JP2016538852A - がん治療のための抗体抗マトリプターゼ - Google Patents

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Abstract

本発明は、チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体マトリプターゼの細胞外ドメインに結合する抗体を提供する。抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および抗体を発現させるための方法も提供される。抗体は、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんを含むがんの治療に使用され得る。

Description

マトリプターゼは、細胞外マトリックスを分解する。SWISS-PROTによれば、それは乳がん浸潤および転移に関与するとの説が出されている。P1部位としてArgまたはLysでの合成基質の切断により定義されるように、それはトリプシン様活性を示す。これは、口腔上皮および表皮の最終分化に関連付けられるプロフィラグリンプロセシング、角質細胞成熟ならびに脂質マトリックス形成に必須の生理的役割を有し、そして毛包の成長にも重要である。これは、ほとんどのヒト上皮に発現するII型膜貫通セリンプロテアーゼであり、そして厳密には上皮性プロテアーゼである。これは、間葉起源の腫瘍においてではなく、上皮起源のがんにおいて発現される。マトリプターゼは、特許文献１においてすでに記載されている。
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マトリプターゼ: Potent Proteolysis on the Cell Surface; List, Bugge and Szabo; Mol Med 12(1-3)1-7, Jan-March 2006 Regulation of the activity of マトリプターゼ on epithelial cell surfaces by a blood derived factor; Benaud, Dickson and Lin; Eur J Biochem 268, 1439-1447, 2001 Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) Ward et al., 1989, Nature 341:544-546 Bird et al., 1988, Science 242:423-426 Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883 Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479 Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448 Jones, 1986, Nature 321:522-525 Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536 Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329 Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33 He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035 Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9 Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973 Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162 Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684 Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618 Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915 Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759 Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125 De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084 Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061 Kohls, M and Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, no. 1, 162-165 Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983) Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) Cheung et al., Virology 176:546 (1990) Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990) Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394 Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085 Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347 Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891 Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350 McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23 Chayen (1997) Structure 5:1269-1274 McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303 Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60 Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423 Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323 Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA91:3809-3813 Shier et al., 1995, Gene 169:147-155 Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004 Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9 Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896 Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245 T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983] Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440 Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764 Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686 Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132 Brennan et al. (1985) Science 229:81-83 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180 Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294 Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740 Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473 Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105 the 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010) Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009) Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791 Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928 Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342 Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973 Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584 Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented Mar. 28, 2004 E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465 Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277 Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725 Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863 Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784 Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) (Journal of Medicinal Chemistry 2001, 44, 737-748 Medicinal Chemistry and Drug Design, ISBN: 978-953-51-0513-8, Ahmed Kamal et al. DOI: 10.5772/38869 Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661 Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931 Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U.Press, 1987. Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93 Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304 Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12 Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476 Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12 Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63 Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals) Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16) Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16 Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408 Remington's Pharmaceutical Sciences 16thEdition, A. Osal., Ed., 1980 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554 Antibody Engineering, edited by Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 and 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689 Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76 Morrison, S. (1985) Science 229:1202 Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038 P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140 M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180 Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134 Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123 J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273 Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851
本開示は、マトリプターゼに対する抗体（例えば、配列番号２６を含むヒトマトリプターゼに対する、またはステム（配列番号２１〜２４）などの機能断片、ならびに、抗体および治療タンパク質をコードする核酸、およびそのような核酸を含む宿主細胞を含む関連組成物を提供する。本発明は、抗マトリプターゼ抗体を調製する方法、ならびに抗体を使用して、マトリプターゼ媒介性障害など、例えば胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんを含むヒトがんなどの疾患を治療する方法をさらに提供する。
特定の実施形態において、本発明の抗マトリプターゼ抗体（またはその抗原結合断片）はマトリプターゼの細胞外ステム領域（配列番号２１〜２４）に結合し、そしてマトリプターゼを発現する細胞により内在化される。
一態様において、本発明は、
（a）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する抗体により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する、もしくは
（b）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する抗体と、LY75への結合を競合する
抗体、またはその抗原結合部位を提供する。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合部位はヒトLY75に結合し、そして、配列番号５、６、および７を含むCDRからなる群より選択される1つ、2つもしくは3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号８、９、および１０を含むCDRからなる群より選択される1つ、2つもしくは3つのCDRを含む軽鎖可変領域を含有する。
別の実施形態において、抗体は、本明細書に記載の特定の抗体（例えば、本明細書において「マトリプターゼ_A1」と呼ぶ）の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（CDR）または可変領域（VR）を含有する。したがって、一実施形態において、抗体は、配列番号１に示される配列を有するマトリプターゼ_A1の重鎖可変（VH）領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびに／または配列番号２に示される配列を有するA1の軽鎖可変（VL）領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含有する。
別の実施形態において、抗体は、配列番号５を含む第一のvhCDR；配列番号６を含む第二のvhCDR；および配列番号７を含む第三のvhCDRを含む重鎖可変領域；ならびに／または配列番号８を含む第一のvlCDR；配列番号９を含む第二のvlCDR；および配列番号１０を含む第三のvlCDRを含む軽鎖可変領域を含有する。
別の実施形態において、本発明の抗体はヒトマトリプターゼに結合し、そしてアミノ酸配列番号１、およびその保存的配列改変を含む重鎖可変領域を含有する。抗体は、アミノ酸配列番号２およびその保存的配列改変を含む軽鎖可変領域をさらに含有し得る。
さらなる実施形態において、本発明の抗体はヒトマトリプターゼに結合し、そして配列番号１および／または２でそれぞれ示されるアミノ酸配列、ならびにその保存的配列改変を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含有する。
保存的配列改変は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換であることが理解されるであろう。本明細書で使用される、用語保存的配列改変は、例えば、アミノ酸の、類似の特性を有するアミノ酸との置換を意味する。そのような置換の何が保存的と見なされるかは、当業者にとって共通の一般的知識である。保存的配列改変であると見なすことができるその他の改変には、例えば、グリコシル化が含まれる。
保存的配列改変は、配列番号１および/もしくは２で示される重鎖および/もしくは軽鎖可変領域の1つ以上のCDR領域内（配列番号５〜１０）ならびに/または1つ以上のフレームワーク領域内（配列番号２９〜３６）に存在し得ることが、さらに理解されるであろう。
好ましい実施形態において、前記抗体は単離された抗体である。
重鎖および軽鎖可変領域を含み、上記配列のいずれかと少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、またはそれ以上の配列同一性を有する単離された抗体もまた、本発明に含まれる。上記の値の中間の範囲、例えば、上記配列のいずれかと少なくとも80〜85%、85〜90%、90%〜95%または95%〜100%の配列同一性を有する重鎖および軽鎖の可変領域も、本発明に含まれることが意図される。一実施形態において、抗体は、配列番号１を含む重鎖可変領域、または、配列番号１に対して少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である配列を含有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号２を含む軽鎖可変領域、または、配列番号２に対して少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である配列を含有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号２９、３０、３１および３２に示されるように、配列番号１の重鎖可変領域のフレームワークと少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク領域を含有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号３３、３４、３５および３６に示されるように、配列番号２の軽鎖可変領域のフレームワークと少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域を含有する。
本発明の抗体とマトリプターゼへの結合を競合する単離された抗体もまた、本発明に包含される。特定の実施形態において、その抗体は、それぞれ配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を、または、それらと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体と、マトリプターゼへの結合を競合する。別の実施形態において、その抗体は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体（A1）と、マトリプターゼへの結合を競合する。
本発明の他の抗体は、同一のエピトープに、または、本明細書に記載の抗体により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する。別の特定の実施形態において、その抗体は、それぞれ配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を、または、それらと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する。別の実施形態において、その抗体は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体（A1）により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する。
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に記載の親抗体と比較して、可変CDRを含む。したがって、本発明は、親抗体の変異可変領域を含む変異抗体を提供し、ここで、親抗体は、配列番号５を含む第一のvhCDR；配列番号６を含む第二のvhCDR；および配列番号７を含む第三のvhCDR、配列番号８を含む第一のvlCDR；配列番号９を含む第二のvlCDR；および配列番号１０を含む第三のvlCDRを含有し、そしてここで、変異抗体は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つもしくは6つのアミノ酸置換を、第一のvhCDR、第二のvhCDR、第三のvhCDR、第一のvlCDR、第二のvlCDR、および第三のvlCDRのセットにまとめて、特定の用途の1〜4つ、1〜3つまたは1〜2つの置換で有し、そしてここで、抗体はマトリプターゼへの特異的結合を保持する。
本発明の抗体は、完全長であってもよく、例えば、以下のアイソタイプ：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgDおよびIgEのいずれかであってもよい。あるいは、抗体は、抗原結合部位または一本鎖抗体などの断片（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、一本鎖Fv断片、単離された相補性決定領域（CDR）または2つ以上の単離されたCDRの組合せ）であり得る。抗体は、ヒト、ヒト化、およびキメラ抗体を含む任意の種類の抗体であり得るが、これらに限定されない。
他の実施形態において、本発明の抗体は、免疫複合体の形態である（すなわち、共有結合した部分をさらに含む）。特定の実施形態において、その部分は、メイタンシノイド、ヘミアステリン、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、CC1065またはその誘導体などの薬物である。好ましい実施形態において、薬物部分はMMAEまたはMMAFである。
他の実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性分子の形態であり、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）反応をエフェクター細胞の存在下で誘発し、それによりマトリプターゼ発現細胞を死滅させる。
別の態様において、本発明は、前述の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。一実施形態において、本発明は、ヒトマトリプターゼに結合する単離されたモノクローナル抗体を提供し、ここで抗体は、配列番号３および４をそれぞれ含む核酸配列により、または、前述の核酸配列と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有する核酸配列により、または、遺伝子コードの縮重により配列番号３および４とは異なる配列によりコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含有する。
本発明の別の態様において、1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸を含む発現ベクターが提供される。
別の態様において、本発明は、前述の抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域またはその抗原結合部位をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。好ましくはここで、宿主細胞を核酸（単数または複数）が発現される条件下で増殖させた場合、宿主細胞は前記重鎖および／もしくは軽鎖可変領域またはその抗原結合部位を発現する。他の実施形態において、本発明の1つ以上の抗体を回収する方法が提供される。好ましい実施形態において、宿主細胞は、
（i）本発明の発現ベクター；または
（ii）本発明の抗体またはその抗原結合部位の重鎖をコードする核酸配列を含む第一の発現ベクターおよび本発明の抗体またはその抗原結合部位の軽鎖をコードする核酸配列を含む第二の発現ベクター
を含有する。
本発明のさらなる態様において、本発明の宿主細胞を抗体またはその抗原結合部位が発現される条件下で培養すること、そして任意に、抗体またはその抗原結合部位を単離することを含む、抗体またはその抗原結合部位を生成することが提供される。
さらなる別の態様において、本発明はがんを治療する方法を提供し、ここで、それを必要とする患者に、本発明の抗体または抗体（複数）またはその抗原結合部位が投与される。特定の実施形態において、患者に、マトリプターゼの細胞外ステム領域（配列番号２１〜２４）に結合する抗体を投与する。別の実施形態において、本発明の抗体または抗体（複数）は内在化される。一実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、共有結合した薬物部分を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５を含む第一のvhCDR；配列番号６を含む第二のvhCDR；および配列番号７を含む第三のvhCDRを含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８を含む第一のvlCDR；配列番号９を含む第二のvlCDR；および配列番号１０を含む第三のvlCDRを含む軽鎖可変領域を含有する。
さらなる態様において、がんを治療する方法が提供され、ここで、それを必要とする患者に、本発明の抗体または抗体（複数）またはその抗原結合部位が投与され、そしてここで、そのような本発明の抗体または抗体（複数）またはその抗原結合部位は、ADCC反応をエフェクター細胞の存在下で誘発する。好ましくは、抗体またはその抗原結合部位は、配列番号５を含む第一のvhCDR；配列番号６を含む第二のvhCDR；および配列番号７を含む第三のvhCDRを含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８を含む第一のvlCDR；配列番号９を含む第二のvlCDR；および配列番号１０を含む第三のvlCDRを含む軽鎖可変領域を含有する。
さらなる態様において、がんを治療する方法が提供され、ここで、それを必要とする患者に、本発明の抗体または抗体（複数）またはその抗原結合部位が投与され、そしてここで、そのような本発明の抗体または抗体（複数）またはその抗原結合部位は、細胞傷害性T細胞応答をエフェクター細胞の存在下で誘発する。好ましくは、抗体は、配列番号５を含む第一のvhCDR；配列番号６を含む第二のvhCDR；および配列番号７を含む第三のvhCDRを含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８を含む第一のvlCDR；配列番号９を含む第二のvlCDR；および配列番号１０を含む第三のvlCDRを含む軽鎖可変領域を含有する。
本発明のさらなる態様において、がんの治療に使用するための本発明の1つ以上の抗体が提供される。
また、がんの治療のための医薬の製造における本発明の1つ以上の抗体の使用が提供される。
一実施形態において、がんは、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんからなる群より選択される。
本発明のさらなる態様によれば、がんの進行を検出、診断および／もしくはスクリーニングもしくは観察する方法が提供され、ここでマトリプターゼは前記がんにおいて発現し、または前記がんの抗がん剤や治療の効果を被験体において観察する方法であって、マトリプターゼへの免疫特異的結合能力のある抗体または1つ以上のその断片の存在もしくはレベルを検出することを含む方法が提供される。
好ましくは、がんは、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんからなる群より選択される。
本発明の組成物（例えば、抗体）、および、任意に、使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットは、少なくとも1つの追加試薬または1つ以上の追加の本発明の抗体をさらに含むことができる。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
ステム領域（配列番号２１〜２４）をもたらすマトリプターゼの切断部位を示す。 ステム領域（配列番号２１〜２４）をもたらすマトリプターゼの切断部位を示す。 マトリプターゼ_A1重鎖、ヒトVH 3〜23生殖系列およびヒトJH4b生殖細胞系列のアラインメントを示す。マトリプターゼ_A1重鎖のCDR領域には下線を付している。 マトリプターゼ_A1軽鎖、ヒトVK A27生殖系列およびヒトJK2生殖系列のアラインメントを示す。マトリプターゼ_A1軽鎖のCDR領域には下線を付している。 ELISAを用いて、マトリプターゼ_A1がマトリプターゼ-ステムに結合することを示す。 SNU1細胞に対するマトリプターゼ_A1のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 HT-29細胞に対するマトリプターゼ_A1のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 H69細胞に対するマトリプターゼ_A1のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 マトリプターゼ_A1が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）応答をエフェクター細胞の存在下で誘発することを示す。 MabZAPアッセイを用いて、HT-29およびH69細胞によるマトリプターゼ_A1の内在化を示す。 毒素結合マトリプターゼ_A1の単回投与（0.3モル/kg：c.2mg/kg）は治癒的であると判明したことを示す。 腫瘍誘発性悪液質の改善を表している、マトリプターゼ_A1の投薬の60日間の体重の変化を示す。 治療に対する用量反応を明らかにしている、HT-29 ADC異種移植片モデルにおける代替用量群を示す。 用量反応の悪液質改善を明らかにしている、HT-29 ADC異種移植片モデルにおける代替用量群を示す。 種々のがん細胞株においてMMAEまたはMMAFのいずれかに結合した抗マトリプターゼ抗体を使用した、ADCの細胞毒性アッセイのEC50値を示す。 卵巣腺がんSCIDマウス異種移植モデルにおいてMMAEまたはMMAFのいずれかに結合した抗マトリプターゼ抗体の有効性を示す。
一実施形態において、本開示は、本明細書で概説するように、配列番号２１〜２４に示されるマトリプターゼのステム領域に高い親和性で特異的に結合する単離された抗体に関する。
特定の実施形態において、本発明のマトリプターゼ抗体は、二重特異性分子の形態であってもよく、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）反応をエフェクター細胞の存在下で増強させ、それによりマトリプターゼ発現細胞を死滅させる。
他の実施形態において、本発明のマトリプターゼ抗体は、マトリプターゼ受容体を発現している細胞に接触した際に内在化される。本明細書で説明するように、マトリプターゼ受容体は、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんの腫瘍を含むが、これらに限定されない特定のがん細胞上で過剰発現ならびに／または差次的に発現される。
したがって、本発明のマトリプターゼ抗体を薬物に結合させた場合（しばしば「抗体-薬物複合体」または「ADC」と称する）、これらADC分子のがん細胞への内在化は、細胞死およびそれによる腫瘍治療をもたらす。
したがって、本開示は、抗体、好ましくは、単離された抗体（以下に概説するように、種々のよく知られている抗体構造、誘導体、模倣剤および複合体を含む）、これらの抗体をコードする核酸、抗体を作製するために使用される宿主細胞、抗体を作製する方法、ならびに、抗体および任意に医薬担体を含む医薬組成物を提供する。
（マトリプターゼタンパク質）
マトリプターゼの細胞外ステム領域は、アミノ酸残基86〜201（配列番号２１）を含む単一のSEAドメインからなることが報告されている。マトリプターゼの活性化は、シーケンシャルエンドプロテアーゼ切断および活性化部位の自己切断を必要とする。切断はアミノ酸Gly149以降に発生し、アミノ酸残基86〜149（マトリプターゼステム配列B、配列番号２２）を含むステム領域をもたらす。さらに、タンパク質分解切断はアミノ酸K189以降に発生し、アミノ酸配列86〜189を含むステム領域（マトリプターゼステム配列C、配列番号２３）をもたらすことができ、またはアミノ酸K204以降に発生し、アミノ酸配列86〜204を含むステム領域（マトリプターゼステム配列D、配列番号２４）をもたらすことができる。マトリプターゼはその後、Arg614以降でタンパク質分解切断することにより、その活性構造に変換される。触媒C末端セリンプロテアーゼドメインは、アミノ酸残基615〜855（配列番号２７）からなる（図１）。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる非特許文献１および非特許文献２を参照。
したがって、本発明は、ヒトマトリプターゼのステム領域に特異的に結合する単離された抗マトリプターゼ抗体を提供する。「ヒトマトリプターゼ」または「ヒトマトリプターゼ抗原」は、配列番号２６のタンパク質、または、本明細書で定義されるようなステム（配列番号２１〜２４）などの機能断片を意味する。一般的に、マトリプターゼは、短い細胞質内テール、膜貫通ドメイン、および、切断した際にマトリプターゼステム領域を生成する細胞外ドメインを有する。特定の実施態様において、本発明の抗体はマトリプターゼタンパク質のステム領域に結合する。
本発明の抗体は、特定の場合において、ヒト以外の種からのマトリプターゼと交差反応してもよい。例えば、臨床試験を容易にするために、本発明の抗体は、マウスまたは霊長類マトリプターゼ分子と交差反応してもよい。あるいは、特定の実施形態において、抗体は、1つ以上のヒトマトリプターゼに完全に特異的であってもよく、そして非ヒトの種または他のタイプに交差反応性を示さなくてもよい。
（抗体）
本発明は、抗マトリプターゼ抗体、一般に、本明細書に記載されるように、治療および／または診断用抗体を提供する。本発明における使用を見出す抗体は、本明細書で説明されるように、従来の抗体、ならびに以下に記載の抗体誘導体、断片および模倣剤を含む多くの形態を取ることができる。本質的に、本発明は、本明細書で定義される6つのCDRのセットを含む抗体構造を提供する（後述のように、少数のアミノ酸変化を含む）。
本明細書で使用される「抗体」は、当業者により理解されるように、少なくとも本明細書で定義される6つのCDRのセットを含有する種々の構造を含み；従来の抗体（モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を含む）、ヒト化および／またはキメラ抗体、抗体断片、改変抗体（例えば、下記のようにアミノ酸改変を有する）、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ならびに当該技術分野で知られているその他の類似体を含むが、これらに限定されない。
従来の抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。各四量体は、典型的には、2つの相同対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、1つの「軽」鎖（典型的には約25kDaの分子量を有する）および1つの「重」鎖（典型的には約50〜70kDaの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、そして抗体のアイソタイプは、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして定義される。IgGはいくつかのサブクラスを有し、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含むが、これらに限定されるものではない。IgMはサブクラスを有し、IgM1およびIgM2を含むが、これらに限定されるものではない。したがって、本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される任意の免疫グロブリンのサブクラスを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD、およびIgEである。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスの任意の組み合わせのハイブリッドも含み得ることが理解されるべきである。
多くの実施形態において、IgGアイソタイプは、多くの用途において特定の用途を見出すIgG1で、本発明において使用される。
各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、3つのループが重鎖および軽鎖のVドメインのそれぞれに集合し、抗原結合部位を形成する。ループのそれぞれは相補性決定領域と呼ばれ（以下、「CDR」と呼ばれる）、そこではアミノ酸配列の変化が最も顕著である。「可変」は、可変領域の特定のセグメントの配列が抗体間で広範囲に異なることを意味する。可変領域内の可変性は、均等に分散されていない。代わりに、V領域は、それぞれ9〜15個のアミノ酸ほど長いまたはより長い「超可変領域」と呼ばれる大きな可変性の短い領域により分離される、15〜30個のアミノ酸のフレームワーク領域（FR）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。
各VHおよびVLは、3つの超可変領域（「相補性決定領域」、「CDR」）、および、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序で配置されている4つのFR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4から構成されている。
超可変領域は、一般に、アミノ酸残基を、軽鎖可変領域においておよそアミノ酸残基24〜34個（LCDR1；「L」は軽鎖を意味する）、50〜56個（LCDR2）および89〜97個（LCDR3）、ならびに重鎖可変領域において、およそ31〜35B個（HCDR1；「H」は重鎖を意味する）、50〜65個（HCDR2）、および95〜102個（HCDR3）；非特許文献３、および／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域において、残基26〜32個（LCDR1）、50〜52個（LCDR2）および91〜96個（LCDR3）ならびに重鎖可変領域において26〜32個（HCDR1）、53〜55個（HCDR2）および96〜101個（HCDR3）；非特許文献４、を包含する。本発明の具体的なCDRは、以下に記載されている。
本明細書全体を通して、可変ドメインの残基に言及する場合、カバットナンバリングシステムが一般的に使用されている（およそ、軽鎖可変領域の1〜107残基および重鎖可変領域の1〜113残基）（例えば、前出の非特許文献３）。
CDRは、抗原結合、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を意味する。エピトープは、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングにより並置される非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒へのばく露により保たれ、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒での処理で失われるのとは対照的である。エピトープは、典型的には、固有の空間的立体構造中に少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸を含む。本明細書に記載されるように、どのエピトープが所与の抗体により結合されるかを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）は当技術分野でよく知られており、例えば免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが含まれ、そこでマトリプターゼからの重複するまたは連続したペプチドは、所与の抗マトリプターゼ抗体との反応性について試験される。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、当技術分野における技法および本明細書に記載されるもの、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴が含まれる（例えば、非特許文献５を参照）。用語「エピトープマッピング」は、抗体-抗原認識のための分子決定因子を同定するプロセスを意味する。
「エピトープ」は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する決定因子を意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、そして通常、特定の構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。単一の抗原は、複数のエピトープを持ち得る。本発明において、正確なエピトープが決定的であるわけではなく；むしろ、マトリプターゼ受容体に結合して内在化する、またはADCC応答をエフェクター細胞の存在下で誘発する本発明の抗体の能力が重要である。
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。カバットらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多くの一次配列を収集した。配列保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をCDRおよびフレームワークに分類し、そのリストを作った（参照によりその全体が組み込まれる、非特許文献３を参照）。
免疫グロブリンのIgGサブクラスにおいて、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書における「免疫グロブリン（Ig）ドメイン」とは、特徴的な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明における目的の重鎖ドメインは、定常重鎖（CH）ドメインおよびヒンジドメインを含む。IgG抗体の文脈では、IgGアイソタイプはそれぞれ3つのCH領域を有する。したがって、IgGの文脈における「CH」ドメインは、次のとおりである：「CH1」は、カバットのEUインデックスに従い位置118〜220を意味する。「CH2」は、カバットのEUインデックスに従い位置237〜340を意味し、そして「CH3」は、カバットのEUインデックスに従い位置341〜447を意味する。
重鎖のIgドメインの別のタイプは、ヒンジ領域である。本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の第一および第二定常ドメインの間にアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドを意味する。構造的には、IgGのCH1ドメインはEU位置220で終了し、IgGのCH2ドメインは残基のEU位置237で開始する。したがって、IgGについて、抗体のヒンジは、本明細書において位置221（IgG1のD221）〜236（IgG1のG236）を含むように定義され、ナンバリングはカバットのEUインデックスに従う。いくつかの実施形態において、例えばFc領域の文脈において、下部ヒンジが含まれ、「下部ヒンジ」は一般的に位置226または230を意味する。
本発明における特定の目的は、Fc領域である。本明細書において使用される「Fc」または「Fc領域」または「Fcドメイン」は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン、およびいくつかの例において、ヒンジの一部を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、FcはIgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、IgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらドメインの可撓性ヒンジN末端を意味する。IgAおよびIgMについて、FcはJ鎖を含み得る。IgGについて、Fcドメインは、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3（Cγ2およびCγ3）、ならびにCγ1（Cγ1）とCγ2（Cγ2）との間の下部ヒンジ領域を含む。Fc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、残基C226またはP230をそのカルボキシル末端に含むように定義され、ナンバリングはカバットのEUインデックスに従う。いくつかの実施形態において、以下により詳細に説明されるように、アミノ酸改変はFc領域で行われ、例えば、1つ以上のFcγR受容体またはFcRn受容体への結合へ改変する。
いくつかの実施形態において、抗体は完全長である。本明細書における「完全長抗体」とは、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味し、可変および定常領域を含み、本明細書で概説するように1つ以上の改変を含む。
あるいは、抗体は様々な構造であることができ、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（しばしば本明細書において「抗体模倣体」と呼ばれる）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（しばしば「抗体複合体」と呼ばれる）、およびそれぞれの断片が含まれるが、これらに限定されない。CDRのセットの使用に依存する構造は、「抗体」の定義内に含まれる。
一実施形態において、抗体は抗体断片である。特定の抗体断片には、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片、（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、（iii）単一抗体のVLおよびVHドメインからなるFv断片；（iv）単一可変からなるdAb断片（非特許文献６、参照によりその全体が組み込まれる）、（v）単離されたCDR領域、（vi）F(ab')2断片、2つの連結されたFab断片を含む二価の断片、（vii）一本鎖Fv分子（scFv）、その中ではVHドメインおよびVLドメインは、2つのドメインを結合させ抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結されている（非特許文献７、非特許文献８、参照によりその全体が組み込まれる）、（viii）二重特異性一本鎖Fv（特許文献２、参照により本明細書に組み込まれる）ならびに（ix）「ダイアボディ」または「トリアボディ」、遺伝子融合により構築される多価または多重特異性断片（非特許文献９；特許文献３；非特許文献１０、参照によりその全体が組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
（キメラおよびヒト化抗体）
いくつかの態様において、抗体は、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体などの、異なる種からの混合物であってもよい。すなわち、本発明において、CDRのセットは、本明細書における配列により具体的に記されたもの以外のフレームワークおよび定常領域と一緒に使用することができる。
一般的に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は、2つ以上の種由来の領域を組み合わせた抗体を意味する。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウス（場合により、またはラット）由来の可変領域（単数または複数）およびヒト由来の定常領域（単数または複数）を含む。「ヒト化抗体」とは、一般に、ヒト抗体に見られる配列と交換される可変ドメインフレームワーク領域を持っていた非ヒト抗体を意味する。一般に、ヒト化抗体において、抗体全体は、CDRを除き、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、またはそのCDR内を除いてそのような抗体と同一である。CDRは、その一部または全てが非ヒト生物に由来する核酸によりコードされており、抗体を作成するためにヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植され、その特異性は、移植したCDRにより決定される。このような抗体の作製は、例えば、特許文献４、非特許文献１１、非特許文献１２に記載されており、参照によりその全体が組み込まれる。対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰突然変異」は、当初の移植された構築物において失われた親和性を回復するためにしばしば必要とされる（特許文献５〜特許文献１３、全て参照によりその全体が組み込まれる）。ヒト化抗体は、最適にはまた、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含み、したがって、典型的にはヒトFc領域を含む。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて作製することができる。非特許文献１３、参照によりその全体が組み込まれる。非ヒト抗体をヒト化および再形成する種々の技法および方法は、当該分野でよく知られている（非特許文献１４およびその中で引用された参考文献を参照、全て参照によりその全体が組み込まれる）。ヒト化の方法には、非特許文献１１；非特許文献１５；非特許文献１２；非特許文献１６〜非特許文献２１に記載されている方法が含まれるが、これらに限定されるものではなく、全て参照によりその全体が組み込まれる。ヒト化または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させる他の方法は、リサーフェシング法を含むことができ、例えば非特許文献２２に記載されており、参照によりその全体が組み込まれる。一実施形態において、親抗体は、当技術分野で知られているように、親和性成熟している。構造ベースの方法は、例えば特許文献１４に記載されているような、ヒト化および親和性成熟のために使用され得る。選択ベースの方法は、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟させるために使用することができ、非特許文献２３〜非特許文献２７に記載される方法を含むが、これらに限定されるものではなく、全て参照によりその全体が組み込まれる。その他のヒト化方法は、CDRの部分のみの移植を含んでいてもよく、特許文献１５；非特許文献２８；非特許文献２９に記載される方法を含むが、これらに限定されるものではなく、全て参照によりその全体が組み込まれる。
一実施形態において、本発明の抗体は、多重特異性抗体であってもよく、そして特に、時に「ダイアボディ」とも呼ばれる二重特異性抗体であってもよい。これらは、同じ抗原上の2つ（またはそれ以上）の異なる抗原または異なるエピトープに結合する抗体である。ダイアボディは、当技術分野で知られている種々の方法で製造することができ（非特許文献３０、参照によりその全体が組み込まれる）、例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製される。
一実施形態において、抗体はミニボディである。ミニボディは、CH3ドメインに結合したscFvを含む最小化された抗体様タンパク質である。非特許文献３１、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの例では、scFvはFc領域に結合することができ、そしてヒンジ領域の一部または全体を含み得る。ミニボディは、CDRのフルセットを持っていないにもかかわらず、「抗体」の定義内に含まれることに留意すべきである。
本発明の抗体は、一般に、単離されているまたは組換え型である。「単離された」とは、本明細書で開示される種々のポリペプチドを説明するために使用される場合、それが発現された細胞または細胞培養物から同定され、ならびに分離されたおよび／または回収されたポリペプチドを意味する。したがって、単離された抗体は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図している（例えば、マトリプターゼに特異的に結合する単離された抗体は、マトリプターゼ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。したがって、「単離された」抗体は、通常は天然には見出されない形で見つかったものである（例えば、非自然発生的）。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、組換えタンパク質、単離されたタンパク質または実質的に純粋なタンパク質である。「単離された」タンパク質は、通常その天然の状態では伴い、例えば所与の試料中の総タンパク質の少なくとも約5%、または少なくとも約50重量%を構成する物質の少なくとも一部を伴わない。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含量の5〜99.9重量%を構成し得ることが理解される。例えば、タンパク質は、有意に高い濃度で、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターを使用して作製することができ、タンパク質がより高い濃度レベルで作製されるようにできる。組換えタンパク質の場合には、その定義は、当該技術分野で知られている、多種多様な生物および／または宿主細胞において自然に発生しない抗体の産生を含む。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製工程により調製される。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する。例えば、マトリプターゼに特異的に結合する単離された抗体は、マトリプターゼ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。
異なる特異性を有する単離されたモノクローナル抗体を、明確に定義された組成物において組み合わせることができる。したがって例えば、本発明の抗体は、以下でさらに議論されるように、任意におよび個々に、製剤に含まれるまたは除外されることができる。
本発明の抗マトリプターゼ抗体は、マトリプターゼ（例えば、マトリプターゼ-ステム（配列番号２１〜２４））に特異的に結合する。特定の抗原またはエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定して異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば分子の結合を、一般に結合活性を持たない類似構造の分子である対照分子の結合と比較して測定することにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、類似の対照分子との標的への競合により測定することができる。
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して、少なくとも約10-4M、少なくとも約10-5M、少なくとも約10-6M、少なくとも約10-7M、少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9M、あるいは少なくとも約10-10M、少なくとも約10-11M、少なくとも約10-12M、またはそれ以上のKDを有する抗体により示されることができ、ここでKDは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を意味する。一般的に、抗原に特異的に結合する抗体は、対照分子よりも20-、50-、100-、500-、1000-、5,000、10,000倍またはそれ以上のKDを抗原またはエピトープに対して持つことになる。しかしながら、本発明において、本発明のマトリプターゼ抗体のADCを投与する際、重要なことは、KDが、内在化およびそれによる細胞死を有意な副作用なしで可能にするのに十分であることである。
また、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して、対照と比べて少なくとも20-、50-、100-、500-、1000-、5,000、10,000倍またはそれ以上のKAまたはKaをエピトープに対して持つ抗体により示されることができ、ここで、KAまたはKaは特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を意味する。
マトリプターゼに対する抗体の結合能を評価するための標準的なアッセイは、タンパク質または細胞レベルで行うことができ、そして当技術分野で知られている、例えばELISA法、ウェスタンブロット、RIA、BIAcore（登録商標）アッセイおよびフローサイトメトリー分析などが含まれる。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。抗体の結合動態（例えば結合親和性）も、Biacore（登録商標）システム分析などの当技術分野で知られている標準的なアッセイにより評価することができる。Raji細胞またはダウディB細胞腫瘍細胞への結合を評価するために、Raji細胞（ATCC寄託番号CCL-86）またはダウディ細胞（ATCC寄託番号CCL-213）を、アメリカ培養細胞系統保存機関などの公的に入手可能な供給元から得ることができ、そしてフローサイトメトリー分析のような標準的なアッセイで使用することができる。
（マトリプターゼ抗体）
本発明は、ヒトマトリプターゼのステム（配列番号２１〜２４）に特異的に結合し、そして細胞表面上にマトリプターゼを発現している細胞に接触した際に内在化されるマトリプターゼ抗体を提供する。これら抗体は、「抗マトリプターゼ」抗体、または記述を容易にするために「マトリプターゼ抗体」として、いずれかで本明細書において言及されている。
マトリプターゼ抗体は、細胞、特に表面にマトリプターゼを発現する腫瘍細胞と接触した際に内在化される。したがって、本明細書で定義され、薬物複合体も含むマトリプターゼ抗体は、腫瘍細胞により内在化され、薬物の放出およびその後の細胞死をもたらし、マトリプターゼ発現を示すがんの治療を可能にする。この文脈における内在化は、いくつかの方法で測定することができる。一実施形態において、本発明のマトリプターゼ抗体は、本明細書に概説されるように細胞株などの細胞と、MAbZapおよびHuZapなどの標準的なアッセイを用いて接触される。MabZapアッセイは、抗体-薬物複合体（ADC）で見られることが予想される効果を表すことは、当業者には明らかであろう。後者の場合、ADCは内在化され、そうして薬物を細胞内に導くことになるであろう。有毒な薬剤は、細胞を殺傷する、すなわち標的がん細胞を殺傷する能力を有するであろう。MabZapアッセイからのデータはADCアッセイを代表することは、当業者により容易に認められる（非特許文献３２）。これらのin vitroアッセイの実施態様において、本発明のマトリプターゼ抗体を、毒素を含む抗マトリプターゼ抗体と一緒に添加する；例えば、マトリプターゼ抗体は、マウスまたはヒト化であってもよく、そして抗マトリプターゼ抗体は、抗マウスまたは抗ヒト化であり、そしてサポリンなどの毒素を含むことができる。［本発明のマトリプターゼ抗体］-［抗マトリプターゼ抗体-薬物複合体］複合物の形成の際に、複合物は内在化され、薬物（例えばサポリン）が放出され、細胞死をもたらす。内在化の際にのみ薬物が放出されるため、細胞は内在化が起きない限り生存し続ける。以下に概説するように、理論に縛られることなく、治療用途において、抗マトリプターゼ抗体は毒素を含み、そして内在化の際に、抗体と毒素との間の結合が切断され、毒素を放出し、細胞を殺傷する。
また、マトリプターゼ抗体は、ADCC応答を、エフェクター細胞、特に表面上にマトリプターゼを発現する腫瘍細胞の存在下で誘発する。
一実施形態において、抗体は、本明細書に記載の特定の抗体（例えば、「マトリプターゼ_A1」と呼ぶ）の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（CDR）または可変領域（VR）を含有する。したがって、一実施形態において、抗体は、配列番号１に示される配列を有する抗体A1の重鎖可変（VH）領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびに配列番号２に示される配列を有するA1の軽鎖可変（VL）領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含有する。
別の実施形態において、抗体は、配列番号５を含む第一のvhCDR；配列番号６を含む第二のvhCDR；および配列番号７を含む第三のvhCDRを含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８を含む第一のvlCDR；配列番号９を含む第二のvlCDR；および配列番号１０を含む第三のvlCDRを含む軽鎖可変領域を含有する。別の実施形態において、本発明の抗体はヒトマトリプターゼに結合し、そして、配列番号１からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的配列改変を含む重鎖可変領域を含有する。抗体は、配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的配列改変を含む軽鎖可変領域をさらに含有し得る。
さらなる実施形態において、本発明の抗体はヒトマトリプターゼに結合し、そして、配列番号１および／または２でそれぞれ示されるアミノ酸配列、ならびにその保存的配列改変を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含有する。
重鎖および軽鎖可変領域を含み、上記配列のいずれかと少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、またはそれ以上の配列同一性を有する単離された抗体もまた、本発明に含まれる。上記の値の中間の範囲、例えば、上記配列のいずれかと少なくとも80〜85%、85〜90%、90%〜95%または95%〜100%の配列同一性を有する重鎖および軽鎖の可変領域も、本発明に含まれることが意図される。一実施形態において、抗体は、配列番号１を含む重鎖可変領域、または、配列番号１に対して少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である配列を含有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号２を含む軽鎖可変領域、または、配列番号２に対して少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である配列を含有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号２９、３０、３１および３２を含む配列番号１の重鎖可変領域のフレームワークと少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク領域を含有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号３３、３４、３５および３６を含む配列番号２の軽鎖可変領域のフレームワークと少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域を含有する。一実施形態において、本発明の抗体は、以下のCDR、ならびに限られた数のアミノ酸変異を含有する変異体を含む抗マトリプターゼ抗体である（本明細書において「A1」抗体と呼ぶ）：
A1などの、本発明の特定のマトリプターゼ抗体のCDRセットを含む可変重鎖および軽鎖、ならびに、完全長重鎖および軽鎖（例えば、定常領域も含む）もまた、本明細書に開示される。当業者により理解されるように、本発明のCDRのセットは、マウス、ヒト化またはヒト定常領域（フレームワーク領域を含む）に組み込むことができる。A1およびhuA1に示されるように、マウスとヒトとの配列間のアミノ酸同一性は、約90%である。したがって、本発明は、本明細書に開示される配列番号に少なくとも約90%〜99%同一である可変重鎖および軽鎖を提供し、90、91、92、93、94、95、96、97、98および99%は全て本発明における使用を見出す。
（本発明のマトリプターゼ抗体と同一のエピトープに結合する抗体）
別の実施形態において、本発明は、本発明の任意のマトリプターゼモノクローナル抗体と同一の、ヒトマトリプターゼ上のエピトープに結合する抗体を提供する。2つ以上の抗体に関連する「同一のエピトープに結合する」という表現は、抗体が抗原への結合について競合し、そして同一の、重複するまたは包含するアミノ酸の連続または不連続セグメントに結合することを意味する。当業者は、「同一のエピトープに結合する」という表現は、必ずしも抗体が全く同一のアミノ酸に結合することを意味するものではないことを理解する。抗体が結合する正確なアミノ酸は異なる可能性がある。例えば、一次抗体は、二次抗体により結合されるアミノ酸のセグメントに完全に包含されるアミノ酸のセグメントに結合することができる。別の実施例において、一次抗体は、二次抗体により結合される1つ以上のセグメントに著しく重複するアミノ酸の1つ以上のセグメントに結合する。本明細書の目的で、そのような抗体は「同一のエピトープに結合する」と見なされる。
したがって、本発明に包含されるのは、本明細書に記載の特定の抗体により認識されるエピトープの全てまたは一部を含むマトリプターゼ上のエピトープに結合する抗体である（例えば、同一もしくは重複領域または間の領域または貫通領域）。
また、本発明に包含されるのは、本明細書に記載の抗体と、ヒトマトリプターゼへの結合を競合する同一のエピトープおよび／または抗体に結合する抗体である。同一のエピトープを認識するか、結合を競合する抗体は、慣用技術を用いて同定することができる。このような技術には、例えばイムノアッセイが含まれ、ある抗体の、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力、すなわち、競合的結合アッセイを示す。競合的結合は、試験下の免疫グロブリンが、参照抗体のマトリプターゼなどの共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにおいて測定される。多くのタイプの競合結合アッセイが知られており、例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（RIA）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（EIA）、サンドイッチ競合アッセイ（非特許文献３３を参照）；固相直接ビオチン-アビジンEIA（非特許文献３４を参照）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（非特許文献３５を参照）；I-125標識を使用する固相直接標識RIA（非特許文献３６を参照）；固相直接ビオチン-アビジンEIA（非特許文献３７）；および直接標識RIA（非特許文献３８）。典型的には、そのようなアッセイは、これらの非標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンのいずれかを有する固体表面または細胞に結合した精製された抗原の使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは、共通の抗原への参照抗体の特異的結合を、少なくとも50〜55%、55〜60%、60〜65%、65〜70%、70〜75%、75〜80%、80〜85%、85〜90%、90〜95%、95〜99%またはそれ以上阻害する。
他の技術には、例えば、抗原：エピトープの原子分解能を与える抗体複合物のX線結晶解析などのエピトープマッピング法が含まれる。他の方法は、抗体の抗原断片への結合または抗原の変異のばらつきを観察し、ここで抗原配列内のアミノ酸残基の改変による結合の損失が、エピトープ構成成分の指標であるとしばしば考えられている。また、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル法を使用することもできる。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特定の短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。ペプチドは、その後、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に相当するエピトープを定義するためのリードとみなされる。エピトープマッピングのために、立体構造的に不連続なエピトープをマッピングするために表示されるコンピューターアルゴリズムも開発されている。
特定の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を、または、それらと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体と、マトリプターゼへの結合を競合する。別の実施形態において、抗体は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体（A1）と、マトリプターゼへの結合を競合する。
本発明の他の抗体は、本明細書に記載の抗体により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する。別の特定の実施形態において、抗体は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を、または、それと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、またはそれと少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する。別の実施形態において、抗体は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する抗体（A1）により認識されるマトリプターゼ上のエピトープに結合する。
（マトリプターゼに対するモノクローナル抗体の特性評価）
本発明のモノクローナル抗体を、様々な既知技術を使用して、マトリプターゼへの結合について特性評価することができる。一般に、抗体は、まずELISAにより特性評価される。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートをPBS中の精製マトリプターゼでコーティングし、その後、PBSで希釈したウシ血清アルブミン（BSA）などの無関係なタンパク質でブロッキングすることができる。マトリプターゼ免疫マウスからの血漿の希釈物を各ウェルに添加し、1〜2時間37℃でインキュベートする。プレートをPBS/Tween 20で洗浄し、その後、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬と共に、1時間37℃でインキュベートする。洗浄後、プレートを、ABTS基質を用いて展開し、405のODで分析する。好ましくは、最も高い力価を呈するマウスを融合に使用する。
ELISAアッセイは上述のように、抗体のスクリーニング、および、したがって、マトリプターゼ免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに使用することができる。好ましくは高い親和性でマトリプターゼに結合するハイブリドーマを、その後サブクローン化し、さらに特性評価することができる。1つのクローンをその後、親細胞の反応性を保持する各ハイブリドーマから（ELISAにより）、細胞バンクを作製するために、および抗体精製のために、選択することができる。
抗マトリプターゼ抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、ローラーボトル、2リットルスピナーフラスコまたはその他の培養系で増殖させることができる。上清を、プロテインAセファロース（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）での親和性クロマトグラフィーの前に濾過および濃縮し、タンパク質を精製することができる。PBSに緩衝液交換した後、濃度を、1.43吸光係数を用いるOD280により、または好ましくは比濁分析により測定することができる。IgGを、ゲル電気泳動により、および抗原特異的方法により確認することができる。
選択された抗マトリプターゼモノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを判定するために、各抗体を、市販の試薬（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）を用いてビオチン化することができる。ビオチン化MAb結合は、ストレプトアビジン標識プローブを用いて検出することができる。精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプELISAを、当該分野で認められた技術を用いて実施することができる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを、抗Ig 10μg/mlで、一晩4℃でコーティングすることができる。5% BSAでブロッキングした後、プレートをモノクローナル抗体10μg/mlと、または精製したアイソタイプ対照群と、周囲温度で2時間かけて反応させる。ウェルをその後、IgG1または他のアイソタイプ特異的結合プローブと反応させることができる。上述のように、プレートを展開および分析する。
モノクローナル抗体の、マトリプターゼを発現する生細胞への結合を試験するために、フローサイトメトリーを使用することができる。簡潔に述べると、膜結合マトリプターゼを発現する細胞株および／またはヒトPBMC（標準増殖条件下で増殖させた）を、様々な濃度のモノクローナル抗体と、0.1% BSAを含有するPBS中で、4℃で1時間かけて混合させる。洗浄後、細胞を、フルオレセイン標識抗IgG抗体と、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。試料は、FACScan装置により、単一細胞のゲートへの光および側方散乱特性を用いて分析することができ、そして標識抗体の結合を測定する。蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用することができる（フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはその代わりに）。細胞を正確に上記の通りに染色し、そして蛍光顕微鏡で検査することができる。この方法は、個々の細胞の可視化を可能にするが、抗原の密度に応じて感度が低下する可能性がある。
抗マトリプターゼ IgGはさらに、ウェスタンブロッティングによりマトリプターゼ抗原との反応性について試験することができる。簡潔に述べると、マトリプターゼを発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、20%マウス血清でブロッキングし、そして試験するモノクローナル抗体でプローブする。IgG結合を、抗IgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、そしてBCIP/NBT基質錠剤（シグマ・ケム社、セントルイス、ミズーリ州）で展開することができる。
結合親和性、交差反応性、および様々な抗マトリプターゼ抗体の結合動態を分析する方法には、例えば、Biacore（登録商標）2000SPR装置（ビアコアAB、ウプサラ、スウェーデン）を使用するBiacore（登録商標）表面プラズモン共鳴（SPR）分析などの、当技術分野で知られている標準的なアッセイが含まれる。
一実施形態において、抗体は、配列番号２６を含むヒトマトリプターゼ、またはステム（配列番号２１〜２４）などの機能断片に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、高い親和性でヒトマトリプターゼに結合する。
好ましくは、本発明の抗体は、マトリプターゼタンパク質に5×10-8M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に2×10-8M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に5×10-9M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に4×10-9M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に3×10-9M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に2×10-9M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に1×10-9M以下のKDで結合する、マトリプターゼタンパク質に5×10-10M以下のKDで結合する、またはマトリプターゼタンパク質に1×10-10M以下のKDで結合する。
一実施形態において、本発明の抗体は、マトリプターゼへの結合を、本明細書に記載の特定の抗マトリプターゼ抗体（例えば、_A1）と競合（例えば、交差競合）する。そのような競合抗体を、標準的なマトリプターゼ結合アッセイにおいて、1つ以上のmAbのマトリプターゼへの結合を競合的に阻害するそれらの能力に基づいて同定することができる。例えば、標準的なELISAアッセイを使用することができ、そこで、組換えヒトマトリプターゼタンパク質をプレート上に固定化し、抗体の1つを蛍光標識し、そして標識抗体の結合を遮断競合する非標識抗体の能力を評価する。追加的または代替的に、BIAcore分析を使用して、抗体の交差競合する能力を評価することができる。本発明の抗マトリプターゼ抗体のヒトマトリプターゼへの結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が、ヒトマトリプターゼへの結合について抗体と競合することができることを実証する。
一実施形態において、競合する抗体は、本明細書に記載の特定の抗マトリプターゼモノクローナル抗体（例えば、A1）と同一の、ヒトマトリプターゼ上のエピトープに結合する抗体である。X線結晶学および2次元核磁気共鳴などの標準的なエピトープマッピング技術を使用し、抗体が、参照抗体と同一のエピトープに結合するかどうかを決定することができる（例えば、非特許文献５を参照）。
一実施形態において、マトリプターゼへの結合を競合するおよび／またはヒトマトリプターゼ上の同一のエピトープに結合する抗体はヒト抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製および単離することができる。
本明細書に記載の所望の特性を有する、単一の、原型的な抗マトリプターゼmAbが単離されれば、当技術分野で公知の方法を用いて、類似の特性を有する、例えば同一のエピトープを有する他のmAbを生成することは簡単である。例えば、本明細書に記載されるようにマウスをマトリプターゼで免疫化し、ハイブリドーマを産生し、そして原型的なmAbとマトリプターゼへの結合を競合する能力についてスクリーニングしたmAbが得られる。マウスを、原型的なmAbが結合するエピトープを含むマトリプターゼの小さな断片で免疫化することもできる。エピトープは、例えば、マトリプターゼにまたがる一連の重複ペプチドへの結合についてのスクリーニングにより、局在化することができる。あるいは、非特許文献３９の方法を使用し、同一のエピトープを有する、そしてしたがって原型的なmAbと同様の特性を有するmAbの選択を導いてもよい。ファージディスプレイを使用して、最初に原型的な抗体の重鎖を軽鎖のレパートリー（好ましくはヒトの）と対にしてマトリプターゼ-結合mAbを選択し、そして新しい軽鎖を重鎖のレパートリー（好ましくはヒトの）と対にして、原型的なmAbと同一のエピトープを有する（好ましくはヒトの）マトリプターゼ-結合mAbを選択する。あるいは、原型的なmAbの変異体を、抗体の重鎖および軽鎖をコードするcDNAの変異誘発により得ることができる。
例えば非特許文献４０に記載されているようなエピトープマッピングを実施し、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを決定することができる。非特許文献４１により説明されているような「アラニンスキャニング突然変異誘発」、またはヒトマトリプターゼ中のアミノ酸残基の点変異誘発の他の形態を使用し、本発明の抗マトリプターゼ抗体に対する機能的エピトープを決定してもよい。しかし、突然変異誘発研究は、全体的なマトリプターゼの三次元構造に重要であるが、抗体-抗原接触には直接は関与しないアミノ酸残基も明らかにするため、この方法を用いて決定される機能的エピトープを確認するために、他の方法が必要となるかもしれない。
特異的抗体が結合するエピトープはまた、抗体のヒトマトリプターゼの断片を含むペプチドへの結合を評価することにより決定されてもよい。マトリプターゼの配列を包含する一連の重複ペプチドを合成し、例えば直接ELISA、競合ELISAにおいて（ペプチドを、マイクロタイタープレートのウェルに結合したマトリプターゼへの抗体の結合を阻止する能力について評価する）、またはチップ上で、結合についてスクリーニングすることができる。そのようなペプチドスクリーニング法は、いくつかの不連続な機能的エピトープ、すなわち、マトリプターゼポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出することができない場合がある。
本発明の抗体が結合するエピトープはまた、X線結晶構造決定（例えば、特許文献１６）、分子モデリングおよび核磁気共鳴（NMR）分光法などの構造的方法により決定されてもよく、マトリプターゼの不安定なアミド水素の、遊離の際および目的の抗体との複合物に結合した際のH-D交換率のNMR測定が含まれる（非特許文献４２；非特許文献４３）。
X線結晶学に関して、結晶化は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して達成することができ（例えば非特許文献４４；非特許文献４５）、マイクロバッチ（例えば非特許文献４６）、懸滴蒸気拡散（例えば非特許文献４７）、播種および透析が含まれる。少なくとも約1mg/mLおよび好ましくは約10mg/mL〜約20mg/mLの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、ポリエチレングリコールを1000〜20,000（PEG；約1000〜約20,000Daの範囲の平均分子量）、好ましくは約5000〜約7000Da、さらに好ましくは約6000Da、約10%〜約30%の範囲の濃度（w/v）で含有する沈殿剤溶液中で最も良く達成され得る。また、タンパク質安定化剤を、例えばグリセロールを、約0.5%〜約20%の範囲の濃度で含むことが望ましい場合がある。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適切な塩も、沈殿剤溶液中に、好ましくは約1mM〜約1000mMの範囲の濃度で存在するのが望ましい場合がある。沈殿剤は、好ましくは、約3.0〜約5.0のpHに、好ましくは約4.0に緩衝される。沈殿剤溶液中で有用な特定の緩衝剤は変化してもよく、当技術分野でよく知られている（非特許文献４８）。有用な緩衝剤の例には、HEPES、トリス、MESおよび酢酸塩が含まれるが、これらに限定されない。結晶は、2℃、4℃、8℃、および26℃を含む広範囲の温度で成長させることができる。
抗体：抗原結晶を、よく知られているX線回折技術を使用して調査することができ、そしてX-PLOR（エール大学、1992年、分子シミュレーション組織により配布される；例えば、非特許文献４９；特許文献１７を参照）、およびBUSTER（非特許文献５０；非特許文献５１；非特許文献５２）などのコンピュータソフトウェアを使用して精製することができ、それらの開示は、参照によりその全体が組み込まれる。
抗体競合アッセイを、本明細書に記載されるように使用し、抗体が他の抗体と「同一のエピトープに結合する」かどうかを決定することができる。典型的には、二次抗体が過剰であり、そして一次が全ての位置を飽和する条件下において、二次抗体によりエピトープと相互作用することが知られている抗体の50%以上、60%以上、70%以上の、例えば70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上の競合が、抗体が「同一のエピトープに結合する」指標である。2つの抗体間の競合のレベルを評価するために、例えば、ラジオイムノアッセイまたは他の標識を抗体に使用するアッセイを使用することができる。例えば、マトリプターゼ抗原を、標識化合物（例えば、3H、125I、ビオチン、またはルビジウム）に結合した一次抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合断片の飽和量と共に、同量の二次非標識抗マトリプターゼ抗体の存在下でインキュベートすることができる。非標識ブロッキング抗体の存在下で抗原に結合した標識抗体の量をその後評価し、非標識ブロッキング抗体の非存在下での結合と比較する。競合は、非標識のブロッキング抗体の存在下における、ブロッキング抗体の非存在下と比較した、結合シグナルのパーセント変化により決定される。したがって、ブロッキング抗体の非存在下での結合と比較して、ブロッキング抗体の存在下において標識抗体の結合の50%阻害が存在する場合、それは、50%の2抗体間競合があるということである。したがって、一次および二次抗体間の50%以上、60%以上、70%以上、例えば70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の競合への言及は、一次抗体が、二次抗体の抗原への結合（またはその逆）を50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上阻害することを意味する（一次抗体の非存在下での二次抗体による抗原の結合と比較して）。したがって、二次抗体による、第一抗体の抗原への結合の50%、605、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の阻害は、2つの抗体が同一のエピトープに結合することを示している。
（抗体改変）
本発明は、しばしば「抗体誘導体」または「抗体類似体」とも呼ばれる変異抗体をさらに提供する。すなわち、本発明の抗体になされる多くの改変があり、CDRにおけるアミノ酸改変（親和性成熟）、Fc領域におけるアミノ酸改変、グリコシル化変異、他のタイプの共有結合修飾（例えば薬物複合体の結合のためなど）が含まれるが、それらに限定されるものではない。
本明細書における「変異体」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変により親ポリペプチドと異なるポリペプチド配列を意味する。一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号１もしくは２に記載の完全長の可変重鎖または軽鎖のいずれかである。アミノ酸改変は、置換、挿入および欠失を含むことができ、前者は多くの場合に好適である。
一般に、変異体は、抗体の機能が、本明細書に記載の通りに依然として存在する限り、いくつもの改変を含むことができる。したがって、本発明の変異抗体は、例えば、依然としてヒトマトリプターゼに特異的に結合しなくてはならない。同様に、アミノ酸変異がFc領域で発生した場合も、例えば、変異抗体は、抗体の特定の適用または指標に必要な受容体結合機能を維持しなくてはならない。
この場合の「変異」は、記載されている抗体のCDR配列、フレームワークまたはFc領域のいずれかにおいてなされ得る。
しかし、一般に、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸置換は、目的が、最小の数の改変で機能を変更することである場合に一般的によく利用されている。いくつかの場合、1〜5つの改変（例えば、個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失）で、1〜2つ、1〜3つおよび1〜4つでも、多くの実施形態での使用を見出す。改変の数は、改変される領域の大きさに依存し得る；例えば、一般的に少数の改変が、CDR領域において所望される。しかし、本明細書に示されているように、本明細書のA1のCDRは、いくらかのアミノ酸変化が行われても結合を保存することができるほど類似している。
アミノ酸改変の数は、機能ドメイン内であってもよいことに留意すべきであり；例えば、野生型または改変タンパク質のFc領域において1〜5つの改変を、ならびに、例えばFv領域において1〜5つの改変を有することが望ましい。変異ポリペプチド配列は、親配列に対して、好ましくは少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するであろう（例えば可変領域、定常領域、および／または重鎖および軽鎖配列A1）。配列の大きさに応じて、同一性の割合は、アミノ酸の数に依存することに留意すべきである。
VHおよび/またはVL CDR1、CDR2および/またはCDR3領域内の可変領域変異では、部位特異的変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発を実施して突然変異（単数または複数）を誘導することができ、そして結合する抗体、または関心のある他の機能特性への影響を、本明細書中に記載および実施例に提供されるようにin vitroまたはin vivoアッセイで評価することができる。好ましくは、（本明細書で説明するように）保存的変異が誘発される。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。また、典型的にはCDR領域内の1、2、3、4または5個以下の残基が変更される。
従って、別の実施形態において、本発明は、以下を含む単離された抗マトリプターゼモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、
（a）配列番号５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号５と比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列含むVH CDR1領域；
（b）配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号６と比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列含むVH CDR2領域；
（c）配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号７と比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列含むVH CDR3領域；
（d）配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号８と比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列含むVL CDR1領域；
（e）配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号９と比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列含むVL CDR2領域；
および（f）配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０と比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列含むVL CDR3領域。
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の、別のアミノ酸での置換を意味する。例えば、置換S100Aは、位置100のセリンがアラニンに置換されている変異ポリペプチドを意味する。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の付加を意味する。本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」は、後に改変されて変異体を生成する、改変されていないポリペプチドを意味する。一般的に、本明細書における親ポリペプチドは、A1である。したがって、本明細書において使用される「親抗体」とは、改変されて変異抗体を生成する抗体を意味する。
本明細書における「野生型」または「WT」または「天然」は、天然に見出され、対立遺伝子変異を含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。WTタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、IgGなどは、意図的には改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
本明細書における「変異Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸改変により野生型Fc配列のものとは異なるFc配列を意味する。Fc変異体は、Fcポリペプチドそれ自体、Fc変異ポリペプチドを含む組成物、またはそのアミノ酸配列を意味し得る。
いくつかの実施形態において、1つ以上のアミノ酸改変は、抗体（任意のA1）の1つ以上のCDRにおいてなされる。一般的に、1つまたは2つまたは3つのみのアミノ酸が任意の単一CDRにおいて置換され、そして一般的に、4、5、6、7、8、9または10より多い変更は、CDRのセット内ではなされない。しかし、任意のCDRにおける無置換、1、2または3つの置換の任意の組み合わせを、独立しておよび任意に他の置換と組み合わせることができることが理解されるべきである。いくつかの場合において、CDRにおけるアミノ酸改変は、「親和性成熟」と呼ばれる。「親和性成熟」抗体は、1つ以上のCDRにおいて1つ以上の変更があるものであり、これらの変更がない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。いくつかの場合、まれではあるが、その抗原に対する抗体の親和性を減少させることが望ましい場合があるが、これは一般に好ましくない。
親和性成熟を行い、抗原に対する抗体の結合親和性を、「親」抗体と比較して、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%もしくはそれ以上、または1、2、3、4〜5倍に増加させることができる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性を有することになる。親和性成熟抗体は、既知の方法により製造される。例えば、可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）ドメインのシャフリングによる親和性成熟を説明する非特許文献５３を参照。CDRおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば特許文献５４〜特許文献５８に記載されている。
あるいは、「サイレント」な、例えば抗原に対する抗体の親和性を著しく変化させないアミノ酸改変が、本発明の抗体の1つ以上のCDRにおいてなされ得る。これらは、発現を最適化するなど、多くの理由のためになされ得る（本発明の抗体をコードする核酸に対してなされ得るように）。
したがって、本発明のCDRおよび抗体の定義内に含まれるのは、変異CDRおよび抗体であり；すなわち、本発明の抗体は、アミノ酸改変を、A1の1つ以上のCDRで含むことができる。加えて、以下に概説されるように、アミノ酸改変はまた、独立しておよび任意にCDR外の領域で行われることができ、本明細書に記載されるように、フレームワーク領域および定常領域が含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗マトリプターゼ抗体は、変異Fcドメインで構成されている。当技術分野で知られているように、抗体のFc領域は、多くのFc受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される一連の重要な機能を付与する。これらのFc受容体には、（ヒトにおいて）アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（抗体依存性細胞傷害性（ADCC）に相関性のあるアロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、FcRn（新生児型受容体）、C1q（補体依存性細胞傷害（CDC）に関与する補体タンパク質）ならびにFcRn（血清半減期に関与する新生児型受容体）が含まれるが、これらに限定されない。適切な改変は、1つ以上の位置でなされてもよく、例えば特許文献１８に、そしてそこに引用されている文献、特許文献１９〜特許文献２８に一般的に概説されており、これらの全て、そして特にFc受容体への結合を増加させる特定のアミノ酸置換は、明示的に、参照によりその全体が組み込まれる。
上記で概説されている改変に加えて、他の改変も可能である。例えば、分子は、VHおよびVLドメインを繋げるジスルフィド架橋の導入により安定化され得る（非特許文献５９、参照によりその全体が組み込まれる）。
また、システインでの改変は、さらに後述するように、抗体-薬物複合体（ADC）の用途に特に有用である。いくつかの実施形態において、抗体の定常領域は、特に「チオール反応性」である1つ以上のシステインを含むように改変することができ、それによりより特異的かつ制御された薬物部分の配置を可能にする。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献２９を参照。
また、以下に概説するようになされ得る、種々の抗体の共有結合修飾がある。
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれ、一般的に、しかし常にではないが、翻訳後に行われる。例えば、抗体の共有結合修飾のいくつかのタイプは、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはN-もしくはC-末端残基と反応する能力のある有機誘導体化剤と反応させることにより、分子中に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα-ハロアセテート（および対応するアミン）と反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-塩化第二水銀安息香酸、2-塩化第二水銀-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールなどとの反応により誘導体化され得る。
ヒスチジル残基は、pH5.5〜7.0でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これはこの薬剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ-ブロモフェナシルブロミドも有用であり；反応は、好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウムにおいてpH6.0で行われる。
リシニルおよびアミノ末端残基を、コハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤での誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ-アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の適切な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソ尿素；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
アルギニル残基は、1つまたはいくつかの従来試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により改変される。アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ性条件下で行うことを必要とし、これはグアニジン官能基のpKaが高いためである。さらに、これらの試薬を、リジン基ならびにアルギニンイプシロン-アミノ基と反応させてもよい。
チロシル残基の特異的改変を、スペクトル標識をチロシル残基に導入することに特に関心をもって、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により行った。最も一般的には、N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、O-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロシル残基を、125Iまたは131Iを用いてヨウ素化し、ラジオイムノアッセイ、適切とされる上述のクロラミンT法で使用するための標識タンパク質を調製する。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（R'-N=C=N-R'）との反応により選択的に改変され、その中でRおよびR'は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドなどの任意に異なるアルキル基である。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
二官能性試薬での誘導体化は、以下に記載される方法に加えて、さまざまな方法で使用する不水溶性支持マトリックスまたは表面に抗体を架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸を有するエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル-3-[(P-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化中間体を産生する。あるいは、特許文献３０〜特許文献３５に記載の、全て参照によりその全体が組み込まれる、カニクイザルゲンブロマイド活性化炭水化物および反応性基質などの反応性水不溶性マトリックスが、タンパク質固定化に使用される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内である。
他の改変には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化（非特許文献６０、参照により全体が組み込まれる）、N末端アミンのアセチル化、ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
また、当業者により理解されるように、蛍光、酵素、磁気、放射性などを含む標識を全て、抗体（ならびに本発明のその他の組成物）に添加することができる。
（二重特異性分子）
別の態様において、本発明は、本発明の抗マトリプターゼ抗体、またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体、またはその抗原結合部位を、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結し、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。本発明の抗体は、実際には、複数の他の機能分子に誘導体化または連結し、2つより多くの異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異的分子を生成することができ；そのような多重特異性分子はまた、本明細書で用いられる用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体を、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの1つ以上の他の結合分子に、二重特異性分子が生じるように機能的に連結することができる（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）。
したがって、本発明は、マトリプターゼに対する少なくとも1つの第一結合特異性、および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本発明の特定の一実施形態において、第二標的エピトープはFc受容体であり、例えばヒトFcγRI（CD64）またはヒトFcα受容体（CD89）である。したがって、本発明は、例えば単球、マクロファージまたは多形核細胞（PMN）などのFcγRまたはFcαR発現エフェクター細胞、およびマトリプターゼを発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、マトリプターゼ発現細胞からエフェクター細胞を標的とし、そしてマトリプターゼ発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成などの、Fc受容体媒介性エフェクター細胞活性を誘発する。
二重特異性分子が多重特異性である本発明の実施形態において、その分子は、抗Fc結合特異性および抗マトリプターゼ結合特異性に加えて、第三の結合特異性をさらに含むことができる。一実施形態において、第三の結合特異性は、抗増強因子（EF）部分、例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を増強させる分子である。「抗増強因子部分」は、例えば抗原または受容体などの所与の分子に結合する抗体、機能的抗体断片またはリガンドであってよく、それによりFc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定基の効果の増強をもたらす。「抗増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第一および第二の結合特異性が結合するエンティティとは異なるエンティティに結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、細胞傷害性T細胞に結合することができる（例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、または標的細胞に対する免疫応答を増強するような他の免疫細胞を介して）。
一実施形態において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAbまたは一本鎖Fvを含む、少なくとも1つの抗体またはその抗体断片を含有する。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体、または任意のその最小断片、例えばFv、もしくは、その内容が参照により組み込まれる特許文献３６に記載されるような一本鎖構築物などであってもよい。
一実施形態において、Fcγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合は、ヒト免疫グロブリンG（IgG）により遮断されない。本明細書で用いられる用語「IgG受容体」とは、染色体1上に位置するに8つのγ-鎖遺伝子のいずれかを意味する。これらの遺伝子は、3つのFcγ受容体クラス：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）に分類される、12回膜貫通型または可溶性受容体アイソフォームの全体をコードする。好ましい一実施形態において、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは、単量体IgG（108〜109M-1）に対して高い親和性を示す、72kDaの分子である。
特定の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の産生および特性評価は、特許文献３７および特許文献３８に記載されており、その教示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位でのFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIIIのエピトープに結合し、そしてこのようにして、それらの結合は、生理学的レベルのIgGにより実質的に遮断されない。本発明において有用な特異的抗FcγRI抗体は、mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62およびmAb 197である。mAb 32を産生するハイブリドーマは、アメリカ培養細胞系統保存機関のATCC寄託番号HB9469から入手可能である。他の実施形態において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22（H22）のヒト化形態である。H22抗体の産生および特性評価は、非特許文献６１および特許文献３９に記載されている。H22抗体産生細胞株は、HA022CL1の名称の下でアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され、寄託番号CRL 11177を有する。
さらに他の好ましい実施形態において、Fc受容体に対する結合特異性は、ヒトIgA受容体、例えばFc-アルファ受容体[FcαRI（CD89）]に結合する抗体により提供され、その結合は、好ましくはヒト免疫グロブリンA（IgA）により遮断されない。「IgA受容体」という用語は、染色体19上に位置する1つのα-遺伝子（FcαRI）の遺伝子産物を含むことを意図している。この遺伝子は、55〜110kDaの、いくつかの選択的にスプライシングされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。FcαRI（CD89）は、単球/マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上ではない。FcαRIは、IgA1およびIgA2の両方に対して中間の親和性（≒5×107M-1）を有し、それはG-CSFまたはGM-CSFなどのサイトカインへのばく露時に増加する［非特許文献６２］。4つのFcαRI特異的モノクローナル抗体は、A3、A59、A62およびA77として同定され、IgAリガンド結合ドメイン外のFcαRIに結合し、［非特許文献６３］に記載されている。
FcαRIおよびFcγRIは、本発明の二重特異性分子における使用に好ましいトリガー受容体であり、その理由は、それらが（1）主に免疫エフェクター細胞上、例えば単球、PMN、マクロファージおよび樹状細胞上で発現し；（2）高レベル（例えば、細胞あたり5,000〜100,000）で発現し；（3）細胞傷害活性（例えばADCC、食作用）のメディエーターであり；ならびに（4）それらを標的とする自己抗原を含む抗原の、抗原提示の増強を媒介するためである。
本発明の二重特異性分子において使用することができる抗体は、マウス、ヒト、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二重特異性分子は、構成結合特異性、例えば抗FcR、抗マトリプターゼ結合特異性を、当技術分野で知られている方法を用いて結合することにより調製することができる。例えば、それぞれの二重特異性分子の結合特異性を別々に生成し、そしてその後、互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を共有結合のために使用することができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（SATA）、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）が含まれる［例えば、非特許文献６４；非特許文献６５を参照］。その他の方法には、非特許文献６６〜非特許文献６８に記載されたものが挙げられる。好ましい結合剤は、SATAおよびスルホ-SMCCであり、両方ともピアスケミカル社（ロックフォード、イリノイ州）]から入手できる。
結合特異性が抗体である場合、それらを2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合させることができる。特に好ましい実施形態において、ヒンジ領域を改変し、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは1つを、結合の前に含むようにする。
あるいは、両結合特異性は同じベクター内にコードされ、同じ宿主細胞において発現および組み立てられてもよい。この方法は、二重特異性分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、1つの一本鎖抗体と結合決定とを含む一本鎖分子、または2つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも2つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製する方法は、例えば特許文献４０〜特許文献４８に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
それらの特異的標的に対する二重特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、FACS分析、バイオアッセイ（例えば成長阻害）、またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらアッセイの各々は、一般に、特定の目的のタンパク質-抗体複合物の存在を、目的の複合物に特異的な標識試薬（例えば抗体）を用いることにより検出する。例えば、FcR-抗体複合物は、例えば抗体-FcR複合物を認識し、そして特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を使用して検出することができる。あるいは、複合物は、任意の様々なその他のイムノアッセイを用いて検出することができる。例えば、抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（RIA）で使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献６９を参照）。放射性同位体を、γカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
（グリコシル化）
共有結合的改変の別のタイプは、グリコシル化の変更である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、1つ以上の改変グリコ型を含むように改変することができる。本明細書で使用する「改変グリコ型」は、抗体に共有結合される炭水化物組成物を意味し、ここで炭水化物組成物は親抗体のものと化学的に異なる。改変グリコ型は、エフェクター機能の増強または低減を含む様々な目的のために有用であり得るが、これに限定されるものではない。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、グリコシル化していない抗体）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。そのような炭水化物改変は、例えば抗体配列内のグリコシル化の1つ以上の部位を変化させることにより達成することができる。例えば、1つ以上のアミノ酸置換により、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除がもたらされ、それによりその部位でのグリコシル化を排除することができる。そのような非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのようなアプローチは、Coらによる特許文献４９および特許文献５０にさらに詳細に記載されており、位置297のアスパラギンを除去することにより達成することができる。
改変グリコ型の好ましい形態は非フコシル化であり、これは、おそらくFcγRIIIa受容体へのより強固な結合を通して、ADCC機能の増加に相関することが示されている。この文脈において、「非フコシル化」は、宿主細胞中で産生された抗体の大部分が実質的にフコースを含まないことを意味し、例えば生成された抗体の90〜95〜98%は、感知できるほどのフコースを抗体の炭水化物部分の構成成分として持たない（一般的にFc領域のN297に結合されている）。機能的に定義すると、非フコシル化抗体は一般的に、FcγRIIIa受容体に対して少なくとも50%またはより高い親和性を示す。
改変グリコ型は、当技術分野で知られている様々な方法により生成することができる（非特許文献７０〜非特許文献７３；特許文献５１〜特許文献５７、全て参照によりその全体が組み込まれる；（ポテリジェント（登録商標）技術［バイオワ社、プリンストン、ニュージャージー州］；GlycoMAb（登録商標）グリコシル化工学技術［グリカートバイオテクノロジーAG、チューリッヒ、スイス］）。これら技術の多くは、Fc領域に共有結合しているフコシル化および／またはバイセクティングオリゴ糖のレベルを制御することに基づいており、例えば、IgGを、改変された、または別の方法を受けた、様々な生物または細胞株において発現することにより（例えばLec-13 CHO細胞またはラットハイブリドーマYB2/0細胞、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、FUT8[α1,6-フコシルトランスエラーゼ]および／またはβ1-4-N-アセチルグルコサミン転移酵素III [GnTIII]を調節することにより）、またはIgGが発現された後に炭水化物（単数または複数）を改変することによる。例えば、「糖改変抗体」または、製造中のフコシル化を阻害する改変糖を添加することによる、シアトルジェネティクス機能の「SEA技術」；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献５８を参照。「改変グリコ型」は、典型的には、グリコシル化技術なしで生成された抗体と比較して異なる炭水化物またはオリゴ糖を意味し；したがって抗体は、改変グリコ型を含めることができる。
あるいは、改変グリコ型は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むIgG変異体を意味し得る。当技術分野で知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で説明する、特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）、またはタンパク質がその中で産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系を以下に説明する。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を意味する。Xがプロリンを除く任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出する。O結合型グリコシル化は、糖の1つ、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、もしくはキシロースの、ヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列を変化させることにより便宜的に達成され、それが1つ以上の上述のトリペプチド配列（N結合型グリコシル化部位について）を含むようにする。その変更はまた、開始配列へ1つ以上のセリンまたはスレオニン残基を添加することにより、またはそれらで置換することにより行われてもよい（O結合型グリコシル化部位について）。容易にするために、抗体のアミノ酸配列を、好ましくは、DNAレベルでの変化を介して変更し、特に予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするDNAを変異させることにより、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるようにする。
抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの方法は、それらがN-およびO-結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有するタンパク質の産生を、宿主細胞において必要としないという点で有利である。使用されるカップリングモードに応じて、糖（単数または複数）を、（a）アルギニンおよびヒスチジン、（b）遊離カルボキシル基、（c）システインのなどの遊離スルフヒドリル基、（d）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのなどの遊離ヒドロキシル基、（e）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのなどの芳香族残基、または（f）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、特許文献５９および非特許文献７４に記載されており、両方とも参照によりその全体が組み込まれる。
出発抗体（例えば、翻訳後）に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、タンパク質の、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのばく露を必要とする。この処理は、ポリペプチドは無傷のままで残しながら、結合糖（N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、非特許文献７５および非特許文献７６に記載されており、両方ともその全体が参照により組み込まれる。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、その全体が参照により組み込まれる非特許文献７７に記載のように、種々のエンド-およびエキソ-グリコシダーゼの使用により達成することができ、当技術分野で知られているように、フコシダーゼ酵素を用いるフコース残基の除去が含まれる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、参照によりその全体が組み込まれる非特許文献７８に記載のように、化合物ツニカマイシンの使用により防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質-N-グリコシド結合の形成を阻害する。
抗体の共有結合修飾の別のタイプは、抗体を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの種々のポリオールを含むが、これらに限定されるものではない様々な非タンパク質性ポリマーに、例えば、ネクター・セラピューティクス社からの2005年〜2006年PEGカタログ（ネクターのウェブサイトで入手可能）、全て参照によりその全体が組み込まれる特許文献６０〜特許文献６５に記載の方法で結合させることを含む。加えて、当技術分野で知られているように、アミノ酸置換は抗体内のさまざまな位置で発生し、PEGなどのポリマーの付加を容易にし得る。例えば、参照によりその全体が組み込まれる特許文献６６を参照。
さらなる実施形態において、例えば診断または検出目的のための本発明の抗体の使用において、抗体は標識を含み得る。本明細書における「標識」は、化合物が、その化合物の検出を可能にするために結合された少なくとも1つの元素、同位体または化学化合物を有することを意味する。一般に、標識は3つのクラスに分類される：a）放射性同位体または重同位体であってもよい同位体標識；b）磁気、電気、熱；およびc）着色または発光色素；とはいえ、標識は酵素または磁性粒子などの粒子も同様に含む。好ましい標識には、蛍光性ランタニド錯体（ユーロピウムおよびテルビウムのを含む）、ならびに、量子ドット、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、テキサスレッド、アレクサ色素は、Cy色素、および、明示的に参照により本明細書に組み込まれる非特許文献７９に記載されているその他のものを含むが、これらに限定されない蛍光標識が挙げられるが、これらに限定されない。
（抗体-薬物複合体）
いくつかの実施形態において、本発明の抗マトリプターゼ抗体は薬剤と結合され、抗体-薬物複合体（ADC）を形成する。一般に、ADCは腫瘍学用途に使用され、そこでは細胞毒性または細胞増殖抑制剤の局所送達のための抗体-薬物複合体の使用は、より高い有効性、より低い毒性などをもたらすことができる薬物部分の腫瘍への標的化送達を可能にする。この技術の概要は、非特許文献８０〜非特許文献８２において提供されており、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
したがって本発明は、薬物に結合した抗マトリプターゼ抗体を提供する。一般的に、以下にさらに説明するように、結合は抗体への共有結合により行われ、そして一般的にリンカー、多くの場合、ペプチド結合に依存する（後述のように、プロテアーゼによる標的部位での切断に対して感受性があるまたはないように設計され得る）。また、上述したように、リンカー-薬物単位（LU-D）の結合は、抗体中のシステインへの結合により行うことができる。当業者により理解されるように、抗体当たりの薬物部分の数は反応条件に応じて変更することができ、そして1：1〜10：1に薬物：抗体を変化させることができる。当業者により理解されるように、実際の数値は平均値である。
したがって本発明は、薬物に結合した抗マトリプターゼ抗体を提供する。以下に説明するように、ADCの薬物は、化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、酵素的に活性な、細菌、真菌、植物、または動物由来の毒素、もしくはその断片）などの細胞傷害性薬剤を含むが、これらに限定されない任意の数の薬剤であってもよく、または、放射性同位体（すなわち、放射性結合）が提供される。他の実施形態において、本発明は、ADCの使用方法をさらに提供する。
本発明において使用される薬物には、細胞毒性薬、特にがん治療に使用されるものが挙げられる。そのような薬剤には、一般的に、DNA損傷剤、代謝拮抗物質、天然産物およびそれらの類似体が含まれる。細胞毒性剤の典型的なクラスには、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤およびチミジル酸合成酵素阻害剤などの酵素阻害剤、DNAインターカレーター、DNA開裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘発剤、ならびにタキソールが含まれる。
これらのクラスのメンバーには、例えば、タキソール、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン（leurosideine）、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、およびエトポシドまたはリン酸エトポシドなどのポドフィロトキシン誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテールレチノイン酸を含むタキサン、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン、エン-ジイン、デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、カリケアマイシン、カンプトテシン、ヘミアステリン、メイタンシノイド（DM1を含む）、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）、およびメイタンシノイド（DM4）ならびにそれらの類似体が含まれる。
毒素は、抗体-毒素複合体として使用され、そしてジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素（非特許文献８３〜非特許文献８５）、メイタンシノイド（特許文献６７；非特許文献８６）、およびカリケアマイシン（非特許文献８７；非特許文献８８）が含まれ得る。毒素は、チューブリン結合、DNA結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムにより、それらの細胞毒性および細胞増殖抑制効果を及ぼし得る。
抗マトリプターゼ抗体と、メイタンシノイド、ドラスタチン、ヘミアステリン、アウリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、およびCC1065などの1つ以上の小分子毒素、ならびに毒素活性を有するこれら毒素の誘導体との複合体が考えられる。好ましい実施形態において、毒素はアウリスタチンであり、より好ましくはMMAEまたはMMAFである。
（複合体の例）
本発明の抗体Z(SH)mを使用する複合体の例（mは1、2、3、4、または5である）を以下に示す。複合体A1〜A6およびA8〜A15は、切断可能な基Cがペプチド結合を含む複合体である。複合体A7およびA16は、切断可能な基Cがヒドラゾンである複合体である。複合体A17およびA18は、切断可能な基Cがジスルフィドである複合体である。複合体A1〜A2、A5〜A9、A11〜A14、およびA16において、パートナー分子Dは、それに結合したプロドラッグ部分を有する細胞毒素である。複合体A10、A11、A14、およびA15は、自壊性部分を有する複合体である（複合体A10の場合は2つ）。複合体A1〜A8およびA10〜A18は、モジュラーセグメントを有するスペーサーの使用を示す。
















前述の式において、存在する場合、
HalはClまたはBrであり、そしてR30は、カルボキシルエステラーゼ切断可能な以下に示すカルバメートプロドラッグ基：

である。
（複合体の調製）
本発明の複合体は、好ましくは、最初にパートナー分子Dおよびリンカー(XZ)aC(XD)bを結合させ、部分D(XZ)aC(XD)b R31を形成することにより調製され、ここでR31は、抗体Z上の官能基と反応し、複合体を形成するのに適した官能基である。適切な基R21の例には、以下が含まれる：

ここでR32はCl、Br、F、メシレート、またはトシレートであり、
そしてR33はCl、Br、I、F、OH、O、N個のスクシンイミジル、O(4-ニトロフェニル)、Oペンタフルオロフェニル、又は-Oテトラフルオロである。適切な部分D(XZ)aC(XD)b R31の製造は、Ngら、特許文献６８（2006）；Ngら、特許文献６９（2006）；Ngら、特許文献７０（2006）；Ngら特許文献７１（2002）；Boydら、特許文献７２（2006）；Chenら、特許文献７３（2006）；Gangwarら、特許文献７４（2006）；Boydら、特許文献７５（2007）；Gangwarら、特許文献７６（2007）；Gangwarら、特許文献７７（2007）；Sufiら、特許文献７８（2008）WO；およびChenら、2008年2月20日に提出された特許文献７９に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
好ましい実施形態（式M）において、R31はマレイミド基であり、そして、以下に示すように、抗体Z上の官能基はチオール基であり、HalがClである複合体A-2および抗体Z(SH)mを使用する：
以下は例示的な手順であり、抗体への遊離チオール基の導入に基づき、そのリジンεアミノ基の2-イミノチオランとの反応、その後に続く、R31がマレイミドである薬物-リンカー部分D (XZ)aC(XD)b R31との反応による。最初に抗体を、50mMのNaClおよび2mMのDTPAを含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に緩衝液交換し、5〜10mg/mLにまで濃縮した。2-イミノ-チオランの抗体への添加により、チオール化が達成される。添加する2-イミノチオランの量は予備実験により決定され、抗体によって変化し得る。予備実験では、2-イミノチオランの増加量の滴定を抗体に付加し、1時間室温での抗体とのインキュベーション後、抗体を50mM、pH6.0のHEPES緩衝液中でSephadex G-25カラムを用いて脱塩し、そして導入されたチオール基の数を、ジチオジピリジン（DTDP）と反応させることにより速やかに決定した。チオール基のDTDPとの反応はチオピリジンの遊離をもたらし、これは324nmで分光学的に観察することができる。0.5〜1.0mg/mlのタンパク質濃度の試料を典型的に使用する。280nmでの吸光度を使用して試料中のタンパク質の濃度を正確に決定することができ、その後各サンプル中のアリコート（0.9mL）を、0.1mLのDTDP（エタノール中5mMストック溶液）と共に、10分間室温でインキュベートする。DTDPを加えた緩衝液のみの空試料も同時にインキュベートする。10分後、324nmでの吸光度を測定し、チオール基の数を、19,800M-1のチオピリジンの吸光係数を使用して定量する。
典型的には、抗体当たり3チオール基のチオール化レベルが、この手順で求められている。例えば、いくつかの抗体を用い、2-イミノチオランの15倍モル過剰の添加に続く室温での1時間のインキュベートにより、これを達成することができる。抗体をその後、2-イミノチオランと共に所望のモル比でインキュベートし、その後結合緩衝液（5mMのグリシンおよび2mMのDTPAを含有する50mM、pH6.0のHEPES緩衝液）に脱塩した。上記のように導入されたチオールの数を定量する間、チオール化材料は氷上で保管する。
導入されたチオールの数の確認の後、薬物-リンカー部分D(XZ)aC(XD)b R31を、チオールあたり3倍モル過剰で添加する。結合反応を、5%の最終濃度のジメチルスルホキシド（DMSO）または類似の代替溶媒を含有する結合緩衝液中で進行させる。通常、薬物-リンカーストック溶液を100%DMSOに溶解させる。ストック溶液を、最終濃度を10%にするように加えられた十分なDMSOを有するチオール化抗体に直接添加するか、または10%DMSOの最終濃度を含有する結合緩衝液に予め希釈し、その後等量のチオール化抗体を添加する。
結合反応混合液を、室温で2時間撹拌しながらインキュベートする。インキュベーション後、結合反応混合液を遠心分離し、0.2μmのフィルターに通して濾過する。複合体の精製は、クロマトグラフィーにより、多くの方法を使用して達成することができる。1つの方法では、5mMグリシンおよび50mMのNaClを含有する50mM、pH7.2のHEPES緩衝液で予め平衡化したSephacryl S200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、複合体を精製する。クロマトグラフィーを、28cm/hの線形流速で実施する。複合体を含む画分を集め、プールし、濃縮する。別の方法では、精製を、イオン交換クロマトグラフィーにより達成することができる。条件は抗体によって異なり、それぞれの場合において最適化されるべきである。例えば、抗体-薬物結合反応混合液を、5mMのグリシンを含有する50mM、pH5.5のHEPESで予め平衡化したSP-Sepharoseカラムに添加する。抗体複合体を、0〜1MのNaClの勾配を用いて、pH5.5の平衡化緩衝液中で溶出する。複合体を含有する関連画分をプールし、調合緩衝液（5mMのグリシンおよび100mMのNaClを含む50mM、pH7.2のHEPES緩衝液）に対して透析する。
当業者は、上記の条件および方法は例示的かつ非限定的であり、そして抗体を結合させるための他の方法は当技術分野で知られており、本発明で使用できることを理解するであろう。
（メイタンシノイド）
メイタンシノイド薬物部分としての使用に適したメイタンシン化合物は、当技術分野においてよく知られており、既知の方法に従って天然の供給源から単離することができ、遺伝子工学技術（非特許文献８９を参照）、または既知の方法に従って合成的に調製されたメイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を用いて製造することできる。以下に説明するように、薬物は、抗体との結合のためのチオールまたはアミン基などの機能的に活性な基を組み込むことにより改変され得る。
例示的なメイタンシノイド薬物部分には、改変された芳香環を有するもの：C-19-デクロロ（特許文献８０）（アンサマイトシン（ansamytocin）P2の水素化アルミニウムリチウム還元により調製）；C-20-ヒドロキシ（またはC-20-デメチル）+/-C-19-デクロロ（特許文献８１および特許文献８２）（ストレプトミセスもしくは放線菌を使用する脱メチル化、またはLAHを使用する脱塩素化により調製）；およびC-20デメトキシ、C-20-アシルオキシ（-OCOR）、+/-デクロロ（特許文献８３）（塩化アシルを使用するアシル化により調製）ならびに他の位置に改変を有するものなどが挙げられる。
例示的なメイタンシノイド薬物部分にはまた、改変を有するもの：C-9-SH（特許文献８４）（メイタンシノールのH2SまたはP2S5との反応により調製）；C-14-アルコキシメチル（デメトキシ／CH2OR）（特許文献８５）；C-14-ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（CH2OHまたはCH2OAc）（特許文献８６）（ノカルジアから調製）；C-15-ヒドロキシ／アシルオキシ（特許文献８７）（メイタンシノールのストレプトミセスによる変換により調製）；C-15-メトキシ（許文献８８および許文献８９）（トレウィア ヌドルフロラ（Trewia nudlflora）から単離）；C-18-N-デメチル（特許文献９０および特許文献９１）（メイタンシノールのストレプトミセスによる脱メチル化により調製）；および4,5-デオキシ（特許文献９２）（メイタンシノールの三塩化チタン／LAH還元により調製）などが含まれる。
特に有用なのは、DM1（特許文献９３に開示され、参照により組み込まれる）およびDM4（特許文献９４に開示され、参照により組み込まれる）である。特許文献９５〜特許文献１０４の多くの追加的メイタンシノイド誘導体および方法を参照し、これらの全ては、その全体が、明示的に参照により組み込まれる。
メイタンシノイドを含むADC、その製造方法、およびそれらの治療的使用は、例えば特許文献９３；特許文献９５；特許文献１０１；および特許文献１０５に開示されており、それらの開示は、明示的に参照により本明細書に組み込まれる。非特許文献８６は、ヒト結腸直腸がんに対するモノクローナル抗体C242に結合したDM1に指定されたメイタンシノイドを含むADCを記述した。複合体は、培養結腸がん細胞に対して高度に細胞毒性であることが見出され、そしてin vivo腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。
非特許文献９０は、ADCを記述し、そこではメイタンシノイドを、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸がん細胞株上の抗原に結合するマウス抗体A7に、またはHER-2/neuがん遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合させた。TA.1-メイタンシノイド複合体の細胞毒性は、in vitroで、細胞当たり3×105個のHER-2表面抗原を発現するヒト乳がん細胞株SK-BR-3において試験された。薬物複合体は、遊離メイタンシノイド剤に類似の細胞障害度を達成し、これは抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増やすことにより増加され得る。A7-メイタンシノイド複合体は、マウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
（アウリスタチンおよびドラスタチン）
いくつかの実施形態において、ADCは、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド類似体および誘導体、アウリスタチンに結合した抗マトリプターゼ抗体を含む（特許文献１０６；特許文献１０７）。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、ならびに核および細胞の分裂に干渉し（非特許文献９１）、そして抗がん活性（特許文献１０８）および抗真菌活性（非特許文献９２）を有することが示されている。ドラスタチンまたはアウリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のN（アミノ）末端またはC（カルボキシル）末端を介して抗体に結合され得る（特許文１０９）。
例示的なアウリスタチンの実施形態としては、N末端結合したモノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDFが挙げられ、非特許文献９３に開示されており、そして特許文献１１０に記載されており、その開示は、その全体が明示的に参照により組み込まれる。
例示的なアウリスタチンの一実施形態は、MMAEである（その全体が明示的に参照により組み込まれる特許文献１１１を参照）。
別の例示的なアウリスタチンの一実施形態はMMAFである、（その全体が明示的に参照により組み込まれる、特許文献１１２〜特許文献１１４）。
MMAEまたはMMAFおよび様々なリンカー成分（本明細書中にさらに記載）を含むさらなる例示的な実施形態は、以下の構造および略称を有する（ここで、Abは抗体を意味し、そしてpは1〜約8、例えば1、2、3、4、5、6、7または8である）。
典型的に、ペプチドベースの薬物部分は、2つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片間でペプチド結合を形成することにより調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば液相合成法に従って調製することができ（非特許文献９４を参照）、それはペプチド化学の分野でよく知られている。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、特許文献１０６；特許文献１０７；非特許文献９５；非特許文献９６；非特許文献９７；非特許文献９８；非特許文献９９の方法に従って調製され得る。
（カリケアマイシン）
他の実施形態において、ADCは、1つ以上のカリケアマイシン分子に結合された本発明の抗体を含む。例えば、マイロターグは最初の商用ADC薬物であり、カリケアマイシンγ1をペイロードとして利用する（その全体が参照により組み込まれる、特許文献１１５を参照）。さらなるカリケアマイシン誘導体は、特許文献１１６〜特許文献１２２に記載されており、全て明示的に参照により組み込まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、二本鎖DNA切断をピコモル以下の濃度で引き起こす能力がある。カリケアマイシンファミリーの複合体の調製については、特許文献１２３、特許文献１２４、特許文献１１９、特許文献１２１、特許文献１２５、特許文献１２６、特許文献１２０、特許文献１２２（全てアメリカン・サイアナミッド社へ）を参照。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体としては、γ1I、α2I、α2I、N-アセチル-γ1I、PSAGおよびθI1（非特許文献８８、非特許文献１００、および上述したアメリカン・サイアナミッドの米国特許）が含まれるが、これらに限定されない。抗体が結合可能な別の抗腫瘍薬は、抗葉酸剤であるQFAである。カリケアマイシンおよびQFAの両方が細胞内の作用部位を有し、そして形質膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介性内在化によるこれらの薬剤の細胞への取り込みは、それらの細胞障害効果を大きく向上させる。
（デュオカルマイシン）
CC-1065（参照により組み込まれる、特許文献１２７を参照）およびデュオカルマイシンは、ADCに利用される抗腫瘍性抗生物質のファミリーのメンバーである。これらの抗生物質は、副溝中のアデニンのN3での配列選択的DNAアルキル化を介して動作し、アポトーシスにつながる事象のカスケードを開始するようである。
デュオカルマイシンの重要なメンバーには、デュオカルマイシンA（特許文献１２８、参照により組み込まれる）およびデュオカルマイシンSA（特許文献１２９、参照により組み込まれる）、ならびに以下に記載されているような多くの類似体が含まれる：特許文献１３０、特許文献１３１、特許文献１２９；特許文献１３２；特許文献１３３；特許文献１３４；特許文献１３４；特許文献１３２；特許文献１２９；特許文献１３５、特許文献１３６、特許文献１３７、特許文献１３８、特許文献１３９、特許文献１４０、特許文献１４１、特許文献１４２、特許文献１４３、特許文献７０、特許文献１４４、および特許文献１４５、これらの全ては、明示的に参照により組み込まれる。
（その他の細胞毒性薬）
本発明の抗体と結合可能なその他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび5-フルオロウラシル、エスペラミシン（特許文献１２２）のと同様に特許文献１４６、特許文献１２６に記載のLL-E33288複合物と総称される既知薬剤のファミリーが含まれる。
使用可能な、酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌から）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが含まれる。例えば、1993年10月28日公開の特許文献１４７を参照。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物との間に形成されたADCをさらに考慮する（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ；DNaseなどのDNAエンドヌクレアーゼ）。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高放射性原子を含んでもよい。種々の放射性同位体が、放射性複合抗体の産生に利用可能である。例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体が挙げられる。
放射-またはその他標識が、既知の方法で複合体に導入され得る。例えば、ペプチドは生合成されてもよく、または水素の代わりに例えばフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成により合成されてもよい。Tc99mまたはI123、Re186、Re188およびIn111などの標識は、ペプチドのシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム-90は、リジン残基を介して結合することができる。ヨードゲン法（非特許文献１０３）を、ヨウ素-123を組み込むために使用することができる。非特許文献１０４では、その他の方法を詳細に説明している。
複数の抗体を含む組成物のために、薬物負荷を、p、抗体あたりの薬物分子の平均数で表す。薬物負荷は、抗体当たり1〜20の薬物（D）に及び得る。結合反応の調製における抗体当たりの薬物の平均数は、質量分析、ELISAアッセイ、およびHPLCなどの従来の手段により特性評価することができる。抗体-薬物複合体の定量的分布も、P単位で決定され得る。
いくつかの例では、pが他の薬物負荷を有する抗体-薬物複合体から一定値である均一な抗体-薬物複合体の分離、精製、および特性評価は、逆相HPLCまたは電気泳動などの手段により達成され得る。例示的な実施形態において、pは2、3、4、5、6、7、もしくは8またはその分数である。
抗体-薬物複合体化合物の生成は、当業者に知られている任意の技術により達成することができる。簡潔に述べると、抗体-薬物複合体化合物は、抗体単位としての抗マトリプターゼ抗体、薬物、および任意に、薬物と結合剤とを結ぶリンカーを含むことができる。
多くの異なる反応が、薬剤および／またはリンカーの結合剤への共有結合のために利用可能である。これは、結合剤のアミノ酸残基、例えば、リジンのアミノ基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な部分を含む抗体分子の反応により達成することができる。一般的に使用される、共有結合の非特異的な方法は、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に連結させるカルボジイミド反応である。さらに、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性試薬が、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に連結させるために使用されてきた。
また、薬物の結合剤への結合に利用可能なのは、シッフ塩基反応である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸酸化を伴い、それによりアルデヒドが形成され、次いで結合剤と反応する。結合は、結合剤のアミノ基でのシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートも、薬物を結合剤に共有結合させるためのカップリング剤として使用することができる。その他の技術は、当業者によく知られており、本発明の範囲内である。
いくつかの実施形態において、リンカーの前駆体である中間体を、適切な条件下で薬物と反応させる。他の実施形態において、反応基は、薬物および／または中間体上で使用される。薬物および中間体、または誘導体化薬物との間の反応の生成物を、続いて本発明の抗マトリプターゼ抗体と、適切な条件下で反応させる。
所望の化合物への化学的改変が、本発明の複合体を調製する目的で、その化合物の反応をより便利にするために行われ得ることが理解される。例えば、アミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリルなどの官能基を、薬物の活性またはその他の特性への影響を最小限または許容可能にする位置で、薬物に付加することができる。
（リンカー単位）
典型的には、抗体-薬物複合体化合物は、薬物単位と抗体単位との間にリンカー単位を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内または細胞外条件下で切断可能であり、リンカーの切断が、適切な環境で抗体から薬物単位を放出するようになっている。例えば、特定のプロテアーゼを分泌する固形腫瘍は、切断可能なリンカーの標的としての役割を果たしうる；他の実施形態において、利用されるのは細胞内プロテアーゼである。さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、例えばリソソームにおける抗体分解により、薬物が放出される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも2つのアミノ酸長、または少なくとも3つのアミノ酸長、またはそれ以上である。
切断剤には、限定されないが、カテプシンBおよびDならびにプラスミンが含まれ、これらの全ては、標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすジペプチド薬物誘導体を加水分解することが知られている（例えば、非特許文献１０５を参照）。マトリプターゼ発現細胞に存在する酵素により切断可能なペプチジルリンカー。例えば、がん組織において高度に発現されている、チオール依存性プロテアーゼのカテプシンBにより切断可能なペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Phe-LeuまたはGly-Phe-Leu-Glyリンカー（配列番号X））。そのようなリンカーの他の例は、例えば特許文献１４８に記載されており、参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Val-CitリンカーまたはPhe-Lysリンカーである（例えば、Val-Citリンカーでのドキソルビシンの合成を記述する特許文献１４８を参照）。
他の実施形態において、切断可能なリンカーはpH感受性であり、すなわち、特定のpH値における加水分解に敏感である。典型的に、pH感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス-アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、特許文献１４９〜特許文献１５１；非特許文献１０５；非特許文献１０６を参照）。そのようなリンカーは、血液中のような中性pH条件下では比較的安定であるが、pH5.5または5.0、おおよそリソソームのpHより低いと不安定である。特定の実施形態において、加水分解性リンカーはチオエーテルリンカーである（例えば、治療剤にアシルヒドラゾン結合を介して結合したチオエーテルなど（例えば、特許文献１５１を参照）。
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で知られており、例えば、SATA（N-スクシンイミジル-5-アセチルチオアセテート）、SPDP（N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート）、SPDB（N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート）およびSMPT（N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン）-、SPDBおよびSMPTを用いて形成されるものなどが挙げられる（例えば、非特許文献１０７；非特許文献１０８を参照）。また、特許文献１５２を参照。
他の実施形態において、リンカーはマロン酸リンカー（非特許文献１０９）、マレイミドベンゾイルリンカー（非特許文献１１０）、または3'-N-アミド類似体（非特許文献１１１）である。
さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、そして薬物は、抗体分解により放出される（参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる特許文献１１２を参照）。
多くの実施形態において、リンカーは自壊性である。本明細書で使用する場合、用語「自壊性スペーサー」とは、2つの離れている化学部分を共に共有結合させて安定した三部構成分子にする能力のある二官能性化学部分を意味する。その第一の部分への結合が切断される場合、それは自発的に第二の化学部分から分離する。例えば、薬物および切断可能な基質が、任意に自壊性リンカーを介して結合されている薬物-切断可能な基質の複合体を対象とし、全て明示的に参照により組み込まれる特許文献７７、特許文献１５３、特許文献１５４、特許文献１５５、特許文献１４０、特許文献１３９、特許文献１５６、特許文献１５７および特許文献１５８を参照。
多くの場合、リンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性ではない。本明細書中で使用する場合、「細胞外環境に対して実質的に感受性でない」とは、リンカーの文脈において、抗体-薬物複合体化合物が細胞外環境（例えば、血漿中）に存在する場合、抗体-薬物複合体化合物の試料中の、約20%、15%、10%、5%、3%以下、または約1%以下のリンカーが切断されることを意味する。
リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性ではないかどうかは、例えば、血漿を用いて抗体-薬物複合体化合物を所定時間（例えば、2、4、8、16、または24時間）インキュベートし、そしてその後血漿中に存在する遊離薬物の量を定量することにより、判定することができる。
他の、非相互排他的な実施形態において、リンカーは細胞内在化を促進する。特定の実施形態において、リンカーは、治療剤に結合した際、細胞内在化を促進する（すなわち、本明細書に記載のように、抗体-薬物複合体化合物のリンカー-治療剤部分の環境で）。さらに他の実施形態において、リンカーは、アウリスタチン化合物および本発明の抗マトリプターゼ抗体の両方に結合した際、細胞内在化を促進する。
本発明の組成物および方法で使用することができる種々の例示的なリンカーが、特許文献１５９、特許文献１６０、特許文献１１２、および特許文献１６１に記載されている（その各々は、参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。
（薬物負荷）
薬物負荷はpで表され、分子中の抗体当たりの薬物部分の平均数である。薬物負荷（「P」）は、抗体当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の部分（D）であってもよく、とはいえしばしば、平均数は分数または小数である。一般的に、1〜4の薬物負荷がしばしば有用であり、1〜2もまた有用である。本発明のADCは、1〜20の範囲の薬物部分と結合した抗体のコレクションを含む。結合反応からのADCの調製物における抗体当たりの薬物部分の平均数は、質量分析およびELISAアッセイなどの従来の手段により特性評価され得る。
P単位でのADCの定量的分布も決定され得る。いくつかの例では、pが他の薬物負荷を有するADCから一定値である均質なADCの分離、精製、および特性評価は、電気泳動などの手段により達成され得る。
いくつかの抗体-薬物複合体では、pは抗体上の結合部位の数により制限され得る。例えば、上記の例示的実施形態と同様に、結合がシステインチオールである場合、抗体は1つまたは複数のみのシステインチオール基を有していてもよく、または、リンカーが介して結合し得る1つまたは複数のみの反応性チオール基を十分に有していてもよい。ある特定の実施形態において、より高い薬物負荷、例えばp>5は、特定の抗体-薬物複合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の損失を引き起こし得る。特定の実施形態において、本発明のADCの薬物負荷は、1〜約8；約2〜約6；約3〜約5；約3〜約4；約3.1〜約3.9；約3.2〜約3.8；約3.2〜約3.7；約3.2〜約3.6；約3.3〜約3.8；または約3.3〜約3.7の範囲である。実際、特定のADCでは、抗体当たりの薬物部分の最適比率は8未満であることがあり、そして約2〜約5であり得ることが示されている。特許文献１１２を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
特定の実施形態において、理論最大値よりも少ない薬物部分が、結合反応中に抗体に結合される。抗体は、例えば、以下に説明するように、薬物-リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含み得る。一般的に、抗体は、薬物部分に結合し得る遊離および反応性システインチオール基を多くは含まず；実際、抗体中のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態において、抗体は、ジチオスレイトール（DTT）またはトリカルボニルエチルホスフィン（TCEP）などの還元剤で、部分的または全体的な還元条件下で還元され、反応性システインチオール基を生成し得る。特定の実施形態において、抗体は変性条件にさらされ、リジンまたはシステインなどの反応性求核基を現す。
ADCの負荷（薬物／抗体比）は、異なる方法で制御される場合があり、例えば：（i）抗体に対する薬物-リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること、（ii）結合反応の時間または温度を制限すること、（iii）システインチオール改変のための部分的または限定的還元条件、（iv）抗体のアミノ酸配列を組換え技術により改変し、システイン残基の数および位置が、リンカー-薬物結合の数および／または位置の制御のために改変されるようにすることなどによる（本明細書および特許文献１６２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように調製されたチオMabまたはチオFabなど）。
1つより多くの求核基が、薬物-リンカー中間体またはリンカー試薬と、それに続く薬物部分試薬と反応する場合、そうして得られた生成物は、抗体に結合した1つ以上の薬物部分の分布を有するADC化合物の混合物であることが理解されるべきである。抗体当たりの薬物の平均数は、混合物から、抗体特異的かつ薬物特異的である二重ELISA抗体アッセイにより計算することができる。個々のADC分子は、質量分析により混合物中で同定され、そしてHPLC、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離され得る。
いくつかの実施形態において、単一の負荷値をもつ均質なADCは、結合混合物から、電気泳動またはクロマトグラフィにより単離することができる。
（ADCの細胞傷害効果を決定する方法）
薬物または抗体-薬物複合体が、細胞増殖抑制および／または細胞傷害効果を細胞上で発揮するかどうかを決定する方法が知られている。一般的に、抗体薬物複合体の細胞毒性または細胞増殖抑制作用は、抗体薬物複合体の標的タンパク質を発現する哺乳動物細胞を細胞培養培地中でばく露させ；細胞を約6時間〜約5日間培養し；そして細胞生存率を測定することにより測定することができる。細胞ベースのin vitroアッセイを使用し、生存率（増殖）、細胞傷害性、および抗体薬物複合体のアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定することができる。
抗体薬物複合体が細胞増殖抑制効果を発揮するかどうかを決定するために、チミジン取り込みアッセイが使用され得る。例えば、標的抗原を5,000細胞／ウェルの96ウェルプレーティング密度で発現するがん細胞を72時間培養し、そして0.5μCiの3H-チミジンに、72時間の最後の8時間の間にばく露させることができる。3H-チミジンの培養物の細胞への取り込みを、抗体薬物複合体の存在下および非存在下で測定する。
細胞毒性を決定するために、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を測定することができる。壊死は、典型的には、原形質膜の透過性の増加；細胞の膨潤、および原形質膜の破裂を伴う。アポトーシスは、典型的には、膜小疱形成、細胞質の凝縮、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化により特性評価される。がん細胞へのこれらのいずれかの効果の決定は、抗体薬物複合体ががんの治療に有用であることを示す。
細胞の生存率は、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはALAMAR（商標）ブルーなどの色素の細胞内の取り込みを測定することにより測定することができる（例えば、非特許文献１１２を参照）。そのようなアッセイでは、色素を含有する培地中で細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、そして色素の細胞取り込みを反映する残りの色素を、分光光度法で測定する。タンパク質結合色素スルホローダミンB（SRB）もまた、細胞毒性を測定するために使用することができる（非特許文献１１３）。
あるいは、死細胞ではなく生細胞を検出することによる哺乳動物細胞の生存および増殖の定量的比色アッセイに、MTTなどのテトラゾリウム塩を使用する（非特許文献１１４を参照）。
アポトーシスは、例えば、DNA断片化を測定することにより定量することができる。DNA断片化のin vitro測定における定量のための商業的測光方法が利用可能である。TUNEL（断片化DNA中の標識ヌクレオチドの取り込みを検出する）およびELISAベースのアッセイを含むそのようなアッセイの例は、非特許文献１１５に記載されている。
アポトーシスは、細胞の形態学的変化を測定することにより決定することもできる。例えば、壊死のように、原形質膜の完全性の喪失は、特定の色素（例えば、アクリジンオレンジまたは臭化エチジウムなどの蛍光色素など）の取り込みを測定することにより決定することができる。アポトーシス細胞の数を測定する方法は、非特許文献１１６により説明されてきた。細胞は、DNA色素（例えば、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、またはヨウ化プロピジウム）で標識することができ、そして細胞は、内核膜に沿ったクロマチン凝縮および辺縁趨向が観察され得る。アポトーシスの決定のために測定されるその他の形態学的変化には、例えば、細胞質の凝縮、膜小疱形成の増加、および細胞収縮が含まれる。
アポトーシス細胞の存在は、培養物の接着および「浮遊」区画の両方で測定することができる。例えば、両区画は、上清を除去し、接着した細胞をトリプシン処理し、遠心洗浄工程（例えば、2000rpmで10分）の後に調製物を合わせ、そしてアポトーシスを検出する（例えば、DNA断片化を測定することにより）ことにより回収することができる（例えば、非特許文献１１７を参照）。
in vivoでは、本発明の抗マトリプターゼ抗体の治療用組成物の効果を、適切な動物モデルで評価することができる。例えば、がん外植片または継代された異種移植片組織を、ヌードまたはSCIDマウスなどの免疫低下動物に導入した異種がんモデルを使用することができる（非特許文献１１８）。効能は、腫瘍形成、腫瘍退縮または転移などの阻害を測定するアッセイを用いて測定することができる。
前述の方法の実施において使用される治療用組成物を、所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物に製剤化することができる。適切な担体には、治療用組成物と組み合わされた際に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持する任意の材料が含まれ、一般的に、患者の免疫系とは非反応的である。例としては、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水などの、任意の多くの標準的な医薬担体が含まれるが、これらに限定されない（一般的に、非特許文献１１９を参照）。
（本発明の抗体を産生する方法）
本発明は、開示の抗マトリプターゼ抗体を産生する方法をさらに提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離された核酸（単数または複数）を含む宿主細胞を培養することを包含する。当業者により理解されるように、これは、抗体の性質に応じて種々の方法で行うことができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体が完全長の従来抗体、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域などであり、抗体が産生され、単離することができるようになっている条件下である場合。
抗体A1-A14の可変重鎖および軽鎖は、本明細書に開示されており（タンパク質および核酸配列の両方）；当技術分野で理解されるように、これらは容易に増加され、完全長の重鎖および軽鎖を生成することができる。すなわち、本明細書に概説されるようにVHおよびVKセグメントをコードするDNA断片が提供されると、これらDNA断片を標準的な組換えDNA技術によりさらに操作し、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、またはscFv遺伝子に変換することができる。これらの操作では、VKまたはVHをコードするDNA断片を、別のタンパク質をコードする、抗体定常領域などの別のDNA断片、または柔軟なリンカーに作動可能に連結させる。「作動可能に連結される」という用語は、この文脈で使用される場合、2つのDNA断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままとなるように、2つのDNA断片が連結されることを意味することを意図している。
VHをコードするDNAを、重鎖定常領域（CH1、CH2およびCH3）をコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより、VH領域をコードする単離されたDNAを、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。マウス重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており［例えば、非特許文献１２０を参照］、そしてこれら領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgDの定常領域であり得るが、最も好ましくはIgG1またはIgG4の定常領域であり得る。Fab断片重鎖遺伝子について、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に作動可能に連結することができる。
VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより、VL/VK領域をコードする単離されたDNAを、完全長軽鎖遺伝子（ならびにFab軽鎖遺伝子）に変換することができる。マウス軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており［例えば、非特許文献１２０を参照］、そしてこれら領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得ることができる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
scFv遺伝子を作製するために、VHおよびVL/VK配列が隣接一本鎖タンパク質として発現され、VL/VKおよびVH領域が柔軟なリンカーにより連結されるように、VHおよびVL/VKをコードするDNA断片を、柔軟なリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Gly4-Ser）3をコードする別の断片に作動可能に連結する［例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献１２１を参照］。
一般的に、核酸は、本発明の抗体をコードして提供される。そのようなポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域および定常領域の両方をコードし、とはいえ他の組み合わせもまた、本明細書に記載の組成物に応じて本発明により考慮される。本発明はまた、開示されたポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチド断片およびこれらポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を考慮する。
ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAの形態であってもよい。DNA、cDNA、ゲノムDNA、核酸類似体および合成DNAの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。DNAは、二本鎖または一本鎖であってもよく、そして、一本鎖の場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書において提供されるコード配列と同一であってもよく、または異なるコード配列であってもよく、その配列は、遺伝コードの重複または縮重の結果として、本明細書中において提供されるDNAと同一のポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸（単数または複数）は発現ベクターに組み込まれ、それは染色体外であってもよく、またはそれが導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計されてもよい。発現ベクターは、任意の数の適切な調節配列（転写および翻訳制御配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などを含むが、これらに限定されるものではない）またはその他の構成要素（選択遺伝子など）を含むことができ、これらの全ては、当技術分野で知られているように、作動可能に連結されている。いくつかの場合において、2つの核酸を使用し、それぞれを異なる発現ベクター内に入れるか（例えば重鎖を第一の発現ベクター内に、軽鎖を第二の発現ベクター内に）、またはあるいは、それらを同じ発現ベクター内に入れることができる。調節配列の選択を含む、発現ベクター（単数または複数）の設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることは、当業者により理解される。
一般に、核酸および／または発現を、適切な宿主細胞に導入して、選択された宿主細胞に適切な任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用い、核酸分子（単数または複数）が1つ以上の発現制御エレメント（例えば、ベクターにおいて、細胞内プロセスにより作製された構築物において、宿主細胞ゲノムに組み込まれている）に作動可能に連結するように、組換え宿主細胞を作製することができる。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下で維持することができ（例えば、誘導因子の存在下で、適切な非ヒト動物において、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などが補充された適切な培地中で）、それにより、コードされるポリペプチド（単数または複数）が産生される。いくつかの場合において、重鎖はある細胞において産生され、軽鎖は別の細胞において産生される。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で知られており、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）（マナサス、バージニア州）から入手可能される、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HEK 293細胞、NSO細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Hep G2）、および多くのその他の細胞株を含むが、これらに限定されない多くの不死化細胞株が挙げられる。細菌、酵母、昆虫、および植物を含むが、これらに限定されない非哺乳動物細胞を使用し、組換え抗体を発現させることもできる。いくつかの実施形態において、抗体を、牛やニワトリなどのトランスジェニック動物において産生することができる。
抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングの一般的な方法はよく知られており、例えば、特許文献１６３〜特許文献１６６、ならびに非特許文献１２２〜非特許文献１２５を参照のこと。
（医薬組成物）
別の態様において、本発明は、本発明の1つのマトリプターゼ抗体もしくはマトリプターゼ抗体の組み合わせ、またはその抗原結合部位（単数または複数）を含み、薬学的に許容される担体と共に製剤化されている組成物、例えば医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明の1つの抗体もしくは（例えば、2つ以上の異なる）抗体の組み合わせ、または免疫複合体もしくは二重特異性分を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体もしくは二重特異性）の組合せを含むことができる。
本発明の医薬組成物はまた、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも1つの他の抗腫瘍剤、または抗炎症剤もしくは免疫抑制剤と組み合わせた本発明の抗抗体を含むことができる。併用療法で使用できる治療剤の例は、本発明の抗体の使用に関する下記段落においてより詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性のあるものなどが含まれる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体、または二重特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸およびその他の自然条件の作用から化合物を保護する物質でコーティングされていてもよい。
本発明の医薬化合物は、1つ以上の薬学的に許容される塩を含んでいてもよい。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そして望ましくない毒性作用を与えない塩を意味する［例えば、非特許文献１２６を参照］。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸から、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性の有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から、ならびにN、N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性の有機アミンから誘導されるものが挙げられる。
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下が含まれる：（1）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（2）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤。
本発明の医薬組成物に使用できる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル類が挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでいてもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順により、および、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤の含有によることの両方により確保され得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい。加えて、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによりもたらされ得る。
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。任意の従来媒体または薬剤が活性化合物と不適合である限りを除いて、本発明の医薬組成物におけるそれら使用が考慮される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
治療用組成物は、典型的には、製造および保管条件下で無菌かつ安定でなければなりない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適するその他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物に含めることによりもたらすことができる。
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒中に、上記に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に、必要に応じて、滅菌精密濾過後に加えることにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌輸送体中に、活性化合物を加えることにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、予め濾過滅菌したその溶液から任意のさらなる所望の成分を得る真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）である。
担体材料と併用して単一剤形を製造することができる活性成分の量は、治療を受ける被験体、および特定の投与様式に応じて変化する。担体材料と併用して単一剤形を製造することができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般的に、100%のうち、この量は、薬学的に許容される担体と併用して、約0.01%〜約99%に及ぶ活性成分であり、好ましくは約0.1%〜約70%、最も好ましくは、約1%〜約30%に及ぶ活性成分である。
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または、治療状況の緊急性により示されるように、用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形は、治療を受ける被験体にとっての単位用量として適した、物理的に別個の単位を意味し；各単位は、所望の治療効果を生成するように計算された所定量の活性化合物を、必要な医薬担体と共に含む。本発明の単位剤形の仕様は、（a）活性化合物に固有の特性および目標とされる特定の治療効果、ならびに（b）個体における感受性の治療のための、そのような活性化合物を配合する技術につきものの制限により決定され、そしてそれらに直接依存している。
抗体の投与に関して、投与量は、約0.0001〜100mg/kg、そしてより一般的には、0.01〜5mg/kg宿主体重に及ぶ。例えば、投与量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重もしくは10mg/kg体重、または1〜10mg/kgの範囲内であってもよい。典型的な治療計画は、1週間に1回、2週間おきに1回、3週間おきに1回、4週間おきに1回、1か月に1回、3カ月おきに1回または3〜6ヶ月おきに1回の投与を必要とする。本発明の抗マトリプターゼ抗体に対する好ましい投与計画は、静脈内投与による、1mg/kg体重または3mg/kg体重の、以下の投与スケジュールのいずれかを使用して与えられる抗体を含む：（i）4週間おきに6回投与、その後は3ヶ月おきに；（iii）3週間おき；（iii）3mg/kg体重を1回、その後は1mg/kg体重を3週間おきに。
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する2つ以上のモノクローナル抗体は同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は示された範囲内にある。抗体は通常、複数回で投与される。1回の投与毎の間隔は、例えば、毎週、毎月、3ヶ月ごとまたは1年ごととすることができる。患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように、間隔は不規則であってもよい。いくつかの方法において、投与量は、血漿抗体濃度が約1〜1000μg/ml、およびいくつかの方法において約25〜300μg/mlとなるように調整される。
あるいは、抗体は徐放製剤として投与することができ、その場合には、低頻度の投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与の用量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかどうかに応じて変化し得る。予防的投与において、比較的低用量を、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与する。一部の患者は、一生治療を受け続ける。治療的投与において、疾患の進行が緩和または終結するまで、そして好ましくは、患者が、部分的または完全な疾患の症状の改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高用量が時には必要とされる。その後は、患者に予防的投与計画を施すことができる。
患者に対して毒性を持つことなく、特定の患者、組成物、および投与方法にとって所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように、本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを変化させることができる。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはそのアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、その他の薬物、化合物および／または使用される特定の組成物と併用して使用される材料、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および以前の病歴を含む種々の薬物動態の要因、ならびに医療分野でよく知られている要因によって決まる。
本発明の抗マトリプターゼ抗体の「治療有効用量」は、好ましくは疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛に起因する機能的障害もしくは身体障害の防止をもたらす。例えば、マトリプターゼ媒介性腫瘍の治療にとって「治療有効用量」は、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を少なくとも約20%、少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約40%、少なくとも約50%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%または少なくとも約90%、未治療の被験者に比べて阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、細胞増殖を阻害する化合物の能力を調べることにより評価することができ、そのような阻害は、in vitroで、当業者に知られているアッセイにより測定することができる。治療化合物の治療有効量は、腫瘍の大きさを減少させる、またはそうでなければ、被験体における症状を改善することができる。当業者は、対象の大きさ、被験体の症状の重症度、および特定の組成物または選択される投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
本発明の組成物は、1つ以上の投与経路を介して、当技術分野で知られている1つ以上の様々な方法を使用して投与することができる。当業者により理解されるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて変化する。本発明の抗体にとっての好ましい投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書において使用される表現「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、そして静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。
あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所的になどの非経口経路を介して投与することができる。
活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護する担体、例えばインプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は特許を取得ており、または一般に当業者に知られている［例えば、非特許文献１２７を参照］。
治療用組成物は、当技術分野で知られている医療器具を用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態において、本発明の治療用組成物は、特許文献１６７〜特許文献１７３に開示されている器具などの、無針皮下注射器具で投与することができる。本発明において有用な、よく知られているインプラントおよびモジュールの例には、制御された速度で投薬するための移植可能な微量注入ポンプを開示している特許文献１７４；皮膚を通して薬剤を投与するための治療器具を開示する特許文献１７５；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する特許文献１７６；連続的な薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する特許文献１７７；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する特許文献１７８；および浸透圧薬物送達システムを開示する特許文献１７９が含まれる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他のそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは、当業者に知られている。
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、in vivoでの適切な分布を確実にするために製剤化することができる。例えば、血液脳関門（BBB）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がBBBを通過することを確実にするために（必要なら）、それらを、例えばリポソーム中に製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、特許文献１８０〜特許文献１８２を参照。リポソームは、選択的に特定の細胞または器官に輸送され、したがって標的薬物送達を促進する1つ以上の部分を含んでいてもよい［例えば、非特許文献１２８を参照］。例示的な標的部分には、葉酸またはビオチン（例えば、特許文献１８３を参照）；マンノシド［非特許文献１２９］；抗体［非特許文献１３０；非特許文献１３１］；界面活性剤タンパク質A受容体［非特許文献１３２］；P120［非特許文献１３３］；非特許文献１３４；非特許文献１３５も参照。
（使用および方法）
本発明の抗体、抗体組成物ならびに方法は、マトリプターゼ媒介性障害の診断および治療を伴う、多くのin vitroおよびin vivoの診断上および治療上の有用性を有する。
いくつかの実施形態において、これらの分子を、培養中の細胞に、in vitroまたはex vivoで、またはヒト被験体に、例えばin vivoで投与し、種々の疾患を治療、予防および診断することができる。本明細書で使用する場合、用語「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい被験体には、マトリプターゼ活性により媒介される疾患を有するヒト患者が含まれる。方法は、異常なマトリプターゼ発現に関連する疾患を有するヒト患者を治療するのに特に適している。マトリプターゼに対する抗体が別の薬剤と共に投与される場合、その2つは、順番にまたは同時に投与することができる。
マトリプターゼに対する本発明の抗体の特異的結合を考慮すると、本発明の抗体を、細胞表面上のマトリプターゼの発現を特異的に検出するために使用することができ、そしてさらに、免疫親和性精製を介してマトリプターゼを精製するために使用することができる。
さらに、腫瘍細胞上のマトリプターゼの発現を考慮すると、本発明の抗体、抗体組成物および方法を、腫瘍形成性疾患、例えばマトリプターゼを発現する腫瘍細胞の存在により特徴づけられる、例えば胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんを含む疾患を有する被験体を治療するための医薬の製造において使用することができる。以下の実施例５および７に示されるように、マトリプターゼは抗体結合の際に内在化することが実証されており、したがって、本発明の抗体が、例えばADCのアプローチ、放射性免疫複合体、またはADEPTのアプローチなどの任意のペイロード作用機序で使用されるのを可能にする。
一実施形態において、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、ナノボディ、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物など）を使用して、マトリプターゼのレベル、またはその膜表面にマトリプターゼを含む細胞のレベルを検出し、そしてそのレベルを、特定の疾患症状と関連させることができる。あるいは、一般にADCとして投与される抗体を使用して、マトリプターゼの機能を阻害または遮断し、そうしてそれを特定の疾患症状の予防または改善に関連させ、それによりマトリプターゼは疾患のメディエーターとして関連があるとすることができる。これは、抗体とマトリプターゼとの間での複合物の形成を可能にする条件の下で、試料および対照試料を抗マトリプターゼ抗体と接触させることにより達成することができる。抗体とマトリプターゼとの間で形成された任意の複合物を検出し、試料および対照において比較する。
別の実施形態において、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）を、治療的または診断的なin vitroでの使用と関連する結合活性について、最初に試験することができる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例に記載のフローサイトメトリーアッセイを用いて試験することができる。
本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子、免疫複合体ならびに組成物）は、マトリプターゼ関連疾患の治療および診断において、さらなる有用性を持つ。例えば、モノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子および免疫複合体を使用して、in vivoまたはin vitroで1つ以上の以下の生物学的活性を誘発することができる：マトリプターゼを発現する細胞の増殖を阻害するおよび／またはそれらを死滅させる；ヒトエフェクター細胞の存在下でマトリプターゼを発現する細胞の食作用またはADCCを媒介する、またはマトリプターゼに結合するマトリプターゼリガンドを阻害する。
特定の実施形態において、抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）をin vivoで使用し、種々のマトリプターゼ関連疾患を治療、予防または診断する。マトリプターゼ関連疾患の例には、とりわけ、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんを代表とするヒトがん組織が含まれる。
本発明の抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫複合体）をin vivoおよびin vitroで投与するのに適切な経路は、当該技術分野でよく知られており、そして当業者により選択されることができる。例えば、抗体組成物を、注射（例えば、静脈内または皮下）により投与することができる。使用される分子の適切な投与量は、被験体の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および／または剤型によって決まる。
前述のように、本発明の抗マトリプターゼ抗体は、1つ以上の他の治療薬、例えば細胞毒性剤、放射毒性剤または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体を、薬剤に結合させることができ（免疫複合物として）、または薬剤とは別々に投与することができる。後者の場合（別々の投与）において、抗体は、薬剤の前後、またはそれと同時に投与することができ、または他の既知の治療法、例えば抗がん療法、例えば放射線と同時に投与することができる。そのような治療剤には、とりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの抗腫瘍剤が含まれ、これらは、それ自体では、患者に対して毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である。シスプラチンは、100mg/kgを4週間おきに1回の投与量として静脈内投与され、そしてアドリアマイシンは、60〜75mg/mlを21日おきに1回の投与量として静脈内投与される。本発明の抗体との同時投与に適した他の薬剤には、例えば、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がんまたは肺がん、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんなどのがんの治療に使用される、アバスチン（登録商標）、5FUおよびゲムシタビンなどの他の薬剤が含まれる。本発明の抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合断片の化学療法剤との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する2つの抗がん剤を提供する。そのような同時投与は、薬物に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化により、それらが抗体に反応しなくなるという問題を解決することができる。
標的特異的エフェクター細胞、例えば本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞を、治療薬として使用することもできる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球であり得る。その他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のIgGまたはIgA受容体保有細胞が含まれる。必要ならば、エフェクター細胞を、治療を受ける被験体から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞を、生理学的に許容される溶液中の細胞懸濁液として投与することができる。投与される細胞の数は、108〜109程度であり得るが、治療目的に応じて変動する。一般に、この量は、標的細胞に、例えばマトリプターゼを発現する腫瘍細胞に局在化するのに十分であり、そして、例えば、食作用による細胞殺傷に影響を与える。投与経路もまた変化し得る。
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の技術と併用して実施することができる。例えば、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用いる抗腫瘍療法および／またはこれらの組成物を持つエフェクター細胞を、化学療法と併用して使用することができる。加えて、併用免疫療法を使用して、2つの異なる細胞傷害性エフェクター集団に腫瘍細胞拒絶を指示することができる。例えば、抗Fc-ガンマRIまたは抗CD3に連結された抗マトリプターゼ抗体を、IgGまたはIgA受容体特異的結合剤と組み合わせて使用してもよい。
本発明の二重特異性および多重特異性分子を使用し、細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去などにより、エフェクター細胞上のFcγRまたはFcγRのレベルを調節することができる。抗Fc受容体の混合物を、この目的のために使用することもできる。
補体に結合するIgG1、-2、もしくは-3またはIgMからの部分などの補体結合部位を有する本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫複合体）を、補体の存在下で使用することもできる。一実施形態において、標的細胞を含む細胞集団の、本発明の結合剤および適切なエフェクター細胞でのex vivo処置は、補体または補体を含む血清の添加により補うことができる。本発明の結合剤でコーティングされた標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合により改善することができる。別の実施形態において、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコーティングされた標的細胞を、補体により溶解することもできる。さらに別の実施形態において、本発明の組成物は補体を活性化しない。
本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫複合体）を、補体と共に投与することもできる。特定の実施形態において、本開示は、抗体、多重特異性もしくは二重特異性分子および血清または補体を含む組成物を提供する。補体が抗体、多重特異性または二重特異性分子に近接して配置されている場合、これらの組成物は、有利であり得る。あるいは、本発明の抗体、多重特異性または二重特異性分子および補体または血清を別々に投与することができる。
また、本発明の範囲内であるのは、本発明の抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体）および使用説明書を含むキットである。キットはさらに、免疫抑制試薬、細胞毒性物質もしくは放射性毒性物質などの1つ以上の追加の試薬、または1つ以上の追加の本発明の抗体（例えば、一次抗体とは異なるマトリプターゼ抗原のエピトープに結合する相補的な活性を有する抗体）を含むことができる。
したがって、本発明の抗体組成物で治療された患者に、細胞毒性または放射剤などの、抗体の治療効果を高めるまたは増強する別の治療薬をさらに投与することができる（本発明の抗体の投与前に、と同時に、または後に）。
他の実施形態において、例えばサイトカインで被験体を処置することによるなど、FcγまたはFcγ受容体の発現または活性を調節する、例えば増強または阻害する薬剤で、被験体をさらに処理することができる。多重特異的分子による治療中の投与に好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、および腫瘍壊死因子（TNF）が含まれる。
本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性および二重特異性分子）を使用して、FcγRまたはマトリプターゼを発現する細胞を標的化することができ、例えば、そのような細胞を標識することができる。そのような使用のために、結合剤を、検出可能な分子に連結させることができる。したがって、本発明は、ex vivoまたはin vitroでFcγR、またはマトリプターゼなどのFc受容体を発現する細胞を局在化する方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。
特定の実施形態において、本発明は、抗体またはその一部とマトリプターゼとの間での複合物の形成を可能にする条件の下で、試料、および対照試料を、マトリプターゼに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合部位に接触させることを含む、試料中のマトリプターゼ抗原の存在を検出する、またはマトリプターゼ抗原の量を測定する方法を提供する。そして複合物の形成を検出し、ここで対照試料と比較した試料間の複合物形成の差は、試料中のマトリプターゼ抗原の存在の指標となる。
他の実施形態において、本発明は、被験体におけるマトリプターゼ媒介障害、例えば、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんを含むヒトがんを治療する方法を提供する。
全ての論文、刊行物、特許、特許出願、プレゼンテーション、教科書、報告書、原稿、パンフレット、書籍、インターネット投稿、雑誌記事、定期刊行物、製品ファクトシートなどを含むが、これらに限定されない本明細書で引用した全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の議論は、それらの著者によりなされた主張を単に要約することを意図しており、そして、任意の参照が先行技術を構成すること、および引用した参考文献の正確性や妥当性に異議を申し立てる出願人の権利の留保を認めるものではない。
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によりいくらか詳細に記載されているが、従属請求項の真意または範囲から逸脱することなく、ある種の変更および修正がなされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかであろう。
本発明は以下の実施例によりさらに例示されるが、これらはさらに限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
（マトリプターゼ-抗原に対するヒトモノクローナル抗体の生成）
マトリプターゼステムタンパク質は、MCF7細胞において多量に発現されることが知られている。これらの細胞を、以下のプロトコールにおける免疫化に使用した。
（トランスジェニックのHuMAb Mouse（登録商標）系統）
マトリプターゼに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックHuMAb Mouse（登録商標）のHCo12系統を使用して調製した。これらのマウス系統において、非特許文献１３６に記載されているように、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子はホモ接合的に破壊されており、そして特許文献１８４の実施例１に記載のように、内因性マウス重鎖遺伝子はホモ接合的に破壊されている。
（HuMab免疫付与）
マトリプターゼに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、HCo12マウス系統のHuMabマウスをマトリプターゼ発現MCF7細胞で免疫した。これらマウスへの一般的な免疫スキームは、非特許文献１３７；非特許文献１３８：および特許文献１８５に記載されている。マウスは、マトリプターゼ発現MCF7細胞の最初の注入時において6〜16週齢であった。
トランスジェニックマウスを、マトリプターゼ発現MCF7細胞で、Ribiアジュバントにおいて腹腔内（IP）、皮下（SC）またはフットパッド経由（FP）のいずれかで、3〜21日間隔（合計9回の免疫付与まで）で免疫した。免疫応答を、後眼窩採血により観察した。血漿をELISAによりスクリーニングし（後述のように）、そして十分な力価の抗マトリプターゼヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用した。屠殺および脾臓除去の3および2日前に、マウスを静脈内に抗原で追加免疫した。概して、各抗原に対して10〜20の融合を行った。数十匹のマウスを、各抗原に対して免疫した。
（抗マトリプターゼ抗体を産生するHuMab Mouse（登録商標）動物の選択）
マトリプターゼに結合する抗体を産生するHuMab Mouse（登録商標）動物を選択するために、非特許文献１３８（前出）により記載されるように、免疫したマウスからの血清をELISAにより試験した。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートをPBS中1〜2μg/mlの精製した組換えマトリプターゼでコーティングし、50μl/ウェルを4℃で一晩インキュベートし、その後、PBS/Tween（0.05%）中に200μl/ウェルの5%ニワトリ血清でブロッキングした。マトリプターゼ免疫マウスからの血漿の希釈物を各ウェルに添加し、1〜2時間周囲温度でインキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と結合したヤギ抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体と共に1時間室温でインキュベートした。洗浄後、プレートをABTS基質で発色させ（モス社、製品：ABTS-1000）、そして分光光度計によりOD 415〜495で分析した。抗マトリプターゼ抗体の最も高い力価を示したマウスを融合に用いた。下記のように融合を実施し、ハイブリドーマ上清を抗マトリプターゼ活性についてELISAおよびFACSにより試験した。
（マトリプターゼに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成）
HuMab Mouse（登録商標）から単離したマウス脾細胞を、電界ベースの電気融合を使用し、Cyto Pulse large chamber cull fusion electroporator（サイト・パルス・サイエンス社、グレンバーニー、メリーランド州）を使用して、マウス骨髄腫細胞株と融合させた。簡潔に述べると、免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、同数のSp2/0非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1581）に融合させた。細胞を、約2×104/ウェルの密度で、平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、次いで10%ウシ胎児血清、10% P388D1（ATCC、CRL TIB-63）馴化培地、DMEM中3〜5%のオリゲン（IGEN）（メディアテック、CRL 10013、高グルコース、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムと共に）を含有する選択培地中で、5mMのHEPES、0.055mMの2-メルカプトエタノール、50mg/mlのゲンタマイシンおよび1×HAT（シグマ社、CRL P-7185）を加えてインキュベートした。1〜2週間後、HATをHTに置き換えた培地中で細胞を培養した。細胞播種の約10〜14日後、個々のウェルからの上清を、それらがヒトg、k抗体を含有していたかどうかについて最初にスクリーニングした。ヒトg、kに対して正のスコアを付けた上清をその後、ELISAおよびFACS（上記）により、ヒト抗マトリプターゼモノクローナルIgG抗体についてスクリーニングした。抗体分泌ハイブリドーマを、24ウェルプレートに移して再度スクリーニングし、そしてヒト抗マトリプターゼIgGモノクローナル抗体に対してまだ陽性である場合、限界希釈により少なくとも2回サブクローニングした。安定なサブクローンを次いでin vitroで培養し、さらなる特性評価のために組織培養培地中で少量の抗体を生成した。
HuMab Mouse（登録商標）から生成されたマトリプターゼ_A1をコードするハイブリドーマクローンを、さらなる分析のために選択した。
（実施例２）
（マトリプターゼに対するモノクローナル抗体の構造解析）
マトリプターゼ_A1モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を、標準的なPCR技術を用いて入手し、そして標準的なDNA配列決定技術を用いて配列決定した。
抗体配列を変異誘発し、1つ以上の残基で生殖系列残基に戻してもよい。
マトリプターゼ_A1の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および１に示される。
マトリプターゼ_A1の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４および２に示される。
マトリプターゼ_A1重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列の比較により、マトリプターゼ_A1重鎖は、マウス生殖細胞系列VH 3〜23からのVHセグメントおよびヒト生殖細胞系列JH JH4bからのJHセグメントを利用していることが実証された。CDR領域決定のカバットシステムを用いるマトリプターゼ_A1 VH配列のさらなる分析により、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域の、それぞれ配列番号５、６および７に示されるような描写につながった。マトリプターゼ_A1 CDR1、CDR2およびCDR3 VH配列から生殖細胞系列VH 3〜23および生殖細胞系列JH JH4b配列のアラインメントを図２ａに示す。
マトリプターゼ_A1軽鎖免疫グロブリン配列と既知のマウス生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列の比較により、マトリプターゼ_A1軽鎖は、ヒト生殖細胞系列VK A27からのVKセグメントおよびヒト生殖細胞系列JKJK2からのJKセグメントを利用していることが実証された。CDR領域決定のカバットシステムを用いるマトリプターゼ_A1 Vk配列のさらなる分析により、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域の、それぞれ配列番号８、９および１０に示されるような描写につながった。マトリプターゼ_A1 CDR1、CDR2およびCDR3 Vk配列から生殖細胞系列VK A27および生殖細胞系列JK JK2配列のアラインメントを図２ｂに示す。
（実施例３）
（酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いる、抗原特異的抗体のスクリーニング）
マトリプターゼの細胞外ステム領域に対するマトリプターゼ_A1の特異性を、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）により決定した。
310ug/mlのマトリプターゼステムタンパク質をELISAコーティング緩衝液（100mmの炭酸ナトリウム/重炭酸塩）で希釈して0.1ug/mlとし、ウェルに100ulで移し、4℃で一晩インキュベートした。
インキュベーション後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、次いで200ulのスーパーブロック（サーモサイエンティフィック）を各ウェルに添加して30分間25℃でインキュベートし、その後ウェルをPBSTでさらに3回洗浄した。
PBSおよび0.1% BSA中で0.01から30umol/Lに連続的に希釈したマトリプターゼ_A1を、ウェルに100ulで移して25℃で1時間インキュベートし、次いでウェルをPBSTで3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgGカッパ特異的HRP（ロット＃NG1876246）およびヤギ抗ヒトIgG FC特異的（ロット＃96091）を0.01から30umol/Lに連続的に希釈し、各ウェルに100ulで移し、その後25℃で1時間インキュベートし、その後PBSTで再度3回洗浄した。TMB基質100ulを各ウェルに添加し、25℃で約1時間再びインキュベートし、その後1N HCL 100ulを各ウェルに加えた。
結果を、Thermo Varioskanを用いて450nmで読み取った（図3を参照）。これらは、マトリプターゼ_A1がマトリプターゼのステムに結合することを示している。
（実施例４）
（マトリプターゼに対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学）
以下の参照プロトコルを使用し、マトリプターゼ_A1を20ug/mlでIHC実験に使用した。これらの条件下で有意な染色は、結腸直腸がん、胃がん、前立腺がんおよび乳がんのFFPEまたは凍結フォーマットとして調製された組織切片において観察された。同一の条件を、マトリプターゼ_A1の正常なヒト組織への結合を試験するのに使用した。
（脱パラフィンおよび再水和）
スライドを2時間60℃で、50mlファルコン中で水浴にて緩衝液なしで加熱した。
各ファルコンは、1つのスライド、または2つの背合わせのスライドを、互いにくっつくのを防ぐためのそれらの間の長いゲルローディングチップと共に有する。スライドを、EZ-DeWax（バイオジェネックス、カリフォルニア州、米国）で5分間黒スライドラックにおいて脱パラフィンし、次いで1mLピペットを使用して同じDeWax溶液でよくすすぎ、その後水で洗浄した。圧力鍋が準備できるまで、スライドを水で満たされたコプリンジャーに入れ；水を数回変えた。
（抗原回復）
水を、抗原回復溶液= 1×クエン酸緩衝液、pH6（DAKO）に交換した。抗原を、圧力鍋法により回復させた。プラスチックコプリンジャー中で抗原回復溶液中のスライドを圧力鍋に入れ、次いでそれを6位（最高設定）まで加熱した。インキュベーションして15〜20分、温度を3位に下げ、さらに20〜25分そのままにした（圧力鍋内の温度が117℃のとき）。そしてホブのスイッチを切り、鍋を冷たいホブ上に置き、そして「開」と「閉」との間の位置にハンドルを移動することにより、圧力を慎重に解放した。システム全体を放置して圧力を解放させ、さらに20分間冷却させた。蓋を開け、試料を取り出しベンチに置いた。スライドをPBS-3T（0.5L PBS+3滴のTween-20）で1x5分洗浄し、そしてスライドをPBSに入れた。
（染色）
抗原回復後、スライドをShandonカバープレートシステムに搭載した。スライドとプラスチックカバープレートとの間に気泡が入るのを、PBSで満たされたコプリンジャーにカバープレートを配置し、組織切片を含むスライドをカバープレートに静かに滑らせることにより防止した。スライドを、カバープレートと一緒にしっかりと保持しながら、コプリンジャーから引き出した。組み立てたスライドをラックに入れ、PBSを漏斗内およびスライドとカバープレートとの間に入れて通過させた。スライドを2×2ml（または4×1ml）のPBS-3Tおよび1×2mlのPBSで洗浄し、全てのPBSがスライドを通過し、実質的にPBSが漏斗に残らなくなるまで待った。
内因性ペルオキシド遮断を、ペルオキシダーゼ遮断試薬（S2001、DAKO）を用いて行った。1〜4滴の過酸化物溶液をスライドごとに使用し、5分間インキュベートした。スライドを水で、次いで2mlのPBS-3Tで1回、そして2mlのPBSで1回すすいだ；洗浄緩衝液の新しい一部を追加する前に、液体が漏斗に実質的には残らなくなるまで待つことが重要であった。
一次抗体を、抗体希釈試薬（DAKO）で希釈した。最適な希釈を、0.5μg/mlと決定した。50〜200μlの希釈した一次抗体を各切片および/または組織マイクロアレイに添加した；組織全体をしっかり覆うように。スライドを優しくたたいて抗体を切片に均等に行き渡らせるか、またはピペット先端部を切片の上端に使用した。スライドを、45分間湿ったチャンバー内で室温でインキュベートした。スライドを、2×2ml（または4×1ml）のPBS-3T、次いで1×2mlのPBSで洗浄し、全てのPBSがスライドを通過し、実質的にPBSが漏斗に残らなくなるまで待った。対応するロバ抗ヤギIgG：HRP（1500P、1mg/ml、セロテック）を1：1000で適用し、35分間室温でインキュベートした。スライドを上記のように洗浄した。DAB基質を希釈緩衝液中で作製した；2滴の基質を含む2mlは、10スライドに十分であった。DAB試薬を、一度に数滴を添加することにより、スライドに塗布した。DABの全てをスライドの間に行き渡らせた。スライドを10分間インキュベートした。スライドを1×2ml（または2×1ml）のPBS-3Tおよび1×2ml（または2×1ml）のPBSで洗浄し、全てのPBSがスライドを通過し、実質的にPBSが漏斗に残らなくなるまで待った。ヘマトキシリン（DAKO）を添加した；1mlは10スライドに十分であり、スライドを1分間室温でインキュベートした。Shandonカバープレートシステムの漏斗を2mlの水で満たし、通過させた。スライドから過剰のヘマトキシリンを取り除き、システムを分解し、組織切片および/またはアレイを洗瓶からの水で洗浄し、そして黒スライドラックに置いた。組織をEZ-DeWaxで5分間、次いで95%エタノールで2〜5分間インキュベートすることにより再水和した。スライドをベンチに放置して室温で乾燥させ、その後封入剤に入れ、そしてカバースリップで覆った。
（結果）
マトリプターゼの発現は、試験した結腸直腸がん（表２）臨床試料の95%〜100%、胃がん（表１）試料の97%、前立腺がん試料の100%および乳がん試料の75%で見られた。
標的が観察された上皮由来細胞において、検出された発現レベルは、相当する腫瘍組織よりも有意に低かった。正常な発現は、腎臓の尿細管および胃腸管でも散在的に観察された。
（実施例５）
（マトリプターゼに対するモノクローナル抗体の特異性。フローサイトメトリー分析により決定）
実施例１で選択したマトリプターゼに対する抗体の特異性を、フローサイトメトリーにより試験した。細胞表面マトリプターゼタンパク質に結合する抗体の能力を試験するために、抗体をマトリプターゼ発現細胞とインキュベートした。細胞をFACS緩衝液（DPBS、2% FBS）中で洗浄して遠心分離し、100μlの希釈した一次マトリプターゼ抗体中に再懸濁した（FACS緩衝液中にも希釈した）。抗体-細胞株複合物を氷上で60分間インキュベートし、その後上述のように、FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞-抗体ペレットを、100μlの希釈した二次抗体中に再懸濁（FACS緩衝液中にも希釈）し、氷上で60分間氷上でインキュベートした。ペレットを前と同様に洗浄し、200μlのFACS緩衝液に再懸濁した。試料をBD FACScanto IIフローサイトメーターに投入し、データをBD FACSdivaソフトウェアを用いて分析した。
フローサイトメトリー分析の結果は、モノクローナル抗体マトリプターゼ_A1は、HT-29およびH69細胞で発現される細胞表面ヒトマトリプターゼに効果的に結合したことを証明した（図４ｂ）。これらの細胞株に加えて、マトリプターゼ_A1は、SNU-1（図４ａ）、A431（扁平上皮がん）、SW620（結腸直腸腺がん）、SKOV-3（卵巣腺がん）、MCF-7（乳がん）およびA549（ヒト肺胞の腺がん）を含む多数の他の細胞株にも高い親和性で結合することが見出された。
（実施例６）
（マトリプターゼ_A1により媒介される抗体依存性細胞傷害性）
標準的な手順に続き、CytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（プロメガUK社）を使用して、エフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞傷害性（HT-29およびOVCAR8細胞でのADCC）を介してマトリプターゼ発現細胞を死滅させるマトリプターゼ_A1抗マトリプターゼmAbの能力を判定した。
ADCCを介して細胞死滅を扇動することが知られている抗体を陽性対照として、およびヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用し、結果は、マトリプターゼ_A1は、ADCCをHT-29細胞に対して誘発することができたことを示している。図５は、マトリプターゼ_A1がADCCをHT-29細胞に対して誘発することを示している。
（実施例７）
（HT-29およびH69細胞によるマトリプターゼ_A1モノクローナル抗体の内在化）
マトリプターゼ_A1抗体は、HT-29細胞（ヒト結腸がん細胞株）およびH69細胞（ヒト小細胞肺がん細胞株）により、MabZAPアッセイを用いて細胞に結合する際に内在化されることが示された。MabZAP抗体を一次抗体に結合させた。次に、MabZAP複合物は細胞により内在化された。細胞へのサポリンの流入は、タンパク質合成の阻害および最終的な細胞死をもたらした。
MabZAPアッセイを以下のように行った。細胞のそれぞれを、各ウェルあたり5x103細胞の密度で播種した。抗マトリプターゼモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照ヒトIgGを連続的に希釈し、細胞に添加した。MabZAPを次いで50μg/mlの濃度で添加し、プレートを48および72時間インキュベートした。プレート内の細胞生存率をCellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイキット（プロメガ、G7571）により検出し、プレートを490nmでLuminomitor（チューナーバイオシステム、サニーベール、カリフォルニア州）により読み取った。データをPrism（グラフパッド）により分析した。
図６は、マトリプターゼ_A1が、HT-29およびH69細胞により、それぞれ0.1829および0.07398のEC50で効率的に内在化されたことを示している。これらの結果は、抗体濃度および他の抗マトリプターゼ抗体に比例したマトリプターゼ_A1の細胞傷害活性の増加を示す。
（実施例８）
（抗マトリプターゼ抗体-薬物複合体は、マウス異種移植モデルにおけるHT-29細胞の増殖を阻害する）
式Mで表されるマトリプターゼ_A1複合体（以下「マトリプターゼ_A1-式M複合体」と呼ぶ）の、マウス異種移植モデルにおけるHT-29細胞に由来する結腸直腸がんの増殖に対する効果を検討した。この異種移植モデルにおいて、SCIDマウス（CB17、チャールズ・リバー・ラボラトリーズから、ホリスター、カリフォルニア州）に、2.5×106 HT-29細胞／マウスを移植し、そしてHT-29細胞を約30日間増殖させた。次いでマウスを無作為化し、腹腔内（i.p.）でマトリプターゼ_A1-式M複合体を処理した（0.03、0.1および0.3μモル/kg）。DT、および抗ジフテリア毒素抗体を、非結合アイソタイプ対照として使用した。
結果は、マトリプターゼ_A1-式M複合体を用いた治療は、有意に用量依存的に腫瘍増殖速度を抑制したことを示す。図７aは、毒素結合mAbの単回投与（0.3μモル/kgで：約2mg/kg）は、治癒的であると判明したことを示す。図７ｂは、投与60日間の体重変化を示し、腫瘍誘導性悪液質における改善を示唆している。図７cは、HT-29 ADC異種移植片モデルにおける代替用量群を示し、治療に対する用量依存性の反応を明らかにしている。図７ｄは、HT-29 ADC異種移植片モデルにおける代替用量群を示し、用量依存性の悪液質改善を明らかにしている。
（実施例９）
（がん細胞株におけるMMAE複合およびMMAF複合抗マトリプターゼモノクローナル抗体の有効性）
（材料）
細胞剥離液（非酵素的細胞解離）（MT-25-056CI）、フィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州、米国から。
pH7.4のPBS（1X）（SH30028LS）、フィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州、米国から。
RPMI 1640培地（MT-10-041-CM）、フィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州、米国から。
Cell Titer Glo（G7572）、プロメガ、ウィスコンシン州、米国から。
（方法）
細胞を細胞剥離液を用いて解離し、計数した。5e3細胞／ウェルを遠沈させ、ペレットにした（浮遊細胞では、細胞の倍加時間に応じて、10e3細胞／ウェルのようにより多くを使用することができる）。ペレットを培養培地に再懸濁し、1e5細胞/mLの濃度にした。
50ul/ウェル細胞懸濁液を、96ウェル両面白色底面透明プレートのウェルに添加した。抗体を、0〜20nM（試験濃度の2倍）の間の濃度に対応する8点（3倍滴定）に希釈および滴定した。希釈した抗体または媒体（未処理の試料について）（50ul/ウェル）を、適切なウェルに添加した。過剰な培地（200ul/ウェル）を、蒸発を防ぐために、プレートの外側の行および列に加えた。プレートを72時間37℃でインキュベートした。
プレートをインキュベータから取り出し、室温で30分間インキュベートした。その間、Cell Titer Glo溶液を解凍した。プレートをはじき、100ul/ウェルのPBSで1x洗浄した（浮遊細胞では、プレートを最初に遠心分離し、細胞をペレット化する）。100ul/ウェルのPBSおよび100ulのCell Titer Gloを各ウェルに添加し、粉砕して混合した。プレートを暗所で室温で15分間インキュベートし、そして顕微鏡により可視化し、発生した効率的な細胞溶解を確保した。その後、プレートをGlomaxルミノメーターで読み取った。
（結果）
表３は、MMAEに結合した抗マトリプターゼ抗体を使用したADCの細胞毒性アッセイでの多くのヒト腫瘍細胞株のEC50値を示す。検査した細胞株は、Coav-4（ヒト卵巣腺がん）、COV644（ヒト卵巣上皮粘液がん）、OVCAR-3（ヒト卵巣腺がん）、OV90（ヒト乳頭状漿液性腺がん）、HCC70（ヒト乳管がんER陰性、PR陰性およびHer2陰性）、HCC1143（ヒト乳管がんER陰性、PR陰性およびHer2陰性）、BT474（ヒト乳管がん）、PC-3（ヒト前立腺がん）、N87（ヒト胃腺がん）、SNU16（ヒト胃腺がん）、KATOIII（ヒト胃腺がん）、ST16（ヒト胃腺がん）、HT-29（ヒト結腸直腸腺がん）およびDMS79（肺小細胞がん）細胞であった。表３はまた、Coav-4、COV644、OVCAR-3、OV90、PC-3、N87、SNU16およびKATOIII細胞株においてMMAFに結合した抗マトリプターゼ抗体のEC50値を示す。これらの結果は、MMAEに結合した抗マトリプターゼ抗体およびMMAFに結合した抗マトリプターゼ抗体の＞1nMでの細胞傷害活性を示す（図８を参照）。
（実施例１０）
（卵巣がん異種移植モデルにおけるMMAE複合およびMMAF複合抗マトリプターゼモノクローナル抗体の有効性）
マトリプターゼ_A1_MMAEおよびマトリプターゼ_A1_MMAFの有効性を、OVACAR-3ヌードマウス異種移植モデルで試験した。
免疫不全無胸腺ヌードマウスに、OVACAR-3（ヒト卵巣腺がん）腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍を定着させ、マウスを、1群あたり5〜8匹のマウスの7つの処理群に分けた。平均腫瘍体積が1群当たり167mm3の平均サイズに達したとき、各群を、提示投与量で静脈内投与される以下の化合物の1つで処理した：群1（輸送体；20mMコハク酸ナトリウム、pH5.0、6%トレハロース、0.04%ポリソルベート；n=8）；群2（マトリプターゼ_A1_MMAE；1mg/kg；n=8）、群3（マトリプターゼ_A1_MMAE；3mg/kg；n=8）、群4（アイソタイプ対照-MMAE；3mg/kg；n=5）、群5（マトリプターゼ_A1_MMAF；1mg/kg；n=8）、群6（マトリプターゼ_A1_MMAF；3mg/kg；n=8）、群7（アイソタイプ対照-MMAF；3mg/kg；n=5）。体重（BW）を観察し、マウスの健康状態または有害な副作用を頻繁に検査し、そして腫瘍を週に2回測定した。腫瘍接種82日後に、マウスを安楽死させた。有効性を、抗腫瘍活性（処理群の平均腫瘍サイズ／対照群の平均腫瘍サイズ×100）およびADC処理対PBS処理マウスにおける平均エンドポイント到達期間（TTE）の増加から決定した。接種71日後、輸送体処理対照マウスの5つの最も大きい腫瘍をサンプリングし、ホルマリン固定およびパラフィン包埋で処理した。
（結果）
図９は、マトリプターゼ_A1_MMAEおよびマトリプターゼ_A1_MMAFそれぞれが、OVACAR-3ヌードマウス異種移植モデルにおける、対照と比較して劇的な抗腫瘍活性を示したことを表している。3mg/kgのマトリプターゼ_A1_MMAEでは、研究の61日目で8/8生存体、8つの完全縮小、最大可能腫瘍増殖遅延（85%）、ならびにアイソタイプ対照および輸送体対照群と比較して有意な生存延長が得られた。マトリプターゼ_A1_MMAFは、3mg/kgで68%TGD、2匹の生存体、3つの部分的縮小および1つの完全縮小をもたらした。全ての処理は十分に耐容性があり、毒性の臨床兆候は観察されなかった。これらのデータは、ADCのマトリプターゼに対する潜在力、例えばマトリプターゼ_A1_MMAEおよびマトリプターゼ_A1_MMAFが、ヒトトリプルネガティブ乳がん患者の治療において臨床的利益を提供することを示唆している。これらの結果から分かるように、マトリプターゼ_A1_MMAEは、この異種移植モデルにおいて驚くほど優れた効果をもたらした。
（実施例１１）
（カニクイザルにおけるMMAE複合およびMMAF複合抗マトリプターゼモノクローナル抗体の毒性）
10匹のサルを、1匹のサル／性／群での調査に割り当てた。輸送体（PBS）、マトリプターゼ_A1_MMAEまたはマトリプターゼ_A1_MMAFのいずれかを、表４に示すように、0mg/kg/用量（PBS、輸送体）、1mg/kg/用量（マトリプターゼ_A1_MMAE）、3mg/kg/用量（マトリプターゼ_A1_MMAE）、3mg/kg/用量（マトリプターゼ_A1_MMAF）、6mg/kg/用量（マトリプターゼ_A1_MMAF）での15分間静脈内注入により、2回投与（1日目および29日目）した。投与開始（1日目）の前、ならびに各投与後1、2、3、7、14、21および28日目に、血液試料を毒物動態評価用に採取した。臨床病理学的分析用の血液試料を、投与開始（1日目）の前、ならびに各投与後1、3、7、14、21、および28日目に採取した（第一投与後28日目は、第二投与の投与前時点ともなった）。全ての研究動物を、57日目の最終採血の後に安楽死させ、剖検した。各血液採取から分離された血漿を、単離、凍結させ、オックスフォードバイオセラピューティクス社に出荷し、ELISAによりADC濃度を分析した。
（結論）
2用量のPBS、3.0mg/kg/用量までのマトリプターゼ_A1_MMAE（切断可能）または6.0mg/kg/用量までのマトリプターゼ_A1_MMAF（非切断）は、それぞれ、カニクイザルにおける15分の静脈内注入を介して、十分に耐容性があった。研究の過程で、死亡または瀕死は観測されなかった。臨床徴候、体重および体重変化または食物消費の変化は、マトリプターゼ_A1_MMAEまたはマトリプターゼ_A1_MMAFで処理した動物において観察されなかった。
AST値の増加は、一方の群3（マトリプターゼ_A1_MMAE、3mg/kg/日）雄；両群4（マトリプターゼ_A1_MMAF、3mg/kg/日）サル；および両群5（マトリプターゼ_A1_MMAF、6mg/kg/日）サルへの各注入後の日のみに認められた。群3雄への各注入後の日のLDH値も増加した。他のどの時点でも、ASTまたはLDHのいずれかの増加は認められなかった。これらの知見は、限られた数の検査した組織における組織病理学的所見とは関連していなかった。増加は試験物質に関連するが、有害ではない。群3（マトリプターゼ_A1_MMAE、3mg/kg/日）雄および雌でのBUN値の増加は、試験物質の投与に関連し得るが、他の研究パラメータとの相関性の欠如および増加の大きさを考えると、それらは毒性学的に有意ではない。血液学、凝固または尿検査のパラメータには、試験物質関連の影響はなかった。治療関連の肉眼的病理所見または絶対的および相対的臓器重量変化はなかった。病理組織学的に、群2（マトリプターゼ_A1_MMAE、1mg/kg/日）雌；群4（マトリプターゼ_A1_MMAF、3mg/kg/日）雌；および群5（マトリプターゼ_A1_MMAF、6mg/kg/日）雄での脾臓動脈周囲鞘中のリンパ球の顕著な数は、試験物質関連の可能性が高いが、毒性学的意味はない。

Claims (34)

  1. （a）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する抗体により認識されるマトリプターゼのステム領域上のエピトープに結合する、もしくは
    （b）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する抗体と、マトリプターゼのステム領域への結合を競合する
    単離された抗体、またはその抗原結合部位。
  2. マトリプターゼのステム領域に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合部位であって、
    a）以下を含む重鎖可変領域：
    i）配列番号５を含む第一のvhCDR；
    ii）配列番号６を含む第二のvhCDR；および
    iii）配列番号７を含む第三のvhCDR；ならびに
    b）以下を含む軽鎖可変領域：
    i）配列番号８を含む第一のvlCDR；
    ii）配列番号９を含む第二のvlCDR；および
    iii）配列番号１０を含む第三のvlCDR；
    を含有し、
    任意に、いずれの1つ以上の上記配列番号が、独立して1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、付加または欠失を含む、
    該抗体。
  3. 配列番号１に対して少なくとも80%、85%、90%、95または99%のアミノ酸配列同一性を有する重鎖および配列番号２に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または99%のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖を含む、請求項１または請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
  4. 共有結合部位をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
  5. 前記部位が薬物部位または放射性部位である、請求項４に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
  6. 前記薬物がメイタンシノイド、ドラスタチン、ヘミアステルリン、アウリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、CC1065およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項５に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
  7. 前記薬物がMMAEおよびMMAFからなる群より選択されるメイタンシノイドである、請求項６に記載の単離された抗体またはその抗原結合部位。
  8. 前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  9. 前記抗体が、高いFc受容体結合性および／もしくは高いADCC効力を有する改変抗体、ならびに／または二重特異性抗体である、請求項８に記載の単離された抗体。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を、1つ以上の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体と共に含む、医薬組成物。
  11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位の重鎖をコードする核酸。
  12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位の軽鎖をコードする核酸。
  13. 1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された請求項１１に記載の核酸および／または1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
  14. （i）1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された請求項１１に記載の核酸および1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター；または
    （ii）1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された請求項１１に記載の核酸を含む第一の発現ベクターおよび1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された請求項１２に記載の核酸を含む第二の発現ベクター
    を含有する宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載の宿主細胞を前記抗体またはその抗原結合部位が発現される条件下で培養すること、そして任意に、前記抗体またはその抗原結合部位を単離することを含む、抗体またはその抗原結合部位を生成する方法。
  16. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
  17. 前記抗体またはその抗原結合部位が、マトリプターゼのステム領域を発現する細胞により内部移行される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗体またはその抗原結合部位が、共有結合薬物複合体を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記共有結合薬物複合体が、アウリスタチン、好ましくはMMAEである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発する、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記がんが、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんからなる群より選択される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. がん治療における使用のための、請求項1〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位。
  23. 前記抗体またはその抗原結合部位が、マトリプターゼのステム領域を発現する細胞により内部移行される、請求項２２に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部位。
  24. 前記抗体またはその抗原結合部位が、共有結合薬物複合体を含む、請求項２２または２３に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部位。
  25. 前記共有結合薬物複合体が、アウリスタチン、好ましくはMMAEである、請求項２４に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部位。
  26. 前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発する、請求項２２に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部位。
  27. 前記がんが、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんからなる群より選択される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部位。
  28. がん治療のための医薬の製造における、請求項1〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位の使用。
  29. 前記抗体またはその抗原結合部位が、マトリプターゼのステム領域を発現する細胞により内部移行される、請求項２８に記載の使用。
  30. 前記抗体またはその抗原結合部位が、共有結合薬物複合体を含む、請求項２８または２９に記載の使用。
  31. 前記共有結合薬物複合体が、アウリスタチン、好ましくはMMAEである、請求項３０に記載の使用。
  32. 前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発する、請求項２８に記載の使用。
  33. 前記がんが、胃がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、好ましくはSCLC、食道がん、頭頸部がん、膵臓がん、リンパ腫、好ましくは非ホジキンリンパ腫および皮膚がんからなる群より選択される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の使用。
  34. 治療における使用のための、または医薬としての使用のための、請求項1〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9849192B2 (en) 2009-11-18 2017-12-26 Rutgers, The State University Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
LT4095130T (lt) 2013-10-18 2024-04-25 Novartis Ag Žymėti prostatos specifinio membranos antigeno (psma) inhibitoriai, jų naudojimas kaip vizualizavimo medžiagų ir farmacinių medžiagų prostatos vėžiui gydyti
AU2014351565A1 (en) 2013-11-25 2016-06-09 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies anti Matriptase for the treatment of cancer
CN108778274A (zh) 2016-03-18 2018-11-09 新泽西鲁特格斯州立大学 用通过可体内裂解的连接部分与抗蛋白裂解酶抗体缀合的化学治疗剂靶向肿瘤细胞

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972616A (en) 1998-02-20 1999-10-26 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas TADG-15: an extracellular serine protease overexpressed in breast and ovarian carcinomas
US7022821B1 (en) 1998-02-20 2006-04-04 O'brien Timothy J Antibody kit for the detection of TADG-15 protein
WO2000053232A1 (en) 1999-03-12 2000-09-14 Georgetown University Matriptase, a serine protease and its applications
US7030231B1 (en) 1999-09-30 2006-04-18 Catalyst Biosciences, Inc. Membrane type serine protease 1 (MT-SP1) and uses thereof
AU774106B2 (en) 1999-10-20 2004-06-17 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, The TADG-15: an extracellular serine protease overexpressed in carcinomas
US6447978B1 (en) 1999-12-03 2002-09-10 Kodak Polychrome Graphics Llc Imaging member containing heat switchable polymer and method of use
EP1252300B1 (en) 2000-02-03 2011-01-19 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon
US6903201B2 (en) 2001-01-05 2005-06-07 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US7125703B2 (en) 2001-03-13 2006-10-24 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon
EP1383884A4 (en) 2001-03-22 2004-12-15 Dendreon Corp SERINE PROTEASE CVSP14 CODING NUCLEIC ACID MOLECULES, THE CODED POLYPEPTIDES AND METHODS THEREOF
WO2002077267A2 (en) 2001-03-27 2002-10-03 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding a transmembran serine protease 9, the encoded polypeptides and methods based thereon
KR20040080940A (ko) 2001-05-14 2004-09-20 덴드레온 코포레이션 트랜스막 세린 프로테아제 10을 암호화하는 핵산 분자,암호화된 폴리펩티드 및 이에 근거한 방법
US20030170245A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-11 Dickson Robert B. Activation of matriptase and diagnostic and therapeutic methods based thereon
US7019019B2 (en) 2002-12-23 2006-03-28 Dendreon Corporation Matriptase inhibitors and methods of use
TW200635946A (en) 2004-12-20 2006-10-16 Abgenix Inc Binding proteins specific for human matriptase
WO2006090389A2 (en) 2005-02-24 2006-08-31 Compugen Ltd. Novel diagnostic markers, especially for in vivo imaging, and assays and methods of use thereof
US20070099251A1 (en) 2005-10-17 2007-05-03 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
WO2009020645A2 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Oxford Genome Sciences (Uk) Ltd. Matriptase protein and uses thereof
SI2285408T1 (sl) * 2008-06-05 2019-02-28 Ablynx N.V. Aminokislinska zaporedja usmerjena proti proteinom ovojnicam virusa in polipeptidi, ki zaporedja vsebujejo za zdravljenje virusnih bolezni
WO2011063127A1 (en) * 2009-11-18 2011-05-26 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
US8205227B1 (en) 2010-02-06 2012-06-19 Frontier Communications Corporation Management and delivery of audiovisual content items that correspond to scheduled programs
KR20130091132A (ko) * 2012-02-07 2013-08-16 한국생명공학연구원 메트립타아제-특이적인 인간 항체 및 그의 용도
AU2014351565A1 (en) 2013-11-25 2016-06-09 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies anti Matriptase for the treatment of cancer

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