vol. 189(11), 1747-1756, 1999 *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0013391B1 (pt) 2018-09-11
US7083785B2 (en) 2006-08-01
DE60034579T2 (de) 2008-01-31
IS2955B (is) 2016-12-15
SK2292002A3 (en) 2002-07-02
EP1210425A2 (en) 2002-06-05
BG106519A (bg) 2003-04-30
US10494416B2 (en) 2019-12-03
US20020172674A1 (en) 2002-11-21
HK1043608A1 (en) 2002-09-20
EP2314694A2 (en) 2011-04-27
NO20111232A1 (no) 2011-09-12
MXPA02001665A (es) 2003-07-14
NO20020789L (no) 2002-04-08
EP1210425B2 (en) 2015-06-17
WO2001012812A2 (en) 2001-02-22
SK288603B6 (sk) 2018-10-01
US20200095305A1 (en) 2020-03-26
HUP0203084A2 (en) 2002-12-28
US20180273605A1 (en) 2018-09-27
CN100447244C (zh) 2008-12-31
EP1806143B1 (en) 2016-06-15
EP1806143A2 (en) 2007-07-11
YU10602A (sh) 2005-06-10
HU1000128D0 (en) 2010-05-28
PL354661A1 (en) 2004-02-09
DE60034579D1 (de) 2007-06-06
US20100040627A1 (en) 2010-02-18
IL148089A (en) 2015-03-31
JP2014037434A (ja) 2014-02-27
US7691804B2 (en) 2010-04-06
SK500172015A3 (cs) 2002-07-02
JP5904985B2 (ja) 2016-04-20
NZ517782A (en) 2004-01-30
SK288287B6 (sk) 2015-07-01
HU230583B1 (hu) 2017-02-28
DE60034579T3 (de) 2015-11-12
EP1210425B1 (en) 2007-04-25
IL148089A0 (en) 2002-09-12
IL230961A (en) 2016-06-30
EP1806143A3 (en) 2007-07-18
PL211786B1 (pl) 2012-06-29
US9650430B2 (en) 2017-05-16
UA75049C2 (uk) 2006-03-15
RS51157B (sr) 2010-10-31
EE05673B1 (et) 2013-08-15
CA2383154C (en) 2013-04-30
JP5379107B2 (ja) 2013-12-25
JP2003507364A (ja) 2003-02-25
KR100897082B1 (ko) 2009-05-14
NO344346B1 (no) 2019-11-11
BR0013391A (pt) 2002-07-09
DK1210425T3 (da) 2007-09-17
AU780240B2 (en) 2005-03-10
HK1043608B (en) 2007-12-07
EE200200071A (et) 2003-04-15
WO2001012812A3 (en) 2001-09-07
NO331410B1 (no) 2011-12-19
AU6911200A (en) 2001-03-13
CZ2002579A3 (cs) 2002-05-15
CA2383154A1 (en) 2001-02-22
DK1210425T4 (en) 2015-08-10
HU227008B1 (en) 2010-04-28
US20020165156A1 (en) 2002-11-07
BRPI0013391B8 (pt) 2021-05-25
JP2011116790A (ja) 2011-06-16
JP2011063600A (ja) 2011-03-31
JP4787439B2 (ja) 2011-10-05
IS6273A (is) 2002-02-15
CN1379815A (zh) 2002-11-13
EP2314694A3 (en) 2013-12-11
PL207501B1 (pl) 2010-12-31
EA200200261A1 (ru) 2002-08-29
KR20020084842A (ko) 2002-11-11
ATE360693T1 (de) 2007-05-15
NO20020789D0 (no) 2002-02-18
US8828669B2 (en) 2014-09-09
IL230961A0 (en) 2014-03-31
KR20090016772A (ko) 2009-02-17
US20120214687A1 (en) 2012-08-23
TR200201063T2 (tr) 2002-10-21
GEP20053685B (en) 2005-12-12
HU227947B1 (en) 2012-06-28
US20150139992A1 (en) 2015-05-21
EA004635B1 (ru) 2004-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10494416B2 (en) Methods of modulating immune responses using BCMA polypeptide
JP4880155B2 (ja) Ａｐｒｉｌレセプター（ｂｃｍａ）およびその使用
ZA200201201B (en) BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent.
HK1157388A (en) Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20200816