KR101972446B1 - Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）­결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B 세포 성숙화 항원 (BCMA) 및 특히 인간 BCMA (hBCMA)에 특이적으로 결합하고 BCMA 수용체에 대한 BAFF 및 APRIL의 결합을 억제하는 항원 결합 단백질 및 이의 단편에 관한 것이다. 약학적 조성물, 스크리닝 및 의학적 치료 방법이 또한 기재된다.

Description

ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９／ＴＮＦＲＳＦ１７）­결합 단백질 {BCMA(CD269/TNFRSF17)-BINDING PROTEINS}
본 발명은 B 세포 성숙화 항원 (BCMA) 및 특히 인간 BCMA (hBCMA)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 및 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 항원 결합 단편으로 질환 또는 질병을 치료하는 방법, 상기 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 그 밖의 구체예는 하기 설명으로부터 명백할 것이다.
BCMA (CD269 또는 TNFRSF17)는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이것은 리간드 BAFF 및 APRIL에 대한 비당화된 내재 막 수용체이다. BCMA의 리간드는 추가의 수용체에도 결합할 수 있다: APRIL 및 BAFF에 결합하는 TACI (막횡단 활성화제 및 칼슘 조절제 및 사이클로필린 리간드 상호작용제); 뿐만 아니라 BAFF에 제한적이지만 높은 친화성을 나타내는 BAFF-R (BAFF 수용체 또는 BR3). 더불어, 이러한 수용체 및 이들의 상응하는 리간드는 체액 면역성, B-세포 발생 및 항상성의 상이한 양태를 조절한다.
BCMA의 발현은 전형적으로 B-세포 계통에 제한되고 말단 B-세포 분화를 증가시키는 것으로 보고된다. BCMA는 인간 혈장 모세포, 편도, 비장 및 골수로부터의 형질 세포에 의해 발현되나, 또한 TACI-BAFFR 낮은 표현형을 지니는 편도 기억 B 세포 및 종자 중심 B 세포에 의해서도 발현된다 (Darce et al, 2007). BCMA는 나이브(naive) 및 기억 B-세포에 사실상 존재하지 않는다 (Novak et al., 2004a and b). BCMA 항원은 세포 표면 상에서 발현되므로 항체에 접근하지 쉬우나, 골지에서도 발현된다. BCMA의 발현 프로파일에서 제안된 대로, 전형적으로 B-세포 생존 및 증식과 관련된 BCMA 신호전달은 B-세포 분화의 후기 단계뿐 아니라 오래 생존하는 골수 형질 세포 (O'Connor et al., 2004) 및 형질모세포 (Avery et al., 2003)의 생존에도 중요하다. 더욱이, BCMA는 높은 친화성으로 APRIL에 결합하므로, BCMA-APRIL 신호전달 축은 아마도 가장 생리학적으로 적절한 상호작용인 B-세포 분화의 후기 단계에 우세할 것으로 제안된다.
다발성 골수종 (MM)은 새롭게 또는 의미불명 모노클로날 감마글로불린병증(MGUS)으로부터의 진행으로서, 순환으로 확산되기 전에 골수내 다수의 부위에서 발생하는 클로날 B-세포 악성종양이다. 이는 일반적으로 파라단백질 및 파골세포 활성에서의 증가뿐 아니라 고칼슘혈증(hypercalcaemia), 혈구감소증(cytopenia), 신 기능 장애(renal dysfunction), 과다점도(hyperviscosity) 및 말초 신경병증(peripheral neuropathy)을 특징으로 한다. 정상 항체 수준 및 중성구 수에서의 감소가 또한 일반적이며, 이는 감염에 대한 생명을 위협하는 감수성을 초래한다. BCMA는 시험관내 골수종 세포주의 성장 및 생존에 관련되었다 (Novak et al., 2004a and b; Moreaux et al., 2004).
BCMA 발현 (전사물과 단백질 둘 모두)은 MM에서 질병 진행과 관련된 것으로 보고된다. Affymetrix 마이크로어레이를 이용하여, TACI 및 BCMA 유전자가 이들의 정상 상대물에 비해 다발성 골수종 세포 (MMC)에서 과발현되었음이 입증되었다 (Moreaux et al, 2004). MGUS를 지닌 환자 및 정상 골수로부터 정제된 형질 세포를 지닌 인간 골수종 세포뿐 아니라 B-세포 계통 백혈병으로부터의 원발성 종양 세포를 비교하기 위해 유전자 발현 분석을 이용하였다 (Bellucci et al, 2005). BCMA 유전자는 모든 골수종 샘플에서 고도로 발현되었다. MGUS을 지닌 환자로부터 정제된 형질 세포는 낮은 발현의 BCMA를 지녔으나, 정상 형질 세포 또는 골수종 세포에서 발견된 발현에 비해 현저한 차이는 없었다. 대조적으로, BCMA 발현은 B-세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 프리-B 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 T-세포 ALL (T-ALL)에서 현저하게 낮았다. 유전자이식에 의해 BAFF 또는 APRIL을 과발현시키는 마우스 모델은 B-세포 림프종의 현저한 증가를 지녔다 (Batten et al., 2004 - BAFF; Planelles et al., 2004 - APRIL). 인간에서, 다수의 B-세포 악성종양 및 그 밖의 B-세포 질병을 지닌 환자의 혈청 및 미세환경에서 과량의 BAFF 및 APRIL이 검출되었다.
본 명세서에 기재된 모든 특허 및 참고 문헌은 명백하게 그리고 전적으로 본원에 참조로서 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1: FMAT 결합 검정 - 인간 및 시노(cyno) BCMA 발현 HEK293 세포에 결합하는 CA8 항체에 대한 FMAT 검정의 결과를 도시하는 도면. 인간 키메라 CA8은 인간 및 시노 BCMA 발현 세포에 잘 결합한다.
도 2: ELISA 결합 검정 - 인간 및 시노 BCMA 재조합 단백질에 결합하는 CA8 항체에 대한 ELISA 결과를 도시하는 도면. 이는 인간 키메라 CA8 항체가 인간 및 시노 BCMA 단백질에 동등하게 결합함을 명백하게 도시한다.
도 3: BiaCore 결합 검정 - Biacore 실험에서 BCMA-Fc, TACI-Fc 및 BAFF-R-Fc 단백질에 대한 CA8의 결합을 도시하는 도면. CA8 키메라 항체는 TACI 또는 BAFF-R 단백질에 결합하지 않는다.
도 4: 세포 결합 검정 - FACS에 의해 측정된 H929 다발성 골수종 세포에 대한 뮤린 S307118G03, S3222110D07, S332121F02 및 S332126E04의 결합 및 BCMA 트랜스펙션된 ARH77 세포에 대한 S3322110D07, S332121F02 및 S332126E04의 결합을 도시하는 도면.
다발성 골수종 세포주 H929 또는 ARH77-hBCMA 10B5 BCMA 발현 트랜스펙턴트(transfectant) 세포를 뮤린 항 BCMA 항체 (채워진 히스토그램) 또는 뮤린 IgG2a 아이소형 대조군 (빈 히스토그램)으로 염색하였다. 세포에 결합된 항체를 검출하기 위해 세포를 FACS에 의해 분석하였다.
도 5: 세포 결합 검정 - FACS에 의해 측정된 다발성 골수종 세포주의 패널에 대한 키메라 CA8의 결합을 도시하는 도면. H929, OPM-2, JJN-3 및 U266에 대한 결합을 결정하기 위해 측정된 유세포분석 및 평균 형광 세기 (MFI) 값에 의해 시험하였다. 시나지스(Synagis)를 무관한 아이소형 대조군으로서 이용하였다.
도 6: 세포 결합 검정 - FACS에 의해 측정된 BCMA 트랜스펙션된 ARH77 세포 (A) 및 다발성 골수종 H929 세포 (B)에 대한 인간화 CA8 변이체의 결합 곡선을 도시하는 도면.
인간화 변이체 J6M0, J6M1 , J6M2, J9M0, J9M1 및 J9M2를, CA8 키메라에 비해 결합을 결정하기 위해 측정된 유세포분석 및 평균 형광 세기 (MFI) 값에 의해 시험하였다.
도 7: 리간드 중화 검정 - (A 및 B) ELISA 플레이트 상에 코팅된 재조합 BCMA에 대한 재조합 BAFF 또는 APRIL의 결합을 중화시키는 CA8 및 J6M0의 능력을 도시하는 도면. OD 값을 이용하여 재조합 BCMA로의 적절한 리간드 단독의 결합에 의해 달성된 최대 신호의 항체 매개된 억제를 계산하였다. 데이터는 최대 신호의 억제 비율로서 보고된다. 시험된 항체는 야생형 및 아푸코실화 (포텔리젠트(Potelligent)) 형태 둘 모두의 키메라 CA8 및 인간화 CA8 버젼 J6M0였다.
(A) BAFF 리간드 결합의 중화; (B)- APRIL 리간드 결합의 중화.
(C) - H929 세포에서 BAFF 또는 APRIL 유도된 NFKappaB의 인산화의 억제에 있어서 J6M0 BCMA 항체의 능력을 도시하는 도면. H-929 세포를 3회 세척하여 임의의 sBCMA를 제거하고 무혈청 배지에 재현탁시켰다. J6M0 포텔리젠트 항체를 96웰 플레이트에 첨가시켜 BAFF 또는 APRIL 리간드와 함께 100㎍/ml 이하의 최종 웰 농도를 수득함으로써 각각 0.6 또는 0.2 ㎍/ml의 최종 웰 농도를 얻었다. 그 후 H-929 세포를 무혈청 배지에 7.5x104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 30분 후에 세포를 용해시키고 인산화 NFkappaB 수준을 MSD pNFkappaB 검정을 이용하여 측정하였다. MSD 리더 502819. 이것은 한 번의 독립적인 실험으로부터의 데이터이다. 각각의 데이터 포인트는 2회 반복의 평균/sd이다.
도 8: ADCC 검정 - BCMA를 발현시키는 표적 세포를 갖는 키메라 CA8 및 탈푸코실화 (Fc 향상됨) CA8의 ADCC 활성을 도시하는 도면.
인간 NK 세포를 다양한 농도의 항체의 존재하에 유로퓸 표지된 ARH77 10B5 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포와 인큐베이션시켰다. 표적 세포로부터의 유로퓸 방출을 측정하고 특이적 용해를 계산하였다. (A) 아이소형 대조군에 비해 키메라 CA8의 ADCC 용량 반응 곡선. (B) BCMA 발현 세포주 ARH77 10B5에 비해 키메라 CA8 및 탈푸코실화 키메라 CA8 (Fc 향상됨)에 대한 ADCC 용량 반응 곡선.
도 9: ADCC 검정 - ARH77 BCMA 발현 표적 세포를 이용한 CA8 인간화 항체에 대한 ADCC 검정을 도시하는 도면.
인간 PBMC를 다양한 농도의 J5, J6, J7, J8 또는 J9 시리즈의 인간화 CA8 항체의 존재하에 유로퓸 표지된 ARH77 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포와 인큐베이션시켰다. 표적 세포로부터의 유로퓸 방출을 측정하고 특이적 용해를 계산하였다. EC50 값을 ㎍/ml로 제시한다.
도 10: ADCC 검정 - 효과기 세포로서 정제된 NK 세포를 갖는 ARH7710B5 표적 세포에 비해 키메라, S332121F02 (A), S3322110D07 (B) S307118G03 (C) 및 인간화 S307118G03 H3L0 (D)의 ADCC 활성을 도시하는 도면, 인간 NK 표적 세포를 다양한 농도의 항체의 존재하에 유로퓸 표지된 ARH77 10B5 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 표적 세포로부터의 유로퓸 방출을 측정하고 특이적 용해를 계산하였다.
도 11: 생육성 검정 용량 반응 곡선 - 인간 다발성 골수종 세포주 (A) NCI-H929 (B) U266-B1 (C) JJN3 및 (D) OPM2에서 키메라 CA8 항체, 키메라 CA8-vcMMAE 및 키메라 CA8-mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트에 대한 세포 생육성 검정에서의 용량 반응 곡선을 도시하는 도면. 항체를 세포에 첨가하고, 96시간 후에 살아있는 세포의 수를 CelltiterGlo를 이용하여 측정하였다. 데이터 포인트는 삼중 CellTiterGlo 측정치의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 12: 세포 주기에 대한 CA8 키메라 항체의 영향
(A) 지시된 시점에 대해 50ng/mL의 컨쥬게이션되지 않은 키메라 CA8, 키메라 CA8-vcMMAE ADC 또는 키메라 CA8-mcMMAF ADC로 처리된 NCI-H929 세포의 세포 주기 히스토그램. 파클리탁셀 (100nM)을 G2/M 세포 주기 억제 및 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 이용하였다. 대조군 인간 IgG1을 음성 대조군으로서 이용하였다. 세포 주기 분석을 그래프에 지시된 시간에 수행하였다. (B) G2/M 억제를 나타내는 4N DNA 세포 집단의 정량 및 (C) 지시된 치료 각각에 대한 세포 사멸을 나타내는 sub-2N DNA 세포 집단. 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하였다 (1 mL의 RPMI + 10% FBS에서 웰당 2x105개 세포). 항체 또는 ADC를 세포 시딩 6시간 후에 첨가하였다.
도 13: 포스포 - 히스톤 H3 에 대한 키메라 CA8 의 영향.
키메라 CA8 ADC 처리는 NCI-H929 세포의 포스포-히스톤 H3 염색을 증가시켰다. (A,B) 대조군 IgG (A) 또는 키메라 CA8-mcMMAF (B)로 처리 후에 DNA 함량 (FL3-H)을 측정하기 위한 프로피듐 아이오다이드로 염색된 세포 x-축 및 항-포스포-히스톤 H3 (Thr11) 항체 (FL1-H) y-축의 점 그림. (C) 지시된 농도의 키메라 CA8 ADC로 처리한 지 48시간 후에 포스포-히스톤 H3 양성 NCI-H929 세포의 정량. 파클리탁셀 (100nM)을 유사분열 억제에 대한 양성 대조군으로서 이용하였고 대조군 키메라 IgG1을 음성 대조군으로서 이용하였다. 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하였다 (1 mL의 RPMI + 10% FBS에서 웰당 2x105개 세포). 항체 또는 ADC를 세포 시딩 6시간 후에 첨가하였다.
도 14: 아넥신 -V에 대한 키메라 CA8 의 영향
키메라 CA8 ADC 처리는 NCI-H929 세포의 아넥신-V 염색을 증가시켰다.
(A) 증가된 농도의 키메라 CA8 ADC로 처리 후에 아넥신-V-FITC (FL1-H; 상부 패널) 및 살아있는 세포 프로피듐 아이오다이드 염색 (FL3-H; 하부 패널)의 히스토그램. (B) 지시된 농도의 키메라 CA8 ADC로 처리한 지 96시간 후에 아넥신-V 양성 NCI-H929 세포의 정량. 파클리탁셀 (100nM)을 아폽토시스에 대한 양성 대조군으로서 이용하였고 대조군 키메라 IgG1을 음성 대조군으로서 이용하였다. 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하였다 (1 mL의 RPMI + 10% FBS에서 웰당 2x105개 세포). 항체 또는 ADC를 세포 시딩 6시간 후에 첨가하였다.
도 15: 생육성 검정 용량 반응 곡선 - 컨쥬게이션되지 않은 (네이키드) 항체 및 키메라 CA8의 vcMMAE 및 mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트 또는 인간화 J6M0 항체에 대한 용량 반응 곡선을 도시하는 도면. 항체 약물 컨쥬게이트는 인간 다발성 골수종 세포주 NCI-H929 및 OPM2에 대해 시험되었다.
도 16: 생육성 검정 용량 반응 곡선 - 인간 다발성 골수종 세포주 NCI-H929 및 U266-B1에서 컨쥬게이션되지 않은 항체, 뮤린 항-BCMA 항체 S332121F02, S322110D07, S332126E04 및 S307118G03의 vcMMAE 및 mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트에 대한 용량 반응 곡선을 도시하는 도면.
도 17: ADC J6M0 분자에 대한 ADCC 활성 - ARH77 BCMA 발현 표적 세포를 이용한 J6M0 항체에 대한 ADCC 검정을 도시하는 도면. 인간 PBMC를 다양한 농도의 J6M0 WT 및 MMAE, MMAF에 컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않은 포텔리젠트 BCMA 항체의 존재하에 유로퓸 표지된 ARH77 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 유로퓸 방출은 Victor 2 1420 다중 표지 리더 상에서 모니터되었다.
도 18: 5개의 다발성 골수종 라인의 패널에 대한 CA8 J6M0 포텔리젠트의 ADCC 용량 반응 곡선 - 인간 PBMC를 50:1의 E:T 비로 다양한 농도의 CA8 J6M0 포텔리젠트 항체의 존재하에 다발성 골수종 표적 세포와 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 효과기 및 표적 혼합물에 남아있는 표적 세포의 비율을 형광 표지된 항-CD138 항체를 이용하여 FACS에 의해 측정하여 표적 세포를 검출하고 세포독성 퍼센트를 계산하였다. A) 시험된 5개의 다발성 골수종 세포주에 대한 CA8 J6M0 포텔리젠트에 대한 예시적인 용량 반응 곡선. 각각의 데이터 포인트는 단일 값으로부터 온 것이다.
도 19: CB .17 SCID 마우스에서 NCI - H929 세포의 성장 및 확립에 대한 J6M0 및 약물 컨쥬게이션된 J6M0 의 용량 증가 효과. 매주 2회씩 2주간 MMAE 또는 MMAF에 컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않은 50 또는 100㎍의 J6M0 항-BCMA 또는 IgG1 아이소형 대조군을 복막내 투여한 후에 CB17 SCID 마우스에서 NCI-H929 종양의 종양 용적 산출. 데이터 포인트는 그룹당 n=5의 평균 종양 용적을 나타낸다.
도 20: 건강한 지원자 및 골수종 환자로부터의 혈청 중 가용성 BCMA 수준의 측정. 혈청 샘플을 다양한 병기(진행성 질환, 관해, 재발, 새롭게 진단됨, 및 기타)를 갖는 MM 환자 샘플로부터 수집하였다. 도면에 도시된 샘플은 검정 전에 1/500으로 희석된 혈청에서 비롯된 것들이다.
가용성 인간 BCMA 수준을 측정하는 R & D Systems로부터의 인간 BCMA/TNFRSF17 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 키트에 제공된 표준 프로토콜에 따라서 BCMA를 계측하였다.
발명의 개요
본 발명은 막 결합된 표적에 결합하는 항원 결합 단백질로서, 내재화(internalisation)될 수 있는 항원 결합 단백질을 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질 및 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트가 제공된다. 추가의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 ADCC 효과기 기능을 지니고, 예를 들어 항원 결합 단백질은 향상된 ADCC 효과기 기능을 지닌다.
본 발명은 BCMA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 예를 들어 BCMA에 특이적으로 결합하고 BCMA 수용체에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 BCMA에 특이적으로 결합하고 BCMA에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제하는 항원 결합 단백질을 제공하고, 여기서 항원 결합 단백질은 FcγRIIIA에 결합할 수 있거나 FcγRIIIA 매개되는 효과기 기능을 할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 BCMA에 특이적으로 결합하고 BCMA에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제하며 여기서 항원 결합 단백질은 FcγRIIIA에 향상된 결합능을 지니거나 향상된 FcγRIIIA 매개되는 효과기 기능을 지닌다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 내재화될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 막 결합되지 않은 BCMA, 예를 들어 혈청 BCMA에 결합하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질 및 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트가 제공된다.
추가의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 아우리스타틴(auristatin)과 같은 독소에 컨쥬게이션된다. 또한 추가의 구체예에서, 약물 컨쥬게이트는 vcMMAE 또는 mcMMAF이다. 한 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 또한 ADCC 향상된다.
항원 결합 단백질은 뮤린 모노클로날 항체 CA8과 관련될 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. CA8 뮤린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:7로서 제공되고 CA8 뮤린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:9로서 제공된다.
항원 결합 단백질은 뮤린 모노클로날 항체 S336105A07과 관련될 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. S336105A07 뮤린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:140으로서 제공되고 S336105A07 뮤린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:144로서 제공된다.
본 발명의 항원 결합 단백질이 또한 유래될 수 있는 그 밖의 뮤린 모노클로날 항체가 표 C에 포함되어 있다.
항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 (VH)은 하기 CDR 또는 이러한 CDR의 변이체 (케이뱃(Kabat)에 의해 정의됨 (Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987))를 포함할 수 있다:
CDRH1은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:182로서 제공된다.
CDRH2는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:183으로서 제공된다.
CDRH3은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:184로서 제공된다.
항원 결합 단백질의 경쇄 가변 영역 (VL)은 하기 CDR 또는 이러한 CDR의 변이체 (케이뱃에 의해 정의됨 (Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987))를 포함할 수 있다:
CDRL1은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:185로서 제공된다.
CDRL2는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:186으로서 제공된다.
CDRL3은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:187로서 제공된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
그러한 폴리뉴클레오티드는 동등한 폴리펩티드 서열에 상응하는 코딩 서열을 나타내나, 그러한 폴리뉴클레오티드 서열은 개시 코돈, 적절한 신호 서열 및 정지 코돈과 함께 발현 벡터로 클로닝될 수 있었음이 이해될 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 적합한 배양 배지, 예를 들어, 혈청 비함유 배양 배지에서 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 첫 번째 벡터 및 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 두 번째 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항원 결합 단백질 중 어느 것을 생성하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA와 이의 리간드인 BAFF 또는 APRIL 사이의 상호작용의 조절과 같이 BCMA를 억제하거나 차단하는 것에 반응하는 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
따라서, 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 형질 세포 악성종양, 예를 들어 다발성 골수종 (MM)과 같은 B 세포 관련 질병 또는 질환을 치료하기 위한 치료적 접근법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, BCMA 및 BAFF 및/또는 APRIL과 같은 이의 리간드 사이의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 및 질병의 치료에서 BCMA (예컨대, hBCMA)에 특이적으로 결합하여 상기 상호작용을 조절 (즉, 억제 또는 차단)하는 항원 결합 단백질, 특히 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 형질 세포 악성종양, 예컨대 다발성 골수종 (MM)과 같은 B 세포 관련 질병 또는 질환에 걸린 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 건선(Psoriasis), 타입 1 당뇨병(Type 1 Diabetes Mellitus) 또는 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에 걸린 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 막 결합된 표적에 결합하는 항원 결합 단백질로서, 내재화될 수 있는 항원 결합 단백질을 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질 및 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트가 제공된다. 추가의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 ADCC 효과기 기능을 지니고, 예를 들어 항원 결합 단백질은 향상된 ADCC 효과기 기능을 지닌다.
그러한 한 구체예에서, BCMA에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 인간 BCMA (hBCMA)에 특이적으로 결합하고 BCMA 수용체에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제하는 항원 결합 단백질 또는 이의 단편이 제공된다.
추가의 구체예에서, 항원 결합 단백질 또는 이의 단편은 BCMA에 특이적으로 결합하고 BCMA에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제하는데, 항원 결합 단백질 또는 이의 단편은 FcγRIIIA에 결합하여 FcγRIIIA 매개되는 효과기 기능을 매개하는 능력을 지니거나, 향상된 FcγRIIIA 매개되는 효과기 기능을 지닌다. 본원에 기재된 바와 같이 제공된 본 발명의 한 구체예에서 항원 결합 단백질은 내재화될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 막 결합되지 않은 BCMA, 예를 들어 혈청 BCMA에 결합한다고 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 양태에서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3의 변이체의 CDRH3을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 추가 양태에서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:1의 CDRH1, SEQ ID NO:2의 CDRH2: SEQ ID NO:4의 CDRL1: SEQ ID NO:5의 CDRL2: 및/또는 SEQ ID NO:6의 CDRL3: 및/또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 양태에서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:184 또는 SEQ ID NO:184의 변이체의 CDRH3을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 추가 양태에서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:182의 CDRH1, SEQ ID NO:183의 CDRH2: SEQ ID NO:185의 CDRL1: SEQ ID NO:186의 CDRL2: 및/또는 SEQ ID NO:187의 CDRL3: 및/또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질이 제공된다.
또한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:3의 CDRH3: SEQ ID NO:2의 CDRH2: SEQ ID NO:1의 CDRH1: SEQ ID NO:4의 CDRL1: SEQ ID NO:5의 CDRL2: 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3을 포함한다.
또한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:184의 CDRH3: SEQ ID NO:183의 CDRH2: SEQ ID NO:182의 CDRH1: SEQ ID NO:185의 CDRL1: SEQ ID NO:186의 CDRL2: 및 SEQ ID NO:187의 CDRL3을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 지닌다. 또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 세포독성제와 컨쥬게이션된다. 또한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 지니고 세포독성제와 컨쥬게이션된다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 자연 항체 또는 이의 기능성 단편 또는 동등물의 구조로 포맷화될 수 있는 본 발명의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 적절한 경쇄와 페어링되는 경우 전장 항체, (Fab')2 단편, Fab 단편, 또는 이의 동등물(예를 들어, scFV, 바이-, 트리- 또는 테트라-바디, Tandabs 등)로 포맷화된 본 발명의 VH 영역을 포함할 수 있다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4; 또는 IgM; IgA, IgE 또는 IgD 또는 이들의 변형된 변이체일 수 있다. 항체 중쇄의 불변 도메인이 이에 따라서 선택될 수 있다. 경쇄 불변 도메인은 카파 또는 람다 불변 도메인일 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질은 모든 부류의 변형, 예를 들어, IgG 이합체, 더 이상 Fc 수용체에 결합하지 않거나 C1q 결합을 매개하지 않는 Fc 돌연변이를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 항원 결합 영역 및 비-면역글로불린 영역을 포함하는 WO86/01533호에 기재된 유형의 키메라 항체일 수 있다.
불변 영역은 임의의 요구되는 기능에 따라 선택되며, 예컨대 IgG1은 보체와의 결합을 통해 용해 능력을 나타낼 수 있고/있거나, ADCC(항체 의존성 세포 세포독성)를 매개할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 가변 영역을 갖는 뮤린 항체 또는 이의 비-뮤린 동등물, 예를 들어, 이의 래트, 인간, 키메라 또는 인간화 변이체로부터 유래되며, 예를 들어, 이들은 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:29에 기재된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 및/또는 SEQ ID NO:35에 기재된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 갖는 항체로부터 유래된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:116 또는 SEQ ID NO:118에 기재된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO:120 또는 SEQ ID NO:122에 기재된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 갖는 항체로부터 유래된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:140에 기재된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO:144에 기재된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 갖는 항체로부터 유래된다.
본 발명의 한 양태에서, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:116 또는 SEQ ID NO:118 중 어느 하나로부터 선택된 분리된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 또는 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:120 또는 SEQ ID NO:122 중 어느 하나로부터 선택된 분리된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 추가 양태에서, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:29 중 어느 하나로부터 선택된 분리된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 및/또는 SEQ ID NO:35 중 어느 하나로부터 선택된 분리된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:23에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:31에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:27에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:31에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:29에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:31에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:116에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:120에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:118에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:122에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14, 또는 SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:18, 또는 SEQ ID NO:20, 또는 SEQ ID NO:22, 또는 SEQ ID NO:24, 또는 SEQ ID NO:26, 또는 SEQ ID NO:28, 또는 SEQ ID NO:30 또는 SEQ ID NO:117 또는 SEQ ID NO:119 또는 SEQ ID NO:141을 포함하는, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
한 양태에서, SEQ ID NO:32, 또는 SEQ ID NO:34, 또는 SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:121 또는 SEQ ID NO:123 또는 SEQ ID NO:145를 포함하는, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
추가 양태에서, SEQ ID NO:24, 또는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:30을 포함하는, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:32, 또는 SEQ ID NO:34를 포함하는, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또한 추가 양태에서, SEQ ID NO:24를 포함하는, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:32를 포함하는, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또한 추가 양태에서, SEQ ID NO:117을 포함하는, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:121을 포함하는, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또한 추가 양태에서, SEQ ID NO:119를 포함하는, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:123을 포함하는, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또한 추가 양태에서, SEQ ID NO:141을 포함하는, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:145를 포함하는, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 중 어느 하나와 조합된 본원에 기재된 바와 같은 가변 중쇄 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 본 발명에 따른 하나 이상의 CDR, 또는 본원에 기재된 본 발명에 따른 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 영장류 BCMA에 결합한다. 한 상기 구체예에서, 항원 결합 단백질은 추가로 비-인간 영장류 BCMA, 예를 들어, 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque) 원숭이 BCMA에 결합한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니항체, 및 미니바디로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 항원 결합 단백질은 인간화 또는 키메라 항체이고, 추가 양태에서, 항체는 인간화 항체이다.
한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 한 양태에서, SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:59 또는 SEQ ID NO:61에 기재된 중쇄 서열을 지니는 항체가 제공된다.
본 발명의 한 양태에서, SEQ ID NO:63 또는 SEQ ID NO:65에 기재된 경쇄 서열을 지니는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 양태에서, SEQ ID NO:55의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:63에 기재된 경쇄 서열을 지니는 항체가 제공된다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 따라서 그러한 한 구체예에서, SEQ ID NO:23의 중쇄 가변 서열 및 SEQ ID NO:31의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
따라서, 추가 양태에서, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118 및 SEQ ID NO:140 중 하나로부터 선택된 중쇄 가변 서열 및 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122 및 SEQ ID NO:144 중 하나로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은, 예를 들어 Biacore에 의해 측정시 높은 친화성으로 인간 BCMA에 결합하고, 이러한 항원 결합 단백질은 20nM 또는 그 미만의 친화성, 또는 15nM 또는 그 미만의 친화성, 또는 5nM 또는 그 미만의 친화성, 또는 1000 pM 또는 그 미만의 친화성, 또는 500pM 또는 그 미만의 친화성, 또는 400pM 또는 그 미만의 친화성, 또는 300pM 또는 그 미만의 친화성, 또는 예를 들어 약 120pM의 친화성으로 인간 BCMA에 결합한다. 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 Biacore에 의해 측정시 약 100pM 내지 약 500pM 또는 약 100pM 내지 약 400pM, 또는 약 10OpM 내지 약 300pM의 친화성으로 인간 BCMA에 결합한다. 본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 150pm 미만의 친화성으로 BCMA에 결합한다.
한 상기 구체예에서, 이는, 예를 들어, 실시예 4에 기재된 바와 같이 Biacore에 의해 측정된다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 BCMA에 결합하고, 세포 중화 검정에서 BCMA 수용체에 대한 리간드 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 중화시키며, 이러한 항원 결합 단백질은 약 1 nM 내지 약 500nM, 또는 약 1 nM 내지 약 100nM, 또는 약 1 nM 내지 약 50nM, 또는 약 1 nM 내지 약 25nM, 또는 약 5nM 내지 약 15nM의 IC50을 갖는다. 본 발명의 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 BCMA에 결합하고, 세포 중화 검정에서 BCMA를 중화시키며, 이러한 항원 결합 단백질은 약 10nM의 IC50을 갖는다.
한 상기 구체예에서, 이는, 예를 들어, 실시예 4.6에 기재된 바와 같이 세포 중화 검정에 의해 측정된다.
본 발명의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체는 본 발명의 항원 결합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 항원 결합 단백질에 대한 상기 코딩 서열을 숙주 세포 내에서의 복제 및 발현, 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상적인 조절성 조절 서열과 작동가능하게 관련되도록 배치함으로써 생성된다. 조절성 서열은 프로모터 서열, 예를 들어, CMV 프로모터, 및 다른 공지된 항체로부터 유래될 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사하게, 상보적 항원 결합 단백질 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 갖는 두 번째 발현 벡터가 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 두 번째 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현될 수 있는 것을 보장하기 위해 코딩 서열 및 선택 마커가 관련된 것을 제외하고는 첫 번째 발현 벡터와 동일하다. 대안적으로, 항원 결합 단백질에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일한 벡터에 존재할 수 있다.
선택된 숙주 세포는 통상적인 기술에 의해 첫 번째 및 두 번째 벡터 둘 모두로 공동 트랜스펙션(또는 간단히 단일 벡터에 의해 트랜스펙션)되어, 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 포함하는 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포가 생성된다. 트랜스펙션된 세포는 이후 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 조작된 항원 결합 단백질이 생성된다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄 둘 모두의 결합을 포함하는 항원 결합 단백질이 적절한 검정, 예를 들어, ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 유사한 통상적 기술이 다른 항원 결합 단백질을 작제하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 작제에서 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 시리즈가 이용될 수 있다. 한 벡터 pUC19는 Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom) 또는 Pharmacia(Uppsala, Sweden)와 같은 공급처로부터 시판된다. 추가로, 용이하게 복제될 수 있고, 다수의 클로닝 부위 및 선택 유전자(예를 들어, 항생제 내성)를 가지며, 용이하게 조작되는 임의의 벡터가 클로닝에 사용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 요인이 아니다.
발현 벡터는 또한 이종성 DNA 서열, 예를 들어, 포유동물 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR)의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자를 특징으로 할 수 있다. 다른 벡터 서열은 폴리 A 신호 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH)으로부터의 폴리 A 신호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열(betaglopro)을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다.
상기 벡터의 구성요소, 예를 들어, 레플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호서열 등은 시판 업체 또는 자연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA의 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 사용하기 위한 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 다수의 유형이 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모, 및 진균 발현을 위해 당 분야에 공지된 다른 적절한 발현 벡터가 또한 상기 목적을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 세포주를 포함한다. 상기 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포가 또한 통상적이다. 그러나, E. 콜라이(E. coli)의 다양한 균주로부터의 세포가 본 발명의 항원 결합 단백질의 작제에서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 포유동물 세포, 예를 들어, NS0, Sp2/0, CHO(예를 들어, DG44), COS, HEK, 섬유모세포 세포(예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포를 포함하며, 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포가 사용될 수 있고, 따라서 분자가 인간 당화 패턴으로 변형되는 것이 가능할 수 있다.
대안적으로, 다른 진핵생물 세포주가 이용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성 및 정제를 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 언급된 문헌[Sambrook et al.]을 참조하라.
박테리아 세포가 재조합 Fab의 발현 또는 본 발명의 다른 구체예에 적합한 숙주 세포로 유용한 것이 입증될 수 있다(예를 들어, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992) 참조). 그러나, 폴딩되지 않거나 부적절하게 폴딩된 형태 또는 당화되지 않은 형태로 존재하는 박테리아 세포에서 발현된 단백질의 경향으로 인해, 박테리아 세포에서 생성된 임의의 재조합 Fab는 항원 결합 능력의 보유에 대해 스크리닝되어야 할 것이다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적절하게 폴딩된 형태로 생성된 경우, 박테리아 세포는 요망되는 숙주일 것이거나, 대안적 구체예에서, 분자는 박테리아 숙주에서 발현될 수 있고, 이후 재폴딩될 수 있다. 예를 들어, 발현에 사용되는 E. 콜라이의 다양한 균주가 생물공학 분야에서 숙주 세포로 널리 공지되어 있다. B. 섭틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 다른 바실러스 등의 다양한 균주가 또한 상기 방법에서 이용될 수 있다.
요망되는 경우, 당업자에게 공지된 효모 세포의 균주, 뿐만 아니라 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 레피돕테라(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템이 숙주 세포로서 또한 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조하라.
벡터가 작제될 수 있는 일반적 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생성시키는데 필요한 트랜스펙션 방법, 및 상기 숙주 세포로부터 본 발명의 항원 결합 단백질을 생성시키는데 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기술일 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 배양 방법은 보통 현탁액 중에서 혈청액 비함유로 세포를 배양함에 의한 혈청 비함유 배양 방법이다. 마찬가지로, 생성된 후, 본 발명의 항원 결합 단백질은 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당 분야의 표준 절차에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 이러한 기술은 당 분야의 기술 범위 내에 있고, 본 발명을 제한하지 않는다. 예를 들어, 변경된 항체의 제조가 WO 99/58679호 및 WO 96/16990호에 기재되어 있다.
항원 결합 단백질의 또 다른 발현 방법은 미국 특허 번호 4,873,316호에 기재된 바와 같이 유전자이식 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이는 포유동물로 유전자이식에 의해 통합되는 경우 암컷이 이의 모유에서 요망되는 재조합 단백질을 생성하는 것을 가능케 하는 동물 카세인 프로모터를 이용하는 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면,
항체의 중쇄를 엔코딩하는 첫 번째 벡터를 제공하는 단계;
항체의 경쇄를 엔코딩하는 두 번째 벡터를 제공하는 단계;
상기 첫 번째 및 두 번째 벡터를 이용하여 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)를 형질전환시키는 단계;
상기 숙주 세포로부터 배양 배지로 항체가 분비되도록 하는 조건하에서 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
단계 (d)의 분비된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 BCMA에 결합하고 이의 활성을 중화시키는 본 발명의 항-BCMA 항체를 생성시키는 방법이 제공된다.
요망되는 방법에 의한 발현 후, 항체는 적절한 검정의 사용에 의해 시험관내 활성에 대해 시험된다. 현재 통상적인 ELISA 검정 포맷이 BCMA에 대한 항체의 정성적 및 정량적 결합을 평가하는데 이용된다. 추가로, 일반적인 청소 메커니즘에도 불구하고 신체 내의 항체의 지속성을 평가하기 위해 수행되는 차후의 인간 임상 연구 전에 중화 효능을 확인하기 위해 다른 시험관내 검정이 또한 이용될 수 있다.
치료 용량 및 지속기간은 인간 순환에서 본 발명의 분자의 상대 지속기간에 관한 것이며, 이는 환자의 치료되는 질환 및 전반적 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 연장된 기간(예를 들어, 4 내지 6개월)에 걸친 반복된 투여(예를 들어, 주 1회 또는 2주에 1회 또는 3주에 1회)가 최대 치료 효능을 달성하는데 필요할 수 있음이 예견된다.
본 발명의 한 구체예에서, 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 재조합의 형질전환되거나, 트랜스펙션되거나, 형질도입된 숙주 세포가 제공되며, 예를 들어, 상기 발현 카세트는 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하거나, 2개의 발현 카세트가 존재하고, 첫 번째 발현 카세트는 경쇄를 엔코딩하고, 두 번째 발현 카세트는 중쇄를 엔코딩한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 첫 번째 발현 카세트는 본원에 기재된 본 발명에 따른 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 본원에 기재된 본 발명에 따른 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 두 번째 카세트를 추가로 포함하며, 예를 들어, 첫 번째 발현 카세트는 SEQ ID NO:56, 또는 SEQ ID NO:60 또는 SEQ ID NO:62로부터 선택된 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 두 번째 발현 카세트는 SEQ ID NO:64 또는 SEQ ID NO:66으로부터 선택된 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 안정적으로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 경쇄를 엔코딩하는 첫 번째 벡터 및 중쇄를 엔코딩하는 두 번째 벡터를 포함할 수 있고, 예를 들어, 첫 번째 벡터는 SEQ ID NO:55, 또는 SEQ ID NO:59 또는 SEQ ID NO:61로부터 선택된 중쇄를 엔코딩하고, 두 번째 벡터는 경쇄, 예를 들어, SEQ ID NO:63 또는 SEQ ID NO:65의 경쇄를 엔코딩한다. 상기 한 예에서, 첫 번째 벡터는 SEQ ID NO:55로부터 선택된 중쇄를 엔코딩하고, 두 번째 벡터는 경쇄, 예를 들어 SEQ ID NO:63의 경쇄를 엔코딩한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 숙주 세포가 제공되며, 상기 세포는 진핵생물 세포이고, 예를 들어, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 세포주의 예는 CHO 또는 NS0를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 배지, 예를 들어, 혈청 비함유 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 본 발명에 따른 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생성을 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법이 제공되며, 여기서 항체는 상기 항체를 함유하는 혈청 비함유 배양 배지와 관련하여 적어도 95% 또는 그 초과(예를 들어, 98% 또는 그 초과)로 추가로 정제된다.
또 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 사용을 위한 설명서와 함께 본원에 기재된 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 부품 키트(kit-of-parts)가 제공된다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주에게 작용제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질, 및 약학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하(s.c), 수막강내, 복막내, 근내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 투여에 특히 유용하다. 상기 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 정맥내 또는 피하 투여된다.
본 발명의 치료제는 약학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 예방적 작용제는 주사 준비 형태의 항원 결합 단백질을 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액이다. 한 구체예에서, 현탁액 또는 용액은 생리학적 pH에서 완충된다. 한 구체예에서, 비경구 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해된 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이의 칵테일의 용액을 포함할 것이다. 한 구체예에서, 담체는 수성 담체이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 이용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 제조될 수 있고, 일반적으로 미립자 물질을 함유하지 않는다. 이들 용액은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 상기 약학적 제형 내의 본 발명의 항원 결합 단백질의 농도는 약 0.5 중량% 미만, 보통 약 1 중량% 또는 그 이상 내지 약 15 중량% 또는 20 중량% 만큼 매우 다양할 수 있고, 이는 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등을 기초로 하여 선택될 것이다.
따라서, 정맥내 주입용의 본 발명의 약학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거액, 및 링거액 ml 당 약 1 내지 약 30 또는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 널리 공지되어 있거나, 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여가능한 항원 결합 단백질 제형의 제조를 위해, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되고, 독자가 특별히 참조하는 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000); Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers.M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922; and Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)]을 참조하라.
한 구체예에서, 약학적 제조물인 경우 본 발명의 치료제는 단위 용량 형태로 존재한다. 적절한 치료적 유효 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 적합한 용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 수 있고, 예를 들어, 적합한 용량은 약 0.1 내지 약 20mg/kg, 예를 들어, 약 1 내지 약 20mg/kg, 예를 들어, 약 10 내지 약 20mg/kg 또는, 예를 들어, 약 1 내지 약 15mg/kg, 예를 들어, 약 10 내지 약 15mg/kg 또는 예를 들어 1-5mg/kg의 범위일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 3주마다 1-5mg/kg으로 제공된다. 인간에서 질환, 예를 들어, 다발성 골수종, SLE 또는 IPT를 효과적으로 치료하기 위해, 적합한 용량은 비경구, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근내 투여될 수 있는 약 0.1 내지 약 1000 mg, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 500mg, 예를 들어, 약 500mg, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 100mg, 또는 약 0.1 내지 약 80mg, 또는 약 0.1 내지 약 60mg, 또는 약 0.1 내지 약 40mg, 또는, 예를 들어, 약 1 내지 약 100mg, 또는 약 1 내지 약 50mg의 본 발명의 항원 결합 단백질의 범위 내일 수 있다. 이러한 용량은 필요시 의사에 의해 적절히 선택된 적절한 시간 간격으로 반복될 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 단백질은 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적절한 담체 중에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 과산화 및 재구성 기술이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염, 타입 1 당뇨병, 다발성 경화증 또는 건선의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, BCMA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 면역컨쥬게이트의 일부이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비분비형 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 의미불명 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 고립성 형질세포종 (골, 골수외), 림프형질세포 림프종 (LPL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병, 일차 아밀로이드증 (AL), 중쇄 질병, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), POEMS 증후군/골경화 골수종, 타입 I 및 II 한랭글로불린혈증, 경쇄 침착 질환, 굿파스처 증후군, 특발 저혈소판 자색반병 (ITP), 급성 사구체신염, 천포창 및 유사천포창 질병, 및 후천성 표피 수포증; 또는 BCMA 발현을 지니는 임의의 비호지킨 림프종 B-세포 백혈병 또는 호지킨 림프종 (HL) 또는 환자가 재조합 단백질 대치 요법에 대한 중화 항체를 발생시키는 임의의 질환으로부터 선택된 B-세포 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 항체 매개된 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공된다.
B-세포 질병은 B-세포 발생/면역글로불린 생성의 결함 (면역결핍) 및 과도하고/제어되지 않은 증식 (림프종, 백혈병)으로 나뉠 수 있다. 본원에서 사용된 B-세포 질병은 두 유형 모두의 질환을 지칭하고, 상기 방법은 항원 결합 단백질로 B-세포 질병을 치료하기 위해 제공된다.
특정 양태에서, 질환 또는 질병은 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 고립성 형질세포종 (골, 골수외), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 질환은 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종 (SMM) 또는 고립성 형질세포종 (골, 골수외)이다.
본 발명의 한 양태에서, 질환은 다발성 골수종이다.
본 발명의 한 양태에서, 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE)이다.
본 발명의 한 양태에서, 질환은 특발 저혈소판 자색반병 (ITP)이다.
본원에 기재된 질환 및 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 또한 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 한 양태에서, BCMA 및 리간드인 BAFF 및 APRIL 사이의 상호작용의 조절 (예컨대 억제 또는 차단)에 반응하는 질환 및 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 류마티스 관절염, 타입 1 당뇨병, 다발성 경화증 또는 건선으로부터 선택된 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 의미불명 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 무증상 다발성 골수종 (SMM), 고립성 형질세포종 (골, 골수외), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 일차 아밀로이드증 (AL), 중쇄 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), POEMS 증후군/골경화 골수종, 타입 I 및 II 한랭글로불린혈증, 경쇄 침착 질환, 굿파스처 증후군, 특발 저혈소판 자색반병 (ITP), 급성 사구체신염, 천포창 및 유사천포창 질병 및 후천성 표피 수포증, BCMA 발현을 지니는 임의의 비호지킨 림프종 및 백혈병 또는 환자가 재조합 단백질 대치 요법에 대한 중화 항체를 발생시키는 임의의 질환으로부터 선택된 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 항체 매개된 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 용도가 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이의 기능성 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 류마티스 관절염, 타입 1 당뇨병, 다발성 경화증 또는 건선, 또는 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 의미불명 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 무증상 다발성 골수종 (SMM), 고립성 형질세포종 (골, 골수외), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 일차 아밀로이드증 (AL), 중쇄 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), POEMS 증후군/골경화 골수종, 타입 I 및 II 한랭글로불린혈증, 경쇄 침착 질환, 굿파스처 증후군, 특발 저혈소판 자색반병 (ITP), 급성 사구체신염, 천포창 및 유사천포창 질병 및 후천성 표피 수포증, BCMA 발현을 지니는 임의의 비호지킨 림프종 및 백혈병 또는 환자가 재조합 단백질 대치 요법에 대한 중화 항체를 발생시키는 임의의 질환으로부터 선택된 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공하고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염, 타입 1 당뇨병, 다발성 경화증 또는 건선, 또는 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질병 또는 질환에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 예를 들어, 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 의미불명 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 무증상 다발성 골수종 (SMM), 고립성 형질세포종 (골, 골수외), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 일차 아밀로이드증 (AL), 중쇄 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), POEMS 증후군/골경화 골수종, 타입 I 및 II 한랭글로불린혈증, 경쇄 침착 질환, 굿파스처 증후군, 특발 저혈소판 자색반병 (ITP), 급성 사구체신염, 천포창 및 유사천포창 질병 및 후천성 표피 수포증, BCMA 발현을 지니는 임의의 비호지킨 림프종 및 백혈병 또는 환자가 재조합 단백질 대치 요법에 대한 중화 항체를 발생시키는 임의의 질환으로부터 선택된 항체 매개되거나 형질 세포 매개된 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 방법은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 구체예에서, 다발성 골수종 (MM)에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
정의
본원에서 사용된 용어 "암", "신생물" 및 "종양"은 상호교환적으로 이용되고, 단수 또는 복수 형태로, 숙주 유기체에 대해 병적인 것이 되게 하는 악성 형질전환을 겪은 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포는 널리 확립된 기법, 특히 조직학 조사에 의해 비암성 세포로부터 용이하게 구별될 수 있다. 본원에서 사용된 암 세포의 정의는 원발성 암 세포뿐 아니라 암 세포 원종에서 유래된 임의의 세포도 포함한다. 이는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 보통 고형 종양으로서 명시된 암의 유형의 지칭할 때, "임상적으로 검출가능한" 종양은, 예컨대 컴퓨터 단층촬영법 (CT) 스캔, 자기 공명 이미징 (MRI), X-선, 초음파 또는 신체 검사에 대한 촉진과 같은 절차에 의해 종괴를 기초로 하여 검출될 수 있고/거나, 환자로부터 수득할 수 있는 샘플에서 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현으로 인해 검출될 수 있는 것이다. 종양은 조혈 (또는 혈액 또는 혈액학 또는 혈액-관련) 암, 예를 들어, "액체 종양"으로서 지칭될 수 있는 혈액 세포 또는 면역 세포로부터 유래된 암일 수 있다. 혈액 종양에 기반한 임상 질환의 특수한 예는 백혈병, 예컨대 만성 골수구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병; 형질 세포 악성종양, 예컨대 다발성 골수종, MGUS 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 림프종, 예컨대 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종 등을 포함한다.
암은 비정상적인 다수의 모세포 또는 원치않는 세포 증식이 존재하거나 림프성 및 골수성 악성종양 둘 모두를 포함하는 혈액 암으로서 진단된 임의의 암일 수 있다. 골수성 악성종양은 이로 제한되는 것은 아니지만 급성 골수성 (또는 골수구성 또는 골수성 또는 골수모구) 백혈병 (미분화되거나 분화됨), 급성 전골수 (또는 전골수구성 또는 전골수성 또는 전골수모구) 백혈병, 급성 골수단핵구 (또는 골수단핵모구) 백혈병, 급성 단핵구 (또는 단핵모구) 백혈병, 적백혈병 및 거핵구 (또는 거핵모구) 백혈병을 포함한다. 이러한 백혈병은 함께 급성 골수성 (또는 골수구성 또는 골수성) 백혈병 (AML)으로 지칭될 수 있다. 골수성 악성종양은 또한 이로 제한되는 것은 아니지만 만성 골수성 (또는 골수) 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구 백혈병 (CMML), 본태성 고혈소판증 (또는 혈소판증가증), 및 진성적혈구증가증 (PCV)을 포함하는 골수증식 질환 (MPD)을 포함한다. 골수성 악성종양은 또한 불응성 빈혈 (RA), 모세포과다성 불응성 빈혈 (RAEB), 및 형질전환중인 모세포과다성 불응성 빈혈 (RAEBT)뿐 아니라 병인불명 골수성 화생을 동반하거나 동반하지 않은 골수섬유증 (MFS)으로서 지칭될 수 있는 골수이형성증 (또는 골수이형성 증후군 또는 MDS)를 포함한다.
조혈 암은 또한 림프절, 비장, 골수, 말초혈, 및/또는 림프절외 부위에 영향을 줄 수 있는 림프성 악성종양을 포함한다. 림프성 암은 B-세포 악성종양을 포함하는데, 상기 악성종양은 이로 제한되는 것은 아니지만 B-세포 비호지킨 림프종 (B-NHL)을 포함한다. B-NHL은 무통성 (또는 저-등급), 중간-등급 (또는 공격적) 또는 고-등급 (매우 공격적)일 수 있다. 무통성 B-세포 림프종은 소포 림프종 (FL); 소림프구 림프종 (SLL); 결절 MZL, 결절외 MZL, 비장 MZL 및 융모 림프구를 지니는 비장 MZL을 포함하는 변연부 림프종 (MZL); 림프형질세포 림프종 (LPL); 및 점막-연관-림프성 조직 (MALT 또는 결절외 변연부) 림프종을 포함한다. 중간-등급 B-NHL은 백혈병 관련성이 있거나 없는 외투 세포 림프종 (MCL), 미만성 대세포 림프종 (DLBCL), 소포성 대세포 (또는 등급 3 또는 등급 3B) 림프종, 및 원발성 종격 림프종 (PML)을 포함한다. 고-등급 B-NHL은 버킷 림프종 (BL), 버킷-유사 림프종, 비분할 소세포 림프종 (SNCCL) 및 림프모구 림프종을 포함한다. 그 밖의 B-NHL은 면역모세포 림프종 (또는 면역세포종), 원발성 삼출성 림프종, HIV 관련 (또는 AIDS 관련) 림프종, 및 이식후 림프구증식 질환 (PTLD) 또는 림프종을 포함한다. B-세포 악성종양은 또한 이로 제한되는 것은 아니지만 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), 털세포 백혈병 (HCL), 대형 과립 림프구 (LGL) 백혈병, 급성 림프성 (또는 림프구 또는 림프모구) 백혈병, 및 캐슬맨 병을 포함한다. NHL은 또한 이로 제한되는 것은 아니지만 달리 명시되지 않은 (NOS) T-세포 비호지킨 림프종을 포함하는 T-세포 비호지킨 림프종 (T-NHL), 말초성 T-세포 림프종 (PTCL), 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 혈관면역모세포 림프성 질환 (AILD), 비내 자연 살해 (NK) 세포/T-세포 림프종, 감마/델타 림프종, 피부 T 세포 림프종, 균상식육종, 및 세자리(Sezary) 증후군을 포함할 수 있다.
조혈 암은 또한 전형적 호지킨 림프종, 결절 경화형 호지킨 림프종, 혼합 세포형 호지킨 림프종, 림프구 우세 (LP) 호지킨 림프종, 결절 LP 호지킨 림프종 및 림프구 고갈 호지킨 림프종을 포함하는 호지킨 림프종 (또는 질환)을 포함한다. 조혈 암은 또한 무증상 MM을 포함하는 다발성 골수종 (MM), 의미불명 (또는 비공지 또는 불명확) 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 형질세포종 (골, 골수외), 림프형질세포 림프종 (LPL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병, 및 일차 아밀로이드증 (AL)과 같은 형질 세포 질환 또는 암을 포함한다. 조혈 암은 또한 다형핵 백혈구 (또는 중성구), 호염기구, 호산구, 가지 세포, 혈소판, 적혈구 및 자연 살세포를 포함하는 추가의 조혈 세포의 기타 암을 포함할 수 있다. 본원에서 "조혈 세포 조직"으로서 지칭되는 조혈 세포를 포함하는 조직은 골수; 말초혈; 가슴샘; 및 주변 림프성 조직, 예컨대 비장, 림프절, 점막과 관련된 림프성 조직 (예컨대, 창자-관련된 림프성 조직), 편도, 파이어판 및 맹장, 및 그 밖의 점막과 연관된 림프성 조직, 예를 들어 기관지 내층을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 인간 BCMA에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 작제물을 나타낸다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, 또는 F(ab)2는 이들의 표준 의미로 사용된다(예를 들어, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) 참조).
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 이는 특별히 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 즉, 개별적 항체를 포함하는 집단은 적은 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 결합 부위에 대해 고도로 특이적으로 유도된다. 또한, 다양한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 다양한 항체를 통상적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제조물과는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일한 결정기에 대해 유도된다.
"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공여 항체 부류 또는 하위부류로부터 유래된 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 조작된 항체의 유형, 뿐만 아니라 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편을 나타낸다(US Patent No . 4,816,567 and Morrison et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855) (1984)).
"인간화 항체"는 비-인간 공여 면역글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖고, 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분이 하나(또는 그 초과)의 인간 면역글로불린(들)로부터 유래되는 조작된 항체의 유형을 나타낸다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화성을 보존하기 위해 변경될 수 있다(예를 들어, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조). 적합한 인간 수용체 항체는 공여 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, KABAT® 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스, 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성(아미노산 기준)을 특징으로 하는 인간 항체가 공여 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기에 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체 중쇄 및 경쇄가 동일 수용체 항체로부터 유래되는 것이 요구되는 것은 아님이 인지되어야 한다. 종래 분야는 상기 인간화 항체를 생성시키는 여러 방식을 기재하고 있으며, 예를 들어, EP-A-0239400호 및 EP-A-054951호를 참조하라.
핵산에 대해, 용어 "실질적 동일성"은 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되는 경우 뉴클레오티드의 적어도 약 80%, 뉴클레오티드의 적어도 약 90% 내지 약 95%, 또는 적어도 약 98% 내지 약 99.5%에서 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 지니며 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 세그먼트가 선택된 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 실질적 동일성이 존재한다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "동일성"은 경우에 따라 하기 (1) 및 (2)에 제공된 알고리즘을 이용하여 계산된 비교를 의미한다:
(1) 폴리뉴클레오티드에 대한 동일성은 제공된 서열 내의 뉴클레오티드의 전체 수에 100으로 나누어진 동일성 퍼센트를 규정하는 정수를 곱한 후, 상기 서열 내의 뉴클레오티드의 상기 전체 수로부터 그 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 계산되고:
nn ≤ xn - (xn·y),
상기 식에서, nn은 뉴클레오티드 변경의 수이고, xn은 제공된 서열 내의 뉴클레오티드의 전체 수이고, y는 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97, 또는 100%에 대해 1.00이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, xn 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xn으로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변경은 상기 코딩 서열에서 논센스, 미스센스 또는 프레임시프트 돌연변이를 발생시킬 수 있고, 이에 의해 상기 변경 후에 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드를 변경시킬 수 있다.
(2) 폴리펩티드에 대한 동일성은 아미노산의 전체 수에 100으로 나누어진 동일성 퍼센트를 규정하는 정수를 곱한 후, 아미노산의 상기 전체 수로부터 그 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 계산되고:
na ≤ xa - (xa·y),
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 수이고, xa는 서열 내의 아미노산의 전체 수이고, y는 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97, 또는 100%에 대해 1.00이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xa로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 함께 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.
"분리된"은 이의 자연 상태로부터 "사람에 의해" 변경된 것을 의미하고, 이의 본래의 환경으로부터 변경되거나 분리되거나, 변경 및 분리된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이 아니고, 이의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "분리된" 것이며, 이는 세포가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 분리된 것과 동일한 종 또는 유형의 세포일지라도, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 세포로 다시 도입되는 경우를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서 및 수반되는 청구항 전체에 걸쳐, 용어 "포함하는" 및 "포함하다"는 "구성되는" 및 "구성되다"를 포함한다. 즉, 상기 용어는 문맥이 허용하는 경우 특별히 언급되지 않은 다른 구성요소 또는 정수의 포함이 가능한 것을 뜻하는 것이다.
본 발명의 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 항원 결합 단백질이 인간 BCMA(hBCMA)에 결합하고, 다른 인간 단백질에 결합하지 않거나 유의하지 않게 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 본 발명의 항원 결합 단백질이 또한 BCMA의 다른 형태, 예를 들어, 영장류 BCMA과 교차 반응할 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 예를 들어, 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 TACI 또는 BAFF-R에 결합하지 않는다.
본 발명의 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "억제하다"는 BCMA의 생물학적 활성이 본 발명의 항원 결합 단백질의 부재하에서의 BCMA의 활성에 비해 본 발명의 항원 결합 단백질의 존재하에서 감소되는 것을 의미한다. 억제는 리간드 결합을 차단하고/거나, 리간드가 수용체를 활성화시키는 것을 방지하고/거나, BCMA을 하향 조절하는 것 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 억제는 또한 항원 결합 단백질이 BCMA에 결합하여 세포 아폽토시스 또는 ADCC를 야기하는 것을 지칭할 수 있다. 본 발명의 항체는 BCMA에 결합하는 BCMA 리간드 BAFF 및/또는 APRIL의 활성을 중화시킬 수 있다. 중화의 수준은 여러 방식, 예를 들어, 4.4에서 H929 세포 NFkB 신호전달 검정에서, 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 검정의 이용에 의해 측정될 수 있다. BCMA 리간드 BAFF 및 APRIL은 NFkB 신호전달 및 BCMA로의 결합 이후 다운스트림 사건을 유도할 수 있다. 이러한 검정에서 BCMA의 중화는 BAFF 또는 APRIL 유도된 NFkB 유도를 억제하는 항-BCMA 모노클로날 항체의 능력을 평가함으로써 측정된다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편이 중화시킬 수 있는 경우, 이는 인간 BAFF 또는 APRIL과 BCMA 사이의 상호작용의 억제를 나타낸다. 인간 BCMA에 대한 중화 활성을 갖는 것으로 간주되는 항체는 실시예 4.4에 기재된 바와 같은 H929 자극 검정에서 30 마이크로그램/ml 미만, 또는 20 마이크로그램/ml 미만, 또는 10 마이크로그램/ml 미만, 또는 5 마이크로그램/ml 미만 또는 1 마이크로그램/ml 미만 또는 0.1 마이크로그램/ml 미만의 IC50을 지닐 것이다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 도메인인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 면역글로불린의 가변 부분 내에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CDR"은 3개 모두의 중쇄 CDR, 또는 3개 모두의 경쇄 CDR(또는 적절한 경우 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 둘 모두)을 나타낼 수 있다.
CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 접촉 잔기 대부분을 제공한다. 본 발명의 관심 CDR은 공여 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되고, 이는 자연 발생 CDR의 유사체를 포함하고, 이러한 유사체는 또한 이들이 유래된 공여 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화 능력을 공유하거나 보유한다.
항체의 CDR 서열은 케이뱃 넘버링 시스템(Kabat et al; (Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)에 의해 결정될 수 있고, 대안적으로, 이들은 초티아 넘버링 시스템(Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), 접촉 정의 방법(MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) 또는 당업자에게 공지된 항체 내의 잔기를 넘버링하고 CDR을 결정하는 임의의 다른 확립된 방법에 의해 결정될 수 있다. 당업자가 이용가능한 CDR 서열에 대한 다른 넘버링 규칙은 "AbM"(University of Bath) 및 "접촉"(University College London) 방법을 포함한다. "최소 결합 단위"를 제공하기 위해 케이뱃, 초티아, AbM 및 접촉 방법 중 적어도 2개를 이용하여 최소 중첩 영역이 결정될 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 하위-부분일 수 있다.
하기 표 A는 각각의 CDR 또는 결합 단위에 대한 각각의 넘버링 규칙을 이용한 한 정의를 나타낸다. 가변 도메인 아미노산 서열을 넘버링하기 위해 표 X에서 케이뱃 넘버링 계획이 이용된다. CDR 정의 중 일부가 이용되는 개별적 간행물에 따라 다양할 수 있음이 인지되어야 한다.
표 A
Figure 112013119716171-pct00001
본 명세서 전체에 걸쳐, 항체 서열 내의 아미노산 잔기는 케이뱃 계획에 따라 넘버링된다. 유사하게, 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"는 문헌[Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987]에 기재된 바와 같은 케이뱃 넘버링 시스템을 따른다.
용어 "변이체"는 서열에서 하나 이상, 2개 또는 3개의 아미노산 변화를 지칭한다. 이러한 아미노산 변화는 결실, 치환 또는 부가일 수 있으나, 바람직하게는 치환이다. 상기 한 구체예에서, 치환은 보존적 치환이다.
대안적인 구체예에서, 변이체 서열은 정준 항원 결합 단백질을 보유하면서 하나 이상의 치환을 함유한다.
상보성 결정 영역 (CDR) L1, L2, L3, H1 및 H2는 주쇄 형태의 유한수(finite number) 중 하나를 구조적으로 나타내는 경향이 있다. CDR의 특정 정준 구조 부류는 CDR의 길이, 및 CDR 및 프레임워크 영역 둘 모두 내의 중요 위치에 위치된 잔기(구조적 결정 잔기 또는 SDR)에 의해 결정된 루프 패킹 둘 모두에 의해 규정된다. 마틴 및 토른톤(Martin and Thornton)의 문헌[1996; J Mol Biol 263:800-815]에서 "중요 잔기" 정준 주형을 규정하는 자동화된 방법이 생성되었다. CDR의 세트에 대한 정준 부류를 규정하기 위해 클러스터 분석이 사용되며, 정준 주형은 이후 매몰 소수성(buried hydrophobics), 수소-결합 잔기, 및 예컨대 보존된 글리신을 분석함으로써 확인된다. 항체 서열의 CDR은 중요 잔기 주형에 대해 서열을 비교하고, 동일성 또는 유사성 매트릭스를 이용하여 각 주형을 스코어링(scoring)함으로써 정준 부류로 지정될 수 있다.
용어 "VH" 및 "VL"은 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 각각 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질의 나머지와 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 나타낸다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 다른 단백질에 첨가되거나, 제거되거나, 전달될 수 있다. "항체 단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인, 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 보유한 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 다양한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 나타낸다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 다양한 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종다합체 또는 이종다합체)로 제공될 수 있고, 상기 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가 가변 도메인과 독립적으로 항원에 결합한다). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어인 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 이는 또한 설치류(예를 들어, WO 00/29004호에 개시되어 있음), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드 VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 VHH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 본 발명에 따른 "도메인 항체"인 것으로 여전히 간주된다. 본원에서 사용되는 "VH"는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 너스 샤크를 포함하는 연골성 어류에서 확인된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 유형이다. 이들 도메인은 또한 신규한 항원 수용체 가변 영역(통상적으로, V(NAR) 또는 NARV로 약어화됨)으로 공지되어 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)] 및 US20050043519A호를 참조하라.
용어 "에피토프-결합 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인을 나타내고, 이는 도메인 항체(dAb), 예를 들어, 인간, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 이는 자연 리간드가 아닌 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(transferrin)(트랜스-바디(trans-body)); 앙키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간 γ-크리스탈린(γ-crystallin) 및 인간 유비퀴틴(affilins); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠(toxinkunitz) 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin))으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 다양한 결합 특성을 부여하기 위해 이종성 서열로 치환될 수 있다. 다양한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로 공지되어 있다. 추가 세부사항을 위해, 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하라.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들어, 스테로이드, 빌린(bilin), 레티노이드 및 지질을 운반하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔 구조의 개방 말단에 다수의 루프를 갖는 단단한 β-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린(anticalin)은 160 내지 180개의 아미노산 크기이고, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US7250297B1호 및 US20070224633호를 참조하라.
어피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 도메인은 약 58개의 아미노산의 3-나선 다발로 구성된다. 표면 잔기의 무작위화에 의해 라이브러리가 생성되었다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 EP1641818A1호를 참조하라.
아비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 약 35개의 아미노산의 자연 도메인은 규정된 이황화결합된 구조를 채택한다. A-도메인의 패밀리에 의해 나타난 자연 변이의 셔플링(shuffling)에 의해 다양성이 생성된다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하라.
트랜스페린은 단량체 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 증식허용 표면 루프 내의 펩티드 서열의 삽입에 의해 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하라.
지정된 앙키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins)은 세포골격에 대한 내재 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 패밀리인 앙키린으로부터 유래된다. 단일 앙키린 반복은 2개의 α-나선 및 β-턴으로 구성되는 33개의 잔기의 모티프이다. 이들은 각 반복의 첫 번째 α-나선 및 β-턴 내의 잔기를 무작위화시킴으로써 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 접촉면은 모듈의 수를 증가(친화성 성숙의 방법)시킴으로써 증가될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) and J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US20040132028A1호를 참조하라.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 III(FN3)의 15개의 반복 단위의 10번째 도메인의 자연 아미노산 서열의 백본으로 구성된다. β-샌드위치의 한 말단의 3개의 루프는 애드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인지하는 것을 가능케 하도록 조작될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], US20080139791호, WO2005056764호 및 US6818418B1호를 참조하라.
펩티드 앱타머는 활성 부위에 삽입된 속박 가변 펩티드 루프를 함유하는 불변 스캐폴드 단백질, 통상적으로 티오레독신(thioredoxin)(TrxA)으로 구성되는 조합 인지 분자이다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하라.
미세소체는 3-4개의 시스테인 브릿지를 함유하는 25-50개의 아미노산 길이의 자연 발생 미세단백질(microprotein)로부터 유래되며 - 미세단백질의 예는 KalataB1 및 코노톡신(conotoxin) 및 크노틴(knottin)을 포함한다. 미세단백질은 미세단백질의 전체 폴드에 영향을 미치지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인의 추가 세부사항에 대해서는, WO2008098796호를 참조하라.
다른 에피토프 결합 도메인은 다양한 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위해 스캐폴드로 사용되는 단백질을 포함하고, 이는 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린(affilins)), 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈 독소(카리브도톡신(charybdotoxin)), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴)을 포함하며, 이들은 문헌[Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) and Protein Science 15:14-27 (2006)]의 챕터 7에 개관되어 있다. 본 발명의 에피토프 결합 도메인은 상기 대안적 단백질 도메인 중 임의의 대안적 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 상의 부위를 나타내며, 이는 단일 도메인, 예를 들어, 에피토프-결합 도메인일 수 있거나, 이는 표준 항체에서 발견될 수 있는 바와 같은 쌍을 이룬 VH/VL 도메인일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 단쇄 Fv(ScFv) 도메인은 항원-결합 부위를 제공할 수 있다.
용어 "mAbdAb" 및 dAbmAb"는 본 발명의 항원-결합 단백질을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 상기 2개의 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본원에서 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 항체, 항체 단편, 예를 들어, 도메인 항체(dAb), ScFv, Fab, Fab2, 및 다른 단백질 작제물을 나타낸다. 항원 결합 분자는 적어도 하나의 Ig 가변 도메인, 예를 들어, 항체, 도메인 항체(dAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, 디아바디, mAbdAb, 어피바디, 헤테로컨쥬게이트 항체 또는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 dAb, 즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, VH, VHH 또는 VL이다. 항원 결합 분자는 2개의 표적에 결합할 수 있고, 즉, 이들은 이중 표적화 단백질일 수 있다. 항원 결합 분자는 항체 및 항원 결합 단편의 조합물, 예를 들어, 모노클로날 항체에 연결된 하나 이상의 도메인 항체 및/또는 하나 이상의 ScFv일 수 있다. 항원 결합 분자는 또한 비-Ig 도메인, 예를 들어, OSM에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앙키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "항원 결합 단백질"은 인간 OSM을 길항시키고/시키거나 중화시킬 수 있을 것이다. 또한, 항원 결합 단백질은 OSM에 결합하고, 자연 리간드가 gp130 수용체에 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 것을 방지함으로써 OSM 활성을 억제하고/하거나 차단할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "효과기 기능"은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 활성(ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성(CDC) 매개 반응, Fc-매개 포식작용 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재이용 중 하나 이상을 나타내는 것을 의미한다. IgG 항체에 대해, ADCC 및 ADCP를 포함하는 효과기 기능은 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면 상에 존재하는 Fcγ 수용체의 패밀리의 상호작용에 의해 매개된다. 인간에서, 이들은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)를 포함한다. 항원에 결합된 항원 결합 단백질과 Fc/Fcγ 복합체의 형성 사이의 상호작용은 세포독성, 면역 세포 활성화, 포식작용 및 염증성 사이토카인의 방출을 포함하는 광범위한 효과를 유도한다.
항원 결합 단백질의 불변 영역과 다양한 Fc 수용체(FcR) 사이의 상호작용은 항원 결합 단백질의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 유의한 생물학적 효과는 효과기 기능, 특히, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 보체의 고정(보체 의존성 세포독성 또는 CDC), 및 항원 결합 단백질의 반감기/청소의 결과일 수 있다. 보통, 효과기 기능을 매개하는 능력은 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 필요로 하며, 모든 항원 결합 단백질이 모든 효과기 기능을 매개하지는 않을 것이다.
효과기 기능은 ADCC 효과기 기능을 측정하기 위해, 예를 들어, 자연 살세포에 대해 FcγRIII의 결합을 통하거나 단핵구/대식세포에 대해 FcyRI을 통하는 것을 포함하는 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연 살세포 검정에서 ADCC 효과기 기능에 대해 평가될 수 있다. 상기 검정의 예는 문헌[Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010]에서 발견될 수 있다. CDC 기능을 결정하는 검정의 예는 문헌[1995 J Imm Meth 184:29-38]에 기재된 것을 포함한다.
인간 불변 영역의 일부 아이소형(isotype), 특히 IgG4 및 IgG2 아이소형은 본질적으로 a) 고전 경로에 의한 보체의 활성화, 및 b) 항체-의존성 세포 세포독성의 기능이 결핍되어 있다. 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역에 대한 다양한 변형은 요망되는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키고, 이에 따라 ADCC 및 CDC를 감소시키는 특정 돌연변이를 함유하는 IgG1 불변 영역이 따로 기재되었다(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168).
본 발명의 한 구체예에서, 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 감소된 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능을 갖는다. 한 상기 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4 아이소형의 자연적으로 불능화된 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 EP0307434호에 기재되어 있다. 한 예는 위치 235 및 237에서 알라닌 잔기의 치환을 포함한다(EU 지표 넘버링).
잔기 Asn297에 특정 돌연변이 또는 변경된 당화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역은 또한 Fc 수용체에 대한 결합을 향상시키는 것으로 기재되었다. 일부 경우에, 이들 돌연변이는 또한 ADCC 및 CDC를 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591 -6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
본 발명의 한 구체예에서, 상기 돌연변이는 239, 332 및 330(IgG1)으로부터 선택된 위치 중 하나 이상, 또는 다른 IgG 아이소형 내의 동등한 위치에 존재한다. 적합한 돌연변이의 예는 S239D 및 I332E 및 A330L이다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명의 항원 결합 단백질은 S239D 및 I332E와 같이 위치 239 및 332에서 돌연변이되거나, 한 추가 구체예에서, 이는 S239D 및 I332E 및 A330L과 같이 239 및 332 및 330으로부터 선택된 3개 이상의 위치에서 돌연변이된다(EU 지표 넘버링).
본 발명의 한 대안적 구체예에서, 변경된 당화 프로파일을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖는다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC를 갖거나, 이는 향상된 ADCC 및 CDC 효과기 기능 둘 모두를 갖는다. 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키기에 적합한 방법의 예는 WO2003011878호, WO2006014679호 및 EP1229125호에 기재되어 있으며, 상기 모두는 본 발명의 항원 결합 단백질에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화되는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 생성을 위한 방법을 제공한다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, FUT8 유전자의 기능성 카피가 결핍된 CHOK1SV 세포가 기능성 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생성된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된 향상된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생성시키는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ)로부터 이용가능한 포텔리젠트(POTELLIGENT)™ 기술 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 포텔리젠트™ 기술 시스템의 양태는 모두 참조로서 본원에 포함되는 US7214775호, US6946292호, WO0061739호 및 WO0231240호에 기재되어 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질, 예를 들어, IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인을 갖는 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC, 또는 향상된 ADCC 및 CDC 기능을 갖는다. 한 상기 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG3으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함할 수 있거나, 둘 모두의 CH2 도메인은 IgG3으로부터 유래될 수 있다.
또한, a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 생성하는 방법이 제공된다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 재조합 숙주 세포가, IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열이 발현되어 상기 키메라 Fc 도메인이 결핍된 달리 동일한 항원 결합 단백질에 비해 증가된 향상된 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 발현 벡터를 포함하는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ) 및 Kyowa Hakko Kogyo(현재, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd.로부터 이용가능한 컴플리젠트(COMPLEGENT)™ 기술 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 컴플리젠트™ 기술 시스템의 양태는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 WO2007011041호 및 US20070148165호에 기재되어 있다. 한 대안적 구체예에서, CDC 활성은 IgG 사슬의 Fc 영역으로 서열 특이적 돌연변이를 도입시킴으로써 증가될 수 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
이러한 변형은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 효과기 기능을 추가로 향상시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 한 상기 구체예에서, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택될 수 있음)를 가져, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다. 한 구체예에서, IgG1 CH2 도메인은 돌연변이 S239D 및 I332E를 갖는다.
본 발명의 한 대안적 구체예에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질이 제공된다. 한 상기 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 당화 프로파일을 가지며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 탈푸코실화(defucosylation)되어 상기 항원 결합 단백질은 상기 돌연변이 및 변경된 당화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는 동등한 항원 결합 단백질과 비교하여 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다. 한 대안적 구체예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 적어도 하나의 중쇄 불변 도메인을 갖고, 둘 모두의 IgG CH2 도메인은 본원에 기재된 제한에 따라 돌연변이된다.
본 발명의 한 양태에서, a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 함유하는 발현 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 Fc 핵산 서열을 추가로 포함하고, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화되는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 제공된다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 키메라 Fc 도메인이 결핍되어 있고 올리고당류 상에 푸코스를 갖는 달리 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된 ADCC 및 CDC 향상된 활성 둘 모두를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는, 포텔리젠트™ 및 컴플리젠트™ 기술 시스템을 조합시킨 BioWa, Inc.(Princeton, NJ)으로부터 이용가능한 ACCRETAMAB™ 기술 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 변경된 당화 프로파일을 가져 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖는다. 한 구체예에서, 돌연변이는 위치 239 및 332 및 330으로부터 선택되고, 예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택된다. 한 추가 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 Ch2 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 당화 프로파일을 갖고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 탈푸코실화되어, 상기 항원 결합 단백질은 동등한 비-키메라 항원 결합 단백질 또는 상기 돌연변이 및 변경된 당화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 비해 향상된 효과기 기능을 갖는다.
면역컨쥬게이트
또한, 이로 제한되는 것은 아니지만 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예컨대, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성컨쥬게이트)에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는 면역컨쥬게이트 (상호교환적으로 "항체-약물 컨쥬게이트" 또는 "ADC"로서 지칭됨)가 제공된다.
면역컨쥬게이트는 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 사멸시키는 약물의 국소 전달에 이용되어 왔다 (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 151-172; U.S. Pat. No. 4,975,278). 면역컨쥬게이트는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화 전달 및 그 안에서 세포내 축적을 가능하게 하는데, 이 때 컨쥬게이션되지 않은 약물의 전신 투여는 정상 세포뿐 아니라 제거하고자 하는 종양 세포에 허용될 수 없는 수준의 독성을 발생시킬 수 있다 (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies have been reported as useful in these strategies (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21 : 183-87). 이러한 방법에 이용된 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986) supra). 항체-독소 컨쥬게이트에 이용된 독소는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신과같은 소분자 독소 (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 마이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리케아미신 (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 일반적인 구조를 갖는 면역컨쥬게이트를 포함한다:
ABP - ((링커)n - Ctx)m
여기에서, ABP는 항원 결합 단백질이고,
링커는 부재하거나 본원에 기재된 절단가능하거나 절단불가능한 임의의 링커이고,
Ctx는 본원에 기재된 임의의 세포독성제이고,
n은 0, 1, 2, 또는 3이고,
m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
MMAE 및 MMAF와 같은 아우리스타틴에 MC 링커에 의해 연결된 항체의 예가 하기 구조식으로 도시된다:
Figure 112013119716171-pct00002
특정 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 이로 제한되는 것은 아니지만 항체 및 화학요법제 또는 그 밖의 독소를 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 면역컨쥬게이트의 생성에 유용한 화학요법제는 본원에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레유리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다. 예컨대, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232호를 참조하라. 다양한 방사성핵종을 방사성컨쥬게이션된 항체의 생성에 이용할 수 있다. 그 예는 211At, 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 이로 제한되는 것은 아니지만 칼리케아미신, 마이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센 및 CC1065를 포함하는 하나 이상의 독소, 및 독소 활성을 갖는 이러한 독소의 유도체에 컨쥬게이션될 수 있다. 적합한 세포독성제는 이로 제한되는 것은 아니지만 도발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌 (MMAF) 및 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)뿐 아니라 MMAE의 에스테르 형태를 포함하는 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 작은 홈 알킬화제, 에네디인, 렉시트롭신, 두오카르마이신, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 탁산, 푸로마이신, 돌라스타틴, 마이탄시노이드, 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 특수한 세포독성제는 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레타트스타틴, 칼리케아미신, 마이탄신, DM-1, DM-4, 네트롭신을 포함한다. 그 밖의 적합한 세포독성제는 항튜불린제, 예컨대 아우리스타틴, 빈카 알칼로이드, 포도필로톡신, 탁산, 박카틴 유도체, 크립토피신, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 또는 돌라스타틴을 포함한다. 항튜불린제는 디메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌디아민 (AFP), MMAF, MMAE, 아우리스타틴 E, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, VP-16, 캄프토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 노코다졸, 콜히친, 콜시미드, 에스트라무스틴, 세마도틴, 디스코데르몰리드, 마이탄신, DM-1, DM-4 또는 엘레우테로빈을 포함한다.
항체 약물 컨쥬게이트는 소분자 항튜불린제 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE) 또는 모노메틸아우리스타틴 F (MMAF)를 항체에 컨쥬게이션시킴에 의해 생성되었다. MMAE의 경우 링커는 자가-이몰러티브(immolative) 단편화기인 티올-반응성 말레이미드, 카프로일 스페이서, 디펩티드 발린-시트룰린, 및 p-아미노벤질옥시카르보닐로 구성된다. MMAF의 경우 프로테아제-내성 말레이미도카프로일 링커가 사용된다. 컨쥬게이션 과정은 각각의 항체 분자에 결합된 약물의 수 (몰 비 [MR]), 및 부착 부위 둘 모두에 변화를 주면서, 약물-항체 부착에서의 이질성을 초래한다. 가장 보급된 종류는 MR = 4인 물질이고; 덜 보급된 것이 0, 2, 6, 및 8의 MR을 지니는 물질이다. 일반적인 평균 약물-대-항체 MR은 약 4이다.
면역컨쥬게이트의 생성
부착 지점은 항체가 단백질 G 친화성 수지에 고정되는 동안 수행되는 항체의 사슬간 디설파이드의 가벼운 환원에 의해 생산되는 시스테인이다 (따라서, 중간 정제 없이 과량의 큰 시약의 이용이 가능하다). 고정되는 동안, 과량의 큰 TCEP는 사슬간 디설파이드를 충분히 환원시킬 것이나 수지에 대한 항체의 결합에는 아무런 영향을 주지 않는다.
이러한 절차에 의해 생성된 항체당 티올의 수는 항체의 공급원 및 아이소형에 의존적이다. 예를 들어, 인간 (및 마우스-인간 키메라) IgG1는 4개의 환원가능한 디설파이드를 지니므로, 충분한 환원시에 8개의 티올을 생성하는 한편, 뮤린 IgG1는 5개의 환원가능한 디설파이드를 지니고 10개의 티올을 생성한다. 최대 약물 로딩된 ADC (예컨대, 뮤린 IgG1의 경우 항체당 10개 약물)가 요망되는 경우, 말레이미도-약물-링커는 완전한 컨쥬게이션을 확보하기 위해 충분히 과량으로 고정된 항체에 간단히 첨가될 수 있다. 그러나, 항체 상에서 이용가능한 티올의 일부를 차지하는 N-에틸 말레이미드 (NEM)와 같은 생물학적으로 비활성인 캡핑제(capping agent)를 포함시킴에 의해 항체당 보다 적은 약물을 지니는 ADC가 또한 충분히 환원된 항체로부터 제조될 수 있다. 말레이미도-약물-링커 및 캡핑제가 충분히 환원된 항체에 동시에 그리고 매우 과량으로 (적어도 3배) 첨가될 때, 2개의 말레이미드 친전자체는 제한적인 수의 이용가능한 티올에 대해 경쟁한다. 이러한 양상으로, 약물 로딩이 약물-링커 및 캡핑제의 상대적인 티올 반응률에 의해 결정되므로, 이것은 속도론적 제어하에 있는 것으로 고려될 수 있다. 말레이미도-약물-링커의 상대적인 반응률은 현저하게 변하므로, 반응 혼합물에 존재하는 NEM에 대한 약물-링커의 몰 비는 요망되는 수준의 약물 로딩을 갖는 ADC의 패널에 도달하도록 경험적으로 결정되어야 한다. 항체당 약 4개의 약물을 갖는 ADC를 제공하는 NEM 혼합물 중 약물 링커 SGD-1006 (vcMMAE) 및 SGD-1269 (mcMMAF)의 몰 분획이 일반적인 인간 및 뮤린 IgG 아이소형에 대해 표 2에 요약되어 있다.
아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴에 컨쥬게이션된 항원 결합 단백질 또는 항체를 포함한다 (U.S. Pat. Nos. 5,635,483; 5,780,588). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 동력학, GTP 가수분해, 및 핵과 세포 분열 (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)을 방해하고 항암 (U.S. Pat. No. 5,663,149) 및 항진균 활성 (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 (돌라스타틴의 펜타펩티드 유도체임) 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 구체예는 그 전문이 명백하게 참조로서 포함된 문헌["Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," U.S. Patent No. 7,498,298]에 기재된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약어 "MMAE"는 모노메틸 아우리스타틴 E를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약어 "MMAF"는 도발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌을 지칭한다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 펩티드 결합은, 예를 들어, 펩티드 화학 분야에 널리 알려져 있는 액체상 합성 방법 (문헌[E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides," volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press]을 참조하라)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 문헌[U.S. Pat. No. 5,635,483; U.S. Pat. No. 5,780,588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; and Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," U.S. Patent No. 7,498,298, filed Nov. 5, 2004]을 참조하라 (예컨대, 링커 및 링커에 컨쥬게이션된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물을 제조하는 방법을 기재하고 있음). 세포독성제처럼 작용하는 생물학적으로 활성인 유기 화합물, 특히 펜타펩티드가 문헌[US Patent Nos. 6,884,869; 7,498,298; 7,098,308; 7,256,257; and 7,423,116]에 기재되어 있다. MMAE 및 MMAF뿐 아니라 아우리스타틴의 다양한 유도체에 연결된 모노클로날 항체 및 이를 제조하는 방법이 문헌[US Patent NO. 7,964,566]에 기재되어 있다.
아우리스타틴의 예는 구조가 하기에 도시되어 있는 MMAE 및 MMAF를 포함한다:
Figure 112013119716171-pct00003
Figure 112013119716171-pct00004
마이탄신 및 마이탄시노이드
마이탄시노이드는 튜불린 중합화를 억제함에 의해 작용하는 유사분열(mitototic) 억제제이다. 마이탄신은 동아프리카 슈럽 마이테누스 세라타(shrub Maytenus serrata)에서 처음 분리되었다 (U.S. Pat. No. 3,896,111). 후속하여, 특정 미생물이 또한 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생성함이 밝혀졌다 (U.S. Pat. No. 4,151,042). 고도로 세포독성인 마이탄시노이드 약물은 악티노신네마(Actinosynnema)와 같은 미생물의 발효에 의해 생산된 안사미토신 전구체로부터 제조될 수 있다. 안사미토신을 분리하는 방법은 문헌[US Patent No. 6,573,074]에 기재되어 있다.
합성 마이탄시놀 및 이의 유도체와 유사체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 기재되어 있다.
항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 마이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 현저히 약화시키지 않으며 항체를 마이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,208,020호를 참조하라. 비록 심지어 한 분자의 독소/항체도 네이키드 항체의 이용에 비해 세포독성을 향상시킬 것으로 예상되나, 항체 분자당 컨쥬게이션된 평균 3-4개의 마이탄시노이드 분자가 항체의 기능 또는 용해성에 부정적인 영향을 미치지 않으며 표적 세포의 세포독성을 향상시키는데 있어서 효능을 나타내었다.
마이탄시노이드는 당 분야에 잘 알려져 있고 공지된 기술에 의해 합성될 수 있거나 천연 공급원으로부터 분리될 수 있다. 적합한 마이탄시노이드는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020호 및 상기 언급된 그 밖의 특허 및 비특허 간행물에 기재되어 있다. 마이탄시노이드는 다양한 마이탄시놀 에스테르와 같은 마이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체이다. 항체와의 연결을 위해 마이탄시노이드를 제조하는 방법은 미국 특허 번호 6,570,024호 및 6,884,874호에 기재되어 있다.
칼리케아미신
항생제의 칼리케아미신 패밀리는 피코몰 이하 농도의 이중-가닥 DNA 파괴를 발생시킬 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 컨쥬게이트의 제조에 대해서는, 문헌[U.S. Pat. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 American Cyanamid Company)]을 참조하라. 이용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 이로 제한되는 것은 아니지만 .gamma.1l, .alpha.2l, .alpha.3l, N-아세틸-.gamma.1l, PSAG 및 .theta.1l (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) and the aforementioned U.S. patents to American Cyanamid)을 포함한다. 항체가 컨쥬게이션될 수 있는 또 다른 항종양 약물은 엽산길항제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 모두는 세포내 작용 부위를 지니고 형질막을 용이하게 가로지르지 않는다. 따라서, 항체 매개된 내재화를 통한 이러한 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
그 밖의 세포독성제
항체에 컨쥬게이션될 수 있는 그 밖의 항종양제는 미국 특허 번호 5,053,394호, 5,770,710호에 기재된 총괄적으로 LL-E33288 복합체로서 알려진 작용제의 패밀리인 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실뿐 아니라 에스페라미신 (U.S. Pat. No. 5,877,296)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에어루기노사로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레유리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232호를 참조하라.
본 발명은 항체와 화합물간에 형성된 핵산분해 활성을 지니는 면역컨쥬게이트를 추가로 고려한다 (예컨대, 데옥시리보뉴클레아제와 같은 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제; DNase).
종양의 선택적 파괴를 위해, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성컨쥬게이션된 항체의 생성에 이용될 수 있다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 컨쥬게이트가 검출에 이용될 때, 이는 신티그래프 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기공명 (NMR) 이미징 (자기공명 이미징, mri로도 알려짐)을 위한 스핀 표지, 예컨대 아이오딘-123 그 밖에, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 카본-13, 니트로겐-15, 옥시겐-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 그 밖의 표지가 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 예를 들어 수소 대신 플루오린-19를 포함시킨 적합한 아미노산 전구체를 이용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)을 이용하여 아이오딘-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]은 그 밖의 방법을 상세하게 기재하고 있다.
ADC의 제조
항체 약물 컨쥬게이트에서, 항체를 세포독성제에 직접 또는 링커를 통해 컨쥬게이션시킬 수 있다. 적합한 링커는, 예를 들어, 절단가능한 링커와 절단불가능한 링커를 포함한다. 절단가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건하에 절단되기 쉽다. 적합한 절당가능한 링커는, 예를 들어, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 링커는 디펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린 (val-cit) 또는 페닐알라닌-리신 (phe-lys) 링커일 수 있다. 그 밖의 적합한 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해될 수 있는 링커, 예컨대 하이드라존 링커를 포함한다. 추가의 적합한 절단가능한 링커는 디설파이드 링커를 포함한다.
Bristol-Myers Squibb은 특정한 리소좀 효소-절단가능한 항종양 약물 컨쥬게이트를 기재하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,345호를 참조하라. Seattle Genetics는 약물 전달제에서의 p-아미노벤질에테르를 기재하고 있는 공개된 출원 미국 특허 출원 2003/0096743호 및 미국 특허 출원 2003/0130189호를 지닌다. 상기 출원에 기재된 링커는 아미노벤질 에테르 조성물로 제한된다.
항원 결합 단백질 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용기성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이작용기성 단백질 커플링제를 이용하여 제조될 수 있다.
추가로 링커는 하나 이상의 링커 구성요소로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 구성요소는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트 ("SIAB")를 포함한다. 추가의 링커 구성요소가 당 분야에 알려져 있고 일부는 본원에 기재되어 있다. 또한, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된 문헌["Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," U.S. Patent No. US7,498,298, filed Nov. 5, 2004]을 참조하라.
링커는 또한 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 아미노산 링커 구성요소는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 구성요소를 포함하는 아미노산 잔기는 자연 발생인 것뿐 아니라 작은 아미노산 및 비자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 구성요소는 특정 효소, 예를 들어, 종양-연관된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이들의 선택성에 대해 설계되고 최적화될 수 있다.
항원 결합 단백질 및 항체는 링커 시약과의 컨쥬게이션에 반응성이도록 제조될 수 있다. 항체 상의 친핵성 기는 이로 제한되는 것은 아니지만 (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예컨대 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예컨대 시스테인, 및 (iv) 항체가 당화된 경우, 당 하이드록실 또는 아미노기를 포함한다. 아민, 티올, 및 하이드록실기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드기를 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 사슬간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 지닌다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제로의 처리에 의해 링커 시약과의 컨쥬게이션에 반응성이도록 제조될 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는, 이론적으로는, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기는 리신과 2-이미노티올란 (트라우트 시약)을 반응시켜 아민을 티올로 전환시킴에 의해 항체로 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 시스테인 잔기를 도입시킴에 의해 항체 (또는 이의 단편)로 도입될 수 있다 (예컨대, 하나 이상의 비자연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 항체를 제조).
항원 결합 단백질 및 항체는 또한 링커 시약 또는 약물 상에서 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자 모이어티를 도입하도록 변형될 수 있다. 당화된 항체의 당은, 예컨대 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화되어 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 시프(Schiff) 염기성 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 예컨대 안정한 아민 연결을 형성하기 위해 보로하이드라이드 시약에 의해 환원될 수 있다. 한 구체예에서, 당화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타-퍼아이오데이트의 반응으로 약물 (Hermanson, Bioconjugate Techniques) 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데하이드 및 케톤)기를 단백질에 생성할 수 있다. 또 다른 구체예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질은 소듐 메타-퍼아이오데이트와 반응하여 처음 아미노산 대신 알데하이드를 생성할 수 있다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; U.S. Pat. No. 5,362,852). 상기 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
약물 모이어티 상의 친핵성 기는 이로 제한되는 것은 아니지만 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드기를 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드기를 포함한다.
일부 구체예에서, 링커는 세포내 환경 (예컨대, 리소좀 또는 엔도솜 또는 소포내)에 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있다. 링커는, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니지만 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있고, 이들 모두는 표적 세포 내부에 활성 약물의 방출을 발생시키는 디펩티드 약물 유도체를 가수분해시키는 것으로 알려져 있다 (예컨대, 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123]을 참조하라). 펩티딜 링커는 세포에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 카텝신-B에 의해 절단될 수 있는 펩티딜 링커를 이용할 수 있다 (예컨대, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:50) 링커). 그 밖의 상기 링커가, 예컨대 미국 특허 번호 6,214,345호에 기재되어 있다. 특수한 구체예에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커이다 (예컨대, val-cit 링커를 이용한 독소루비신의 합성을 기재하고 있는 미국 특허 번호 6,214,345호를 참조하라). 치료제의 세포내 단백질분해 방출의 한 가지 이점은 컨쥬게이션될 때 작용제가 통상적으로 약독화되고 컨쥬게이트의 혈청 안정성이 통상적으로 높다는 것이다.
다른 구체예에서, 절단가능한 링커는 pH-민감성이며, 즉 특정 pH 값에서 가수분해에 민감하다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산 조건하에 가수분해될 수 있다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산-불안정 링커 (예컨대, 하이드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니트산 아미드, 오르소에스테르, 아세탈, 케탈 등)를 이용할 수 있다. (예컨대, U.S. Pat. Nos. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661을 참조하라). 상기 링커는 혈액의 pH와 같은 중성 pH 조건하에 상대적으로 안정하지만, 리소좀의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 특정 구체예에서, 가수분해될 수 있는 링커는 티오에테르 링커이다 (예컨대, 아실하이드라존 결합을 통해 치료제에 부착된 티오에테르 (예컨대, 미국 특허 번호 5,622,929호를 참조하라)).
또한 다른 구체예에서, 링커는 환원 조건하에 절단될 수 있다 (예컨대, 디설파이드 링커). 예를 들어, SATA (N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)-, SPDB 및 SMPT를 이용하여 형성될 수 있는 것들을 포함하는 다양한 디설파이드 링커가 당 분야에 알려져 있다 (예컨대, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. 또한 U.S. Pat. No. 4,880,935를 참조하라)를 참조하라.
또한 다른 특수한 구체예에서, 링커는 말로네이트 링커 (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12)이다.
전형적으로, 링커는 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않다. 본원에서 사용된 바와 같이 링커와 관련해서 "세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않다"는 것은 ADC 또는 ADC 유도체가 세포외 환경 (예컨대, 혈장에) 제공될 때 ADC 또는 ADC 유도체의 샘플에 있는 링커의 약 20% 이하, 전형적으로 약 15% 이하, 보다 전형적으로 약 10% 이하, 및 심지어 더욱 전형적으로 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하가 절단됨을 의미한다. 링커가 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은지 여부는, 예를 들어 (a) ADC 또는 ADC 유도체 ("ADC 샘플") 및 (b) 등몰량의 컨쥬게이션되지 않은 항체 또는 치료제 ("대조군 샘플") 둘 모두를 소정의 기간 (예컨대, 2, 4, 8, 16, 또는 24시간) 동안 혈장과 독립적으로 인큐베이션시킨 다음, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정되는, ADC 샘플에 존재하는 컨쥬게이션되지 않은 항체 또는 치료제의 양을 대조군 샘플에 존재하는 양과 비교함에 의해 측정될 수 있다.
그 밖의 상호적으로 배타적이지 않은 구체예에서, 링커는 세포 내재화를 촉진시킨다. 특정 구체예에서, 링커는 치료제에 컨쥬게이션될 때 세포 내재화를 촉진한다 (즉, 본원에 기재된 바와 같이 ADC 또는 ADC 유도체의 링커-치료제 모이어티의 환경에서). 또한 그 밖의 구체예에서, 링커는 치료제 및 항원 결합 단백질 또는 항체 또는 이의 유도체 둘 모두에 컨쥬게이션될 때 세포 내재화를 촉진한다 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 ADC 또는 ADC 유도체의 환경에서).
본 조성물 및 방법에 이용될 수 있는 다양한 링커는 문헌[WO 2004010957 entitled "Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease" filed Jul. 31 , 2003, and U.S. Provisional Application No. 60/400,403, entitled "Drug Conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease", filed Jul. 31, 2002 (이의 기재는 본원에 참조로서 포함된다)]에 기재되어 있다.
대안적으로, 항원 결합 단백질 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예컨대 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 컨쥬게이트의 요망되는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 엔코딩하는 영역에 의해 분리되거나 서로 인접한 컨쥬게이트의 두 부분을 엔코딩하는 개별적인 영역을 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 항체는 종양 전-표적화에서의 활용을 위해 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 컨쥬게이션될 수 있고, 이 때 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 후에, 제거제를 이용하여 순환에서 결합되지 않은 컨쥬게이트를 제거한 다음, 세포독성제 (예컨대, 방사성뉴클레오티드)에 컨쥬게이션된 "리간드" (예컨대, 아비딘)를 투여한다.
본원에서 사용되는 용어 "비 인간 항체 또는 이의 항체 단편"은 인간이 아닌 임의의 종으로부터 기원되는 항체 또는 이의 단편을 나타내는 것을 의미하며, 여기서 인간은 키메라 항체를 포함한다.
용어 "공여 항체"는 이의 가변 도메인, CDR, 또는 이의 다른 기능성 단편 또는 유사체의 아미노산 서열을 첫 번째 면역글로불린 파트너에 제공하여, 공여 항체의 항원성 특이성 및 중화 활성 특징을 갖는 변경된 면역글로불린 코딩 영역 및 결과로서 발현된 변경된 항체를 제공하는 항체(모노클로날, 및/또는 재조합)를 나타낸다.
용어 "수용체 항체"는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 엔코딩하는 아미노산 서열 모두(또는 임의의 일부, 바람직하게는 모두)를 첫 번째 면역글로불린 파트너에 제공하는 공여 항체에 이종성인 항체(모노클로날 및/또는 재조합)를 나타낸다. 인간 항체는 수용체 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 수용체 서열"은 인간 항체 또는 이의 항체 단편으로부터 유래된 VH 또는 VL 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편의 프레임워크 또는 비-인간 종으로부터의 CDR이 통합될 수 있는 인간 컨센서스 서열 프레임워크를 나타내는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 CDR 또는 과가변 영역의 "통합"은 비-인간 CDR이 인간 수용체 프레임워크와 함께 위치되는 임의의 수단을 포함한다. 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있고, 예를 들어, 요망되는 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산이 비-인간 가변 도메인 서열을 엔코딩하는 핵산을 이의 프레임워크 잔기가 인간 수용체 프레임워크 잔기로 변경되도록 돌연변이시키거나, 인간 가변 도메인 서열을 엔코딩하는 핵산을 CDR이 비-인간 잔기로 변경되도록 돌연변이시키거나, 요망되는 서열을 엔코딩하는 핵산을 합성함으로써 생성될 수 있음이 인지될 것이다. 한 구체예에서, 최종 서열은 인 실리코(in silico)로 생성된다.
본 발명은 이제 실시예로만 기재된다. 첨부된 청구항은 하기 실시예 중 하나 이상의 개괄을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 모노클로날 항체 생성 및 선택
1.1 면역화 방법
항-인간 BCMA mAb 뮤린 부모 CA8은 전장 인간 BCMA로 면역화된 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터 동정되었다. BALB/c 마우스는 CFA와 조합된 25 ㎍의 재조합 (rBCMA) 단백질로 i.p. 면역되었다. 마우스를 25 ㎍의 전장 rBCMA 단백질 + 10 ㎍의 모노포스포릴 지질 A-안정한 에멀젼 (MPL-SE) (Corixa Corporation, Seattle, WA)을 이용하여 1개월 간격으로 3회 추가접종하였고 융합 3일 전에 30 ㎍의 rBCMA 단백질의 융합 전 추가접종을 i.v. 제공하였다. 하이브리도마를 생성시키고 ClonaCell-HY 하이브리도마 클로닝 키트 (StemCell Technologies, Vancouver, BC)를 이용하거나 통상적인 방법을 이용하여 클로닝시켰다. 통상적인 방법에서, 면역화된 동물의 비장으로부터의 B 세포를 PEG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 존재하에 Sp2/0 골수종 세포와 융합시켰다. 밤새 회수한 후에, 융합된 세포를 제한적인 희석률로 96웰 플레이트에 플레이팅하고 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 선택에 적용시켰다. 하이브리도마 배양 상청액을 ELISA 및 유세포분석에 의해 항-BCMA 항체의 존재에 대해 조사하였다.
항-인간 BCMA mAb 뮤린 부모 S307118G03를 RIMMS 방법 (급속 면역화 다중 부위)을 이용하여 재조합 인간 BCMA/TNFRSF17-Fc 키메라 (R&D 193-Fc)로 면역화된 SJL 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터 동정하였다. 0일에 마우스당 5㎍의 단백질을 등의 2 부위 (좌골 위 및 어깨 위) 및 전방의 4 부위의 주요 림프절 밑에서 AS02a 애쥬번트에 에멀젼화시켰다. 6일 및 11일에, RIBI 애쥬번트 중 마우스당 2.5㎍의 단백질을 전방 4 부위의 주요 림프절 밑에 주입하였다. 14일에 마우스를 치사시켰다. 림프절 및 비장을 절제하고, 붕괴시키고, 마우스 골수종 세포 X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58)와 3:1 비를 이용하여 PEG1500 유도된 체세포 융합을 수행하였다. 융합물을 10 x 96웰 플레이트로 플레이팅하고 이로부터 직접 스크리닝하였다.
항-인간 BCMA mAb 뮤린 부모 S336105A07를 동일한 면역화로부터 유래된 하이브리도마로부터 동정하였다. 림프절 및 비장을 14일에 절제하고, 붕괴시키고, 마우스 골수종 세포 X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58)와 1:1 비를 이용하여 사이토펄스(Cytopulse) 전기세포융합을 수행하였다. 융합물을 반고체 배지를 함유하는 옴니트레이에 플레이팅한 후 10 x 96웰 플레이트로 채집하고 5일 후 이로부터 직접 스크리닝하였다.
항-인간 BCMA 뮤린 부모 mAb S332121F02 및 S332126E04를 RIMMS 방법 (급속 면역화)을 이용하여 인간 BCMA (4-53)BCMA의 세포외 도메인의 재조합 Fc 융합물로 면역화된 SJL 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터 동정하였다. 0일에, 마우스당 5㎍의 단백질을 등의 2 부위 (좌골 위 및 어깨 위) 및 전방의 4 부위의 주요 림프절 밑에서 AS02a 애쥬번트에 에멀젼화시켰다. 6일에, RIBI 애쥬번트 중 마우스당 5㎍의 재조합 시노 BCMA-Fc 단백질을 전방 4 부위의 주요 림프절 밑에 주입하였다. 11일에 RIBI 애쥬번트 중 마우스당 2.5㎍의 재조합 인간 BCMA-Fc 및 2.5㎍의 재조합 시노 BCMA-Fc를 전방 4 부위의 주요 림프절 밑에 주입하였다. 14일에 동물을 치사시키고 세포를 S307118G03과 같이 처리하였다.
항-인간 BCMA 뮤린 부모 mAb S322110D07을 1:1 몰 비로 미리 혼합된 재조합 인간 April (R&D 5860-AP/CF)과 합쳐진 인간 BCMA (4-53)의 세포외 도메인의 재조합 Fc 융합물로 면역화된 SJL 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터 동정하였다. 마우스를 RIBI 애쥬번트에 현탁된, PBS 중 5㎍의 April/시노 BCMA-Fc 복합체로 마우스당 100㎕의 용량으로 i.p. 면역시키고, RIBI 애쥬번트에 현탁된, PBS 중 2.5㎍의 April/시노 BCMA-Fc 복합체를 이용하여 3-4주 간격으로 3회 추가접종하였으며, 마우스당 10O㎕의 용량이 복막내 경로를 통해 주입되었고 융합 1일 전에 동일한 면역원의 융합전 추가접종이 제공되고 S307118G03과 같이 처리되었다.
항-인간 BCMA mAb 뮤린 부모 S335115G01 및 S335122F05는 RIMMS 방법 (급속 면역화 다중 부위)을 이용하여 인간 BCMA (4-53)의 세포외 도메인의 재조합 Fc 융합물 및 시노 BCMA (4-52)의 세포외 도메인의 재조합 Fc 융합물의 혼합물로 면역화된 SJL 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터 동정되었다. 0일에, 마우스당 2.5㎍의 각각의 단백질을 AS02a 애쥬번트에서 에멀젼화하고 등의 2 부위 (좌골 위 및 어깨 위) 및 전방의 4 부위의 주요 림프절 밑에 주입하였다. 6일 및 11일에 RIBI 애쥬번트 중 마우스당 2.5㎍의 각각의 단백질을 전방 4 부위의 주요 림프절 밑에 주입하였다. 14일에 동물을 치사시켰다. 림프절 및 비장을 절제하고, 붕괴시키고, 마우스 골수종 세포 X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58)와 1:1 비를 이용하여 사이토펄스 전기세포융합을 수행하였다. 융합물을 반고체 배지를 함유하는 옴니트레이에 플레이팅한 후 32 x 96웰 플레이트로 채집하고 5일 후 이로부터 직접 스크리닝하였다.
실시예 2: 인간화
2.1 CA8 하이브리도마 가변 영역의 클로닝
총 RNA를 CA8 하이브리도마 세포로부터 추출하고, 그 후 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 cDNA 서열을 역전사 및 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 생성하였다. RT-PCR용 정방향 프라이머는 뮤린 면역글로불린 유전자 선도-서열에 특이적인 축퇴성 프라이머의 혼합물이었고 역방향 프라이머는 항체 불변 영역에 특이적이었다. IgG1, IgG2a 및 IgG2b에 특이적인 역방향 프라이머는 아이소형이 알려지지 않은 경우에 이용되었다. 프라이머를 설계하기 위해, 마우스 VH 및 Vk 유전자의 선도 서열의 DNA 다중 서열 정렬이 생성되었다.
2.2 키메라 CA8의 클로닝
키메라 항체를 엔코딩하는 DNA 발현 작제물을 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위 및 인간 신호 서열을 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 형성에 의해 새로이 제조하였다. HindIII 및 SpeI 제한 부위를 인간 γ1 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열을 포함하는 VH 도메인을 구성하기 위해 도입시켰다. Hindlll 및 BsiWI 제한 부위를 인간 카파 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열을 함유하는 VL 도메인을 구성하기 위해 도입시켰다.
2.3 인간화 CA8 변이체의 클로닝
인간화 항체 변이체를 엔코딩하는 DNA 발현 작제물을 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위 및 인간 신호 서열을 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 형성에 의해 새로이 제조하였다. HindIII 및 SpeI 제한 부위를 인간 γ1 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열을 포함하는 VH 도메인을 구성하기 위해 도입시켰다. HindIII 및 BsiWI 제한 부위를 인간 카파 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열을 함유하는 VL 도메인을 구성하기 위해 도입시켰다.
2.4 재조합 CA8 항체의 발현 (항체 정량 포함)
중쇄 및 경쇄를 각각 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK 293 6E 세포로 일시적으로 공-트랜스펙션시키고 소규모로 발현시켜 항체를 생성하였다. 항체를 ELISA에 의해 정량하였다. ELISA 플레이트를 1 mg/ml의 항-인간 IgG (Sigma I3382)로 코팅하고 차단 용액 (Tris 완충된 염수 중 4% BSA)으로 차단하였다. 다양한 희석률의 조직 배양 상청액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 공지된 표준 항체의 희석액을 또한 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 TBST에서 세척하고 차단 용액 중 1/1000 희석률의 퍼옥시다이즈 표지된 항-인간 카파 경쇄 항체 (Sigma A7164)를 첨가함에 의해 결합을 검출하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후 TBST에서 세척하였다. OPD 기질 (Sigma P9187)의 첨가에 의해 플레이트를 현상하고 2M H2S04를 첨가시켜 발색을 중지시켰다. 흡광도를 490nm에서 측정하고 공지된 표준 희석률에 대한 데이터를 이용하여 표준 곡선을 플롯팅하였다. 표준 곡선을 이용하여 조직 배양 상청액 중 항체의 농도를 추정하였다. 대규모 항체 제조물을 단백질 A를 이용하여 정제하고 Nanodrop (Thermo Scientific)을 이용하여 농도를 측정하였다.
표 1. CA8 가변 중쇄 및 경쇄 인간화 변이체의 설계
Figure 112013119716171-pct00005
2.5 탈푸코실화 항체 생성
탈푸코실화 항체를 생성하기 위해, 중쇄 및 경쇄를 각각 CHO DG44 MS705 BioWa 세포로 공-트랜스펙션시키고 항체를 생성하는 규모로 발현시켰다. 간단히, 30㎍의 DNA를 Not1으로 밤새 선형화하고, DNA를 에탄올 침전시키고, TE 완충액에 재용해시켰다. 배양액으로부터, 2.4X107 BioWa DG44 세포를 수득하였고 14ml의 가온된 PBS-수크로스에서 세척하였다. 세포를 회전시키고 펠렛을 1.6ml의 PBS-수크로스에 재현탁시켰다. PBS-수크로스에 현탁된 상기 언급된 세포의 반 (0.8ml)을 30㎍의 선형화된 DNA (50㎕의 TE 완충액 중)를 지닌 BioRad 큐벳에 첨가하였다. BioRad GenePulser는 25 μF의 용량을 갖는 380V로 프로그래밍되었고 큐벳은 일렉트로포레이션에 들어갔다. 생성된 850㎕의 일렉트로포레이션된 세포 및 DNA를 (80ml) 가온된 SFM512 배지 (페놀 레드 포함, 2XHT (뉴클레오시드), 글루타맥스(glutamax) 및 Gibco 보충물4)에 첨가하였다. 마지막으로, 생성된 80ml의 세포 현탁액을 4 X 96웰 플레이트 중 하나의 각각의 웰에 옮겼다 (150㎕/웰). 48시간 후에, 대략 130㎕의 조건화된 배지를 제거하고 150㎕의 새로운 선택 배지가 SFM512 배지 (페놀 레드 및 글루타맥스 포함)를 대신함에 의해 배지를 뉴클레오시드가 없는 것으로 교체하였다. 3-4일마다, 130-150㎕의 조건화된 배지를 제거하고, 새로운 선택 배지로 교체하였다. 색 변화에 대해 웰을 모니터하고 앞서 논의된 바와 같이 IgG 농도에 대해 검정하였다.
2.6 추가의 항체 - 하이브리도마 가변 영역의 클로닝
총 RNA를 S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01 및 S335122F05 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. 그 후 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 cDNA 서열을 역전사 및 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 생성하였다. 아이소형 IgG2a의 경우에, RT-PCR용 정방향 프라이머는 뮤린 면역글로불린 유전자 선도-서열에 특이적인 축퇴성 프라이머의 혼합물이었고 역방향 프라이머는 항체 불변 영역에 특이적이었다. 프라이머는 Jones 및 Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991)에 의해 기재된 방법에 기반하여 설계되었다. 정확한 V-영역 서열의 추후 확인이 가능하도록 둘 모두의 V-영역 서열에 대해 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에 의해 생성된 V-영역 생성물에 대해 DNA 서열 데이터를 수득하였다.
2.7 추가의 항체 - 키메라의 클로닝
포유동물 발현 벡터로의 V-유전자 PCR 생성물의 주입 어드밴티지 PCR 클로닝(Clonetech)에 의해 키메라 항체를 엔코딩하는 DNA 발현 작제물을 새롭게 제조하였다. 이러한 클로닝은 인간 IgG1 H 사슬 및 카파 L 사슬 불변 영역으로 뮤린 가변 영역의 융합을 가능하게 하였다.
2.8 S307118G03 - 인간화 변이체의 클로닝
클로닝을 단락 2.3과 같이 수행하였다.
2.9 S307118G03 재조합 항체의 발현
적절한 중쇄 및 경쇄 (하기 표 8에 열거됨)를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK 293 6E 세포로 일시적으로 공-트랜스펙션시키고 소규모로 발현시켜 항체를 생성하였다. 항체를 상청액으로부터 단백질 A 정제시키고 Nanodrop 분광계를 이용하여 정량하였다.
하기 8) HEK 293 6E 세포로 일시적으로 공-트랜스펙션시키고 소규모로 발현시켜 항체를 생성하였다. 항체를 상청액으로부터 단백질 A 정제시키고 Nanodrop 분광계를 이용하여 정량하였다.
실시예 3: 항체 약물 컨쥬게이트 ( ADC )를 형성하기 위해 vcMMAE 및 mcMMAF 에 대한 항체의 컨쥬게이션
표 B 약물-링커의 화학적 구조
Figure 112013119716171-pct00006
감마바인드 플러스(Gammabind Plus) 단백질 G 세파로스 (GE Healthcare) 수지 슬러리 (75 ㎕)를 딥 웰 (2 mL 용량) 필터 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 컨쥬게이션하려는 항체를 종 및 아이소형에 의해 그룹화하고 0.5 mg 이하의 각 항체를 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. 각각의 항체를 2개의 분리된 웰로 옮겨서 약물-링커 SGD-1006 및 SGD-1269를 지니는 2개의 컨쥬게이트의 제조를 촉진하였다. 그 후 필터 플레이트를 5℃에서 1200 RPM으로 2시간 동안 진탕시켜 항체를 수지에 결합시켰다. 이어서 필터 플레이트를 500x g로 3분 동안 원심분리시켜 각각의 웰의 바닥으로 모든 유체 및 수지의 완전한 풀다운(pulldown)을 확보하였다.
이어서 100 mM KP04, 150 mM NaCl, pH 7, 1 mM EDTA 중 500 ㎕의 10 mM TCEP를 첨가하고 30분간 22℃에서 진탕시킴에 의해 결합된 항체를 환원시켰다. 환원 후에, 플레이트를 다시 원심분리시켜 TCEP 용액을 제거하고 이어서 웰당 1 mL의 PBS + 1 mM EDTA로 세척하였다. 세척 용액을 원심분리에 의해 제거하고 이 과정을 총 4번의 세척 동안 3회 반복하였다. 결합되고 환원된 항체를 그 후 표 2에 지시된 몰 분획에 따라서 제조된 NEM 및 약물 링커의 혼합물을 이용하여 컨쥬게이션시켰다.
표 2.
Figure 112013119716171-pct00007
이에 따라 NEM 및 약물 링커의 분리된 혼합물을 SGD-1006, SGD-1269 (표 B를 참조하라) 및 NEM의 10 mM DMSO 원액을 이용하여 각각의 항체 종/아이소형에 대해 제조하였다. 적절한 비로 혼합시에 총 말레이미드 농도는 그로 말미암아 여전히 10 mM이었고, 이러한 값을 이용하여 각각의 웰에 첨가되는 말레이미드 용액의 부피를 계산하였다. 예를 들어, 5개의 환원가능한 디설파이드 (환원시에 10개의 이용가능한 티올)를 지닌 뮤린 IgG1의 경우, 150 kD의 0.5 mg의 항체는 티올의 33.3 nmol에 상응하는 3.33 nmol이다. 따라서, 3배 과량은 100 nmol의 총 말레이미드 또는 10㎕의 10 mM 약물 링커/NEM 혼합물이다. SGD-1269 컨쥬게이트의 경우, 이러한 혼합물은 이후 5.86㎕의 SGD-1269 및 4.14㎕의 NEM으로 제조될 것이다. 그 후 고정된 환원 항체에 첨가하기 전에 말레이미드 혼합물을 500㎕의 PBS로 희석시킬 것이다. 실질적으로, 각각의 아이소형의 다수의 항체가 동시에 컨쥬게이션되었으므로, 웰당 10㎕까지 그 아이소형을 함유하는 웰의 수를 늘린 다음 웰의 개수 배만큼 500㎕와 동등한 PBS의 부피로 희석시킴에 의해 각각의 아이소형에 대한 단일 SGD-1269/NEM 혼합된 용액을 제조하였다. 유사한 양상으로, 총 8개의 약물-링커/NEM 혼합물을 제조하고 - SGD-1006을 지닌 4개 및 SGD-1269을 지닌 4개 - PBS로 희석시켰다. 이어서 이러한 혼합물을 환원된 항체에 첨가하고 (웰당 500㎕) 플레이트를 30분간 22℃에서 진탕시켰다. 그 후 플레이트를 상기와 같이 원심분리시켜 과량의 반응 용액을 제거하고, 이어서 전과 같이 PBS로 4배 희석하였다.
그 후 200㎕의 50 mM 글리신 pH 2.5를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 3분 동안 1200 RPM에서 진탕시킴에 의해 결합된 ADC를 용리시켰다. 진탕시키는 동안 20㎕의 중화 완충액 (1 M 포타슘 포스페이트, pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20)을 1 mL 수집 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후 1500x g에서 6분 동안 회전시킴에 의해 ADC를 수집 플레이트로 용리시켰다. 이어서 수집 플레이트를 간단히 진탕시켜 중화 완충액의 완전한 혼합을 확보하였다.
그 후 용액을 UV 검정 플레이트 (Costar model 3635, Corning)로 옮기고 280 nm에서 광학 밀도를 측정함에 의해 각각의 ADC의 농도를 흡광도 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다. 1.45 mL mg-1 cm-1의 평균 IgG 흡광 계수를 이용하여 패널에 걸쳐 ADC 농도의 적당한 추정을 제공하였다. 성공적인 컨쥬게이션을 확인하기 위해, 역상 단백질 HPLC 방법 (하기 기재됨)을 이용하여 아이소형 대조군의 약물 로딩을 추정하였다. CA8의 인간화 변이체를 함유하는 플레이트에 대해 이러한 방법을 이용하여 모든 ADC의 로딩을 직접 추정하였다.
약물 로딩을 측정하기 위한 역상 단백질 크로마토그래피 방법은 PLRP-S 중합성 고정상 (Agilent Technologies)을 이용한다. 컨쥬게이션 과정 동안 항체가 충분히 환원되었기 때문에, 모든 항체 서브유닛이 단일 폴리펩티드 사슬로서 컬럼으로부터 용리되어 다양한 수준의 약물 로딩을 지닌 경쇄 및 중쇄 종의 부분모집단이 별도로 평가될 수 있다. 따라서, 이러한 데이터의 분석은 이후 기본 지식을 지닌 평균 항체 약물 로딩을 측정하기 위해 조합될 수 있는 독립적인 인자로서 평균 경쇄 약물 로딩 및 평균 중쇄 약물 로딩을 계산할 수 있게 하고 각각의 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다: 이동상 A로서 물 + 0.05% TFA 및 이동상 B로서 아세토니트릴 + 0.01% TFA를 이용한 PRLP-S 컬럼, 1000Å, 50 x 2.1 mm, 8 ㎛ 입자 크기 (Agilent Technologies); 12.5분 후에 27% B 내지 42% B의 선형 구배로 용리됨.
항-BCMA 항체를 3개의 분리된 배치에서 7개월의 기간에 걸쳐 SGD-1006 및 SGD-1269와 컨쥬게이션시켰다. 첫 번째 배치에서 총 29개의 항체가 컨쥬게이션되었다 (58개 ADC 발생). 각각의 아이소형 대조군의 약물 로딩을 PLRP 크로마토그래피에 의해 측정하고 데이터를 표 3에 요약한다.
표 3.
Figure 112013119716171-pct00008
두 번째 배치의 경우 추가의 25개 항체가 컨쥬게이션되었다 (50개 ADC 발생). 각각의 아이소형 대조군의 약물 로딩을 역시 PLRP 크로마토그래피에 의해 측정하고 데이터를 표 4에 요약한다.
표 4.
Figure 112013119716171-pct00009
세 번째 배치의 경우 CA8의 13개 인간화 변이체를 포함하는 30개 항체가 컨쥬게이션되었다 (60개 ADC 발생). 이러한 최종 배치에서, 모든 ADC의 약물 로딩을 측정하고 하기 2개의 플레이트 맵에 요약한다 (표 5 & 6)
표 5.
Figure 112013119716171-pct00010
표 6.
Figure 112013119716171-pct00011
평균 약물 로딩 및 %CV가 맨 밑에 각각의 아이소형 시리즈에 대해 표시된다. mIgG2b 항체로 제조된 SGD-1269 ADC에 대해 약물 로딩에 있어서 특징이 없는 큰 가변성이 관찰되었다; 그 이유는 명확하지 않다. 또한, Fc-향상된 CA8 항체는 그 밖의 CA8 인간 변이체보다 다소 낮은 약물 로딩 수준을 발생시켰다; 이를 다루기 위해, 추가의 Fc-향상된 CA8을 용액상 반응으로 컨쥬게이션시켜 그 밖의 항체에 대해 달성된 약물 로딩과 더 잘 맞췄다.
실시예 4: 결합 데이터
4.1 인간 또는 시노 BCMA를 발현시키는 세포에 대한 키메라 CA8의 결합을 나타내는 FAMT 결합 검정.
냉동보존된 트랜스펙션된 인간, 시노 BCMA 및 모의 트랜스펙션된 HEK293 세포를 LN2 저장물로부터 회수하였다. 검정 웰을 다양한 농도의 범위로 인간 키메라 CA8 항체를 이용하여 제조하고, 인간 BCMA HEK293, 시노 BCMA HEK293 및 모의 트랜스펙션된 세포와 각각 혼합시켰다. 항-인간 IgG FMAT 블루 이차 컨쥬게이트를 인간 키메라 CA8의 검출을 위해 첨가하였다. 검정 플레이트를 최소 90분 동안 방치한 후 생성물을 ABI8200 (FMAT) 플레이트 리더 상에서 판독하였다.
이는 키메라 형태의 CA8 항체가 HEK293 세포 상에서 발현된 인간 및 시노 BCMA 단백질 둘 모두에 잘 결합함을 나타내었다.
결과를 도 1에 도시한다.
4.2 재조합 BCMA 단백질에 대한 키메라 CA8의 결합을 나타내는 ELISA 실험
키메라 CA8 항체를 Fc 융합물로서 발현된 인간 BCMA 및 시노 BCMA에 대한 결합에 대해 시험하였다. 인간 BCMA-Fc 및 시노 BCMA-Fc를 ELISA 플레이트에 코팅시키고, 플레이트를 BSA를 이용하여 차단시켜 비특이적 결합을 감소시켰다. CA8 키메라 항체를 5㎍/ml 내지 0.1㎍/ml의 농도 범위로 인간 및 시노 BCMA 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가시켰다. 임의의 결합된 인간 키메라 CA8 항체를 적절한 경우 항-인간 IgG HRP 컨쥬게이션된 이차 항체를 이용하여 검출하였다. HRP 기질 (TMB)을 첨가하여 ELISA를 현상하였다. 이는 CA8 항체가 ELISA 검정에서 재조합 인간 및 시노 BCMA에 결합함을 나타내었다.
결과를 도 2에 도시한다.
4.3 TACI 단백질과의 교차 반응성을 측정하기 위해 BCMA 및 TACI 단백질에 대한 CA8 항체 결합을 나타내는 Biacore 실험.
CA8 키메라 항체를 주입하고 단백질 A 상에 포획하였다. (단백질 A 유도체화된 센서칩을 이용하였다). 고농도의 인간 IgG 용액을 주입시켜 나머지 단백질 A 결합을 차단하였다. 그 후 항체로의 결합에 대해 BCMA-Fc, TACI-Fc 또는 BAFF-R-Fc 용액을 시험하였다. 3개의 단백질을 차례대로 주입시키고 결합 사건을 측정하였다. 각각의 단백질의 주입 사이에 표면을 재생시켰다.
Biaevaluation 프로그램에서 센소그램을 분석하였다. 센소그램 곡선으로부터 임의의 비특이적 결합 및 기계 잡음을 제거하기 위해 이중 참조 공제를 수행하였다.
이는 CA8이 BCMA 결합에 특이적이나 TACI 및 BAFFR에는 그렇지 않음을 나타내었다.
BCMA-Fc, TACI-Fc 및 BAFF-R-Fc에 대한 CA8 항체의 결합은 도 3에 도시된 대로 플롯팅되었다.
4.4 세포 결합 및 중화 항체
4.4.1 다발성 골수종 세포 및 BCMA 발현 세포에 대한 뮤린 항 BCMA 항체의 결합
다발성 골수종 세포주 H929 및 ARH77-hBCMA 10B5 BCMA 발현 트랜스펙턴트(transfectant) 세포를 5㎍/mL의 뮤린 S332211D07, S3332121F02 또는 S332126E04 또는 뮤린 아이소형 대조군으로 염색하였다. 다발성 골수종 세포주 H929를 뮤린 S307118G03으로 염색하였다. 세포를 실온 (RT)에서 20분 동안 인큐베이션시킨 다음 FACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA + 0.1% 소듐 아지드)으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 이차 PE 표지된 항-마우스 IgG 항체와 15분 동안 RT에서 인큐베이션시킨 다음 FACS 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 FACS에 의해 분석하여 세포에 결합된 항체를 검출하였다.
결과 (도 4)는 4개 모두의 뮤린 항체가 H929 다발성 골수종 세포주에 결합되었고 ARH77 BCMA 트랜스펙션된 세포 상에서 시험된 3개의 항체가 여기에 결합되었음을 나타내었다.
4.4.2 FACS에 의해 측정된 다발성 골수종 세포에 대한 키메라 CA8의 결합 곡선
다발성 골수종 세포주의 패널을 이용하여 키메라 CA8의 결합을 측정하였다. 세포주 H929, OPM-2, JJN-3 및 U266을 다양한 농도의 키메라 CA8 또는 무관한 항체 (Synagis)로 20분 동안 RT에서 염색시켰다. 그 후 세포를 FACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA + 0.1% 소듐 아지드)으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 이차 PE 표지된 항-인간 IgG 항체와 함께 15분 동안 RT에서 인큐베이션한 다음 FACS 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 FACS에 의해 분석하고, 평균 형광 세기 (MFI) 값을 측정하여 결합을 결정하였다.
결과는 키메라 CA8이 용량 의존적인 방식으로 다발성 골수종 세포주 H929, OPM-2, JJN-3 & U266에 결합함을 나타내었다 (도 5).
4.4.3 FACS에 의해 측정된 BCMA 트랜스펙션된 세포에 대한 인간화 CA8의 결합
ARH77-hBCMA 10B5 BCMA 발현 트랜스펙턴트 세포 또는 H929 세포를 다양한 농도의 키메라 CA8 또는 J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2로 명명된 CA8의 인간화 변이체로 20분 동안 RT에서 염색시켰다. 그 후 세포를 FACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA + 0.1% 소듐 아지드)으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 이차 PE 표지된 항-인간 IgG 항체와 함께 15분 동안 RT에서 인큐베이션시킨 다음 FACS 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 FACS에 의해 분석하고, 평균 형광 세기 (MFI) 값을 측정하여 결합을 결정하였다.
결과는 키메라 CA8 및 J9M2을 제외한 시험된 모든 항체가 ARH77-hBCMA 10B5 BCMA 발현 트랜스펙턴트 세포 및 H929 세포에 용량 의존적인 방식으로 결합하였음을 나타내었다 (도 6).
4.5 재조합 BCMA에 대한 BAFF 또는 APRIL의 결합을 중화시키는 CA8 및 인간화 버젼 J6M0의 능력 입증.
본 검정의 목적은 둘 모두 야생형이고 아푸코실화 (포텔리젠트) 형태인 다양한 농도의 항체 CA8, 및 인간화 버젼 J6M0에 대해 BCMA 리간드인 BAFF 또는 APRIL의 결합 능력을 중화시키는 능력을 평가하는 것이었다.
96웰 편평한 바닥 플레이트를 PBS 중 재조합 인간 BCMA Fc 4-53의 1㎍/mL 용액으로 밤새 코팅하였다. 0.05% TWEEN20을 이용한 세척 단계 이후에, 플레이트를 PBS 중 2% 우혈청 알부민 용액으로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 플레이트를 전과 같이 세척하고 10㎍/mL에서 시작하여, 이중으로 두 번 중 처음에 적정된 40㎕의 각각의 항체 (뮤린 IgG, 뮤린 CA8, 및 키메라 CA8)를 적절한 웰에 첨가시키고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 40㎕의 2% BSA를 적절한 대조군 웰에 첨가하였다. 10㎕의 재조합 인간 BAFF (2149-BF/CF, R&D Systems) 또는 재조합 인간 APRIL (5860-AP/CF, R&D Systems)을 각각 30ng/mL 및 750ng/mL로 첨가하여, 각각의 웰에서 각각 6ng/mL 및 150ng/mL의 최종 농도를 얻었다. 등용적의 2% BSA를 적절한 대조군 웰에 첨가하였다. 플레이트가 2시간 동안 실온에서 인큐베이션되게 한 후에, 이들을 전과 같이 세척하였다. 바이오티닐화된 항-인간 리간드 (BAFF BAF124 또는 APRIL BAF884, R&D Systems)를 50ng/mL로 적절한 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 단계 후에, 스트렙타비딘-HRP (Amersham RPN4401)의 50㎕의 1:4000 희석액을 각각의 웰에 첨가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 세척 과정을 다시 반복한 후에 100㎕의 테트라메틸벤지딘 기질 용액 (T8665, Sigma)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 20-25분 동안 인큐베이션시키고, 포일로 감쌌다. 100㎕의 1M H2S04를 첨가시켜 반응을 중지시켰다. 광학 밀도를 Spectromax 리더를 이용하여 450nm에서 측정하였다. 도 7A 및 B를 참조하라.
BCMA에 대한 BAFF 또는 APRIL의 결합을 중화시키는 플레이트 기반 검정에서, 키메라 CA8에 대해 계산된 EC50 값은 각각 0.695㎍/mL 및 0.773㎍/mL였다. 인간화 J6M0에 대한 값은 0.776ng/ml 및 0.630ng/ml였다. J6M0 포텔리젠트 버젼에 대한 값은 각각 0.748 및 0.616ng/ml였다.
4.6 H929 세포에서 BAFF 또는 APRIL 유도된 NFkB의 인산화에 대한 키메라 CA8 및 인간화 J6M0 BCMA 항체의 효과
한 세트의 실험에서, H-929 세포를 96웰 플레이트에서 혈청 비함유 배지에 75,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 키메라 CA8 항체를 24시간 후에 첨가하여 200㎍/ml 이하의 최종 웰 농도를 얻었다. 10분 후에, BAFF 또는 APRIL 리간드를 세포에 첨가하여 각각 0.6 또는 0.3㎍/ml의 최종 웰 농도를 얻었다. 30분 후에, 세포를 용해시키고 인산회된 NfkappaB 수준을 MSD pNFkappaB 검정을 이용하여 측정하였다.
키메라 BCMA 항체 CA8은 H-929 세포에서 BAFF 및 APRIL 유도된 NfkappaB 세포 신호절단 둘 모두를 중화시켰다. 이것은, APRIL 유도된 NfkappaB 세포 신호전달에 대한 257nM에 비해, 이러한 세포 유형에서 10nM의 평균 IC50으로 BAFF 유도된 NfkappaB 세포 신호전달을 중화시키는데 특히 효능 있었다.
2번의 실험에 대한 평균 데이터
IC50은 BAFF 유도된 NfkappaB 중화에 대해 10nM이었고 APRIL 유도된 NfkappaB 중화에 대해 257nM이었으며 (2번의 독립적인 실험의 평균), 이는 표 7에 제시되어 있다.
표 7
Figure 112013119716171-pct00012
세포 기반 시스템에서 APRIL 및 BAFF의 중화에서의 효능간에 왜 이러한 불일치가 존재하는지를 알기 위해 추가 세트의 실험을 수행하였다. BCMA의 가용성 형태의 발견 후에, 실험 설계는 가용성 BCMA에 대한 항체 결합으로부터의 방해를 감소시키기 위해 H929 세포를 검정 전에 세척하는 단계를 포함하도록 변경되었다. H-929 세포를 3회 세척하여 임의의 sBCMA를 제거하고 혈청 비함유 배지에 재현탁시켰다. J6M0 포텔리젠트 항체를 96웰 플레이트에 첨가시켜 BAFF 또는 APRIL 리간드와 함께 100㎍/ml 이하의 최종 웰 농도를 수득함으로써 각각 0.6 또는 0.2 ㎍/ml의 최종 웰 농도를 얻었다. 그 후 H-929 세포를 혈청 비함유 배지에 7.5x104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 30분 후에 세포를 용해시키고 인산화 NFkappaB 수준을 MSD pNFkappaB 검정을 이용하여 측정하였다. 이것은 1회 실험으로부터의 데이터이다. 각각의 데이터 포인트는 2회 반복의 평균/sd이다. 이러한 실험의 데이터를 도 7C에 도시한다. BAFF 및 APRIL 신호전달의 억제에 대한 IC50은 각각 0.91㎍/ml 및 2.43㎍/ml로 측정되었다.
4.7 항-BCMA CA8 키메라 및 인간화 작제물의 ProteOn 분석
CA8 키메라 및 인간화 변이체의 초기 스크린을 ProteOn XPR36 (Biorad) 상에서 수행하였다. 방법은 다음과 같았다; 단백질 A를 GLC 칩 (Biorad, Cat No: 176-5011) 상에서 일차 아민 커플링에 의해 고정시켰다. 그 후 CA8 변이체를 그 표면에 포획하고 재조합 인간 BCMA (인 하우스(in house) 또는 시판 US Biological, B0410) 물질 (단 2회 진행))을 결합 곡선을 이중 참조하는데 이용되는 OnM 주입 (즉, 완충액만)과 함께 256, 64, 16, 4, 1nM으로 통과시켰으며, 이용된 완충액은 HBS-EP 완충액이다. 50mM NaOH를 이용하여 포획 표면을 재생시켰다. 데이터를 ProteOn XPR36 고유의 분석 소프트웨어를 이용하여 1:1 모델에 핏팅시켰다. 진행 1은 인간화 CA8 변이체 (JO 내지 J5 시리즈)의 첫 번째 스크린에 상응하고 진행 2는 인간화 CA8 변이체 (J5 내지 J9 시리즈)의 두 번째 스크린에 상응한다. 둘 모두의 진행은 25℃에서 수행되었다.
진행 1에서 수득된 데이터를 표 8에 개시하고 진행 2로부터의 데이터를 표 9에 개시한다. 진행 2의 여러 개의 분자 (표 9)는 ProteOn에 의해 측정될 수 있는 친화성 값을 갖지 못했는데, 이는 오프율(off-rate)이 이러한 검정에서 기계의 민감성을 넘어섰기 때문이고, 그러나 이는 이러한 모든 분자가 재조합 인간 BCMA에 단단히 결합함을 나타낸다. 진행 1로부터의 데이터는 일부 작제물이 재조합 시노 BCMA에 어떠한 결합도 나타내지 않았음을 나타낸다.
표 8: 진행 1 - 재조합 인간 BCMA에 대한 항-BCMA 분자의 동력학 분석
Figure 112013119716171-pct00013
표 9: 진행 2 - 재조합 인간 BCMA에 대한 항-BCMA 분자의 동력학 분석
항체 J8M0, J9M0, J8M1, J9M2, J7M2, J5M0, J7M1, J7M0, J8M2, J9M1, J5M2, J5M1의 경우, 오프율은 검정의 민감성을 넘어섰고, 따라서 데이터는 도시되지 않았다.
Figure 112013119716171-pct00014
4.8 항-BCMA CA8 키메라 및 인간화 작제물의 BIAcore 분석 (J7 내지 J9 시리즈)
단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 (GE Healthcare, Cat No: BR-1005-30) 상에 고정시킨 다음 항체 분자를 포획하는데 이러한 표면을 이용하였다. 재조합 인간 BCMA (US Biological, B0410)를 256nM, 64nM, 16nM, 4nM 및 1 nM의 분석물로서 이용하였다.
50mM NaOH를 이용하여 포획 표면의 재생을 수행하였다. 모든 결합 곡선은 완충액 주입 (즉, OnM)과 이중 참조되었고, T100 평가 소프트웨어에 고유한 1:1 모델을 이용하여 데이터를 핏팅시켰다. 진행 완충액으로서 HBS-EP를 이용하여 진행을 37℃에서 수행하였다.
그 결과는, J9M2를 제외한 시험된 분자들이 키메라 분자와 유사한 친화성으로 재조합 인간 BCMA에 결합함을 나타내었다. 이러한 실험에서 비롯된 데이터를 표 10에 제시한다.
표 10: 재조합 인간 BCMA에 대한 항-BCMA 인간화 분자의 동력학 분석
Figure 112013119716171-pct00015
4.9 항-BCMA CA8 키메라 및 인간화 작제물 J6M0 및 J9M0의 BIAcore 분석
단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 (GE Healthcare, Cat No: BR-1005-30) 상에 고정시킨 다음 항체 분자를 포획하는데 이러한 표면을 이용하였다. 재조합 인간 BCMA (US Biological, B0410)를 256nM, 64nM, 16nM, 4nM 및 1 nM의 분석물로서 이용하였다.
50mM NaOH를 이용하여 포획 표면의 재생을 수행하였다. 모든 결합 곡선은 완충액 주입 (즉, OnM)과 이중 참조되었고, T100 평가 소프트웨어에 고유한 1:1 모델을 이용하여 데이터를 핏팅시켰다. 진행은 진행 완충액으로서 HBS-EP를 이용하여 실험 1의 경우 25℃ 및 37℃에서 수행되었고 실험 2의 경우 37℃에서만 수행되었다.
둘 모두의 진행에서 J9M0가 인간 BCMA에 대한 전반적인 친화성에 있어서 최고의 분자임이 확인되었다. 이러한 실험에서 생성된 데이터를 표 11에 제시한다.
표 11: 인간 BCMA에 대한 항-BCMA 인간화 분자의 동력학 분석
Figure 112013119716171-pct00016
4.10. 새로운 항-BCMA 키메라 작제물의 ProteOn 분석
하이브리도마의 두 번째 배치로부터의 새로운 키메라 변이체의 초기 스크린을 ProteOn XPR36 (Biorad) 상에서 수행하였다. 방법은 다음과 같았다; 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 GLM 칩 (Biorad, Cat No: 176-5012) 상에 고정시킨 다음, 항-BCMA 변이체를 이러한 표면 위에 포획하고 재조합 인간 BCMA (인 하우스 물질)를 결합 곡선을 이중 참조하는데 이용된 OnM 주입 (즉, 완충액만)과 함께 256, 64, 16, 4, 1 nM으로 통과시켰으며, 이용된 완충액은 HBS-EP 완충액이다. 포획 표면의 재생을 50mM NaOH를 이용하여 수행하였다. ProteOn XPR36에 고유한 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 1:1 모델에 핏팅시켰다. 진행을 25℃에서 수행하였다.
이러한 실험에서 비롯된 데이터를 표 12에 제시한다.
표 12: 인간 BCMA에 대한 항-BCMA 인간화 분자의 동력학 분석
Figure 112013119716171-pct00017
실시예 5: 세포 사멸 검정
5.1 BCMA를 발현시키는 ARH77 세포에서 키메라 CA8 및 탈푸코실화 키메라 CA8 버젼의 ADCC 효능
인간 자연 살해 (NK) 세포를 5:1의 E:T 비로 다양한 농도의 항체의 존재하에 유로퓸 표지된 ARH77 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포 (10B5)와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 표적 세포로부터의 유로퓸 방출을 측정하고 특이적 용해를 계산하였다.
결과: 키메라 CA8 및 탈푸코실화 키메라 CA8은 ADCC를 통해 BCMA 발현 표적 세포를 사멸시켰다. 탈푸코실화 키메라 항체는 부모 키메라 항체에 비해, 시험된 모든 표적 세포로 달성된 보다 높은 퍼센트의 용해에 의해 측정된 바와 같이 더욱 강력한 ADCC 활성 및 높은 BCMA 발현 표적 세포주 10B5 상에서 10배 낮은 EC50을 나타내었다. 도 8A 및 8B를 참조하라.
5.2 효과기로서 ARH77 BCMA 발현 표적 세포 및 PBMC를 이용한 CA8 인간화 항체의 ADCC 활성
인간 PBMC를 5:1의 E:T 비로 다양한 농도의 인간화 버젼의 CA8 항체의 존재하에 (5㎍/ml 내지 0.005㎍/ml) 유로퓸 표지된 ARH77 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포 (10B5)와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 표적 세포로부터의 유로퓸 방출을 측정하고 특이적 용해를 계산하였다.
결과:
결과: CA8의 인간화 변이체의 모든 J5, J6, J7 J8 & J9 시리즈는 용량 의존적인 방식으로 ARH77 높은 BCMA 발현 세포주 10B5에 대해 ADCC 활성을 나타내었다. ADCC는 키메라 CA8 분자를 이용한 실험에서 발견된 것과 유사한 수준이었다. 도 9를 참조하라.
5.3 효과기 세포로서 정제된 NK 세포를 지닌 BCMA를 발현하는 ARH77 10B5 세포에 대한 키메라 S322110F02, S322110D07 및 S307118G03 및 인간화 S307118G03 H3L0의 ADCC 효능
인간 자연 살해 (NK) 표적 세포를 5:1의 E:T 비로 다양한 농도의 항체의 존재하에 유로퓸 표지된 ARH77 BCMA 트랜스펙션된 표적 세포 (10B5)와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 표적 세포로부터의 유로퓸 방출을 측정하고 특이적 용해를 계산하였다. 결과: 시험된 4개 모두의 항체가 ARH77 10B5 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내었다. 도 10을 참조하라.
5.4 키메라 CA8 ADC의 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 활성
인간 다발성 골수종 세포주에 대한 키메라 CA8 항체, 키메라 CA8-mcMMAF 항체 약물 컨쥬게이트 및 키메라 CA8-vcMMAE 항체 약물 컨쥬게이트의 ADC 활성을 측정. 다발성 골수종 세포주를 키메라 CA8 항체-약물 컨쥬게이트로 처리하여 성장 억제 및 사멸에 요구되는 ADC 농도를 결정하였다.
시험된 항체 약물 컨쥬게이트를 1 ㎍/ml 내지 5ng/ml의 농도로 다발성 골수종 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 96시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 이 시점에 살아있는 세포를 Cell titre Glo를 이용하여 정량하였다. 컨쥬게이션되지 않은 키메라 CA8 항체는 시험된 항체 농도에서 어떠한 현저한 성장 억제 활성도 나타내지 않았다. 키메라 CA8-mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트는 시험된 4개 모두의 다발성 골수종 세포주에서 키메라 CA8-vcMMAE 항체-약물 컨쥬게이트에 비해 큰 성장 억제 활성을 나타내었다. 도 11 및 표 13을 참조하라.
표 13: 4개의 상이한 다발성 골수종 세포주에서 키메라 CA8-vcMMAE 및 키메라 CA8-mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트에 대해 ng/mL로 표시된 IC50 값
Figure 112013119716171-pct00018
5.5 인간 다발성 골수종 세포주 H929에 대한 키메라 CA8 항체, 키메라 CA8-mcMMAF 항체 약물 컨쥬게이트 및 키메라 CA8-vcMMAE 항체 약물 컨쥬게이트의 세포 주기 억제 활성 측정
키메라 CA8 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)가 다발성 골수종 세포에서 성장 억제를 야기하는 메카니즘을 측정하기 위해, NCI-H929 세포의 세포 주기를 키메라 CA8 항체 및 키메라 CA8 ADC 처리 이후의 여러 시점에 고정된 세포 프로피듐 아이오다이드 염색을 통해 세포 DNA 내용물을 측정함에 의해 모니터하였다.
시험된 키메라 CA8 ADC 농도(50ng/mL)에서, 키메라 CA8-mcMMAF ADC는 48시간에 최고점에 달하는 현저한 G2/M 세포 주기 억제 (4N DNA 내용물)를 야기하였다. 이후 시점인 48, 72 및 96시간에, 키메라 CA8-mcMMAF ADC를 이용한 처리는 sub-2N DNA 내용물을 갖는 세포 집단의 축적을 발생시켰는데, 이는 세포 사멸의 전형이다. 시험된 50ng/mL 농도에서, 키메라 CA8-vcMMAE ADC는 G2/M 세포 주기 억제 또는 sub-G1 축적에 현저한 영향을 주지 않았다. 도 12를 참조하라.
5.6 키메라 CA8-mcMMAF 항체 약물 컨쥬게이트 및 키메라 CA8-vcMMAE 항체 약물 컨쥬게이트에 대한 마커로서 포스포-히스톤-H3 (Thr11) 염색은 유사분열 억제를 유도하였다.
4N DNA 내용물을 갖는 세포의 축적이 키메라 CA8 ADC에 의해 유도된 유사분열 억제의 특수한 결과인지를 측정하기 위해 NCI-H929 세포를 증가하는 농도의 컨쥬게이션되지 않은 키메라 CA8, 키메라 CA8-vcMMAE 또는 키메라 CA8-mcMMAF로 48시간 동안 처리한 후에 항-포스포-히스톤 H3 항체로 염색하였다.
키메라 CA8 ADC로의 처리는 유사분열 세포의 특수한 마커인 65에록시디-히스톤 H3 (Thr11)에 대해 양성 염색된 NCI-H929 세포의 용량-의존적인 축적을 발생시켰다. 키메라 CA8-mcMMAF ADC는 키메라 CA8-vcMMAE ADC보다 낮은 농도의 65에록시디-히스톤 H3 양성 세포의 축적을 야기시켰다. 도 13을 참조하라.
5.7 아넥신 V에 대한 염색에 의해 키메라 CA8 ADC에 반응하는 NCI-H929 세포에서의 아폽토시스 측정.
sub-2N DNA 내용물을 갖는 세포의 축적이 키메라 CA8 ADC에 의해 유도된 아폽토시스의 특수한 결과인지를 측정하기 위해 NCI-H929 세포를 증가하는 농도의 컨쥬게이션되지 않은 키메라 CA8, 키메라 CA8-vcMMAE 또는 키메라 CA8-mcMMAF로 48시간 동안 처리한 후에 항-아넥신-V 항체로 염색하였다. 키메라 CA8 ADC로의 처리는 아폽토시스의 특수한 마커인 아넥신-V에 대해 양성 염색된 NCI-H929 세포의 용량-의존적인 축적을 발생시켰다. 키메라 CA8-mcMMAF ADC는 키메라 CA8-vcMMAE ADC보다 낮은 농도의 아넥신-V 양성 세포의 축적을 야기시켰다. 도 14를 참조하라.
5.8 CA8 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트의 인간화 변이체의 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 활성.
세포를 96웰 플레이트 (100㎕의 RPMI + 10% FBS에서 웰당 4,000개 세포)에 플레이팅하고, 네이키드 항체 또는 ADC를 세포 시딩 6시간 후에 첨가하고 플레이트를 144시간 동안 인큐베이션하였다. 항체 또는 ADC의 존재하에서의 성장 억제를 Cell Titre glo를 이용하여 144시간에 측정하였다. 데이터 포인트는 삼중 CellTiterGlo 측정치의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
다발성 골수종 세포주 NCI-H929 및 OPM2를 인간화 CA8 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트로 처리하여 성장 억제 및 사멸에 필요한 ADC 농도를 결정하였다. 이러한 항체의 mcMMAF 및 vcMMAE 항체-약물 컨쥬게이트 형태는 CA8 키메라에서 밝혀진 것에 필적하는 현저한 성장 억제 활성을 나타내었다. 변이체 J6M0는 키메라보다 높은 효능을 나타내었고 데이터는 H929 세포 및 OPM2 세포에서 도 15에 도시되어 있다. mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트는 시험된 둘 모두의 세포주에서의 모든 항체에 대해 vcMMAE 항체-약물 컨쥬게이트보다 큰 성장 억제 활성을 나타내었다. 모든 인간화 변이체에 대한 결과를 표 14에 제시한다.
표 14. NCI-H929 및 U266-B1 세포에서 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트에 대해 ng/mL로 표시된 IC50 값
Figure 112013119716171-pct00019
5.9 그 밖의 뮤린 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트의 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 활성.
세포를 96웰 플레이트 (100㎕의 RPMI + 10% FBS에서 웰당 4,000개 세포)에 플레이팅하고, 항체 또는 ADC를 세포 시딩 6시간 후에 첨가하고 플레이트를 144시간 동안 인큐베이션하였다. ADC의 존재하에서의 성장 억제를 Cell Titre glo를 이용하여 144시간에 측정하였다. 삼중 CellTiterGlo 측정치의 평균을 제시한다. 표 15a 및 15b는 다양한 시리즈의 항체에 대해 상이한 시점에 수행된 실험에서 비롯된다. 다발성 골수종 세포주 NCI-H929 및 U266-B1을 표 15a의 항체에 대해 이용하였다.
뮤린 항체 S322110D07, S332121F02 및 S332136E04의 mcMMAF 및 vcMMAE 항체-약물 컨쥬게이트 형태는 현저한 성장 억제 활성을 나타내었다. mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트는 활성이 관찰된 시험된 모든 뮤린 항-BCMA 항체에서 vcMMAE 항체-약물 컨쥬게이트보다 큰 성장 억제 활성을 나타내었다. IC50 수치를 표 15a에 제시한다. 이러한 3개의 항체 및 또한 S107118G03에 대한 용량 반응 곡선에 대해서는 도 16을 참조하라. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 표 15b에서 항체에 대한 NCI-H929, U266-B1, JJN3 및 OPM2 세포를 상이한 시리즈의 뮤린 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트로 처리하여 성장 억제 및 사멸에 필요한 ADC 농도를 결정하였다. IC50 수치를 표 15b에 제시한다. 표에 제시된 5개의 항체 모두는 현저한 ADC 활성을 지녔다.
표 15a. NCI-H929 및 U266-B1 세포에서 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트에 대해 ng/mL로 표시된 IC50 값
Figure 112013119716171-pct00020
표 15b. NCI-H929, U266-B1, JJN3 및 OPM2 세포에서 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트에 대해 ng/mL로 표시된 IC50 값
Figure 112013119716171-pct00021
5.10 컨쥬게이션된 아푸코실화 J6M0 (포텔리젠트)의 ADCC 효능
MMAE 또는 MMAF에 컨쥬게이션된 아푸코실화 J6M0를 BCMA 트랜스펙턴트를 이용하여 ADCC 검정에서 시험하여 이의 ADCC 활성이 컨쥬게이션에 의해 손상되지 않았음을 확인하였다. 유로퓸 표지된 ARH77-10B5 세포를 10000ng/ml 이하 농도의 다양한 J6M0 WT 및 포텔리젠트 BCMA 항체와 30분 동안 인큐베이션시킨 후 PBMC (PBMC: 표적 세포 비 50:1)를 첨가하였다. 2시간 후 분취량의 세포 배지를 샘플링하고 향상 용액과 혼합시켰다. 플레이트 진탕기 상에서 30분 후, 유로퓸 방출을 Victor 2 1420 다중-표지 리더 상에서 모니터하였다. 데이터 포인트는 삼중 값의 평균을 나타낸다. 이러한 데이터는 2회 실험을 대표한다.
J6M0 포텔리젠트의 컨쥬게이션되지 않은 형태 및 ADC 형태간에 ADCC 효능에 있어서 현저한 차이는 없었다. 아푸코실화 버젼과 효능을 어떻게 비교할 지를 나타내기 위해 동일한 실험에 J6M0의 야생형 버젼을 포함시켰다. 예상과 같이, 탈푸코실화는 보다 낮은 EC50 및 더 높은 최대 용해를 발생시켰다. J6M0의 Fc 불능화 형태에서는 어떠한 용해도 관찰되지 않았다 (도 17)
5.11 MM 세포주에 대한 아푸코실화 J6M0의 ADCC 효능
인간 PBMC를 다양한 농도의 아푸코실화 (포텔리젠트) J6M0의 존재하에 50:1의 E:T 비로 다발성 골수종 표적 세포와 인큐베이션시켰다. 18시간 후에 효과기 + 표적 세포 혼합물에 남아 있는 표적 세포의 비율을 형광 표지된 항-CD138 항체를 이용하여 FACS에 의해 측정함으로써 표적 세포를 검출하고 용해 퍼센트를 계산하였다. 이는 7회 실험을 대표한다.
J6M0 포텔리젠트 항체는 시험된 5개 모두의 다발성 골수종 표적 세포주에 대해 ADCC 활성을 나타내었다. 이것은 시험에 있어서 중요한데, 그 이유는 이전의 연구가 트랜스펙션된 세포를 이용하여 수행되었기 때문이다.
결과를 도 18에 제시한다. 다수의 공여체를 이용한 충분한 데이터세트를 표 16에 제시한다. 효능은 트랜스펙턴트에서 밝혀진 것과 모두 유사한 범위에 있었다. ADCC 활성은 이러한 세포주 상에서 BCMA 표면 발현과 직접 관련되지 않았다.
표 16. 5개의 다발성 골수종 세포주에 대해 11개의 공여체 (A-K로 명명됨)를 이용한 13회의 독립적인 검정에 대해 산출된 EC50 값.
Figure 112013119716171-pct00022
실시예 6: 이종이식 데이터
6.1 시험관내에서 계측된 항체 효능이 생체내에서도 입증될 수 있는지를 확인하기 위해 인간 MM 세포주의 뮤린 이종이식편을 시험하였다. 이종이식 연구를 위해 선택된 세포주는 시험관내 ADC 및 ADCC 사멸에 민감한 NCI-H929였다. T 및 B 세포는 결핍되었으나 NK 세포를 유지하여 ADCC 활성이 허용되는 면역약화된 CB.17 SCID 마우스에서 연구를 수행하였다. 그러나, 비록 인간 IgG1이 뮤린 Fc 수용체를 채용할 수 있으나, 프로텔리젠트 강화는 이것이 인간 Fc 수용체와 작용함에 따라 친화성을 개선시키지 않음이 주목되어야 한다.
6.2 NCI-H929 종양 성장에 대한 컨쥬게이션되지 않은 J6M0 및 MMAE 또는 MMAF 컨쥬게이션된 J6M0의 영향
J6M0의 ADCC 및 ADC 활성 둘 모두를 독립적으로 분석하기 위해, MMAF 또는 MMAE 컨쥬게이션의 존재 및 부재하에 J6M0 항체를 시험하였다. 컨쥬게이션되지 않은 J6M0을 시험함에 의해, 임의의 항종양 효과는 ADDC 및 기능적 억제 활성의 일부 조합에 기인할 수 있었다.
평균 200 mm3의 부피에 도달한 NCI-H929 종양을 갖는 마우스를 50 ㎍ 또는 100㎍ 용량의 인간 IgG1 대조군 또는 J6M0 항체 (컨쥬게이션되지 않음, MMAE 또는 MMAF)로 매주 2회씩 2주간 치료하였다. 이러한 연구로부터의 결과는 100 ㎍ 용량의 J6M0-MMAF 컨쥬게이트가 투여가 완료된 그러한 마우스에서 종양을 제거시켰음을 나타낸다. 마지막 투여 후에 J6M0-MMAF 마우스는 종양 발생의 재발 없이 40일 동안 유지되었다. 이러한 실험으로부터의 상기 결과는 MMAF 컨쥬게이션이 컨쥬게이션되지 않은 J6M0 항체 및 J6M0-MMAE 컨쥬게이트 둘 모두에 비해 항종양 활성을 증가시켰음을 입증한다. 도 19를 참조하라.
실시예 7: MM 환자 혈청으로부터의 가용성 BCMA 수준의 평가
7.1 BCMA가 세포외에 존재하는지 그리고 혈액에서 검출될 수 있는지는 현재 알려져 있지 않다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 MM 환자로부터의 인간 BCMA의 혈청 수준을 측정하였다. 54 MM 및 형질 세포 이혼화증 환자로부터의 혈청 샘플 및 20개의 정상 대조군 샘플을 ELISA에 의해 분석하였다. 인간 피검체 승인을 Western Institutional Review Board로부터 입수하였다.
7.2 혈청 인간 BCMA 수준의 평가
임상 중에 있는 환자 및 정상 대조군으로부터의 혈액을 혈청 수집 튜브에 수집하였다. MM 환자 샘플을 다양한 병기에서 얻었다 (진행성 질환, 관해, 재발, 새롭게 진단, 및 기타). 혈액 샘플을 10,000 rpm에서 10분 동안 회전시키고, 혈청을 멸균 마이크로-원심분리 플라스틱 튜브로 옮겼다.
가용성 인간 BCMA 수준을 측정하는 R & D Systems로부터의 인간 BCMA/TNFRSF17 ELISA 키트(catalog # DY193E)를 이용하여 키트와 함께 공급된 표준 프로토콜에 따라서 BCMA를 검출하였다.
간단히 말해, 96웰 마이크로플레이트를 웰당 100㎕의 포획 항체로 코팅시키고 4oC에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS 중 0.05% Tween 20, pH 7.2)으로 3회 세척하고 PBS 중 300㎕의 1% BSA로 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 10O㎕의 혈청 샘플 또는 표준을 각각의 웰에 첨가시키고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척한 다음 10O㎕의 검출 항체를 각각의 웰에 첨가시켜 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척한 후에 10O㎕의 스트렙타비딘-HRP를 각각의 웰에 첨가하고 암실에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고 50㎕의 정지 용액을 첨가시킨 다음, 570nM 파장을 이용하여 마이크로플레이트 리더에 의해 측정하였다.
존재하는 BCMA의 수준에 적절한 혈청 희석 인자를 결정하기 위해 일련의 검정을 수행하였다. 1:500의 희석 인자가 대다수의 샘플에 적합한 것으로 밝혀졌고 데이터에 사용된 희석 인자가 도 20에 도시된다. 전체 데이터 세트는 표 17에 제시된다.
희석되고 삼중으로 진행된 환자 및 정상 대조군 혈청 샘플의 BCMA 수준을 측정하였다. BCMA의 혈청 수준은 이러한 연구에서 정상 대조군에 비해 MM 환자로부터의 혈청에서 현저하게 증가되었다. 질병 서브세트를 추가로 세분해 보면, 관해인 환자에 비해 진행성 MM 환자로부터의 혈청에 BCMA의 혈청 수준이 증가하는 경향이 존재하였다. 이것은 임의의 인간 질환에서 혈청 BCMA를 동정한 최초의 보고서이고, 이러한 수준이 MM 환자 및 형질 세포 매개된 질환을 갖는 그 밖의 환자의 질환 상태 및 치료 반응을 모니터하기 위한 신규한 바이오마커일 수 있음을 시사한다.
표 17. 수치는 1/50, 1/500 및 1/5000로 희석된 샘플로부터 계산된 ng/ml의 가용성 BCMA의 혈청 농도를 나타낸다. P 값은 일방적 T-테스트를 이용하여 계산되었고 95% 유의성 값은 표 아래에 있다.
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서열 요약 (표 C)
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SEQUENCE LISTING <110> CRAIGEN, Jennifer WATTAM, Trevor Anthony Kenneth PARMER, Radha Shah MAYES, Patrick HAMBLIN, Paul Andrew CLEGG, Stephanie ALGATE, Paul LEWIS, Alan Peter <120> Antigen Binding Proteins <130> PB64476 <150> us 61/490732 <151> 2011-05-27 <160> 199 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 363 <212> DNA <213> mus musculus <400> 8 gaggtgcagc tgcagcagag cggcgccgtg ctggccaggc ccggagctag cgtgaagatg 60 agctgcaagg gcagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaaacagagg 120 cccggccagg gactggagtg gatcggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaagctg accgccgtga cctcaaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgac caacgaggac agcgccgtct attactgcac caggggcgcc 300 atctacaacg gctacgacgt gctggacaat tggggccagg gaacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> mus musculus <400> 9 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Val Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Tyr Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 324 <212> DNA <213> mus musculus <400> 10 gatatccagc tgacccagac cacaagcagc ctgagcgcct ccctgggcga cagggtgacc 60 attagctgca gcgccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 gacggcaccg tggagctcgt gatctactac acctccaacc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 aggttctctg gcagcggcag cggcaccgac tacagcctga ccatcggcta tctggagccc 240 gaggacgtcg ccacctacta ctgccagcag tacaggaagc tgccctggac cttcggcgga 300 ggctctaagc tggagattaa gcgt 324 <210> 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ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacaacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 14 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatgggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacaacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp 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Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 20 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg gcagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatcggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggcgaccctc accgccgaca cgagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcac caggggcgcc 300 atctacaacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 21 <211> 121 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accgccgaca cgagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcac caggggcgcc 300 atctacgacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 24 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatgggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacgacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 26 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatgggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacgacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humansed antibody sequence <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile 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gatctactac acctccaacc tgcactccgg cgtgcccagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgat tacaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaggaagc tcccctggac tttcggccag 300 ggcaccaaac tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 69 <211> 115 <212> PRT <213> mus musculus <400> 69 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 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ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654 <210> 164 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 164 Asp Tyr Tyr Asn Met 1 5 <210> 165 <211> 16 <212> PRT <213> mus musculus <400> 165 Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Gly 1 5 10 15 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 166 Ser Val Tyr Asp Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> mus musculus <400> 167 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His 1 5 10 15 <210> 168 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 168 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 169 Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Arg Thr 1 5 <210> 170 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 170 Asp Tyr Ser Ile Asp 1 5 <210> 171 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 171 Asp Ile Asp Pro Asn Tyr Gly Asp Pro Ile Tyr Asn His Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 172 Arg Ala Thr Gly Thr Asp Trp Phe Ala Phe 1 5 10 <210> 173 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 173 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 174 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 174 Ala Ala Thr Ile Leu Ala Asp 1 5 <210> 175 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 175 Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 176 Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 177 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 177 Ile Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 178 Gly Ile Tyr Asp Tyr Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 179 <211> 15 <212> PRT <213> mus musculus <400> 179 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His 1 5 10 15 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 180 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 181 Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 182 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 182 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 183 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 183 Glu Ile Asn Pro Asp Arg Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 184 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 184 Phe Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 185 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 185 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 186 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 186 Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 187 Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 188 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 188 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 189 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 189 Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 190 Gln Val Phe Asp Tyr Pro Met Asp Tyr 1 5 <210> 191 <211> 15 <212> PRT <213> mus musculus <400> 191 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His 1 5 10 15 <210> 192 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 192 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 193 Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 194 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 194 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 195 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 195 Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 196 Ser Ile Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 197 <211> 15 <212> PRT <213> mus musculus <400> 197 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His 1 5 10 15 <210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 198 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 199 Gln Gln Ser Ile Glu Tyr Pro Arg Thr 1 5

Claims (31)

  1. B 세포 성숙화 항원 (BCMA)에 특이적으로 결합하여 BCMA에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제하는 항원 결합 단백질로서,
    i) SEQ ID NO:3 또는 이의 변이체 N99D에 개시된 CDRH3;
    ii) SEQ ID NO:1에 개시된 CDRH1;
    iii) SEQ ID NO:2에 개시된 CDRH2;
    iv) SEQ ID NO:4에 개시된 CDRL1;
    v) SEQ ID NO:5에 개시된 CDRL2; 및
    vi) SEQ ID NO:6에 개시된 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 FcγRIIIA에 결합할 수 있거나 FcγRIIIA 매개되는 효과기(effector) 기능을 할 수 있고 상기 항원 결합 단백질이 내재화(internalisation)될 수 있는 항원 결합 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 FcγRIIIA에 향상된 결합능을 지니거나 향상된 FcγRIIIA 매개되는 효과기 기능을 지니는 항원 결합 단백질.
  4. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 효과기 기능을 지니는 항원 결합 단백질.
  5. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 탈푸코실화된 항원 결합 단백질.
  6. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 Taci에 결합하지 않는 항원 결합 단백질.
  7. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:23으로 나타낸 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:31로 나타낸 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  8. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 인간화 모노클로날 항체인 항원 결합 단백질.
  9. 제 8항에 있어서, 항체가 IgG1 아이소형인 항원 결합 단백질.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니항체, 또는 미니바디인 항원 결합 단백질.
  11. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 비-인간 영장류 BCMA에 추가로 결합하는 항원 결합 단백질.
  12. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 150pM보다 강한 친화성으로 BCMA에 결합하는 항원 결합 단백질.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 및 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트.
  14. 제 13항에 있어서, 항원 결합 단백질이 링커에 의해 세포독성제에 연결된 면역컨쥬게이트.
  15. 제 13항에 있어서, 세포독성제가 아우리스타틴(auristatin)또는 돌로스타틴(dolostatin)인 면역컨쥬게이트.
  16. 제 13항에 있어서, 세포독성제가 MMAE 및 MMAF로부터 선택되는 면역컨쥬게이트.
  17. 제 13항에 있어서, 세포독성제가 상기 항원 결합 단백질에 공유적으로 결합하는 면역컨쥬게이트.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 링커가 절단가능한 링커인 면역컨쥬게이트.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 링커가 절단불가능한 링커인 면역컨쥬게이트.
  20. 제 14항에 있어서, 링커가 6-말레이미도카프로일 (MC), 말레이미도프로파노일 (MP), 발린-시트룰린 (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트 (SMCC), 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB)로부터 선택되는 면역컨쥬게이트.
  21. 제 13항에 있어서, 상기 면역컨쥬게이트가 종양 세포와 접촉시 종양 세포에 의해 포식되는 면역컨쥬게이트.
  22. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, B 세포 림프종 치료용 약학적 조성물.
  23. 제 13항에 따른 면역컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, B 세포 림프종 치료용 약학적 조성물.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 B 세포 림프종은 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비호지킨 림프종 (NHL), 미만성 대세포 림프종 (DLBCL), 또는 소포 림프종 (FL)인 약학적 조성물.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 B 세포 림프종은 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비호지킨 림프종 (NHL), 미만성 대세포 림프종 (DLBCL), 또는 소포 림프종 (FL)인 약학적 조성물.
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