BR112013028779B1 - proteína de ligação de antígeno ou imunoconjugado, imunoconjugado, composição farmacêutica, e, uso de uma composição - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO OU IMUNOCONJUGADO, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE HUMANO AFLIGIDO COM UM DISTÚRBIO OU DOENÇA INFLAMATÓRIOS, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se às proteínas que ligam antígeno e fragmentos das mesmas que especificamente ligam o Antígeno de Maturação de Célula B (BCMA), particularmente BCMA humana (hBCMA) e que inibem a ligação de BAFF e APRIL ao receptor de BCMA. São descritos ainda composições farmacêuticas, métodos de triagem e tratamento farmacêutico.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se às proteínas que ligam antígeno e fragmentos das mesmas que especificamente ligam o Antígeno de Maturação de Célula B (BCMA) e em particular BCMA humano (hBCMA).

[002] A presente invenção também se refere a métodos de tratar doenças ou distúrbios com os ditos fragmentos de ligação de antígeno, composições farmacêuticas que compreendem os ditos fragmentos de ligação de antígeno e métodos de fabricação. Outras formas de realização da presente invenção estarão evidentes a partir da descrição abaixo.

Fundamentos da invenção

[003] BCMA (CD269 ou TNFRSF17) é um membro da superfamília do receptor de TNF. O mesmo é um receptor de membrana integral não glicosilado para os ligandos BAFF e APRIL. Os ligandos de BCMA também podem ligar receptores adicionais: TACI (Ativador de Transmembrana e modulador de Cálcio e Interador do ligando de ciclofilina), que liga APRIL e BAFF; assim como BAFF-R (Receptor BAFF ou BR3), que mostra afinidade restrita porém alta para BAFF. Juntos, estes receptores e seus ligandos correspondentes regulam aspectos diferentes de imunidade humoral, desenvolvimento de célula B e homeostase.

[004] A expressão de BCMA é tipicamente restrita à linhagem de célula B e é relatada aumentar na diferenciação de célula B de terminal. O BCMA é expressado pelos blastos plasmáticos humanos, células plasmáticas das amígdalas, baço e medula óssea, mas também pelas células B de memória tonsilar e pelas células do centro germinal, que têm um fenótipo TACI- BAFFR baixo (Darce et al, 2007). BCMA é virtualmente ausente no ingênuo e células B de memória (Novak et al., 2004a e b). O antígeno de BCMA é expressado na superfície da célula de modo que é acessível ao anticorpo, mas também é expressado no complexo de Golgi. Como sugerido pelo seu perfil de expressão, a sinalização de BCMA, tipicamente ligada com a sobrevivência e proliferação de célula B, é importante nos estágios tardios de diferenciação de célula B, assim como a sobrevivência de células plasmáticas da medula óssea de vida longa (O’Connor et al., 2004) e plasmablastos (Avery et al., 2003). Além disso, conforme BCMA liga APRIL com alta afinidade, o eixo de sinalização BCMA-APRIL é sugerido predominar nos últimos estágios de diferenciação de célula B, talvez sendo a interação mais fisiologicamente relevante.

[005] Mieloma Múltiplo (MM) é uma malignidade de célula B clonal que ocorre em sítios múltiplos dentro da medula óssea antes de se espalhar para a circulação; de novo, ou como uma progressão de gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS). O mesmo é habitualmente caracterizado pelos aumentos na paraproteína e atividade de osteoclasto, assim como hipercalcemia, citopenia, disfunção renal, hiperviscosidade e neuropatia periférica. Diminuições tanto nos níveis normais de anticorpo quanto nos números de neutrófilos são também comuns, levando a uma susceptibilidade potencialmente letal para a infecção. O BCMA foi implicado no crescimento e sobrevivência de linhagens de célula de mieloma in vitro (Novak et al., 2004a e b; Moreaux et al., 2004).

[006] A expressão de BCMA (tanto de transcrito quanto de proteína) é relatada correlacionar-se com a progressão de doença em MM. Usando microarranjos Affymetrix, foi demonstrado que os genes TACT e BCMA foram sobrexpressados em Células de Mieloma Múltiplo (MMC) comparadas com suas contrapartes normais (Moreaux et al, 2004). A análise de expressão de gene foi usada para comparar células de mieloma humanas com células plasmáticas purificadas de pacientes com MGUS e de medula óssea normal assim como com células de tumor primário das leucemias da linhagem de célula B (Bellucci et al, 2005). O gene BCMA foi altamente expressado em todas as amostras de mieloma. Embora células plasmáticas purificadas de pacientes com MGUS tivessem expressão de BCMA mais baixa, não houve nenhuma diferença significante quando comparadas com a expressão encontrada em células plasmáticas normais ou células de mieloma. Ao contrário, a expressão de BCMA foi significantemente mais baixa na Leucemia Linfocítica Crônica (CLL) de célula B, Leucemia Linfocítica Aguda pré-B (ALL) e ALL de célula T (T-ALL). Os modelos de camundongo que transgenicamente sobrexpressam BAFF ou APRIL têm um aumento significante nos linfomas de célula B (Batten et al., 2004 - BAFF; Planelles et al., 2004 - APRIL). Nos seres humanos, BAFF e APRIL em excesso foram detectados nos soros e microambientes de pacientes com várias malignidades de célula B, assim como outros distúrbios de célula B.

[007] Todas as referências de patente e literatura descritas dentro do presente relatório descritivo são expressa e totalmente aqui incorporadas por referência.

Breve Descrição das Figuras

[008] Figura 1: Ensaio de Ligação de FMAT - Figura que mostra os resultados do ensaio FMAT para a ligação de anticorpo CA8 às células HEK293 que expressam BCMA humano e de cino. O CA8 quimérico humano liga-se bem às células que expressam BCMA humano e de cino.

[009] Figura 2: Ensaio de Ligação de ELISA - Figura que mostra os resultados de ELISA para a ligação dos anticorpos CA8 às proteínas recombinantes de BCMA humano e de cino. Isto claramente mostra que os anticorpos CA8 quiméricos humanos se ligam ao BCMA humano e proteínas de cino igualmente.

[0010] Figura 3: Ensaio de Ligação BiaCore - Figura que mostra a ligação de CA8 às proteínas de BCMA-Fc, TACI-Fc e BAFF-R-Fc no experimento Biacore. O anticorpo quimérico CA8 não se liga às proteínas TALI ou BAFF-R.

[0011] Figura 4: Ensaio de ligação de célula - Figura que mostra a ligação de S307118G03, S3222110D07, S332121F02 e S332126E04 murino às células de mieloma múltiplas H929 e S3322110D07, S332121F02 e S332126E04 às células ARH77 transfectadas com BCMA como determinado por FACS.

[0012] A linhagem de célula de BCMA H929 ou ARH77-hBCMA 10B5 Mieloma Múltiplo que expressam células transfectantes foram tingidas com anticorpos anti BCMA de murino (histograma sólido) ou controle de isótipo de IgG2a de murino (histogramas abertos). As células foram analisadas por FACS para detectar anticorpo ligado às células.

[0013] Figura 5: Ensaio de ligação de célula - Figura que mostra a ligação de CA8 quimérico a um painel de linhagens de célula de Mieloma Múltiplo como determinado por FACS. A ligação a H929, OPM-2, JJN-3 e U266 foi testada pela citometria de fluxo e valores de intensidade de fluorescência média (MFI) medidos para determinar a ligação. Synagis foi usado como um controle de isótipo irrelevante.

[0014] Figura 6: Ensaio de ligação de célula - Figura que mostra as curvas de ligação de variantes CA8 humanizadas para células ARH77 transfectadas com BCMA (A) e células H929 de Mieloma Múltiplo (B) como determinado por FACS. As variantes humanizadas J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1 e J9M2 foram testadas pela citometria de fluxo e os valores de intensidade de fluorescência média (MFI) medidos para determinar a ligação comparada com a quimera CA8.

[0015] Figura 7: Ensaios de neutralização de ligando - (A e B) Figura que mostra a capacidade de CA8 e J6M0 para neutralizar a ligação de BAFF ou APRIL recombinantes ao BCMA recombinante revestido em uma placa de ELISA. Os valores OD foram usados para calcular a inibição mediada por anticorpo do sinal máximo obtido pela ligação apenas do ligando relevante ao BCMA recombinante. Os dados são relatados como inibição percentual do sinal máximo. Os anticorpos testados foram CA8 quiméricos e CA8 humanizados versão J6M0 tanto na forma do tipo selvagem quanto afucosilada (Potelligent). (A) Neutralização da ligação de ligando BAFF; (B) Neutralização da ligação de ligando APRIL. (C) - Figura que mostra a capacidade do anticorpo J6M0 BCMA na inibição da fosforilação induzida por BAFF ou APRIL de NFCapaB em células H929. As células H-929 foram lavadas 3 vezes para remover qualquer sBCMA e recolocados em suspensão em meio isento de soro. anticorpo J6M0 potelligent foi adicionado a uma placa de 96 reservatórios para dar uma concentração de reservatório final de até 100 μg/ml junto com ligando BAFF ou APRIL para dar uma concentração de reservatório final de 0,6 ou 0,2 μg/ml respectivamente. As células H-929 foram depois plaqueadas a 7,5 x 104 células/reservatório em meio isento de soro. 30 minutos mais tarde as células foram lisadas e os níveis de NFcapaB fosforilado medidos usando um ensaio de MSD pNFcapaB. A leitora de MSD 502819. Isto é, dados de um dos experimentos independentes. Cada ponto de dados é a média/sd de duas réplicas.

[0016] Figura 8: Ensaio de ADCC - Figura que mostra a atividade de ADCC de CA8 quimérico e CA8 desfucosilado (realçado com Fc) com células alvo que expressam BCMA.

[0017] As células NK humanas foram incubadas com células alvo ARH77 10B5 transfectadas com BCMA rotuladas com európio na presença de concentrações variáveis do anticorpo. A liberação de európio das células alvo foi medida e a lise específica calculada. (A) as curvas de resposta de dose ADCC de CA8 quimérico comparado com o controle de isótipo. (B) as curvas de resposta de dose ADCC para CA8 quimérico e CA8 quimérico desfucosilado (realçada com Fc), contra a linhagem de célula ARH77 10B5 que expressa BCMA.

[0018] Figura 9: ensaio de ADCC - Figura que mostra ensaio de ADCC sobre anticorpos humanizados com CA8 usando células alvo que expressam ARH77 BCMA.

[0019] PBMC Humanas foram incubadas com células alvo transfectadas com ARH77 BCMA rotuladas com európio na presença de uma faixa de concentrações da série J5, J6, J7, J8 ou J9 de anticorpos CA8 humanizados. A liberação de európio das células alvo foi medida e a lise específica calculada. Os valores EC50 são mostrados na μg/ml.

[0020] Figura 10: Ensaio de ADCC - Figura que mostra a atividade de ADCC de quimérico, S332121F02 (A), S3322110D07 (B) S307118G03 (C) e S307118G03 H3L0 humanizado (D) contra células alvo ARH7710B5 com células NK purificadas como células efetoras. As células alvo NK humanas foram incubadas com células alvo transfectadas com ARH77 10B5 BCMA rotuladas com európio na presença de concentrações variáveis do anticorpo. A liberação de európio das células alvo foi medida e a lise específica calculada.

[0021] Figura 11: As curvas de resposta de dose do ensaio de viabilidade - Figura que mostra curvas de resposta de dose em um ensaio de viabilidade de célula para anticorpo CA8 quimérico, conjugados de droga de anticorpo CA8-vcMMAE quimérico e CA8-mcMMAF quimérico em linhagens de célula de Mieloma Múltiplo humanos (A) NCI-H929 (B) U266- B1 (C) JJN3 e (D) OPM2. O anticorpo foi adicionado às células e o número de células viáveis depois de 96 horas medidos usando CelltiterGlo. Os pontos de dados representam a média de medições de CellTiterGlo em triplicata. As barras de erro representam erro padrão.

[0022] Figura 12: Impacto de anticorpo quimérico CA8 sobre o ciclo celular. (A) Histogramas do ciclo celular de células NCI-H929 tratadas com CA8 quimérico não conjugado, CA8vcMMAE ADC quimérico ou CA8- mcMMAF ADC quimérico a 50 ng/ml para os pontos de tempo indicados. Pactitaxel (100 nM) foi usado como um controle positivo para a parada do ciclo celular G2/M e morte de célula. IgG1 de ser humano de controle foi usado como um controle negativo. A análise do ciclo celular foi realizada nos tempos mostrados nos gráficos. (B) Quantificação da população de célula de DNA 4N indicativa de parada de G2/M e (C) população de célula de DNA sub-2N indicativa de morte de célula para cada um dos tratamentos indicados. As células foram semeadas em placas de 12 reservatórios (2 x 105 células por reservatório em 1 ml de RPMI + 10 % de FBS). Anticorpo ou ADC foram adicionados 6 horas depois da semeadura de célula.

[0023] Figura 13: Impacto de CA8 quimérico sobre a fosfo- histona H3.

[0024] O tratamento com CA8 ADC quimérico resulta em tingimento com fosfo-Histona H3 aumentada de células NCI-H929. (A,B) As plotagens de pontos de células tingidas com iodeto de propídio para medir o teor de DNA (FL3-H) eixo x e anticorpo anti-fosfo-Histona H3 (Thr11) (FL1-H) eixo y depois do tratamento com IgG de Controle (A) ou CA8-mcMMAF quimérico (B). (C) Quantificação de células NCI-H929 positivas em fosfo-Histona H3 depois de um tratamento de 48 horas com as concentrações indicadas de ADCs CA8 quiméricos. Pactitaxel (100 nM) foi usado como um controle positivo para a parada mitótica e IgG1 quimérica de controle foi usada como um controle negativo. As células foram semeadas em placas de 12 reservatórios (2 x 105 células por reservatório em 1 ml de RPMI + 10 % de FBS). Anticorpo ou ADC foram adicionados 6 horas depois da semeadura das células.

[0025] Figura 14: Impacto de CA8 quimérico sobre Anexina-V.

[0026] O tratamento com ADC CA8 quimérico resulta em tingimento com Anexina-V aumentado de células NCI-H929. (A) Histogramas de Anexina-V-FITC (FL1-H; painéis de topo) e tingimento com iodeto de propídio de célula viva (FL3-H; painéis de fundo) depois do tratamento com concentrações crescentes de ADCs CA8 quiméricos (B) Quantificação de células NCI-H929 positivas em Anexina-V depois de um tratamento de 96 horas com as concentrações indicadas de ADCs CA8 quiméricos. Pactitaxel (100 nM) foi usado como um controle positivo para apoptose e a IgG1 quimérica de controle foi usada como um controle negativo. As células foram semeadas em placas de 12 reservatórios (2 x 105 células por reservatório em 1 ml de RPMI + 10 % de FBS). Anticorpo ou ADC foram adicionados 6 horas depois da semeadura de célula.

[0027] Figura 15: Curvas de resposta de dose do ensaio de viabilidade - Figura que mostra curvas de resposta de dose para não conjugados (nus) e conjugados de anticorpo vcMMAE e conjugados de droga de anticorpos mcMMAF ou J6M0 humanizados. Os conjugados de droga de anticorpo foram testados contra linhagens de célula de Mieloma Múltiplo humano NCI-H929 e OPM2.

[0028] Figura 16: curvas de resposta de dose do ensaio de viabilidade - Figura que mostra curvas de resposta de dose para os anticorpos não conjugados, conjugados de droga de anticorpo vcMMAE e mcMMAF de anticorpos anti-BMCA murinos S332121F02, S322110D07, S332126E04 e S307118G03 em linhagens de célula de Mieloma Múltiplo humano NCI- H929 e U266-B1.

[0029] Figura 17: Atividade ADCC de moléculas ADC J6M0 - Figura que mostra ensaio ADCC em anticorpos J6M0 usando células alvo que expressam ARH77 BCMA. PBMCs humanas foram incubadas com células alvo transfectadas com ARH77 BCMA rotuladas com európio na presença de uma faixa de concentrações de anticorpos J6M0 WT e potelligent BCMA conjugados a MMAE, MMAF, ou não conjugadas a liberação de európio foi monitorada na leitora de multi-rótulo Victor 2 1420.

[0030] Figura 18: Curvas de resposta de dose ADCC de CA8 J6M0 Potelligent contra um painel de 5 linhagens de Mieloma Múltiplo - PBMCs humanas foram incubadas com células alvo de mieloma múltiplo na presença de concentrações variáveis de anticorpo CA8 J6M0 potelligent a uma razão E: T de 50: 1 por 18 horas. A porcentagem das células alvo que permanecem no efetor mais a mistura alvo foi depois medida por FACS usando um anticorpo anti-CD138 fluorescentemente rotulado para detectar as células alvo e a citotoxicidade percentual calculada. A) Curvas de resposta de dose de exemplo para CA8 J6M0 potelligent contra as cinco linhagens de célula de Mieloma Múltiplo testadas. Cada ponto de dados é de um valor de apenas uma amostra.

[0031] Figura 19: Efeito de escalação de dose de J6M0 e conjugado de droga J6M0 no crescimento e estabelecimento de células NCI-H929 em camundongos CB,17 SCID Volumes de tumor calculados de tumores NCI-H929 em camundongos CB17 SCID que seguem a dosagem intraperitoneal duas vezes semanalmente de 50 ou 100 μg de controle de isótipo J6M0 anti-BCMA ou IgG1 não conjugado, ou conjugado ao MMAE ou MMAF por 2 semanas. Os pontos de dados representam volume de tumor médio de n = 5 por grupo

[0032] Figura 20: Determinação dos níveis de BCMA solúvel em soro de voluntários saudáveis e pacientes com mieloma. As amostras de soro que foram coletadas de amostras de paciente com MM foram de uma variedade de estágios (doença progressiva, remissão, recaída, recém diagnosticado, e outros). As amostras mostradas na figura são aquelas de soro diluído 1/500 antes do ensaio.

[0033] Um kit de ELISA intercalado de BCMA humano/ TNFRSF17 da R& D Systems que mede os níveis de BCMA humano solúvel foi usado para detectar BCMA seguindo o protocolo padrão fornecido com o kit.

Sumário da invenção

[0034] A presente invenção fornece proteínas que ligam antígeno que se ligam aos alvos ligados à membrana e em que a proteína de ligação de antígeno é capaz de internalização. Em uma outra forma de realização é fornecido um imunoconjugado que compreende a proteína de ligação de antígeno da presente invenção e um agente citotóxico. Em uma outra forma de realização a proteína de ligação de antígeno tem função efetora de ADCC por exemplo a proteína de ligação de antígeno tem função efetora de ADCC realçada.

[0035] A presente invenção fornece proteínas que ligam antígeno que especificamente se ligam a BCMA, por exemplo anticorpos que especificamente se ligam a BCMA e que inibem a ligação de BAFF e/ou APRIL ao receptor de BCMA. A presente invenção também fornece proteínas que ligam antígeno que especificamente se ligam a BCMA e que inibem a ligação de BAFF e/ou APRIL ao BCMA em que a proteína de ligação de antígeno é capaz de ligação a FcyRIIIA ou é capaz de função efetora mediada por FcyRIIIA.

[0036] As proteínas que ligam antígeno da presente invenção especificamente se ligam a BCMA e inibem a ligação de BAFF e/ou APRIL ao BCMA em que a proteína de ligação de antígeno tem ligação realçada a FcyRIIIA ou tem função efetora mediada por FcyRIIIA realçada. Em uma forma de realização a proteína de ligação de antígeno é capaz de internalização.

[0037] Em um aspecto da invenção é fornecido uma proteína de ligação de antígeno que se liga a BCMA não ligado à membrana, por exemplo ao BCMA sérico.

[0038] Em uma forma de realização da presente invenção é fornecido um imunoconjugado que compreende a proteína de ligação de antígeno da presente invenção e um agente citotóxico.

[0039] Em uma outra forma de realização as proteínas que ligam antígeno são conjugadas a uma toxina tal como uma auristatina. Já em uma outra forma de realização o conjugado de droga é vcMMAE ou mcMMAF. Em uma forma de realização o imunoconjugado também é ADCC realçada.

[0040] As proteínas que ligam antígeno podem estar relacionadas a, ou derivadas de um anticorpo monoclonal de murino CA8. A sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de murino CA8 é fornecida como a SEQ ID NO. 7 e a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve de murino CA8 é fornecida como a SEQ ID NO. 9.

[0041] As proteínas que ligam antígeno podem estar relacionadas a, ou derivadas de um anticorpo monoclonal de murino 5336105A07. A sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de murino 5336105A07 é fornecida como a SEQ ID NO. 140 e a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve de murino 5336105A07 é fornecida como a SEQ ID NO. 144.

[0042] Outros anticorpos monoclonais de murino a partir dos quais as proteínas que ligam antígeno da presente invenção também podem ser derivadas são incluídos na Tabela C.

[0043] As regiões variáveis da cadeia pesada (VH) das proteínas que ligam antígeno podem compreender as CDRs ou variantes que seguem destas CDR’s (como definidas por Kabat (Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)): A CDRH1 é fornecida como a SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 182 A CDRH2 é fornecida como a SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 183 A CDRH3 é fornecida como a SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO. 184

[0044] As regiões variáveis da cadeia leve (VL) das proteínas que ligam antígeno podem compreender as CDRs ou variantes que seguem destas CDR’s (como definidas por Kabat (Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)): A CDRL1 é fornecida como a SEQ ID NO. 4 ou SEQ ID NO. 185 A CDRL2 é fornecida como a SEQ ID NO. 5 ou SEQ ID NO. 186 A CDRL3 é fornecida como a SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO. 187

[0045] A invenção também fornece uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma região variável da cadeia pesada de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável da cadeia leve de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas.

[0046] A invenção também fornece uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas, e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas.

[0047] Tais polinucleotídeos representam a sequência codificadora que corresponde às sequências de polipeptídeo equivalentes, entretanto será entendido que tais sequências de polinucleotídeo podem ser clonadas em um vetor de expressão junto com um códon de partida, uma sequência de sinal apropriada e um códon de parada.

[0048] A invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante transformada ou transfectada que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas.

[0049] A invenção fornece ainda um método para a produção de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas método este que compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira que compreende um primeiro e segundo vetores, o dito primeiro vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas e o dito segundo vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de qualquer uma das proteínas que ligam antígeno aqui descritas, em um meio de cultura adequado, por exemplo meio de cultura isento de soro.

[0050] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0051] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou profilaxia de uma doença ou distúrbio responsivo à inibição ou bloqueio de BCMA tal como a modulação da interação entre BCMA e seus ligandos, BAFF ou APRIL método este que compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrita.

[0052] É portanto um objetivo da presente invenção fornecer um método terapêutico para o tratamento de distúrbios ou doenças relacionados com a célula B tais como doenças mediadas por anticorpo ou mediadas pela célula plasmática ou malignidades da célula plasmática tais como por exemplo Mieloma Múltiplo (MM). Em particular é um objetivo da presente invenção fornecer proteínas que ligam antígeno, especialmente anticorpos que especificamente se ligam a BCMA (por exemplo, hBCMA) e modulam (isto é, inibem ou bloqueiam) a interação entre BCMA e seus ligandos tais como BAFF e/ou APRIL no tratamento de doenças e distúrbios responsivos à modulação desta interação.

[0053] Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um método de tratar um paciente humano afligido com um distúrbio ou doença relacionados com a célula B tais como doenças mediadas por anticorpo ou mediadas pela célula plasmática ou malignidades da célula plasmática tais como por exemplo Mieloma Múltiplo (MM) método este que compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.

[0054] Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um método de tratar um paciente humano afligido com Artrite Reumatóide, Psoríase, Diabete Melito Tipo 1 ou Esclerose Múltipla método este que compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.

Descrição Detalhada da Invenção

[0055] A presente invenção fornece proteínas que ligam antígeno que se ligam aos alvos ligados às membranas e em que a proteína de ligação de antígeno é capaz de internalização. Em uma outra forma de realização é fornecido um imunoconjugado que compreende a proteína de ligação de antígeno da presente invenção e um agente citotóxico. Em uma outra forma de realização a proteína de ligação de antígeno tem função efetora de ADCC por exemplo a proteína de ligação de antígeno tem função efetora de ADCC realçada.

[0056] Em uma tal forma de realização são fornecidas proteínas que ligam antígeno ou fragmentos do mesmo que especificamente se ligam a BCMA, por exemplo que especificamente se ligam ao BCMA humano (hBCMA) e que inibem a ligação de BAFF e/ou APRIL ao receptor de BCMA.

[0057] Em uma outra forma de realização as proteínas que ligam antígeno ou fragmentos especificamente se ligam a BCMA e inibem a ligação de BAFF e/ou APRIL ao BCMA em que as proteínas que ligam antígeno ou fragmentos do mesmo têm a capacidade para se ligar a FcyRIIIA e mediar as funções efetoras mediadas por FcgRIIIA, ou têm funções efetoras mediadas por FcgRIIIA realçada. Em uma forma de realização da invenção como aqui fornecida as proteínas que ligam antígeno são capazes de internalização.

[0058] Em um aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção como aqui descrita que se liga a BCMA não ligado à membrana, por exemplo ao BCMA sérico.

[0059] Em um aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita em que a proteína de ligação de antígeno compreende CDRH3 da SEQ ID NO. 3 ou uma variante da SEQ ID NO. 3.

[0060] Em um outro aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita em que a proteína de ligação de antígeno compreende ainda uma ou mais de: CDR H1 da SEQ ID NO: 1, CDRH2: SEQ ID NO: 2: CDRL1: SEQ ID NO: 4, CDRL2: SEQ ID NO: 5 e/ou CDRL3: SEQ ID NO: 6 e ou variantes da mesma.

[0061] Em um aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita em que a proteína de ligação de antígeno compreende CDRH3 da SEQ ID NO. 184 ou uma variante da SEQ ID NO. 184.

[0062] Em um outro aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita em que a proteína de ligação de antígeno compreende ainda uma ou mais de: CDR H1 da SEQ ID NO: 182, CDRH2: SEQ ID NO: 183: CDRL1: SEQ ID NO: 185, CDRL2: SEQ ID NO: 186 e/ou CDRL3: SEQ ID NO: 187 e ou variantes da mesma.

[0063] Ainda em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno compreende CDR H3 da SEQ ID NO: 3: CDRH2: SEQ ID NO: 2: CDR H1 of SEQ ID NO: 1: CDRL1: SEQ ID NO: 4: CDRL2: SEQ ID NO: 5 e CDRL3: SEQ ID NO: 6.

[0064] Ainda em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno compreende CDR H3 da SEQ ID NO: 184: CDRH2: SEQ ID NO: 183: CDR H1 da SEQ ID NO: 182: CDRL1: SEQ ID NO: 185: CDRL2: SEQ ID NO: 186 e CDRL3: SEQ ID NO: 187.

[0065] Em um aspecto da invenção a proteína de ligação de antígeno tem função efetora realçada. Em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno é conjugada a um agente citotóxico. Ainda em uma outra forma de realização a proteína de ligação de antígeno tanto tem função efetora realçada quanto é conjugada a um agente citotóxico.

[0066] As proteínas que ligam antígeno da presente invenção podem compreender regiões variáveis da cadeia pesada e regiões variáveis da cadeia leve da invenção que podem ser formatadas na estrutura de um anticorpo natural ou fragmento funcional ou equivalente do mesmo. Uma proteína de ligação de antígeno da invenção pode, portanto, compreender as regiões VH da invenção formatadas em um anticorpo de tamanho natural, um fragmento (Fab’)2, um fragmento Fab, ou equivalente do mesmo (tal como scFV, bi- tri- ou tetra-corpos, Tandabs etc.), quando emparelhadas com uma cadeia leve apropriada. O anticorpo pode ser um IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4; ou IgM; IgA, IgE ou IgD ou uma variante modificada do mesmo. O domínio constante da cadeia pesada do anticorpo pode ser selecionado consequentemente. O domínio constante da cadeia leve pode ser um domínio constante capa ou lambda. Além disso, a proteína de ligação de antígeno pode compreender modificações de todas as classes por exemplo, dímeros de IgG, mutantes de Fc que não mais ligam receptores de Fc ou medeiam a ligação de C1q. A proteína de ligação de antígeno também pode ser um anticorpo quimérico do tipo descrito na WO86/01533 que compreende uma região de ligação de antígeno e uma região que não de imunoglobulina.

[0067] A região constante é selecionada de acordo com qualquer funcionalidade requerida por exemplo, uma IgG1 pode demonstrar capacidade lítica através da ligação ao complemento e/ou mediará ADCC (citotoxicidade de célula dependente de anticorpo).

[0068] As proteínas que ligam antígeno da presente invenção são derivadas do anticorpo de murino que tem as regiões variáveis como descritas na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou equivalentes que não de murino das mesmas, tais como de rato, ser humano, variantes quiméricas ou humanizadas da mesma, por exemplo elas são derivadas do anticorpo que tem as sequências variáveis da cadeia pesada como descritas na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29 e/ou as sequências variáveis da cadeia leve como descritas na SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 e/ou SEQ ID NO: 35.

[0069] Em uma outra forma de realização as proteínas que ligam antígeno da presente invenção são derivadas de um anticorpo que tem as sequências variáveis da cadeia pesada como descritas na SEQ ID NO: 116 ou SEQ ID NO: 118 e/ou as sequências variáveis da cadeia leve como descritas na SEQ ID NO: 120, ou SEQ ID NO: 122.

[0070] Em uma outra forma de realização as proteínas que ligam antígeno da presente invenção são derivadas de um anticorpo que tem as sequências variáveis da cadeia pesada como descritas na SEQ ID NO: 140 e/ou as sequências variáveis da cadeia leve como descritas na SEQ ID NO: 144.

[0071] Em um aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende um domínio variável de cadeia pesada isolado selecionado a partir de qualquer uma das que seguem: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 116 ou SEQ ID NO: 118.

[0072] Em um outro aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve isolado selecionado a partir de qualquer uma das que seguem: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 122.

[0073] Em um outro aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende um domínio variável de cadeia pesada isolado selecionado a partir de qualquer uma das que seguem: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29 e um domínio variável de cadeia leve isolado selecionado a partir de qualquer uma das que seguem: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 e/ou SEQ ID NO: 35.

[0074] Em um aspecto a proteína de ligação de antígeno da presente invenção compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 23 e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 31.

[0075] Em um aspecto a proteína de ligação de antígeno da presente invenção compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 27 e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 31. Em um aspecto a proteína de ligação de antígeno da presente invenção compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 29 e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 31.

[0076] Em um aspecto a proteína de ligação de antígeno da presente invenção compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 116 e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 120

[0077] Em um aspecto a proteína de ligação de antígeno da presente invenção compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 118 e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 122

[0078] Em um aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24, ou SEQ ID NO: 26, ou SEQ ID NO: 28, ou SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 141.

[0079] Em um aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 121 ou SEQ ID NO: 123 ou SEQ ID NO: 145.

[0080] Em um outro aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 24, ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 30 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 34.

[0081] Ainda em um outro aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 24 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 32.

[0082] Ainda em um outro aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 117 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 121.

[0083] Ainda em um outro aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 119 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 123.

[0084] Ainda em um outro aspecto é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 141 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve variável isolada o dito polinucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 145.

[0085] Em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno pode compreender qualquer uma das cadeias pesadas variáveis como aqui descritas em combinação com qualquer uma das cadeias leves como aqui descritas.

[0086] Em um aspecto a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreendem uma ou mais CDR’s de acordo com a invenção aqui descritas, ou um ou ambos dos domínios variáveis da cadeia pesada ou leve de acordo com a invenção aqui descritas. Em uma forma de realização a proteína de ligação de antígeno liga BCMA de primata. Em uma tal forma de realização a proteína de ligação de antígeno adicionalmente liga BCMA de primata não humano, por exemplo BCMA de macaco cinomolgo.

[0087] Em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno é selecionada do grupo que consiste de um dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, minianticorpo, e um minicorpo,.

[0088] Em um aspecto da presente invenção a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo humanizado ou quimérico, em um outro aspecto o anticorpo é humanizado.

[0089] Em um aspecto o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[0090] Em um aspecto da presente invenção é fornecido um anticorpo com a sequência da cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 61.

[0091] Em um aspecto da presente invenção é fornecido um anticorpo com a sequência da cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 63 ou SEQ ID NO: 65.

[0092] Em um outro aspecto da invenção é fornecido um anticorpo com a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 55 e uma sequência da cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 63.

[0093] Em uma forma de realização é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compete com uma proteína de ligação de antígeno da invenção como aqui descrita. Em uma tal forma de realização é portanto fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compete com uma proteína de ligação de antígeno que compreende a sequência variável da cadeia pesada da SEQ ID NO 23 e a região variável da cadeia leve da SEQ ID NO 31.

[0094] Em uma outra forma de realização é portanto fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compete com uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma sequência variável da cadeia pesada selecionada de uma das SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 116, SEQ ID NO 118 e SEQ ID NO 140 e uma região variável da cadeia leve selecionada de uma das SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 120, SEQ ID NO 122 e SEQ ID NO 144.

[0095] Em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno se liga a BCMA humano com alta afinidade por exemplo quando medido por Biacore a proteína de ligação de antígeno se liga a BCMA humano com uma afinidade de 20 nM ou menos ou uma afinidade de 15 nM ou menos ou uma afinidade de 5 nM ou menos ou uma afinidade de 1000 pM ou menos ou uma afinidade de 500 pM ou menos ou uma afinidade de 400 pM ou menos, ou 300 pM ou menos ou por exemplo de cerca de 120 pM. Em uma outra forma de realização a proteína de ligação de antígeno se liga a BCMA humano quando medido por Biacore entre cerca de 100 pM e cerca de 500 pM ou entre cerca de 100 pM e cerca de 400 pM, ou entre cerca de 100 pM e cerca de 300 pM. Em uma forma de realização da presente invenção a proteína de ligação de antígeno liga BCMA com uma afinidade de menos do que 150 pM.

[0096] Em uma tal forma de realização, isto é medido por Biacore, por exemplo como apresentado no Exemplo 4.

[0097] Em um outro aspecto a proteína de ligação de antígeno se liga a BCMA humano e neutraliza a ligação dos ligandos BAFF e/ou APRIL ao receptor de BCMA em um ensaio de neutralização de célula em que a proteína de ligação de antígeno tem uma IC50 entre cerca de 1 nM e cerca de 500 nM, ou entre cerca de 1 nM e cerca de 100 nM, ou entre cerca de 1 nM e cerca de 50 nM, ou entre cerca de 1 nM e cerca de 25 nM, ou entre cerca de 5 nM e cerca de 15 nM. Em uma outra forma de realização da presente invenção a proteína de ligação de antígeno liga BCMA e neutraliza BCMA em um ensaio de neutralização de célula em que a proteína de ligação de antígeno tem uma IC50 de cerca de 10 nM.

[0098] Em uma tal forma de realização, isto é medido por um ensaio de neutralização de célula, por exemplo como apresentado no Exemplo 4.6.

[0099] As proteínas que ligam antígeno, por exemplo anticorpos da presente invenção podem ser produzidas pela transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de expressão que compreende a sequência codificadora para a proteína de ligação de antígeno da invenção. Um vetor de expressão ou plasmídeo recombinante é produzido pela colocação destas sequências codificadoras para a proteína de ligação de antígeno em associação operativa com sequências de controle reguladoras convencionais capazes de controlar a replicação e expressão em, e/ou secreção a partir de, uma célula hospedeira. As sequências reguladoras incluem sequências promotoras, por exemplo, Promotor de CMV, e sequências de sinal que podem ser derivadas de outros anticorpos conhecidos. Similarmente, um segundo vetor de expressão pode ser produzido que tem uma sequência de DNA que codifica uma proteína de ligação de antígeno complementar de cadeia leve ou pesada. Em certas formas de realização este segundo vetor de expressão é idêntico ao primeiro exceto na medida em que as sequências codificadoras e marcadores selecionados estão envolvidas, de modo a garantir tanto quanto possível que cada cadeia de polipeptídeo seja funcional\ expressada. Alternativamente, as sequências codificadoras de cadeia pesada e leve para a proteína de ligação de antígeno pode residir em um único vetor.

[00100] Uma célula hospedeira selecionada é cotransfectada pelas técnicas convencionais tanto com o primeiro quanto com o segundo vetores (ou simplesmente transfectada por um único vetor) para criar a célula hospedeira transfectada da invenção que compreende tanto a cadeias leve quanto a pesada recombinantes ou sintéticas. A célula transfectada é depois cultivada pelas técnicas convencionais para produzir a proteína de ligação de antígeno engendrada da invenção. A proteína de ligação de antígeno que inclui a associação tanto da cadeia pesada quanto da leve recombinantes é triada da cultura pelo ensaio apropriado, tal como ELISA ou RIA. Técnicas convencionais similares podem ser utilizadas para construir outras proteínas que ligam antígeno.

[00101] Os vetores adequados para as etapas de clonagem e subclonagem utilizadas nos métodos e construção das composições desta invenção podem ser selecionados por uma pessoa de habilidade na técnica. por exemplo, a série pUC convencional de vetores de clonagem pode ser usada. Um vetor, pUC19, é comercialmente disponível de firmas fornecedoras, tais como Amersham (Buckinghamshire, reino Unido) ou Pharmacia (Uppsala, Suécia). Adicionalmente, qualquer vetor que seja capaz de replicar facilmente, tem uma abundância de sítios de clonagem e genes selecionáveis (por exemplo, resistência a antibiótico), e seja facilmente manipulado pode ser usado para clonagem. Assim, a seleção do vetor de clonagem não é um fator limitante nesta invenção.

[00102] Os vetores de expressão também podem ser caracterizados pelos genes adequados para a amplificação da expressão das sequências de DNA heterólogas, por exemplo, o gene da diidrofoliato redutase de mamífero (DHFR). Outras sequências de vetor incluem uma sequência de sinal poli A, tal como do hormônio do crescimento bovino (BGH) e a sequência promotora de betaglobina (betaglopro). Os vetores de expressão úteis aqui podem ser sintetizados pelas técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados neste ramo.

[00103] Os componentes de tais vetores, por exemplo, réplicons, genes de seleção, realçadores, promotores, sequências de sinal e os semelhantes, podem ser obtidos a partir de fontes comerciais ou naturais ou sintetizados pelos procedimentos conhecidos para o uso no direcionamento da expressão e/ou secreção do produto do DNA recombinante em um hospedeiro selecionado. Outros vetores de expressão apropriados dos quais númerosos tipos são conhecidos na técnica para a expressão em mamífero, bactéria, inseto, levedura, e fungo também podem ser selecionados para este propósito.

[00104] A presente invenção também abrange uma linhagem de células transfectadas com um plasmídeo recombinante que contenha as sequências codificadoras das proteínas que ligam antígeno da presente invenção. As célula hospedeiras úteis para a clonagem e outras manipulações destes vetores de clonagem também são convencionais. Entretanto, as células de várias cepas da E. coli podem ser usadas para a replicação dos vetores de clonagem e outras etapas na construção de proteínas que ligam antígeno desta invenção.

[00105] As células hospedeiras ou linhagens de célula adequadas para a expressão das proteínas que ligam antígeno da invenção incluem células de mamífero tais como NSO, Sp2/0, CHO (por exemplo, DG44), COS, HEK, uma célula de fibroblasto (por exemplo, 3T3), e células de mieloma, por exemplo as mesmas podem ser expressadas em uma célula CHO ou uma célula de mieloma. As células humanas podem ser usadas, possibilitando assim que a molécula seja modificada com padrões de glicosilação humanos.

[00106] Alternativamente, outras linhagens de célula eucariótica podem ser utilizadas. A seleção de células hospedeiras de mamífero adequadas e métodos para a transformação, cultura, amplificação, triagem e produção e purificação de produto são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., citado acima.

[00107] As células bacterianas podem se mostrar úteis como células hospedeiras adequadas para a expressão dos Fabs recombinantes ou outras formas de realização da presente invenção (ver, por exemplo, Plückthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)). Entretanto, devido à tendência das proteínas expressadas em células bacterianas a estar em uma forma desdobrada ou inadequadamente dobrada ou em uma forma não glicosilada, qualquer Fab recombinante produzido em uma célula bacteriana teria que ser triada quanto à retenção da capacidade de ligação de antígeno. Se a molécula expressada pela célula bacteriana fosse produzida em uma forma apropriadamente dobrada, esta célula bacteriana seria um hospedeiro desejável, ou em formas de realização alternativas a molécula pode expressar no hospedeiro bacteriano e depois ser subsequentemente redobrada. por exemplo, várias cepas de E. coli usadas para a expressão são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da Biotecnologia. Várias cepas de B. Subtilis, Streptomyces, outros bacilos e os semelhantes também podem ser utilizadas neste método.

[00108] Onde desejado, células de cepas de levedura conhecidas por aqueles habilitados na técnica também estão disponíveis como células hospedeiras, assim como células de inseto, por exemplo, Drosófila e Lepidoptera e sistemas de expressão viral. Ver, por exemplo, Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) e referências aí citadas.

[00109] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, os métodos de transfecção requeridos para produzir as células hospedeiras da invenção, e métodos de cultura necessários para produzir a proteína de ligação de antígeno da invenção a partir de tal célula hospedeira podem ser todas as técnicas convencionais. Tipicamente, o método de cultura da presente invenção é um método de cultura isento de soro, usualmente pelo cultivo das células isento de soro na suspensão. Do mesmo modo, uma vez produzidas, as proteínas que ligam antígeno da invenção podem ser purificadas dos conteúdos da cultura de célula de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo a precipitação com 16eroxidi de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese em gel e os semelhantes. Tais técnicas estão dentro da habilidade da técnica e não limita esta invenção. por exemplo, preparações de anticorpos alterados são descritas na WO 99/58679 e WO 96/16990.

[00110] Já um outro método de expressão das proteínas que ligam antígeno pode utilizar a expressão em um animal transgênico, tal como descrito na Patente U.S. No. 4.873.316. Isto refere-se a um sistema de expressão que usa o promotor da caseína animal que quando transgenicamente incorporado dentro de um mamífero permite que a fêmea produza a proteína recombinante desejada no seu leite.

[00111] Em uma outra forma de realização da invenção é fornecido um método de produzir um anticorpo da invenção método este que compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor que codifica a cadeia leve e/ou pesada do anticorpo da invenção e recuperar o anticorpo produzido por meio disto.

[00112] De acordo com a presente invenção é fornecido um método de produzir um anticorpo anti-BCMA da presente invenção que se liga a e neutraliza a atividade de BCMA humano método este que compreende as etapas de: fornecer um primeiro vetor que codifica uma cadeia pesada do anticorpo; fornecer um segundo vetor que codifica uma cadeia leve do anticorpo; transformar uma célula hospedeira de mamífero (por exemplo, CHO) com o dito primeiro e segundo vetores; cultivar a célula hospedeira da etapa (c) sob condições condutivas à secreção do anticorpo a partir da dita célula hospedeira dentro do dito meio de cultura; recuperar o anticorpo secretado da etapa (d).

[00113] Uma vez expressado pelo método desejado, o anticorpo é depois examinado quanto a atividade in vitro pelo uso de um ensaio apropriado. Os formatos de ensaio de ELISA presentemente convencional são utilizados para avaliar a ligação qualitativa e quantitativa do anticorpo a BCMA. Adicionalmente, outros ensaios in vitro também podem ser usados para verificar a eficácia de neutralização antes dos estudos clínicos humanos subsequentes realizados para avaliar a persistência do anticorpo no corpo a despeito dos mecanismos de depuração usuais.

[00114] A dose e duração de tratamento refere-se à duração relativa das moléculas da presente invenção na circulação humana, e podem ser ajustadas por uma pessoa de habilidade na técnica dependendo da condição que é tratada e da saúde geral do paciente. É considerado que a dosagem repetida (por exemplo, uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas ou uma vez a cada 3 semanas) em um período de tempo prolongado (por exemplo, quatro a seis meses) pode ser requerida para se alcançar a eficácia terapêutica máxima.

[00115] Em uma forma de realização da presente invenção é fornecida uma célula hospedeira recombinante transformada, transfectada ou transduzida que compreende pelo menos um cassete de expressão, por exemplo onde o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção aqui descrita e compreende ainda um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção aqui descrita ou onde existe dois cassetes de expressão e o 1o codifica a cadeia leve e o segundo codifica a cadeia pesada. Por exemplo em uma forma de realização o primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que é ligado a uma região constante de acordo com a invenção aqui descrita e compreende ainda um segundo cassete que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que é ligado a uma região constante de acordo com a invenção aqui descrita por exemplo o primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada selecionada da SEQ ID NO: 56, ou SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62 e um segundo cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve selecionada da SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 66.

[00116] Em uma outra forma de realização da invenção é fornecida uma célula hospedeira estavelmente transformada que compreende um vetor que compreende um ou mais cassetes de expressão que codificam uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve do anticorpo que compreendem uma região constante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que é ligado a uma região constante como aqui descrita. Por exemplo tais células hospedeiras podem compreender um primeiro vetor que codifica a cadeia leve e um segundo vetor que codifica a cadeia pesada, por exemplo o primeiro vetor codifica uma cadeia pesada selecionada da SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 61 e um segundo vetor que codifica uma cadeia leve por exemplo da cadeia leve da SEQ ID NO: 63 ou SEQ ID NO: 65. Em um tal exemplo o primeiro vetor codifica uma cadeia pesada selecionada da SEQ ID NO: 55 e um segundo vetor que codifica uma cadeia leve por exemplo a cadeia leve da SEQ ID NO: 63.

[00117] Em uma outra forma de realização da presente invenção é fornecida uma célula hospedeira de acordo com a invenção aqui descrita em que a célula é eucariótica, por exemplo onde a célula é de mamífero. Os exemplos de tais linhagens de célula incluem CHO ou NSO.

[00118] Em uma outra forma de realização da presente invenção é fornecido um método para a produção de um anticorpo que compreende uma região constante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que é ligado a uma região constante de acordo com a invenção aqui descrita método este que compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira em um meio de cultura, por exemplo meio de cultura isento de soro.

[00119] Em uma outra forma de realização da presente invenção é fornecido um método de acordo com a invenção aqui descrita em que o dito anticorpo é purificado ainda até pelo menos 95 % ou maior (por exemplo, 98 % ou maior) com relação ao dito meio de cultura isento de soro que contém anticorpo.

[00120] Ainda em uma outra forma de realização é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00121] Em uma outra forma de realização da presente invenção é fornecido um kit de partes que compreende a composição de acordo com a invenção aqui descrita junto com instruções para o uso.

[00122] O modo de administração do agente terapêutico da invenção pode ser qualquer via adequada que libere o agente ao hospedeiro. As proteínas que ligam antígeno, e as composições farmacêuticas da invenção são particularmente úteis para a administração parenteral, isto é, subcutânea (s.c.), intratecal, intraperitoneal, intramuscular (i.m.) ou intravenosamente (i.v.). Em uma tal forma de realização as proteínas que ligam antígeno da presente invenção são administradas intravenosa ou subcutaneamente.

[00123] Agentes terapêuticos da invenção podem ser preparados como composições farmacêuticas que contêm uma quantidade eficaz da proteína de ligação de antígeno da invenção como um ingrediente ativo em um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização o agente profilático da invenção é uma suspensão ou solução aquosas que contêm a proteína de ligação de antígeno em uma forma pronta para injeção. Em uma forma de realização a suspensão ou solução são tamponadas no pH fisiológico. Em uma forma de realização as composições para a administração parenteral compreenderão uma solução da proteína de ligação de antígeno da invenção ou um coquetel do mesmo dissolvido em um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização o carreador é um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser utilizada, por exemplo, 0,9 % de solução salina, 0,3 % de glicina, e os semelhantes. Estas soluções podem ser feitas estéreis e no geral isentas de matéria particulada. Estas soluções podem ser esterilizadas pelas técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para se aproximar das condições fisiológicas tais como agentes de ajuste de pH e tamponizantes, etc. A concentração da proteína de ligação de antígeno da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos do que cerca de 0,5 %, usualmente a ou pelo menos cerca de 1 % a tanto quanto como cerca de 15 ou 20 % em peso e será selecionado primariamente com base nos volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.

[00124] Assim, uma composição farmacêutica da invenção para a infusão intravenosa pode ser completada até conter cerca de 250 ml de solução de Ringer estéril, e cerca de 1 a cerca de 30 ou 5 mg a cerca de 25 mg de uma proteína de ligação de antígeno da invenção por ml da solução de Ringer. Os métodos reais para preparar composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos ou estará evidente por aqueles habilitados na técnica e são descritos em mais detalhes, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia. Para a preparação das formulações de proteína de ligação de antígeno intravenosamente administráveis da invenção ver Lasmar U e Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, página 129-137, Vol. 3 (3 de abril de 2000); Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceutics”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceutical Part A and B ed Ahern T. J., Manning M. C., Nova Iorque, NY: Plenum Press (1992); Akers, M. J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K et al “Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its protein- structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 10331039; Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulation for protein peroxidise 19g19n”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922; e Ha, E Wang W, Wang Y.j. “Peroxide formation in polisorbate 80 and protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002) os conteúdos inteiros dos quais são aqui incorporados por referência e aos quais o leitor é especificamente encaminhado.

[00125] Em uma forma de realização o agente terapêutico da invenção, quando em uma preparação farmacêutica, está presente em formas de dosagem unitárias. A dose terapeuticamente eficaz apropriada será facilmente determinada por aqueles de habilidade na técnica. As doses adequadas podem ser calculadas para pacientes de acordo com seu peso, por exemplo as doses adequadas podem estar na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg, por exemplo de cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg, por exemplo de cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg ou por exemplo de cerca de 1 a cerca de 15 mg/kg, por exemplo de cerca de 10 a cerca de 15 mg/kg ou por exemplo de 1 a 5 mg/kg. Em uma forma de realização o anticorpo é dado de 1 a 5 mg/kg a cada 3 semanas. Para tratar eficazmente condições tais como Mieloma Múltiplo, SLE ou IPT em um ser humano, as doses adequadas podem estar dentro da faixa de cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg, por exemplo de cerca de 0,1 a cerca de 500 mg, por exemplo de cerca de 500 mg, por exemplo de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg, ou de cerca de 0,1 a cerca de 80 mg, ou de cerca de 0,1 a cerca de 60 mg, ou de cerca de 0,1 a cerca de 40 mg, ou por exemplo de cerca de 1 a cerca de 100 mg, ou de cerca de 1 a cerca de 50 mg, de uma proteína de ligação de antígeno desta invenção, que pode ser administrada parenteralmente, por exemplo subcutânea, intravenosa ou intramuscularmente. Tal dose, se necessário, pode ser repetida em intervalos de tempo apropriados selecionados como apropriado por um médico.

[00126] As proteínas que ligam antígeno aqui descritas podem ser liofilizadas para a armazenagem e reconstituídas em um carreador adequado antes do uso. Esta técnica foi mostrada ser eficaz com as imunoglobulinas convencionais e peroxidase conhecida na técnica e técnicas de reconstituição podem ser utilizadas.

[00127] Em um outro aspecto da invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita para o uso em uma droga.

[00128] Em um aspecto da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção como aqui descrita para o uso no tratamento de artrite reumatóide, Diabete Melito Tipo 1, Esclerose Múltipla ou psoríase em que o dito método compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.

[00129] Em uma forma de realização da presente invenção, métodos são fornecidos para tratar câncer em um ser humano que compreende a administração ao dito ser humano de uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga a BCMA. Em alguns casos a proteína de ligação de antígeno é parte de um imunoconjugado.

[00130] Em um outro aspecto da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção como aqui descrita para o uso no tratamento de uma doença mediada por célula B ou mediada por célula plasmática ou doença ou distúrbio mediados por anticorpo selecionados de Mieloma Múltiplo (MM), leucemia linfocítica crônica (CLL), Mieloma Múltiplo não secretor, Mieloma Múltiplo que Arde, gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS), plasmacitoma solitário (Osso, Extramedular), linfoma Linfoplasmacítico (LPL), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Leucemia de célula plasmática, Amiloidose Primária (AL), doença da cadeia pesada, Lupo eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de POEMS/mieloma osteosclerótico, crioglobulinemia Tipo I e II, doença da deposição da cadeia leve, síndrome de Goodpasture, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), glomerulonefrite aguda, Pênfigo e distúrbios penfigóides, e Epidermólise bolhosa adquirida; ou qualquer leucemia de célula B de Linfoma de Não Hodgkin ou linfoma de Hodgkin (HL) com expressão de BCMA ou qualquer doenças em que os pacientes desenvolvem anticorpos de neutralização para a terapia de reposição de proteína recombinante em que o dito método compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.

[00131] Os distúrbios de célula B podem ser divididos em defeitos de desenvolvimento de célula B/produção de imunoglobulina (imunodeficiências) e proliferação excessiva/descontrolada (linfomas, leucemias). Como aqui usado, distúrbio de célula B refere-se a ambos os tipos de doenças, e métodos são fornecidos para tratar os distúrbios de célula B com uma proteína de ligação de antígeno.

[00132] Em um aspecto particular, a doença ou distúrbio são selecionados do grupo que consiste de Mieloma Múltiplo (MM), Leucemia Linfocítica Crônica (CLL), Plasmacitoma Solitário (Osso, Extramedular), Macroglobulinemia de Waldenstrom.

[00133] Em um aspecto da presente invenção a doença é Mieloma Múltiplo, Mieloma Múltiplo que Arde (SMM) ou Plasmacitoma Solitário (Osso, Extramedular).

[00134] Em um aspecto da presente invenção a doença é Mieloma Múltiplo.

[00135] Em um aspecto da presente invenção a doença é Lupo eritematoso sistêmico (SLE)

[00136] Em um aspecto da presente invenção a doença é Púrpura trombocitopênica idiopática (ITP)

[00137] O uso da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita na fabricação de uma droga para o tratamento de doenças e distúrbios como aqui descritos também é fornecido.

[00138] Por exemplo em um aspecto da invenção é fornecido o uso da proteína de ligação de antígeno como aqui descrito para o uso no tratamento ou profilaxia de doenças e distúrbios responsivos à modulação (tal como inibição ou bloqueio) da interação entre BCMA e os ligandos BAFF e APRIL.

[00139] Em um outro aspecto da invenção é fornecido o uso da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita para o uso no tratamento ou profilaxia de uma doença mediada por anticorpo ou mediada por célula plasmática ou distúrbio selecionado de artrite reumatóide, Diabete Melito Tipo 1, Esclerose Múltipla ou psoríase.

[00140] Em um outro aspecto da invenção é fornecido o uso da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita para o uso no tratamento ou profilaxia de uma doença mediada por anticorpo ou mediada por célula plasmática ou distúrbio selecionado de Mieloma Múltiplo (MM), leucemia linfocítica crônica (CLL), gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS), Mieloma Múltiplo que Arde (SMM), Plasmacitoma Solitário (Osso, Extramedular), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Amiloidose Primária (AL), Doença da cadeia pesada, Lupo eritematoso sistêmico (SLE), Síndrome de POEMS/mieloma osteosclerótico, crioglobulinemia Tipo I e II, doença da deposição da cadeia leve, síndrome de Goodpasture, Púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Glomerulonefrite Aguda, Pênfigo e distúrbios penfigóides e Epidermólise bolhosa adquirida, qualquer Linfoma de Não Hodgkin e Leucemia com expressão de BCMA ou qualquer doença em que os pacientes desenvolvem anticorpos neutralizantes para a terapia de reposição de proteína recombinante em que o dito método compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.

[00141] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno da presente invenção ou um fragmento funcional do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável para o tratamento ou profilaxia de artrite reumatóide, Diabete Melito Tipo 1, Esclerose Múltipla ou psoríase ou uma doença mediada por anticorpo ou mediada por célula plasmática ou distúrbio selecionado de Mieloma Múltiplo (MM), leucemia linfocítica crônica (CLL), Gamopatia Monoclonal de significância indeterminada (MGUS), Mieloma Múltiplo que Arde (SMM), Plasmacitoma Solitário (Osso, Extramedular), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Amiloidose Primária (AL), Doença de cadeia pesada, Lupo eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de POEMS/mieloma osteosclerótico, crioglobulinemia Tipo I e II, doença de deposição da cadeia leve, síndrome de Goodpasture, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Glomerulonefrite aguda, Pênfigo e Distúrbios penfigóides e Epidermólise bolhosa adquirida, qualquer Linfoga Não Hodgkin e Leucemia com expressão de BCMA ou qualquer doença em que os pacientes desenvolvem anticorpos neutralizantes para a terapia de reposição da proteína recombinante em que o dito método compreende a etapa de administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.

[00142] Em uma outra forma de realização da presente invenção é fornecido um método de tratar um paciente humano afligido com artrite reumatóide, Diabete Melito Tipo 1, Esclerose Múltipla ou psoríase ou um distúrbio ou doença mediados por anticorpo ou mediados por célula plasmática método este que compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção como aqui descrita, por exemplo é fornecido um método de tratar um paciente humano afligido com um doença mediada por anticorpo ou mediada por célula plasmática ou distúrbio selecionado de Em um outro aspecto da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção como aqui descrita para o uso no tratamento de uma doença mediada por anticorpo ou mediada por célula plasmática ou distúrbio selecionados de Mieloma Múltiplo (MM), Leucemia Linfocítica Crônica (CLL), Gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS), Mieloma Múltiplo que Arde (SMM), Plasmacitoma Solitário (Osso, Extramedular), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Amiloidose Primária (AL), Doença de cadeia pesada, Lupo eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de POEMS/mieloma osteosclerótica, crioglobulinemia Tipo I e II, doença da deposição da cadeia leve, síndrome de Goodpasture, Púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Glomerulonefrite aguda, Pênfigo e Distúrbios penfigóides e Epidermólise bolhosa adquirida, qualquer Linfoma de Não Hodgkin e Leucemia com expressão de BCMA ou qualquer doença em que os pacientes desenvolvem anticorpos neutralizantes para a terapia de reposição da proteína recombinante em que o dito método compreende a etapa de administrar uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção aqui em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00143] Em uma outra forma de realização é fornecido um método de tratar um paciente humano afligido com Mieloma Múltiplo (MM).

[00144] Definições

[00145] Como aqui usado, os termos “câncer”, “neoplasma”, e “tumor” são usados intercambiavelmente e, na forma singular ou plural, referem-se às células que sofreram uma transformação maligna que as tornam patológicas para o organismo hospedeiro. As células cancerosas primárias podem ser facilmente distinguidas das células não cancerosas pelas técnicas bem estabelecidas, particularmente exame histológica. A definição de uma célula cancerosa, como aqui usada, inclui não apenas uma célula cancerosa primária, mas qualquer célula derivada de uma célula cancerosa ancestral. Isto inclui células cancerosas metastatizadas, e culturas in vitro e linhagens de célula derivadas de células cancerosas. Quando da alusão a um tipo de câncer que normalmente se manifesta como um tumor sólido, um tumor “clinicamente detectável” é um que é detectável com base na massa de tumor; por exemplo, pelos procedimentos tais como varredura de tomografia computadorizada (CT), formação de imagem pela ressonância magnética (MRI), raio X, ultrassom ou apalpação no exame físico, e/ou que é detectável por causa da expressão de um ou mais antígenos específicos do câncer em um amostra obtenível de um paciente. Os tumores podem ser um câncer hematopoiético (ou hematológico ou envolvido com o sangue ou relacionado com o sangue), por exemplo, cânceres derivados de células sanguíneas ou células imunes, que podem ser aludidos como “tumores líquidos”. Os exemplos específicos de condições clínicas com base nos tumores hematológicos incluem leucemias tais como leucemia mielocítica crônica, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crônica e leucemia linfocítica aguda; malignidades da célula plasmática tais como Mieloma Múltiplo, MGUS e macroglobulinemia de Waldenstrom; linfomas tais como linfoma de Não Hodgkin, Linfoma de Hodgkin; e os semelhantes.

[00146] O câncer pode ser qualquer câncer em que um número anormal de células Blast ou proliferação de célula indesejada está presente ou que é diagnosticado como um câncer hematológico, que inclui malignidades tanto linfóide quanto mielóide. As malignidades mielóides incluem, mas não são limitadas a, leucemia mielóide aguda (ou mielocítica ou mielógena ou mieloblástica) (não diferenciada ou diferenciada), leucemia promielóide aguda (ou promielocítica ou promielógena ou promieloblástica), leucemia mielomonocítica aguda (ou mielomonoblástica), leucemia monocítica aguda (ou monoblástica), eritroleucemia e leucemia megacariocítica (ou megacarioblástica). Estas leucemias podem ser aludidas juntas como leucemia mielóide aguda (ou mielocítica ou mielógena) (AML). As malignidades mielóides também incluem distúrbios mieloproliferativos (MPD) que incluem, mas não são limitados a, leucemia mielógena (ou mielóide) crônica (CML), leucemia mielomonocítica crônica (CMML), trombocitemia essencial (ou trombocitose), e policitemia verdadeira (PCV). As malignidades mielóides também incluem mielodisplasia (ou síndrome mielodisplástica ou MDS), que pode ser aludida como anemia refratária (RA), anemia refratária com blastos em excesso (RAEB), e anemia refratária com blastos em excesso em transformação (RAEBT); assim como mielofibrose (MFS) com ou sem metaplasia mielóide agnogênica.

[00147] Os cânceres hematopoiéticos também incluem malignidades linfóides, que podem afetar os linfônodos, baços, medula óssea, sangue periférico, e/ou sítios extranodais. Os cânceres linfóides incluem malignidades de célula B, que incluem, mas não são limitados a, linfoma de célula B de Não Hodgkins (B-NHLs). BNHLs podem ser indolentes (ou grau baixo), grau intermediário (ou agressivo) ou grau alto (muito agressivo). Os linfomas de célula B indolentes incluem linfoma folicular (FL); linfoma linfocítico pequeno (SLL); linfoma de zona marginal (MZL) que inclui MZL nodal, MZL extranodal, MZL esplênico e MZL esplênico com linfócitos vilosos; linfoma linfoplasmacítico (LPL); e linfoma de tecido linfóide associado com a mucosa (MALT ou zona marginal extranodal). BNHLs de grau intermediário incluem linfoma de célula do manto (MCL) com ou sem envolvimento leucêmico, linfoma de célula grande difusa (DLBCL), linfoma de célula grande folicular (ou grau 3 ou grau 3B), e linfoma mediastinal primário (PML). B-NHLs de grau alto incluem linfoma de Burkitt (BL), linfoma igual ao de Burkitt, linfoma de célula não clivada pequena (SNCCL) e linfoma linfoblástico. Outros B-NHLs incluem linfoma imunoblástico (ou imunocitoma), linfoma de efusão primária, linfomas associados com o HIV (ou relacionados com a AIDS), e distúrbio ou linfoma linfoproliferativo pós transplante (PTLD). As malignidades de célula B também incluem, mas não são limitados a, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia de linfócito granular grande (LGL), leucemia linfóide aguda (ou linfocítica ou linfoblástica), e doença de Castleman. NHL também pode incluir linfomas de Não Hodgkin de célula T (T-NHLs), que incluem, mas não são limitados a linfoma de Não Hodgkin de célula T de outro modo não especificado (NOS), linfoma de célula T periférica (PTCL), linfoma de célula grande anaplástica (ALCL), distúrbio linfóide angioimunoblástico (AILD), célula matadora natural nasal (NK)/linfoma de célula T, linfoma gama/delta, linfoma de célula T cutâneo, micose fungóide, e síndrome de Sezary.

[00148] Os cânceres hematopoiéticos também incluem Linfoma de Hodgkin (ou doença) que inclui Linfoma de Hodgkin clássico, Linfoma de Hodgkin esclerosante nodular, Linfoma de Hodgkin de celularidade misturada, Linfoma de Hodgkin de linfócito predominante (LP), Linfoma de Hodgkin LP nodular, e Linfoma de Hodgkin esgotado de linfócito. Os cânceres hematopoiéticos também incluem doenças ou cânceres de célula plasmática tais como Mieloma Múltiplo (MM) que inclui MM que arde, gamopatia monoclonal de significância indeterminada (ou desconhecida ou incerta) (MGUS), plasmacitoma (osso, extramedular), linfoma linfoplasmacítico (LPL), Macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia de célula plasmática, e amiloidose primária (AL). Os cânceres hematopoiéticos também podem incluir outros cânceres de células hematopoiéticas adicionais, que incluem leucócitos polimorfonucleares (ou neutrófilos), basófilos, eosinófilos, células dendríticas, plaquetas, eritrócitos e células matadoras naturais. Os tecidos que incluem células hematopoiéticas aqui aludidas como “tecidos de célula hematopoiética” incluem medula óssea; sangue periférico; timo; e tecidos linfóides periféricos, tais como baço, linfônodos, tecidos linfóides associados com mucosa (tais como os tecidos linfóides associados com o intestino), amígdalas, Placas de Peyer e apêndice, e tecidos linfóides associados com outra mucosa, por exemplo, os revestimentos brônquicos.

[00149] O termo “proteína de ligação de antígeno” como aqui usado refere-se a anticorpos, fragmentos de anticorpos e outras construções de proteína que são capazes de ligar e neutralizar BCMA humano.

[00150] Os termos Fv, Fc, Fd, Fab, ou F(ab)2 são usados com seus significados padrão (ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

[00151] O termo “anticorpo” é aqui usado no sentido mais amplo e especificamente abrange anticorpos monoclonais (que inclui anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos)

[00152] O termo “anticorpo monoclonal” como aqui usado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos sendo direcionados contra um único sítio de ligação antigênica. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno.

[00153] Um “anticorpo quimérico” refere-se a um tipo de anticorpo projetado em que um porção da cadeia pesada e/ou cadeia leve é idêntica com o homólogo que corresponde às sequências em anticorpos derivados de uma classe ou subclasse de anticorpo doador particular, enquanto o remanescente das cadeias é idêntico aos homólogos que correspondem às sequências em anticorpos derivados de um outra espécie ou que pertence a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que estes apresentem a atividade biológica desejada (Patente US N° 4, 816,567 e Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855) (1984)).

[00154] Um “anticorpo humanizado” refere-se a um tipo de anticorpo projetado que tem seus derivados de CDR derivada de uma imunoglobulina de doador não humano, as partes derivadas de imunoglobulina remanescentes da molécula sendo derivada de um (ou mais) imunoglobulinas humanas. Além disso, os resíduos de suporte de estrutura podem ser alterados para preservar a afinidade de ligação (ver, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 1002910032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)). Um anticorpo receptor humano adequado pode ser um selecionado de uma base convencional de dados, por exemplo, a base de dados KABAT®, base de dados Los Alamos e base de dados Swiss Proteína, por homologia ao nucleotídeo e sequência de aminoácidos do anticorpo doador. Um anticorpo humano caracterizado por uma homologia às regiões de estrutura do anticorpo doador (em uma base de aminoácido) pode ser adequado fornecer uma região constante da cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia pesada de matriz para a inserção dos CDRs doadores. Um anticorpo receptor adequado capaz de doar constante de cadeia leve ou regiões de estrutura variável pode ser selecionado de uma maneira similar. Deve ser observado que os anticorpos de cadeia pesada e leve receptores não são requeridos para originar o mesmo anticorpo receptor. A técnica anterior descreve várias maneiras de se produzir tais anticorpos humanizados - ver por exemplo, EP-A-0239400 e EP-A-054951.

[00155] Para ácidos nucleicos, o termo “identidade substancial” indica que dois ácidos nucleicos ou sequências projetadas do mesmo, quando otimamente alinhados e comparados e, são idênticos, inserções ou anulações de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos cerca de 80 % dos nucleotídeos, pelo menos cerca de 90 % a cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 98 % a cerca de 99,5 % dos nucleotídeos. Alternativamente, identidade substancial existe quando os segmentos hibridizar-se-ão sob condições de hibridização seletivas, ao complemento do filamento. “identidade”, significa, para polinucleotídeos e polipeptídeos, como o caso pode ser, a comparação calculada usando-se o algoritmo fornecido em (1) e (2) abaixo:

[00156] (1) A identidade para os polinucleotídeos é calculada pela multiplicação do número total de nucleotídeos em uma dada sequência pelo número inteiro que define a identidade percentual dividida por 100 e depois subraindo-se aquele produto do dito número total de nucleotídeos na dito sequência, ou: nn < xn - (xn • y), em que nn é o número de alterações de nucleotídeo, xn é o número total de nucleotídeos em uma dada sequência, y é 0,95 por 95 %, 0,97 por 97 % ou 1,00 por 100 %, e • é o símbolo para o operador de multiplicação, e em que qualquer produto não inteiro de xn e y é arredondado para baixo até o número inteiro mais próximo antes de sua subtração de xn. As alterações de uma sequência de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo podem criar mutações sem sentido, sentido errado ou mudança de estrutura nesta sequência codificadora e, desse modo, altera, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo que segue tais alterações.

[00157] (2) A identidade dos polipeptídeos é calculada pela multiplicação do número total de aminoácidos pelo número inteiro que define a identidade percentual dividida por 100 e depois subtraindo-se aquele produto do dito número total de aminoácidos, ou: na < xa - (xa • y), em que na é o número de aminoácido alterações, xa é o número total de aminoácidos na sequência, y é 0,95 por 95 %, 0,97 por 97 % ou 1,00 por 100 %, e • é o símbolo para o operador de multiplicação e em que qualquer produto não inteiro de xa e y é arredondado para baixo ao número inteiro mais próximo antes de sua subtração de xa.

[00158] Para a sequência de nucleotídeo e aminoácidos, o termo “idêntica” indica o grau de identidade entre dois ácidos nucleicos ou sequências de aminoácido quando otimamente alinhados e comparados com inserções ou anulações apropriadas.

[00159] “Isolado” significa alterado “pela mão do homem” de seu estado natural, foi mudado ou removido de seu ambiente natural ou ambos. por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um organismo vivente não é “isolado”, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separados dos materiais coexistentes de seu estado natural é “isolado”, que inclui mas não limita-se a quando tais polinucleotídeos ou polipeptídeos são introduzidos novamente em uma célula, mesmo se a célula for da mesma espécie ou tipo como aquele do qual o polinucleotídeo ou polipeptídeo foi separado.

[00160] Através do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, o termo “que compreende” e “compreende” incorpora “que consiste de” e “consiste de”. Isto é, estas palavras são pretendidas transmitir a inclusão possível de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, onde o contexto permite.

[00161] O termo “liga-se especificamente” como usado através do presente relatório descritivo em relação às proteínas que ligam antígeno da invenção significa que a proteína de ligação de antígeno liga BCMA humano (hBCMA) sem nenhuma ligação ou ligação insignificante a outras proteínas humanas. O termo, entretanto, não exclui o fato que proteínas que ligam o antígeno da invenção também pode ser reativos com outras formas de BCMA, por exemplo, BCMA de primata. Por exemplo, em uma forma de realização a proteína de ligação de antígeno não se liga à TACI ou BAFF-R.

[00162] O termo “inibe” como usado através do presente relatório descritivo em relação às proteínas que ligam antígeno da invenção significa que a atividade biológica de BCMA é reduzida na presença das proteínas que ligam antígeno da presente invenção em comparação com a atividade de BCMA na ausência de tais proteínas que ligam antígeno. A inibição pode ser devida, mas não limitada a um ou mais de ligação do ligando de bloqueio, evitam que o ligando ative o receptor e/ou regule o BCMA. A inibição também pode referir-se a uma proteína de ligação de antígeno ao BCMA e que causa a apoptose de célula ou ADCC. Os anticorpos da invenção podem neutralizar a atividade dos ligandos de BCMA BAFF e/ou ligação de APRIL a BCMA. Os níveis de neutralização podem ser medidos de várias maneiras, por exemplo, pelo uso dos ensaios como apresentados nos exemplos abaixo, por exemplo, em 4,4 em um ensaio de sinalização de NFkB de célula H929. Os ligandos BCMA BAFF e APRIL são capazes de induzir a sinalização de NFkB e os eventos a jusante que seguem ligação ao BCMA. A neutralização de BCMA neste ensaio é medido pela estimativa da capacidade de anticorpos monoclonais de anticorpos anti-BCMA para inibir a indução de NFkB conduzida por BAFF ou APRIL.

[00163] Se um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é capaz de neutralização depois que este é indicativo de inibição da interação entre BAFF ou APRIL e BCMA humanos. Os anticorpos que são considerados ter atividade neutralizadora contra BCMA humano deve ter um IC50 menor do que 30 microgramas/ml ou menor do que 20 microgramas/ml, ou menos do que 10 microgramas/ml ou menos do que 5 microgramas/ml ou menos do que 1 microgramas/ml ou menos do que 0,1 microgramas/ml no ensaio de estímulo de H929 como apresentado no Exemplo 4,4

[00164] Os “CDRs” são definidos como a região determinadora de sequências de aminoácido de complementaridade de um anticorpo que são os domínios hipervariáveis de cadeias de imunoglobulina de cadeias leves e pesadas. Existem CDRs de três cadeias pesadas e três cadeias leves (ou regiões de CDR regiões) na porção variável de uma imunoglobulina. Desta maneira, os “CDRs” como aqui usado pode referir-se a todos os três CDRs de cadeia pesada ou todos os três CDRs de cadeia leve (ou tanto todos os CDRS de cadeia pesada e todos de cadeia leve, se apropriado).

[00165] Os CDRs fornecem a maioria de resíduos e contato para a ligação do anticorpo ao antígeno ou epítopo. Os CDRs de interesse nesta invenção são derivados de sequências de anticorpo variável doador de cadeia pesada e leve e incluem análogos dos CDRs de ocorrência natural, cujos análogos também dividem ou retêm a mesma especificidade e antígeno de ligação e/ou capacidade de neutralização como o anticorpo doador do qual estes foram derivados.

[00166] As sequências do anticorpo de CDRs podem ser determinadas pelo sistema de numeração de Kabat (Kabat et al; (Sequências de proteínas de interesse imunológico NIH, 1987), alternativamente estes podem ser determinados usando-se o sistema de numeração de Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), o método de definição de contato (MacCallum R.M., e Martem um.C.R. e Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) ou qualquer outro método estabelecido para a numeração dos resíduos em um anticorpo e determinação dos CDRs conhecidos à pessoa habilitada na técnica

[00167] Outras convenções de numeração para sequências de CDR disponíveis para uma pessoa habilitada na técnica incluem métodos “AbM” (University de Bath) e “contato” (University College London). A região de sobreposição mínima usando-se pelo menos dois dos métodos de Kabat, Chothia, AbM e contato podem ser determinados para fornecer a “unidade de ligação mínima”. A unidade de ligação mínima pode ser uma subporção de um CDR.

[00168] A Tabela A abaixo representa uma definição usando-se cada convenção de numeração para cada CDR ou unidade de ligação. O esquema de numeração de é usado na Tabela X para a numeração do domínio de sequência de aminoácido variável. Deve ser observado que algumas das definições de CDR podem variar dependendo da publicação individual usada. Tabela A

[00169] Através deste relatório descritivo, os resíduos de aminoácido nas sequências de anticorpo são numeradas de acordo com o esquema de Kabat. similarmente, os termos “CDR”, “CDRL1”, “CDRL2”, “CDRL3”, “CDRH1”, “CDRH2”, “CDRH3” seguem o sistema de numeração de Kabat como apresentado em Kabat et al; Sequences of proteins of Imunological Interest NIH, 1987.

[00170] Os termos “variantes” refere-se a pelo menos uma, duas ou três faixas de aminoácido na sequência. Estas mudanças de aminoácido podem ser anulação, substituição ou adição mas são, preferivelmente, substituição. Em uma tal forma de realização as substituições são substituições conservativas.

[00171] Em uma forma de realização alternativa, a sequência variante sequência contém pelo menos uma substituição enquanto retém-se o canônico da proteína de ligação de antígeno.

[00172] As regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) L1, L2, L3, H1 e H2 tendem a apresentar estruturalmente um de um número finito de conformações de cadeia principal. A estrutura canônica particular de um CDR é definida tanto pelo comprimento do CDR quanto pelo empacotamento de arco, determinado por resíduos localizados em posições chave tanto nos CDRs quanto das regiões de estrutura (determinação estrutural de resíduos ou SDRs). Martin e Thornton (1996; J Mol Biol 263: 800-815) geraram um método automático para definir os padrões canônicos “resíduo chave”. A análise de grupo é usada para definir as classes canônicas para as séries de CDRs e os padrões canônicos são depois identificados pela análise de hidrofóbicos isolados, resíduos de ligação de hidrogênio e, por exemplo, glicinas conservadas. Os CDRs das sequências de anticorpo pode ser denominados às classes canônicas por comparação das sequências com os resíduos chave padrão e registro de cada padrão usando-se matrizes de identidade ou similaridade.

[00173] Os termos “VH” e “VL” são aqui usados para referir-se a um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve respectivamente de um anticorpo.

[00174] Como aqui usado o termo “domínio” refere-se a uma estrutura de proteína dobrada tendo estrutura terciária independente do resto da proteína. No geral, os domínios são responsáveis pelas propriedades funcionais distintas de proteínas e em muitos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos a outras proteínas sem perda de função do remanescente da proteína e/ou do domínio. Um “domínio variável de anticorpo único” é um domínio de polipeptídeo dobrado que compreendem sequências características dos domínios variáveis de anticorpo. Portanto, este inclui domínios variáveis de anticorpo completos e domínios variáveis modificados, por exemplo, em que um ou mais arcos foram substituídos pelas sequências que não são características dos domínios variáveis de anticorpo ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões de terminal N ou de terminal C, assim como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêm pelo menos a atividade de ligação e especificidade do domínio de tamanho natural.

[00175] A frase “domínio variável único de imunoglobulina” refere-se a um domínio variável de anticorpo (VH, VHH, VL) que liga-se especificamente um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio V diferente. Um domínio variável único de imunoglobulina pode estar evidente em um formato (por exemplo, homo- ou hetero-multimero) com outro, regiões variáveis ou domínios variáveis diferentes nas outras regiões ou domínios que são requeridos para a ligação de antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina único (isto é, onde o domínio variável único de imunoglobulina liga antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais). Um “domínio de anticorpo” ou “dAb” é o mesmo como um “domínio variável único de imunoglobulina” que é capaz de ligação a um antígeno como o termo é aqui usado. Um domínio variável único de imunoglobulina pode ser um domínio variável de anticorpo humano, mas também incluem únicos domínios variáveis de anticorpo de outras espécies, tais como roedor (por exemplo, como descrito no WO 00/29004), VHH dAbs de tubarão lixa e Camelídeo. VHH de camelídeo são polipeptídeos de imunoglobulina de domínio variável simples que são derivados de espécies que inclui camelo, lhama, alpaca, dromedário e guanaco, que produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves. Tais domínios de VHH pode ser humanizados de acordo com técnicas padrão disponíveis na técnica e tais domínios ainda são considerados serem “anticorpos de domínio” de acordo com a invenção. Como aqui usado “VH inclui domínios de VHH de camelídeo. NARV são um outro tipo de domínio variável único de imunoglobulina que foram identificados em peixes cartilaginosos que incluem o tubarão lixa. Estes domínios também são conhecidos como nova região variável de receptor e antígeno (habitualmente abreviado a V(NAR) ou NARV). Para detalhes adicionais ver Mol. Imunol. 44, 656-665 (2006) e US20050043519A.

[00176] O termo “domínio de ligação de epítopo” refere-se a um domínio que liga-se especificamente um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio V diferente, este pode ser um anticorpo de domínio (dAb), por exemplo, um domínio variável simples de humano, camelídeo ou tubarão de imunoglobulina ou este pode ser um domínio que é um derivado de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de CTLA-4 (Evicorpo); lipocalina; moléculas derivadas de proteína A, tais como domínio Z de proteína A (Aficorpo, SpA), A-domínio (Avimer/Maxicorpo); proteínas de choque por calor, tais como GroEl e GroES; 29eroxidise29g (trans-corpo); proteína de repetição de ancirina (DARPin); aptâmero de peptídeo; domínio C do tipo lectina (Tetranectina); y- cristalina humana e ubiquitina humana (afilins); domínios PDZ; toxinas tipo kunitz de toxina de escorpião de inibidores de protease humana e fibronectina (adnectina); que foram submetidos ao projeto de proteína a fim de obter a ligação a um outro ligando que não o ligando natural.

[00177] CTLA-4 (antígeno 4 associado com linfócito T citotóxico) é um receptor da família de CD28 principalmente em células T de CD4+. Seu domínio extracelular tem uma dobra de Ig semelhante ao domínio variável. Os arcos correspondem aos CDRs dos anticorpos podem ser substituídos com sequência heteróloga para conferir propriedades de ligação diferentes. As moléculas de CTLA-4 projetadas para ter especificidades de ligação diferentes também são conhecidas como Evicorpos. Para detalhes adicionais ver Journal of Imunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)

[00178] As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam moléculas hidrofóbicas pequenas, tais como esteróides, bilinas, retinóides e lipídeos. Estes têm uma estrutura secundária de 8 lâminas rígida com diversos arcos na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser projetada para ligar-se a antígenos alvos diferentes. As anticalinas estão entre 160 e 180 aminoácidos de tamanho e são derivadas de lipocalinas. Para detalhes adicionais ver Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 e US20070224633.

[00179] Um aficorpo é uma estrutura derivada de Proteína A de Staphilococcus aureus que pode ser projetada para ligar-se ao antígeno. O domínio consiste de um feixe de três hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. As bibliotecas foram geradas por aleatorização de resíduos de superfície. Para detalhes adicionais ver Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) e EP1641818A1

[00180] Os avímeros são proteínas de multidomínio derivados da família de estrutura de domínio A. Os domínios naturais de aproximadamente 35 aminoácidos adotam uma estrutura ligada por bissulfeto definida. A diversidade é gerada pela mudança da variação apresentada pela família de domínios A. Para detalhes adicionais ver Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) e Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909917 (Junho de 2007)

[00181] Uma transferrina é uma glicoproteína de transporte de soro monomérico. As transferrinas podem ser projetadas para a ligação aos antígenos alvo diferentes pela inserção de sequências de peptídeo em um arco de superfície permissivo. Os exemplos de estruturas de transferrinas projetadas incluem o Trans-corpo. Para detalhes adicionais, ver J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).

[00182] As proteínas de repetição de ancirinas planejadas (DARPins) são derivadas de Ancirina que é uma família de proteínas que mediam a ligação de proteínas de membrana integral ao citoesqueleto. Uma repetição de ancirina única é um motivo de 33 resíduos que consiste de duas a-hélices e uma volta β. Stes podem ser projetados para a ligação de antígenos alvos diferentes pela aleatorização de resíduos na primeira a-hélice e uma volta β de cada repetição. Sua interface de ligação pode ser aumentada pelo aumento do número de módulos (um método de maturação por afinidade). Para detalhes adicionais, ver J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) e J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US20040132028A1.

[00183] A fibronectina é uma estrutura que pode ser projetada para serem ligadas a um antígeno. As adnectinas consistem de uma cadeia principal da sequência de aminoácido natural do 10° domínio das 15 unidades de repetição de fibronectina humana tipo III (FN3). Três arcos em uma extremidade de e-sanduíche podem ser projetados para permitir que uma adnectina para reconhecer especificamente um alvo terapêutico de interesse. Para detalhes adicionais, ver Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, W02005056764 e US6818418B1.

[00184] Os aptâmeros de peptídeo são moléculas de reconhecimento combinatórias que consistem de uma proteína de estrutura constante, tipicamente tiorredoxina (TrxA) que contém um arco de peptídeo variável restrito inserido no local ativo. Para detalhes adicionais, ver Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).

[00185] Os microcorpos são derivadas de microproteínas de ocorrência natural de 25 a 50 aminoácidos de comprimento que contêm 3 a 4 pontes de cisteína - exemplos de microproteínas incluem KalataB1 e conotoxina e knotinas. As microproteínas têm um arco que pode ser projetado para incluir atpe 25 aminoácidos sem afetar a dobra total da microproteína. Para detalhes adicionais de domínios de knotina projetados, ver WO2008098796.

[00186] Outros domínios de ligação de epítopo incluem proteínas que foram usados como uma estrutura para projetar propriedades de ligação de antígeno alvo diferente incluem y-cristalina humana e ubiquitina humana e ubiquitina humana (afilinas), domínios tipo kunitz de inibidores da protease humana, domínios de PDZ da proteína de ligação de Ras AF-6, toxinas de escorpião (caribdotoxina), domínio C do tipo lectina (tetranectinas) são revistas no Capítulo 7 - Non-Antibodies Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, editado por Stefan Dubel) e Protein Science 15: 14-27 (2006). Os domínios de ligação de epítopo da presente invenção podem ser derivados de qualquer um destes domínios de proteína alternativos.

[00187] Como aqui usado, o termo “sítio de ligação de antígeno” refere-se a um sítio on uma proteína que é capaz de ligar-se especificamente ao antígeno, este pode ser um único domínio, por exemplo, um domínio de ligação de epítopo ou este pode ser domínios de VH/VL em pares como pode ser observado em um anticorpo padrão. Em algumas formas de realização da invenção da cadeia única os domínios Fv (ScFv) podem fornecer sítios de ligação de antígeno.

[00188] Os termos “mAbdAb” e dAbmAb” são aqui usados para referir-se a proteínas que ligam antígeno da presente invenção. Os dois termos podem ser usado intercambiavelmente, e são pretendido ter o mesmo significado como aqui usado.

[00189] O termo “proteína de ligação de antígeno” como aqui usado refere-se a anticorpos, fragmentos de anticorpos por exemplo, um domínio de anticorpo (dAb), ScFv, Fab, Fab2, e outros construtos de proteína. As moléculas de ligação de antígeno podem compreender pelo menos um domínio variável de Ig, por exemplo, anticorpos, domínio anticorpos (dAbs), Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, ScFv, diacorpos, mAbdAbs, aficorpos, anticorpos heteroconjugados ou anticorpos biespecíficos. Em uma forma de realização, a molécula de antígeno de ligação é um anticorpo. Em uma outra forma de realização, a molécula de antígeno de ligação é um dAb, isto é, um domínio variável único de imunoglobulina tal como um VH, VHH ou VL que liga-se especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio V diferentes. As moléculas de ligação de antígeno ligação podem ser capazes de ligação a dois alvos, isto é, estas podem ser proteínas de alvejamento duplas. As moléculas de antígeno de ligação podem ser um combinação dos anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno, tal como por exemplo, um ou mais anticorpos de domínio e/ou um ou mais ScFvs ligados a um anticorpo monoclonal. As moléculas de ligação de antígeno ligação também podem compreender um domínio que não de Ig, por exemplo, um domínio que é um derivado de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de CTLA-4 (Evicorpo); lipocalina; moléculas derivadas de proteína A, tal como domínio Z de Proteína A (Aficorpo, SpA), domínio A (Avímero/Maxicorpo); Proteínas de choque por calor tais como GroEl e GroES; 31eroxidise31g (trans-corpo); proteína de repetição de ancirina (DARPin); aptâmero de peptídeo; domínio C do tipo lectina (Tetranectin); y- crystalina humana e ubiquitina humana (afilinas); domínios de PDZ; domínios tipo kunitz de toxina de escorpião de inibidores de protease humana e fibronectina (adnectina); que foram submetidos ao projeto de proteína a fim de obter a ligação a OSM. Como aqui usado “proteína de ligação de antígeno” será capaz de antagonizar e/ou neutralizar OSM humano. Além disso, uma proteína de ligação de antígeno pode inibem e/ou bloqueiam a atividade de OSM pela ligação a OSM e prevenir um ligando natural de ligação e/ou ativar o receptor de gp130.

[00190] O termo “Efeito ou Função” como aqui usado é entendido referir-se a uma ou mais de atividade citotóxica de célula dependente de anticorpo (ADCC), respostas mediadas citotóxicas de atividade dependente de complemento (CDC), fagocitose mediada por Fc e reciclagem de anticorpo por intermédio do receptor de FcRn. Para anticorpos de IgG, o efeito ou as funcionalidades que incluem ADCC e ADCP são mediadas pela interação da região constante da cadeia pesada com uma familia de receptores de Fcy presentes na superfície de células imunes. Em seres humanos, estes incluem FcyR1 (CD64), FcyR11 (CD32) e FcyR111 (CD16). A interação entre a proteína de ligação de antígeno ligado ao antígeno e a formação do complexo de Fc/Fcy induz uma faixa de efeitos que incluem citotoxicidade, ativação de célula imune, fagocitose e liberação e citocinas inflamatórias.

[00191] Acredita-se que a interação entre a região constante de uma proteína de ligação de antígeno e vários receptores de Fc (FcR) medir o efeito ou funções da proteína de ligação de antígeno. Os efeitos biológicos significantes podem ser uma consequência de efeito ou funcionalidade, em particular, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fixação de complemento (citotoxicidade dependente de complemento ou CDC), e vida média/liberação da proteína de ligação de antígeno. Usualmente, a capacidade para mediar o efeito ou função requer a ligação da proteína de ligação de antígeno ao um antígeno e não todas as proteínas que ligam o antígeno mediarão cada efeito ou função.

[00192] Efeito ou função podem ser medidos de diversas maneiras que incluem, por exemplo, por intermédio da ligação do FcyR111 a células matadoras naturais ou por intermédio de FcyR1 a monócitos/macrófagos para medição quanto à função atuadora de ADCC. por exemplo, um proteína de ligação de antígeno da presente invenção pode ser estimada quanto à função efetora de ADCC em um ensaio de célula matadora natural. Os exemplos de tais ensaios podem ser observados em Shields et al, 2001 The Journal de Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal de Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.

[00193] Os exemplos de ensaios para determinar a função de CDC incluem aqueles descritos em 1995 J Imm Meth 184: 29-38.

[00194] Alguns isotipos de regiões constantes humanas, em particular isotipos IgG4 e IgG2, precisam essencialmente as funções de a) ativação do complemento pelo caminho clássico; e b) citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Várias modificações à região constante da cadeia pesada de proteínas que ligam antígeno podem ser realizadas dependendo do efeito ou propriedade desejada. As constantes de região de IgG1 que contenham mutações específicas foram separadamente descritas para reduzir a ligação aos receptores de Fc e, portanto, reduzem ADCC e CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Imunol. 1991, 147; 26572662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton e Woof, Adv. Imunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Imunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168).

[00195] Em uma forma de realização da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante tais que a proteína de ligação de antígeno tem reduzida ADCC e/ou ativação de complemento ou funcionalidade. Em uma tal forma de realização a região constante da cadeia pesada pode compreender uma região constante naturalmente inválida de isotipo de IgG2 ou IgG4 ou uma região constante de IgG1 mutado. Os exemplos de modificações adequadas em EP0307434. Um exemplo compreende as substituições de resíduos de alanina em posições de 235 e 237 (numeração do índice EU).

[00196] As constantes de região de IgG1 humano contendo mutações específicas ou glicosilação alterada no resíduo Asn297 foram descritos para realçar a ligação aos receptores de Fc. Em alguns casos, as mutações também foram mostradas para realçar ADCC e CDC (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 40054010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Imunol, 2007, 44; 1815-1817).

[00197] Em uma forma de realização da presente invenção, tais mutações estão, em uma ou mais de posições selecionadas de 239, 332 e 330 (IgG1) ou as posições equivalentes em outros isotipos IgG. Os exemplos de mutações adequadas são S239D e 1332E e A330L. Em uma forma de realização, a proteína de ligação de antígeno da invenção aqui descrita é mutada nas posições 239 e 332, por exemplo, S239D e 1332E ou em uma outra forma de realização é mutada em três ou mais posições selecionadas de 239 e 332 e 330, por exemplo, S239D e 1332E e A330L. (número do índice EU).

[00198] Em uma forma de realização alternativa da presente invenção, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante da cadeia pesada com um perfil de glicosilação alterado tal que a proteína de ligação de antígeno tem função atuadora realçada. Por exemplo, em que a proteína de ligação de antígeno tem ADCC realçada ou CDC realçada ou em que este tem tanto efeito quanto função de ADCC e CDC realçados. Os exemplos de metodologias adequadas para a produção de proteínas que ligam o antígeno com um perfil de glicosilação alterado são descritas em WO2003011878, WO2006014679 e EP1229125, todos os quais podem ser aplicados como proteínas que ligam o antígeno da presente invenção.

[00199] A presente invenção também fornece um método para a produção de uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção que compreendem as etapas de: a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão que compreendem o ácido nucleico isolado como aqui descrito, em que o gene FUT8 que codifica alfa-1,6- fucosiltransferase foi inativada na célula hospedeira recombinante; e b) recuperar a proteína de ligação de antígeno.

[00200] Tais métodos para a produção de proteínas que ligam antígeno podem ser realizados, por exemplo, usando-se o sistema de tecnologia de POTELLIGENTTM disponível da BioWa, Inc. (Princeton, NJ) em que as células CHOK1SV que precisam de uma cópia funcional do gene FUT8 produzem anticorpos monoclonais que tem atividade citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo realçada (ADCC) que é aumentada com relação a um anticorpo monoclonal idêntico produzido em uma célula com um gene FUT8 funcional. Os aspectos do sistema de tecnologia POTELLIGENTTM sistema são descritos em US7214775, US6946292, W00061739 e W00231240 todos os quais são incorporados aqui por referência. Aquela pessoa habilitada na técnica também reconhecerá outros sistemas apropriados.

[00201] Em uma forma de realização da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante quimérica da cadeia pesada, por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante quimérica da cadeia pesada com pelo menos um domínio CH2 de IgG3 tais que a proteína de ligação de antígeno tem função efetora realçada, por exemplo, em que tem ADCC realçada ou CDC realçada, ou funções ADCC e CDC realçada. Em uma tal forma de realização, a proteína de ligação de antígeno pode compreender um domínio CH2 de IgG3 ou ambos os domínios CH2 podem ser de IgG3.

[00202] Também fornecido é um método de produzir uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção que compreende as etapas de: a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico isolado como aqui descrito em que o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio Fc que tem tanto os resíduos do aminoácido do domínio IgG1 quanto IgG3 Fc; e b) recuperar a proteína de ligação de antígeno.

[00203] Tais métodos para a produção de proteínas que ligam antígeno podem ser realizados, por exemplo, usando o sistema de tecnologia COMPLEGENTTM disponível de BioWa, Inc. (Princeton, NJ) e Kyowa Hakko Kogyo (agora, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd. Em que uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão em que uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio Fc quimérico que tem tanto os resíduos do aminoácido do domínio IgG1 quanto IgG3 Fc é expressado para produzir uma proteína de ligação de antígeno que tem atividade da citotoxicidade dependente de complemento realçado (CDC) que é aumentada relativa a uma proteína de ligação de antígeno idêntica de outra maneira que carece um tal domínio Fc quimérico. Os aspectos do sistema de tecnologia COMPLEGENTTM são descritos no W02007011041 e U520070148165 cada um de que são incorporados aqui por referência. Em uma forma de realização alternativa a atividade de CDC pode ser aumentada para introduzir as mutações da sequência específica na região Fc de uma cadeia IgG. Aquela pessoa habilitada na técnica também reconhecerá outros sistemas apropriados.

[00204] É evidente para aqueles habilitados na técnica que tais modificações não podem apenas estar sozinhos, mas podem ser usados em combinação com cada outro a fim de intensificar a função efetiva adicional.

[00205] Em uma tal forma de realização da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante da cadeia pesada que compreende uma região constante quimérica e mutada da cadeia pesada por exemplo, em que uma proteína de ligação de antígeno que compreende pelo menos um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH2 de IgG1, em que o domínio IgG1 CH2 tem uma ou mais mutações nas posições selecionadas de 239 e 332 e 330 (por exemplo, as mutações podem ser selecionadas de 5239D e 1332E e A330L) tais que a proteína de ligação de antígeno tem função efetora realçada, por exemplo, em que tem uma ou mais das seguintes funções, ADCC realçada ou CDC realçada, por exemplo, em que tem ADCC realçada e CDC realçada. Em uma forma de realização o domínio IgG1 CH2 tem as mutações 5239D e 1332E.

[00206] Em uma forma de realização alternativa da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região quimérica constante da cadeia pesada e que tem um perfil de glicosilação alterado. Em uma tal forma de realização a região constante da cadeia pesada compreende pelo menos um domínio CH2 de IgG3 e um domínio CH2 de IgG1 e tem um perfil de glicosilação alterado tais que a razão de fucose a manose é 0,8: 3 ou menos, por exemplo, em que a proteína de ligação de antígeno é desfucosilada de modo que a dita proteína de ligação de antígeno tem uma função efetora realçada em comparação com um equivalente da proteína de ligação de antígeno com uma região constante de imunoglobulina da cadeia pesada que carece as ditas mutações e perfil de glicosilação alterado, por exemplo, em que tem uma ou mais das seguintes funções, ADCC realçada ou CDC realçada, por exemplo, em que tem ADCC realçada e CDC realçada. Em uma forma de realização alternativa a proteína de ligação de antígeno tem pelo menos um domínio IgG3 CH2 e pelo menos um domínio constante da cadeia pesada de IgG1 em que tantos os domínios IgG CH2 são mutados de acordo com as limitações aqui descritas.

[00207] Em um aspecto da invenção é fornecido um método de produzir uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção aqui descrita que compreende as etapas de: a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que contenha um vetor de expressão que contenha um ácido nucleico isolado como aqui descrito, o dito vetor de expressão ainda que compreende uma sequência de ácido nucleico Fc que codifica um domínio Fc quimérico que tem tantos os resíduos de aminoácidos dos domínios IgG1 quanto IgG3 Fc, e em que o gene FUT8 que codifica alfa-1,6-fucosiltransferase foi inativada na célula hospedeira recombinante; e b) Recuperar uma proteína de ligação de antígeno

[00208] Tais métodos para a produção de proteínas que ligam antígeno podem ser realizados, por exemplo, usando o sistema de tecnologia ACCRETAMABTM disponível de BioWa, Inc. (Princeton, NJ) que combina os sistemas de tecnologia POTELLIGENTTM e COMPLEGENTTM para produzir uma proteína de ligação de antígeno que tem atividade tanto ADCC quanto CDC realçada que é aumentada relativa a um anticorpo monoclonal idêntico de outra maneira que carece um domínio Fc quimérico e que tem fucose no oligossacarídeo.

[00209] Ainda em uma outra forma de realização da presente invenção é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma região constante mutada e quimérica da cadeia pesada em que a dita proteína de ligação de antígeno tem um perfil de glicosilação alterado tais que a proteína de ligação de antígeno tem função efetora realçada, por exemplo, em que tem uma ou mais das seguintes funções, ADCC realçada ou CDC realçada. Em uma forma de realização as mutações são selecionadas a partir das posições 239 e 332 e 330, por exemplo, as mutações são selecionadas de S239D e 1332E e A330L. Em uma outra forma de realização a região constante da cadeia pesada compreende pelo menos um domínio CH2 de IgG3 e um domínio Ch2 de IgG1. Em uma forma de realização a região constante da cadeia pesada tem um perfil de glicosilação alterado tal que a razão de fucose a manose é 0,8: 3 ou menos por exemplo, a proteína de ligação de antígeno é desfucosilada, de modo que a dita proteína de ligação de antígeno tem uma função efetora realçada em comparação com uma proteína de ligação de antígeno não quimérica equivalente ou com uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina que carece as ditas mutações e perfil de glicosilação alterado. Imunoconjugados

[00210] Também fornecida é um imunoconjugado (intercambiavelmente aludida como “anticorpo-conjugado de droga”, ou “ADCs”) que compreende uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a invenção como aqui descrita que inclui, mas não limitado a, um anticorpo conjugado a um ou mais agente citotóxicos, tal como um agente quimioterapêutico, uma droga, um inibidor de desenvolvimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina de proteína, uma toxina enzimaticamente ativa de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana, ou fragmentos do mesmo), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

[00211] Os imunoconjugados foram usados pela liberação local dos agentes citotóxicos, isto é, drogas que matam ou inibem o desenvolvimento ou proliferação das células, no tratamento de câncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3: 207-212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 151-172; Pat. U.S. N°. 4.975.278). Os imunoconjugados permitem para a liberação alvejada de uma porção de droga a um tumor, e acúmulo intracelular neste, onde administração sistemática das drogas não conjugadas podem resultar nos níveis inaceitáveis de toxicidade as células normais assim como as células de tumor procuram ser eliminadas (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological E Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Tantos os anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais foram relacionados como úteis nestas estratégias (Rowland et al., (1986) Cancer Imunol. Imunother. 21: 183-87). As drogas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et al., (1986) supra). As toxinas usadas nos conjugados de toxina de anticorpo incluem toxinas bacterianas tal como toxina de difteria, toxinas vegetais tal como ricina, toxinas de molécula menor tal como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugado Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hi nMan et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342).

[00212] Em uma forma de realização, a presente invenção inclui imunoconjugados que tem a seguinte estrutura geral: ABP - ((Ligante)n - Ctx)m

[00213] Em que ABP é uma proteína de ligação de antígeno O ligante está ausente ou qualquer um ligante clivável ou não clivável aqui descrito Ctx é qualquer agente citotóxico aqui descrito n é 0, 1, 2, ou 3 e m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[00214] Os exemplos dos anticorpos ligados por um ligante MC com auristatinas tal como MMAE e MMAF são descritos nas seguintes estruturas:

[00215] Em certas formas de realização, um imunoconjugado compreende uma proteína de ligação de antígeno, que inclui mas não limitado a, um anticorpo e um agente quimioterapêutico ou outra toxina. Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração dos imunoconjugados são aqui descritos. As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos do mesmo que podem ser usados incluem difteria de cadeia A, fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, exotoxia de cadeia A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de arroz, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de Outubro de 1993. Uma variedade de radionuclídeos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 211A1 212Bi 131I 131I 90Y 186R , , , na, , e e.

[00216] As proteínas que ligam antígeno da presente invenção também podem ser conjugadas a uma ou mais toxinas, que incluem, mas não limitado a, um caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas, um tricoteceno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que tem a atividade de toxina. Os agentes citotóxicos adequados incluem, mas não são limitados a, uma auristatina que inclui dovalina-valina-dolaisoleunina-dolaproine- fenilalanina (MMAF) e monometil auristatina E (MMAE) assim como formas de éster de MMAE, um agente de ligação de ranhura menor DNA, um agente de alquilação de ranhura menor de DNA, um enediino, um lexitropsina, uma duocarmicina, um taxano, que inclui paclitaxel e docetaxel, uma puromicina, uma dolastatina, um maitansinóide, e um alcanóide vinca. Os agentes citotóxicos específicos incluem topotecan, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatin-10, equinomicina, combretatstatina, chaliqueamicina, maitansina, DM-1, DM-4, netropsina. Os agentes citotóxicos adequados incluem agentes anti-tubulina, tal como um auristatina, um alcanóide vinca, um podofilotoxina, um taxano, um derivado de bacatina, um criptofisina, um maitansinóide, um combretastatina, ou um dolastatina. O agente de antitubulina inclui dimetilvalina-valinadolaisoleuina-dolaproina- fenilalanina-p-fenileno-diamina (AFP), MMAF, MMAE, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, paclitaxel, docetaxel, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colquicinas, colcimid, estramustina, cemadotina, discodermolida, maitansina, DM-1, DM- 4 ou eleuterobina.

[00217] Os conjugados de droga de anticorpo foram produzidos pela conjugação do agente anti-tubulina de molécula menor de monometilauristatina E (MMAE) ou monometilauristatina F (MMAF) aos anticorpos. No caso de MMAE o ligante consiste de uma maleimida reativa de tiol, um espaçador de caproila, a valinacitrulina de dipeptídeo, e p- aminobenziloxicarbonila, um grupo de fragmento imolativo próprio. No caso de MMAF um ligante de maleimidocaproila resistente de protease é usado. O processo de conjugação leva a heterogeneidade na ligação do anticorpo de droga, variando em ambos os números de drogas ligadas em cada anticorpo molécula (razão em mol [MR]), e o sítio da ligação. As espécies mais prevalentes é o material com um MR = 4; menos prevalentes são materiais com MR de 0, 2, 6, e 8. A droga-a-anticorpo médio total MR é aproximadamente 4. Produção de Imunoconjugados

[00218] Os pontos de ligação são cisteínas produzidos pela redução branda dos bissulfetos de intercadeia do anticorpo que é realizado enquanto os anticorpos são imobilizados na resina de afinidade de proteína G (deste modo capaz de usar os excessos reagentes amplos sem purificações intermediárias). Enquanto imobilizado, um excesso amplo de TCEP totalmente reduzirá os bissulfetos de intercadeia mas não tem impacto na ligação do anticorpo à resina.

[00219] O número de tióis por anticorpo gerado por este procedimento depende da fonte e isótipo dos anticorpos. Por exemplo, IgG1s humanos (e camundongo-humano quimérico) tem 4 bissulfetos reduzíveis, e deste modo geram 8 tióis na redução total, ao passo que IgG1s de murino tem 5 bissulfetos redutíveis e produzem 10 tióis. Se ADCs com o carregamento da droga máximo (por exemplo, 10 drogas por anticorpo pelos IgG1s de murino) são desejados, depois o maleimido-droga-aglutinante pode ser simplesmente adicionado aos anticorpos imobilizados no excesso suficiente para garantir a conjugação completa. Entretanto, ADCs com poucas drogas por anticorpo também pode ser preparado a partir dos anticorpos totalmente reduzidos pelo qual incluem um agente de revestimento biologicamente inerte tal como maleimida de N-etila (NEM) que ocupa alguns dos tióis disponíveis no anticorpo. Quando o maleimido-droga-ligante e o agente de revestimento são adicionados simultaneamente ao anticorpo totalmente reduzido e no excesso amplo (pelo menos 3 vezes), os dois eletrófilos de maleimida competem pelo número limitante dos tióis disponíveis. Nesta maneira, o carregamento de droga é determinado pelas taxas de reação de tiol relativo da droga-ligante e agente de revestimento, e deste modo pode ser considerado estar sob controle cinético. A taxas de reação relativa de maleimido-droga-ligantes variam significantemente, e deste modo a razão molar da droga-ligante a NEM presente em uma mistura de reação deve ser determinada empiricamente para atingir em um painel de ADCs com um nível desejado do carregamento de droga. A fração em mol dos ligantes de droga SGD-1006 (vcMMAE) e SGD- 1269 (mcMMAF) nas misturas NEM que produzem ADCs com aproximadamente 4 drogas pelo anticorpo são resumidos na Tabela 2 pelos isótipos IgG humanos e murinos comuns. Auristatinas e Dolastatinas

[00220] Em algumas formas de realização, o imunoconjugado compreende uma proteína de ligação de antígeno ou anticorpo conjugado análogo e derivados peptídicos de dolastatinas ou dolostatinas, as auristatinas (Patente U.S. N°. 5.635.483; 5.780.588). As dolastatinas e auristatinas foram mostrados interferir com dinâmicos de microtúbulo, hidrólise GTP, e celular divisão e nuclear (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents e Chemother. 45(12): 3580-3584) e tem anticâncer (Pat. U.S. N°. 5.663.149) e atividade antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961- 2965). A porção de droga de dolastatina ou auristatina (que são derivados de pentapeptídeo de dolastatinas) pode ser ligada ao anticorpo através do terminal N (amino) ou o terminal C (carboxila) da porção de droga peptídico (WO 02/088172).

[00221] As formas de realização de auristatinas exemplares incluem as porções de droga de monometilauristatina ligadas pelo terminal N DE e DF, descrita em “Monometilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, Patente U.S. N°. 7.498.298, a descrição de que é expressadamente incorporada por referência em sua totalidade. Como aqui usado, a abbreviação “MMAE” refere-se a monometil auristatina E. Como aqui usado a abreviação “MMAF” refere-se a dovalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina.

[00222] Tipicamente, porções de droga com base em peptídeo podem ser preparadas pela formação de uma ligação de peptídeo entre dois ou mais fragmentos de aminoácidos e/ou peptídeos. Tais ligações de peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (ver E. Schroder e K. Lubke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeo. As porções de droga de auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: Pat. U.S. N°. 5.635.483; Pat. U.S. N°. 5.780.588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Câncer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G. R., et al. Síntese, 1996, 719-725; e Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863. Ver também Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; “Monometilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, Patente U.S. N°. 7.498.298, depositado em 5 de Novembro de 2004, incorporado neste por referência em sua totalidade (descrito, por exemplo, ligantes e métodos de preparar compostos de monometilvalina tal como conjugadas a ligantes de MMAE e MMAF). Os compostos orgânicos biologicamente ativos que atuam como agentes citotóxicos, especificamente pentapeptídeos, são descritos na Patente U.S. N°. 6.884.869; 7.498.298; 7.098.308; 7.256.257; e 7.423.116. Os anticorpos monoclonais ligados com MMAE adn MMAF assim como vários derivados de auristatinas e métodos de fabricação destes são descritos na Patente U.S. N°. 7.964.566.

[00223] Exemplos de auristatinas incluem MMAE e MMAF as estruturas de que são mostradas abaixo:

Maitansina e Maitansinóides

[00224] As maitansinóides são inibidores mitotóticos que atuam pela inibição da polimerização de tubulina. A maitansina foi primeiro isolada a partir do arbusto fabricado ocidental Maytenus serrata (Pat. U.S. N°. 3.896.111). Subsequentemente, foi recuperado que certos micróbios também produzem maitansinóides, tal como maitansinol e ésteres de C-3 Maitansinol (Pat. U.S. N°. 4.151.042). As drogas de drogas maitansinóide altamente citotóxicas podem ser preparadas a partir dos precursores de ansamitocina produzidos pela fermentação dos microrganismos tal como Actinosynnema. Os métodos para isolamento de ansamitocinas são descritos na Patente U.S. N°. 6.573.074. O Maitansinol sintético e derivados e análogos do mesmo são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N°. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.

[00225] Os conjugados de anticorpo-Maitansinóide são preparados pela ligação quimicamente de um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem significantemente diminuir a atividade biológica do anticorpo ou a molécula de maitansinóide. Ver, por exemplo, Pat. U.S. N°. 5.208.020. Uma média de moléculas de 3-4 Maitansinóide conjugadas pela molécula de anticorpo tem mostrado eficácia na intensificação da citotoxicidade das células alvo sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora ainda uma molécula de toxina/anticorpo deve ser esperada para realçar citotoxicidade no uso do anticorpo nu. Os maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados pelas técnicas conhecidas ou isoladas a partir das fontes naturais. Os maitansinóides adequados são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N°. 5.208.020 e as outras Patentes e Publicações de não Patentes refere-se a anteriormente mencionada. Os maitansinóides são análogos de maitansinol e maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como vários ésteres de maitansinol. Os métodos para preparar matansinóides pela ligação com anticorpos são descritos na Patente U.S. N°. 6.570.024 e 6.884.874. Caliqueamicina

[00226] A família de caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA filamentados duplos nas concentrações subpicomolares. Para a preparação dos conjugados da família de caliqueamicina, ver Patente U.S. N°. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todos em American Cyanamid Company). Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, .gama,1l, .alfa,21, .alfa,31, N- acetil-.gama,11, PSAG e .teta.l1 (Hi nMan et al., Cancer Research 53: 3336- 3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) e as Patentes U.S. anteriormente mencionadas a American Cyanamid). Uma outra droga antitumor que o anticorpo pode ser conjugada é QFA que é um antifolato. Tanto caliqueamicina e quanto QFA tem os sítios intracelulares de ação e não prontamente cruzam a membrana de plasma. Portanto, a absorção celular destes agentes através do anticorpo mediado pela internalização realça muito seus efeitos citotóxicos. Outros agentes citotóxicos

[00227] Outros agentes antitumores que podem ser conjugados aos anticorpos incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracila, a família dos agentes conhecidos coletivamente pelo complexo LL-E33288 descrito na Patente U.S. N°. 5.053.394, 5.770.710, assim como esperamicinas (Pat. U.S. N°. 5.877.296).

[00228] As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos do mesmo que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação da toxina de difteria, exotoxia de cadeia A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de arroz, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americanas (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de Outubro de 1993.

[00229] A presente invenção ainda considera um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com a atividade nucleolítica (por exemplo, um ribonuclease ou um endonuclease de DNA tal como um desoxiribonuclease; DNase).

[00230] Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo relativamente radioativo. Uma variedade dos isótopos radioativos é disponível para a produção de anticorpos de radioconjugados. Exemplos incluem At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado pela deteção, este pode compreender um átomo radioativo pelos estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou 1123, ou um rótulo de rotação pela formação de imagem de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[00231] Os rótulos radio- ou outros podem ser incorporados no conjugado nas maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biosintetizado ou pode ser sintetizado pela síntese de aminoácido química usando os precursores de aminoácido adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em lugar de hidrogênio. Os rótulos tal como tc99m ou 1123, Re186, Re188 e 1n111 pode ser ligados via um cysteine resíduo in the peptídeo. Yttrium-90 podem ser ligados por intermédio de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. “Monoclonal Antibodies in Imunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes. Preparação de ADCs

[00232] Nas drogas conjugadas pelo anticorpo, o anticorpo pode ser conjugado diretamente ao agente citotóxico ou por intermédio de um ligante. Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não cliváveis. Um ligante clivável é tipicamente susceptível para clivar sob as condições intracelulares. Os ligantes cliváveis adequados incluem, por exemplo, um peptídeo ligante clivável por uma protease intracelular, tal como protease lisossomal ou uma protease endossomal. Nas formas de realização exemplares, o ligante pode ser um ligante de dipeptídeo, tal como um valina- citrulina (val-cit) ou um ligante de fenilalanina-lisina (phe-lys). Outros ligantes adequados incluem ligantes hidrolisáveis em um pH de menos do que 5,5, tal como um ligante de hidrazona. Os ligantes cliváveis adequados adicionais incluem ligantes de bissulfeto.

[00233] Bristol-Myers Squibb tem descrito drogas de conjugado clivável de enzima lisossomal particular. Ver, por exemplo, Pat. U.S. N°. 6.214.345. Seattle Genetics tem Pedido publicados nos Pedidos de Patente U.S. 2003/0096743 e Pedidos de Patente U.S. 2003/0130189, que describe p- aminobenziléteres nos agentes de liberação de droga. Os ligantes descritos nestas aplicações são limitados às composições do éter aminobenzílico.

[00234] Os conjugados da proteína de ligação de antígeno e agente citotóxico pode ser feito usando uma variedade dos agentes de ligação de proteína bifuncional tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetila NCI), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6- diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenzeno).

[00235] Adicionalmente o ligante pode ser composto de um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplares incluem 6- maleimidocaproil (“MC”), maleimidopropanoil (“MP”), valina-citrulina (“valcit”), alanina-fenilalanina (“ala-phe”), p-aminobenziloxicarbonila (“PAB”), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-Succinimidila (“SPP”), 4-(N- maleimidometil)cicloexano-1 carboxilato de N-Succinimidila (“SMCC”), e (4-iodo-acetil)aminobenzoato de N-Succinimidila (“STAB”). Componentes ligantes adicionais são conhecidos na técnica e alguns são aqui descritos. Ver também “Monometilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, Patente U.S. N°. US 7.498.298, depositado em 5 de Novembro de 2004, os conteúdos de que são portanto incorporados por referência em sua totalidade.

[00236] Os ligantes também podem compreender aminoácidos e/ou análogos de aminoácidos. Os componentes ligantes de aminoácidos incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Os dipeptídeos exemplares incluem: valina-citruline (vc ou val-cit), alanina- fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina- citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Os resíduos de aminoácidos compreendem um componente ligante de aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, assim como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos de ocorrência não natural, tal como citrulina. Os componentes ligantes de aminoácidos podem ser planejados e otimizados em sua seletividade pela clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada por tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.

[00237] As proteínas que ligam antígeno e anticorpos podem ser feitas reativas pela conjugação com reagentes ligantes. Os grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não são limitados a: (i) grupos amina de terminal N, (ii) grupos amina de cadeia secundária, por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia secundária, por exemplo, cisteína, e (iv) grupos amino ou hidroxil de açúcar onde o anticorpo é glicosilado. Grupos amina, tiol, e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar as ligações covalentes com grupos eletrofílicos nas porções ligantes e reagentes ligantes que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tal como grupos haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila, e maleimida. Certos anticorpos têm bissulfetos de intercadeia redutíveis, isto é, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser feitos reativos pela conjugação com reagentes ligantes pelo tratamento com um agente de redução tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína deste modo formará, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente Traut) resultando na conversão de um amina em um tiol. Os grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) pela introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparar anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos de aminoácidos de cisteína não naturais).

[00238] As proteínas que ligam antígeno e anticorpos também podem ser modificadas para introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou droga. Os açúcares dos anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com periodato oxidizando os reagentes, para formar grupos de aldeído ou cetona que podem reagir no grupo amina dos reagentes ligantes ou porções de drogas. Os grupos base Schiff imina resultantes podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, por exemplo, pelos reagentes de boroidreto para formar as ligações de amina estável. Em uma forma de realização, reação da porção de carboidrato de um anticorpo glicosilado com glactose oxidase ou meta- periodato de sódio pode produzir grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que pode reagir com os grupos apropriados na droga (Hermanson, Bioconjugado Técnicas). Em uma outra forma de realização, proteínas que contenha resíduos de serina ou treonina de terminal N podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugado Chem. 3: 138-146; Pat. U.S. N°. 5.362.852). Tais aldeídos podem ser reagidos com uma porção de droga ou nucleófilo ligante.

[00239] Os grupos nucleofílicos em uma porção de droga incluem, mas não são limitados a: grupos amina, tiol, hidroxil, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e arilidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nas porções ligantes e reagentes ligantes que incluem: (i) ésteres ativos tal como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tal como haloacetamidas; (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila, e maleimida.

[00240] Em algumas formas de realização, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro um lisossomo ou endossomo ou caveolea). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima de protease, que inclui, mas não limitado a, uma protease lisossomal ou endossomal. Tipicamente, o ligante de peptidila é pelo menos dois aminoácidos longos ou pelo menos três aminoácidos longos. Os agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, todos de que são conhecidos para hidrolisar os derivados da droga de dipeptídeo resultando na liberação da droga ativa dentro das células alvo (ver, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). Os ligantes de peptidila podem ser clivável pelas enzimas que estão presentes nas células, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivável pela protease catepsina-B dependente de tiol, que é altamente expressada no tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligante Phe-Leu ou um Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID N°: 50)). Outro tais ligantes são descritos, por exemplo, na Pat. U.S. N°. 6.214.345. Nas formas de realização específicas, o ligante de peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit ou um ligante Phe- Lys (ver, por exemplo, Pat. U.S. N°. 6.214.345, que descreve a síntese de doxorubicina com o ligante val-cit). Uma vantagem do uso da liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugados e as estabilidades de soro dos conjugados são tipicamente altos.

[00241] Nas outras formas de realização, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível a hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o ligante hidrolisável sensível ao pH sob condições ácidas, por exemplo, um ligante instável ácido que é hidrolisável no lisossomo (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítico, ortoéster, acetal, cetal, ou outros) pode ser usado. (Ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653- 14661.) Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tal como aqueles no sangue, nas são instáveis abaixo do pH 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossomo. Em certas formas de realização, o ligante hidrolisável é um ligante tioéter (tal como, por exemplo, um tioéter ligado ao agente terapêutico por intermédio uma ligação acilidrazona (ver, por exemplo, Pat. U.S. N°. 5.622.929)).

[00242] Ainda em outras formas de realização, o ligante é clivável sob condições redutoras (por exemplo, um ligante de bissulfeto). Uma variedade de ligantes de bissulfeto é conhecida na técnica, que inclui, por exemplo, aquelas que podem ser formadas usando SATA (N-succinimidil-5- acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil- oxicarbonil-alfametil-alfa-(2-piridil-dithio)tolueno)- , SPDB e SMPT (Ver, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Câncer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immuoconjugates: Conjugates Antibody in Radioimagery e Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver também Pat. U.S. N°. 4,880,935.)

[00243] Ainda em outras formas de realização específicas, o ligante é um ligante de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), um ligante de maleimidobenzoila (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304), ou um análogo de 3’-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med- Chem. 3(10): 1305-12).

[00244] Tipicamente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como aqui usado, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular”, no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20 %, tipicamente não mais do que cerca de 15 %, mais tipicamente não mais do que cerca de 10 %, e ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 5 %, não mais do que cerca de 3 %, ou não mais do que cerca de 1 % dos ligantes, em um amostra de ADC ou derivado ADC, são clivados quando o ADC ou derivado ADC presente em um ambiente extracelular (por exemplo, em plasma). Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, pela incubação independente com plasma tanto (A) o ADC quanto derivado ADC (a “amostra ADC”) e (b) uma quantidade molar igual de anticorpo não conjugados ou agente terapêutico (a “amostra de controle”) por um período de tempo pré-determinado (por exemplo, 2, 4, 8, 16, ou 24 horas) e depois comparando uma quantidade de anticorpo não conjugado ou agente terapêutico presente na amostra ADC com aquele presente na amostra de controle, como medido, por exemplo, pela cromatografia líquida de desempenho alto.

[00245] Em outras formas de realização não mutualmente exclusivas, o ligante promove a internalização celular. Em certas formas de realização, o ligante promove a internalização celular quando conjugada ao agente terapêutico (isto é, no ambiente da porção do ligante-agente terapêutico de ADC ou derivado ADC como aqui descrito). Ainda em outras formas de realização, o ligante promove a internalização celular quando conjugados tanto pelo agente terapêutico quanto pela proteína de ligação de antígeno ou anticorpo ou derivado do mesmo (isto é, no ambiente de ADC ou derivado ADC como aqui descrito).

[00246] Uma variedade de ligantes que pode ser usada com as presentes composições e métodos são descritas no WO 2004010957 intitulado “Drug Conjugates e Their Use for treating Cancer, An Autoimmune disease or an Infectious disease” depositado em 31 de Julho de 2003, e Pedido Provisório U.S. N°. 60/400,403, intitulado “Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease”, depositado em 31 de Julho de 2002 (a descrição de que é incorporado por referência aqui).

[00247] Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende a proteína de ligação de antígeno e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, pelas técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. O comprimento de DNA pode compreender regiões respectivas que codifica dois porções do conjugado adjacente a um outro ou separado por uma região que codifica um ligante peptídeo que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

[00248] Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) pela utilização no pré- alvejamento do tumor em que o conjugado do anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado pela circulação usando um agente de clarificação e depois administração de um “ligando” (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

[00249] O termo “Anticorpo não humano ou fragmento de anticorpo do mesmo” como aqui usado significa referir-se aos anticorpos ou fragmentos do mesmo que originam-se de quaisquer espécies outros do que humanos em que humano inclui os anticorpos quiméricos.

[00250] O termo “anticorpo doador” refere-se a um anticorpo (monoclonal, e/ou recombinante) que contribui a sequência de aminoácidos de seus domínios variáveis, CDRs, ou outros fragmentos funcionais ou análogos do mesmo a um primeiro associado de imunoglobulina, de modo como para fornecer a região codificadora de imunoglobulina alterada e anticorpo alterado expressado resultante com a especificidade antigênica e neutralização da característica da atividade do anticorpo doador.

[00251] O termo “anticorpo receptor” refere-se a um anticorpo (monoclonal e/ou recombinante) heterólogo ao anticorpo doador, que contribui com todos (ou qualquer porção, mas preferivelmente todos) da sequência de aminoácidos que codifica suas regiões de estrutura de cadeia pesada e/ou cadeia leve e/ou suas regiões constantes da cadeia leve e/ou pesada ao primeiro associado a imunoglobulina. O anticorpo humano é o anticorpo receptor. O termo “sequência receptora humana” como aqui usado significa referir-se a uma estrutura de um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo que compreende a sequência de aminoácido de uma estrutura VH ou VL derivada de um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo do mesmo ou uma estrutura de sequência consenso humana nos CDR’s a partir das espécies não humanas pode ser incorporada.

[00252] O termo “incorporação” de CDR’s ou regiões hipervariáveis como aqui usado abrange qualquer meio pelos CDR’s não humanos são situados com a estrutura receptora humana. Será estimado que este pode ser obtido em várias maneiras, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácido desejado pode ser gerada pela mutação dos ácidos nucleicos que codificam a sequência de domínio variável não humano de modo que os resíduos de estrutura do mesmo são mudados aos resíduos de estrutura receptora humana, ou pela mutação do ácido nucleico que codifica a sequência de domínio variável humana de modo que os CDR’s são mudados aos resíduos não humanos, ou para sintetizar os ácidos nucleicos que codificam a sequência desejado. Em uma forma de realização a sequência final é gerada in silico.

[00253] A presente invenção agora é descrita apenas por meio do exemplo. As reivindicações anexas podem incluir uma generalização de um dos mais dos seguintes exemplos. Exemplos Exemplo 1 Geração e Seleção DE Anticorpo Monoclonal 1.1 Estratégias de Imunização

[00254] O CA8 precursor de mAb de murino anti BCMA humana foi identificado a partir de hibridomas derivados de camundongos imunizados com BCMA humana de tamanho natural. Um camundongo BALB/c foi imunizados i.p. com 25 μg de proteína recombinante (rBCMA) combinada com CFA. O camundongo foi reforçado três vezes em intervalos de um mês com 25 μg de proteína rBCMA de tamanho natural + 10 μg de emulsão estável de monofosforil lipídeo A (MPL-SE) (Corixa Corporation, Seattle, WA) e dado um reforço pré-fusão de 30 μg de proteína rBCMA i.v. 3 dias antes da fusão. Os hibridomas foram gerados e clonados usando o kit de clonagem de hibridoma ClonaCell-HY (StemCell Technologies, Vancouver, BC) ou usando um método convencional. No método convencional, as células B dos baços do animal imunizado foram fundidas com células de mieloma Sp2/0 na presença de PEG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Depois da recuperação durante a noite, as células fundidas foram plaqueadas na diluição limitante em placas de 96 reservatórios e submetidas à seleção de hipoxantina-aminopterina-timidina. Os sobrenadantes de cultura de hibridoma foram examinados quanto a presença de anticorpos anti-BCMA pelo ELISA e citometria de fluxo.

[00255] O mAb precursor de murino anti BCMA humano 5307118G03 foi identificado a partir de hibridomas derivados de camundongos SJL imunizados com a quimera BCMA humano recombinante/ TNFRSF17-Fc (R&D 193-Fc) usando o método de RIMMS (sítios múltiplos de imunização rápida). No Dia 0, 5 μg de proteína por camundongo foram emulsificados em adjuvante AS02a em 2 sítios no dorso (sobre os quadris e sobre os ombros) e subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 6 e dia 11 2,5 μg de proteína por camundongo em adjuvante RIBI foi injetado subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 14 os animais foram sacrificados. Os linfônodos e o baço foram excisados, rompidos e uma fusão de célula somática induzida por PEG1500 realizada usando uma razão 3:1 com células de mieloma de camundongo X63 AG8 653.GFP.BcI-2,11 (BioCat 112754; R17209/58). A fusão foi plaqueada em 10 x placas de 96 reservatórios e triada diretamente destas.

[00256] O mAb precursor de murino anti BCMA humano 5336105A07 foi identificado a partir de hibridomas derivados de imunizações idênticas. Os linfônodos e baço foram excisados no dia 14, rompidos, e uma eletrofusão Cytopulse foi realizada usando uma razão 1:1 com células de mieloma de camundongo X63 AG8 653.GFP.BcI-2,11 (BioCat 112754; R17209/58). A fusão foi plaqueada em omnitrays contendo meio semi sólido antes de escolher em 10 x placas de 96 reservatórios e foi triada diretamente destas 5 dias mais tarde.

[00257] Os mAbs precursores anti BCMA humano de murino S332121F02 e S332126E04 foram identificados a partir de hibridomas derivados de camundongos SJL imunizados com fusão Fc recombinante do domínio extracelular de BCMA humano (4-53) BCMA usando o método RIMMS (Imunização rápida). No Dia 0, 5 μg de proteína por camundongo foi emulsificada em adjuvante AS02a em 2 sítios no dorso (sobre os quadris e sobre os ombros) e subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 6 5 μg de proteína BCMA-Fc recombinante de cino por camundongo em adjuvante RIBI foi injetado subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 11 2,5 μg de BCMA humano recombinante-Fc e 2,5 μg de BCMA-Fc recombinante de cino por camundongo em adjuvante RIBI foi injetado subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 14 os animais foram sacrificados e as células tratadas como para S307118G03.

[00258] O mAb precursor anti BCMA humano de murino S322110D07 foi identificado a partir de hibridomas derivados de camundongos SJL imunizados com fusão Fc recombinante do domínio extracelular de BCMA humano (453) em complexo com April humano recombinante (R&D 5860- AP/CF) pré-misturado na razão molar de 1:1. Os camundongos foram imunizados i.p. com 5 μg de complexo de April/ BCMA-Fc de Cino em PBS, colocado em suspensão em adjuvante RIBI, 100 μl de dose por camundongo e reforçado 3 vezes em intervalos de 3 a 4 semanas com 2,5 μg de complexo April/BCMA-Fc de Cino em PBS, colocado em suspensão em adjuvante RIBI, 100 μl de dose por camundongo injetado por intermédio da via intraperitoneal e dado um reforço pré-fusão do mesmo imunógeno 1 dia antes da fusão e tratado como para S307118G03.

[00259] Os mAbs precursores anti BCMA humano de murino S335115G01 e 5335122F05 foram identificados a partir de hibridomas derivados de camundongos SJL imunizados com uma mistura de fusão Fc recombinante do domínio extracelular de BCMA humano (4-53) e fusão de Fc recombinante do domínio extracelular de BCMA de cino (4-52) usando o método RIMMS (Sítios múltiplos de imunização rápida). No Dia 0, 2, 5 μg de cada proteína por camundongo foram emulsificados em adjuvante AS02a e injetados em 2 sítios no dorso (sobre os quadris e sobre os ombros) e subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 6 e dia 11 2,5 μg de cada proteína por camundongo em adjuvante RIBI foram injetados subjacente aos linfônodos principais em 4 sítios na frente. No dia 14 os animais foram sacrificados. Os linfônodos e baço foram excisados, rompidos e uma eletrofusão Cytopulse foi realizada usando uma razão 1:1 com as células de mieloma de camundongo X63 AG8 653.GFP.BcI-2,11 (BioCat 112754; R17209/58). A fusão foi plaqueada dentro de omnitrays contendo meio semi sólido antes de escolher em 32 x placas de 96 reservatórios e foi triada diretamente destas 5 dias mais tarde. Exemplo 2 Humanização. 2.1 Clonagem de Regiões Variáveis de Hibridoma CA8

[00260] O RNA total foi extraído de células de hibridomas CA8, a sequência de cDNA de domínio variável pesado e leve foi depois gerada pela transcrição reversa e reação da cadeia da polimerase (RT-PCR). O iniciador avançado para RT-PCR foi uma mistura de iniciadores específicos degenerados para sequencias líder do gene da imunoglobulina de murino e o iniciador reverso foi específico para as regiões constantes de anticorpo. Iniciadores reversos específicos para IgG1, IgG2a e IgG2b foram usados neste caso visto que o isótipo foi desconhecido. Para planejar os iniciadores, alinhamentos de sequência múltipla de DNA das sequências líder dos genes VH e Vk de camundongo foram gerados. 2.2 Clonagem de CA8 quimérica

[00261] As construções de expressão de DNA que codificam o anticorpo quimérico foram preparadas de novo pela construção de oligonucleotídeos de sobreposição que inclui sítios de restrição para a clonagem em vetores de expressão de mamífero assim como uma sequência de sinal humana. Os sítios de restrição HindIII e SpeI foram introduzidos na estrutura do domínio VH que contém a sequência de sinal para a clonagem em vetores de expressão de mamífero que contêm a região constante yí humana. Os sítios de restrição HindIII e BsiWI foram introduzidos na estrutura do domínio VL que contém a sequência de sinal para a clonagem em vetores de expressão de mamífero que contêm a região constante capa humana. 2.3 Clonagem das variantes de CA8 humanizadas

[00262] As construções de expressão de DNA que codificam as variantes de anticorpo humanizadas foram preparadas de novo pela construção de oligonucleotídeos de sobreposição que inclui sítios de restrição para a clonagem em vetores de expressão de mamífero assim como uma sequência de sinal humana. Os sítios de restrição HindIII e SpeI foram introduzidos na estrutura do domínio VH que contém a sequência de sinal para a clonagem em vetores de expressão de mamífero que contém a região constante yí humana. Os sítios de restrição HindIII e BsiWI foram introduzidos na estrutura do domínio VL que contém a sequência de sinal para a clonagem no vetor de expressão de mamífero que contém a região constante capa humana. 2.4 Expressão dos anticorpos CA8 recombinantes (que inclui a quantificação de anticorpo)

[00263] Os plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesada e leve respectivamente foram transitoriamente cotransfectadas em células HEK 293 6E e expressadas em escala pequena para produzirem anticorpo. Os anticorpos foram quantificados por ELISA. As placas de ELISA foram revestidas com IgG anti ser humano (Sigma í3382) a í mg/ml e bloqueadas com solução de bloqueio (4 % de BSA em solução salina tamponada com Tris). Várias diluições dos sobrenadantes de cultura de tecido foram adicionadas e a placa foi incubada por í hora na temperatura ambiente. As diluições de um anticorpo padrão conhecido também foram adicionadas à placa. A placa foi lavada em TBST e a ligação foi detectada pela adição de um anticorpo de cadeia leve capa anti ser humano rotulado com peroxidise (Sigma A7í64) a uma diluição de í/í000 em solução de bloqueio. A placa foi incubada por í hora na temperatura ambiente antes da lavagem em TBST. A placa foi desenvolvida pela adição de substrato OPD (Sigma P9í87) e o desenvolvimento de cor interrompido pela adição de H2SO4 2 M. A absorbância foi medida a 490 nM e uma curva padrão plotada usando dados para as diluições padrão conhecidas. A curva padrão foi usada para estimar a concentração do anticorpo nos sobrenadantes de cultura de tecido. As preparações de anticorpo em escala maior foram purificadas usando proteína A e as concentrações foram medidas usando um Nanodrop (Thermo Scientific). Tabela í. Planejamento de variantes pesada e leve humanizadas da variável CA8

2.5 Produção de anticorpo desfucosilado

[00264] Para gerar anticorpos defucosilados as cadeias pesada e leve respectivamente foram cotransfectadas em células CHO DG44 MS705 BioWas e expressadas em escala para produzir anticorpo. Em resumo, 30 μg de DNA foram linearizados durante a noite com NatI, o DNA foi precipitado com etanol e redissolvido em tampão TE. A partir da cultura, 2,4 X 107 células DG44 BioWa foram obtidas e lavadas em 14 ml de PBS-sacarose aquecidos. As células foram giradas e a pelota recolocada em suspensão em 1,6 ml de PBS-sacarose. metade (0,8 ml) das células anteriormente mencionadas, colocadas em suspensão em PBS-sacarose, foram adicionadas a uma cubeta BioRad com os 30 μg de DNA linearizado (em 50 μl de tampão TE). Um GenePulser BioRad foi programado a 380 V com uma capacitância de 25 μF e a cubeta foi introduzida para a eletroporação. Os 850 μl resultantes de células electroporadas e DNA foram adicionados a (80 ml) meio SFM512 aquecido (que inclui vermelho de fenol, 2XHT (nucleosídeos), glutamax e suplemento 4 da Gibco). Finalmente, os 80 ml resultantes de suspensão de célula foram transferidos (150 μl/reservat0rio) a cada reservatório de uma das 4 X placas de 96 reservatórios. Depois de 48 horas, o meio foi trocado para isento de nucleosídeo pela remoção de modo apropriado de 130 μl de condicionado e substituindo com 150 μl de meio de seleção fresco SFM512 (que inclui vermelho de fenol e glutamax). A cada 3 a 4 dias, 130 a 150 μl de meio condicionado foi removido e substituído com meio de seleção fresco. Os reservatórios foram monitorados quanto a mudança de cor e ensaiado quanto à concentração de IgG como debatido anteriormente. 2.6 Anticorpos Adicionais - Clonagem de Regiões Variáveis de Hibridoma

[00265] O RNA total foi extraído das células de hibridoma S307118G03, S332121 F02, S332126E04, S322110D07, 5336105A07, S335115G01 e 5335122F05. A sequência de cDNA do domínio variável pesado e leve foi depois gerada pela transcrição reversa e reação dsa cadeia da polimerase (RT-PCR). O iniciador avançado para a RT-PCR foi uma mistura de iniciadores degenerados específicos para as sequencias líder do gene da imunoglobulina de murino e o iniciador reverso foi específico para as regiões constantes de anticorpo, neste caso isótipo IgG2a. Os iniciadores foram planejados com base em uma estratégia descrita por Jones e Bendig (Bio/Technology 9: 88, 1991). A RT-PCR foi realizada para ambas as sequências da região V para permitir a verificação subsequente das sequências da região V corretas. Os dados da sequência de DNA foram obtidos para os produtos da região V gerados pela RT-PCR. 2.7 Anticorpos adicionais - Clonagem das quimeras

[00266] As construções de expressão de DNA que codificam os anticorpos quiméricos foram preparadas de novo pela infusão advantage PCR cloning (Clonetech) dos produtos de PCR do gene V em vetores de expressão de mamífero. Este método de clonagem permitiu a fusão das regiões variáveis de murino às regiões constantes de cadeia H e cadeia L capa de IgG1 de ser humano. 2.8 S307118G03 - Clonagem das variantes humanizadas

[00267] A clonagem foi realizada como para o parágrafo 2.3. 2.9 S307118G03 Expressão dos anticorpos recombinantes

[00268] Os plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesada e leve relevantes (listadas na Tabela 8 abaixo) foram transitoriamente cotransfectadas em células HEK 293 6E e expressadas em escala pequena para produzir anticorpo. Os anticorpos foram purificados com Proteína A a partir dos sobrenadantes e quantificados usando o espectrofotômetro Nanodrop.

[00269] 8 abaixo) foram transitoriamente cotransfectadas em células HEK 293 6E e expressadas em escala pequena para produzir anticorpo. Os anticorpos foram purificados com Proteína A a partir dos sobrenadantes e quantificados usando o espectrofotômetro Nanodrop. Exemplo 3 Conjugação dos anticorpos para vcMMAE e mcMMAF para formar conjugados de droga de anticorpo (ADC) Tabela B Estruturas químicas de ligantes de droga

[00270] Pasta fluida da resina Gammabind Plus Protein G Sepharose (GE Healthcare) (75 μl) foi adicionada a cada reservatório de uma placa de filtro de reservatório profundo (2 ml de capacidade). Os anticorpos a serem conjugados foram agrupados pela espécie e isótipo e até 0,5 mg de cada anticorpo transferido para cada reservatório da placa. Cada anticorpo foi transferido para dois reservatórios separados para facilitar a preparação de dois conjugados, com os ligantes de droga SGD-1006 e SGD-1269. A placa de filtro foi depois agitada a 1200 RPM por 2 horas a 5°C para ligar os anticorpos à resina. A placa de filtro foi depois centrifugada a 500x g por 3 minutos para garantir deposição completa de todos os fluidos e resina para o fluido de cada reservatório.

[00271] Os anticorpos ligados foram depois reduzidos pela adição de 500 μL de TCEP 10 mM em 100 mM de KPO4, 150 mM de NaCI, pH 7, 1 mM de EDTA e agitação por 30 minutos a 22°C. A seguir da redução, a placa foi mais uma vez centrifugada para remover a solução de TCEP e subsequentemente lavada com PBS + 1 mM de EDTA, 1 ml por reservatório. A solução de lavagem foi removida pela centrifugação e o processo repetido 3 vezes por um total de 4 lavagens. Os anticorpos ligados e reduzidos foram depois conjugados usando uma mistura de NEM e ligante de droga preparada de acordo com as frações molares indicadas na Tabela 2. Tabela 2.

*também para IgG1 quimérica de murino/ser humano

[00272] Misturas separadas de NEM e ligante de droga foram assim preparadas para cada espécie/isótipo de anticorpo usando soluções de estoque de 10 mM de DMSO de SGD-1006, SGD-1269 (Ver Tabela B) e NEM. Quando misturados na razão apropriada, a concentração de maleimida total foi portanto ainda de 10 mM, e este valor foi usado para calcular o volume de solução de maleimida a ser adicionada a cada reservatório. por exemplo para uma IgG1 de murino com 5 dissulfetos redutíveis (10 tióis disponíveis quando reduzidos) 0,5 mg do anticorpo a 150 kD é 3,33 nMol que corresponde a 33,3 nMol de tiol. Um excesso de 3 vezes é portanto 100 nMol de maleimida total ou 10 μl da mistura a 10 mM do ligante de droga/NEM. Para o conjugado SGD-1269 esta mistura depois seria preparada com 5,86 μl de SGD-1269 e 4,14 μl de NEM. A mistura de maleimida depois seria diluída em 500 μl de PBS antes da adição ao anticorpo reduzido imobilizado. Na prática, visto que anticorpos múltiplos de cada isótipo foram conjugados simultaneamente uma única solução misturada de SGD-1269/NEM para cada isótipo foi preparada pela multiplicação do número de reservatórios que contém este isótipo por 10 μl por reservatório depois de diluir em um volume de PBS igual a 500 μl vezes o número de reservatórios. Na maneira igual um total de oito misturas de ligante de droga/NEM foram preparadas - quatro com SGD-1006 e quatro com SGD-1269 - e diluídas em PBS. Estas misturas foram depois adicionadas aos anticorpos reduzidos (500 μl por reservatório) e a placa foi agitada por 30 minutos a 22°C. A placa foi depois centrifugada como acima para remover a solução de reação em excesso, e subsequentemente lavados 4 vezes com PBS como antes.

[00273] As ADCs ligadas foram depois eluídas pela adição de 200 μl de glicina a 50 mM pH 2,5 a cada reservatório e agitando a placa por 3 minutos a 1200 RPM. Sob agitação 20 μl de tampão de neutralização (1 M de fosfato de potássio, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 0,2 % de Tween-20) foram adicionados a cada reservatório de uma placa de coleta de 1 ml. As ADCs foram depois eluídas na placa de coleta girando-se a 1500x g por 6 minutos. A placa de coleta foi depois ligeiramente agitada para garantir a mistura completa do tampão de neutralização.

[00274] A concentração de cada ADC foi depois determinada com uma leitora de placa em absorbância pela transferência das soluções em uma placa de ensaio UV (Costar modelo 3635, Corning) e medindo a densidade óptica a 280 nM. Um coeficiente de extinção de IgG média de 1,45 ml mg-1 cm-1 foi usado para fornecer uma estimativa adequada de concentração ADC através do painel. Para confirmar a conjugação bem sucedida, um método de HPLC de proteína de fase reversa (descrito abaixo) foi usado para estimar a carga de droga dos controles de isótipo. Para a placa que contém as variantes de humanização de CA8 este método foi usado para estimar a carga de todas as ADCs diretamente.

[00275] O método de cromatografia de proteína de fase reversa para determinar a carga de droga utiliza a fase estacionária polimérica de PLRPS (Agilent Technologies). Visto que os anticorpos foram totalmente reduzidos durante o processo de conjugação todas as subunidades de anticorpo eluem da coluna como cadeias de polipeptídeo únicas que permitem que as subpopulações de espécies de cadeia leve e pesada com níveis variáveis de carga de droga sejam avaliadas separadamente. Assim, a análise destes dados permite o cálculo da carga de droga de cadeia leve média e a carga de droga de cadeia pesada média como fatores independentes que podem ser depois combinadas para determinar a carga de droga de anticorpo média com o conhecimento básico que cada anticorpo é compreendido de duas cadeias leves e duas pesadas. As condições cromatográficas foram como segue: Uma coluna PRLP-S, 1000 Â, 50 x 2,1 mm, tamanho de partícula de 8 μm (Agilent Technologies) com água + 0,05 % de TFA como fase móvel A e acetonitrila + 0,01 % de TFA como fase móvel B; elução com um gradiente linear de 27 % de B a 42 % de B em 12,5 minutos.

[00276] Os anticorpos anti-BCMA foram conjugados com SGD-1006 e SGD-1269 em três lotes separados em um período de sete meses. No primeiro lote um total de 29 anticorpos foram conjugados (resultando em 58 ADCs). A carga de droga de cada controle de isótipo determinada pela cromatografia PLRP e os dados estão resumidos na Tabela 3. Tabela 3.

[00277] Para o segundo lote um adicional de 25 anticorpos foi conjugado (resultando em 50 ADCs). A carga de droga de cada controle de isótipo foi mais uma vez determinada pela cromatografia de PLRP e os dados estão resumidos na Tabela 4. Tabela 4.

[00278] No terceiro lote 30 anticorpos foram conjugados (resultando em 60 ADCs), que inclui 13 variantes humanizadas de CA8. Neste lote final, as cargas de droga de todas as ADCs foram determinadas e estão resumidas nos dois mapas de placa que seguem. (Tabela 5 & 6) Tabela 5

Tabela 6

[00279] A carga de droga média e a % CV são indicadas para cada série de isótipo no fundo. Uma variabilidade não caracteristicamente grande na carga de droga foi observada para os ADCs SGD-1269 preparados com anticorpos mIgG2b; a razão para isto é incerta. Também, os anticorpos CA8 realçados com Fc produziram níveis de carga de droga um tanto mais baixos do que as outras variantes CA8 humanas; para tratar isto, CA8 realçado com Fc adicional foi conjugado em uma reação de fase de solução para igualar melhor a carga de droga obtida para os outros anticorpos. Exemplo 4 - Dados de Ligação 4.1 Ensaio de ligação de FMAT para mostrar a ligação de CA8 Quimérico às células que expressam BCMA humana ou de cino.

[00280] As células HEK293 humanas transfectadas criopreservadas, transfectadas com BCMA de cino e simulada foram recuperadas da armazenagem LN2. Os reservatórios de ensaio foram preparados com anticorpo CA8 quimérico humano, em uma faixa de concentrações diferentes, misturados com célula HEK293 transfectadas com BCMA humana, BCMA de cino e simulado respectivamente. Conjugado secundário de IgG anti- humano FMAT Azul foi adicionado para a detecção de CA8 quimérico humano. As placas de ensaio foram deixadas por um mínimo de 90 minutos antes que o resultado fosse lido na leitora de placa AB18200 (FMAT).

[00281] Isto mostrou que o anticorpo CA8 na forma quimérica liga-se bem tanto às proteínas BCMA humanas quanto às de cino expressadas nas células HEK293.

[00282] Os resultados são mostrados na Figura 1. 4.2 Experimento de ELISA que mostra a ligação de CA8 quimérico à proteína de BCMA recombinante

[00283] Os anticorpos CA8 quiméricos foram testados quanto a ligação à BCMA humana e BCMA de cino expressado como fusões Fc. BCMA humana-Fc e BCMA de cino-Fc foram revestidas nas placas de ELISA e as placas foram bloqueadas usando BSA para reduzir a ligação não específica. Anticorpos quiméricos CA8 foram adicionados em uma faixa de concentração de 5 μg/ml a 0,1 μg/ml às placas de ELISA revestidas com BCMA humana e de cino. Qualquer anticorpo CA8 quimérico humano ligado foi detectado usando anticorpo secundário conjugado com IgG anti-humano HRP como apropriado. O substrato HRP (TMB) foi adicionado para desenvolver o ELISA. Isto mostrou que o anticorpo CA8 se liga à BCMA humana e de cino recombinante em um ensaio de ELISA.

[00284] Os resultados são mostrados na Figura 2. 4.3 Experimento Biacore para mostrar ligação de anticorpo CA8 às proteínas BCMA e TACI para determinar a reatividade cruzada com a proteína TACI.

[00285] O anticorpo quimérico CA8 foi injetado e capturado na proteína A. (Um chip sensor derivado na proteína A foi usado). A ligação da proteína A residual foi bloqueada com uma injeção de uma alta concentração de solução de IgG humana. Soluções de BCMA-Fc, TACI-Fc ou BAFF-R-Fc foram depois testadas quanto a ligação ao anticorpo. As 3 proteínas foram injetadas na sequência e eventos de ligação foram medidos. A superfície foi regenerada entre a injeção de cada proteína.

[00286] Sensogramas foram analisados no programa Biaevaluation. A subtração de dupla referência foi feita para remover o ruído do instrumento e qualquer ligação não específica das curvas do sensograma.

[00287] Isto mostrou que CA8 foi específico para ligação à ligação de BCMA e não a TACI e BAFFR.

[00288] A ligação do anticorpo CA8 a BCMA-Fc, TACI-Fc e BAFF- R-Fc foi plotada como mostrado na Figura 3. 4.4 Ligação de célula e dados de neutralização 4.4.1 Ligação de anticorpos anti BCMA de murino às células de mieloma múltiplo e células que expressam BCMA

[00289] A linhagem de célula de Mieloma Múltiplo H929 e ARH77- hBCMA 10B5 BCMA que expressa células transfectantes foram tingidas com S332211D07, S3332121F02 ou S332126E04 de murino ou controle de isótipo de murino a 5 μg/ml. A linhagem de célula de Mieloma Múltiplo H929 foi tingida com S307118G03 de murino. As células foram incubadas por 20 mins na temperatura ambiente (RT) e depois lavados com tampão FACS (PBS + 0,5 % BSA + 0,1 % de azida de sódio) para remover anticorpo não ligado. As células foram incubadas com um secundário PE labelled anti-camundongo IgG anticorpo por 15 minutos na RT e depois lavados com tampão FACS para remover o anticorpo não ligado. As células foram analisadas por FACS para detectar o anticorpo ligado às células.

[00290] Os resultados (Figura 4) mostraram que todos os 4 anticorpos de murino ligados à linhagem de célula de Mieloma Múltiplo H929 e os três anticorpos testados nas células ARH77 BCMA transfectadas ligadas a estas. 4.4.2 Curva de ligação de CA8 quimérico às células de mieloma múltiplas como determinado por FACS

[00291] Um painel de linhagem de células de Mieloma Múltiplo foi usado para determinar a ligação de CA8 quimérico. As linhagens de células H929, OPM-2, JJN-3 e U266 foram tingidas com CA8 quimérico ou anticorpo irrelevante (Synagis) nas concentrações variáveis por 20 minutos na temperatura ambiente. As células foram depois lavadas com tampão FACS (PBS + 0,5 % de BSA + 0,1 % de azida de sódio) para remover anticorpo não ligado. As células foram incubadas com um anticorpo IgG anti-humano rotulado com PE secundário por 15 minutos na temperatura ambiente e depois lavados com tampão FACS para remover o anticorpo não ligado. As células foram analisadas por FACS e os valores de intensidade de fluorescência média (MFI) medidos para determinar a ligação.

[00292] Os resultados mostraram que CA8 quimérico ligou-se às linhagens de célula de Mieloma Múltiplo H929, OPM-2, JJN-3 & U266 em uma maneira dependente da dose (Figura 5). 4.4.3 Ligação de CA8 humanizado às células BCMA transfectadas como determinado por FACS

[00293] ARH77-hBCMA 10B5 BCMA que expressa células transfectantes ou células H929 foram tingidas com CA8 quimérico ou variantes humanizadas de CA8 designadas J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2 nas concentrações variáveis por 20 minutos na temperatura ambiente. As células foram depois lavadas com tampão FACS (PBS + 0,5 % de BSA + 0,1 % de azida de sódio) para remover o anticorpo não ligado. As células foram incubadas com um anticorpo de IgG anti-humano rotulado com PE secundário por 15 minutos na temperatura ambiente e depois lavados com tampão FACS para remover o anticorpo não ligado. As células foram analisadas por FACS e os valores de intensidade de fluorescência média (MFI) medidos para determinar a ligação.

[00294] Os resultados mostraram que CA8 quimérico e todos os anticorpos testados à parte de J9M2 ligado a ARH77hBCMA 10B5 BCMA que expressa células transfectantes e células H929 em uma maneira dependente da dose (Figura 6). 4.5 Demonstração da capacidade de CA8 e a versão humanizada J6M0 para neutralizar a ligação de BAFF ou APRIL à BCMA recombinante.

[00295] O objetivo deste ensaio foi avaliar a capacidade do anticorpo CA8, e versão humanizada de J6M0 na forma tanto do tipo selvagem quanto afucosilada (Potelligent), em várias concentrações, para neutralizar a capacidade de ligação de ligando de BCMA, BAFF ou APRIL.

[00296] As placas de fundo chato de 96 reservatórios foram revestidas durante a noite com 1 μg/ml de solução de BCMA humano Fc 4-53 recombinant em PBS. A seguir de uma etapa de lavagem usando 0,05 % de TWEEN20, as placas foram bloqueadas com solução a 2 % de albumina sérica bovina em PBS por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como antes e 40 μl de cada anticorpo (IgG de murino, CA8 de murine, e CA8 quimérico), partindo a 10 μg/ml, titulado a 1 em 2 em duplicata foi adicionado aos reservatórios relevantes e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. 40 μl de BSA a 2 % foi adicionado aos reservatórios de controle relevantes. 10 μl de BAFF recombinante humano (2149BF/CF, R&D Systems) ou APRIL recombinante humano (5860-AP/CF, R&D Systems) foram adicionados a 30 ng/ml e 750 ng/ml respectivamente, dando uma concentração final de 6 ng/ml e 150 ng/ml respectivamente em cada reservatório. O volume equivalente de BSA a 2 % foi adicionado aos reservatórios de controle relevantes. As placas foram deixadas incubar por 2 horas na temperatura ambiente, depois do que elas foram lavadas como antes. Ligando anti-humano biotinilado (BAFF BAF124 ou APRIL BAF884, R&D Systems) foi adicionado aos reservatórios relevantes a 50 ng/ml e incubados por 1 hora. A seguir de uma etapa de lavagem, 50 μl de uma diluição 1:4000 de Estreptavidina-HRP (Amersham RPN4401) foi adicionado a cada reservatório e incubados por 30 minutos na temperatura ambiente. O processo de lavagem foi repetido mais uma vez seguido pela adição de 100 μl de solução de substrato de Tetrametilbenzidina (T8665, Sigma) em cada reservatório. As placas foram incubadas por 20 a 25 minutos na temperatura ambiente, enroladas em folha metálica. A reação foi interrompida com a adição de 100 μl de H2SO4 1 M. A densidade óptica foi determinada a 450 nM usando leitora Spectromax. Ver a Figura 7A e B.

[00297] Em um ensaio com base em placa para a neutralização da ligação de BAFF ou APRIL à BCMA, os valores EC50 calculados para CA8 quimérico foram 0,695 μg/ml e 0,773 μg/ml respectivamente. Os valores para a J6M0 humanizada foram 0,776 ng/ml e 0,630 ng/ml. Os valores para a versão J6M0 potelligent foram 0,748 e 0,616 ng/ml respectivamente.

[00298] 4.6 Efeito de anticorpo BCMA CA8 quimerizado e J6M0 humanizado sobre a fosforilação induzida por BAFF ou APRIL de NFkB em células H929.

[00299] Em um conjunto de experimentos, células H-929 foram plaqueadas a 75.000 células/reservatório em uma placa de 96 reservatórios em meio isento de soro. O anticorpo CA8 quimérico foi adicionado 24 horas mais tarde para dar a concentração de reservatório final até 200 μg/ml. Dez minutos mais tarde, os ligandos BAFF ou APRIL foram adicionados às células para dar a concentração de reservatório final de 0,6 ou 0,3 μg/ml respectivamente. Depois de 30 minutos as células foram lisadas e fosforiladas, os níveis de NfcapaB medidos usando um ensaio de MSD pNFcapaB.

[00300] O anticorpo CA8 de BCMA quimérico neutralizou a sinalização de célula NfcapaB induzida tanto por BAFF quanto por APRIL em células H-929. O mesmo foi particularmente potente na sinalização de célula NfcapaB induzida por BAFF neutralizante neste tipo de célula com uma IC50 média de 10 nM, comparada com 257 nM para a sinalização de célula NfcapaB induzida por APRIL.

[00301] Dados calculados em média de 2 experimentos

[00302] As IC50s foram 10 nM para a neutralização de NfcapaB induzida por BAFF e 257 nM para a neutralização de NfcapaB induzida por APRIL (média de 2 experimentos independentes) são mostradas na Tabela 7. Tabela 7

Um outro conjunto de experimentos foi realizado para intentar entender o porque houve uma tal discrepância entre a potência na neutralização de APRIL e BAFF no sistema com base em célula. Que segue a descoberta da forma solúvel de BCMA o planejamento experimental foi mudado para incluir uma etapa onde as células H929 foram lavados antes do ensaio para reduzir a interferência da ligação do anticorpo à BCMA solúvel. As células H-929 foram lavadas 3 vezes para remover qualquer sBCMA e recolocadas em suspensão em meio isento de soro. O anticorpo J6M0 potelligent foi adicionado a uma placa de 96 reservatórios para dar uma concentração de reservatório final de até 100 μg/ml junto com os ligandos BAFF ou APRIL para dar uma concentração de reservatório final de 0,6 ou 0,2 μg/ml respectivamente. As células H-929 foram depois plaqueadas a 7,5 x 104 células/ reservatório em meio isento de soro. 30 minutos mais tarde as células foram lisadas e os níveis de NFcapaB fosforilado medidos usando um ensaio de MSD pNFcapaB. Estes são dados de um experimento. Cada ponto de dado é a média/sd de duas duplicatas. Os dados deste experimento são mostrados na Figura 7c. As IC50s para a inibição de sinalização de BAFF e APRIL foram determinadas como 0,91 μg/ml e 2,43 μg/ml respectivamente. 4.7 Análise de proteína de construções de CA8 quimérico e humanizado anti-BCMA

[00303] A triagem inicial de variantes de CA8 quiméricas e humanizadas foi realizado no ProteOn XPR36 (Biorad). O método foi como segue; Proteína A foi imobilizada em um chip GLC (Biorad, Cat No: 176- 5011) pela ligação de amina primária, variantes CA8 foram depois capturadas nesta superfície e materiais de BCMA humana recombinante (interna ou comercial US Biological, B0410) (apenas a rodada 2)) passadas a 256, 64, 16, 4, 1 nM com uma injeção de 0 nM (isto é, apenas tampão) usado para as curvas de ligação de referência dupla, o tampão usado é o tampão HBS-EP. 50 mM de NaOH foram usados para regenerar a superfície de captura. Os dados foram ajustados ao modelo 1:1 usando o software de análise inerente ao ProteOn XPR36. A rodada 1 corresponde à primeira triagem de variantes de CA8 humanizadas (série J0 a J5) e a rodada 2 à segunda triagem de variantes de CA8 humanizadas (série J5 a J9). Ambas as rodadas foram realizadas a 25°C.

[00304] Os dados obtidos da rodada 1 são apresentados na Tabela 8 e os dados da rodada 2 são apresentados na Tabela 9. Várias moléculas na Rodada 2 (Tabela 09) falharam em dar valores de afinidade mensuráveis por ProteOn, isto foi devido à taxa de dissociação que está além da sensibilidade da máquina neste ensaio, isto entretanto indica que todas estas moléculas ligaram-se firmemente à BCMA humana recombinante. A partir da Rodada 1 os dados indicam que algumas construções não mostraram nenhuma ligação ao BCMA recombinante de cino. Tabela 8: Rodada 1 - Análises cinéticas de moléculas anti-BCMA contra BCMA humana recombinante

Tabela 9. Rodada 2 - Análises cinéticas de moléculas anti-BCMA contra BCMA humana recombinante para os anticorpos J8M0, J9M0, J8M1, J9M2, J7M2, J5M0, J7M1, J7M0, J8M2, J9M1, J5M2, J5M1 a taxa de dissociação foi além da sensibilidade do ensaio consequentemente nenhum dado é mostrado.

4.8 Análise BIAcore de construções anti-BCMA de CA8 quimérico e humanizado (série J7 a J9)

[00305] A proteína A foi imobilizada em um chip CM5 (GE Healthcare, Cat No: BR-1005-30) pela ligação de amina primária e esta superfície foi depois usada para capturar as moléculas de anticorpo. BCMA humana recombinante (US Biological, B0410) foi usada como analito a 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM e 1 nM. A regeração da superfície de captura foi realizada usando 50 mM NaOH. Todas as curvas de ligação foram de referência dupla com uma injeção de tampão (isto é, 0 nM) e os dados foram ajustados ao uso do modelo 1:1 inerente ao software de avaliação T100. A rodada foi realizada a 37°C, usando HBS-EP como o tampão de condução.

[00306] Os resultados mostraram as moléculas testadas com a exceção de J9M2 que se liga à BCMA humana recombinante, com afinidade similar como a molécula quimérica. Os dados gerados deste experimento são apresentados na tabela 10. Tabela 10: Análise de cinéticas de moléculas humanizadas anti-BCMA contra BCMA humana recombinante

4.9 Análise BIAcore das construções CA8 quiméricas e humanizadas anti-BCMA J6M0 e J9M0

[00307] A Proteína A foi imobilizada em um chip CM5 (GE Healthcare, Cat No: BR-1005-30) pela ligação de amina primária e a sua superfície foi depois usada para capturar as moléculas de anticorpo. BCMA humano recombinante (US Biological, B0410) foi usada como analito a 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM e 1 nM. A regeração da superfície de captura foi realizada usando 50 mM de NaOH. Todas as curvas de ligação foram de referência dupla com uma injeção de tampão (isto é, 0 nM) os dados foram ajustados para o uso do modelo 1:1 inerente ao software de avaliação T100. A rodada foi realizada a 25°C e 37°C para o experimento 1 e apenas 37°C para o experimento 2 usando HBS-EP como o tampão de condução.

[00308] Ambas as rodadas identificaram J9M0 como a melhor molécula em termos de afinidade global para BCMA humano. Os dados gerados a partir deste experimento estão apresentados na tabela 11. Tabela 11 Análises cinéticas de moléculas anti-BCMA humanizadas contra BCMA humana

4.10. Análise PrateOn de novas construções quiméricas anti- BCMA

[00309] A triagem inicial das novas variantes quiméricas do segundo lote de hibridomas foi realizada no PrateOn XPR36 (Biorad). O método foi como segue; Proteína A foi imobilizada em um chip GLM (Biorad, Cat No: 176-5012) pela ligação de amina primária, variantes anti-BCMA foram depois capturadas nesta superfície e BCMA humana recombinante (material interno) passado a 256, 64, 16, 4, 1 nM com uma injeção 0 nM (isto é, apenas tampão) usada para as curvas de ligação de referência dupla, o tampão usado é o tampão HBS-EP. A regeração da superfície de captura foi realizada usando 50 mM de NaOH. Os dados foram ajustados ao modelo 1:1 usando o software de análise inerente ao PrateOn XPR36. A rodada foi realizada a 25°C.

[00310] Os dados gerados a partir deste experimento são apresentados na tabela 12. Tabela 12: Análises cinéticas de moléculas anti-BCMA humanizadas contra BCMA humana

Exemplo 5 Ensaios de Morte de Célula. 5.1 As potências de ADCC das versões CA8 quimérico e CA8 quimérico desfucosilado em células ARH77 que expressam BCMA

[00311] As células matadoras naturais humanas (NK) foram incubadas com células transfectadas alvo ARH77 BCMA (10B5) rotuladas com európio na presença de concentrações variáveis do anticorpo em uma razão E:T de 5:1 por 2 horas. A liberação de európio a partir das células alvo foi medida e a lise específica calculada.

[00312] Resultado: CA8 quimérico e CA8 quimérico desfucosilado mataram as células alvo que expressam BCMA por intermédio de ADCC. O anticorpo quimérico defucosilado mostrou atividade de ADCC mais potente, como medido por uma lise percentual mais alta obtida com todas as células alvo testadas e uma EC50 dez vezes mais baixa na linhagem de célula alvo que expressa BCMA alto 10B5, comparado com o anticorpo quimérico precursor. Ver a Figura 8A e 8B. 5.2 Atividade de ADCC de anticorpos CA8 humanizados usando células alvo que expressam ARH77 BCMA expressar e PBMC como efetores

[00313] PBMC humanas foram incubadas com células transfectadas alvo ARH77 BCMA (10B5) rotuladas com európio na presença de concentrações variáveis de versões humanizadas de anticorpo CA8 (5 μg/ml a 0,005 μg/ml) em uma razão E:T de 5:1 por 2 horas. A liberação de európio a partir das células alvo foi medida e a lise específica calculada. Resultado:

[00314] Resultado: Todas as séries J5, J6, J7 J8 & J9 de variantes humanizadas de CA8 mostraram atividade ADCC contra a linhagem de célula 10B5 que expressa BCMA alto ARH77 em uma maneira dependente da dose. ADCC foi em um nível similar como aquele encontrado nos experimentos usando molécula de CA8 quimérica. Ver a Figura 9. 5.3 Potências de ADCC de 5322110F02, 5322110D07 e 5307118G03 quiméricos e 5307118G03 H3L0 humanizado contra células ARH77 10B5 expressar BCMA com purificada NK células como células efetoras

[00315] Células Exterminadoras alvo (NK) naturais Humanas foram incubadas com célula transfectadas alvo ARH77 BCMA rotuladas com európio na presença de concentrações variáveis do anticorpo em uma razão E: T de 5:1 por 2 horas. Liberação de európio das células alvo foi medida e lise específica calculada. Resulto: todas de 4 anticorpos testados mostraram atividade ADCC contra células ARH77 10B5. Ver a Figura 10. 5.4 Atividade de anticorpo-conjugado de droga (ADC) de CA8 ADCs quimérico.

[00316] Medir a atividade ADC de anticorpo CA8 quimérico, Conjugados de droga de anticorpo quimérico CA8-mcMMAF e conjugados de droga de anticorpo quimérico CA8-vcMMAE contra linhagens de célula de Mieloma Múltiplo humana. As linhagens de célula de Mieloma Múltiplo foram tratadas com conjugado de drogas de anticorpo CA8 quimérico para determinar as concentrações de ADC requeridas para a inibição do crescimento e morte.

[00317] Os conjugados de droga de anticorpos testados foram adicionados aos reservatórios que contém células de mieloma múltiplo em concentrações que variam de 1 μg/ml a 5 ng/ml. As placas foram incubadas a 37°C por 96 horas ponto no qual as células viáveis foram quantificadas usando Célula titre Glo. O anticorpo CA8 quimérico não conjugado não mostrou nenhuma atividade inibidora de crescimento significante nas concentrações de anticorpo que foram testadas. O conjugado de anticorpo CA8-mcMMAF quimérico mostrou maior atividade de inibidora de crescimento do que o conjugado de anticorpo CA8-vcMMAE quimérico- droga em todas as 4 das linhagens de célula de Mieloma Múltiplo que foram testadas. Ver a Figura 11 e Tabela 13 Tabela 13 Valores de IC50 representados em ng/ml para os conjugados de droga-anticorpo CA8-vcMMAE quimérico e CA8-mcMMAF quimérico em 4 linhagens de célula de Mieloma Múltiplo diferentes

5.5 Medir a atividade de parada do ciclo celular de anticorpo CA8 quimérico, conjugado de anticorpo CA8-mcMMAF quimérico-droga e conjugado de anticorpo CA8-vcMMAE quimérico-droga contra linhagem de célula H929 de Mieloma Múltiplo humano.

[00318] Para determinar por qual mecanismo o conjugado de anticorpo CA8 quimérico-droga (ADC’s) causa a inibição do crescimento em células de mieloma múltiplo, o ciclo celular de células NCI-H929 foi monitorado pela medição do teor de DNA celular através do tingimento com iodeto de propídio de célula fixa em pontos de tempo múltiplos que seguem o tratamento com anticorpo CA8 quimérico e ADC CA8 quimérico.

[00319] Na concentração de ADC CA8 quimérico testada (50 ng/ml), o ADC quimérico CA8-mcMMAF causou parada do ciclo celular G2/M significante (teor de DNA 4N) que deu pico em 48 horas. Nos últimos pontos de tempo 48, 72 e 96 horas, o tratamento com o ADC quimérico CA8- mcMMAF resultou no acúmulo de uma população de célula com teor de DNA sub-2N, que é representativo da morte de célula. Na concentração de 50 ng/ml testada o ADC CA8-vcMMAE quimérico não teve nenhum efeito significante sobre a parada do ciclo celular G2/M ou acúmulo sub-G1. Ver a Figura 12. 5.6 Tingimento com Fosfo-Histona-H3 (Thr11) como um marcador para a parada mitótica induzida pelo conjugado quimérico de anticorpo CA8 mcMMAF-medicamento e conjugado de anticorpo CA8 quimérico mcMMAF-droga.

[00320] Para determinar se o acúmulo de células com teor de DNA 4N é um resultado específico da parada mitótica induzida pelos ADCs CA8 quimérico células NCI-H929 foram tingidas com um anticorpo anti- fosfo-Histona H3 que segue o tratamento com concentrações crescentes de CA8 quimérico não conjugado, CA8-vcMMAE quimérico ou CA8-mcMMAF quimérico por 48 horas.

[00321] O tratamento com ADCs CA8 quimérico resultou em um acúmulo dependente da dose de células NCI-H929 que tingiram positivo para 65eroxidi-Histona H3 (Thr11), um marcador específico de células mitóticas. O ADC quimérico CA8-mcMMAF causou acúmulo de células positivas em 65eroxidi-Histona H3 nas concentrações mais baixas do que o ADC CA8- vcMMAE quimérico. Ver a Figura 13. 5.7 Medir apoptose em células NCI-H929 em resposta aos ADCs CA8 quiméricos pelo tingimento por Annexin V.

[00322] Para determinar se o acúmulo de células com teor de DNA sub-2N é um resultado específico de apoptose induzida pelos ADCs CA8 quiméricos, as células NCI-H929 foram tingidas com um anticorpo anti- Annexin-V que segue o tratamento com concentrações crescentes de CA8 quimérico não conjugado, CA8-vcMMAE quimérico ou CA8-mcMMAF quimérico por 48 horas. O tratamento com ADCs CA8 quiméricos resultou em um acúmulo dependente da dose de células NCI-H929 que tingiram positivo para Annexin-V, um marcador específico de apoptose. O ADC quimérico CA8-mcMMAF causou acúmulo de células positivas em Annexin- V nas concentrações mais baixas do que o ADC CA8-vcMMAE quimérico. Ver a Figura 14. 5.8 Atividade de conjugado anticorpo-droga (ADC) de variantes humanizadas de conjugado de anticorpo CA8 anti-BCMA-droga.

[00323] Células foram plaqueadas em placas de 96 reservatórios (4.000 células por reservatório em 100 μl de RPMI + 10 % de FBS)

[00324] Anticorpo nu ou ADC foram adicionados 6 horas depois da semeadura de célula e as placas foram incubadas por 144 horas. A inibição do crescimento na presença dos anticorpos ou ADCs foi medida em 144 horas usando Cell Titre glo. Os pontos de dados representam a média de medições CellTiterGlo em triplicata. As barras de erro representam erro padrão.

[00325] As linhagens de célula de Mieloma Múltiplo NCI-H929 e OPM2 foram tratadas com conjugado de anticorpohumanizados CA8 anti- BCMA-droga para determinar as concentrações de ADC requeridas para a inibição do crescimento e morte. As formas de conjugado de anticorpo mcMMAF e vcMMAE-droga destes anticorpos mostraram atividade inibidora de crescimento significante comparável com aquela encontrada com a quimera CA8. A variante J6M0 mostrou potência mais alta do que a quimera e os dados são mostrados na figura 15 em células H929 e células OPM2. O conjugado anticorpo mcMMAF-droga mostrou maior atividade inibidora do crescimento do que o conjugado anticorpo vcMMAE-droga para todos os anticorpos em ambas as linhagens de célula testadas. Os resultados para todas as variantes humanizadas são mostrados na Tabela 14. Tabela 14. Valores de IC50 representados em ng/ml para o conjugado de anticorpo anti BCMA-droga em células NCI-H929 e U266-B1

5.9 Atividade de Conjugado Anticorpo-droga (ADC) de outro conjugado anticorpo anti-BCMA de murine-droga.

[00326] As células foram plaqueadas em placa de 96 reservatórios (4.000 células por reservatório em 100 μl de RPMI + 10 % de FBS)

[00327] Anticorpo ou ADC foram adicionados 6 horas depois da semeadura de célula e as placas foram incubadas por 144 horas. A inibição do crescimento na presença dos ADCs foi medida em 144 horas usando Cell Titre glo. A média de medições em triplicata de CellTiterGlo é mostrada. As Tabelas 15a e 15b são de experimentos realizados em tempos diferentes em séries diferentes dos anticorpos. As linhagens de célula de Mieloma Múltiplo NCI-H929 e U266-B1 foram usadas para anticorpos na Tabela 15a.

[00328] As formas de conjugado de anticorpo mcMMAF e vcMMAE- droga de anticorpos de murino S322110D07, S332121F02 e S332136E04 mostraram atividade inibidora de crescimento significante. O conjugado de anticorpo mcMMAF-droga mostrou maior atividade inibidora do crescimento do que o conjugado de anticorpo vcMMAE-droga em todos dos anticorpos anti-BCMA de murino testado onde atividade foi observada. Figuras de IC50 são mostradas na Tabela 15a. Ver a Figura 16 quanto às curvas de resposta de dose para estes três anticorpos e também S107118G03. As barras de erro representam erro padrão. As células NCI-H929, U266-B1, JJN3 e OPM2 para os anticorpos na Tabela 15b foram tratadas com uma série diferente de conjugado anticorpo anti-BCMA de murino-droga para determinar as concentrações de ADC requeridas para a inibição do crescimento e morte. As figuras de IC50 são mostradas na Tabela 15b. Todos os 5 anticorpos mostrados na tabela tiveram atividade de ADC significante. Tabela 15a. Valores IC50 representados em ng/ml para o conjugado anticorpo anti-BCMA-droga em células NCI-H929 e U266-B1.

5.10 Potência de ADCC de J6M0 conjugada, afucosilada (Potelligent)

[00329] J6M0 afucosilada conjugada a MMAE ou MMAF foi testada em ensaios de ADCC usando transfectantes BCMA para garantir que a sua atividade de ADCC não foi comprometida pela conjugação. Células ARH77- 10B5 rotuladas com európio foram incubadas com várias J6M0 WT e anticorpos BCMA Potelligent em concentrações de até 10000 ng/ml por 30 minutos antes da adição de PBMCs (PBMC: razão de célula alvo 50:1). Duas horas mais tarde uma alíquota de meio de célula foi amostrada e misturada com solução de realce. Depois de 30 minutos sobre um agitador de placa, a liberação de európio foi monitorada na leitora de rótulo múltiplo Victor 2 1420. Os pontos de dados representam médias de valores em triplicata. Estes dados são representativos de 2 experimentos.

[00330] Não houve nenhuma diferença significante na potência de ADCC entre as formas não conjugadas e ADC de J6M0 Potelligent. No mesmo experimento uma versão do tipo selvagem de J6M0 foi incluída para mostrar como a potência compara com a versão afucosilada. Como esperado, a desfucosilação resultou em uma EC50 mais baixa e lise máxima mais alta. Nenhuma lise foi observada com a forma deficiente em Fc de J6M0. (Figura 17). 5.11 Potência de ADCC de J6M0 afucosilada em linhagens de célula MM

[00331] PBMC humanas foram incubadas com células de mieloma múltiplo alvo a uma razão E:T de 50:1 na presença de concentrações variáveis de J6M0 afucosilada (Potelligent). A porcentagem de células alvo que permanecem na mistura de efetor + célula alvo depois de 18 horas foi medida por FACS usando um anticorpo anti-CD138 fluorescentemente rotulado para detectar as células alvo e a lise percentual calculada. Isto é representativo de vários experimentos.

[00332] Os anticorpos J6M0 Potelligent mostraram atividade ADCC contra todas as cinco linhagens de célula de Mieloma Múltiplo alvo testadas. Isto foi importante testar visto que estudos mais no princípio foram realizados usando células transfectadas. Os resultados são mostrados na Figura 18. O conjunto de dados completo com doadores múltiplos é mostrado na Tabela 16. As potências foram todas em uma faixa similar como aquela encontrada com os transfectantes. A atividade de ADCC não foi diretamente relacionada com a expressão de superfície de BCMA nestas linhagens de célula. Tabela 16 Valores EC50 gerados em 13 ensaios independentes usando 11 doadores (designados de A a K) através das cinco linhagens de célula de Mieloma Múltiplo.

Exemplo 6. Dados de Xenoenxerto 6.1 Xenoenxertos de murino de linhagens de célula MM humanas foram testadas para garantir que a potência de anticorpo detectada in vitro também pudesse ser demonstrada in vivo.

[00333] A linhagem de célula selecionada para os estudos de xenoenxerto foi a NCI-H929 que é sensível à morte pelo ADC e ADCC in vitro. Os estudos foram realizados em camundongos CB,17 SLID imunocomprometidos que carecem de células T e B mas mantêm células NK para permitir a atividade de ADCC. Entretanto deve ser mencionado que embora IgG1 de ser humano possa se juntar aos receptores Fc de murino, o realce com Potelligent não melhora a afinidade como o faz com receptores Fc humanos. 6.2 Impacto de J6M0 não conjugada e conjugada com MMAE ou MMAF sobre o crescimento do tumor NCI-H929.

[00334] De modo a analisar independentemente as atividades tanto de ADCC quanto de ADC de J6M0 nós testamos anticorpo J6M0 na presença e ausência da conjugação com MMAF ou MMAE. Pelo teste da J6M0 não conjugada, qualquer um dos efeitos antitumor puderam ser atribuídos a alguma combinação de ADDC e a atividade inibidora funcional.

[00335] Camundongos com tumores NCI-H929 que atingiram um volume de 200 mm3 em média foram tratados com um controle de IgG1 de ser humano ou o anticorpo de J6M0 (não conjugado, MMAE ou MMAF) duas vezes semanalmente em uma dose de 50 μg ou 100 μg, por 2 semanas. Os resultados deste estudo mostram que uma dose de 100 μg do conjugado J6MO-MMAF resultou na eliminação de tumores nestes camundongos que completaram a dosagem. Os camundongos J6MO-MMAF foram mantidos por 40 dias depois da última dose sem que ocorresse nenhuma reocorrência de tumor. Estes resultados deste experimento demonstram que a conjugação de MMAF teve atividade antitumor aumentada tanto no anticorpo J6M0 não conjugado quanto no conjugado J6MO-MMAE Ver a Figura 19. Exemplo 7 Avaliação dos Níveis de BCMA Solúvel a partir do Soro de Paciente com MM 7.1 É correntemente desconhecido se BCMA está presente extracelularmente e pode ser detectado no sangue.

[00336] Neste trabalho, nós determinamos o nível sérico de BCMA humana a partir de pacientes com MM. As amostras de soro de 54 pacientes com MM e discrasia de célula plasmática e 20 amostras de controle normais foram analisadas por ELISA. A aprovação humana individual foi obtida do Western Institutional Review Board. 7.2 Avaliação dos níveis humanos séricos de BCMA

[00337] Sangue, de pacientes e controles normais na clínica, foi coletado em tubos de coleta de soro. As amostras de paciente MM foram de uma variedade de estágios (doença progressiva, remissão, recaída, recém diagnosticado, e outros). As amostras de sangue foram giradas a 10.000 rpm por 10 minutos e o soro transferido para dentro de tubos plásticos de microcentrífuga estéril.

[00338] Um kit de ELISA de BCMA humano/TNFRSF17 da R& D Systems (catálogo # DY193E) que mede os níveis de BCMA humana solúvel foi usado para detectar BCMA seguindo o protocolo padrão fornecido com o kit.

[00339] Em resumo, microplacas de 96 reservatórios foram revestidos com 100 μl por reservatório para capturar anticorpo e incubadas durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (0,05 % de Tween 20 em PBS, pH 7,2) e bloqueadas com 300 μl de BSA a 1 % em PBS na temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem. 100 μl de amostra de soro ou padrão foi adicionado em cada reservatório e incubados por 2 horas na temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e depois 100 μl do anticorpo de detecção foram adicionados a cada reservatório e incubados 2 horas na temperatura ambiente. 100 μl de Estreptavidina-HRP foram adicionados em cada reservatório depois de lavar as placas três vezes e incubadas em ambiente escuro por 20 minutos. As placas foram lavadas três vezes e adicionadas com 50 μl de solução de parada e depois determinadas pela leitora de microplaca com comprimento de onda de 570 nM.

[00340] Uma série de ensaios foram realizados de modo a determinar o fator de diluição sérica apropriado para os níveis de BCMA que foram presentes. Um fator de diluição de 1:500 foi descoberto ser adequado para a maioria das amostras e é o fator de diluição usado nos dados mostrados na Figura 20. O conjunto de dados completo é mostrado na Tabela 17.

[00341] As amostras de soro de paciente e controle normal diluídas e conduzidas em triplicatas tiveram os níveis de BCMA determinados. Os níveis séricos de BCMA foram significantemente elevados nos soros de pacientes com MM comparados com os controles normais neste estudo. Quando o subconjunto de doença foi dividido ainda mais houve uma tendência para níveis séricos elevados de BCMA nos soros de pacientes com MM progredindo comparados com aqueles em remissão. Este é o primeiro relato que identifica BCMA sérico em qualquer doença humana e sugere que estes níveis podem ser um novo biomarcador para monitorar o estado de doença e respostas terapêuticas de pacientes com MM e para outros pacientes com doenças mediadas por célula plasmática. Tabela 17. As figuras representam a concentração sérica de BCMA solúvel em ng/ml calculada a partir de amostras diluídas a 1/50, 1/500 e 1/5000. Os valores P foram calculados usando o Teste T de uma cauda e os valores de 95 % de significância estão abaixo na tabela.

Valores P (Teste T de Uma Cauda, 95 % de Significância) ~1-500 Único Normal vs Progressivo: p = 0,0010* Progressivo vs Remissão: p = 0,0146* ~1-500 Triplicata Normal vs Progressivo: p = 0,0004* Progressivo vs Remissão: p = 0,0091* ~1-50 Teste 1 Normal vs Progressivo: p = 0,0171* Progressivo vs Remissão: p = 0,0777 ~1-50 Teste 2 Normal vs Progressivo: p = 0,0184* Progressivo vs Remissão: p = 0,0876 * mostra significância Sumário de Sequência (Tabela C)

Claims (25)

1. Proteína de ligação de antígeno, caracterizada pelo fato de que especificamente se liga à BCMA e que inibe a ligação de BAFF e/ou APRIL à BCMA, em que a proteína de ligação de antígeno é capaz de ligação ao FcyRIIIA ou é capaz de função efetora mediada por FcyRIIIA e em que a proteína de ligação de antígeno é capaz de internalização e compreende: i) a CDRH3 como apresentada na SEQ ID NO. 3, variante N99D; ii) a CDRH1 como apresentada na SEQ ID NO. 1; iii) a CDRH2 como apresentada na SEQ ID NO. 2; iv) a CDRL1 como apresentada na SEQ ID NO. 4; v) a CDRL2 como apresentada na SEQ ID NO. 5; e vi) a CDRL3 como apresentada na SEQ ID NO. 6.

2. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno tem ligação realçada ao FcyRIIIA ou tem funções efetoras mediadas por FcgRIIIA realçadas.

3. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno tem função efetora de ADCC realçada.

4. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno é desfucosilada.

5. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno não se liga à Taci.

6. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada codificada por qualquer uma de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29.

7. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve codificada por qualquer uma de SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33.

8. Proteína de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 23 e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 31.

9. Proteína de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno compreende uma cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 31.

10. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo monoclonal humanizado.

11. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um isótipo IgG1.

12. Proteína de ligação de antígeno de acordo com quaisquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno é um fragmento que é um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, minianticorpo, minicorpo, VH isolada ou VL isolada.

13. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende a proteína de ligação de antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 e um agente citotóxico.

14. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno é ligada ao agente citotóxico por intermédio de um ligante.

15. Imunoconjugado de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é uma auristatina ou uma dolostatina.

16. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado de MMAE e MMAF.

17. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é covalentemente ligado à dita proteína de ligação de antígeno.

18. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno é ligada ao agente citotóxico por meio de um ligante clivável.

19. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o dito ligante é um ligante não clivável.

20. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 19, caracterizado pelo fato de que o ligante é selecionado de 6-maleimidocaproíla (MC), maleimidopropanoíla (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), p-amino- benziloxicarbonila (PAB), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidila (SPP), 4-(N-maleimidometil)cicloexano-1 carboxilato de N-succinimidila (SMCC), e (4-iodo-acetil) aminobenzoato de N-succinimidila (SIAB).

21. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 20, caracterizado pelo fato de que o dito imunoconjugado é engolfado por uma célula de tumor quando contatada com uma célula de tumor.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação de antígeno ou imunoconjugado como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

23. Uso de uma composição como definida na reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para tratar um paciente humano afligido com um distúrbio ou doença inflamatórios.

24. Uso de uma composição como definida na reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente humano afligido com um linfoma de célula B tal como Mieloma Múltiplo (MM) ou Leucemia Linfocítica Crônica (CLL).

25. Proteína de ligação de antígeno ou imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pelo fato de que são para o uso no tratamento de um paciente humano afligido com um linfoma de célula B tal como Mieloma Múltiplo (MM) ou Leucemia Linfocítica Crônica (CLL).

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