CN105849127A - 用于治疗癌症的抗间质蛋白酶抗体 - Google Patents

用于治疗癌症的抗间质蛋白酶抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN105849127A
CN105849127A CN201480070410.1A CN201480070410A CN105849127A CN 105849127 A CN105849127 A CN 105849127A CN 201480070410 A CN201480070410 A CN 201480070410A CN 105849127 A CN105849127 A CN 105849127A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
proteose
enzyme
antigen
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480070410.1A
Other languages
English (en)
Inventor
J·特雷特
C·劳-奈克
H·黄
S·波格
E·麦道
M·库恩
C·潘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oxford Biotherapeutics Ltd
Original Assignee
Oxford Biotherapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxford Biotherapeutics Ltd filed Critical Oxford Biotherapeutics Ltd
Publication of CN105849127A publication Critical patent/CN105849127A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015Breast
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046Stomach, Intestines
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565Complementarity determining region [CDR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77Internalization into the cell
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供结合酪氨酸‑蛋白激酶跨膜受体间质蛋白酶的细胞外结构域的抗体。亦提供编码该等抗体的核酸分子、用于表达该等抗体的表达载体、宿主细胞及方法。该等抗体可用于治疗癌症,包括胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌症、肺癌(优选为SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选为非霍奇金氏淋巴瘤)及皮肤癌。

Description

用于治疗癌症的抗间质蛋白酶抗体
背景技术
间质蛋白酶降解细胞外基质。根据SWISS-PROT,提出其在乳腺癌侵袭和癌转移中起一定作用。其展现如通过以Arg或Lys作为P1位点裂解合成基质所定义的胰蛋白酶样活性。其在与口腔上皮和表皮的终末分化相关的丝聚合蛋白原处理、角质细胞成熟和脂质基质形成中具有必需的生理作用,且亦对于毛囊生长至关重要。其为表达于大部分人类上皮中的II型跨膜丝氨酸蛋白酶且其为严格的上皮蛋白酶。其表达于上皮来源的肿瘤中且不表达于间叶细胞来源的肿瘤中。间质蛋白酶已先前描述于WO2009/020645中。
发明内容
本发明提供针对间质蛋白酶(例如针对包含SEQ ID NO:26或功能部分,例如干(SEQ ID NO:21-24)的人类间质蛋白酶的抗体和相关组合物,包括编码所述抗体和治疗蛋白质的核酸,和包含所述核酸的宿主细胞。本发明进一步提供制备抗间质蛋白酶抗体的方法和使用所述抗体治疗例如以下疾病的方法:间质蛋白酶介导病症,例如人类癌症,包括胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))和皮肤癌。
在一具体实施方式中,本发明的抗间质蛋白酶抗体(或其抗原结合片段)结合间质蛋白酶的细胞外主干区(SEQ ID NO:21-24)且被表达间质蛋白酶的细胞内化。
在一个方面中,本发明提供一种抗体或其抗原结合部分,其:(a)与被抗体所识别的间质蛋白酶的表位结合,所述抗体包括含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区,或(b)与抗体竞争结合LY75,所述抗体包括含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分结合人类LY75且包括包含选自包含SEQ ID NO:5、6和7的CDR的1、2或3个CDR的重链可变区,和/或包含选自包含SEQ ID NO:8、9和10的1、2或3个CDR的CDR的轻链可变区。
在另一实施方式中,所述抗体包含本文所述的具体抗体(例如在本文中称为“间质蛋白酶_A1”)的重链和轻链互补决定区(CDR)或可变区(VR)。因此,在一个实施方式中,抗体包含具有SEQ ID NO:1所示的序列的间质蛋白酶_A1的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2和CDR3域,和/或具有SEQ ID NO:2所示的序列的A1的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3域。
在另一实施方式中,抗体包含重链可变区,其包括包含SEQ ID NO:5的第一VHCDR;包含SEQ ID NO:6的第二VHCDR;和包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR;和/或轻链可变区,其包括包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR;包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR;和包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR。
在另一实施方式中,本发明抗体结合人类间质蛋白酶且包括含氨基酸序列SEQ IDNO:1及其保守序列修饰的重链可变区。抗体可进一步包括含氨基酸序列SEQ ID NO:2及其保守序列修饰的轻链可变区。
在另一实施方式中,本发明的抗体结合人类间质蛋白酶且包括分别包括SEQ IDNO:1和/或2所示的氨基酸序列及其保守序列修饰的重链可变区和轻链可变区。
应理解,保守序列修饰可为氨基酸取代、添加或缺失,但优选为取代。如本文所用,术语保守序列修饰是指例如氨基酸经具有类似特征的氨基酸取代。何种此类取代可视为保守为本领域技术人员的公知常识。可视为保守序列修饰的其他修饰包括例如糖基化。
另外应理解,保守序列修饰可存在于SEQ ID NO:1和/或2所示的重链和/或轻链可变区的CDR区域(SEQ ID NO:5-10)中的一个或多个和/或构架区(SEQ ID NO:29-36)中的一个或多个中。
在优选实施方式中,所述抗体为分离的抗体。
包括与以上序列中的任意具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或99%以上序列相同性的重链和轻链可变区的分离的抗体也包括在本发明中。在上述值中间的范围,例如与以上序列中的任意具有至少80%-85%、85%-90%、90%-95%或95%-100%序列相同性的重链和轻链可变区也被本发明所包含。在一个实施方式中,抗体包括含SEQ ID NO:1,或与SEQ ID NO:1具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的序列的重链可变区。在另一实施方式中,抗体包括含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的序列的轻链可变区。在另一实施方式中,抗体包含重链构架区,所述重链构架区包含与SEQ ID NO:1的重链可变区的构架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的氨基酸序列,其如SEQID NO 29、30、31和32中所示。在另一实施方式中,抗体包含轻链构架区,所述轻链构架区包含与SEQ ID NO:2的轻链可变区的构架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的氨基酸序列,其如SEQID NO:33、34、35和36中所示。
本发明也包含与本发明抗体竞争结合间质蛋白酶的分离的抗体。在一具体实施方式中,抗体与包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合间质蛋白酶。在另一实施方式中,抗体与包括含SEQ ID NO:1和2(A1)所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合间质蛋白酶。
本发明的其他抗体结合相同表位或由本文所述的抗体识别的间质蛋白酶上的表位。在另一具体实施方式中,抗体结合由包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体识别的间质蛋白酶上的表位。在另一实施方式中,抗体结合由包括含SEQ ID NO:1和2(A1)所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体识别的间质蛋白酶上的表位。
在另一实施方式中,本发明的抗体包含与本文所述的亲本抗体相比可变的CDR。因此,本发明提供包含亲本抗体的变异可变区的变异抗体,其中所述亲本抗体包括包含SEQID NO:5的第一VHCDR、包含SEQ ID NO:6的第二VHCDR、包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR、包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR、包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR和包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR,且其中所述变异抗体在第一VHCDR、第二VHCDR、第三VHCDR、第一VLCDR、第二VLCDR和第三VLCDR的组中总共具有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代,其中1至4个、1至3个或1至2个取代具有具体用途,且其中所述抗体保留与间质蛋白酶的特异性结合。
本发明的抗体可为全长,例如以下同种型中的任意:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。或者,抗体可为例如抗原结合部分的片段或单链抗体(例如Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段、分离的互补决定区(CDR)或两个或两个以上分离的CDR的组合)。所述抗体可为任何种类的抗体,包括但不限于人类抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
在其他实施方式中,本发明的抗体呈免疫偶联物形式(即另外包括共价连接部分)。在一具体实施方式中,所述部分为药物,例如美登木素(maytansinoid)、哈米特林(hemiasterlin)、尾海兔素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)、新月毒素(trichothecene)、卡奇霉素(calicheamicin)、CC1065或其衍生物。在一优选实施方式中,药物为奥瑞他汀,优选MMAE或MMAF。
在其它实施方式中,本发明抗体呈双特异性分子形式,例如在效应细胞存在下引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应,因此杀死表达间质蛋白酶的细胞。
在另一方面中,本发明提供编码前述抗体的重链和/或轻链可变区的核酸。在一个实施方式中,本发明提供一种结合人类间质蛋白酶的分离的单克隆抗体,其中所述抗体包含通过分别包含SEQ ID NO:3和4的核酸序列或与上述核酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的核酸序列或由于遗传编码的简并性而不同于SEQ ID NO:3和4的序列所编码的重链可变区和轻链可变区。
在本发明的另一方面中,提供包含可操作地连接一个或多个调节元件的编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区的核酸的表达载体。
在另一方面中,本发明提供含有编码上述抗体的重链和/或轻链可变区或其抗原结合部分的核酸的宿主细胞。优选地,其中在宿主细胞于表达核酸的条件下生长时其表达所述重链和/或轻链可变区或其抗原结合部分。在其他实施方式中,提供恢复一种或多种本发明抗体的方法。在一优选实施方式中,宿主细胞包含:(i)根据本发明的表达载体;或
(ii)包含编码本发明抗体的重链或其抗原结合部分的核酸序列的第一表达载体和包含编码本发明抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸序列的第二表达载体。
在本发明的另一方面中,提供制造抗体或其抗原结合部分的方法,包含在表达抗体或其抗原结合部分的条件下培养本发明的宿主细胞和任选分离所述抗体或其抗原结合部分。
在另一方面中,本发明提供一种治疗癌症的方法,其中向有需要的患者给予本发明的一种或多种抗体或其结合部分。在一具体实施方式中,向患者给予结合间质蛋白酶的细胞外主干区(SEQ ID NO:21-24)的抗体。在另一实施方式中,本发明的一种或多种抗体经内化。在一个实施方式中,抗体或抗原结合部分包含共价连接的药物部分。在另一实施方式中,抗体包含重链可变区,其包括包含SEQ ID NO:5的第一VHCDR;包含SEQ ID NO:6的第二VHCDR;和包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR,和轻链可变区,其包括包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR,包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR和包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR。
在另一方面中,提供治疗癌症的方法,其中向有需要的患者给予本发明的抗体或其抗原结合部分且其中所述本发明的抗体或其抗原结合部分在效应细胞存在下引发ADCC反应。优选地,抗体或其抗原结合部分包含重链可变区,其包括包含SEQ ID NO:5的第一VHCDR;包含SEQ ID NO:6的第二VHCDR;和包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR;和轻链可变区,其包括包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR,包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR和包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR。
在另一方面中,提供治疗癌症的方法,其中向有需要的患者给予本发明的抗体或其抗原结合部分,且其中所述本发明的抗体或其抗原结合部分在效应细胞存在下引发细胞毒性T细胞反应。优选地,抗体包含重链可变区,其包括包含SEQ ID NO:5的第一VHCDR;包含SEQ ID NO:6的第二VHCDR;和包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR;和和轻链可变区,其包括包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR;包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR;和包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR。
在本发明的另一方面中,提供用于癌症治疗的一种或多种本发明的抗体。
也提供一种或多种本发明的抗体在制造用于癌症治疗的药物中的用途。
在一个实施方式中,癌症选自胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌症、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤)和皮肤癌。
根据本发明的另一方面,提供在个体中检测、诊断和/或筛检表达间质蛋白酶的癌症、或监测所述癌症的进展、或监测针对所述癌症的癌症药物或疗法的效应的方法,其包含检测能够免疫特异性结合间质蛋白酶的抗体或其一种或多种片段的存在或含量。
优选地,癌症是选自胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌症、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤)和皮肤癌。
包含本发明的组合物(例如抗体)和任选存在的使用说明书的试剂盒也在本发明的范畴内。所述试剂盒可另外含有至少一种额外试剂或一种或多种本发明的额外抗体。
本发明的其他特征和优势将由以下实施方式和申请专利范围变得显而易见。
附图说明
图1a和图1b描绘产生主干区(SEQ ID NO:21-24)的间质蛋白酶的裂解位点。
图2a描绘间质蛋白酶_A1重链、人类VH 3-23种系和人类JH4b种系的比对。间质蛋白酶_A1重链的CDR区带下划线。
图2b描绘间质蛋白酶_A1轻链、人类VK A27种系和人类JK2种系的比对。间质蛋白酶_A1轻链的CDR区带下划线。
图3显示使用ELISA结合间质蛋白酶-干的间质蛋白酶_A1。
图4a显示SNU1细胞上的间质蛋白酶_A1的流式细胞学分析的结果。
图4b描绘HT-29细胞上的间质蛋白酶_A1的流式细胞学分析的结果。
图4c描绘H69细胞上的间质蛋白酶_A1的流式细胞学分析的结果。
图5描绘在效应细胞存在下引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应的间质蛋白酶_A1。
图6描绘使用MabZAP分析,通过HT-29和H69细胞的间质蛋白酶_A1的内化。
图7a显示发现单剂量(以0.3摩尔/千克:约2毫克/千克)的毒素偶联间质蛋白酶_A1为治愈性的。
图7b显示表明改善肿瘤诱发的恶病体质的经60天给予间质蛋白酶_A1的体重改变。
图7c显示表现对治疗的剂量反应的HT-29ADC异种移植模型中的替代剂量组。
图7d显示表现剂量反应恶病体质改善的HT-29ADC异种移植模型中的替代剂量组。
图8描绘使用偶联至各种癌细胞系中的MMAE或MMAF的抗间质蛋白酶抗体的ADC细胞毒性分析的EC50值。
图9描绘偶联至卵巢腺癌SCID小鼠异种移植模型中的MMAE或MMAF的抗间质蛋白酶抗体的功效。
实施方式
在一个实施方式中,本发明关于如本文中所述的以高亲和力特异性地结合SEQ IDNO:21-24中所述的间质蛋白酶的主干区的分离抗体。
在具体实施方式中,本发明的间质蛋白酶抗体可呈双特异性分子形式,例如在效应细胞存在下促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应,因此杀死表达间质蛋白酶的细胞。
在其他实施方式中,本发明的间质蛋白酶抗体在与表达间质蛋白酶受体的细胞接触时内化。如本文中所论述,间质蛋白酶受体过度表达和/或不同地表达于某些癌细胞上,所述癌细胞包括但不限于胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤)和皮肤癌的肿瘤。
因此,当本发明的所述间质蛋白酶抗体偶联至药物(有时在本文中称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)时,这些ADC分子内化至癌细胞中导致细胞死亡且因此导致肿瘤治疗。
因此,本发明提供抗体,具体为分离抗体(其如在下文中所概述,包括多种已知抗体结构、衍生物、模拟物和偶联物)、编码这些抗体的核酸、用于制造抗体的宿主细胞、制造抗体的方法和包含抗体且任选包括医药载剂的药物组合物。
间质蛋白酶蛋白
已报导间质蛋白酶的细胞外主干区由包含氨基酸残基86-201(SEQ ID NO:21)的单一SEA域组成。间质蛋白酶的活化需要连续内蛋白分解裂解和活化位点自裂解。在氨基酸Gly149之后发生裂解,产生包含氨基酸残基86-149(间质蛋白酶主干序列B,SEQ ID NO:22)的主干区。其他蛋白分解裂解可出现在氨基酸K189之后,其产生包含氨基酸序列86-189(间质蛋白酶主干序列C,SEQ ID NO:23)的主干区或或氨基酸K204,其产生包含氨基酸序列86-204(间质蛋白酶主干序列D,SEQ ID NO:24)的主干区。间质蛋白酶随后通过在Arg614的后的蛋白分解裂解转化成其活性构型。催化C端丝氨酸蛋白酶域由氨基酸残基615-855(SEQID NO:27)组成(图1)。参见例如Matriptase:Potent Proteolysis on the Cell Surface(间质蛋白酶:细胞表面上的有力蛋白质水解);List,Bugge和Szabo;Mol Med 12(1-3)1-7,2006年1月-3月和Regulation of the activity of Matriptase on epithelial cellsurfaces by a blood derived factor(通过血液源性因子调控间质蛋白酶对于表皮细胞表面的活性);Benaud,Dickson和Lin;Eur J Biochem 268,1439-1447,2001,其全文纳入本文中。
因此,本发明提供特异性结合人类间质蛋白酶的主干区的分离抗间质蛋白酶抗体。“人类间质蛋白酶”或“人类间质蛋白酶抗原”是指SEQ ID NO:26的蛋白质或功能部分,例如主干(SEQ ID NO:21-24)(如本文所定义)。一般而言,间质蛋白酶具有短胞质内尾端、跨膜域和细胞外结构域,其在裂解时产生间质蛋白酶主干区。在具体实施方式中,本发明的抗体结合间质蛋白酶蛋白质的主干区。
在某些情况下,本发明抗体可与来自除人类以外的物种的间质蛋白酶交叉反应。例如,为有助于临床测试,本发明的抗体可与鼠类或灵长类间质蛋白酶分子交叉反应。或者,在某些实施方式中,抗体可完全对一种或多种人类间质蛋白酶具有特异性且可不表现物种或其他类型的非人类交叉反应性。
抗体
本发明提供抗间质蛋白酶抗体,一般为如本文所述的治疗性和/或诊断性抗体。在本发明中可用的抗体可呈如本文所述的许多形式,包括下文所述的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。基本上,本发明提供含有6个如本文所定义的CDR组的抗体结构(包括较小数目的氨基酸变化,如下文所述)。
如本文所用的“抗体”包括如本领域技术人员应理解的多种结构,其最少含有6个如本文所定义的CDR的组;包括但不限于传统抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、人源化和/或嵌合抗体、抗体片段、工程改造抗体(例如具有如在下文中概述的氨基酸修饰)、多特异性抗体(包括双特异性抗体)和本领域已知和本文中论述的其他类似物。
传统抗体结构单元通常包含四聚体。各四聚体通常由相同的两对多肽链组成,各对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。将人类轻链分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。将重链分类为μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon),且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干子类,包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的子类。因此,如本文所用的“同种型”表示通过恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的子类中的任意。已知人类免疫球蛋白同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。应理解,治疗抗体也可包含同种型和/或子类的任何组合的混合物。
在多个实施方式中,IgG同种型用于本发明中,其中IgG1具体可用于多种应用中。
各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变区。在可变区中,对于重链和轻链的V域中的每个聚集三个环以形成抗原结合位点。所述环中的每个被称作互补决定区(在下文中称为“CDR”),其中氨基酸序列中的变化最明显。“可变”是指可变区的某些片段在抗体中的序列中广泛不同。可变区内的可变性并非均匀分布。换言之,V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对恒定伸展区组成,所述相对恒定的伸展区经各9-15个氨基酸长的称为“高变区”的极端可变较短区分开。
各VH和VL由三个高变区(“互补决定区”、“CDR”)和四个FR组成,自氨基端至羧基端按以下顺序排列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高变区一般包含以下氨基酸残基:轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1;“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)和重链可变区中的约31-35B(HCDR1;“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3);Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST(《免疫学热门蛋白质序列》),第5版Public Health Service(公众健康服务),National Institutes of Health(国家健康研究院),Bethesda,Md.(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)和重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3);Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。本发明的具体CDR描述于下文中。
在整个本说明书中,当提及可变域中的残基(大致轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时,一般使用卡贝特编号系统(Kabat numbering system)(例如Kabat等人,前述(1991))。
CDR促进形成抗体的抗原结合,或更具体地,表位结合位点。术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上位点。表位可由相连氨基酸或因蛋白质的三级折叠而毗邻的非相连氨基酸形成。由相连氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留,而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括呈独特空间构型的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。用于测定何种表位由给定抗体结合(即表位定位)的方法为本领域所已知的且包括例如免疫印迹法和免疫沉淀分析,其中测试间质蛋白酶的重叠或相连肽与给定抗间质蛋白酶抗体的反应性。测定表位的空间构型的方法包括本领域的技术和本文所述的那些技术,例如X射线结晶和2维核磁共振(参见例如Epitope Mapping Protocols(表位定位实验方案),Methods in Molecular Biology(分子生物学方法),第66卷,G.E.Morris编(1996))。术语“表位定位”是指鉴别用于抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位根据例如氨基酸或糖侧链的分子分组且通常具有具体结构特征以及荷质比特征。单一抗原可具有一个以上的表位。在本发明中,精确表位并非限定的;更确切地,本发明抗体结合间质蛋白酶受体且经内化或在效应细胞存在下引发ADCC反应的能力是重要的。
各链的羧基端部分限定主要负责效应功能的恒定区。Kabat等人收集重链和轻链的可变区的许多一级序列。基于序列的保守度,其将个别一级序列分类为CDR和构架且制得其清单(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(《免疫学热门序列》),第5版,NIH出版公司,第91-3242号,E.A.Kabat等人,通过引用全文纳入本文)。
在免疫球蛋白的IgG子类中,重链中存在若干免疫球蛋白域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中表示具有独特三级结构的免疫球蛋白区。本发明中所关注的为重链域,包括恒定重链(CH)域和铰链域。在IgG抗体的情形下,IgG同种型各具有三个CH区。因此,在IgG的情形下,“CH”结构域如下:“CH1”是指根据如Kabat中的EU指数的位置118-220。“CH2”是指根据如Kabat中的EU指数的位置237-340,且“CH3”是指根据如Kabat中的EU指数的位置341-447。
重链的另一类型的Ig域为铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中表示包含抗体的第一和第二恒定结构域的间的氨基酸的挠性多肽。在结构上,IgG CH1结构域在EU位置220处结束,且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此,对于IgG,抗体铰链在本文中限定为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236),其中编号是根据如Kabat中的EU指数。在一些实施方式中,例如在Fc区的情形下,包括下部铰链,其中“下部铰链”一般指位置226或230。
本发明中尤其受关注的为Fc区。如本文所用,“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”表示包含抗体恒定区(第一恒定区免疫球蛋白结构域除外)和在一些情况下,铰链的一部分的多肽。因此,Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、和这些结构域的挠性铰链N端。对于IgA和IgM,Fc可包括J链。对于IgG,Fc结构域包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)和Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的下部铰链区。虽然Fc区的边界可改变,但人类IgG重链Fc区通常限定为包括残基C226或P230至其羧基端,其中编号是根据如Kabat中的EU指数。在一些实施方式中,如下文更充分地描述,对Fc区进行氨基酸修饰,例如以改变与一种或多种FcγR受体或与FcRn受体的结合。
在一些实施方式中,抗体为全长。“全长抗体”在本文中表示构成抗体的天然生物学形式的结构,包括可变区和恒定区,包括如本文所概述的一种或多种修饰。
或者,抗体可为多种结构,包括但不限于抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体偶联物”)和对应地每个的片段。依赖于使用一组CDR的结构包括在“抗体”的定义内。
在一个实施方式中,所述抗体为抗体片段。特异性抗体片段包括但不限于:(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段,(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段,(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段;(iv)由单一可变物组成的dAb片段(Ward等人,1989,Nature 341:544-546,通过引用全部纳入),(v)分离的CDR区,(vi)F(ab')2片段,包含两个连接的Fab片段的二价片段,(vii)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接,使得两个结构域关联以形成抗原结合位点(Bird等人,1988,Science 242:423-426,Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883,通过引用全部纳入),(viii)双特异性单链Fv(WO 03/11161,通过引用纳入本文中)和(ix)“双功能抗体”或“三功能抗体”,通过基因融合构筑的多价或多特异性片段(Tomlinson等人,2000,MethodsEnzymol.326:461-479;WO94/13804;Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448,都通过引用全部纳入)。
嵌合和人源化抗体
在一些实施方式中,抗体可为来自不同物种的混合物,例如嵌合抗体和/或人源化抗体。即,在本发明中,CDR组可与除由本文序列具体描述的构架区和恒定区以外的构架区和恒定区一起使用。
一般而言,“嵌合抗体”和“人源化抗体”是指组合来自一种以上物种的区的抗体。例如,“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下,大鼠)的可变区和来自人类的恒定区。“人源化抗体”一般是指已用人类抗体中发现的序列交换可变结构域构架区的非人类抗体。一般而言,在人源化抗体中,除CDR之外的整个抗体由人类来源的聚核苷酸编码,或除在其CDR内之外,与此类抗体一致。一些或全部由来源于非人类生物体的核酸编码的CDR移植至人类抗体可变区的β折叠构架中以形成抗体,其特异性由移植的CDR决定。此类抗体的形成描述于例如WO 92/11018;Jones,1986,Nature 321:522-525;Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中,其都通过引用全部纳入。常常需要使所选受体构架残基“回复突变”成对应供体残基以恢复初始移植构建体中损失的亲和力(US 5530101;US 5585089;US 5693761;US 5693762;US 6180370;US 5859205;US 5821337;US 6054297;US 6407213,都通过引用全文纳入本文)。人源化抗体优选也应包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分,通常为人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区,且因此应通常包含人类Fc区。人源化抗体也可使用具有经基因工程改造的免疫系统的小鼠来产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654,通过引用全文纳入本文。使非人类抗体人源化和重建的多种技术和方法本领域已知(参见Tsurushita和Vasquez,2004,Humanization ofMonoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells(单克隆抗体人源化,B细胞分子生物学),533-545,Elsevier Science(USA)及其中所引用的参考文献,其都通过引用全文纳入本文)。人源化方法包括但不限于以下文献中所述的方法:Jones等人,1986,Nature321:522-525;Riechmann等人,1988;Nature 332:323-329;Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536;Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33;He等人,1998,J.Immunol.160:1029-1035;Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9;Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9;Gorman等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185;O'Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8,其都通过引用全文纳入本文。人源化或降低非人类抗体可变区免疫原性的其他方法可包括表面重建方法,如例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中所述,其通过引用全文纳入本文。在一个实施方式中,亲本抗体如本领域已知已为亲和力成熟的。可采用基于结构的方法用于人源化和亲和力成熟,如例如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可用以使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟,包括但不限于Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162:Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684;Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618;Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:8910-8915;Krauss等人,2003,Protein Engineering16(10):753-759中所述的方法,其都通过引用全文纳入本文。其他人源化方法可涉及移植仅部分CDR,包括但不限于USSN 09/810,510;Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125;De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中所述的方法,其都通过引用全文纳入本文。
在一个实施方式中,本发明的抗体可为多特异性抗体且尤其双特异性抗体,也有时称为“双功能抗体”。这些抗体为结合两个(或两个以上)不同抗原或相同抗原上的不同表位的抗体。双功能抗体可以本领域已知的多种方式来制造(Holliger和Winter,1993,Current Opinion Biotechnol.4:446-449,其通过引用全文纳入本文),例如以化学方式或由杂交瘤来制备。
在一个实施方式中,抗体为微型抗体。微型抗体为包含接合至CH3域的scFv的最小化抗体样蛋白质。Hu等人,1996,Cancer Res.56:3055-3061,通过引用全文纳入本文。在一些情况下,scFv可接合至Fc区,且可包括一些或整个铰链区。应注意,尽管微型抗体不具有一组完整的CDR的事实,其仍包括在“抗体”的定义内。
本发明的抗体一般为分离的或重组的。“分离的”在用于描述本文所公开的各种多肽时,表示已从表达细胞或细胞培养物鉴定和分离和/或回收的多肽。因此,分离的抗体指实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合间质蛋白酶的分离的抗体实质上不含特异性结合除间质蛋白酶以外的抗原的抗体)。因此,“分离的”抗体为发现呈在自然界中正常未发现的形式的抗体(例如非天然存在的)。
在一些实施方式中,本发明的抗体为重组蛋白质、分离的蛋白质或实质上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质没有伴随在其天然状态中与其正常关联的至少一些物质,例如占给定样品总蛋白质的至少约5重量%或至少约50重量%。应理解,分离的蛋白质可任选而定,占总蛋白质含量的5重量%至99.9重量%。例如,蛋白质可通过使用诱导性启动子或高表达启动子而以明显较高浓度制得,使得蛋白质以增加的浓度水平制得。就重组蛋白质而言,定义包括在本领域已知的广泛多种生物体和/或宿主细胞中产生非天然产生的抗体。通常,分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如,特异性结合间质蛋白酶的分离的抗体实质上不含特异性结合除间质蛋白酶以外的抗原的抗体。
具有不同特异性的分离的单克隆抗体可组合在明确定义的组合物中。因此,例如,本发明的抗体可任选和单独包括或排除在制剂中,如下文进一步论述。
本发明的抗间质蛋白酶抗体特异性结合间质蛋白酶(例如间质蛋白酶-主干(SEQID NO:21-24))。“特异性结合”或“特异性结合至”或“对”具体抗原或表位“具有特异性”表示可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过测定一种分子的结合相较于对照分子(一般为不具结合活性的类似结构分子)的结合来测量。例如,可通过与类似于标靶的对照分子的竞争测定特异性结合。
针对具体抗原或表位的特异性结合可例如通过抗体对抗原或表位具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大的KD来显现,其中KD指具体抗体-抗原相互作用的解离速率。通常,特异性结合抗原的抗体相对于抗原或表位应具有比对照分子大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或10,000倍以上的KD。然而,在本发明中,当给予本发明的间质蛋白酶抗体的ADC时,重要的是KD足以允许内化且因此使得细胞死亡而无明显副作用。
另外,针对具体抗原或表位的特异性结合可例如通过抗体对抗原或表位具有相对于对照对表位大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或10,000倍以上的KA或Ka来显现,其中KA或Ka是指具体抗体-抗原相互作用的关联速率。
评估抗体对间质蛋白酶的结合能力的标准分析可在蛋白质或细胞水平上进行且为本领域已知的,包括例如ELISA、Western印迹、RIA、分析和流式细胞分析。适合的分析在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可通过本领域已知的标准分析,例如通过分析来评定。为评估与Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞的结合,可从公开可用的来源(例如美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))获得Raji(ATCC保藏号CCL-86)或Daudi(ATCC保藏号CCL-213)细胞且用于标准分析,例如流式细胞分析。
间质蛋白酶抗体
本发明提供特异性结合人类间质蛋白酶(SEQ ID NO:21-24)的主干且在与表达细胞表面上的间质蛋白酶的细胞接触时内化的间质蛋白酶抗体。这些抗体在本文中称为“抗间质蛋白酶”抗体,或为易于描述称为“间质蛋白酶抗体”。
间质蛋白酶抗体可在与细胞,具体为在表面上表达间质蛋白酶的肿瘤细胞接触时内化。因此,也包含药物偶联物的如本文所定义的间质蛋白酶抗体由肿瘤细胞内化,导致药物释放和随后细胞死亡,允许治疗表现间质蛋白酶表达的癌症。内化在此情形中可以若干方式加以测量。在一个实施方式中,使用例如MAbZap和HuZap的标准分析,本发明的间质蛋白酶抗体与例如本文中概述的细胞系的细胞接触。技术人员应清楚,MabZap分析表示效应将预期在抗体-药物偶联物(ADC)的情况下可见。在后一情况中,ADC将经内化,由此将药物放入细胞中。毒性药物将具有杀死细胞,即杀死靶向癌细胞的能力。本领域技术人员可容易地接受来自MabZap分析的资料代表ADC分析(Kohls,M和Lappi,D.,[2000]Biotechniques,第28卷,第1号,162-165)。在这些体外分析实施方式中,本发明的间质蛋白酶抗体连同包含毒素的抗间质蛋白酶抗体一起添加;例如间质蛋白酶抗体可为鼠类或人源化的,且抗间质蛋白酶抗体可为抗鼠类或抗人源化的且含有例如沙泊宁(saporin)的毒素。在形成[本发明的间质蛋白酶抗体]-[抗间质蛋白酶抗体-药物偶联物]复合物后,所述复合物经内化且释放药物(例如沙泊宁),导致细胞死亡。仅在内化后释放药物,且因此细胞在不存在内化的情况下保持活力。如下文所概述,不受理论限制,在治疗性应用中,抗间质蛋白酶抗体含有毒素且在内化后,抗体与毒素之间的键裂解,释放毒素且杀死细胞。
另外,间质蛋白酶抗体可在效应细胞,具体为表达表面上的间质蛋白酶的肿瘤细胞存在下引发ADCC反应。
在一个实施方式中,所述抗体包含本文所述的具体抗体(例如在本文中称为“间质蛋白酶_A1”)的重链和轻链互补决定区(CDR)或可变区(VR)。因此,在一个实施方式中,抗体包含具有SEQ ID NO:1所示的序列的抗体A1的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2和CDR3域,和具有SEQ ID NO:2所示的序列的A1的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3域。
在另一实施方式中,抗体包含包括包含SEQ ID NO:5的第一VHCDR;包含SEQ IDNO:6的第二VHCDR;和包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR的重链可变区;和包括包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR;包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR;和包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR的轻链可变区。在另一实施方式中,本发明抗体结合人类间质蛋白酶且包括含选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列及其保守序列修饰的重链可变区。所述抗体可进一步包括含选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列及其保守序列修饰的轻链可变区。
在另一实施方式中,本发明的抗体结合人类间质蛋白酶且包括分别包括SEQ IDNO:1和/或2所示的氨基酸序列及其保守序列修饰的重链可变区和轻链可变区。
包括与以上序列中的任意具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或99%以上序列相同性的重链和轻链可变区的分离的抗体也包括在本发明中。本发明也包含在上述值中间的范围,例如与以上序列中的任意具有至少80-85%、85-90%、90-95%或95-100%序列相同性的重链和轻链可变区。在一个实施方式中,所述抗体包括包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的序列的重链可变区。在另一实施方式中,所述抗体包括包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的序列的轻链可变区。在另一实施方式中,抗体包含重链构架区,所述重链构架区包含与SEQ IDNO:1的重链可变区的构架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的氨基酸序列,其包含SEQ ID NO29、30、31和32。在另一实施方式中,抗体包含轻链构架区,所述轻链构架区包含与SEQ IDNO:2的轻链可变区的构架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性的氨基酸序列,其包含SEQ ID NO33、34、35和36。在一个实施方式中,本发明的抗体为包含以下CDR的抗间质蛋白酶抗体(在本文中称为“A1”抗体)以及含有有限数目的氨基酸变体的变体:
A1 SEQ ID NO
可变重链CDR1 5
可变重链CDR2 6
可变重链CDR3 7
可变轻链CDR1 8
可变轻链CDR2 9
可变轻链CDR3 10
本文也公开包含本发明的具体间质蛋白酶抗体(例如A1)的CDR组的可变重链和轻链,以及全长重链和轻链(例如也包含恒定区)。本领域技术人员应理解,本发明的CDR组可纳入鼠类、人源化或人类恒定区(包括构架区)中。如关于A1和huA1所示,鼠类与人类序列之间的氨基酸相同性为约90%。因此,本发明提供与本文所公开的SEQ ID至少约90%-99%一致的可变重链和轻链,其中90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%都可用于本发明中。
与本发明的间质蛋白酶抗体结合相同表位的抗体
在另一实施方式中,本发明提供与本发明的间质蛋白酶单克隆抗体中的任意结合人类间质蛋白酶上的相同表位的抗体。关于两个或两个以上抗体的术语“结合相同表位”表示抗体竞争结合抗原和结合氨基酸的相同、重叠或涵盖的连续或非连续区段。本领域技术人员理解词组“结合相同表位”未必表示抗体结合完全相同的氨基酸。抗体结合的确切氨基酸可不同。例如,第一抗体可结合由第二抗体所结合的氨基酸区段完全涵盖的氨基酸区段。在另一实施例中,第一抗体结合与由第二抗体结合的一个或多个区段明显重叠的一个或多个氨基酸区段。出于本文的目的,此类抗体视为“结合相同表位”。
因此,本发明也涵盖结合间质蛋白酶上的表位的抗体,所述表位包含由本文所述的具体抗体识别的表位的全部或一部分(例如相同或重叠区或介于区之间或跨越所述区的区)。
本发明也涵盖与本文所述的抗体结合相同表位的抗体和/或与本文所述的抗体竞争结合人类间质蛋白酶的抗体。可使用常规技术鉴定识别相同表位或竞争结合的抗体。此类技术包括例如免疫分析,其展示一种抗体阻断另一抗体结合目标抗原的能力,即竞争性结合分析。竞争性结合在受测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与例如间质蛋白酶的常见抗原的特异性结合的分析中加以测定。已知许多类型的竞争性结合分析,例如:固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见Stahli等人,Methods in Enzymology 9:242(1983));固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人,J.Immunol.137:3614(1986));固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析(参见Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体:实验室手册》),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1988));使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人,Mol.Immunol.25(1):7(1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,Virology 176:546(1990));和直接标记RIA(Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。此类分析通常涉及使用结合于带有未经标记的测试免疫球蛋白和经标记的参考免疫球蛋白中任意的固体表面或细胞的经纯化抗原。竞争性抑制是通过测定在测试免疫球蛋白存在下结合于固体表面或细胞的标记的量来测量。测试免疫球蛋白通常过量存在。通常,当竞争抗体过量存在时,其将抑制参考抗体与常见抗原的特异性结合少50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-99%或99%以上。
其他技术包括例如表位定位方法,例如抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析,其提供表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合,其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰的结合损失常常视为表位组分的指示。此外,也可使用表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于所关注的抗体亲和分离来自组合噬菌体呈现肽库的具体短肽的能力。肽则视为与用于筛检肽库的抗体对应的表位的定义的例子。对于表位定位,也已开发展示定位构型不连续表位的计算算法。
在一具体实施方式中,抗体与包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其具有至少80%相同性的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合间质蛋白酶。在另一实施方式中,抗体与包括含SEQ ID NO:1和2(A1)所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合间质蛋白酶。
本发明的其他抗体结合由本文所述的抗体识别的间质蛋白酶上的表位。在另一具体实施方式中,抗体结合由包括含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同性的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体识别的间质蛋白酶上的表位。在另一实施方式中,抗体结合由包括含SEQ ID NO:1和2(A1)所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体识别的间质蛋白酶上的表位。
间质蛋白酶的单克隆抗体的表征
可使用多种已知技术表征本发明的单克隆抗体结合间质蛋白酶。一般而言,抗体最初通过ELISA表征。简言之,微量滴定盘可用含经纯化间质蛋白酶的PBS涂布,且随后用稀释于PBS中的例如牛血清白蛋白(BSA)的不相关蛋白质阻断。将来自经间质蛋白酶免疫的小鼠的血浆稀释液添加至各孔且在37℃下孵育1-2小时。盘用PBS/吐温20洗涤且随后与偶联至碱性磷酸酶的山羊抗人类IgG Fc特异性多克隆试剂一起在37℃下孵育1小时。在洗涤后,盘用ABTS底物显影且在OD 405下分析。优选地,出现最高效价的小鼠将用于融合蛋白。
如上所述的ELISA分析可用于筛检展示与间质蛋白酶免疫原的阳性反应性的抗体,且因此筛检产生所述抗体的杂交瘤。可接着亚克隆优选以高亲和力结合间质蛋白酶的杂交瘤且进一步表征。可接着从保留亲本细胞的反应性(通过ELISA)的各杂交瘤选择一个克隆用于制造细胞库和用于抗体纯化。
为纯化抗间质蛋白酶抗体,所选杂交瘤可在滚瓶、两升转瓶或其他培养系统中生长。可过滤上清液且浓缩,随后用蛋白质A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)亲和层析以纯化蛋白质。在缓冲液更换为PBS后,可通过使用1.43消光系数的OD280或优选通过浊度分析测定浓度。IgG可通过凝胶电泳和通过抗原特异性方法来检查。
为测定所选抗间质蛋白酶单克隆抗体是否结合独特表位,可使用市售试剂(伊利诺州罗克福德,皮尔斯公司(Pierce))对各抗体进行生物素标记。可使用抗生蛋白链菌素标记的探针检测生物素标记的MAb结合。为测定经纯化抗体的同种型,可使用本领域公认的技术进行同种型ELISA。例如,微量滴定盘的孔可在4℃下用10μg/ml抗Ig涂布隔夜。在用5%BSA阻断后,使盘在环境温度下与10μg/ml单克隆抗体或经纯化同种型对照反应两小时。可接着使孔与特异性结合探针的IgG1或其他同种型反应。显影滴定盘,且如以上所描述分析。
为测试单克隆抗体与表达间质蛋白酶的活细胞的结合,可使用流式细胞术。简言之,使表达膜结合间质蛋白酶的细胞系和/或人类PBMC(在标准生长条件下生长)在4℃下与含有0.1%BSA的含各种浓度的单克隆抗体的PBS混合1小时。在洗涤后,使所述细胞在与一次抗体染色相同的条件下与经荧光素标记的抗IgG抗体反应。样品可通过使用光散射和侧向散射特性对单细胞进行闸控的FACScan仪器来分析,且测定经标记抗体的结合。除流式细胞仪分析之外或代替流式细胞仪分析,可使用使用荧光显微镜术的替代性分析。细胞可完全如上所述染色且由荧光显微镜术进行检验。所述方法允许目测个别细胞,但可视抗原密度而使敏感性减小。
可通过Western印迹法进一步测试抗间质蛋白酶IgG与间质蛋白酶抗原的反应性。简言之,可由表达间质蛋白酶的细胞制备细胞提取物且进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后,将所述分离的抗原转移至硝酸纤维素膜,以20%小鼠血清阻断,且以待测试的单克隆抗体探查。可使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合且通过BCIP/NBT受质锭剂(蒙拿大州圣路易斯,西格玛化学公司(Sigma Chem.Co.))显影。
用于分析各种抗间质蛋白酶抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准分析,例如使用BiacoreTM 2000SPR仪器(瑞典乌普萨拉,比亚科公司(Biacore AB))的BiacoreTM表面电浆子共振(SPR)分析。
在一个实施方式中,抗体特异性地结合包含SEQ ID NO:26或功能部分,例如主干(SEQ ID NO:21-24)的人类间质蛋白酶。优选地,本发明的抗体以高亲和力结合人类间质蛋白酶。
优选地,本发明抗体结合具有5×10-8M或5×10-8M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有2×10-8M或2×10-8M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有5×10-9M或5×10-9M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有4×10-9M或4×10-9M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有3×10-9M或3×10-9M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有2×10-9M或2×10-9M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有1×10-9M或1×10-9M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质、结合具有5×10-10M或5×10-10M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质或结合具有1×10-10M或1×10-10M以下的KD的间质蛋白酶蛋白质。
在一个实施方式中,本发明的抗体与本文所述的具体抗间质蛋白酶抗体(例如_A1)竞争(例如交叉竞争)结合间质蛋白酶。此类竞争抗体可基于其在标准间质蛋白酶结合分析中竞争性抑制一种或多种mAb结合间质蛋白酶的能力来鉴定。例如,可使用标准ELISA分析,其中将重组人类间质蛋白酶蛋白质固定于滴定盘上,荧光标记一种抗体且评估未标记的抗体竞争断开经标记抗体的结合的能力。或者或另外,可使用BIAcore分析来评估抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制本发明的抗间质蛋白酶抗体与人类间质蛋白酶结合的能力表明测试抗体可与抗体竞争结合人类间质蛋白酶。
在一个实施方式中,竞争抗体为与本文所述的具体抗间质蛋白酶单克隆抗体(例如A1)结合人类间质蛋白酶上的相同表位的抗体。例如x射线结晶和2维核磁共振的标准表位定位技术可用于测定抗体是否与参考抗体结合相同表位(参见例如Epitope MappingProtocols(表位定位实验方案),Methods in Molecular Biology(分子生物学方法),第66卷,G.E.Morris编(1996))。
在一个实施方式中,竞争结合间质蛋白酶和/或结合人类间质蛋白酶上的相同表位的抗体为人类抗体。所述人类单克隆抗体可如实施例中所述来制备和分离。
一旦已分离具有本文所述的所需特性的单一、原型抗间质蛋白酶mAb,则容易通过使用本领域已知的方法产生具有类似特性(例如具有相同表位)的其他mAb。例如,小鼠可经如本文所述的间质蛋白酶免疫,产生杂交瘤,且就与原型mAb竞争结合间质蛋白酶的能力筛检所得mAb。小鼠也可经含有原型mAb所结合的表位的间质蛋白酶的较小片段免疫。表位可通过例如筛检与跨越间质蛋白酶的一系列重叠肽的结合来定位。或者,可使用Jespers等人,Biotechnology 12:899,1994的方法支配具有与原型mAb相同的表位且因此具有类似特性的mAb的选择。使用噬菌体呈现,首先使原型抗体的重链与(优选人类)轻链的谱系配对以选择结合间质蛋白酶的mAb,且随后使新轻链与(优选人类)重链的谱系配对以选择具有与原型mAb相同的表位的(优选人类)结合间质蛋白酶的mAb。或者,可通过编码抗体重链和轻链的cDNA的诱变法获得原型mAb的变体。
可进行例如如Champe等人(1995)J.Biol.Chem.270:1388-1394中所述的表位定位以测定抗体是否结合所关注的表位。人类间质蛋白酶中氨基酸残基的如Cunningham和Wells(1989)Science 244:1081-1085所述的“丙氨酸扫描诱变法”或一些其他形式的点诱变法也可用于测定本发明的抗间质蛋白酶抗体的功能性表位。然而,诱变法研究也可展示对间质蛋白酶的整体三维结构关键单不直接涉和抗体-抗原接触的氨基酸残基,且因这可能需要证实使用此方法测定的功能表位的其他方法。
由特异性抗体结合的表位也可通过评估抗体与包含人类间质蛋白酶片段的肽的结合来测定。可合成一是列涵盖间质蛋白酶序列的重叠肽且例如在直接ELISA、竞争性ELISA(其中评估肽阻止抗体与结合微量滴定盘的孔的间质蛋白酶结合的能力)或于芯片上就结合进行筛检。此类肽筛检方法可能无法检测一些不连续的功能性表位,即涉和氨基酸残基沿着间质蛋白酶多肽链的一级序列为不相连的功能性表位。
也可通过结构方法,例如x射线晶体结构测定(例如WO2005/044853)、分子模拟和核磁共振(NMR)光谱法,包括在游离时和与感兴趣抗体结合于复合物中时的间质蛋白酶中的不稳定酰胺氢的H-D交换速率的NMR测定来确定与本发明的抗体结合的表位(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31,11335-11347;Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry32,6884-6891)。
关于X射线结晶学,结晶可使用本领域已知方法中的任意来实现(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50:339-350;McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1-23),包括微批量法(例如Chayen(1997)Structure 5:1269-1274)、悬滴蒸气扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300-6303)、播晶种和透析。需要使用具有至少约1mg/mL和优选约10mg/mL至约20mg/mL的浓度的蛋白质制剂。结晶可优选在含有浓度范围介于约10%至约30%(w/v)的聚乙二醇1000-20,000(PEG;平均分子量范围介于约1000至约20,000Da),优选约5000至约7000Da,优选约6000Da的沉淀剂溶液中实现。也可能需要包括蛋白质稳定剂,例如甘油,其浓度介于约0.5%至约20%范围内。沉淀剂溶液中也可能需要适合的盐,例如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠,浓度范围优选介于约1mM至约1000mM。沉淀剂优选缓冲至约3.0至约5.0、优选约4.0的pH。适用于沉淀剂溶液中的具体缓冲液可变化且为本领域已知的(Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(《蛋白质纯化:原理与实践》),第三版,(1994)纽约施普林格出版社(Springer-Verlag))。适用的缓冲剂的实施例包括但不限于HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可在各种温度下生长,包括2℃、4℃、8℃和26℃。
抗体:抗原晶体可使用已知X射线绕射技术研究且可使用例如X-PLOR(耶鲁大学,1992,由分子模拟公司(Molecular Simulations,Inc.)发行;参见例如Blundell和Johnson(1985)Meth.Enzymol.114和115,H.W.Wyckoff等人编,学术出版社(Academic Press);美国专利申请公开第2004/0014194号)和BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49:37-60;Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A:361-423,Carter和Sweet编.;Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56:1313-1323)的计算机软件改进,所述文献的内容通过引用全文纳入本文中。
如本文所述的抗体竞争分析可用于测定抗体是否与另一抗体“结合相同表位”。通常,已知与表位相互作用的抗体在第二抗体过量且首先使所有位点饱和的条件下,由第二抗体竞争50%或50%以上、60%或60%以上、70%或70%以上,例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上指示所述抗体“结合相同表位”。为评估两种抗体之间的竞争水平,可使用抗体的放射免疫分析或使用其他标记的分析。例如,间质蛋白酶抗原可与饱和量的与标记化合物(例如3H、125I、生物素或铷)偶联的第一抗间质蛋白酶抗体或其抗原结合片段在相同量的第二未标记抗间质蛋白酶抗体存在下一起孵育。接着评估在未标记的阻断抗体存在下结合抗原的经标记抗体的量,且与在不存在未标记的阻断抗体的情况下的结合相比。竞争是通过在未标记的阻断抗体存在下,与不存在阻断抗体相比的结合信号的变化百分比来测定。因此,若在阻断抗体存在下经标记抗体的结合与无阻断抗体存在下的结合相比存在50%抑制,则在两种抗体之间存在50%的竞争。因此,第一与第二抗体之间50%或50%以上、60%或60%以上、70%或70%以上,例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的竞争表示第一抗体抑制第二抗体(或反的也然)与抗原的结合达50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上(与无第一抗体存在下抗原与第二抗体的结合相比)。因此,第一抗体与抗原的结合由第二抗体抑制50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上表明所述两种抗体结合相同表位。
抗体修饰
本发明还提供变异抗体,有时称为“抗体衍生物”或“抗体类似物”。即存在多种可对本发明抗体进行的修饰,包括但不限于CDR中的氨基酸修饰(亲和力成熟)、Fc区中的氨基酸修饰、糖基化变体、其他类型的共价修饰(例如用于连接药物偶联物等。
“变体”在本文中表示由于至少一个氨基酸修饰而与亲本多肽不同的多肽序列。在一个实施方式中,亲本多肽为SEQ ID NO:1和2中所列的全长可变重链和/或轻链。氨基酸修饰可包括取代、插入和缺失,在多数情况下前者优选。
一般而言,如本文所述,变体可包括任意数目的修饰,只要抗体的功能仍存在。因此,例如,本发明的变异抗体应仍特异性结合人类间质蛋白酶。类似地,若例如产生具有Fc区的氨基酸变体,则变异抗体应维持抗体的具体应用或适应症所需的受体结合功能。
在此情况下,可在列出的抗体CDR序列、构架区或Fc区中制得“变体”。
然而,一般使用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代,因为目标常常为用最小数目的修饰改变功能。在一些情况下,存在1至5个修饰(例如个别氨基酸取代、插入或缺失),在许多实施方式中,也发现使用1-2、1-3和1-4个。修饰的数目可视所修饰区的尺寸而定;例如,CDR区中一般需要较少修饰。然而,如本文所示,本文中的A1的CDR为类似的,使得可进行多种氨基酸变化和保留结合。
应注意,许多氨基酸修饰可在功能结构域内:例如,可能需要在野生型或经工程改造的蛋白质的Fc区中具有1-5个修饰,以及在例如Fv区中具有1至5个修饰。变异多肽序列将优选与亲本序列(例如可变区、恒定区和/或重链和轻链序列A1)具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性。应注意,视序列的尺寸而定,相同性百分比应视氨基酸的数目而定。
对于在VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的可变区修饰而言,可进行定点诱变法或PCR介导的诱变法以引入突变且可在如本文所述且提供于实施例中的体外或体内分析中评估对抗体结合或其他相关功能属性的作用。优选引入保守修饰(如本文中所论述)。突变可为氨基酸取代、添加或缺失,但优选为取代。此外,通常CDR区内不大于1个、2个、3个、4个或5个残基得以改变。
因此,在另一实施方式中,本发明提供分离的抗间质蛋白酶单克隆抗体,或其抗原结合部分,其包含:(a)包含选自SEQ ID NO:5的氨基酸序列或相比于SEQ ID NO:5具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR1区;(b)包含选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列或相比于SEQ ID NO:6具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区;(c)包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列或相比于SEQ ID NO:7具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区;(d)包含选自SEQ ID NO:8的氨基酸序列或相比于SEQ ID NO:8具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区;(e)包含选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列或相比于SEQ ID NO:9具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区;和(f)包含选自SEQ ID NO:10的氨基酸序列或相比于SEQ ID NO:10具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”表示亲本多肽序列中的具体位置处的氨基酸经另一氨基酸置换。例如,取代S100A是指在位置100处的丝氨酸经丙氨酸置换的变异多肽。如本文所用的“氨基酸插入”或“插入”表示在亲本多肽序列的具体位置添加氨基酸。如本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”表示移除在亲本多肽序列中的具体位置处的氨基酸。
如本文所用的“亲本多肽”、“亲本蛋白质”、“前驱多肽”或“前驱蛋白质”表示随后经修饰以产生变体的未经修饰的多肽。一般而言,本文中的亲本多肽为A1)。因此,如本文所用的“亲本抗体”表示经修饰以产生变异抗体的抗体。
本文的“野生型”或“WT”或“天然”表示在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列,包括对偶基因变异。WT蛋白质、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本文的“变异Fc区”表示由于至少一个氨基酸修饰而与野生型Fc序列不同的Fc序列。Fc变体可指Fc多肽本身、包含Fc变异多肽的组合物或氨基酸序列。
在一些实施方式中,在抗体(A1中的任意)的一个或多个CDR中进行一个或多个氨基酸修饰。一般,在任意单个CDR中仅取代1或2或3个氨基酸,且在一组CDR内一般进行不超过4、5、6、7、8、9或10个变化。然而,应理解,任意CDR中无取代、1、2或3个取代的任何组合可独立地和任选与任何其他取代组合。在一些情况下,CDR中的氨基酸修饰称为“亲和力成熟”。“亲和力成熟”抗体为在一个或多个CDR中具有一个或多个改变,从而产生与不具有那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力改良的抗体。在一些情况下,虽然稀少,但可能需要降低抗体对其抗原的亲和力,但此举一般并非优选。
可进行亲和力成熟化作用,使抗体对抗原的结合亲和力提高至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、约110%、约120%、约130%、约140%、约150%或150%以上,或比“亲本”抗体提高1、2、3、4至5倍。优选亲和力成熟抗体对标靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟抗体通过已知程序产生。参见例如,Marks等人,1992,Biotechnology 10:779-783,其描述通过可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域改组的亲和力成熟化。CDR和/或构架残基的随机诱变法描述于例如Barbas等人1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813;Shier等人,1995,Gene 169:147-155;Yelton等人,1995,J.Immunol.155:1994-2004;Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9;和Hawkins等人,1992,J.Mol.Biol.226:889-896中。
或者,可在“静默”(例如不明显改变抗体对抗原的亲和力)的本发明抗体的一个或多个CDR中进行氨基酸修饰。可出于许多原因进行这些修饰,包括使表达优化(如对编码本发明抗体的核酸所进行的)。
因此,变异CDR和变异抗体包括在本发明的CDR和抗体的定义内;即,本发明的抗体可包括A1的一个或多个CDR中的氨基酸修饰。此外,如下文所概述,也可在CDR外的任何区域(包括如本文所述的构架区和恒定区)中独立地和任选进行氨基酸修饰。
在一些实施方式中,本发明的抗间质蛋白酶抗体由变异Fc结构域组成。如本领域已知,抗体的Fc区与许多Fc受体和配位体相互作用,赋予一系列重要的功能性能力,称为效应功能。这些Fc受体包括但不限于(在人类中)FcγRI(CD64),包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc;FcγRII(CD32),包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc;和FcγRIII(CD16),包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158,与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)相关)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)、FcRn(新生儿受体)、C1q(参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的补体蛋白质)和FcRn(参与血清半衰期的新生儿受体)。可在一个或多个位置处进行适合的修饰,如例如美国专利申请案11/841,654和其中所引用的参考文献、US 2004/013210、US 2005/0054832、US 2006/0024298、US 2006/0121032、US 2006/0235208、US2007/0148170、USSN 12/341,769、美国专利第6,737,056号、美国专利第7,670,600号、美国专利第6,086,875号中所大体概述,其都以全文引用的方式明确地纳入,且特别指提高与Fc受体的结合性的具体氨基酸取代法。
除以上概述的修饰的外,可进行其他修饰。例如,可通过纳入连接VH和VL域的二硫键使分子稳定(Reiter等人,1996,Nature Biotech.14:1239-1245,通过引用全文纳入本文)。
此外,在半胱氨酸处的修饰尤其适用于抗体-药物偶联物(ADC)应用,其进一步描述如下。在一些实施方式中,抗体的恒定区可经工程改造以含有尤其具有“硫醇反应性”的一个或多个半胱氨酸,以便允许以更具特异性和控制的方式安置药物部分。参见例如美国专利第7,521,541号,其通过引用全文纳入本文中。
此外,存在多种可如下文所概述进行的抗体的共价修饰。
抗体的共价修饰包括在本发明的范畴内,且一般(但未必总是)在翻译后进行。例如,抗体的若干类型的共价修饰通过使抗体的特异性氨基酸残基与能够与所选择的侧链或N端或C端残基反应的有机衍生试剂反应引入分子中。
最通常使半胱氨酰基残基与α-卤基乙酸酯(和相应胺)(例如氯乙酸、氯乙酰胺)反应以得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑等反应而衍生。
组氨酰基残基通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应而衍生化,因为此试剂对组氨酰基侧链具相对特异性。对溴苯酰甲基溴也适用;反应优选在pH 6.0下于0.1M甲胂酸钠中进行。
使赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。其他用于衍生含有α-氨基的残基的合适试剂包括亚氨基酯类,例如甲基吡啶酰亚胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮和与乙醛酸酯的转氨酶催化的反应。
精氨酰基残基通过与一种或若干种常规试剂(其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮)反应而进行修饰。由于胍官能基具有高pKa,因此精氨酸残基的衍生化需要反应在碱性条件下进行。此外,这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可对酪氨酰基残基进行具体修饰,其中尤其关注通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记引入酪氨酰基残基中。最通常分别使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。酪氨酰基残基使用125I或131I碘化以制备用于放射免疫分析的经标记蛋白质,上述氯胺T方法为适合的。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R'-N=C=N--R')反应而选择性地修饰,其中R和R'为不同烷基,例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外,天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应而转化成天冬酰氨酰基和谷酰氨酰基残基。
用双功能试剂衍生化适用于使抗体交联至除下文所述的方法外的多种方法所用的不溶于水的支撑基质或表面。常用交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮水杨酸的酯)、同源双功能亚氨基酯(包括羟基琥珀酰亚胺,例如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双功能马来酰亚胺(例如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷)。例如3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺甲酯的衍生剂产生能够在光存在下形成交联的可光活化中间物。或者,采用不溶于水的反应性基质,例如美国专利第3,969,287号;第3,691,016号;第4,195,128号;第4,247,642号;第4,229,537号和第4,330,440号中所述的赛诺莫根溴化物(cynomolgusogen bromide)活化的糖和反应性底物进行蛋白质固定,所述专利都通过引用全文纳入本文。
常使谷酰氨酰基和天冬酰氨酰基残基脱去酰氨基以分别形成相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者,在适度酸性条件下将所述残基脱酰胺化。这些残基的任一形式均属于本发明范畴内。
其他修饰包括:脯氨酸和赖氨酸的羟基化;丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化;赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties(蛋白质:结构和分子性质),W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,第79-86页[1983],通过引用全文纳入本文)、N末端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
此外,如本领域技术人员应理解,标记(包括荧光、酶促、磁性、放射性等都可添加至抗体(以及本发明的其他组合物)。
双特异性分子
在另一方面中,本发明提供包含本发明的抗hTSLP抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可衍生成例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配位体)的另一功能分子或与其连接以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体可实际上衍生成或连接至一个以上其他功能分子以产生与两个以上不同结合位点和/或目标分子结合的多特异性分子;此类多特异性分子也由如本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子,可使本发明抗体(例如通过化学偶联、基因融合、非共价关联或其他方法)功能性连接至一个或多个其他结合分子,例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物,从而产生双特异性分子。
因此,本发明包括包含至少一种对hTSLP的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本发明的一个实施方式中,第二靶表位为Fc受体,例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此,本发明包括能够结合表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN)和表达间质蛋白酶的目标细胞的双特异性分子。这些双特异性分子靶向表达间质蛋白酶的细胞至效应细胞且触发Fc受体介导的效应细胞活性,例如表达间质蛋白酶的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子产生。
在本发明的一实施方式中(其中双特异性分子为多特异性的),分子可进一步包括除抗Fc结合特异性和抗间质蛋白酶结合特异性以外的第三结合特异性。在一实施方式中,所述第三结合特异性为一抗-增强因子(EF)部分,例如结合参与细胞毒素活性的表面蛋白质且因此增加抵抗所述目标细胞的免疫反应的分子。所述“抗强化因子部分”可为与给定分子(例如抗原或受体)结合,且由此使得结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的效应增强的抗体、功能抗体片段或配位体。所述“抗强化因子部分”可结合Fc受体或靶细胞抗原。或者,所述抗强化因子部分可结合一不同于第一和第二结合特异性所结合的实体的实体。例如,所述抗强化因子部分可结合细胞毒性T-细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或使得抗靶细胞的免疫反应增加的其他免疫细胞)。
在一实施方式中,本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一个抗体或其抗体片段,包括(例如)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb或单链Fv。所述抗体也可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段,例如Fv或如美国专利第4,946,778号中所述的单链构建体,其内容通过引用明确纳入。
在一实施方式中,由单克隆抗体提供对Fc受体的结合特异性,所述单克隆抗体的结合不受人类免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文所用,术语“IgG受体”是指位于染色体1上的八个γ-链基因中的任意。这些基因编码总共十二个跨膜或可溶受体同种型,其分组成三个Fcγ受体类别:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方式中,Fcγ受体为人类高亲和力FcγRI。人类FcγRI为72kDa分子,其展示对单体IgG的高亲和力(108-109M-1)。
某些优选抗Fcγ单克隆抗体的产生和表征描述于PCT公开WO 88/00052和美国专利第4,954,617号中,其内容通过引用全部纳入本文中。这些抗体在不同于受体的Fcγ结合位点的位点处结合FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位,且因此其结合实质上不受生理含量的IgG阻断。适用于本发明的特异性抗FcγRI抗体为mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb197。产生mAb 32的杂交瘤获自美国菌种保藏中心,ATCC储存编号HB9469。在其他实施方式中,抗Fcγ受体抗体为人源化形式的单克隆抗体22(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano,R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10):4996-5002和PCT公开WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系以名称HA022CL1储存在美国菌种保藏中心,储存编号CRL 11177。
在其他优选实施方式中,由结合例如Fc-α受体[FcαRI(CD89)]的人类IgA受体的抗体提供对Fc受体的结合特异性,其结合优选不受人类免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”包括位于染色体19上的一种α-基因的基因产物(FcαRI)。已知此基因编码若干55至110kDa的替代性剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)组成性表达于单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上,但未表达于非效应细胞群体。FcαRI对于IgA1和IgA2二者具有介质亲和力(5×107M-1,其在暴露于例如G-CSF或GM-CSF的细胞因子时增加[Morton,H.C.等人(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440]。已描述鉴别为A3、A59、A62和A77的四种FcαRI特异性单克隆抗体,其结合IgA配位体结合域外部的FcαRI[Monteiro,R.C.等人(1992)J.Immunol.148:1764]。
FcαRI和FcγRI为用于本发明的双特异性分子的优选触发受体,因为其(1)主要表达于例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突状细胞的免疫效应细胞上;(2)以高含量表达(例如每一细胞5,000-100,000);(3)细胞毒素活性(例如ADCC、吞噬作用)的介导物;和(4)介导靶向其的抗原(包括自体抗原)的增强的抗原呈现。
可用于本发明的双特异性分子中的抗体为鼠类、人类、嵌合和人源化单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可通过使用本领域已知的方法偶联组成结合特异物,例如抗FcR和抗间质蛋白酶结合特异物来制备。例如,各双特异性分子的结合特异物可分别产生,接着彼此偶联。当结合特异物为蛋白质或肽时,多种偶联剂或交联剂可用于共价结合。交联剂的实施例包括蛋白A、碳化二亚胺、S-乙酰基-硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯基二马来酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺酸基-SMCC)[参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp。Med.160:1686;Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648]。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132;Brennan等人(1985)Science 229:81-83和Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375中所述的那些方法。优选偶联剂为SATA和磺基-SMCC,二者均获自皮尔斯化学公司(伊利诺州罗克福德)]。
当结合特异性为抗体时,其可通过两条重链的C末端铰链区的氢硫基键结偶联。在优选实施方式中,在偶联前,修饰所述铰链区以含有奇数个氢硫基残基、优选一个。
或者,两种结合特异性可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达和组装。此方法在所述双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位体×Fab融合蛋白时尤其适用。本发明的双特异性分子可为包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子,或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利第5,260,203号;第5,455,030号;第4,881,175号;第5,132,405号;第5,091,513号;第5,476,786号;第5,013,653号;第5,258,498号和第5,482,858号中,所述专利都通过引用明确地纳入本文中。
双特异性分子与其特异性标靶的结合可通过例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生长抑制)或Western印迹分析来证实。这些分析中的每个一般通过采用对相关复合物具特异性的经标记试剂(例如抗体)来检测具体相关蛋白质-抗体复合物的存在。例如,FcR-抗体复合物可使用例如识别抗体-FcR复合物且与其特异性结合的酶联抗体或抗体片段来检测。或者,所述复合物可使用多种其他免疫分析中的任意来检测。例如,抗体可经放射性标记并用于放射性免疫分析(RIA)(例如,参见Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays(放射免疫测定法原理),SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques(第七次放射性配体测定技术培训班),内分泌学会(The Endocrine Society),1986年3月,其通过引用纳入本文中)。可通过例如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过自动射线摄影术来检测放射性同位素。
糖基化
另一类型的共价修饰为糖基化的改变。在一些实施方式中,本文所公开的抗体可经修饰以包括一种或多种经工程改造的糖型。如本文所用的“经工程改造的糖型”表示共价连接至抗体的碳水化合物组分,其中所述碳水化合物组分在化学上与亲本抗体的碳水化合物组分不同。经工程改造的糖型可用于多种目的,包括但不限于增强或降低效应功能。例如,可制备去糖基化抗体(即,缺乏糖基化的抗体)。糖基化可经改变以例如增加抗体对抗原的亲和力。可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点实现所述碳水化合物修饰。例如,可进行一个或多个氨基酸取代,其消除一个或多个可变区构架糖基化位点以由此消除彼位点处的糖基化。所述去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此类方法更详细地描述于Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中,且可通过移除位置297处的天冬酰胺来实现。
经工程改造的糖型的优选形式为去海藻糖基化,其已展示与ADCC功能增加相关,可能通过与FcγRIIIa受体的更紧密结合。在此情形中,“去海藻糖基化”表示宿主细胞中产生的大部分抗体实质上不含海藻糖,例如90-95-98%所产生的抗体不具有明显的海藻糖作为抗体的碳水化合物部分的组分(一般连接在Fc区的N297)。功能确定的去海藻糖基化抗体一般对FcγRIIIa受体表现至少50%或50%以上的亲和力。
经工程改造的糖型可通过多种本领域已知的方法产生(等人,1999,NatBiotechnol 17:176-180;Davies等人,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294;Shields等人,2002,J Biol Chem 277:26733-26740;Shinkaw等人,2003,J Biol Chem 278:3466-3473;US 6,602,684;USSN 10/277,370;USSN 10/113,929;PCT WO 00/61739A1;PCT WO01/29246A1;PCT WO 02/31140A1;PCT WO 02/30954A1全部通过引用全文纳入本文;(技术[新泽西州普林斯顿的波娃公司(Biowa,Inc.)];糖基化工程改造技术[瑞士苏黎世的GLYCART生物技术公司])。许多这些技术基于控制共价连接至Fc区的海藻糖基化和/或截开型寡糖的含量,例如通过在经工程改造或以其他方式改造的各种生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞中表达IgG,通过调控参与糖基化路径的酶(例如FUT8[α1,6-海藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III[GnTIII]),或通过在IgG已表达后修饰碳水化合物。例如,西雅图遗传学公司(Seattle Genetics)的“经糖工程改造的抗体”或“SEA技术”通过在产生期间添加经修饰的糖类抑制海藻糖基化而起作用;参见例如US/2009/0317869,其通过引用全文纳入本文中。“经工程改造的糖型”通常指与在无糖基化技术的情况下制得的抗体相比不同的碳水化合物或寡糖;因此抗体可包括经工程改造的糖型。
或者,经工程改造的糖型可指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG变体。如本领域所已知,糖基化模式可视蛋白质的序列(例如存在或不存在以下所论述的具体糖基化氨基酸残基)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体而定。以下论述具体表达系统。
多肽的糖基化通常为N连接或O连接。N连接型是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰氨酸-X-丝氨酸和天冬酰氨酸-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸的外的任何氨基酸)为碳水化合物部分酶促结合天冬酰氨酸侧链的识别序列。为此,这些三肽序列中的任意在抗体中的存在产生潜在糖基化位点。经O连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接,尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸,但所述羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸。
在抗体中添加糖基化位点便利地通过改变氨基酸序列,以使其含有上述三肽序列中的一个或多个来实现(针对N-连接型糖基化位点)。也可通过向原始序列加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或经一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代原始序列来进行改变(对于O连接糖基化部位)。出于简易性,抗体氨基酸序列优选通过在DNA水平的变化来改变,尤其通过使编码目标多肽的DNA在预选碱基处突变以便产生将翻译成所需氨基酸的密码子。
增加抗体上碳水化合物部分的数目的另一方式为通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些程序为有利的,因为其不需要在具有糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质来进行N-连接型和O-连接型糖基化。根据所用偶联模式,可将所述糖连接至(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基例如半胱氨酸的那些巯基、(d)游离羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些羟基、(e)芳族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳族残基、或(f)谷酰氨酸的酰氨基。这些方法描述于WO87/05330和Aplin和Wriston,1981,CRCCrit.Rev.Biochem.,第259-306页中,其都通过引用全文纳入本文。
移除起始抗体上存在的碳水化合物部分(例如翻译后)可以化学或酶促方式来实现。化学去糖基化作用需要将所述抗体暴露至化合物三氟甲磺酸、或等效化合物。此处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)的外的绝大多数或所有糖的裂解,而使抗体完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52和Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131所述,其都通过引用全文纳入本文。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用多种胞内和胞外糖苷酶来实现,如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.138:350所述,其通过引用全文纳入本文,包括如本领域已知使用海藻糖苷酶移除海藻糖残基。在潜在性糖基化位点处的糖基化可通过使用化合物衣霉素(tunicamycin)来防止,如Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.257:3105所述,其通过引用全文纳入本文。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
抗体的另一类型的共价修饰包含使抗体连接至各种非蛋白质聚合物,包括但不限于各种多元醇,例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧亚烷基,以例如内克塔治疗公司(NektarTherapeutics)的2005-2006PEG目录(可在Nektar网站获得)、美国专利4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337所示的方式,其都通过引用全文纳入本文。此外,如本领域已知,氨基酸取代可在抗体内的不同位置进行以有助于例如PEG的聚合物的添加。参见例如美国公开第2005/0114037A1号,其通过引用全文纳入本文。
在其他实施方式中,例如在出于诊断性或检测目的使用本发明的抗体时,抗体可包含标记。“经标记”在本文中表示化合物连接有至少一个元素、同位素或化合物以便能够检测所述化合物。一般而言,标记分成三个类别:a)同位素标记,其可为放射性同位素或重同位素;b)磁性、电、热;和c)彩色或发光染料;但标记也包括酶和例如磁性粒子的粒子。优选标记包括但不限于荧光镧系元素复合物(包括铕和铽的那些),且荧光标记包括但不限于量子点、荧光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明、伊红(eosin)、赤藻红(erythrosin)、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀绿(Malacite green)、芪、荧光黄(Lucifer Yellow)、级联蓝(Cascade Blue)、得克萨斯红(Texas Red)、Alexa染料、Cy染料和Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook(分子探针手册)第6版中所描述的其他标记,因此通过引用明确地纳入。
抗体-药物偶联物
在一些实施方式中,本发明的抗间质蛋白酶抗体与药物结合以形成抗体-药物偶联物(ADC)。一般而言,ADC用于肿瘤学应用,其中使用抗体-药物偶联物进行细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的局部传递允许将药物部分靶向传递至肿瘤,其可允许功效较高、毒性较低等。此技术的概述提供于Ducry等人,Bioconjugate Chem.,21:5-13(2010),Carter等人,Cancer J.14(3):154(2008)和Senter,Current Opin.Chem.Biol.13:235-244(2009)中,其都通过引用全文纳入本文中。
因此,本发明提供与药物偶联的抗间质蛋白酶抗体。一般而言,结合通过共价连接至抗体来进行,如下文进一步描述,且一般依赖于连接基团,常常为肽键(其如下所述,可经设计以在目标位点处对蛋白酶裂解敏感或不敏感)。此外,如上所述,接头-药物单元(LU-D)的连接可通过连接至抗体内的半胱氨酸来进行。如本领域技术人员应理解,每一抗体的药物部分的数目可变化,视反应条件而定,且可在1:1至10:1药物:抗体的范围内变化。如本领域技术人员应理解,实际数目为平均值。
因此,本发明提供与药物偶联的抗间质蛋白酶抗体。如下所述,ADC的药物可为任意数目的药剂,提供包括但不限于细胞毒性剂,例如化学治疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。在其他实施方式中,本发明另外提供使用ADC的方法。
用于本发明的药物包括细胞毒性药物,尤其用于癌症疗法的那些细胞毒性药物。此类药物一般包括DNA损伤剂、抗代谢物、天然产物等。示例性类别的细胞毒性剂包括酶抑制剂,例如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸腺嘧啶核苷合成酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA裂解剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素家族的药物、长春花药物、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、细胞毒性核苷、蝶啶类药物、二炔类(diynenes)、鬼臼毒、尾海兔素、美登木素、分化诱导剂、和紫杉醇。
这些类别的成员包括,例如,紫杉醇、氨甲蝶呤、甲氨喋呤、二氯氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、环氧长春碱、长春西定(leurosideine)、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素C、丝裂霉素A、洋红霉素、氨基蝶呤、他利霉素、鬼臼及鬼臼衍生物如足叶乙甙或磷酸足叶乙甙、长春花碱、长春新碱、长春地辛、紫杉烷包括紫杉醇、多西他赛视黄酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱、卡奇霉素、埃斯培拉霉素、烯-二炔、多卡霉素A、多卡霉素SA、卡奇霉素、喜树碱、哈米特林、美登木素(包括DM1)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、和美登木素(DM4)等。
毒素可用作抗体-毒素偶联物且包括细菌毒素,例如白喉毒素;植物毒素,例如蓖麻毒素;小分子毒素,例如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.Nat.CancerInst.92(19):1573-1581;Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028;Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登木素(EP 1391213;Liu等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)和卡奇霉素(Lode等人(1998)CancerRes.58:2928;Hinman等人(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性和细胞生长抑制效应。
涵盖抗间质蛋白酶抗体和例如美登木素、尾海兔素、哈米特林、奥瑞他汀、新月毒素、卡奇霉素和CC1065的一种或多种小分子毒素的偶联物和具有毒素活性的这些毒素的衍生物。在一优选实施方式中,毒素为奥瑞他汀,优选MMAE或MMAF。
偶联物示例
通过本发明的抗体Z(SH)m(其中m为1、2、3、4或5)制得的偶联物的示例显示如下。偶联物A 1至A 6和A 8至A 15为可裂解基团C包含肽键的偶联物。偶联物A 7和A 16为可裂解基团C为腙的偶联物。偶联物A 17和A 18为可裂解基团C为二硫化物的偶联物。在偶联物A1至A 2、A 5至A 9、A 11至A 14和A 16中,伴侣分子D为其中连接有前药部分的细胞毒素。偶联物A 10、A 11、A 14和A 15为具有自分解部分(偶联物A10具有两个)的偶联物。偶联物A1至A 8和A 10至A 18说明具有模块化片段的间隔子的用途。
当存在于前述式中时,Hal为Cl或Br且R30为羧酸酯酶可裂解氨基羧酸酯前药基团,其显示如下:
制备偶联物
本发明的偶联物优选通过首先接合伴侣分子D和接头(XZ)aC(XD)b以形成部分D(XZ)aC(XD)b R31(其中R31为适合于与抗体Z上的官能团反应的官能团)以形成偶联物而制备。适合的基团R21的示例包括:
其中R32为Cl、Br、F、甲磺酸根或甲苯磺酸根且R33为Cl、Br、I、F、OH、ON琥珀酰亚氨基、O(4-硝基苯基)、O五氟苯基或-O四氟苯基。制备适合的部分D(XZ)aC(XD)b R31公开于Ng等人,US 7,087,600 B2(2006);Ng等人,US 6,989,452B2(2006);Ng等人,US 7,129,261 B2(2006);Ng等人,WO 02/096910 A1(2002);Boyd等人,US 2006/0024317 A1(2006);Chen等人,US 2006/0004081 A1(2006);Gangwar等人,US 2006/0247295 A1(2006);Boyd等人,WO2007/038658 A2(2007);Gangwar等人,WO 2007/051081A1(2007);Gangwar等人,WO 2007/059404A2(2007);Sufi等人,WO 2008/083312 A2(2008);和2008年2月20日申请的Chen等人,PCT申请第PCT/US2008/054362号中,所述专利的公开内容通过引用纳入本文中。
在一优选实施方式(式M)中,R31为马来酰亚氨基团且抗体Z上的官能基为硫醇基,如下所述,使用偶联物A-2(其中Hal为Cl)和抗体Z(SH)m:
式M
以下为说明性方法,其基于通过赖氨酸ε-氨基与2-亚氨基四氢噻吩的反应,接着与药物-接头部分D(XZ)aC(XD)b R31(其中R31为马来酰亚胺)反应将游离硫醇基引入抗体中。起初,抗体经缓冲液更换为含有50mM NaCl和2mM DTPA的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)且浓缩至5-10mg/mL。通过添加2-亚氨基四氢噻吩至抗体中实现硫醇化。待添加的2-亚氨基四氢噻吩的量可通过初步实验测定且在抗体与抗体之间变化。在初步实验中,将滴定增加量的2-亚氨基四氢噻吩添加至抗体中,且在与抗体在室温下孵育1小时后,使用Sephadex G-25管柱将抗体脱盐为50mM pH 6.0HEPES缓冲液且通过与二硫二吡啶(DTDP)反应快速测定引入的硫醇基的数目。硫醇基与DTDP的反应导致释放硫吡啶,其可在324nm下以光谱方式监测。通常使用在0.5-1.0mg/mL的蛋白质浓度下的样品。280nm下的吸光度可用于精确测定样品中的蛋白质浓度,接着在室温下用0.1mL DTDP(5mM储备溶液,于乙醇中)孵育各样品的等分试样(0.9mL)10分钟。也在旁边孵育单独缓冲液的空白样品加上DTDP。在10分钟的后,测量324nm下的吸光度且使用19,800M-1的硫吡啶的消光系数定量硫醇基的数目。
通常,每个抗体三个硫醇基的硫醇化水平为此方法所需。例如,在一些抗体中,这可通过添加15倍摩尔过量的2-亚氨基四氢噻吩,接着在室温下孵育1小时实现。随后将抗体与2-亚氨基四氢噻吩以所需摩尔比孵育,接着脱盐为偶联缓冲液(50mM pH 6.0HEPES缓冲液,含有5mM甘氨酸和2mM DTPA)。将硫醇化材料维持于冰上,同时如上文所述定量引入的硫醇的数目。
在校验引入的硫醇的数目的后,以每硫醇3倍摩尔过量添加药物-接头部分D(XZ)aC(XD)b R31。允许在也含有最终浓度为5%的二甲亚砜(DMSO)或类似替代溶剂的偶联缓冲液中进行偶联反应。通常,药物-接头储备溶液溶解于100%DMSO中。将储备溶液直接添加至硫醇化抗体,其经添加足够DMSO以使最终浓度达到10%,或预稀释于含有最终浓度为10%的DMSO的偶联缓冲液中,接着添加至相同体积的硫醇化抗体中。
在搅拌的情况下在室温下孵育偶联反应混合物2小时。在孵育后,将偶联反应混合物离心且通过0.2μm过滤器过滤。可通过使用多种方法的层析实现偶联物的纯化。在一种方法中,在通过含有5mM甘氨酸和50mM NaCl的50mM pH 7.2HEPES缓冲液预平衡的丙烯葡聚糖凝胶S200管柱上使用尺寸排阻层析纯化偶联物。在28cm/h的线性流动速率下进行层析。收集含有偶联物的馏份,将其合并且浓缩。在替代方法中,可通过离子交换层析实现纯化。条件在抗体与抗体之间变化且应在各情况下优化。例如,抗体-药物偶联物反应混合物涂覆至在含有5mM甘氨酸的50mM pH 5.5HEPES中预平衡的SP-琼脂糖凝胶管柱。在pH 5.5下的平衡缓冲液中使用0-1M NaCl的梯度洗脱抗体偶联物。合并含有偶联物的相关馏份且相对于制剂缓冲液(50mM pH 7.2HEPES缓冲液,含有5mM甘氨酸和100mM NaCl)透析。
本领域技术人员应理解,上述条件和方法为示例性和非限制性的,且用于偶联抗体的其他方法为本领域已知的且可用于本发明中。
适于用作美登木素药物部分的美登素(Maytansine)化合物为本领域所已知,且可根据已知方法自天然来源分离,使用基因工程改造技术产生(参见Yu等人(2002)PNAS 99:7968-7973),或为根据已知方法以合成方式制备的美登醇(maytansinol)和美登醇类似物。如下所述,药物可通过纳入用于结合抗体的例如硫醇或氨基的官能活性基团而经修饰。
示例性美登木素药物部分包括具有经修饰的芳环的那些美登木素药物部分,例如:C-19-去氯(美国专利第4,256,746号)(通过氢化锂铝还原安丝菌素P2(安莎霉素(ansamytocin)P2)来制备);C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利第4,361,650号和第4,307,016号)(通过使用链霉菌属(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)去甲基化或使用LAH去氯来制备);和C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利第4,294,757号)(通过使用酰基氯酰化来制备)和在其他位置具有修饰的那些美登木素药物部分。
示例性美登木素药物部分也包括具有以下修饰的那些美登木素药物部分,例如:C-9-SH(美国专利第4,424,219号)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备);C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利第4,331,598号);C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利第4,450,254号)(由诺卡菌属(Nocardia)制备);C-15-羟基/酰氧基(美国专利第4,364,866号)(通过链霉菌属转化美登醇来制备);C-15-甲氧基(美国专利第4,313,946号和第4,315,929号)(自滑桃树(Trewia nudlflora)分离);C-18-N-去甲基(美国专利第4,362,663号和第4,322,348号)(通过链霉菌属使美登醇去甲基化来制备);和4,5-脱氧(美国专利第4,371,533号)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。
尤其使用DM1(公开于美国专利第5,208,020号中,其通过引用纳入)和DM4(公开于美国专利第7,276,497号中,其通过引用纳入)。也参见5,416,064、WO/01/24763、7,303,749、7,601,354、USSN 12/631,508、WO02/098883、6,441,163、7,368,565、WO02/16368和WO04/1033272中的许多额外美登木素衍生物和方法,其都以全文引用的方式明确地纳入。
含有美登木素的ADC、其制造方法和其治疗性用途公开于例如美国专利第5,208,020号;第5,416,064号;第6,441,163号和欧洲专利EP 0 425 235 B1中,其公开内容因此通过引用明确地纳入。Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述包含连接至针对人类结肠直肠癌的单克隆抗体C242的美登木素(命名为DM1)的ADC。已发现所述偶联物对所培养的结肠癌细胞具有高细胞毒性且在体内肿瘤生长分析中展示抗肿瘤活性。
Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)描述ADC,其中美登木素通过二硫基接头与结合人类结肠癌细胞系上的抗原的鼠类抗体A7结合,或与结合HER-2/neu致癌基因的另一鼠类单克隆抗体TA.1结合。体外测试TA.1-美登木素偶联物对每一细胞表达3×105个HER-2表面抗原的人类乳腺癌细胞是SK-BR-3的细胞毒性。药物偶联物实现与游离美登素类药物类似的细胞毒性程度,所述细胞毒性程度可通过增加每个抗体分子美登素类化合物分子的数目而增加。A7-美登木素偶联物在小鼠体内展示出低全身性细胞毒性。
奥瑞他汀和尾海兔素
在一些实施方式中,ADC包含与尾海兔素或尾海兔素肽类似物和衍生物奥瑞他汀偶联的抗间质蛋白酶抗体(美国专利第5,635,483号;第5,780,588号)。已展示尾海兔素和奥瑞他汀主干扰微管动力学、GTP水解和细胞核分裂与细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(美国专利第5,663,149号)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。尾海兔素或奥瑞他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端连接抗体(WO 02/088172)。
示例性奥瑞他汀实施方式包括2004年3月28日提出的“Senter等人,Proceedingsof the American Association for Cancer Research(美国癌症研究学会进展),第45卷,摘要编号623中所公开且美国专利公开第2005/0238648号中所描述的N端连接的单甲基阿瑞他汀药物部分DE和DF,其公开内容以全文引用的方式明确地纳入本文中。
示例性优选奥瑞他汀实施方式为MMAE(参见美国专利第6,884,869号,其以全文引用的方式明确地纳入本文中)。
另一示例性奥瑞他汀实施方式为MMAF(US 2005/0238649、5,767,237和6,124,431,以全文引用的方式明确地纳入)。
包含MMAE或MMAF和各种连接组分的其他示例性实施方式(进一步描述于本文中)具有以下结构和缩写(其中Ab表示抗体且p为1至约8,例如1、2、3、4、5、6、7或8)。
肽基药物部分通常可通过在两个或两个以上氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这些肽键可例如根据肽化学领域中已知的液相合成方法(参见E.Schrder和K.Lubke,“The Peptides(肽)”,第1卷,第76-136页,1965,学术出版社)制备。奥瑞他汀/尾海兔素药物部分可根据以下的方法制备:美国专利第5,635,483号;美国专利第5,780,588号;Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design13(抗癌药物设计13):243-277;Pettit,G.R.等人Synthesis(合成),1996,719-725;Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863;和Doronina(2003)Nat Biotechnol21(7):778-784。
卡奇霉素
在其他实施方式中,ADC包含本发明的抗体与一个或多个卡奇霉素分子偶联。例如,麦罗塔(Mylotarg)为第一市售ADC药物且利用卡奇霉素γ1作为有效负载(参见美国专利第4,970,198号,其通过引用全文纳入本文中)。其他卡奇霉素衍生物描述于美国专利第5,264,586号、第5,384,412号、第5,550,246号、第5,739,116号、第5,773,001号、第5,767,285号和第5,877,296号中,其都通过引用明确地纳入。抗生素的卡奇霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA碎片。对于制备刺孢霉素家族的偶联物,参见美国专利第5,712,374、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、第5,877,296号(均属于美国氰胺公司(American Cyanamid Company))。可使用的卡奇霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α2I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode等人,Cancer Research 58:2925-2928(1998);和属于美国氰胺公司的上述美国专利)。可与抗体偶联的另一抗肿瘤药物为QFA,其为抗叶酸剂。卡奇霉素与QFA均具有细胞内作用位点且不易于跨过质膜。因此,细胞通过抗体介导的内化作用摄取这些药剂明显增强其细胞毒性作用。
多卡霉素
CC-1065(参见4,169,888,通过引用纳入)和多卡霉素为ADC中所采用的抗肿瘤抗生素家族的成员。这些抗生素似乎通过使DNA在小沟中的腺嘌呤的N3处序列选择性烷基化,引发导致细胞凋亡的级联事件而起作用。
多卡霉素的重要成员包括多卡霉素A(美国专利第4,923,990号,通过引用纳入)和多卡霉素SA(美国专利第5,101,038号,通过引用纳入)和如美国专利第7,517,903号、第7,691,962号、第5,101,038号;第5,641,780号;第5,187,186号;第5,070,092号;第5,070,092号;第5,641,780号;第5,101,038号;第5,084,468号、第5,475,092号、第5,585,499号、第5,846,545号、WO2007/089149、WO2009/017394A1、第5,703,080号、第6,989,452号、第7,087,600号、第7,129,261号、第7,498,302号和第7,507,420号中所述的大量类似物,其都通过引用明确地纳入。
其他细胞毒性试剂
可与本发明的抗体偶联的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲霉素(streptozoicin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶、美国专利第5,053,394号、第5,770,710号中描述的统称为LL-E33288复合物的药剂家族以及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利第5,877,296号)。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(获自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、迈托毒素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族毒素。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明进一步涵盖抗体与具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切酶,例如脱氧核糖核酸酶;DNA酶)之间所形成的ADC。
为选择性破坏肿瘤,抗体可包含高度放射性原子。可使用多种放射性同位素产生放射性偶联抗体。示例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。
可以已知方式将放射性标记或其他标记纳入偶联物中。例如,肽可生物合成,或可通过使用涉和例如以氟-19替代氢的适合氨基酸前体进行化学氨基酸合成来合成。例如tc99m或I123、Re186、Re188和In111的标记可通过肽中的半胱氨酸残基附着。钇-90可通过赖氨酸残基连接。可使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57纳入碘-123。“Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy(免疫闪烁法中的单克隆抗体)”(Chatal,CRC Press 1989)详细描述其他方法。
对于包含复数个抗体的组合物,药物负载量由每一抗体的药物分子的平均数目p表示。药物负载可在每个抗体1至20个药物(D)的范围内。在预备偶联反应时每个抗体的药物平均数目可通过例如质谱法、ELISA分析和HPLC的常规手段来表征。也可根据p确定抗体-药物偶联物的定量分布。
在一些情况下,均质抗体-药物偶联物可通过例如逆相HPLC或电泳的手段来分离、纯化和表征,其中p为具有其他药物负载的抗体药物偶联物的某一值。在示例性实施方式中,p为2、3、4、5、6、7或8或其分数。
抗体-药物偶联物化合物可通过本领域技术人员已知的任何技术来产生。简言之,抗体-药物偶联物化合物可包括抗间质蛋白酶抗体作为抗体单元、药物和任选存在的使药物与结合剂接合的接头。
多种不同反应可用于使药物和/或接头共价连接结合剂。这可通过结合剂(例如抗体分子)的氨基酸残基,包括赖氨酸的氨基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基、半胱氨酸的巯基和芳族氨基酸的各个部分的反应来实现。共价连接的常用非特异性方法为碳二亚胺反应以使化合物的羧基(或氨基)连接至抗体的氨基(或羧基)。此外,已使用双功能试剂(例如二醛或酰亚胺酯)使化合物的氨基连接抗体分子的氨基。
席夫碱反应(Schiff base reaction)也可用于使药物连接结合剂。此方法涉和含有二醇或羟基的药物的过碘酸盐氧化,从而形成醛,接着使其与结合剂反应。通过用结合剂的氨基形成席夫碱来进行连接。异硫氰酸酯也可用作使药物共价连接结合剂的偶联剂。其他技术为本领域技术人员所已知且属于本发明的范畴。
在一些实施方式中,中间物,即接头的前体,在适当条件下与药物反应。在其他实施方式中,使用药物和/或中间物上的反应性基团。药物与中间物之间反应的产物或经衍生药物随后在适当条件下与本发明的抗间质蛋白酶抗体反应。
应理解,也可对所需化合物进行化学修饰,以使得所述化合物的反应更便于制备本发明的偶联物的目的。例如,例如胺、羟基或巯基的官能基可在对药物的活性或其他特性具有最小或可接受的影响的位置处随附于药物。
接头单元
通常,抗体-药物偶联物化合物在药物单元与抗体单元之间包含接头单元。在一些实施方式中,接头在细胞内或细胞外条件下可裂解,使得接头在适当环境中裂解而自抗体释放药物单元。例如,分泌某些蛋白酶的实体肿瘤可充当可裂解接头的目标;在其他实施方式中,其为所用的细胞内蛋白酶。在其他实施方式中,接头单元不可裂解且例如通过在溶酶体中分解抗体而释放药物。
在一些实施方式中,接头为通过细胞内环境(例如,溶酶体或内体或胞膜窖内)中存在的裂解剂可裂解的。接头可为例如由细胞内肽酶或蛋白酶裂解肽基接头,所述蛋白酶包括但不限于溶酶体或核内体蛋白酶。在一些实施方式中,肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长或更长。
裂解剂可包括但不限于组织蛋白酶B和D和纤维蛋白溶酶,已知其均水解二肽药物衍生物,导致靶细胞内部的活性药物的释放(参见例如Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。肽基接头可被表达间质蛋白酶的细胞中存在的酶所裂解。例如,可使用可通过在癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的肽基接头(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头(SEQ ID NO:X))。所述接头的其他示例描述于例如美国专利第6,214,345号中,所述专利以全文引用的方式且出于所有目的纳入本文中。
在一些实施方式中,由细胞内蛋白酶可裂解的肽基接头为Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见例如,美国专利第6,214,345号,其描述使用val-cit接头合成多柔比星)。
在其他实施方式中,可裂解接头为pH敏感的,即在某些pH值下对水解敏感。通常,pH值敏感性接头可在酸性条件下水解。例如,可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(例如,腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见例如美国专利第5,122,368号;第5,824,805号;第5,622,929号;Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123;Neville等人,1989,Biol.Chem.264:14653-14661)。)所述接头在中性pH条件(例如血液中的pH条件)下相对稳定,但在低于pH5.5或5.0(近似溶酶体的pH)下不稳定。在某些实施方式中,可水解接头为硫醚接头(例如通过酰基腙键连接治疗剂的硫醚(参见例如美国专利第5,622,929号))。
在其他实施方式中,接头在还原条件下可裂解(例如,二硫接头)。各种二硫接头为本领域已知的,包括例如可使用以下形成的二硫接头:SATA(N-琥珀酰亚氨基-5-乙酰基硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚氨基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB和SMPT。(参见例如Thorpe等人,1987,Cancer Res.47:5924-5931;Wawrzynczak等人,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery andTherapy of Cancer(免疫偶联物中:放射性成像和癌症治疗中的抗体偶联物)(C.W.Vogel编,牛津大学出版社(Oxford U.Press),1987)。也参见美国专利第4,880,935号。)
在其他实施方式中,接头为丙二酸酯接头(Johnson等人,1995,AnticancerRes.15:1387-93)、马来酰亚氨基苯甲酰基接头(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在其他实施方式中,接头单元不可裂解,且药物通过抗体降解而释放。(参见美国公开第2005/0238649号,所述案以全文引用的方式且出于所有目的纳入本文中)。
在许多实施方式中,接头为自分解型。如本文所用的术语“自分解型间隔子”是指能够将两个间隔开的化学部分共价连接在一起形成稳定三联分子的双功能化学部分。若其与第一部分的键裂解,则其将自发地与第二化学部分分离。参见例如WO 2007059404A2、WO06110476A2、WO05112919A2、WO2010/062171、WO09/017394、WO07/089149、WO 07/018431、WO04/043493和WO02/083180,其是关于药物-可裂解底物偶联物,其中所述药物和可裂解底物任选通过自分解型接头连接,且其都通过引用明确地纳入。
接头通常实质上对细胞外环境不敏感。如本文所用,在接头的情形下,“实质上对细胞外环境不敏感”表示当抗体-药物结合化合物存在于细胞外环境(例如血浆)时,抗体-药物结合化合物样品中不超过约20%、15%、10%、5%、3%或不超过约1%的接头裂解。
接头是否实质上对细胞外环境不敏感可例如通过使抗体-药物结合化合物与血浆一起孵育预定时段(例如,2、4、8、16或24小时),且随后定量血浆中存在的游离药物的量来测定。
在其他非互斥实施方式中,接头促进细胞内化。在某些实施方式中,当与治疗剂结合时(即,在如本文所述的抗体-药物偶联化合物的接头-治疗剂部分的背景中),接头促进细胞内化。在其他实施方式中,当与奥瑞他汀化合物和本发明的抗间质蛋白酶抗体两者结合时,接头促进细胞内化。
可用于本发明组合物和方法的各种示例性接头描述于WO 2004-010957、美国公开第2006/0074008号、美国公开第20050238649号和美国公开第2006/0024317号(其中每个均以全文引用的方式且出于所有目的纳入本文中)中。
药物负载
药物负载由p表示且为分子中每个抗体的药物部分的平均数目。药物负载(“p”)可为每个抗体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上部分(D),尽管平均数目时常为分数或小数。一般而言,1至4的药物负载为频繁使用的,且1至2的药物负载也适用。本发明的ADC包括与1至20个的一系列药物部分偶联的抗体的集合。在由结合反应制备ADC时,每个抗体的药物部分的平均数目可通过例如质谱和ELISA分析的常规方式表征。
也可测定ADC中p的定量分布。在一些情况下,均质ADC可通过例如电泳的手段来分离、纯化和表征,其中p为具有其他药物负载的ADC的某一值。
对于一些抗体-药物偶联物,p可能受抗体上的连接位点数限制。例如,若连接如以上示例性实施方式为半胱氨酸硫醇基,则抗体可能仅具有一个或数个半胱氨酸硫醇基,或可能仅具有一个或数个具有足够反应性的硫醇基,接头可通过所述硫醇基连接。在某些实施方式中,较高药物负载(例如p>5)可造成某些抗体-药物偶联物的凝聚、不可溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施方式中,本发明的ADC的药物负载在以下范围内:1至约8;约2至约6;约3至约5;约3至约4;约3.1至约3.9;约3.2至约3.8;约3.2至约3.7;约3.2至约3.6;约3.3至约3.8;或约3.3至约3.7。实际上,已显示对于某些ADC,每个抗体的药物部分的优选比可小于8,且可为约2至约5。参见US 2005-0238649 A1(通过引用全文纳入本文中)。
在某些实施方式中,在偶联反应期间,少于理论最大值的药物部分与抗体偶联。抗体可含有例如不与药物-接头中间物或接头试剂反应的赖氨酸残基,如下文所论述。一般,抗体不含有可连接药物部分的许多游离和反应性半胱氨酸硫醇基;实际上,抗体中大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在。在某些实施方式中,抗体可在部分或完全还原条件下用例如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂还原,产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方式中,使抗体经受变性条件以暴露例如赖氨酸或半胱氨酸的反应性亲核基团。
ADC的负载(药物/抗体比率)可以不同方式加以控制,例如通过:(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体摩尔过量,(ii)限制结合反应时间或温度,(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件,(iv)通过重组技术工程改造抗体的氨基酸序列,使得半胱氨酸残基的数目和位置经修饰以控制接头-药物连接的数目和/或位置(例如,如本文和WO2006/034488(通过引用全文纳入本文中)所公开制备的thioMab或thioFab)。
应理解当一个以上亲核基团与药物-接头中间物或接头试剂、随后药物部分试剂反应时,所得产物为具有一个或多个药物部分连接抗体的分布的ADC化合物的混合物。每个抗体的药物平均数目可由所述混合物通过双ELISA抗体分析计算,所述分析对于抗体具有特异性且对于药物具有特异性。个别ADC分子可通过质谱法在混合物中鉴别出且通过HPLC(例如疏水性相互作用层析)分离。
在一些实施方式中,具有单一负载值的均质ADC可通过电泳或层析自偶联物混合物分离。
测定ADC的细胞毒性效应的方法
测定药物或抗体-药物偶联物是否对细胞发挥细胞生长抑制和/或细胞毒性作用的方法已知。一般而言,抗体药物偶联物的细胞毒性或细胞生长抑制活性可通过以下来测量:将表达抗体药物偶联物的目标蛋白的哺乳细胞暴露于细胞培养基中;培养所述细胞约6小时至约5天;和测量细胞存活率。可使用基于细胞的体外分析测量抗体药物偶联物的活力(增殖)、细胞毒性和细胞雕亡的诱导(胱冬酶(caspase)活化)。
为测定抗体药物偶联物是否发挥细胞生长抑制作用,可使用胸苷纳入分析。例如,可在96孔板中每孔5,000个细胞的密度下培养表达目标抗原的癌细胞72小时,且在72小时时期的最后8小时期间暴露于0.5μCi 3H-胸苷。在抗体药物偶联物存在和不存在下测量培养物的细胞中3H-胸苷的纳入。
为测定细胞毒性,可测量坏死或细胞凋亡(渐进式细胞死亡)。坏死通常伴随有质膜的渗透性增加;细胞膨胀和质膜破裂。细胞凋亡通常特征为膜起泡、细胞质凝聚和内源核酸内切酶活化。测定出对癌细胞的任一这些作用指示抗体药物偶联物适用于治疗癌症。
细胞活力可通过测定细胞中例如中性红、台盼蓝或ALAMARTM蓝的染料的吸收来测量(参见例如Page等人,1993,Intl.J.Oncology 3:473-476)。在所述种分析中,在含有染料的培养基中孵育细胞,洗涤细胞且以分光光度法测量剩余染料,其反映细胞对染料的吸收。也可使用结合蛋白质的染料磺酸基若丹明B(sulforhodamine B,SRB)测量细胞毒性(Skehan等人,1990,J.Natl.Cancer Inst.82:1107-12)。
或者,在通过检测活的(但未死)细胞的哺乳动物细胞存活和增殖的定量比色分析中使用例如MTT的四唑鎓盐(参见例如Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65:55-63)。
细胞凋亡可通过测量例如DNA断裂来定量。可利用用于体外定测量定DNA断裂的市售亮度法。此类分析的示例,包括TUNEL(其检测断裂的DNA中经标记核苷酸的纳入)和基于ELISA的分析,描述于Biochemica,1999,第2期,第34-37页(罗氏分子生物化学品(RocheMolecular Biochemicals))中。
也可通过测量细胞中的形态变化来测定细胞凋亡。例如,与坏死相同,可通过测量某些染料(例如荧光染料,例如吖啶橙或溴化乙锭)的吸收来确定质膜完整性的丧失。用于测量凋亡细胞数目的方法已由Duke和Cohen,Current Protocols in Immunology(《新编免疫学方案》)(Coligan等人编,1992,第3.17.1-3.17.16页)描述。也可用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记细胞,且观测细胞的染色质凝聚和沿内部核膜的蚀边现象。可测量以确定细胞凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚、膜起泡增加和细胞收缩。
可在培养物的附着区和“漂浮”区测量到凋亡细胞的存在。例如,这两区均可通过移除上清液、以胰蛋白酶处理附着的细胞、在离心洗涤步骤(例如在2000rpm下10分钟)后组合制备物和检测细胞凋亡(例如通过测量DNA断裂)来收集。(参见例如,Piazza等人,1995,Cancer Research 55:3110-16)。
可在适合的动物模型中,于体内评估本发明的抗间质蛋白酶抗体的治疗组合物的效应。例如,可使用异种癌症模型,其中将癌症外植体或继代异种移植组织引入免疫功能不全的动物中,例如裸小鼠或SCID小鼠的(Klein等人,1997,Nature Medicine 3:402-408)。可使用测量肿瘤形成、肿瘤消退或癌转移的抑制作用的分析及其类似分析测量功效。
用于实施上述方法的治疗性组合物可配制成包含适用于所需传递方法的载剂的药物组合物。适当载剂包括与治疗性组合物组合时仍可保持所述治疗性组合物的抗肿瘤功能且与患者免疫系统通常无反应性的任何物质。示例包括但不限于多种标准医药载剂中的任一种,例如无菌磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、抑菌水等(一般参见Remington'sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)第16版,A.Osal.编,1980)。
产生本发明抗体的方法
本发明另外提供用于产生所公开的抗间质蛋白酶抗体的方法。这些方法涵盖培养含有编码本发明抗体的分离的核酸的宿主细胞。如本领域技术人员应理解,这可通过多种方式进行,其视抗体的性质而定。在一些实施方式中,以本发明抗体为全长传统抗体时为例,例如重链可变区和轻链可变区处于可以产生抗体产生且可以分离抗体的条件下。
本文公开抗体A1-A14的可变重链和轻链(蛋白质和核酸序列二者);如在本领域应理解,这些重链和轻链可容易地经扩增以产生全长重链和轻链。即,在已提供如本文所概述的编码VH和VK区段的DNA片段的情况下,这些DNA片段可另外通过标准重组DNA技术操纵,例如以将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中,使编码VK或VH的DNA片段操作性连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段,例如抗体恒定区或挠性接头。如上下文中所用的术语“可操作地连接”表示接合所述两个DNA片段以便使由两个DNA片段编码的氨基酸序列在框架中保留。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至另一编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子而将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。鼠类重链恒定区基因的序列在本领域已知(参见(例如)Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest(《免疫学热门蛋白质序列》),第五版,美国卫生及公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版物第91-3242号)且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言,可将编码VH的DNA可操作地连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可通过将编码VL的DNA可操作地连接至另一编码轻链恒定区CL的DNA分子而将编码VL/VK区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。鼠类轻链恒定区基因的序列在本领域已知(参见(例如)Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest(《免疫学热门蛋白质序列》),第五版,美国卫生及公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版物第91-3242号)且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。在优选实施方式中,轻链恒定区可为κ或λ恒定区。
为产生scFv基因,编码VH和VL/VK的DNA片段可操作地连接编码挠性接头,例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段,使得VH和VL/VK序列可表达为相邻单链蛋白质,VL/VK和VH区通过挠性接头接合[参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426;Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;McCafferty等人,(1990)Nature 348:552-554]。
一般而言,提供编码本发明的抗体的核酸。所述聚核苷酸编码重链和轻链各自的可变区与恒定区,不过根据本文所述的组合物,本发明也涵盖其他组合。本发明也涵盖来源于所公开的聚核苷酸的寡核苷酸片段和与这些聚核苷酸互补的核酸序列。
聚核苷酸可呈RNA或DNA的形式。DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA形式的聚核苷酸属于本发明的范畴。DNA可为双链或单链DNA,且若为单链DNA,则可为编码(有义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可与本文提供的编码序列一致,或可为不同编码序列,所述序列由于遗传编码的冗余或简并,编码与本文提供的DNA相同的多肽。
在一些实施方式中,将编码本发明抗体的核酸纳入表达载体中,所述表达载体可为染色体外的或经设计以整合至所引入的宿主细胞的基因组中。表达载体可含有任意数目的适当调节序列(包括但不限于转录和翻译控制序列、启动子、核糖体结合位点、强化子、复制起点等)或其他元件(选择基因等),其都如本领域所已知般可操作地连接。在一些情况下,使用两个核酸且将其各自置于不同表达载体中(例如重链在第一表达载体中,轻链在第二表达载体中),或者其可置于同一表达载体中。本领域技术人员应理解,表达载体的设计(包括调节序列的选择)可视例如宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达量等因素而定。
通常,可使用适合于所选宿主细胞的任何方法(例如转型、转染、电穿孔、感染)将核酸和/或表达物引入适合的宿主细胞中以形成重组宿主细胞,使得核酸分子可操作地连接一种或多种表达控制元件(例如在载体中、在通过处理在细胞中形成的构建体中、整合至宿主细胞基因组中)。可将所得重组宿主细胞维持于适于表达的条件下(例如在诱导剂存在下,于适合非人类动物中,在补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的适合培养基中),籍此产生所编码的多肽。在一些情况下,在一个细胞中产生重链且在另一细胞中产生轻链。
作为用于表达的宿主可用的哺乳动物细胞系为本领域已知且包括购自美国菌种保藏中心(ATCC),Manassas,VA的许多永生化细胞系,包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK 293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和许多其他细胞系。包括但不限于细菌、酵母、昆虫和植物的非哺乳动物细胞也可用于表达重组抗体。在一些实施方式中,抗体可在例如母牛或鸡的转基因动物中产生。
抗体分子生物学、表达、纯化和筛检的一般方法为所已知的,例如参见美国专利第4,816,567号、第4,816,397号、第6,331,415号和第7,923,221号以及AntibodyEngineering(《抗体工程改造》),Kontermann和Dubel编,Springer,Heidelberg,2001和2010Hayhurst和Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol 5:683-689;Maynard和Georgiou,2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-76;和Morrison,S.(1985)Science 229:1202。
药物组合物
在另一方面中,本发明提供一种含有本发明的一种或一组单克隆抗体,或其抗原结合部分连同药学上可接受的载剂一起配置的组合物(例如药物组合物)。所述组合物可包括一种或一组(例如两种或两种以上不同的)本发明抗体、或免疫偶联物或双特异性分子。例如,本发明的药物组合物可包含一组与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性分子)。
本发明的药物组合物也可以组合疗法,即与其他药剂组合给予。例如,组合疗法可包括本发明的抗-抗体与至少一种其他抗肿瘤剂或消炎剂或免疫抑制剂的组合。可用于组合疗法中的治疗剂的示例以下更详细描述于关于本发明的抗体的用途的部分中。
如本文所用,“药学上可接受的载剂”包括生理学上相容的任何和全部溶剂、分散介质、涂覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。载剂优选适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊椎或表皮给予(例如通过注射或输注)。视给予途径而定,活性化合物(即抗体、免疫偶联物或双特异性分子)可包覆于材料中以保护所述化合物免受可使所述化合物失活的酸和其他自然条件的作用。
本发明的医药化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的生物活性且并不赋予任何非所需毒理学作用的盐[参见例如Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19]。所述盐的示例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括由非毒性无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及由非毒性有机酸(例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)衍生的盐。碱加成盐包括由以下各碱衍生的盐:碱土金属,例如钠、钾、镁、钙等;以及无毒性有机胺,例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的示例包括:(1)水溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金属螯合剂,例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明的药物组合物中的合适水性和非水性载剂的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过使用涂层物质(例如卵磷脂)、在分散液的情况中通过维持所要粒径和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物也可含有佐剂,例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过前述灭菌程序与通过包括多种抗菌剂和抗真菌剂(例如,对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物存在。也可需要在组合物中包括等张剂,例如糖、氯化钠等。另外,可注射医药形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散液,和用于实时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。医药学活性物质的所述介质和试剂的用途在本领域已知。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容,否则涵盖其在本发明的药物组合物中使用。也可在组合物中纳入辅助性活性化合物。
治疗组合物通常必须在制造和储存条件下无菌且稳定。所述组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的规则结构。载剂可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质和其适合混合物。可(例如)通过使用例如卵磷脂的涂层,在分散液的状况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下,优选组合物中包括等张剂,例如,糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶),可使可注射组合物的吸收延长。
无菌可注射溶液可通过纳入所需量的在适当溶剂中的活性化合物以及一种或一组上文所列举的成分,若需要随后进行灭菌微过滤来制备。通常通过将活性化合物纳入无菌载剂中来制备分散液,所述无菌载剂含有基础分散介质和来自上文所列举的成分的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干),其自无菌粉末的前述无菌过滤溶液中得到活性成分加任何其他所要成分的粉末。
可与载剂物质组合以产生单一剂型的活性成分的量应视所治疗的对象和具体给予模式而定。可与载剂物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将一般为产生治疗效应的组合物的量。一般而言,在100%当中,此量应介于约0.01%至约99%活性成分的范围内,优选约0.1%至约70%、优选约1%至约30%活性成分与药学上可接受的载剂组合。
调整给药方案以提供优选所需反应(例如治疗反应)。例如,可给予单一大丸剂;可随时间给予若干分次剂量;或可按治疗情况的紧急需要指示按比例减小或增加剂量。出于给予简便性和剂量均一性考虑,将胃肠外组合物配制成单位剂型尤其有利。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的对象的物理上分散的单位;每一单位含有经计算以产生所要治疗效应的预定量的与所要药用载剂关联的活性化合物。本发明的单位剂型的规格通过下列情况指定且直接取决于下列情况:(a)活性化合物的独特特征和要实现的具体治疗效应,和(b)复配所述种用于治疗个体敏感性的活性化合物的技术中的固有限制。
为给予抗体,剂量在每千克宿主体重约0.0001毫克至100毫克,且更通常0.01毫克至5毫克的范围内。例如,剂量可为每千克体重0.3毫克、每千克体重1毫克、每千克体重3毫克、每千克体重5毫克或每千克体重10毫克,或在每千克1-10毫克范围内。示例性治疗方案使得必须每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次进行给予。本发明的抗间质蛋白酶抗体的优选剂量方案包括通过静脉内给予每千克体重1毫克或每千克体重3毫克,同时使用以下给药时程中的一者给予抗体:(i)每四周六次剂量,接着每三个月;(ii)每三周;(iii)每千克体重3毫克一次,接着每三周每千克体重1毫克。
在一些方法中,同时给予两种或两种以上具有不同结合特异性的单克隆抗体,在所述种状况下,所给予的各抗体的剂量处于指定范围内。抗体通常多次给予。单一剂量之间的时间间隔可为(例如)一周、一个月、三个月或一年。如通过测量患者体内靶抗原的抗体的血液含量所指示,时间间隔也可不规则。在一些方法中,调节剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度,且在一些方法中,实现约25-300μg/ml。
或者,抗体可以持续释放制剂的形式给予,在所述种状况下,需要较不频繁的给予。剂量和频率视抗体在患者体内的半衰期而变化。一般而言,人类抗体表现最长半衰期,随后为人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给予的剂量和频率可视治疗为预防性或治疗性而变化。在预防性应用中,历经长时期以相对不频繁的时间间隔给予相对低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中,有时需要以相对较短间隔给予相对较高剂量直至疾病进展降低或终止且优选直至患者展示病症的部分或完全改善。其后,可向患者施以预防性疗法。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量含量可变化以获得有效实现对具体患者、组合物和给予模式的所要治疗反应,而对患者不具有毒性的活性成分的量。选定剂量含量应视多种药物动力学因素而定,所述药物动力学因素包括所用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性;给予途径;给予时间;所用具体化合物的排泄速率;治疗持续时间;与所用具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质;所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前医疗病史;和医学领域中已知的类似因素。
“治疗有效剂量”的本发明的抗间质蛋白酶抗体可使得疾病症状严重性降低,无疾病症状时期的频率和持续时间增加,或预防由疾病病痛所致的损伤或残疾。例如,为治疗间质蛋白酶介导的肿瘤,“治疗有效剂量”优选相对于未经治疗对象抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20%、至少约30%、优选至少约40%、至少约50%、优选至少约60%、至少约70%且优选至少约80%或至少约90%。可在预测在人类肿瘤中的功效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。或者,组合物的此特性可通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评估,此类抑制可通过本领域技术人员已知的分析而体外测量。治疗有效量的治疗性化合物可减小肿瘤尺寸,或另外改善对象症状。本领域一般技术人员将能够基于例如对象尺寸、对象症状严重性和所选择的特别组合物或给予路径的因子测定所述量。
本发明的组合物可通过一种或多种给予途径使用本领域已知的多种方法中的一个或多个给予。如本领域技术人员所理解,给予途径和/或给予方式将视所需结果而变化。本发明的抗体的优选给予途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他胃肠外给予途径,例如通过注射或输注。如本文中所用的短语“胃肠外给予”表示除经肠给予和局部给予以外,通常通过注射的给予模式,且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者,本发明的抗体可通过非胃肠外途径给予,例如局部、表皮或黏膜给予途径,例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部。
活性化合物可与将保护所述化合物免于快速释放的载剂一起制备,所述载剂例如控释制剂,包括植入物、经皮贴片和微囊化的传递是统。可使用生物可降解、生物相容性聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述制剂的许多方法为获得专利的或本领域技术人员一般已知的[参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems(缓释与控释药物递送系统)(1978)J.R.Robinson编,纽约马塞尔·德克尔出版社(Marcel Dekker,Inc.)]。
治疗组合物可用本领域已知的医学装置给予。例如,在优选实施方式中,本发明的治疗组合物可以无针皮下注射装置给予,所述无针皮下注射装置例如美国专利第5,399,163号;第5,383,851号;第5,312,335号;第5,064,413号;第4,941,880号;第4,790,824号或第4,596,556号中所示的装置。美国专利第4,487,603号,其公开用于以受控速率分散药物的可植入微输注泵;美国专利第4,486,194号,其公开通过皮肤给予药物的治疗性装置;美国专利第4,447,233号,其公开以精确输注速率传递药物的药物输注泵;美国专利第4,447,224号,其公开用于连续药物传递的可变流动可植入输注设备;美国专利第4,439,196号,其公开具有多腔隔室的渗透药物传递系统;和美国专利第4,475,196号,其公开渗透药物传递系统。这些专利通过引用纳入本文中。多种其他所述植入物、传递系统和模块为本领域技术人员已知。
在某些实施方式中,可配制本发明的人类单克隆抗体以确保在体内适当分布。例如,血脑障壁(BBB)排除了许多高度亲水化合物。为确保本发明的治疗化合物与BBB交叉(若需要),可(例如)在脂质体中配制所述化合物。关于制造脂质体的方法,参见例如美国专利4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂质体可包含选择性输送至具体细胞或器官的一个或多个部分,因此增强标靶药物传递[参见例如V.V.Ranade(1989),J.Clin.Pharmacol.29:685]。示例性标靶部分包括叶酸或生物素(参见例如美国专利5,416,016);甘露糖苷[Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038];抗体[P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140;M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180];表面活性剂蛋白A受体[Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134];p120[Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090];也参见K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。
应用与方法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内诊断性和治疗性效用,涉及间质蛋白酶介导的病症的诊断和治疗。
在一些实施方式中,这些分子可体外或离体给予培养物中的细胞或例如体内给予人类个体,以治疗、预防和诊断多种病症。如本文所用,术语“对象”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类动物和爬虫动物。优选对象包括患有由间质蛋白酶活性介导的病症的人类患者。所述方法尤其适用于治疗患有与异常间质蛋白酶表达相关联的病症的人类患者。当间质蛋白酶的抗体连同另一药剂给予时,所述两者可以任意次序或同时给予。
考虑到本发明的抗体对间质蛋白酶的特异性结合,本发明的抗体可用于特异性检测细胞表面上的间质蛋白酶表达,且此外,可用于通过免疫亲和力纯化来纯化间质蛋白酶。
此外,鉴于间质蛋白酶于肿瘤细胞上的表达,本发明的抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有致瘤病症的对象,例如特征为存在表达间质蛋白酶的肿瘤细胞的病症,包括例如胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))和皮肤癌。如下文实施例5和7所说明,已显示间质蛋白酶在抗体结合时会内化,因此使得本发明的抗体能够用于任何有效负载作用机制,例如ADC方法、放射免疫偶联物或ADEPT方法。
在一个实施方式中,本发明的抗体(例如单克隆抗体、抗体片段、奈米抗体、多特异性和双特异性分子和组合物等)可用于检测间质蛋白酶的含量或在膜表面上含有间质蛋白酶的细胞的含量,所述含量可随后与某些疾病症状相关联。或者,抗体一般以ADC形式给予,可用于抑制或阻断间质蛋白酶功能,继而可与某些疾病症状的预防或改善有关,由此暗示间质蛋白酶为所述疾病的介导物。这可通过在允许在抗体与间质蛋白酶之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与抗间质蛋白酶抗体接触实现。在样品和对照中检测且比较在抗体与间质蛋白酶之间形成的任何复合物。
在另一实施方式中,可首先测试本发明的抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与体外治疗性或诊断性用途相关联的结合活性。例如,本发明的组合物可使用下文实施例中所述的流式细胞分析来测试。
本发明的抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物和组合物)在间质蛋白酶相关疾病的疗法和诊断中具有额外效用。例如,单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物可用于体内或体外引发以下生物活性中的一个或多个:抑制表达间质蛋白酶的细胞的生长和/或杀死所述细胞;在人类效应细胞存在下介导表达间质蛋白酶的细胞的吞噬作用或ADCC,或阻断间质蛋白酶配位体与间质蛋白酶的结合。
在一个具体实施方式中,体内使用抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)以治疗、预防或诊断多种间质蛋白酶相关疾病。间质蛋白酶相关疾病的示例尤其包括表示胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤)和皮肤癌的人类癌症组织。
体内和体外给予本发明的抗体组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的适合途径为本领域所已知,且可由一般技术者选择。例如,抗体组合物可通过注射(例如静脉内或皮下)给予。所用分子的适合剂量将视对象的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂而定。
如先前所描述,本发明的抗间质蛋白酶抗体可与一种或多种其他治疗剂(例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂)一起同给予。抗体可连接至药剂(以免疫复合物形式)或可与药剂分开给予。在后一情况(单独给予)中,抗体可在药剂之前、之后或同时给予或可与其他已知疗法(例如抗癌疗法,例如辐射)共给予。此类治疗剂尤其包括抗赘生性剂,例如多柔比星(阿霉素(adriamycin))、顺铂博莱霉素硫酸盐(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)和环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea),其本身仅在对患者具毒性或亚毒性的含量下有效。顺铂每四周一次以100mg/kg剂量静脉内给予,且阿霉素每21天一次以60-75mg/ml剂量静脉内给予。适合于与本发明的抗体共给予的其他药剂包括用于治疗癌症,例如胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或肺癌、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤)和皮肤癌的其他药剂,例如5FU和吉西他滨(gemcitabine)。本发明的抗间质蛋白酶抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共给予提供通过不同机制起作用的两种抗癌剂,其对人类肿瘤细胞产生细胞毒性效应。所述共给予可解决由于形成抗药性或可能导致对抗体无反应的肿瘤细胞抗原性变化所带来的问题。
本发明的目标特异性效应细胞,例如连接至组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)的效应细胞也可用作治疗剂。作为目标的效应细胞可为人类白细胞,例如巨噬细胞、嗜中性细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜伊红血球、天然杀伤细胞和其他具备IgG-或IgA-受体的细胞。若需要,则可由待治疗对象取得效应细胞。目标特异性效应细胞系可作为于生理上可接受的溶液内的细胞悬浮液给予。给予细胞数目可为108-109的量级,但将视治疗目的而变动。一般而言,所述量应足以在目标细胞(例如表达间质蛋白酶的肿瘤细胞)处获得定位,和通过例如吞噬作用影响细胞杀死。给予途径也可改变。
可与供除去目标细胞的其他技术联合执行使用目标特异性效应细胞的疗法。例如,可与化学治疗联合使用利用本发明的组合物(例如人类抗体、多特异和双特异分子)和/或装备这些组合物的效应细胞的抗-肿瘤疗法。另外,可使用组合免疫疗法以指引两个相异细胞毒素效应子群体针对肿瘤细胞排斥。例如,连接至抗Fc-γRI或抗CD3的抗间质蛋白酶抗体可与IgG或IgA受体特异性结合剂联合使用。
也可使用本发明的双特异和多特异分子调节效应细胞内FcγR或FcγR水平,例如通过加帽和消除细胞表面的受体。对于此目的也可使用抗-Fc受体的混合物。
本发明的组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)具有补体结合位点,例如IgG1、IgG2或IgG3或IgM的结合补体的部分,也可在补体存在下使用。在一实施方式中,用本发明的结合剂和合适效应细胞对包括目标细胞的细胞群体的间接体内治疗,可通过添加补体或包含补体的血清来补充。通过补体蛋白质的结合可改善涂布以本发明的结合剂的目标细胞的噬胞作用。在另一实施方式中,包覆有本发明的组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可由补体溶解。在另一实施方式中,本发明的组合物不活化补体。
本发明的组合物(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可连同补体一起给予。在某些实施方式中,本发明提供包含抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。当补体与抗体、多特异性或双特异性分子紧密接近时,这些组合物可为有利的。或者,本发明的抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清可单独给予。
包含本发明的抗体组合物(例如单克隆抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)和使用说明书的试剂盒也在本发明的范畴内。所述试剂盒可另外含有一种或多种额外试剂,例如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射毒性剂,或一种或多种本发明的额外抗体(例如具有不同于第一抗体的结合间质蛋白酶抗原中的表位的补充活性的抗体)。
因此,用本发明的抗体组合物治疗的患者可(在本发明的抗体给予之前、同时或之后)用另一治疗剂(例如细胞毒性或放射毒性剂)另外给予,其增强或加强抗体的治疗效应。
在其他实施方式中,可用一调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药剂另外治疗对象,例如通过用一细胞因子治疗所述对象。适于在所述多特异分子治疗期间给予的优选细胞因子包括粒细胞群落-刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞群落-刺激因子(GM-CSF)、主干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(例如抗体、多特异性和双特异性分子)也可用于靶向表达FcγR或间质蛋白酶的细胞,例如以便标记此类细胞。对于所述用途,可将结合剂连接至一可检测的分子。因此,本发明提供用于离体或体外定位表达Fc受体(例如FcγR)或间质蛋白酶的细胞的方法。所述可检测标记可为(例如)放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。
在一具体实施方式中,本发明提供用于检测样品中间质蛋白酶抗原的存在或测量间质蛋白酶抗原的量的方法,其包含在允许在抗体或其部分与间质蛋白酶之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与单克隆抗体或其抗原结合部分(其特异性结合间质蛋白酶)接触。接着检测复合物的形成,其中样品与对照样品相比的差异复合物形成指示样品中存在间质蛋白酶抗原。
在其他实施方式中,本发明提供用于治疗对象中间质蛋白酶介导的病症,例如人类癌症,包含胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(优选SCLC)、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤(优选非霍奇金氏淋巴瘤)和皮肤癌的方法。
本说明书中所引用的所有参考文献,包括但不限于所有论文、公开、专利、专利申请、演示、文本、报导、手稿、手册、书、因特网公告、杂志文章、期刊、产品说明书等,吾人据此通过引用全文纳入本文本说明书中。本文参考文献的论述仅概述其作者的声明且不承认任何参考文献构成现有技术,且申请人保留攻击所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。
尽管已通过说明和实施例较为详细地描述前述发明以实现理解清楚的目的,但本领域技术人员根据本发明的指导可容易地在不背离所附独立权利要求的精神和范围下,对其产生某些变化和修改。
以下实施例进一步说明本发明,所述实施例不应视为进一步限制本发明。
实施例1:针对间质蛋白酶抗原生成人单克隆抗体
已知间质蛋白酶-主干蛋白质充分表达于MCF7细胞中。这些细胞用于以下免疫接种方案中。
转基因品系
使用表达人抗体基因的转基因的HCo12株系制备间质蛋白酶的全人类单克隆抗体。在这些小鼠株系中,内源性小鼠κ轻链基因已如Chen等人(1993)EMBOJ.12:811-820中所述经同种型结合破坏且内源性小鼠重链基因已如PCT公开WO 01/09187的实施例1中所述经同种型结合破坏。
HuMab免疫
为产生间质蛋白酶的全人类单克隆抗体,通过表达间质蛋白酶的MCF7细胞使HCo12小鼠株系是的HuMab小鼠免疫。这些小鼠的一般免疫接种流程描述于Lonberg,N等人(1994)Nature 368(6474):856-859;Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和PCT公开WO 98/24884中。小鼠在第一次输注表达间质蛋白酶的MCF7细胞时为6-16周龄。
通过以3-21天间隔腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过脚掌(FP)给予的Ribi佐剂中的表达间质蛋白酶的MCF7细胞使转基因小鼠免疫(至多总共9次免疫接种)。通过眶后出血监测免疫反应。通过ELISA筛选血浆(如下所述),且具有抗间质蛋白酶人类免疫球蛋白的足够效价的小鼠用于融合。在处死和移除脾脏的前3天和2天用抗原静脉内增强小鼠。通常,对于各抗原进行10-20次融合。几十只小鼠针对各抗原经免疫。
选择产抗间质蛋白酶抗体的动物
为选择产生结合间质蛋白酶的抗体的动物,如Fishwild,D.等人(1996)(前述)所述通过ELISA测试来自经免疫小鼠的血清。简言之,以PBS中1-2μg/ml的经纯化重组间质蛋白酶涂布微量滴定盘,在4℃下以50微升/孔孵育隔夜,随后用200微升/孔的PBS/吐温中的5%鸡血清(0.05%)阻断。将来自经间质蛋白酶免疫的小鼠的血浆的稀释液添加至各孔中且在环境温度下孵育1-2小时。用PBS/吐温洗涤盘,且随后在室温下,用与辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)偶联的山羊抗人类IgG Fc多克隆抗体孵育1小时。在洗涤的后,用ABTS底物(Moss Inc,产品:ABTS-1000)使盘显影且通过分光亮度计于OD 415-495下进行分析。产生抗间质蛋白酶抗体的最高效价的小鼠用于融合。如下所述进行融合且通过ELISA和FACS测试杂交瘤上清液的抗间质蛋白酶活性。
生成产生针对间质蛋白酶的人单克隆抗体的杂交瘤
使用基于电场的电融合通过小鼠骨髓瘤细胞系融合自分离的小鼠脾细胞,所述电融合使用Cyto Pulse大腔室剔除融合电致孔器(马里兰州格伦伯尼的细胞脉冲科学公司(Cyto Pulse Sciences,Inc.))。简言之,将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至与Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL1581)相同的数目。细胞以每孔大致2×104个的密度接种于平底微量滴定盘中,随后在含有10%胎牛血清、10%P388D1(ATCC,CRL TIB-63)改良性培养基、DMEM(Mediatech,CRL 10013,具有高葡萄糖、L-谷酰氨酸和丙酮酸钠)中的3-5%Origen(IGEN)加上5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/mL健大霉素(gentamycin)和1×HAT(西格玛公司(Sigma),CRL P-7185)的选择性培养基中孵育。在1-2周的后,在以HT置换HAT的培养基中培养细胞。在细胞接种的后大致10-14天,首先关于来自个别孔的上清液是否含有人类g,k抗体对其进行筛选。随后通过ELISA和FACS(上文所述)自人类g,k评分为阳性的上清液筛选人类抗间质蛋白酶单克隆IgG抗体。将分泌杂交瘤的抗体转移至24孔盘中,再次筛选且若仍对于人类抗间质蛋白酶IgG单克隆抗体呈阳性,则通过限制稀释法亚克隆至少两次。随后体外培养稳定亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体,其用于进一步表征。
选择编码产生自的间质蛋白酶_A1的杂交瘤克隆用于进一步分析。
实施例2:针对间质蛋白酶的单克隆抗体的结构特征
使用标准PCR技术获得编码间质蛋白酶_A1单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列且使用标准DNA定序技术定序。
抗体序列可在一个或多个残基处诱变回复至种系残基。
间质蛋白酶_A1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别出示于SEQ ID NO:3和1中。
间质蛋白酶_A1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别出示于SEQ ID NO:4和2中。
间质蛋白酶_A1重链免疫球蛋白序列与已知人类种系免疫球蛋白重链序列的比较表明间质蛋白酶_A1重链利用来自鼠类种系VH 3-23的VH区段和来自人类种系JH JH4b的JH区段。使用CDR区测定的Kabat系统的间质蛋白酶_A1VH序列的进一步分析产生分别如SEQID NO:5、6和7中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3区的描绘。间质蛋白酶_A1CDR1、CDR2和CDR3VH序列与种系VH 3-23和种系JH JH4b序列的比对示于图2a中。
间质蛋白酶_A1轻链免疫球蛋白序列与已知鼠类种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明间质蛋白酶_A1轻链利用来自人类种系VK A27的VK区段和来自人类种系JK JK2的JK区段。使用CDR区测定的Kabat是统的间质蛋白酶_A1VK序列的进一步分析产生分别如SEQ IDNO:8、9和10中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的描绘。间质蛋白酶_A1CDR1、CDR2和CDR3VK序列与种系VK A27和种系JK JK2序列的比对示于图2b中。
实施例3:通过酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选抗原特异性抗体
通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定间质蛋白酶_A1对间质蛋白酶的细胞外主干区的特异性。
将310μg/ml间质蛋白酶主主干蛋白质在ELISA涂布缓冲液(100mm碳酸钠/碳酸氢钠)中稀释至0.1μg/mL、以100μl转移至孔中且在4℃下孵育隔夜。
在孵育后,通过PBST洗涤孔三次。随后将200μl SuperBlock(赛默科学公司(Thermo Scientific))添加至各孔中且在25℃下孵育30分钟,随后再通过PBST洗涤孔三次。
以100μl将在PBS和0.1%BSA中自0.01μmol/L连续稀释至30μmol/L的间质蛋白酶_A1转移至孔中且在25℃下孵育1小时,随后通过PBST洗涤孔三次。将山羊抗人类IgGκ特异性HRP(批号NG1876246)和山羊抗人类IgG FC特异性(批号96091)自0.01μmol/L连续稀释至30μmol/L且以100μl转移至孔中的每个中,随后在25℃下孵育1小时,接着再次通过PBST洗涤三次。随后将100μl TMB底物添加至各孔中且在25℃下再次孵育大致1小时,随后添加100μl1N HCL至各孔中。
使用Thermo Varioskan在450nm处读取结果(参见图3)。这些结果显示间质蛋白酶_A1结合间质蛋白酶的主干区。
实施例4:用针对间质蛋白酶的单克隆抗体的免疫组织化学
使用以下参考方案,间质蛋白酶_A1以20μg/ml用于IHC实验中。在这些条件下,在关于以FFPE或冷冻形式制备的组织部分的结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌和乳腺癌中观测到明显染色。相同条件用于测试间质蛋白酶_A1在正常人类组织上的结合。
脱石蜡和重新水合
在无缓冲液的水浴中在50ml Falcon中于60℃下加热载玻片2小时。各Falcon具有一个载玻片或两个背对背的载玻片,在其之间具有长凝胶加载尖端,用于阻止盖玻片彼此黏着。在黑色载玻片架中于EZ-DeWax(美国加利福尼亚州拜尔基因公司(BioGenex))中将载玻片脱蜡5分钟,随后使用1ml滴管以相同DeWax溶液充分冲洗,随后用水洗涤。将载玻片置放于用水填充的科普林氏缸(coplin jar)中直至压力釜准备就绪;更换水若干次。
抗原回收
用抗原修复溶液=1×柠檬酸盐缓冲液,pH 6(DAKO)更换水。通过压力釜方法修复抗原。就爱那个抗原修复溶液中的塑料科普林氏缸中的载玻片放置到压力釜中,随后将其加热至位置6(最高设定)。孵育15-20分钟后,将温度降低至位置3且在该状态(当压力釜内部的温度为117℃时)下再维持20-25分钟。随后关闭搁架且将釜置放于冷搁架上且通过将柄小心地移动至“打开”与“关闭”之间的位置释放压力。使整个系统释放压力且再冷却20分钟。打开盖且取出样品,将其搁置于实验台上。通过PBS-3T(0.5L PBS+3滴吐温-20)洗涤载玻片1×5分钟且将载玻片置放于PBS中。
染色
在抗原修复之后,将载玻片安置于Shandon Coverplate系统中。通过将盖板放置到用PBS填充的科普林氏缸中且将具有组织切片的载玻片温和地滑动至盖板中阻止载玻片与塑料盖板之间的气泡截留。将载玻片自科普林氏缸拔出,同时使其与盖板紧密地保持在一起。将经组装的载玻片放置到托架中,使漏斗中和载玻片与盖板之间截留的PBS通过。用2×2ml(或4×1mL)PBS-3T和1×2ml PBS洗涤载玻片,等待直至所有PBS已通过载玻片且漏斗中几乎无PBS剩余。
使用过氧化酶阻断试剂(S2001,DAKO)进行内源性过氧化物阻断。每个载玻片使用1-4滴过氧化物溶液且孵育5分钟。通过水冲洗载玻片,接着通过2ml PBS-3T冲洗一次且通过2ml PBS冲洗一次;在添加洗涤缓冲液的新部分之前等到漏斗中几乎无液体生育为重要的。
用抗体稀释试剂(DAKO)稀释一级抗体。优选稀释度经测定为0.5μg/ml。将50-200μl稀释一级抗体涂覆至各切片和/或组织微阵列;注意覆盖整个组织。温和地轻触载玻片以经切片均匀地分配抗体或经切片的顶部使用滴管端。在室温下在保湿室中孵育载玻片45分钟。用2×2ml(或4×1mL)PBS-3T接着用1×2ml PBS洗涤载玻片,等待直至所有PBS已通过载玻片且漏斗中几乎无PBS剩余。以1:1000应用对应驴抗山羊IgG:HRP(1500P,1mg/mL,Serotec)且在室温下孵育35分钟。如上洗涤载玻片。在稀释缓冲液中制造DAB底物;含有2滴底物的2ml对于10个载玻片足够。通过一次涂覆几滴将DAB试剂涂覆至载玻片。所有DAB分布在载玻片之间。将载玻片孵育10分钟。用1×2ml(或2×1mL)PBS-3T和1×2ml(或2×1mL)PBS洗涤载玻片,等待直至所有PBS已通过载玻片且漏斗中几乎无PBS剩余。涂覆苏木精(DAKO);1ml对于10个载玻片足够且在室温下孵育载玻片1分钟。用2ml水填充Shandon Coverplate系统的漏斗且使其通过。当对载玻片清除过量苏木精时,拆卸系统,用来自洗涤瓶的水洗涤组织切片和/或阵列且放置到黑色载玻片架中。通过在EZ-DeWax中孵育5分钟,接着在95%乙醇中孵育2-5分钟使组织重新水合。使载玻片在室温下于实验台上干燥,接着安置于安装介质中且通过盖玻片覆盖。
结果
发现间质蛋白酶表达于95%-100%结肠直肠癌(表2)临床测试样品、97%胃癌(表1)测试样品、100%前列腺癌测试样品和75%乳腺癌测试样品中。
在观测到标靶的上皮起源细胞中,检测的表达量明显低于类似肿瘤组织。在肾小管以及胃肠道中偶发地观测到正常表达。
表1.结肠直肠癌中的间质蛋白酶_A1的IHC:下表概述主干蛋白质在41个胃癌样品和8个正常胃样品的阵列的细胞表面上的表达
表2.结肠直肠癌中的间质蛋白酶_A1的IHC:下表概述主干蛋白质在54结肠癌样品的阵列的细胞表面上的表达
实施例5:针对间质蛋白酶的单克隆抗体的特异性。通过流式细胞术测定。
通过流式细胞术测试抗体针对实施例1中选择的间质蛋白酶的特异性。为测试抗体结合细胞表面间质蛋白酶蛋白质的能力,使抗体与表达间质蛋白酶的细胞一起孵育。细胞在FACS缓冲液(DPBS、2%FBS)中洗涤,离心且再悬浮于100μl经稀释的一级间质蛋白酶抗体(也稀释于FACS缓冲液中)中。抗体-细胞系复合物在冰上孵育60分钟且随后用如上所述的FACS缓冲液洗涤两次。将细胞-抗体离心块再悬浮于100μl经稀释的二级抗体(也稀释于FACS缓冲液中)中,且在冰上孵育60分钟。如前所述洗涤离心块且再悬浮于200μl FACS缓冲液中。将样品装载至BDFACScanto II流式细胞仪上且使用BD FACSdiva软件分析数据。
流式细胞分析的结果表明单克隆抗体间质蛋白酶_A1有效地结合表达于HT-29和H69细胞中的细胞表面人类间质蛋白酶(图4b)。除那些细胞系以外,也发现间质蛋白酶_A1以高亲和力结合多种其他细胞系,包括SNU-1(图4a)、A431(表皮样癌)、SW620(结肠直肠腺癌)、SKOV-3(卵巢腺癌)、MCF-7(乳腺癌)和A549(人类肺泡腺癌)。
实施例6:间质蛋白酶A1介导的抗体依赖性细胞的细胞毒性
遵循标准程序,CytoTox非放射性细胞毒性分析(普洛麦格英国有限公司(Promega UK Ltd))用于测定间质蛋白酶_A1抗间质蛋白酶mAb通过抗体依赖性细胞毒性(HT-29和OVCAR8细胞的ADCC)在效应细胞存在下杀死表达间质蛋白酶的细胞的能力。
使用已知通过ADCC引发细胞杀伤的抗体作为阳性对照,且使用人类IgG1同种型对照作为阴性对照,结果显示间质蛋白酶_A1能够在HT-29细胞上引发ADCC。图5展示在HT-29细胞上引发ADCC的间质蛋白酶_A1。
实施例7:HT-29和H69细胞对间质蛋白酶A1单克隆抗体的内化
使用MabZAP分析,显示间质蛋白酶_A1抗体在结合HT-29细胞(人类结肠癌细胞系)和H69细胞(人类小细胞肺癌细胞系)时通过所述细胞内化。MabZAP抗体结合初级抗体。随后,MabZAP复合物通过所述细胞内化。沙泊宁进入细胞中导致蛋白质合成抑制和最终细胞死亡。
如下进行MabZAP分析。将细胞中的每个以5×103个细胞/孔的密度接种。连续稀释抗间质蛋白酶单克隆抗体或同种型对照人类IgG,随后添加至细胞中。随后以50μg/ml的浓度添加MabZAP且使盘保温48和72小时。通过发光细胞活力分析试剂盒(Promega,G7571)检测盘中的细胞活力且通过光度计(Luminomitor)(加利福尼亚州森尼韦尔特纳生物系统公司(Tuner BioSystems))在490nM下读取盘。通过Prism(Graphpad)分析数据。
图6展示间质蛋白酶_A1通过HT-29和H69细胞有效内化,分别具有0.1829和0.07398的EC50。这些结果表明间质蛋白酶_A1的细胞毒性活性的增加与抗体浓度和其他抗间质蛋白酶抗体成正比。
实施例8:在小鼠异种移植模型中抗间质蛋白酶抗体-药物偶联物抑制HT-29细胞生长
检测根据式M的间质蛋白酶_A1偶联物(在下文中称为“间质蛋白酶_A1-式M偶联物”)对小鼠异种移植模型中来源于结肠直肠癌的HT-29细胞的生长的影响。在此异种移植模型中,SCID小鼠(CB17,来自Charles River Laboratories,Hollister,CA)植入2.5×106个HT-29细胞/小鼠且使HT-29细胞生长约30天。随后将小鼠随机分组且通过间质蛋白酶_A1-式M偶联物(0.03、0.1和0.3微摩尔/千克)腹膜内(i.p.)处理。DT和抗白喉毒素抗体用作非结合同种型对照。
结果显示通过间质蛋白酶_A1-式M偶联物处理以剂量依赖方式明显抑制肿瘤生长率。图7a显示发现单剂量(以0.3摩尔/千克:约2毫克/千克)的毒素偶联mAb为治愈性的。图7b显示表明肿瘤诱发的恶病体质的改善的经60天给药的体重改变。图7c显示表现对处理的剂量依赖性响应的HT-29ADC异种移植模型中的替代剂量组。图7d显示表现剂量依赖性恶病体质改善的HT-29ADC异种移植模型中的替代剂量组。
实施例9:MMAE-偶联的和MMAF-偶联的抗间质蛋白酶单克隆抗体在癌细胞系中的功效
材料
来自飞世尔科技公司(Fisher Scientific,美国宾夕法尼亚)的细胞剥离液(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)。
来自飞世尔科技公司(美国宾夕法尼亚)的PBS pH 7.4(1×)(SH30028LS)。
来自飞世尔科技公司(美国宾夕法尼亚)的RPMI 1640培养基(MT-10-041-CM)。
来自普洛麦格公司(Promega,美国威斯康星州)的Cell Titer Glo(G7572)。
方法
使用细胞剥离液解离细胞且计数。将5e3个细胞/孔短暂离心成离心块(对于悬浮细胞,视细胞倍增时间而定,可使用更多,例如10e3个细胞/孔)。将离心块再悬浮于培养基中至1e5个细胞/毫升的浓度。
将50微升/孔细胞悬浮液添加至白边、透明底的96孔盘的孔中。抗体经稀释且滴定至8点(3倍滴定),相当于0-20nM的浓度(两倍测试浓度)。将经稀释的抗体或培养基(对于未经处理的样品)(50微升/孔)添加至适当孔。将过量培养基(200微升/孔)添加至所述盘的外部列和行以防止蒸发。所述盘在37℃下孵育72小时。
所述盘自孵育箱移出且在室温下孵育30分钟。同时解冻Cell Titer Glo溶液。轻弹所述盘且用100微升/孔PBS洗涤1次(对于悬浮细胞,首先将盘离心以使细胞集结)。将100微升/孔PBS和100微升Cell Titer Glo添加至各孔且研磨混合。所述盘在暗处在室温下孵育15分钟且通过显微法目测以确保发生有效细胞溶解。接着在Glomax亮度计上读取所述盘。
结果
表3显示使用偶联至MMAE的抗间质蛋白酶抗体的ADC细胞毒性分析中的多种人类肿瘤细胞系的EC50值。检测的细胞系为Coav-4(人类卵巢腺癌)、COV644(人类卵巢上皮黏液癌)、OVCAR-3(人类卵巢腺癌)、OV90(人类乳头状的浆液腺癌)、HCC70(人类乳腺管癌ER阴性、PR阴性和Her2阴性)、HCC1143(人类乳腺管癌ER阴性、PR阴性和Her2阴性)、BT474(人类乳腺管癌)、PC-3(人类前列腺癌)、N87(人类胃腺癌)、SNU16(人类胃腺癌)、KATOIII(人类胃腺癌)、ST16(人类胃腺癌)、HT-29(人类结肠直肠腺癌)和DMS79(肺小细胞癌)细胞。表3也显示偶联至Coav-4、COV644、OVCAR-3、OV90、PC-3、N87、SNU16和KATOIII细胞系中的MMAF的抗间质蛋白酶抗体的EC50值。这些结果表明偶联至MMAE的抗间质蛋白酶抗体和偶联至MMAF的抗间质蛋白酶抗体在>1nM下的细胞毒性活性(参见图8)。
表3:针对癌细胞系的ADC细胞毒性试验的EC50值概况
实施例10:MMAE-偶联的和MMAF-偶联的抗间质蛋白酶单克隆抗体在卵巢癌异种移植模型中的功效
在OVACAR-3裸鼠异种移植模型中测试间质蛋白酶_A1_MMAE和间质蛋白酶_A1_MMAF的功效。
通过OVACAR-3(人类卵巢腺癌)肿瘤细胞对免疫缺陷无胸腺裸小鼠皮下接种。允许建立肿瘤且将小鼠分成七个处理组,每组5-8只小鼠。当平均肿瘤体积达到每组167mm3的平均尺寸时,用以下化合物中的一种以指定剂量静脉内给予处理各组:第1组(载剂;20mM丁二酸钠,pH 5.0,6%海藻糖,0.04%聚山梨醇酯;n=8);第2组(间质蛋白酶_A1_MMAE;1mg/kg;n=8),第3组(间质蛋白酶_A1_MMAE;3mg/kg;n=8),第4组(同种型对照-MMAE;3mg/kg;n=5),第5组(间质蛋白酶_A1_MMAF;1mg/kg;n=8),第6组(间质蛋白酶_A1_MMAF;3mg/kg;n=8),第7组(同种型对照-MMAF;3mg/kg;n=5)。监测体重(BW),时常检查小鼠的健康状况和不良副作用,且每周测量肿瘤两次。在肿瘤接种后82天将小鼠安乐死。在ADC处理小鼠对比PBS处理小鼠中,由抗肿瘤活性(处理组的平均肿瘤尺寸/对照组的平均肿瘤尺寸×100)和平均时间端点(TTE)增加测定功效。在接种后第71天,在载剂处理的对照小鼠中取样五个最大的肿瘤,通过福尔马林固定和石蜡包埋加工。
结果
图9显示间质蛋白酶_A1_MMAE和间质蛋白酶_A1_MMAF各自表明相比于对照组的OVACAR-3裸鼠异种移植模型中的明显抗肿瘤活性。3mg/kg下的间质蛋白酶_A1_MMAE产生在研究的第61天的8/8位幸存者、八个完全消退、最大可能肿瘤生长延缓(85%)和明显生存延长(相比于其同种型对照组和载剂对照组)。间质蛋白酶_A1_MMAF产生3mg/kg下的68%TGD、两位幸存者、三个部分消退和一个完全消退。所有处理为良好耐受的且未观察到毒性临床症状。这些数据表明针对例如间质蛋白酶_A1_MMAE和间质蛋白酶_A1_MMAF的间质蛋白酶的ADC在人类三阴性乳腺癌患者的治疗中提供临床效益的潜能。如这些结果所示,间质蛋白酶_A1_MMAE在此异种移植模型中产生出人意料的优良作用。
实施例11:MMAE-偶联的和MMAF-偶联的抗间质蛋白酶单克隆抗体在猕猴中的毒性
分配十只猴进行研究,一只猴/性别/组。如表4中所示,通过15分钟静脉内输注以0毫克/千克/剂量(PBS,载剂)、1毫克/千克/剂量(间质蛋白酶_A1_MMAE)、3毫克/千克/剂量(间质蛋白酶_A1_MMAE)、3毫克/千克/剂量(间质蛋白酶_A1_MMAF)6毫克/千克/剂量(间质蛋白酶_A1_MMAF)给予载剂(PBS)、间质蛋白酶_A1_MMAE或间质蛋白酶_A1_MMAF两次(在第1天和第29天)。在剂量开始(第1天)的前和各剂量后1、2、3、7、14、21和28天采集血液样品用于毒物动力学评估。在剂量开始(第1天)之前和各剂量后1、3、7、14、21和28天(在第1剂量后28天也充当第2剂量的剂量前时间点)采集血液样品用于临床病理学分析。在第57天最终血液采集后将所有研究动物安乐死且验尸。将从每次抽取的血液分离的血浆隔离、冷冻且运送至牛津生物疗法有限公司(Oxford BioTherapeutics,Inc.)以便通过ELISA分析ADC浓度。
表4
结论
猕猴通过15分钟静脉内输注分别输注两次剂量的PBS、多至3.0毫克/千克/剂量的间质蛋白酶_A1_MMAE(可裂解)或多至6.0毫克/千克/剂量的间质蛋白酶_A1_MMAF(不可裂解)的耐受良好。在研究过程期间未观测到死亡或濒死。在用间质蛋白酶_A1_MMAE或间质蛋白酶_A1_MMAF处理的动物中未观测到临床症状、一个或多个体重和体重变化或食物消耗的变化。
仅在各输注的后的一天对于一只第3组(间质蛋白酶_A1_MMAE,3毫克/千克/日)雄性;两只第4组(间质蛋白酶_A1_MMAF,3毫克/千克/日)猴;和两只第5组(间质蛋白酶_A1_MMAF,6毫克/千克/日)猴注意到AST值的增加。第3组雄性在各输注的后的一天的LDH值也增加。AST或LDH在任何其他时间点无增加。这些发现与检测的有限数目的组织中的组织病理学发现不相关。增加与测试物品相关但并非不良。第3组(间质蛋白酶_A1_MMAE,3毫克/千克/日)雄性和雌性的增加的BUN值可与测试物品给予相关,但鉴于缺乏与其他研究参数的相关性和增加的量级,其并非毒理学显著。对于血液学、凝血或尿分析参数不存在测试物品相关作用。不存在绝对和相对器官重量的处理相关总体病理学发现或变化。组织病理学上,第2组(间质蛋白酶_A1_MMAE,1毫克/千克/日)雌性;第4组(间质蛋白酶_A1_MMAF,3毫克/千克/日)雌性;和第5组(间质蛋白酶_A1_MMAF,6毫克/千克/日)雄性的脾动脉周围鞘中明显数目的淋巴细胞可能与测试物品相关,但不具有毒理学明显性。
序列表概况

Claims (34)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分,其:(a)与被抗体所识别的间质蛋白酶的主干区上的表位结合,所述抗体包括含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区,或(b)与抗体竞争结合间质蛋白酶的主干区,所述抗体包括含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
2.一种分离的抗体或其抗原结合部分,其结合间质蛋白酶的主干区,该抗体包含:a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:5的第一VHCDR;ii)包含SEQ ID NO:6的第二VHCDR;和iii)包含SEQ ID NO:7的第三VHCDR;和b)轻链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:8的第一VLCDR;ii)包含SEQ ID NO:9的第二VLCDR;和iii)包含SEQ ID NO:10的第三VLCDR;任选其中以上SEQ ID NO中的任意独立地包含一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、添加或缺失。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分,其包含与SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、95%或99%氨基酸序列相同性的重链和与SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、95%或99%氨基酸序列相同性的轻链。
4.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分,其还包含共价连接的部分。
5.如权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合部分,其中所述部分为药物部分或放射性部分。
6.如权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合部分,其中该药物选自:美登木素、尾海兔素、哈米特林、奥瑞他汀、新月毒素、卡奇霉素、CC1065及其衍生物。
7.如权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合部分,其中所述药物为选自MMAE和MMAF的美登木素。
8.如权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体,其中所述抗体诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
9.如权利要求8所述的分离的抗体,其中所述抗体为与Fc受体的结合性提高和/或针对ADCC的效能提高的经工程改造的抗体,和/或双特异性抗体。
10.一种药物组合物,其包含前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂。
11.一种核酸,其编码如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的重链。
12.一种核酸,其编码如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的轻链。
13.一种表达载体,其包含可操作地连接一个或多个调节元件的如权利要求11所述的核酸和/或可操作地连接一个或多个调节元件的如权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞,其包含:(i)表达载体,其包含可操作地连接一个或多个调节元件的如权利要求11所述的核酸和可操作地连接一个或多个调节元件的如权利要求12所述的核酸;或(ii)第一表达载体,其包含可操作地连接一个或多个调节元件的如权利要求11所述的核酸,和第二表达载体,其包含可操作地连接一个或多个调节元件的如权利要求12所述的核酸。
15.一种制造抗体或其抗原结合部分的方法,其包括在表达抗体或其抗原结合部分的条件下培养如权利要求14所述的宿主细胞,和任选分离所述抗体或其抗原结合部分。
16.一种治疗癌症的方法,所述方法包括给予需要的对象权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述抗体或其抗原结合部分被表达间质蛋白酶的主干区的细胞内化。
18.如权利要求16或17所述的方法,其中所述抗体或抗原结合部分包含共价连接的药物偶联物。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述共价连接的药物偶联物为奥瑞他汀,优选为MMAE。
20.如权利要求16所述的方法,其中所述抗体诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
21.如权利要求16-20中任一项所用的方法,其中所述癌症选自:胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、优选SCLC、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤优选非霍奇金氏淋巴瘤和皮肤癌。
22.一种用于治疗癌症用途的如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
23.如权利要求22所述的用途的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体或其抗原结合部分被表达间质蛋白酶的主干区的细胞内化。
24.如权利要求22或23所述的用途的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体或抗原结合部分包含共价连接的药物偶联物。
25.如权利要求24所述的用途的抗体或其抗原结合部分,其中所述共价连接的药物偶联物为奥瑞他汀,优选为MMAE。
26.如权利要求22所述的用途的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
27.如权利要求22-26中任一项所述的用途的抗体或其抗原结合部分,其中所述癌症选自:胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、优选为SCLC、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤优选非霍奇金氏淋巴瘤和皮肤癌。
28.如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
29.如权利要求28所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合部分被表达间质蛋白酶的主干区的细胞内化。
30.如权利要求28或29所述的用途,其中所述抗体或抗原结合部分包含共价连接的药物偶联物。
31.如权利要求30所述的用途,其中所述共价连接的药物偶联物为奥瑞他汀,优选为MMAE。
32.如权利要求28所述的用途,其中所述抗体诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
33.如权利要求28-32中任一项所述的用途,其中所述癌症选自:胃癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、优选为SCLC、食道癌、头颈癌、胰脏癌、淋巴瘤优选非霍奇金氏淋巴瘤和皮肤癌。
34.一种用于治疗或用作药物的如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
CN201480070410.1A 2013-11-25 2014-11-25 用于治疗癌症的抗间质蛋白酶抗体 Pending CN105849127A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361908371P 2013-11-25 2013-11-25
US61/908,371 2013-11-25
PCT/GB2014/053470 WO2015075477A1 (en) 2013-11-25 2014-11-25 Antibodies anti matriptase for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105849127A true CN105849127A (zh) 2016-08-10

Family

ID=52000873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480070410.1A Pending CN105849127A (zh) 2013-11-25 2014-11-25 用于治疗癌症的抗间质蛋白酶抗体

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9932411B2 (zh)
EP (1) EP3074423A1 (zh)
JP (1) JP2016538852A (zh)
KR (1) KR20160079818A (zh)
CN (1) CN105849127A (zh)
AR (1) AR098523A1 (zh)
AU (1) AU2014351565A1 (zh)
BR (1) BR112016011435A2 (zh)
CA (1) CA2929402A1 (zh)
EA (1) EA201690806A1 (zh)
IL (1) IL245551A0 (zh)
MX (1) MX2016006486A (zh)
TW (1) TW201605905A (zh)
WO (1) WO2015075477A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9849192B2 (en) 2009-11-18 2017-12-26 Rutgers, The State University Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
GEP20237496B (en) 2013-10-18 2023-04-10 Deutsches Krebsforsch Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
EP3074423A1 (en) 2013-11-25 2016-10-05 Oxford BioTherapeutics Ltd Antibodies anti matriptase for the treatment of cancer
AU2017235571B2 (en) * 2016-03-18 2024-05-16 Georgetown University Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to anti-matriptase antibodies by in vivo cleavable linking moieties

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030170245A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-11 Dickson Robert B. Activation of matriptase and diagnostic and therapeutic methods based thereon
WO2006068975A2 (en) * 2004-12-20 2006-06-29 Abgenix, Inc. Binding proteins specific for human matriptase
WO2011063127A1 (en) * 2009-11-18 2011-05-26 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
KR20130091132A (ko) * 2012-02-07 2013-08-16 한국생명공학연구원 메트립타아제-특이적인 인간 항체 및 그의 용도

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7022821B1 (en) 1998-02-20 2006-04-04 O'brien Timothy J Antibody kit for the detection of TADG-15 protein
US5972616A (en) 1998-02-20 1999-10-26 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas TADG-15: an extracellular serine protease overexpressed in breast and ovarian carcinomas
JP4778617B2 (ja) 1999-03-12 2011-09-21 ジョージタウン ユニバーシティ マトリプターゼ、セリンプロテアーゼおよびその応用
US7030231B1 (en) 1999-09-30 2006-04-18 Catalyst Biosciences, Inc. Membrane type serine protease 1 (MT-SP1) and uses thereof
EP1226150A4 (en) 1999-10-20 2005-05-25 Univ Arkansas TADG-15: EXTRACELLULAR SERINE PROTEASE EXPRESSED IN CARCINOMA
US6447978B1 (en) 1999-12-03 2002-09-10 Kodak Polychrome Graphics Llc Imaging member containing heat switchable polymer and method of use
DE60143880D1 (de) 2000-02-03 2011-03-03 Dendreon Corp Nukleinsäuren, welche für tramsmembran serin proteasen kodieren, die kodierten proteine und darauf basierende methoden
US6903201B2 (en) 2001-01-05 2005-06-07 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
WO2002072786A2 (en) 2001-03-13 2002-09-19 Corvas International, Inc. Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon
KR20040011480A (ko) 2001-03-22 2004-02-05 덴드레온 샌 디에고 엘엘씨 세린 프로테아제 cvsp14를 암호화하는 핵산 분자,암호화된 폴리펩티드 및 이에 근거한 방법
EP1379637A4 (en) 2001-03-27 2005-04-06 Dendreon Corp TRANSMEMBRANE SERINE PROTEASE 9 CODING NUCLEIC ACID MOLECULES, THE POLYPEPTIDE CODED, AND METHODS FORMING THEREOF
EP1539942A4 (en) 2001-05-14 2005-10-19 Dendreon Corp A TRANSMEMBRANE SERINE PROTEASE 10 CODING NUCLEIC ACID MOLECULES, THE POLYPEPTIDE CODED AND METHOD THEREOF
US7019019B2 (en) 2002-12-23 2006-03-28 Dendreon Corporation Matriptase inhibitors and methods of use
EP1851543A2 (en) 2005-02-24 2007-11-07 Compugen Ltd. Novel diagnostic markers, especially for in vivo imaging, and assays and methods of use thereof
WO2007047796A2 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
ES2550754T3 (es) 2007-08-07 2015-11-12 Oxford Biotherapeutics Ltd. Proteína matriptasa y usos de la misma
SI2285408T1 (sl) * 2008-06-05 2019-02-28 Ablynx N.V. Aminokislinska zaporedja usmerjena proti proteinom ovojnicam virusa in polipeptidi, ki zaporedja vsebujejo za zdravljenje virusnih bolezni
US8205227B1 (en) 2010-02-06 2012-06-19 Frontier Communications Corporation Management and delivery of audiovisual content items that correspond to scheduled programs
EP3074423A1 (en) 2013-11-25 2016-10-05 Oxford BioTherapeutics Ltd Antibodies anti matriptase for the treatment of cancer

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030170245A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-11 Dickson Robert B. Activation of matriptase and diagnostic and therapeutic methods based thereon
WO2006068975A2 (en) * 2004-12-20 2006-06-29 Abgenix, Inc. Binding proteins specific for human matriptase
WO2011063127A1 (en) * 2009-11-18 2011-05-26 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
KR20130091132A (ko) * 2012-02-07 2013-08-16 한국생명공학연구원 메트립타아제-특이적인 인간 항체 및 그의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FOLTZ I N,等: "Generation of a Fully Human High Affinity Neutralizing Antibody Against MT-SP1/Matriptase and Its Potential Role for the Treatment of B Cell Lymphoma", 《JOURNAL OF THE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION》 *
XINLIAN JIN,等: "Matriptase activates stromelysin (MMP-3) and promotes tumor growth and angiogenesis", 《CANCER SCIENCE BANNER》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2929402A1 (en) 2015-05-28
JP2016538852A (ja) 2016-12-15
US20160289338A1 (en) 2016-10-06
AR098523A1 (es) 2016-06-01
AU2014351565A1 (en) 2016-06-09
TW201605905A (zh) 2016-02-16
MX2016006486A (es) 2016-08-05
EA201690806A1 (ru) 2016-09-30
EP3074423A1 (en) 2016-10-05
US9932411B2 (en) 2018-04-03
BR112016011435A2 (pt) 2017-09-26
IL245551A0 (en) 2016-06-30
KR20160079818A (ko) 2016-07-06
WO2015075477A1 (en) 2015-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9228023B2 (en) Anti-ROR1 antibodies and methods of use for treatment of cancer
US20190194335A1 (en) Antibodies specific for epidermal growth factor receptor variant iii and their uses
US20210371541A1 (en) Conjugated antiboides against ly75 for the treatment of cancer
CN106471009A (zh) 结合至cd38和cd3的双特异性抗体
CN103402538A (zh) 结合于191p4d12蛋白的抗体药物偶联物(adc)
CN109069871A (zh) 用于治疗癌症的新抗体
CN110494448B (zh) 包含抗-ly75抗体的医药组合
CN105849127A (zh) 用于治疗癌症的抗间质蛋白酶抗体
BR112020016169A2 (pt) Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação, conjunto de ácidos nucleicos isolados, conjunto de vetores, conjunto de células hospedeiras, imunoconjugado, composição, uso da molécula de ligação, métodos para tratar ou retardar a progressão de um câncer, métodos para aperfeiçoar a função imune e kit
TERRETT et al. Patent 2929402 Summary
NZ718617B2 (en) Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160810