KR20160079818A - 암 치료용 항-매트립타제 항체 - Google Patents

암 치료용 항-매트립타제 항체 Download PDF

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체타나 라오-나익
하이준 황
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에리카 미드도우
미쉘 쿤
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Abstract

본 발명은 티로신-단백질 키나제 막관통 수용체인 매트립타제의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 제공한다. 이 항체를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체의 발현 방법 또한 제공한다. 본 항체는 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암 등의 암을 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

암 치료용 항-매트립타제 항체 {ANTIBODIES ANTI MATRIPTASE FOR THE TREATMENT OF CANCER}
매트립타제 (matriptase)는 세포외 기질 (matrix)을 분해한다. SWISS-PROT에는, 이것이 유방암 침습과 전이에 소정의 역할을 하는 것으로 제시되어 있다. 이것은 P1 사이트로서 Arg 또는 Lys를 가진 합성 기질을 절단하는 것으로 정의되는 트립신-유사 활성을 나타낸다. 이 효소는 프로필라그린 프로세싱 (profilaggrin processing), 각질세포 (corneocyte)의 성숙, 및 구강 상피 및 표피의 최종 분화와 관련된 지질 매트릭스를 형성하는데 있어 기본적인 생리학적 기능을 담당하며, 또한 모낭 생장에도 중요한 역할을 한다. 이것은 대부분의 인간 상피에서 발현되는 II형 막관통 세린 프로테아제이며, 엄밀하게는 상피 프로테아제이다. 이것은 상피 기원의 암종에서 발현되며, 간엽 기원의 종양에서는 발현되지 않는다. 매트립타제는 기존에 WO 2009/020645에서 언급된 바 있다.
본 발명은 매트립타제 (예, 서열번호 26을 포함하는 인간 매트립타제) 또는 이의 기능성 영역, 예를 들어 스템 (stem) (서열번호 21-24)에 대한 항체 및 이 항체를 코딩하는 핵산과 치료 단백질을 포함하는 관련 조성물 및 이들 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은, 또한, 항-매트립타제 항체의 제조 방법과, 매트립타제 매개 장애, 예를 들어, 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암 등의 인간 암과 같은 질환을 치료하기 위한 이 항체의 이용 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-매트립타제 항체 (또는 이의 항원 결합 단편)는 매트립타제의 세포외 스템 영역 (서열번호 21-24)에 결합하며, 매트립타제를 발현하는 세포에 의해 내재화된다.
일 측면에서, 본 발명은, (a) 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역과 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 매트립타제의 에피토프에 결합하거나, 또는 (b) LY75로의 결합에 대해 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역과 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 제공한다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 인간 매트립타제에 결합하며, 서열번호 5, 6 및 7을 포함하는 CDR들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변성 영역, 및/또는 서열번호 8, 9 및 10을 포함하는 CDR들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 특정 항체 (예, 본원에서 "매트립타제_A1"으로 언급됨)의 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 가변성 영역 (VR)을 포함한다. 이에, 일 구현예에서, 항체는 서열번호 1로 나타낸 서열을 가지는 매트립타제_A1의 중쇄 가변성 영역 (VH)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인들과, 및/또는 서열번호 2로 나타낸 서열을 가지는 매트립타제_A1의 경쇄 가변성 영역 (VL)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인들을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체는 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변성 영역; 및/또는 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR; 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR; 및 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 매트립타제에 결합하며, 서열번호 1의 아미노산 서열과 이의 보존적인 서열 변형 등의 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 항체는, 서열번호 2의 아미노산 서열과 이의 보존적인 서열 변형 등의 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 매트립타제에 결합하며, 각각 서열번호 1 및/또는 2에 나타낸 아미노산 서열, 및 이의 보존적인 서열 변형을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
보존적인 서열 변형은 아미노산 치환, 부가 또는 결손일 수 있으며, 바람직하게는 치환인 것으로 이해될 것이다. 본원에서, 용어, 보존적인 서열 변형은, 예를 들어, 아미노산의 특성이 비슷한 아미노산으로의 치환을 의미한다. 당해 기술 분야의 당업자에게는 이러한 치환이 보존적인 것으로 인지될 수 있음은 통상의 상식이다. 보존적인 서열 변형으로 간주될 수 있는 그외 변형으로는, 예를 들어, 당화를 포함한다.
보존적인 서열 변형은, 서열번호 1 및/또는 2에 나타낸 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역의, CDR 영역들 (서열번호 5-10) 중 하나 이상 및/또는 프레임워크 영역 (서열번호 29-36) 중 하나 이상에 존재할 수 있는 것으로, 추가로 이해될 것이다.
바람직한 구현예에서, 항체는 단리된 항체이다.
전술한 서열들 중 어느 서열에 대해서라도 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는, 중쇄 가변성 영역과 경쇄 가변성 영역을 포함하는, 단리된 항체 역시 본 발명에 포함된다. 앞에서 언급된 값들의 사이 범위, 예를 들어 전술한 임의 서열에 대해 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95% 또는 95-100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변성 영역 및 경쇄 가변성 영역 역시 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, 항체는, 서열번호 1, 또는 서열번호 1에 대한 동일성이 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%인 서열을 포함하는, 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 2, 또는 서열번호 2에 대한 동일성이 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%인 서열을 포함하는, 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 29, 30, 31 및 32에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 중쇄 가변성 영역의 프레임워크에 대한 동일성이 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%인 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 프레임워크 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 33, 34, 35 및 36에 나타낸 바와 같이, 서열번호 2의 경쇄 가변성 영역의 프레임워크에 대한 동일성이 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%인 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다.
또한, 매트립타제와의 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하는 단리된 항체도 본 발명에 포함된다. 구체적인 구현예에서, 항체는, 매트립타제와의 결합에 대해, 서열번호 1 및 2에 각각 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역, 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 구현예에서, 항체는 매트립타제와의 결합에 대해, 서열번호 1 및 2에 각각 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체 (A1)와 경쟁한다.
본 발명의 다른 항체들은 본원에 기술된 항체에 의해 인지되는 동일한 에피토프 또는 매트립타제의 에피토프에 결합한다. 다른 구체적인 구현예에서, 항체는, 서열번호 1 및 2에 각각 나타낸 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 매트립타제 상의 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 1 및 2로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체 (A1)에 의해 인지되는 매트립타제 상의 에피토프에 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 모 항체와 비교해 가변성인 CDR들을 포함한다. 이에, 본 발명은, 모 항체가 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR, 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR, 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR, 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR, 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR 및 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하고, 변이 항체가 제1 vhCDR, 제2 vhCDR, 제3 vhCDR, 제1 vlCDR, 제2 vlCDR 및 제3 vlCDR로 된 세트에 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 가지고 있고, 1-4개, 1-3개 또는 1-2개의 치환이 구체적으로 적용되며, 변이 항체가 매트립타제에 대한 특이적인 결합성을 유지하는, 모 항체의 변이 가변성 영역을 포함하는 변이 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 전장, 예를 들어 이소형, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 중 임의의 것일 수 있다. 다른 예로, 항체는 항원-결합 영역 또는 단쇄 항체 (예, Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 2 이상의 단리된 CDR들의 조합) 등의 단편일 수 있다. 항체는, 비제한적인 예로, 인간, 인간화 (humanized) 및 키메라 항체 등의 임의 타입의 항체일 수 있다.
다른 구현예들에서, 본 발명의 항체는 면역접합체 형태 (즉, 공유 결합된 모이어티를 추가로 포함함)이다. 구체적인 구현예에서, 모이어티는 메이탄시노이드 (maytansinoid), 헤미아스테를린 (hemiasterlin), 돌라스타틴 (dolastatin), 아우리스타틴 (auristatin), 트리코테센 (trichothecene), 칼리케아미신 (calicheamicin), CC1065 또는 이의 유도체 등의 약물이다. 바람직한 구현예에서, 약물은 아우리스타틴 (auristatin)이며, 더 바람직하게는 MMAE 또는 MMAF이다.
다른 구현예들에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 작동자 세포의 존재시 항체 의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 반응을 발휘하여 매트립타제-발현 세포를 사멸시키는, 이중특이성 분자 (bispecific molecule) 형태이다.
다른 측면에서, 본 발명은 전술한 항체의 중쇄 가변성 영역을 코딩하는 핵산 및/또는 경쇄 가변성 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 인간 매트립타제에 결합하는 단리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기서 항체는 서열번호 3 및 4를 각각 포함하는 핵산 서열, 또는 전술한 핵산 서열에 대해 유전자 코드의 축중으로 인해 서열번호 3 및 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지는 핵산, 또는 유전자 코드의 축중 (degeneracy)으로 인한 차이가 있는 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변성 영역 및 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
본 발명은 다른 측면에서 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체의 중쇄 가변성 영역을 코딩하는 핵산 및/또는 경쇄 가변성 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 코딩하는 핵산 또는 전술한 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포를 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 배양하면, 숙주 세포는 상기 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역, 또는 항원 결합 영역을 발현한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 항체를 회수하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는:
(i) 본 발명에 따른 발현 벡터; 또는
(ii) 본 발명의 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 항원 결합 영역을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 항원 결합 영역을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은, 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 숙주 세포를 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 발현되는 조건 하에 배양하고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 단리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체들 또는 이들의 결합 영역을 투여하는, 암 치료 방법을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 환자에게 매트립타제의 세포외 스템 영역 (서열번호 21-24)에 결합하는 항체를 투여한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체들은 내재화된다. 일 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 영역은 공유 결합된 약물 모이어티를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변성 영역, 및 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR, 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR 및 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
다른 측면에서, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체들 또는 이들의 항원-결합 영역을 투여하며, 본 발명의 이들 항체, 항체들 또는 이들의 항원-결합 영역이 작동자 세포의 존재 시 ADCC 반응을 유발하는, 암 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변성 영역과; 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR; 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR; 및 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
추가적인 측면에서, 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 항체, 항체들 또는 이들의 항원-결합 영역을 투여하며, 본 발명의 이러한 항체, 항체들 또는 항원-결합 영역가 작동자 세포의 존재시 세포독성 T-세포 반응을 유발하는, 암 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항체는, 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변성 영역과; 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR; 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR; 및 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
본 발명은, 다른 측면에서 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 하나 이상의 항체를 제공한다.
또한, 암 치료용 약제의 제조에 있어 본 발명의 하나 이상의 항체의 용도를 제공한다.
일 구현예에서, 암은 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암으로 된 군으로부터 선택된다.
본 발명은, 또 다른 측면에서, 매트립타제에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서, 매트립타제가 발현되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하거나 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 암에 대한 항암제 또는 요법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 암은 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 범위에, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체)과 선택적으로 사용 설명서를 포함하는 키트도 포함한다. 키트는 하나 이상의 추가적인 시약 또는 하나 이상의 추가적인 본 발명의 항체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징들과 이점들은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명확해질 것이다.
도 1a 및 1b는 스템 영역 (서열번호 21-24)이 획득되는 매트립타제의 절단부를 도시한 것이다.
도 2a는 매트립타제_A1 중쇄, 인간 VH 3-23 Germline 및 인간 JH4b Germline을 정렬한 것이다. 매트립타제_A1 중쇄의 CDR 영역들은 밑줄로 표시된다.
도 2b는 매트립타제_A1 경쇄, 인간 VK A27 Germline 및 인간 JK2 Germline을 정렬한 것이다. 매트립타제_A1 경쇄의 CDR 영역들은 밑줄로 표시된다.
도 3은 ELISA를 이용한 매트립타제_A1의 매트립타제-스템 결합 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 SNU1 세포에서의 매트립타제_A1의 유세포 측정 분석 결과를 도시한 것이다.
도 4b는 HT-29 세포에서의 매트립타제_A1의 유세포 측정 분석 결과를 도시한 것이다.
도 4c는 HT69 세포에서의 매트립타제_A1의 유세포 측정 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5는 작동자 세포의 존재 시 매트립타제_A1이 항체 의존적인 세포성 세포동성 (ADCC) 반응을 유발함을 보여주는 것이다.
도 6은 MabZAP 분석을 이용한 HT-29 세포와 H69 세포에 의한 매트립타제_A1의 내재화를 보여주는 것이다.
도 7a는 독소 접합된 매트립타제_A1의 1회 투여 (0.3 mole/kg: c.2mg/kg)가 치유 효과가 있음을 보여주는 것이다.
도 7b는 매트립타제_A1의 60일간 투여시 체중 변화를 나타낸 것으로, 종양-유발성 악액질의 완화가 확인된다.
도 7c는 HT-29 ADC 이종이식 모델에서 교차 투약군 (alternate dose group)의 치료에 대한 용량 반응을 도시한 것이다.
도 7d는 HT-29 ADC 이종이식 모델에서 교차 투약군의 용량 반응성 악액질 완화를 도시한 것이다.
도 8은 다양한 암 세포주들에서 MMAE 또는 MMAF가 접합된 항-매트립타제 항체를 이용한 ADC 세포독성 분석의 EC50 값을 도시한 것이다.
도 9는 난소 선암종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 MMAE 또는 MMAF가 접합된 항-매트립타제 항체의 효능을 도시한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이, 서열번호 21-24에 기재된 매트립타제의 스템 영역에 고 친화성으로 특이적으로 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 매트립타제 항체는, 이중특이성 분자의 형태일 수 있으며, 예를 들어 작동자 세포의 존재 시 항체 의존적인 세포성 세포독성 (ADC) 반응을 강화하여 매트립타제-발현 세포를 사멸시키는, 이중특이성 분자의 형태일 수 있다.
다른 구현예들에서, 본 발명의 매트립타제 항체는 매트립타제 수용체를 발현하는 세포와의 접촉시 내재화된다. 본원에 언급된 바와 같이, 매트립타제 수용체는, 비제한적인 예로, 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암 등의 특정 암 세포에서 과다 발현되거나, 및/또는 차별적으로 발현된다.
이에, 이러한 본 발명의 매트립타제 항체에 약물이 접합된 경우 (본원에서 종종 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"라 함), 이들 ADC 분자의 암 세포로의 내재화로 인해 세포 사멸이 발생하며, 따라서 종양이 치료된다.
따라서, 본 발명은, 항체 특히 (본원에 후술된 바와 같이, 널리 공지된 매우 댜앙한 항체 구조, 유도체, 모방체 및 접합체를 포함하는) 단리된 항체, 이들 항체를 코딩하는 핵산, 항체 제조에 사용되는 숙주 세포, 항체 제조 방법 및 항체와 선택적으로 약제학적 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
매트립타제 단백질
매트립타제의 세포외 스템 영역은 아미노산 잔기 86-201 (서열번호 21)를 포함하는 단일한 SEA 도메인을 구성하는 것으로 보고된 바 있다. 매트립타제의 활성화에는 순차적인 엔도프로테오라이틱 절단과 활성화 부위의 자동절단 (autocleavage)이 요구된다. 절단은 아미노산 Gly149 다음에 발생하며, 아미노산 잔기 86-149를 포함하는 스템 영역 (매트립타제 스템 서열 B, 서열번호 22)이 수득된다. 추가적인 단백질분해에 의한 절단이 아미노산 K189 다음 위치에서 발생할 수 있는데, 그 결과 아미노산 서열 86-189를 포함하는 스템 영역 (매트립타제 스템 서열 C, 서열번호 23)이 수득되거나, 또는 아미노산 K204 다음에 절단되어 아미노산 서열 86-204를 포함하는 스템 영역 (매트립타제 스템 서열 D, 서열번호 24)이 수득될 수 있다. 이후, 매트립타제는 Arg614 다음 위치에서 단백질분해에 의해 절단되어 활성 형태로 전환된다. C-말단 세린 프로테아제 촉매 도메인은 아미노산 잔기 615-855로 구성된다 (서열번호 27) (도 1). 예를 들어, Matriptase: Potent Proteolysis on the Cell Surface; List, Bugge and Szabo; Mol Med 12(1-3)1-7, Jan-March 2006 및 Regulation of the activity of Matriptase on epithelial cell surfaces by a blood derived factor; Benaud, Dickson and Lin; Eur J Biochem 268, 1439-1447, 2001을 참조하며, 이들 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
이에, 본 발명은 인간 매트립타제의 스템 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항-매트립타제 항체를 제공한다. "인간 매트립타제" 또는 "인간 매트립타제 항원"은 본원에 정의된 바와 같이 서열번호 26의 단백질 또는 스템 등의 기능성 단편 (서열번호 21-24)을 지칭한다. 일반적으로, 매트립타제는 짧은 세포질내 꼬리 (intracytoplasmic tail), 막관통 도메인, 및 절단 시 매트립타제 스템 영역이 되는 세포외 도메인을 가진다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 매트립타제 단백질의 스템 영역에 결합한다.
본 발명의 항체는, 소정의 경우에는, 인간이 아닌 다른 종으로부터 유래된 매트립타제와 교차-반응할 수 있다. 예를 들어, 임상 검사를 용이하게 하기 위해, 본 발명의 항체는 설치류류 또는 영장류의 매트립타제 분자와 교차 반응할 수 있다. 다른 예로, 특정 구현예에서, 항체는 1종 이상의 인간 매트립타제에 완전히 특이적일 수 있으며, 인간 이외의 다른 종 또는 유형에 대해서는 교차-반응성을 나타내지 않을 수도 있다.
항체
본 발명은 항-매트립타제 항체, 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 치료용 및/또는 진단용 항체를 제공한다. 본 발명에서 용도를 가지는 항체는, 전통적인 항체 뿐만 아니라 후술한 항체 유도체, 단편 및 모방체 등의, 본원에 기술된 여러가지 포맷을 취할 수 있다. 기본적으로, 본 발명은 본원에 정의되는 바와 같이 6개의 CDR 한 세트를 포함하는 (후술한 몇가지 아미노산 변화를 포함하는) 항체 구조체를 제공한다.
"항체"는, 본원에서, 당해 기술 분야의 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 최소한 본원에 정의된 6개의 CDR로 된 세트를 포함하는 매우 다양한 구조를 포함하며; 비제한적인 예로, 전통적인 항체 (단일클론 및 다클론 항체를 포함함), 인간화 항체 및/또는 키메라 항체, 항체 단편, 엔지니어드 항체 (engineered antibody)(예, 아래에 개략적으로 기술된 아미노산 변형을 가짐), 다중특이성 항체 (2중특이성 항체를 포함함), 및 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 본원에 언급된 기타 유사체를 포함한다.
전통적인 항체 구조 단위는 통상적으로 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 전형적으로 동일한 폴리펩타이드 체인 2쌍으로 구성되며, 각 쌍은 "경"쇄 (전형적으로 분자량이 약 25 kDa임) 하나와 "중"쇄 (전형적으로 분자량이 약 50-70 kDa임) 하나를 가진다. 인간 경쇄는 카파 경쇄와 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형인 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 각각 정의된다. IgG는, 비제한적인 예로, lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4 등의 몇몇 서브클래스를 가진다. IgM는, 비제한적인 예로, lgM1 및 lgM2 등의 서브클래스를 가진다. 따라서, 본원에서 "이소형"은 불변 영역의 화학적 특성과 항원 특성에 의해 정의되는 면역글로불린의 임의의 서브클래스를 의미한다. 공지된 인간 면역글로불린 이소형으로는 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, lgM1, lgM2, IgD 및 IgE가 있다. 치료 항체 역시 이소형 및/또는 서브클래스의 임의의 조합의 하이브리드를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
다수 구현예들에서, IgG 이소형들이 본 발명에 사용되며, 다수 활성에 IgG1이 특별한 용도를 가진다.
각 체인의 아미노-말단 부위는 주로 항원 인지를 담당하는 아미노산 약 100 내지 110개 이상으로 된 가변성 영역을 포함한다. 가변성 영역에서, 중쇄 및 경쇄의 각 V 도메인에 대한 루프 3개가 조합되어 항원 결합 영역을 형성한다. 각각의 루프는, 아미노산 서열의 변형이 가장 현저한, 상보성 결정 영역 (본원에서 "CDR"로 지칭됨)으로 지칭된다. "가변성"은 가변성 영역의 특정 세그먼트가 항체들 간에 서열 상 큰 차이를 보인다는 것을 의미한다. 가변성 영역내 가변성은 균일하게 분포하는 것은 아니다. 대신, V 영역은 아미노산 15-30개로 된 프레임워크 (FR)라 지칭되는 상대적으로 불변인 가닥들과 그 사이에 존재하는 각 아미노산 9-15개 이상의 길이를 가지는 "과가변성 영역"으로 지칭되는 극도의 가변성을 보이는 짧은 영역으로 구성된다.
각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열된, 3개의 과가변성 영역 ("상보성 결정 영역," "CDR")과 4개의 FR로 구성된다.
과가변성 영역은 일반적으로 경쇄 가변성 영역에서 아미노산 잔기 약 24-34 (LCDR1; "L"은 경쇄를 표시함), 50-56 (LCDR2) 및 89-97 (LCDR3)과, 중쇄 가변성 영역에서 아미노산 잔기 약 31-35B (HCDR1; "H"는 중쇄를 표시함), 50-65 (HCDR2) 및 95-102 (HCDR3) (Kabat et al., SSEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), 및/또는 과가변성 루프를 형성하는 잔기들 (예, 경쇄 가변성 영역에서 잔기 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) 및 91-96 (LCDR3)과, 중쇄 가변성 영역에서 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) 및 96-101 (HCDR3))를 포함한다 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). 본 발명의 구체적인 CDR들은 아래에서 설명된다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 가변성 도메인의 잔기 (대략적으로, 경쇄 가변성 영역의 1-107 잔기와 중쇄 가변성 영역의 1-113 잔기)를 언급할 때 일반적으로 카바트 번호 체계를 사용한다 (예, Kabat et al., supra (1991)).
CDR은 항원-결합을 형성하거나, 보다 구체적으로는 항체의 에피토프 결합 자리 (epitope binding site)를 형성하는 역할을 한다. "에피토프" 또는 "항원 결정기 (antigenic determinant)"는, 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 자리를 지칭한다. 에피토프는 인접한 아미노산들로부터 형성되거나, 또는 단백질의 3차원 접힘에 의해 정렬되는 비-인접한 아미노산들로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산들로부터 형성되는 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출되더라도 유지되는 반면, 3차원 접힘에 의해 형성되는 에피토프는 변성 용매의 처리시 전형적으로 소실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 고유한 입체 구조 (spatial conformation)로 포함한다. 주어진 항체에 대해 어떠한 에피토프가 결합하는 지를 결정하는 방법 (즉, 에피토프 맵핑)은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 면역블록팅 및 면역침강 분석을 포함하며, 매트립타제로부터 유래되는 중첩되거나 연속되는 펩타이드를 대상으로 주어진 항-매트립타제 항체와의 반응성에 대해 검사한다. 에피토프의 입체 구조를 결정하는 방법은, 당해 기술 분야의 기법과 본원에 기술된 기법, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명 (예, Epitope Mapping Protocoles in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.(1996) 참조)을 포함한다. "에피토프 맵핑"이라는 용어는 항체-항원을 인지하기 위한 분자 결정 부위를 동정하는 과정을 의미한다.
"에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변성 영역내 특정 항원 결합 자리와 상호작용하는 결정기를 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 그룹핑이며, 통상적으로 특이적인 구조 특징들 뿐만 아니라 특이적인 하전 특징들을 가진다. 하나의 항원이 2 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 본 발명에서, 정확한 에피토프가 중요한 것이 아니고, 오히려 본 발명의 항체가 매트립타제 수용체에 결합하여 내재화되거나 또는 작동자 세포의 존재 시 ADCC 반응을 발생시키는 능력이 중요하다.
각 체인의 카르복시-말단 영역은 작동자 기능을 주로 담당하는 불변 영역을를 정의한다. Kabat 등은 중쇄와 경쇄의 가변성 영역의 일차 서열을 다수 수집하였다. 서열의 보존성 수준에 기반하여, Kabat 등은 각 일차 서열을 CDR과 프레임워크로 분류하여, 목록을 작성하였다 (SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al. 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
면역글로불린의 IgG 서브클래스의 경우, 중쇄에 면역글로불린 도메인이 수개 존재한다. "면역글로불린 (Ig) 도메인"은 본원에서 구분되는 3차 구조를 가지는 면역글로불린 영역을 의미한다. 본 발명에서 관심을 가지는 대상은, 불변 중쇄 (CH)와 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이다. IgG 항체 측면에서, IgG 이소형은 각각 3개의 CH 영역을 가진다. 따라서, IgG에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 118-220번 위치이다. "CH2"는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 237-340번 위치이고, "CH3"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 341-447번 위치이다.
중쇄의 다른 유형의 Ig 도메인은 힌지부이다. "힌지" 또는 "힌지부" 또는 "항체 힌지부" 또는 "면역글로불린 힌지부"는, 본원에서, 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이에 위치한 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 220번 위치에서 끝나며, IgG CH2 도메인은 EU 237번 위치에서 시작된다. 즉, IgG의 경우, 항체 힌지는 221번 (IgG1의 경우 D221)에서 236번 (IgG1의 경우 G236)까지를 포함하는 것으로 정의되며, 이때 번호는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 구현예들에서, 예를 들어 Fc 영역의 경우, 하류 힌지 (lower hinge)를 포함하는데, "하류 힌지"는 일반적으로 226번 또는 230번 위치를 지칭한다.
본 발명에서 특히 관심을 가지는 부분은 Fc 영역이다. 본원에서 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하며, 일부 경우에는 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 즉, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 경우에는 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 그리고 이들 도메인에 대한 N-말단 가요성 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 체인을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2과 Cγ3 (Cγ2 및 Cγ3) 및 Cγ1(Cγ1)과 Cγ2(Cγ2) 사이의 하류 힌지 영역을 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은 통상적으로 C226 또는 P230에서 카르복시 말단까지의 잔기를 포함하는 것으로 정의되며, 번호 체계는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따른다. 일부 구현예에서, 하기에서 더욱 충분히 기술된 바와 같이, Fc 영역에 아미노산 변형, 예를 들어, 하나 이상의 FcγR 수용체 또는 FcRn 수용체와의 결합을 변형시키기 위해, 아미노산 변형이 이루어진다.
일부 구현예들에서, 항체는 전장 (full length)이다. 본원에서, "전장 항체"는, 본원에 개략적으로 기술된 바와 같이 하나 이상의 변형을 포함하며, 가변성 영역과 불변성 영역을 포함하는, 항체의 자연적인 생물학적 형태를 구성하는 구조를 의미한다.
다른 예로, 항체는 다양한 구조일 수 있으며, 비제한적인 예로, 항체 단편, 단일클론 항체, 2중특이성 항체, 미니바디 (minibody), 도메인 항체, 합성 항체 (종종 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합 (종종 "항체 접합체"로 지칭됨) 및 각각의 단편을 각각 포함한다. CDR 세트의 사용에 기반한 구조는 "항체"의 정의에 포함된다.
일 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 구체적인 항체 단편으로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 단일한 가변성 영역로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), (v) 단리된 CDR 영역, (vi) 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (vii) 단쇄 Fv 분자 (scFv)로서, VH 도메인과 VL 도메인이 펩타이드 링커에 의해 연결되어 있어 이들 2개의 도메인은 연합하여 항원 결합 영역을 형성할 수 있음 (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), (viii) 이중특이성 단쇄 Fv (WO 03/1 1161, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이성 단편인 "다이아바디" 또는 "트리아바디" (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 이들 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
키메라 항체 및 인간화 항체
일부 구현예에서, 항체는 서로 다른 종들로부터 유래된 혼합물일 수 있으며, 예를 들어, 키메라 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있다. 즉, 본 발명에서, CDR 세트들은 본원에 서열로 구체적으로 기술된 것 외의 프레임워크와 불변성 영역과 함께 사용할 수 있다.
일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화 항체"는 둘다 2종 이상으로부터 유래된 영역들을 조합한 항체를 지칭한다. 예를 들어, "키메라 항체"는 전통적으로 마우스 (또는 일부 경우에는 랫) 유래 가변성 영역(들)와 인간 유래 불변성 영역(들)을 포함한다. "인간화 항체"는 일반적으로 인간 항체에서 발견되는 서열을 대체하는 가변성 도메인 프레임워크 영역을 가진, 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, CDR을 제외한 항체 전체는 인간 기원의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나 또는 CDR을 제외하고는 상기한 항체와 동일하다. 일부 또는 전체가 비-인간 유기체에서 기원한 핵산에 의해 코딩되는 CDR을, 인간 항체 가변성 영역의 베타-시트 프레임워크에 이식하여, 항체의 특이성이 이식된 CDR에 의해 결정되는 항체를 구축한다. 이런 항체의 구축 방법은, 예를 들어, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536에 기술되어 있으며, 이들 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 처음 이식된 구조체에서 소실된 친화성을 재 획득하기 위해서는 선택된 어셉터 프레임워크 잔기를 대응되는 도너 잔기로 "역돌연변이"하는 것이 종종 요구된다 (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, 이들 문헌 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 또한, 인간화 항체는 최적으로는 면역글로불린 불변성 영역의 일정 부분 이상, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일정 부분 이상을 포함할 것이며, 따라서 전형적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 유전자 조작된 면역계를 가진 마우스를 이용해 제조할 수도 있다 (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 비-인간 항체를 인간화하고 재구현화 (reshaping)하기 위한 다양한 기법들과 방법들이 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)와 인용된 문헌, 이들 문헌 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 인간화 방법으로는, 비제한적으로, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8에 기술된 방법들을 포함하며, 이들 문헌 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 비-인간 항체 가변성 영역의 면역원성을 낮추기 위한 인간화 또는 기타 방법들은 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973에 기술된 바와 같이 리서페이싱 방법 (resurfacing method)을 포함할 수 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일 구현예에서, 모 항체는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 친화성 성숙된 것이다. 예를 들어, USSN 11/004,590에 기술된 바와 같이, 인간화 및 친화성 성숙화를 위해 구조-기반의 방법이 적용될 수 있다. 선택 기반의 방법을 적용해, 성숙형 항체 가변성 영역을 인간화 및/또는 친화 성숙시킬 수 있으며, 그러한 방법으로는, 비제한적인 예로, Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759에 기술된 방법들이 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 인간화 방법들, 비제한적인 예로, SSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084에 기술된 방법들이 CDR들 중 일부만을 이식하는 것을 수반할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 다중특이성 항체, 특히 종종 "다이아바디"로도 언급되는 이중특이성 항체일 수 있다. 이들은 2종 (이상)의 다른 항원 또는 동일 항원의 서로 다른 에피토프에 결합하는 항체이다. 다이아바디는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들어 화학적으로 제조하거나 도는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조할 수 있다 (Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
일 구현예에서, 항체는 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소형의 항체-유사 단백질이다. Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061을 참조하며, 그 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 경우에, scFv는 Fc 영역에 연결될 수 있으며, 힌지부 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 미니바디는 CDR 전체 세트를 포함하지 않지만 "항체"의 정의에 포함됨에 유념하여야 한다.
본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 또는 재조합된 형태이다. "단리된"은, 본원에 기술된 다양한 폴리펩타이드를 설명하기 위해 사용되는 경우, 폴리펩타이드가 이것이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 식별 및 분리 및/또는 회수된 것을 의미한다. 즉, 단리된 항체는 상이한 항원 특성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것으로 의도된다 (예, 매트립타제에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 매트립타제 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 따라서, "단리된" 항체는 자연에서 정상적으로는 발견되지 않는 (예, 비-천연적) 형태로 발견되는 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 항체는 재조합 단백질, 단리된 단백질 또는 실질적으로 순수한 단백질이다. "단리된" 단백질은 자연 상태에서는 정상적으로 조합되는 물질을 적어도 일부 수반하지 않으며, 예를 들어 주어진 샘플에서 전체 단백질 중 약 5 중량% 이상 또는 약 50 중량% 이상을 차지한다. 단리된 단백질은 경우에 따라서는 전체 단백질 함량의 5 내지 99.9 중량%를 차지하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 단백질은 유도성 프로모터 또는 고발현성 프로모터를 사용함으로써 매우 높은 농도로 만들 수 있어, 단백질은 증가된 농도 수준으로 제조된다. 재조합 단백질의 경우, 그 정의는 천연적으로는 생산되지 않는 당해 기술 분야에 공지된 매우 다양한 유기체 및/또는 숙주 세포에서의 항체 생산을 포함한다. 통례적으로, 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 서로 다른 항원 특징을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것이며, 예를 들어, 매트립타제에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 매트립타제 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다.
서로 다른 특성을 가진 단리된 단일클론 항체들은 잘 확립된 조성물로 조합할 수 있다. 즉, 예를 들어, 본 발명의 항체는 선택적으로 그리고 개별적으로 추가로 후술한 바와 같이 제형에 포함 또는 제외될 수 있다.
본 발명의 항-매트립타제 항체는 매트립타제에 특이적으로 결합한다 (예, 매트립타제-스템 (서열번호 21-24). 특정 항원 또는 에피토프에 대한 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적"인은 비-특이적인 상호작용과 측정가능할 정도로 다른 결합을 의미한다. 특이적인 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성이 없는 유사한 구조를 가진 분자인, 대조군 분자의 결합과 비교해, 분자의 결합성을 측정함으로써, 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 타겟과 유사한 대조군 분자와 경쟁함으로써 확인할 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적인 결합은, 예를 들어, 항원 또는 에피토프에 대해 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 다른 예로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 적어도 약 10-12 M 또는 그 이상의 KD를 가지는 항원에 의해 나타날 수 있으며, 여기서 KD는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 의미한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 대한 대조군 분자에 비해 항원 또는 에피토프에 대한 KA 또는 Ka가 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000- 배 이상 높을 것이다. 그러나, 본 발명에서, 본 발명의 매트립타제 항체의 ADC 투여하는 경우, 중요한 사항은 KD가 내재화가 가능하고 따라서 유의한 부작용 없이 세포 사멸시키기에 충분하다는 것이다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적인 결합은, 예를 들어 대조군 대비 에피토프에 대해 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000- 배 또는 그 이상 배수로 높은 KA 또는 Ka를 항원 또는 에피토프에 대해 가지는 항원에 의해 나타날 수 있으며, 여기서 KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 조합 속도 (association rate)이다.
매트립타제에 대한 항체의 결합력을 평가하기 위한 표준 분석법은 단백질 또는 세포 수준에서 행할 수 있으며, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블록, RIA, BIAcore® 분석 및 유세포 측정 분석 등의 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 적합한 분석법은 실시예들에 상세히 기술되어 있다. 또한, 항체의 결합 카이네틱스 (예, 결합 친화성) 역시 Biacore® 시스템 분석에 의해서와 같이 당해 기술 분야에 공지된 표준 분석에 의해 평가할 수 있다. Raji 또는 Daudi B 세포 종양 세포에 대한 결합성을 평가하기 위해, Raji (ATCC 기탁 번호 CCL-86) 또는 Daudi (ATCC 기탁 번호 CCL-213) 세포는 미국 American Type Culture Collection 등의 공공의 이용가능한 소스로부터 수득가능하며, 유세포 측정 분석과 같은 표준 분석에 사용할 수 있다.
매트립타제 항체
본 발명은, 인간 매트립타제의 스템 (서열번호 21-24)에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 상에 매트립타제를 발현하는 세포와 접촉하였을 때 내재화되는, 매트립타제 항체를 제공한다. 이러한 항체는 본원에서 "항-매트립타제" 항체로 언급되거나, 또는 간단히 나타내기 위해 "매트립타제 항체"로 언급한다.
매트립타제 항체는 세포, 특히 표면에 매트립타제를 발현하는 종양 세포와 접촉하게 되면 세포 안에 들어갈 수 있다. 따라서, 약물 접합체를 또한 포함하는 본원에 정의된 매트립타제 항체는 종양 세포내에 내재화되어, 약물을 방출시키고, 이후 세포 사멸시켜, 매트립타제를 발현하는 암을 치료할 수 있다. 이러한 맥락에서 내재화는 여러가지 방식으로 측정할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 매트립타제 항체는, 본원에 개략적으로 기술된 세포주 등의 세포와 MAbZap 및 HuZap 등의 표준 분석 방법을 이용해 접촉시킨다. 당해 기술 분야의 당업자라면, MabZap 분석이 항체-약물 접합체 (ADC)로 발생할 것으로 예상되는 결과를 제시한다는 것이 자명할 것이다. 이후에, ADC는 내재화되어, 약물이 세포로 흡수될 것이다. 독성 약물은 세포를 사멸, 즉 타겟 암 세포를 사멸시킬 수 있는 능력을 가지고 있을 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면 MabZap 분석 데이타가 ADC 분석을 나타내는 것임을 쉽게 수용한다 (Kohls, M and Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, no. 1, 162-165). 이러한 시험관내 분석의 구현예에서, 본 발명의 매트립타제 항체는, 독소를 포함하는 항-매트립타제 항체와 함께 첨가되며; 예를 들어 매트립타제 항체는 설치류 또는 인간화 항체일 수 있으며, 항-매트립타제 항체는 항-설치류 또는 항-인간화 항체일 수 있으며 사포린 등의 독소를 포함할 수 있다. [본 발명의 매트립타제 항체]-[항-매트립타제 항체-약물 접합체] 복합체의 형성시, 이 복합체는 내재화되어 약물 (예, 사포린)을 방출시켜 세포를 사멸시킨다. 내재화되었을 때에만 약물이 방출되므로, 내재화되지 않은 경우 세포는 살아있는 상태로 유지된다. 하기에 개략적으로 기술된 바와 같이, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 치료학적 용도에서, 항-매트립타제 항체는 독소를 포함하며, 내재화되면 항체와 독소 간의 결합이 절단되어 독소가 방출되고 세포를 사멸시킨다.
또한, 매트립타제 항체는 작동자 세포의 존재 시, 특히 표면에 매트립타제를 발현하는 종양 세포에 ADCC 반응을 유발할 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 본원에 언급된 특정 항체의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 가변성 영역 (VR)를 포함한다 (예, 본원에서 "매트립타제_A1"로 표시됨). 이에, 일 구현예에서, 항체는 서열번호 1에 나타낸 서열을 가지는 항체 A1의 중쇄 가변성 영역 (VH)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인들과, 서열번호 2로 나타낸 서열을 가지는 항체 A1의 경쇄 가변성 영역 (VL)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인들을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는, 중쇄 가변성 영역과; 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR; 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR; 및 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하는, 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 매트립타제에 결합하며, 서열번호 1 및 이의 보존적인 서열 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 비롯하여, 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 항체는 서열번호 2 및 이의 보존적인 서열 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 비롯하여, 경쇄 가변성 영역을 더 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 매트립타제에 결합하며, 서열번호 1 및/또는 2로 각각 기재된 아미노산 서열과 이의 보존적인 서열 변형을 비롯한, 중쇄 가변성 영역 및 경쇄 가변성 영역을 포함한다.
전술한 임의의 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 가지는, 경쇄 가변성 영역과 중쇄 가변성 영역을 포함하는 단리된 항체도 본 발명에 포함된다. 이들 언급된 값들 사이의 범위, 예를 들어, 전술한 임의의 서열에 대해, 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95% 또는 95-100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변성 영역 및 경쇄 가변성 영역도 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, 항체는, 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 2, 또는 서열번호 2와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 29, 30, 31 및 32를 포함하는, 서열번호 1의 중쇄 가변성 영역의 프레임워크에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 프레임워크 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는, 서열번호 33, 34, 35 및 36을 포함하여, 서열번호 2의 경쇄 가변성 영역의 프레임워크에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는, 아래 CDR들 뿐만 아니라 한정된 수의 아미노산 변이를 가진 변이를 포함하는 항-매트립타제 항체 (본원에서 "A1" 항체라 함)이다:
A1 서열번호
중쇄 가변 CDR1 5
중쇄 가변 CDR2 6
중쇄 가변 CDR3 7
경쇄 가변 CDR1 8
경쇄 가변 CDR2 9
경쇄 가변 CDR3 10
또한, 본 발명은, A1과 같이 본 발명의 특정 매트립타제 항체의 CDR 세트를 포함하는 가변성 중쇄 및 경쇄 뿐만 아니라 전장 중쇄 및 경쇄 (예, 물론 불변성 영역을 포함함)를 개시한다. 당해 기술 분야의 당업자라면 이해하는 바와 같이, 본 발명의 CDR 세트는 설치류, 인간화 또는 인간 불변성 영역 (프레임워크 영역 포함)에 병합시킬 수 있다. A1 및 huA1에서 나타낸 바와 같이, 설치류와 인간 간의 아미노산 서열 동일성은 약 90%이다. 이에, 본 발명은 본원에 언급된 서열번호와 적어도 약 90%-99% 동일한 가변성 중쇄 및 경쇄를 제공하며, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 및 99% 모두 본 발명에 적용된다.
본 발명의 매트립타제 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 매트립타제 상의 본 발명의 임의의 매트립타제 단일클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 2 이상의 항체를 언급하는데 있어 "동일한 에피토프에 결합한다"라는 것은, 항체들이 항원과의 결합에 대해 경쟁하며, 동일한, 중첩되는 또는 걸쳐있는 연속 또는 비-연속 아미노산 세그먼트에 결합한다는 의미이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, "동일한 에피토프에 결합한다"라는 표현이 필연적으로 항체가 동일한 아미노산에 정확하게 결합한다는 것을 의미하는 것은 아님을 알 것이다. 항체에 결합하는 정확한 아미노산은 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 항체는 제2 항체에 의해 결합되는 세그먼트를 완전히 포괄하는 아미노산 세그먼트에 결합할 수 있다. 다른 예로, 제1 항체는 제2 항체에 의해 결합되는 하나 이상의 세그먼트와 상당히 겹치는 하나 이상의 아미노산 세그먼트에 결합한다. 본원에서, 이들 항체는 "동일한 에피토프에 결합"하는 것으로 간주한다.
이에, 또한, 본 발명은 본원에 기술된 특정 항체에 의해 인지되는 에피토프 전체 또는 일부 (예, 동일 영역 또는 겹치는 영역, 또는 사이 영역 또는 걸쳐있는 영역)를 포함하는 매트립타제의 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 언급된 항체와 인간 매트립타제와의 결합에 경쟁하는 동일한 에피토프 및/또는 항체에 결합하는 항체를 포함한다. 동일 에피토프를 인지하거나 또는 결합에 대해 경쟁하는 항체는 통상적인 기법으로 식별할 수 있다. 이러한 기법으로는, 예를 들어, 하나의 항체가 다른 항체의 타겟 항원으로의 결합을 차단하는 능력을 보이는 면역분석, 즉, 경쟁적인 결합 분석을 포함한다. 경쟁적인 결합은, 면역글로불린이 테스트에서 기준 항체가 매트립타제와 같은 공통 항원에 특이적으로 결합하는 것을 저해하는 분석에서 측정한다. 다수 타입의 경쟁적인 결합 분석들이 공지되어 있으며, 예를 들어, 고상 직접 또는 간접 방사성면역분석 (RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); 고상 직접 표지 분석, 고상 직접 표지 샌드위치 분석 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); I-125 표지물질을 이용한 고상 직접 표지 RIA (Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지 RIA가 있다 (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). 전형적으로, 이들 분석은 비-표지된 테스트 면역글로불린과 표지된 기준 면역글로불린 중 하나를 가진 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적인 저해는 테스트 면역글로불린의 존재 시 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지 물질의 양을 측정함으로써 측정한다. 통상적으로, 테스트 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적인 결합은 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% % 75-80% 80-85% 85-90% 90-95% 95-99% 또는 그 이상으로 저해될 것이다.
기타 기법으로는, 예를 들어, 에피토프의 원자적 해명 (atomic resolution)을 제공하는, 항원:항체 복합체 결정에 대한 X선 분석 등의 에피토프 맵핑 방법을 포함한다. 다른 방법은 항체가 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 결합하는 결합성을 모니터링하는 것으로, 이 경우 항원 서열내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합 상실이 에피토프 구성 성분을 나타내는 지표로 흔히 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 전산 조합 방법들도 이용할 수 있다. 이들 방법들은 조합형 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩타이드를 친화성으로 분리하는 대상 항체의 능력에 기반한다. 그런 후, 펩타이드는 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된 항체에 대응되는 에피토프를 규명하기 위한 리드로서 간주한다. 에피토프 맵핑을 위해, 전산 알고리즘도 개발되었으며, 이는 형태적인 불연속 에피토프 (conformational discontinuous epitope)들을 맵핑하는 것으로 확인된 바 있다.
구체적인 구현예에서, 항체는, 서열번호 1 및 2로 각각 나타낸 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체와, 매트립타제와의 결합에 대해 경쟁한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 1 및 2로 각각 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체 (A1)와, 매트립타제와의 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명의 다른 항체는 본원에 기술된 항체에 의해 인지되는 매트립타제의 에피토프에 결합한다. 다른 구체적인 구현예에서, 항체는 서열번호 1 및 2로 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 매트립타제의 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 1 및 2로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역 및/또는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체 (A1)에 의해 인지되는 매트립타제의 에피토프에 결합한다.
매트립타제에 대한 단일클론 항체의 특정화
본 발명의 단일클론 항체는 다양한 공지 기법을 이용해 매트립타제에 대한 결합성을 특정화할 수 있다. 통상적으로, 항체를 먼저 ELISA로 특정화한다. 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트를 정제된 매트립타제로 PBS 중에 코팅한 다음, PBS에 희석한 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 무-관련 단백질로 블록킹할 수 있다. 매트립타제-면역화된 마우스 유래 혈장 희석액을 각 웰에 첨가하여 37℃에서 1-2시간 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/Tween 20으로 헹군 다음, 알칼라인 포스파타제가 접합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적인 다클론 시약과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 헹군 후, ABTS 기질로 현상하여, OD 405에서 분석한다. 바람직하게는, 최고 역가를 발생시킨 마우스를 융합에 이용한다.
전술한 ELISA 분석을 이용해 항체를 스크리닝할 수 있으며, 따라서 매트립타제 면역원에 양성 반응을 보이는 항체를 생산 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 바람직하게는 고 친화성으로 매트립타제에 결합하는 하이브리도마를 이후 서브 클로닝하여 추가로 특정화할 수 있다. (ELISA에 의해) 모 세포의 반응성을 유지하는 각 하이브리도마로부터 유래되는 하나의 클론을, 이후 세포 은행 제작 및 항체 정제용으로 선택할 수 있다.
항-매트립타제 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 롤러 바틀, 2 L 스피너-플라스크 또는 기타 배양 시스템에서 배양할 수 있다. 상층액을 여과 및 농축한 다음 단백질 A-세파로즈 (Pharmacia, Piscataway, NJ)로 친화성 크로마토그래피를 실시하여 단백질을 정제할 수 있다. 완충제를 PBS로 교체한 후, 1.43 흡광 계수를 이용한 OD280 또는 바람직하게는 비탁 분석에 의해 농도를 측정할 수 있다. IgG는 겔 전기영동과 항원 특이적인 방법에 의해 체크할 수 있다.
선택된 항-매트립타제 단일클론 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지를 확인하기 위해, 각 항체를 시판 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 이용해 바이오틴화할 수 있다. 바이오틴화된 MAb의 결합은 스트렙타비딘으로 표지된 프로브로 검출할 수 있다. 정제된 항체의 이소형을 확인하기 위해, 이소형 ELISA를 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용해 수행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항-Ig 10 ㎍/ml로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 플레이트를 5% BSA로 블록킹한 다음, 10 ㎍/ml의 단일클론 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 2시간 동안 주위 온도에서 반응시킬 수 있다. 그런 후, 웰을 IgG1 또는 기타 이소형 특이적인 접합형 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전술한 바와 같이 현상하여 분석한다.
매트립타제를 발현하는 살아있는 세포에 대한 단일클론 항체의 결합성을 테스트하기 위해, 유세포 측정을 활용할 수 있다. 간략하게는, 막 결합형 매트립타제를 발현하는 (표준 배양 조건에서 배양한) 세포주 및/또는 인간 PBMC를, 0.1% BSA를 함유한 PBS 중에서 다양한 농도의 단일클론 항체와 4℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 헹군 후, 세포를 플루오레세인-표지된 항-IgG 항체와 일차 항체 염색시와 동일 조건 하에 반응시킨다. 샘플은 광 및 측방 산란 특성을 이용하는 FACScan 장치에 의해 분석하여 단일 세포를 게이팅할 수 있으며, 표지된 항체의 결합성을 분석한다. 형광 현미경을 이용하는 다른 분석도 (유세포 측정 분석과 더불어 또는 대신에) 사용할 수 있다. 세포는 전술한 바와 같이 동일하게 염색하고, 형광 현미경으로 검사할 수 있다. 이 방법은 개개 세포를 가시화시킬 수 있지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 민감성을 나타낼 수도 있다.
항-매트립타제 IgG는 웨스턴 블록팅을 통해 매트립타제 항원과의 반응성에 대해 더욱 조사할 수 있다. 간략하게는, 매트립타제를 발현하는 세포로부터 유래된 세포 추출물을 준비하여, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 전기영동 수행 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 20% 마우스 혈청으로 블록킹한 다음 검사할 단일클론 항체로 탐침한다. IgG 결합은 항-IgG 알칼라인 포스파타제를 이용해 검출할 수 있으며, BCIP/NBT 기질 타블렛 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)으로 현상할 수 있다.
다양한 항-매트립타제 항체의 결합 친화성, 교차-반응성 및 결합 카이네틱스를 분석하는 방법은 당해 기술 분야에 공지된 표준 분석법, 예를 들어, BiacoreTM 2000 SPR 장치 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용한 BiacoreTM 포면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호 26을 포함하는 인간 매트립타제 또는 스템 (서열번호 21-24)과 같은 기능성 단편에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 고 친화성으로 인간 매트립타제에 결합한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 매트립타제 단백질에 KD 5 x 10-8 M 이하로 결합거나, 매트립타제 단백질에 KD 2 x 10-8 M 이하로 결합하거나, 매트립타제 단백질에 KD 5 x 10-9 M 이하로 결합하거나, 매트립타제 단백질에 KD 4 x 10-9 M 이하로 결합하거나, 매트립타제 단백질에 KD 3 x 10-9 M 이하로 결합하거나, 매트립타제 단백질에 KD 2 x 10-9 M 이하로 결합하거나, 매트립타제 단백질에 KD 1 x 10-9 M 이하로 결합하거나, 매트립타제 단백질에 KD 5 x 10-10 M 이하로 결합하거나, 또는 매트립타제 단백질에 KD 1 x 10-10 M 이하로 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 매트립타제와의 결합에 대해 본원에 기술된 특정한 항-매트립타제 항체 (예, _A1)와 경쟁 (예, 교차-경쟁)한다. 이러한 경쟁 항체는 표준 매트립타제 결합 분석에서 하나 이상의 mAb의 매트립타제와의 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력을 기반으로 동정할 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 매트립타제 단백질을 플레이트에 고정시키고 항체 한종은 형광 표지하여 표지된 항체의 결합과 경쟁하는 비표지 항체의 능력을 평가하는, 표준적인 ELISA 분석을 사용할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, BIAcore 분석을 이용해 항체의 교차 경쟁력을 평가할 수 있다. 테스트 항체가, 본 발명의 항-매트립타제 항체의 인간 매트립타제에 대한 결합을 저해하는 저해력은, 테스트 항체가 인간 매트립타제에 대한 결합성에 대해 항체와 결합할 수 있음을 입증해준다.
일 구현예에서, 경쟁 항체는, 본원에 기술된 특정 항-매트립타제 단일클론 항체 (예, _A1)와 동일한 인간 매트립타제의 에피토프에 결합하는 항체이다. x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명과 같은 표준 에피토프 맵핑 기술을 이용해, 항체가 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 확인할 수 있다 (예, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.(1996)에서의 에피토프 맵핑 프로토콜 참조).
일 구현예에서, 매트립타제와의 결합에 대해 경쟁하거나 및/또는 인간 매트립타제의 동일 에피토프에 결합하는 항체는 인간 항체이다. 이들 인간 단일클론 항체는 실시예에 기술된 바와 같이 제조 및 단리할 수 있다.
본원에 기술된 바람직한 특성을 가진 단일한 원형 (archtypal) 항-매트립타제 mAb가 단리되면, 유사한 특성을 가진, 예를 들어 동일한 에피토프를 가진 다른 mAb를 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용함으로써 제조하는 것은 쉬운 일이다. 예를 들어, 마우스는 본원에 기술된 매트립타제로 면역화하고, 하이브리도마를 제조한 후, 생성된 mAb을 매트립타제와의 결합에 있어 원형 mAb와 경쟁하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 또한, 마우스는 원형 mAb가 결합하는 에피토프를 함유한 매트립타제의 소형 단편으로 면역화할 수 있다. 에피토프는, 예를 들어, 매트립타제에 걸쳐있는 중첩 펩타이드 시리즈에 대한 결합을 스크리닝함으로써, 국한 (localizing)할 수 있다. 다른 예로, Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994에 기술된 방법을 사용해, 동일 에피토프를 가지는 mAb를 선택하도록 유도하고, 이로써 원형 mAb에 대한 유사한 특성을 가진 mAb를 선택하도록 유도할 수 있다. 파지 디스플레이를 이용함으로써, 원형 항체의 제1 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄 레파토리와 쌍을 지워 매트립타제-결합 mAb를 선택한 다음, 새로운 경쇄를 (바람직하게는 인간) 중쇄 레파토리와 쌍을 지워 원형 mAb와 동일한 에피토프를 가지는 (바람직하게는 인간) 매트립타제-결합 mAb를 선택한다. 다른 예로, 원형 mAb에 대한 변이체는, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 cDNA에 돌연변이를 가함으로써 수득할 수 있다.
에피토프 맵핑, 예를 들어, Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394에 기술된 에피토프 맵핑을 수행해, 항체가 대상 에피토프에 결합하는지의 여부를 확인할 수 있다. Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085에 의해 개시된 "알라닌 스케닝 돌연변이 유발 (Alanine scanning mutagenesis)" 또는 인간 매트립타제에서 아미노산 잔기의 점 돌연변이인 일부 다른 형태를 또한 사용해 본 발명의 항-매트립타제 항체에 대한 기능성 에피토프를 결정할 수도 있다. 그러나, 돌연변이 실험은, 매트립타제의 전체 3차원 구조에는 중요하지만 항체-항원 접촉에는 직접 관여하지 않는 아미노산 잔기를 찾아낼 수도 있으므로, 따라서 이 방법으로 결정된 기능성 에피토프를 검증하기 위해서는 다른 방법이 필요할 수도 있다.
특이 항체에 결합된 에피토프는 인간 매트립타제의 단편을 포함하는 펩타이드에 대한 항체의 결합을 평가함으로써 확인할 수도 있다. 매트립타제 서열을 포함하는 중첩 펩타이드 시리즈를 합성하여, 예를 들어, 직접 ELISA, 경쟁적 ELISA (마이크로타이터 플레이트의 웰에 결합된 매트립타제에 대해 항체가 결합하는 것을 저해하는 저해력을 펩타이드에서 평가하는 경우) 또는 칩 상에서 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 펩타이드 스크리닝 방법은 일부 불연속적인 기능성 에피토프들, 즉 매트립타제 폴리펩타이드 체인의 일차 서열에서 연속하지 않은 아미노산 잔기가 참여하는 기능성 에피토프는 검출하지 못할 수 있다.
본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프는, 또한 구조적인 방법, 예를 들어, X-선 결정 구조 결정 (예를 들어, WO 2005/044853), 분자 모델링 및 대상 항체와의 복합체에 유리된 경우와 결합된 경우 매트립타제 내 불안정한 아미드 수소의 H-D 치환율에 대한 NMR 측정 등의 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 결정할 수도 있다 (Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al.(1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
X선 결정학과 관련하여, 결정화는, 미세배치 (microbatch) (예, Chayen (1997) Structure 5:1269-1274), 현적 증기 확산 (hanging-drop vapor diffusion) (예, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), 시딩 및 투석 (seeding and dialysis) 등의, 당해 기술 분야의 임의 공지 방법을 이용해 달성할 수 있다 (예, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23). 적어도 약 1 mg/mL, 바람직하게는 약 10 mg/mL - 약 20 mg/mL의 농도를 가지는 단백질 조제물을 사용하는 것이 바람직하다. 결정화는 약 10% 내지 약 30% (w/v) 범위의 농도로 폴리에틸렌 글리콜 1000-20,000 (PEG; 평균 분자량 약 1000 내지 약 20,000 Da), 바람직하게는 약 5000 내지 약 7000 Da, 더 바람직하게는 약 6000 Da을 함유하는 석출 용액에서 가장 잘 달성할 수 있다. 또한, 단백질 안정화제, 예를 들어, 약 0.5% 내지 약 20% 범위의 농도로 글리세롤을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 염화나트륨, 염화리튬 또는 시트르산 나트륨과 같은 적절한 염이, 석출 용액에, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1000 mM 범위의 농도로 존재하는 것도 바람직할 수 있다. 석출제는 바람직하게는 약 3.0 내지 약 5.0, 바람직하게는 약 4.0의 pH로 완충된다. 석출 용액에 사용가능한 구체적인 완충제들은 변경될 수 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed.,(1994) Springer-Verlag, New York). 유용 완충제의 예로는 HEPES, Tris, MES 및 아세테이트를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 결정은 2℃, 4℃, 8℃ 및 26℃ 등의 다양한 온도 범위에서 생장할 수 있다.
항체:항원 결정은 잘 알려진 X-선 회절 기법을 적용해 연구할 수 있으며, X-PLOR (Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포됨; 예를 들어, Blundell & Johnson(1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; U.S. 특허 출원 공개 번호 2004/0014194 참조), 및 BUSTER (Bricogne(1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne(1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)과 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용해 개선할 수 있으며, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에 기술된 항체 경쟁 분석을 사용해, 항체가 다른 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는"지를 확인할 수 있다. 전형적으로, 제2 항체가 과량으로 존재하고 모든 부위가 제1 항체로 포화된 조건에서, 제2 항체가 에피토프와 상호작용하는 것으로 알려진 항체와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상으로 경쟁하는 것은, 항체가 "동일한 에피토프에 결합한다"는 것을 의미한다. 2종의 항체 간의 경쟁 수준을 평가하기 위해, 예를 들어, 방사면역분석 또는 항체에 대한 다른 표지를 이용한 분석을 사용할 수 있다. 예를 들어, 매트립타제 항원은, 동량의 제2 비표지 항-매트립타제 항체의 존재 하에, 표지된 화합물 (예, 3H, 25l, 비오틴 또는 루비듐)이 접합된 포화량의 제1 항-매트립타제 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 인큐베이션할 수 있다. 그런 후, 비표지 차단 항체의 존재 하에 항원에 결합되는 표지된 항체의 양을 평가하고, 비표지 차단 항체의 부재 조건에서의 결합과 비교한다. 경쟁은, 차단 항체의 부재 시와 비교해, 비표지 차단 항체의 존재 시의 결합 신호의 변화 퍼센트로 결정한다. 따라서, 표지 항체의 결합이 차단 항체의 부재 시의 결합 대비 차단 항체의 존재 시에 50%로 저해되면, 이들 2 항체 간의 경쟁율은 50%이다. 즉, 제1 및 제2 항체 간의 경쟁이 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이라는 것은, 제1 항체가 항원에 대한 제2 항체의 결합 (또는 그 반대)을 (제1 항체의 부재시 제2 항체가 항원에 결합하는 수준과 비교해) 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로 저해한다는 것을 의미한다. 즉, 제2 항체가, 제1 항체와 항원의 결합을 50%, 60%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로 저해한다는 것은, 2종의 항체가 동일 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다.
항체 변형
또한, 본 발명은, 때때로 "항체 유도체" 또는 "항체 유사체"로도 지칭되는 변이체 항체를 추가로 제공한다. 즉, 본 발명의 항체에 가해질 수 있는 변형, 비제한적인 예로, CDR 내 아미노산 변형 (친화성 성숙), Fc 영역 내 아미노산 변형, 당화 변이체, (예를 들어, 약물 접합체의 부착을 위한) 다른 유형의 공유 결합적 변형 등이 다수 존재한다.
본원에서 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 모 폴리펩타이드와 차이가 있는 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 일 구현예에서, 모 폴리펩타이드는 각각 서열번호 1 또는 2에 열거된 전장 가변 중쇄 또는 경쇄이다. 아미노산 변형은 치환, 삽입 및 결손을 포함할 수 있으며, 많은 경우 전자를 선호한다.
일반적으로, 변이체는 본원에 기술된 항체의 기능이 여전히 존재하는 한 임의 수의 변형을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 변이체 항체는, 예를 들어, 항체는 여전히 인간 매트립타제에 특이적으로 결합해야 한다. 마찬가지로, 아미노산 변이체를 Fc 영역을 이용해 제조하는 경우, 예를 들어, 변이체 항체는 항체의 특정한 용도 또는 표시를 위해 요구되는 수용체 결합 기능을 유지해야 한다.
이 경우, "변이체"는 항체의 열거된 CDR 서열, 프레임워크 또는 Fc 영역내에 형성될 수 있다.
그러나, 일반적으로 목표가 종종 최소 한의 변형으로 기능을 변형하는 것이기 때문에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환이 일반적으로 적용된다. 일부 경우에서, 1 내지 5개의 변형 (예, 개별 아미노산 치환, 삽입 또는 결손)이 존재하며, 많은 구현예들에서 1-2, 1-3 및 1-4개로 사용된다. 변형 갯수는 변형되는 영역의 크기에 좌우될 수 있는데; 예를 들어, 일반적으로, CDR 영역 내에는 거의 변형되지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 본원에 나타낸 바와 같이, A1의 CDR들은 유사하여, 아미노산의 수적 변동이 이루어질 수 있으며, 결합성을 보존할 수 있다.
다수의 아미노산 변형이 기능적 도메인 내에 존재할 수 있음에 유념하여야 한다: 예를 들어, 야생형 또는 엔지니어드 단백질의 Fc 영역에 1 내지 5개의 변형 뿐 아니라, 예를 들어, Fv 영역에 1 내지 5개의 변형이 바람직할 수 있다. 변이체 폴리펩타이드 서열은, 바람직하게는, 모 서열 (예, A1의 가변성 영역, 불변성 영역, 및/또는 중쇄 및 경쇄 서열)에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 것이다. 서열의 크기에 따라, 동일성 %는 아미노산의 수에 의존함에 유념하여야 한다.
VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역들에서의 가변성 영역 변형하는 경우, 부위-특이적인 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있으며, 항체 결합성 또는 기타 목적한 기능성 특성을 본원에 기술되고 실시예에 제시된 바와 같이 시험관내 또는 생체내에서 평가할 수 있다. 바람직하게는, (본원에 기술된) 보존적인 변형을 도입한다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결손일 수 있으며, 바람직하게는 치환이다. 또한, CDR 영역에서 1개 이하, 2개 이상, 3개 이하, 4개 이하 또는 5개 이하의 잔기가 변형된다.
이에, 다른 구현예에서, 본 발명은, (a) 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 5에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 10에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는, 단리된 항-매트립타제 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공한다.
본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환 S100A는 100번 위치의 세린이 알라닌으로 치환된 변이체 폴리펩타이드를 지칭한다. 본원에서 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩타이드 서열 내 특정 위치에 아미노산이 부가되는 것을 의미한다. 본원에서, "아미노산 결손" 또는 "결손"은 모 폴리펩타이드 서열 내 특정 위치에서 아미노산이 제거되는 것을 의미한다.
본원에서, "모 폴리펩타이드", "모 단백질", "전구체 폴리펩타이드", 또는 "전구체 단백질"은, 향후 변형되어 변이체를 생성하게 되는 비변형 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 본원에서 모 폴리펩타이드는 A1)이다. 따라서, 본원에서 "모 항체"는 변이되어 변이체 항체를 생성하는 항체를 의미한다.
본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연적인"은 대립 유전자 변이를 비롯하여 자연에서 발견되는, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 면역글로불린, IgG, 등은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에서 "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 야생형 Fc 서열과 상이한 Fc 서열을 의미한다. Fc 변이체는 Fc 폴리펩타이드 그 자체, Fc 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
일부 구현예들에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 항체 (임의 A1)의 하나 이상의 CDR에 행해진다. 일반적으로, 임의의 하나의 CDR에서 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산만 치환되며, 일반적으로 CDR 한세트에는 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하 또는 10개 이하의 변형이 행해진다. 그러나, 임의의 CDR에서 비-치환, 1, 2 또는 3개의 치환으로 된 임의의 조합은 독립적이며, 선택적으로 임의의 다른 치환과 조합될 수 있음을 인지하여야 한다. 일부 경우, CDR 내 아미노산 변형은 "친화성 성숙"으로 지칭된다. "친화성 성숙" 항체는 하나 이상의 CDR 내 하나 이상의 변형(들)을 가지는데 이러한 변형은 이러한 변형(들)을 가지지 않는 모 항체에 비하여 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시킨다. 일부 경우에서, 드물기는 하지만, 항원에 대한 항체의 친화성을 낮추는 것이 바람직할 수 있지만, 이는 일반적으로 선호되지 않는다.
친화성 성숙은 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 "모" 항체 대비 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150% 또는 그 이상으로, 또는 1, 2, 3, 4 내지 5배로 높이기 위해 행할 수 있다. 바람직한 친화성 성숙 항체는 타겟 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 가질 것이다. 친화성 성숙화된 항체는 공지 기법으로 제조한다. 예를 들어, 가변성 중쇄 (VH) 및 가변성 경쇄 (VL) 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙을 기술한 Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783을 참조한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이는, 예를 들어 Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896에 기술되어 있다.
다른 예로, 본 발명의 항체의 CDR들 중 하나 이상을 "침묵"으로 만드는, 예를 들어 항체의 항원 친화성을 유의하게 변형시키지 않는, 아미노산 변형을 행할 수 있다. 이는 (본 발명의 항체를 코딩하는 핵산에 대해 수행될 수 있는 바와 같은) 발현의 최적화 등의 여러가지 이유로 행해질 수 있다.
따라서, CDR 및 본 발명의 항체의 정의에, 변이체 CDR과 항체가 포함되는데; 즉, 본 발명의 항체는 A1의 하나 이상의 CDR에 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 또한, 아래에 개략화된 바와 같이, 아미노산 변형은, 또한, 본원에 기술된 프레임워크 및 불변성 영역을 비롯하여, CDR을 제외한 임의 영역에서 독립적이고 선택적으로 행해질 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 항-매트립타제 항체는 변이체 Fc 도메인으로 구성된다. 당해 기술 분야에 알려진 바와 같이, 항체의 Fc 영역은 다수의 Fc 수용체 및 리간드와 상호작용하여, 작동기 기능으로서 지칭되는 다수의 중요한 기능적 능력을 부여한다. 이러한 Fc 수용체로는, 비제한적으로, (인간에서) 이소형 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc 등의 FcγRI(CD64); 이소형 FcγRlla (설프하이이형 H131 및 R131을 포함함), FcγRllb (FcγRllb-1 및 FcγRllb-2를 포함함) 및 FcγRllc 등의 FcγRII(CD32); 및 이소형 FcγRllla (항체 의존성 세포독성 (ADCC)에 관련된 설프하이이형 V158 및 F158를 포함함) 및 FcγRlllb (설프하이이형 FcγRlllb-NA1 및 FcγRlllb-NA2를 포함함) 등의 FcγRIII(CD16), FcRn (신생아 수용체 (neonatal receptor)), C1q (보체 의존성 세포독성(CDC)에 관련된 보체 단백질) 및 FcRn (혈청 반감기에 관련된 신생아 수용체)를 포함한다. 적합한 변형은, 예를 들어, 미국 특허 출원 11/841,654 및 이에 인용된 참조문헌, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341,769, 미국 특허 번호 6,737,056, 미국 특허 번호 7,670,600, 미국 특허 번호 6,086,875에 일반적으로 개략적으로 기술된 하나 이상의 위치에서 행해질 수 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명백하게 포함되며, 특히 Fc 수용체에 대한 결합을 증가시키는 특이적인 아미노산 치환을 목적으로 행해질 수 있다.
전술한 변형 외에도 다른 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 결합을 삽입함으로써 안정화할 수 있다 (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
또한, 후술된 항체-약물 접합체(ADC) 사용에 시스테인에서의 변형이 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 항체의 불변성 영역을, 특히 "티올 반응성"인 하나 이상의 시스테인을 함유하도록 조작하여, 약물 모이어티의 보다 특이적이고 조절된 배치가 가능할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541을 참조하며, 이 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
또한, 후술된 바와 같이 제조할 수 있는 항체의 다양한 공유 결합성 변형들이 존재한다.
항체의 공유 결합성 변형은 본 발명의 범위에 포함되며, 항상 그런 것은 아니지만 일반적으로는 번역 후 수행된다. 예를 들어, 항체의 몇가지 유형의 공유 결합성 변형은, 항체의 특정 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 물질과 반응시킴으로써 분자 내로 도입한다.
가장 흔하게는 시스테이닐 잔기를 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은, α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민)과 반응시켜, 카르복시메틸 또는 카르복실아미도에틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기를, 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 다이설파이드, 메틸 2-피리딜 다이설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸 등과의 반응에 의해 유도체화할 수 있다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 다이에틸피로카보네이트와의 반응을 통해 유도체화되는데, 이 물질이 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모페나실 브로마이드 역시 사용가능하며; 이 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1 M 소듐 카코딜레이트 내에서 수행한다.
라이시닐 및 아미노 말단 잔기를 숙신산 무수물 또는 다른 카복실산 무수물과 반응시킨다. 이러한 물질을 이용한 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 반전시키는 효과를 가진다. 알파 아미노를 함유하는 잔기를 유도체화하는 다른 적합한 물질로는 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜타다이온과 같은 이미도에스테르와 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제 촉매 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 수개의 통상적인 물질, 특히 페닐글리옥살, 2,3-부타다이온, 1,2-사이클로헥산다이온 및 닌히드린과의 반응을 통해 변형시킨다. 아르기닌 잔기의 유도체화는, 구아니딘 작용기의 높은 pKa로 인해, 염기성 조건에서 반응을 수행하여야 한다. 아울러, 이들 반응 시약을 아르기닌 엡실론 아미노기 뿐 아니라 라이신의 기와 반응시킬 수 있다.
티로실 잔기에 특이적인 변형이 가해질 수 있는데, 방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응을 통해 티로실 잔기에 스펙트럼 표지 물질을 도입하는 것에 특히 주목한다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 사용해, O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 제조한다. 방사성면역분석에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해, 티로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화하며, 전술한 클로라민 T 방법이 적합하다.
카르복시 측 기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카보다이이미드 (R'-N=C=N-R')와의 반응을 통해 선택적으로 변형시키며, R 및 R'는 선택적으로 다른 알킬기이며, 예를 들어 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리닐-4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드이다. 또한, 아스파르틸 잔기와 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응을 통해 아스파라기닐 잔기와 글루타밀 잔기로 변환시킨다.
2관능성 물질을 이용한 유도체화는, 후술된 방법 외에도, 다양한 방법에 사용하기 위해 항체를 수불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 가교시키는데에도 사용가능하다. 통상적으로 사용되는 가교제로는, 예를 들어, 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산을 가지는 에스테르, 다이숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-다이티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) 등의 설프하이 2관능성 이미도에스테르, 및 2관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)다이티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광의 존재 하에 가교 결합을 형성할 수 있는 광활성 중간 산물을 만들어낸다. 다른 예로, 미국 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에 기술된 반응성 기질 및 시노몰구소겐 (cynomolgusogen) 브로마이드-활성화된 카보하이드라이트 등의 수불용성 매트릭스는, 단백질을 고정시키기 위해 채택되며, 상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
글루타밀 및 아스파라기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미드화시킨다. 다른 예로, 이들 잔기는 약 산성 조건에서 탈아미드화한다. 이들 잔기의 형태 둘 다 본 발명의 범주에 포함된다.
그외 변형으로는 프롤린 및 라이신의 수산화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록시 기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983], 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복시 기의 아미드화를 포함한다.
또한, 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 표지 물질 (형광, 효소, 자기, 방사성 등)을 모두 항체 (뿐만 아니라 본 발명의 다른 조성물)에 첨가될 수 있다.
이중특이성 분자
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-매트립타제 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이성 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 영역은, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 타겟 분자에 결합하는 이중특이성 분자를 제조하기 위해, 유도체화하거나 또는 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질 (예, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)와 결합시킬 수 있다. 본 발명의 항체는, 실제 3개 이상의 서로 다른 결합 부위 및/또는 타겟 분자에 결합하는 다중특이성 분자를 제조하기 위해, 유도체화하거나, 또는 2 이상의 서로 다른 기능성 분자와 결합시킬 수 있으며; 이러한 다중특이성 분자 역시 본원에서 사용되는 "이중특이성 분자"라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이성 분자를 제조하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이성 분자가 제조되도록 (예, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 결합 또는 기타에 의해) 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어, 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체와 기능적으로 결합시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 매트립타제에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성과 제2 타겟 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는, 이중특이성 분자를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 제2 타겟 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은, FcγR 또는 FcαR 발현성 작동자 세포 (예, 단핵세포, 대식세포 또는 다형핵세포 (PMN))과 매트립타제를 발현하는 타겟 세포 모두에 결합할 수 있는 이중특이성 분자를 포함한다. 이들 이중특이성 분자는 매트립타제 발현 세포를 작동자 세포로 타겟팅하여, Fc 수용체-매개 작동자 세포 활성, 예를 들어 매트립타제 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 슈퍼옥사이드 음이온 생성을 촉발한다.
이중특이성 분자가 다중특이성인 본 발명의 일 구현예에서, 이 분자는, 항-Fc 결합 특이성 및 항-매트립타제 결합 특이성 (binding specificity) 외에도, 제3의 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제3 결합 특이성은 항-EF (anti-enhancement factor) 영역, 예를 들어, 세포 독성 활성에 참여하는 표면 단백질에 결합함으로써 타겟 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-EF 영역"은 항체, 기능성 항체 단편 또는 주어진 분자에 결합하여 Fc 수용체 또는 타겟 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과를 강화하는, 리간드, 예컨대 항원 또는 수용체일 수 있다. "항-EF 영역"은 Fc 수용체 또는 타겟 세포 항원에 결합할 수 있다. 다른 예로, 항-EF 영역은 제1 및 제2 결합 특이성 영역이 결합하는 물질과는 다른 물질에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-EF 영역은 (예, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 타겟 세포에 대해 증가된 면역 반응을 일으키는 다른 면역 세포를 경유하여) 세포독성 T 세포에 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중특이성 분자는 결합 특이성으로서 하나 이상의 항체 또는 이의 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb 또는 단쇄 Fv를 포함한다. 또한, 항체는 경쇄 또는 중쇄 다이머이거나, 또는 미국 특허 4,946,778에 기술된 바와 같이 Fv 또는 단쇄 구조체 등의 이의 임의 최소 단편일 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 명백하게 포함된다.
일 구현예에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성은 단일클론 항체에 의해 제공되며, 결합은 인간 면역글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서, 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체에 위치한 8개의 감마-체인 유전자들 중 어느 하나를 지칭한다. 이들 유전자는 3종의 Fcγ 수용체 클래스: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12개의 막관통 또는 용해성 수용체 이소형을 코딩한다. 바람직한 일 구현예에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa의 분자로서, 단량체 IgG에 대해 높은 친화성 (108-109 M-1)을 나타낸다.
소정의 바람직한 항-Fcγ 단일클론 항체의 제조 및 특정화는 PCT 공개공보 WO 88/00052와 미국 특허 4,954,617에 기술되어 있으며, 이들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 완전히 포함된다. 이들 항체는, 수용체의 Fcγ 결합부와 구분되는 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하며, 따라서 이의 결합은 IgG의 생리학적 수준에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 사용가능한 구체적인 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 미국 세포주 은행 (American Type Culture Collection)으로부터 ATCC 수탁번호 HB9469로 입수가능하다. 다른 구현예에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 단일클론 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 제조 및 특정화는 Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002와 PCT 공개공보 WO 94/10332에 기술되어 있다. H22 항체를 생산하는 세포주는 미국 세포주 은행에 기탁번호 HA022CL1로 기탁되었으며, 등재번호는 CRL 11177이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fc-알파 수용체 [FcαRI(CD89)]에 결합하는 항체에 의해 제공되는데, 결합은 바람직하게는 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. "IgA 수용체"라는 용어는 19번 염색체에 위치한 하나의 α-유전자(FcαRI)로부터 만들어지는 유전자를 포함하는 것으로 의도된다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa의 수개의 다른 방식으로 스플라이싱되는 막관통 이소형을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)는 단핵구/대식구, 호산구성 및 호중구성 과립구 상에서 항시적으로 발현되지만, 비-작동자 세포 군집에서는 그렇지 않다. FcαRI은 lgA1과 lgA2에 대하여 보통 수준의 친화도(
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5 x 107 M-1)를 가지는데, 친화성은 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에 노출되면 증가한다 [Morton, H.C. et al.(1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. IgA 리간드 결합 도메인 외부의 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 식별되는 4개의 FcαRI-특이적인 단일클론 항체들은 [Monteiro, R.C. et al.(1992) J. Immunol. 148:1764]에 기술되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI는 본 발명의 이중특이성 분자에 사용하기 위한 바람직한 촉발자 수용체인데, 그 이유는 이들이 (1) 면역 작동자 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에 주로 발현하고; (2) 높은 수준 (예를 들어, 세포 당 5,000-100,000)으로 발현되고; (3) 세포독성 활성 (예를 들어, ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 이들에 타겟화된 자가-항원 등의 항원의 강화된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
본 발명의 이중특이성 분자에 적용될 수 있는 항체는 뮤라인, 인간, 키메라 및 인간화 단일클론 항체이다.
본 발명의 이중특이성 분자는 결합 특이성 영역, 예를 들어, 항-FcR와 항-매트립타제 결합 영역들을 당해 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 접합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 각각의 이중특이성 분자의 결합 특이성 영역을 각각 제조한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성 영역이 단백질 또는 펩타이드일 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제를 공유 접합에 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-다이티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌다이말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)[예를 들어, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]를 포함한다. 그외 방법으로는 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기술된 방법을 포함한다. 바람직한 접합 물질은 SATA와 설포-SMCC이며, 이둘 모두 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 구입가능하다.
결합 특이성 영역이 항체일 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해 접합할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 힌지 영역을 접합 전에 홀수의 설포히드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 함유하도록 변형시킨다.
다른 예로, 양쪽 결합 특이성 영역을 동일한 벡터에 코딩함으로써, 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조합시킬 수 있다. 이 방법은 이중특이성 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이성 분자는 하나의 단쇄 항체와 결합 결정부를 포함하는 단쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정부를 포함하는 이중특이성의 단쇄 분자일 수 있다. 이중특이성 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이성 분자의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; 및 5,482,858 (이들 모두가 본원에 참조로서 명백하게 포함됨)에 기술되어 있다.
이중특이성 분자의 특이적인 타겟에 대한 결합은, 예를 들어, 효소-연계성 면역 흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), FACS 분석, 바이오어레이 (예, 생장 저해) 또는 웨스턴 블록 분석에 의해 검증할 수 있다. 이러한 분석들은 각각 일반적으로 특히 관심 있는 단백질-항체 복합체의 존재를 대상 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예, 항체)을 사용함으로써, 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는, 예를 들어, 효소-결합된 항체 또는 항체-FcR 복합체를 인지하여 특이적으로 결합하는 항체 단편을 사용해 검출할 수 있다. 다른 예로, 복합체는 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용해 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사능 표지하여 방사성면역분석 (RIA) (예, 참조로서 본원에 포함됨, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986)에 사용할 수 있다. 방사성 동위원소는 γ 카운터 또는 신틸레이션 카운터의 사용과 같이 이러한 수단에 의해 또는 오토라디오그라피에 의해 검출할 수 있다.
당화
공유 결합에 의한 변형의 또 다른 타입으로 당화 변형이 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 하나 이상의 엔지니어드 글리코형 (engineered glycoform)을 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서, "엔지니어드 글리코형"은 항체에 공유 결합으로 결합된 탄수화물 조성물을 의미하며, 탄수화물 조성물은 모 항체와 화학적으로 형태가 다르다. 엔지니어드 글리코형은, 비제한적인 예로, 작동자 기능 강화 또는 저하 등의 다양한 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 비딩화 (aglycoslated) 항체를 제조할 수 있다 (즉, 당화가 없는 항체). 당화는, 예를 들어, 항체의 항원 친화성을 높이도록 변형시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 당화 자리를 변형시킴으로써 달성할 수 있으며, 에를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어, 하나 이상의 가변성 영역 프레임워크에 당화 자리를 제거함으로써 그 자리에서의 당화를 없앨 수 있다. 이러한 당화는 항체의 항원 친화성을 높일 수 있다. 이러한 방식은 Co 등의 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에 보다 상세히 기술되어 있으며, 297번 위치에서 아스파라긴을 제거함으로써 달성할 수 있다.
엔지니어드 글리코형의 바람직한 형태는 비-푸코시화 (afucosylation)이며, 이는아마도 FcγRIIIa 수용체에 대한 더 견고한 결합을 통해, ADCC 기능의 증가와 상호연관있는 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, "비-푸코시화"는 숙주 세포에서 생산되는 항체 대부분에 실질적으로 푸코스가 없다는 것을 의미하며, 예를 들어, 제조된 항체의 90-95-98%가 항체의 탄수화물 모이어티 (일반적으로 Fc 영역 내 N297에서 결합됨)의 구성 요소로서 감지될 만한 푸코스를 가지지 않는다는 것을 의미한다. 기능적으로 정의되는 비-푸코시화 항체는 일반적으로 FcγRIIIa 수용체에 대해 적어도 50% 이상의 친화성을 나타낸다.
엔지니어드 글리코형은 당해 기술 분야에 알려진 다양한 방법을 통해 제조할 수 있다 (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1, 이들 모두 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨; POTELLIGENT® 기법 [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb® 당화 조작 기술 [Glycart Biotechnology AG, Zurich, 스위스). 이들 기법들 다수는, 예를 들어, 조작되거나 또는 그렇지 않은 다양한 유기체 또는 세포주 (예, Lec-13 CHO 세포 또는 랫 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 IgG를 발현시키거나, 당화 경로 (예를 들어 FUT8 [α1,6-푸코실트랜세라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III [GnTIII])에 관여하는 효소)를 조절하거나, 또는 IgG가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형함으로써, Fc 영역에 공유 결합된 올리고사카라이드의 푸코시화 수준 조절 및/또는 바이섹팅(bisecting)하는 단계를 기반으로 한다. 예를 들어, "당 엔지니어드 항체" 또는 Seattle Genetics의 "SEA 기술"은 제조 중에 푸코실화를 저해하는 변형된 당류를 부가함으로써 작동하며; 예를 들어, US2009/0317869를 참조하며, 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. "엔지니어드 글리코형"은 전형적으로 당화 기술 없이 제조된 항체와 비교해 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 의미하며; 따라서 항체는 엔지니어드 글리코형을 포함할 수 있다.
다른 예로, 엔지니어드 글리코형은 여러가지 탄수화물 또는 올리고당을 포함하는 IgG 변이체를 지칭할 수도 있다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 당화 패턴은 단백질의 서열 (예, 후술한 특정 당화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질을 생산하는 숙주 세포 또는 유기체에 따라 결정될 수 있다. 구체적인 발현 시스템은 아래에서 논의한다.
폴리펩타이드의 당화는 전형적으로 N-연결되거나 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 부착되는 것을 의미한다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린와 아스파라긴-X-트레오닌 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 효소적으로 부착하기 위한 인지 서열이다. 즉, 폴리펩타이드에 이러한 트리펩타이드 서열이 있으면 잠재적인 당화 부위를 형성하게 된다. O-연결된 당화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나가 결합되는 것을 의미한다.
항체에 당화 자리 부가는, (N-연결된 당화 자리인 경우) 아미노산 서열이 하나 이상의 전술한 트리펩타이드 서열을 포함하도록 서열을 변형함으로써, 편리하게 달성된다. 또한, 변형은 (O-연결된 당화 자리인 경우) 시작 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환함으로써, 이루어질 수 있다. 편의 상, 항체 아미노산 서열은, 특히 원하는 아미노산을 번역시키는 코돈이 제작되도록 타겟 폴리펩타이드 코딩하는 DNA를 미리 선정된 염기에서 돌연변이시킴으로써, 바람직하게는 DNA 수준에서 변경을 통해 변형시킨다.
항체에 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 방법은 단백질에 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 이러한 과정은, N- 및 O-연결된 당화력을 가진 숙주 세포에서 단백질을 생산하여야 할 필요가 없다는 점에서 유리하다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)을 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복시 기, (c) 유리 설프하이드릴 기, 예를 들어 시스테인의 유리 설프하이드릴 기, (d) 유리 하이드록시 기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 하이드록시 프롤린의 유리 하이드록시 기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐 알라닌, 티로신 또는 트립토판, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 결합시킬 수 있다. 이러한 방법들은 WO 87/05330과 Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
출발 항체 (예, 번역 후)에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성할 수 있다. 화학적인 탈당화의 경우 단백질을 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가의 화합물에 노출시키면 된다. 이런 처리로, 연결 당 (N-아세틸글루코스민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 당류가 대부분 또는 전부 절단되지만 폴리펩타이드는 손상되지 않고 유지된다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131에 의해 개시되었으며, 이들 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 폴리펩타이드에서 탄수화물의 효소적 절단은, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 푸코시다제 효소를 이용한 푸코스 잔기의 제거를 비롯하여, Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350에 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 이용함으로써 달성할 수 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 투니카마이신은 단백질-N-글루코시드 결합의 형성을 차단한다.
항체의 공유 결합 변형의 또 다른 타입은, 비제한적인 예로, 예를 들어 2005-2006 PEG Catalog from Nektar Therapeutics (Nektar 웹사이트에서 이용가능함) US 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기술된 방식으로, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 등의 다양한 폴리올 등의, 다양한 비-단백질성 폴리머를 항체에 결합시키는 것을 포함하며, 상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 아울러, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, PEG와 같은 폴리머의 부가를 용이하게 하기 위해, 항체내 다양한 위치에서 아미노산 변형을 행할 수 있다. 예를 들어, 미국 공개번호 2005/0114037A1을 참조하며, 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
추가적인 구현예에서, 예를 들어, 진단 또는 검출을 위해 본 발명의 항체를 사용하는 경우, 항체는 표지 물질을 포함할 수 있다. 본원에서, "표지된"은 화합물이 화합물의 검출을 가능하도록 부착되는 하나 이상의 요소, 동위원소 또는 화학적 화합물을 가진다는 것을 의미한다. 표지 물질은 효소 및 자성 입자와 같은 입자도 포함하지만, 일반적으로, 표지 물질은 3가지 클래스로 분류된다: a) 방사성 또는 헤비 동위 원소일 수 있는 동위원소 표지 물질; b) 자기, 전기, 열; 및 c) 착색 또는 발광 염료. 바람직한 표지 물질은, 비제한적으로, 형광 란탄족 복합체 (유로품 및 테르븀의 복합체가 포함됨)와, 비제한적으로, 양자점, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루, 텍사스 레드, 알렉사 염로, Cy 염료 및 Richard P. Haugland 6th Edition of the Molecular Probes Handbook에 기술된 기타 물질 등의 형광 표지 물질을 포함하며, 상기 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
항체-약물 접합체
일부 구현예에서, 본 발명의 항-매트립타제 항체는 약물과 접합되어 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성한다. 일반적으로, ADC는, 세포독성 물질 또는 세포정지제 (cytostatic agent)의 국소 전달을 위해 항체-약물 접합체를 사용하여 약물 모이어티를 종양으로 타겟 전달할 수 있는, 종양학적 용도에 사용되며, 이는 고 효능, 저 독성 등을 가능하게 할 수 있다. 이러한 기법에 대한 개괄적인 내용은 Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) 및 Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009)에 의해 제공되며, 이들 문헌 전체는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
따라서, 본 발명은 약물이 접합된 항-매트립타제 항체를 제공한다. 일반적으로, 접합은, 후술한 바와 같이 항체로의 공유 결합에 의해 행해지며, 통상적으로 링커, 종종 펩타이드 결합 (후술한 바와 같이, 타겟 부위에서 프로테아제에 의한 절단에 민감하거나 또는 그렇지 않게 설계될 수 있음)에 의존한다. 아울러, 전술한 바와 같이, 링커-약물 유닛 (LU-D)의 결합은 항체 내 시스테인으로의 부착에 의해 수행될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 항체 당 모이어티의 수는 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 약물:항체 1:1 내지 10:1에서 다양할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 실제 갯수는 평균값이다.
따라서, 본 발명은 약물이 접합된 항-매트립타제 항체를 제공한다. 후술한 바와 같이, ADC의 약물은 임의 갯수의 물질일 수 있으며, 비제한적인 예로, 화학요법제, 생장 저해제, 독소 (예, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제가 제공된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 ADC의 이용 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 사용하기 위한 약물은 세포독성 약물, 특히 암 치료요법에 사용되는 약물을 포함한다. 이러한 약물로는, 일반적으로, DNA 손상제, 항-대사산물제, 천연 생성물 및 이들의 유사체를 포함한다. 세포독성제에 대한 예시적인 클래스로는, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 저해제 및 티미딜레이트 신타제 저해제와 같은 효소 저해제, DNA 인터칼레이터, DNA 절단제, 토포이소머라제 저해제, 안트라사이클린 계열의 약물, 빈카 (vinca) 약물, 미토마이신 (mitomycin), 블레오마이신 (bleomycine), 세포독성 뉴클레오시드, 프테리딘 계열의 약물, 디이넨 (diynene), 포도필로톡신 (podophyllotoxins), 돌라스타틴 (dolastatin), 메이탄시노이드 (maytansinoid), 분화 유도제 및 탁솔 (taxol)을 포함한다.
이러한 클래스에 속하는 구성원으로는, 예를 들어, 탁솔 (taxol), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메토프테린 (methopterin), 다이클로로메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 시토신 아라비노시드 (arabinoside), 멜팔란 (melphalan), 레우로신 (leurosine), 레우로시데인 (leurosideine), 액티노마이신 (actinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 카미노마이신 (caminomycin), 아미노프테린 (aminopterin), 탈리소마이신 (tallysomycin), 포도필로톡신 (podophyllotoxin) 및 포도필로톡신 유도체, 예를 들어, 에토포시드 (etoposide) 또는 에토포시드 포스페이트, 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 탁산, 예를 들어 탁솔 (taxol), 탁소테레 (taxotere) 레티노익산, 부티르산, N8-아세틸 스페르미딘, 캄프토테신 (camptothecin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 에스페라미신 (esperamicin), 엔-다이인 (ene-diyne), 두오카르마이신 (duocarmycin) A, 두오카르마이신 SA, 칼리케아미신 (calicheamicin), 캄프토테신 (camptothecin), 메이탄시노이드 (DM1 포함), 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F (MMAF) 및 메이탄시노이드 (DM4) 및 이들의 유사체를 포함한다.
독소는 항체-독소 접합체로 사용될 수 있으며, 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신 (geldanamycin) (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) 및 칼리케아미신 (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al(1993) Cancer Res. 53:3336-3342)과 같은 소분자 독소를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제의 저해 등의 기전을 통해 세포독성 및 세포정지 효과를 발휘할 수 있다.
항-매트립타제 항체; 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 헤미아스테를린, 아우리스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신 및 CC1065, 및 독소 활성을 가지는 이들 독소의 유도체로 된, 접합체도 고려된다. 바람직한 구현예에서, 독소는 아우리스타틴이며, 더 바람직하게는 MMAE 또는 MMAF이다.
접합체의 예
본 발명의 항체 Z(SH)m (m = 1, 2, 3, 4 또는 5)를 이용해 제조되는 접합체의 예를 아래에 나타낸다. 접합체 A 1 - A 6와 A 8 - A 15는, 절단성 기 C가 펩타이드 결합을 포함하는, 접합체이다. 접합체 A 7과 A 16은, 절단성 기 C가 하이드라존인, 접합체이다. 접합체 A 17과 A 18은, 절단성 기 C가 다이설파이드인, 접합체이다. 접합체 A 1 - A 2, A 5 - A 9, A 11 - A 14 및 A 16에서, 파트너 분자 D는 프로드럭 모이어티가 결합된 세포 독소이다. 접합체 A 10, A 11, A 14 및 A 15은 자기-희생 (self-immolating) 모이어티 (접합체 A 10의 경우에 2개)를 가진 접합체이다. 접합체 A 1 - A 8과 A 10 - A 18은 모듈 세그먼트 (modular segment)를 가진 스페이스의 사용을 예시한다.
Figure pct00002
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상기한 식이 존재하는 경우, Hal은 Cl 또는 Br이고, R30은 카르복시에스테라제로 절단가능한 하기로 표시되는 카바메이트 프로드럭 기이다:
Figure pct00019
접합체의 제조
본 발명의 접합체는, 바람직하게는 파트너 분자 D와 링커 (XZ)aC(XD)b를 먼저 연결하여 모이어티 D (XZ)aC(XD)b R31를 형성하여 제조되며, R31은 접합체를 형성하기 위해 항체 Z 상의 관능기와 반응하기에 적합한 관능기이다. 적합한 기 R21의 예로는 하기를 포함한다:
Figure pct00020
Figure pct00021
및
Figure pct00022
.
상기 식에서, R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 또는 토실레이트이고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, O N 숙신이미딜, O (4-니트로페닐), O 펜타플루오로페닐 또는 -O 테트라플루오로페닐이다. 적합한 모이어티 D (XZ)aC(XD)b R31의 제조 방법은 Ng et al., US 7,087,600 B2 (2006); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., US 7,129,261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317 A1 (2006); Chen et al., US 2006/0004081 A1 (2006); Gangwar et al., US 2006/0247295 A1 (2006); Boyd et al., WO 2007/038658 A2 (2007); Gangwar et al., WO 2007/051081 A1 (2007); Gangwar et al., WO 2007/059404 A2 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); 및 2008년 2월 20일자 Chen et al., PCT 출원번호 PCT/US2008/054362에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직한 구현예에서 (식 M), Hal이 Cl인 접합체 A-2와 항체 Z(SH)m을 이용하며, R31은 말레이미드 기이고, 항체 Z 상의 관능기는 하기에 나타낸 티올 기이다:
Figure pct00023
식 M
하기 내용은, 라이신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란과의 반응을 통해 항체로 유리 티올 기를 도입한 다음, 약물-링커 모이어티 D (XZ)aC(XD)b R31 (R31은 말레이미드임)와 반응시키는, 예시적인 공정을 기술한다. 먼저, 항체를 50 mM NaCl 및 2 mM DTPA를 함유한 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)로 완충제 교체하고, 5-10 mg/mL로 농축시킨다. 2-이미노티올란을 항체에 첨가하여 티올화를 수행한다. 2-이미노티올란의 첨가량은 예비 실험을 통해 결정할 수 있으며, 항체에 따라 달라진다. 예비 실험에서, 2-이미노티올란을 증가시키면서 여러가지 함량으로 항체에 첨가하고, 항체를 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음 항체를 Sephadex G-25 컬럼을 이용해 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제로 탈염하고, 다이티오다이피리딘 (DTDP)과 반응시켜 도입된 티올 기의 수를 신속하게 측정한다. DTDP와 티올 기의 반응으로 티오피리딘이 자유로워져, 324 nm에서 분광광도계로 모니터링할 수 있다. 전형적으로 단백질 농도가 0.5-1.0 mg/mL인 샘플을 사용한다. 280 nm에서의 흡광도를 이용해, 샘플내 단백질 농도를 정확하게 측정한 다음, 각 샘플의 분획 (0.9 mL)을 0.1 mL DTDP (에탄올 중의 5 mM 원액)와 실온에서 10분간 인큐베이션한다. 완충제 단독 + DTDP로 이루어진 블랭크 샘플 역시 동시에 인큐베이션한다. 10분 후, 324 nm에서의 흡광도를 측정하고, 티올 기의 수를 티오피리딘 흡광 계수 19,800 M- 1를 이용해 결정한다.
전형적으로, 항체 당 티올 기 3개의 티올화 정도가 본 공정에서 바람직하다. 예를 들어, 일부 항체를 이용하는 경우, 이는 2-이미노티올란을 15배 몰 과량으로 첨가한 다음 실온에서 1시간 인큐베이션하여 달성할 수 있다. 그런 후, 항체를 2-이미노티올란과 원하는 몰 비로 인큐베이션한 다음, 접합 완충제 (50 mM pH 6.0 HEPES 완충제 + 5 mM 글리신 + 2 mM DTPA)로 탈염한다. 티올화된 물질은 얼음 위에서 유지시키고, 도입되는 티올의 수를 전술한 바와 같이 측정한다.
도입된 티올의 수를 검증한 후, 약물-링커 모이어티 D (XZ)aC(XD)b R31를 티올 당 3배 몰 과량으로 첨가한다. 접합 반응은 다이메틸설폭사이드 (DMSO)를 최종 농도 5%로 함유하는 접합 완충제 또는 유사한 대체 용매로 진행한다. 통상적으로, 약물-링커 원액을 100% DMSO에 용해한다. 원액을 티올화된 항체에 직접 첨가하고, 최종 농도 10%가 되도록 충분히 DMSO를 첨가하거나, 또는 DMSO를 최종 농도 10%로 포함하는 접합 완충제에 예비-희석한 다음 티올화된 항체를 동일 부피로 첨가한다.
접합 반응 혼합물을 교반하면서 실온에서 2시간 인큐베이션한다. 인큐베이션한 후, 접합 반응 혼합물을 원심분리하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다. 접합체의 정제는, 다수 방법을 이용해 크로마토그래피로 달성할 수 있다. 한가지 방법으로, 접합체를 5 mM 글리신과 50 mM NaCl이 첨가된 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제로 예비-평형화된 Sephacryl S200 컬럼에서의 크기-배제 크로마토그래피를 이용해 정제한다. 크로마토그래피는 선형 유속 28 cm/h로 수행한다. 접합체가 함유된 분획을 수집하여, 모은 다음, 농축한다. 다른 방법의 경우, 정제는 이온-교환 크로마토그래피를 통해 달성할 수 있다. 조건은 항체에 따라 달라지며, 각 경우에 맞게 최적화되어야 한다. 예를 들어, 항체-약물 접합제 반응 믹스를 5 mM 글리신이 첨가된 50 mM pH 5.5 HEPES에서 예비-평형화한 SP-Sepharose 컬럼에 적용한다. 항체 접합체는 평형 완충제 pH 5.5에서 0-1 M NaCl 농도 구배를 이용해 용출시킨다. 접합체가 함유된 관련 분획들을 모아, 포뮬레이션 완충제 (50 mM pH 7.2 HEPES 완충제 + 5 mM 글리신 + 100 mM NaCl)에서 투석한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 전술한 조건과 방법인 예로서 비-제한적이며, 다른 항체 접합 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 본 발명에 사용가능하다는 것을, 인지하고 있다.
메이탄시노이드
메이탄시노이드 약물 모이어티로 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 공지 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리하거나, 유전적 조작 기술 (Yu et al(2002) PNAS 99:7968-7973 참조), 또는 공지 방법에 따라 합성적으로 제조된 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 사용하여 제조할 수 있다. 아래에 기술된 바와 같이, 약물은 항체에 접합하기 위한 티올 또는 아민 기와 같은 기능적으로 활성인 기의 삽입에 의해 변형시킬 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티로는, C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4,256,746) (안사미토신 (ansamytocin) P2의 리튬 알루미늄 하이드라이드 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4,361,650 및 4,307,016)(스트렙토마이세스 또는 액티노마이세스를 이용한 탈메틸화 또는 LAH를 이용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/- 데클로로 (미국 특허 번호 4,294,757)(아실 클로라이드를 이용한 아실화에 의해 제조됨)과 같은 변형된 방향족 고리를 가지는 모이어티와, 다른 위치에서 변형을 가지는 모이어티를 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한, C-9-SH (미국 특허 번호 4,424,219)(H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응으로 제조됨); C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) (미국 특허 번호 4,331,598); C-14-하이드록시 메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 번호 4,450,254)(Nocardia 사에서 제조함); C-15-하이드록시/아실옥시 (미국 특허 번호 4,364,866)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 변환에 의해 제조됨); C-15-메톡시 (미국 특허 번호 4,313,946 및 4,315,929)(트레비아 누들플로라 (Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 (미국 특허 번호 4,362,663 및 4,322,348)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 (미국 특허 번호 4,371,533)(메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의해 제조됨)와 같은 변형을 가지는 것을 포함한다.
특히, DM1 (미국 특허 번호 5,208,020에 개시됨, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)과 DM4 (미국 특허 번호 7,276,497에 개시됨, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)가 사용된다. 또한, 5,416,064, WO/01/24763, 7,303,749, 7,601,354, USSN 12/631,508, WO02/098883, 6,441,163, 7,368,565, WO02/16368 및 WO04/1033272 (이들 모두는 그 전체가 명백하게 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술된 다수의 추가적인 메이탄시노이드 유도체 및 방법도 참조한다.
메이탄시노이드를 함유하는 ADC, 이의 제조 방법 및 이의 치료적 용도는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 (이들의 개시 내용은 명백하게 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 개시되어 있다. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)은 인간 직장결장암에 대해 유도된 단일클론 항체 C242에 결합된 DM1으로 설계된 메이탄시노이드를 포함하는 ADC를 기술하고 있다. 이 접합체는 배양된 대장암 세포에 대해 세포독성이 높은 것으로 밝혀졌으며, 생체내 종양 생장 분석에서 항종양 활성을 나타내었다.
Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)은, 메이탄시노이드를 이황화 링커를 통해, 인간 대장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤라인 항체 A7, 또는 HER-2/neu 종양 유전자에 결합하는 또 다른 뮤라인 단일클론 항체 TA.1에 접합시킨, ADC를 기술하고 있다. TA.1-메이탄소노이드(maytansonoid) 접합체의 세포독성은 세포 당 3 x 105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 평가되었다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 나타내었는데, 이는 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수적 증가에 의해 높일 수 있었다. A7-메이탄시노이드 접합체는 전신 세포독성은 마우스에서 낮았다.
아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 구현예들에서, ADC는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴 (미국 특허 번호 5,635,483; 5,780,588)에 접합된 항-LY75 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 다이나믹스 (microtubule dynamics), GTP 가수분해, 및 핵과 세포 분열을 간섭하는 것으로 입증되었으며 (Woyke et al(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), 항암 (미국 특허 번호 5,663,149) 및 항진균 활성 (Pettit et al(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 가진다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩타이드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착시킬 수 있다 (WO 02/088172).
아우리스타틴에 대한 예시적인 구현예로는 "Senter et. al., Proceedings of the American Association for Cacner Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented Mar. 28, 2004"와 미국 특허 공개 번호 2005/0238648에 기술된, N-말단 결합된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함하며, 상기 문헌들은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAE이다 (미국 특허 번호 6,884,869를 참조하며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함됨).
다른 예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAF이다 (US 2005/0238649, 5,767,237 및 6,124,431을 참조하며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함됨).
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 구성요소 (본원에서 추가로 기술됨)를 포함하는 추가적인 예시적인 구현예는 다음과 같은 구조와 약어를 가진다: Ab는 항체를 의미하며, p는 1 내지 약 8, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
전형적으로, 펩타이드-기반의 약물 모이어티는 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩타이드 단편들 간에 펩타이드 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드 결합은, 예를 들어, 펩타이드 화학 분야에 잘 알려진 액상 합성법 (E. Schroder and K. Lubke, "The peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press 참조)에 따라 제조할 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 미국 특허 번호 5,635,483; 미국 특허 번호 5,780,588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R. et al Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans.1 5:859-863; 및 Doronina(2003) Nat Biotechnol 21(7)778-784의 방법에 따라 제조할 수 있다.
칼리케아미신
다른 구현예들에서, ADC는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 예를 들어, Mylotarg는 최초의 상업적인 ADC 약물로서, 칼리케아미신 γ1을 페이로드 (payload)로 이용한다 (미국 특허 번호 4,970,198을 참조하며, 본 명세서에 원용에 의해 포함된). 추가적인 칼리케아미신 유도체는 미국 특허 번호 5,264,586, 5,384,412, 5,550,246, 5,739,116, 5,773,001, 5,767,285 및 5,877,296 (모두 명백하게 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 피코몰 보다 낮은 농도에서 이중 가닥 DNA에 브레이크(break)를 만들 수 있다. 칼리케아미신계 접합체의 제조 방법은 미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 American Cyanamid Company)을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체로는, 비제한적으로, γ1l, α2l, α2l, N-아세틸-γ1l, PSAG 및 θl1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342(1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928(1998) 및 전술된 American Cyanamid의 미국 특허)을 포함한다. 항체를 접합시킬 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항-폴레이트제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA는 세포 내 작용 부위를 가지고 있지만, 원형질 막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 항체 매개 내재화를 통한 이러한 제제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
두오카마이신
CC-1065 (원용에 의해 본 명세서에 포함되는 4,169,888 참조) 및 두오카마아신은 ADC에 이용되는 항종양 항생제의 패밀리에 속하는 구성원이다. 이들 항생제는 세포자살을 발생시키는 케스케이트 현상을 개시하는, 마이너 그루브 내 아데닌의 N3 위치에서 DNA 서열을 선택적으로 알킬화함으로써 작용하는 것으로 보인다.
두오카마아신에 속하는 주요 구성원으로는 두오카마아신 A (원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 번호 4,923,990) 및 두오카마아신 SA(원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 번호 5,101,038)를 포함하며, 미국 특허 번호 7,517,903, 7,691,962, 5,101,038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,070,092; 5,641,780; 5,101,038; 5,084,468, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545, WO2007/089149, WO2009/017394A1, 5,703,080, 6,989,452, 7,087,600, 7,129,261, 7,498,302 및 7,507,420 (이들 모두가 명백하게 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술된 다수의 유사체를 포함한다.
기타 세포독성제
본 발명의 항체에 접합시킬 수 있는 또 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조이신 (streptozoicin), 빈크리스틴 (vincristine) 및, 미국 특허 번호 5,053,394, 5,770,710에 기술된 총괄적으로 LL-E33288 복합체로 알려진 유형의 제제인 5-플루오로우라실 뿐만 아니라 에스페라미신 (esperamicin) (미국 특허 번호 5,877,296)을 포함한다.
사용가능한 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 체인, 디프테리아 독소의 비-결합성 활성 단편, (슈도모나스 에루지노사의) 외독소 A 체인, 리신 A 체인, 아브린 (abrin) A 체인, 모데신 (modeccin) A 체인, 알파-사르신 (sarcin), 아로라이트 포디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca Americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (neomycin) 및 트리코테센 (tricothecenes)을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와 핵산 분해 활성 (nucleolytic activity)을 가지는 화합물(예, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클라제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 간에 형성된 ADC를 더 포함한다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사-접합 항체 제조에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
방사성- 또는 다른 표지 물질은 알려진 방식으로 접합체에 병합할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 생합성하거나, 또는 예를 들어, 수소를 대신 플루오린-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지 물질을 펩타이드 내 시스테인 잔기를 통해 부착할 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통하여 부착할 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)을 이용해, 요오드-123을 병합시킬 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989))에는 다른 방법이 자세히 기술되어 있다.
복수의 항체를 포함하는 조성물의 경우, 약물 로딩 (drug loading)은 항체 당 약물 분자의 평균 수인 p로 나타낸다. 약물 로딩은 항체 당 1 내지 20개의 약물(D) 범위일 수 있다. 접합 반응물의 제조시 항체 당 약물의 평균 수는 질량 분광법, ELISA 분석 및 HPLC와 같은 통상적인 수단에 의해 특정화할 수 있다. p 측면에서 항체-약물-접합체의 정량적인 분포를 결정할 수도 있다.
일부 사례에서, p가 서로 다른 약물 로딩을 가지는 항체-약물-접합체로부터 특정 값을 가진 동종 항체-약물-접합체의 분리, 정제 및 특성 분석은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성할 수 있다. 예시적인 구현예에서, p는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이거나, 또는 이들의 일부 (fraction)이다.
항체-약물 접합체 화합물의 제조는 당업자에게 공지된 임의 기술에 의해 달성할 수 있다. 간략하게, 항체-약물 접합체 화합물은 항체 유닛으로서 항-매트립타제 항체, 약물과, 선택적으로 약물 및 결합제를 연결하는 링커를 포함할 수 있다.
다수의 여러가지 반응들이 결합제에 약물 및/또는 링커를 공유 결합시키는데 이용가능하다. 이는 결합성 물질, 예를 들어, 라이신의 아민 기, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카르복시 기, 시스테인의 설프하이드릴 기 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티 등의, 항체 분자의 아미노산 잔기의 반응을 통해 달성할 수 있다. 흔히 사용되는 비-특이적인 공유 결합 방법은 화합물의 카르복시 (또는 아미노) 기를 항체의 아미노 (또는 카르복시) 기에 결합시키는 카르보다이이미드 반응이다. 추가적으로, 다이알데하이드 또는 이미도에스테르와 같은 2관능성 물질을 사용해 화합물의 아미노 기를 항체 분자의 아미노 기에 결합시킨다.
결합 물질에 약물을 부착시키는데에는, 또한 쉬프 (Schiff) 염기 반응도 이용가능하다. 이 방법은 글리콜 또는 하이드록시 기를 함유하는 약물을 페리오데이트 산화 (periodate oxidation)하여 알데하이드를 형성한 다음 이를 결합제와 반응시키는 과정을 수반한다. 부착은 결합제의 아미노 기와 쉬프 염기를 형성함으로써 이루어진다. 이소티오시아네이트도 역시 약물을 결합제에 공유 결합시키는 커플링제로 사용할 수 있다. 기타 기법들은 당업자들에게 공지되어 있으며, 본 발명의 범위에 포함된다.
일부 구현예에서, 링커의 전구체인 중간산물을 적정 조건 하에 약물과 반응시킨다. 다른 구현예에서, 반응성 기는 약물 및/또는 중간산물 상에서 사용된다. 약물과 중간산물, 또는 유도체화 약물 간의 반응 생성물은, 이후 적정 조건 하에 본 발명의 항-매트립타제 항체와 반응시킨다.
본 발명의 접합체를 제조하기 위한 목적으로 화합물의 반응을 더욱 편리하게 하기 위해 원하는 화합물에 화학적 변형 역시 가해질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 관능기, 예를 들어, 아민, 하이드록시 또는 설프하이드릴은, 약물의 활성 또는 기타 특성에 대해서는 최소한의 효과나 또는 수용가능한 수준의 효과를 가지는 위치에서 약물로 부가될 수 있다.
링커 유닛
통상적으로, 항체-약물 접합체 화합물은 약물 유닛과 항체 유닛 사이에 링커 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 세포내 또는 세포외 조건 하에 절단가능하여, 링커의 절단으로 적절한 환경에서 약물 유닛이 항체로부터 분리된다. 예를 들어, 특정 프로테아제를 분비하는 고형 종양을 절단가능한 링커의 표적으로서 이용할 수 있으며; 다른 구현예에서, 이용되는 것은 세포내 프로테아제이다. 또 다른 구현예에서, 링커 유닛은 절단가능하지 않으며, 약물은, 예를 들어, 리소좀에서의 항체 분해를 통해 분리된다.
일부 구현예에서, 링커는 세포 내 환경 (예를 들어, 리소좀 또는 엔도솜 또는 소포 내)에 존재하는 절단제에 의해 절단가능하다. 링커는, 비제한적인 예로, 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제 등의 세포 내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩타이딜 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이딜 링커는 아미노산 2개 이상의 길이이거나, 또는 아미노산 3개 이상의 길이이다.
절단제는, 비제한적인 예로, 카텝신 B와 D, 및 플라스민을 포함할 수 있는데, 이들 모두는 다이펩타이드 약물 유도체를 가수분해하여 타겟 세포 안에서 활성 약물을 방출시키는 것으로 알려져 있다 (예, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 참조). 매트립타제-발현 세포에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있는 펩타이딜 링커. 예를 들어, 암성 조직에서 많이 발현되는 티올-의존적인 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단될 수 있는 펩타이딜 링커 (예, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커 (서열 번호 X))를 사용할 수 있다. 이러한 링커의 또 다른 예들은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,34 (그 전체가 사실상 원용에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 세포 내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩타이딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커 (예, val-cit 링커를 가지는 독소루비신의 합성을 기술한 미국 특허 번호 6,214,345를 참조)이다.
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 pH 민감성 링커로서, 즉, 특정 pH 값에서의 가수분해에 민감하다. 전형적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해가능하다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해가능한 산-취약성 링커 (예를 들어, 하이드라존 (hydrazone), 세미카바존 (semicarbazone), 티오세미카바존 (thiosemicarbazone), 시스-아코니트 아미드 (cis-aconitic amide), 오르토에스테르, 아세탈 또는 케탈 등)가 사용될 수 있다 (예, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik 및 Walker 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123); Neville et al 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). 이러한 링커는 혈중과 같은 중성 pH 조건에서 상대적으로 안정하지만, 리소좀, 즉 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 특정 구현예에서, 가수분해 가능한 링커는 (예를 들어, 아실하이드라존 결합에 의해 치료제에 부착된 티오에테르와 같은) 티오에테르 링커이다 (예, 미국 특허 번호 5,622,929를 참조함).
또 다른 구현예에서, 링커는 환원 조건에서 절단가능하다 (예를 들어, 이황화 링커). 예를 들어, SATA (N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)-, SPDB 및 SMPT를 이용하여 형성가능한 링커를 비롯해, 다양한 이황화 링커들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987을 참조함, 또한 미국 특허 번호 4,880,935도 참조함).
다른 구현예에서, 링커는 말로네이트 링커 (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304) 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)이다.
또 다른 구현예에서, 링커 유닛은 절단가능하지 않으며, 약물은 항체의 분해를 통해 방출된다 (미국 공개 번호 2005/0238649를 참조하며, 문헌의 전체 내용이 모든 목적으로 본 명세서에 포함됨).
다수 구현예들에서, 링커는 자기-희생형이다. 본원에서, "자기-희생형 스페이서"라는 용어는 2개의 이격된 화학적 모이어티를 안정한 삼원성 분자 (tripartite molecule)로 공유 결합시킬 수 있는 2관능성 화학적 모이어티를 지칭한다. 자기-희생형 스페이서는 제1 모이어티에 대한 결합이 절단되면 제2 화학적 모이어티로부터 자발적으로 분리될 것이다. 예를 들어, 약물 및 절단가능한 기질이 자기-희생형 링커를 통해 선택적으로 결합된 약물-절단가능한 기질 접합체에 관한 WO 2007/059404A2, WO06/110476A2, WO05/112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 및 WO02/083180를 참조하며, 이들 문헌 모두 명백하게 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
종종 링커는 세포 외 환경에 실질적으로 민감하지 않다. 링커와 관련하여, 본원에서, "세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은"은, 항체-약물 접합체 화합물이 세포외 환경 (예, 혈장 내)에 존재하는 경우에, 항체-약물 접합체 화합물의 샘플에서 링커의 절단율이 약 20%, 15%, 10%, 5%, 3% 이하 또는 약 1% 이하인 것을 의미한다.
링커가 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은지 여부는, 예를 들어, 혈장과 항체-약물 접합체 화합물을 사전 결정된 시간 (예를 들어, 2, 4, 8, 16 또는 24시간)동안 인큐베이션한 다음 혈장 내 존재하는 유리 약물의 양을 정량함으로써 결정할 수 있다.
다른, 비상호 배타적인 구현예에서, 링커는 세포 내재화 (cellular internalization)를 촉진하다. 특정 구현예에서, 링커가 치료제 (즉, 본원에 기술된 항체-약물 접합체 화합물의 링커-치료제 모이어티의 환경에서)에 접합되면, 세포 내재화를 촉진한다. 또 다른 구현예에서, 링커는 아우리스타틴 화합물과 본 발명의 항-매트립타제 항체에 접합되는 경우, 세포 내재화를 촉진한다.
본 조성물과 함께 사용될 수 있는 링커와 방법에 다양한 예들이 WO 2004/010957, 미국 공개 번호 2006/0074008, 미국 공개 번호 20050238649 및 미국 공개 번호 2006/0024317 (각각 그 전체가 모든 의도로 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
약물 로딩 (Drug Loading)
약물 로딩은 p로 표시되며, 분자내 항체 당 약물 모이어티의 평균 갯수이다. 평균 갯수가 종종 분수 또는 소수 값일 수도 있지만, 약물 로딩 ("p") 즉 항체 당 모이어티 (D)의 갯수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상일 수 있다. 일반적으로, 1 내지 4의 약물 로딩이 대개 사용되며, 1 내지 2도 또한 사용된다. 본 발명의 ADC는 1 내지 20개의 약물 모이어티 범위로 접합된 항체의 콜렉션 (collection)을 포함한다. 접합 반응으로부터 생긴 ADC 조제물에서 항체 당 약물 모이어티의 평균 갯수는 질량 분광법 및 ELISA 분석과 같은 통상적인 수단에 의해 특정화할 수 있다.
p 측면에서 ADC의 정량 분포도 또한 결정할 수 있다. 일부 경우, p가 서로 다른 약물 로딩을 가진 ADC로부터 특정 값을 가진 동종 ADC의 분리, 정제 및 특성 분석은 전기영동과 같은 수단에 의해 달성할 수 있다.
일부 항체-약물 접합체의 경우, p는 항체 상의 부착 자리의 수적 제한을 받을 수 있다. 예를 들어, 전술한 예시적인 구현예에서처럼 부착 자리가 시스테인 티올인 경우, 항체는 시스테일 티올 기를 단 하나 또는 수개만 가지거나, 또는 링커가 결합할 수 있는 충분한 반응성의 티올 기를 오직 하나 또는 수개만 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 약물 로딩이 높은 경우, 예를 들어, p>5는 소정의 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성 소실을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ADC에 대한 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4; 약 3.1 내지 약 3.9; 약 3.2 내지 약 3.8; 약 3.2 내지 약 3.7; 약 3.2 내지 약 3.6; 약 3.3 내지 약 3.8; 또는 약 3.3 내지 약 3.7의 범위이다. 실제, 소정의 ADC의 경우, 항체 당 약물 모이어티의 최적비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 확인된 바 있다. US 2005/0238649 A1(그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 참조한다.
특정 구현예에서, 접합 반응 중에 약물 모이어티는 이론적인 최대치보다 더 적은 값으로 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들어, 아래에서 논의되는 바와 같이, 약물-링커 중간산물 또는 링커 시약과 반응하지 않는 라이신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 결합될 수 있는 유리형의 반응성 시스테인 티올 기를 다수 함유하지 않는데; 실제 항체 내 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 가교로서 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는, 부분적 또는 전체적 환원 조건 하에 다이티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)과 같은 환원제로 환원시켜, 반응성 시스테인 티올 기를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 변성 조건에 두어, 라이신 또는 시스테인과 같은 반응성 친핵성 기가 노출되게 한다.
ACD의 로딩 (약물/항체 비)은 여러가지 방식, 예를 들어, (i) 항체에 대한 약물-링커 중간산물 또는 링커 시약의 몰 과잉을 제한하거나, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하거나, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건에 의해, (iv) 시스테인 잔기의 수 및 위치가 링커-약물 부착 (예, 본원과 WO2006/034488 (본원에 원용에 의해 포함됨)에 개시된 바와 같이 제조되는 thioMab 또는 thioFab)의 수 및/또는 위치 조절을 위해 변형되도록 항체의 아미노산 서열을 재조합 기술에 의해 조작함으로써, 조절할 수 있다.
2 이상의 친핵성 기를 약물-링커 중간산물 또는 링커 시약과 반응시킨 후 약물 모이어티 시약과 반응시키는 경우, 얻어진 생성물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 가지는 ADC 화합물의 혼합물인 것으로 이해된다. 항체 당 약물의 평균 갯수는, 항체 특이적이며 약물 특이적인, 이중 ELISA 항체 분석을 통해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개개 ADC 분자는 질량 분광법으로 혼합물에서 식별하고, HPLC, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 로딩 값을 가지는 동종 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피를 통해 접합 혼합물로부터 분리할 수 있다.
ADC의 세포독성 효과를 결정하는 방법
약물 또는 항체-약물 접합체가 세포에 대해 세포정지 및/또는 세포독성 효과를 발휘하는지를 결정하는 방법은 공지되어 있다. 통상적으로, 항체 약물 접합체의 세포독성 또는 세포정지 활성은, 항체 약물 접합체의 표적 단백질을 발현하는 포유류 세포를 세포 배양 배지에 노출시키고; 세포를 약 6시간 내지 약 5일의 기간 동안 배양한 다음; 세포 생존성을 측정함으로써, 확인할 수 있다. 세포 기반의 시험관내 분석을 이용해, 항체 약물 접합체의 생존성 (증식), 세포독성 및 세포자살 유도 (카스파제 활성화)를 측정할 수 있다.
항체 약물 접합체가 세포정지 효과를 발휘하는지를 결정하기 위해, 티미딘 병합 분석을 이용할 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트에 접종된 5,000 세포/웰 밀도의 타겟 항원을 발현하는 암 세포를 72시간 동안 배양하고, 72시간 중 마지막 8시간 동안 0.5 μCi의 3H-티미딘에 노출시킬 수 있다. 배양물 세포로의 3H-티미딘 병합을 항체 약물 접합체의 존재 및 부재 하에 측정한다.
세포독성을 결정하기 위해, 세포괴사 또는 세포자살 (프로그래밍된 세포 사멸)을 측정할 수 있다. 세포괴사는 전형적으로 원형질막의 투과성 증가; 세포의 팽윤 및 원형질막의 파괴에 의해 달성된다. 세포자살은 전형적으로 막의 블레빙 (blebbing), 세포질의 응축 및 내인성 엔도뉴클라제의 활성화가 특징적이다. 암 세포에 대한 임의의 이러한 효과 측정은, 항체 약물 접합체가 암 치료에 유용함을 보여준다.
세포 생존성은 뉴트랄 레드, 트립판 블루, 또는 ALAMAR™ 블루와 같은 염료의 흡수를 세포에서 확인함으로써 측정할 수 있다 (예를 들어, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476 참조). 이러한 분석에서, 세포를 염료를 함유한 배지에서 인큐베이션한 다음 세포를 세척하는데, 염료의 세포 흡수를 나타내는 잔류 염료를 분광측정법으로 측정한다. 단백질-결합성 염료인 설포로다민 B (SRB)도 사용하여 세포독성을 측정할 수 있다 (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cacer Inst. 82:1 107-12).
다른 예로, 테트라졸륨 염, 예를 들어 MTT를, 죽은 세포가 아닌 살아 있는 세포를 검출함으로써, 포유류 세포의 생존 및 증식에 대한 정량적인 비색 분석에 사용한다 (예를 들어, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63 참조).
세포자살은, 예를 들어, DNA 단편화 (DNA fragmentation)를 측정함으로써 정량할 수 있다. DNA 단편화를 정량적으로 시험관내에서 측정하기 위한, 시판 측광법들을 이용할 수 있다. 이러한 분석의 예로는, TUNEL (단편화 DNA에 표지된 뉴클레오티드가 병합된 것을 검출함) 및 ELISA 기반의 분석이 있으며, 이는 Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals)에 기술되어 있다.
또한, 세포자살은 세포의 형태학적 변화를 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 세포괴사에서처럼, 원형질막의 온전성 상실을 특정 염료 (예, 아크리딘 오렌지 또는 에티디움브로마이드과 같은 형광 염료)의 흡수를 측정함으로써 확인할 수 있다. 세포자살 세포 수를 측정하기 위한 방법은 Duke 및 Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16) 기술되어 있다. 세포는, 또한, DNA 염료 (예, 아크리딘 오렌지 또는 에티디움브로마이드, 또는 요오드화 프로피디움)로 표지할 수 있어, 염색체 응축과 핵 내막의 변연화 (margination)를 세포에서 관찰할 수 있다. 세포자살을 확인하기 위해 측정할 수 있는 또 다른 형태학적 변화로는, 예를 들어, 세포질 응축, 막 블레빙 증가 및 세포 수축을 포함한다.
세포자살 세포의 존재는 배양물의 부착된 구획과 “부유성” 구획 둘다에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 양쪽 구획은, 상층액을 제거하고; 부착된 세포를 트립신 처리하고; 원심분리 세척 단계 (예, 2000 rpm에서 10분간) 후 조제물들을 조합하고; (예를 들어, DNA 단편화를 측정함으로써) 세포자살을 검출함으로써 수집할 수 있다 (예를 들어, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:31 10-16 참조).
본 발명의 항-매트립타제 항체의 치료 조성물의 생체내 효과는 적합한 동물 모델에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 이종 암 모델을 사용할 수 있는데, 암 외식편 또는 계대 배양한 이종이식 조직을 면역 약화 동물, 예를 들어 누드 또는 SCID 마우스에 도입시킨다 (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). 종양 형성 저해, 종양 퇴화 또는 전이 등을 측정하는 분석으로 효능을 측정할 수 있다..
전술한 방법의 수행시 사용되는 치료 조성물은 원하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 적합한 담체로는, 치료 조성물과 조합될 때 치료 조성물의 항-종양 기능을 유지하고 일반적으로 환자의 면역계와는 반응하지 않는, 임의의 물질을 포함한다. 그 예로는, 비제한적으로, 멸균 인산 완충 염 용액, 정균수 등과 같은 다수의 임의의 표준 약학적 담체를 포함한다 (일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980을 참조함).
본 발명의 항체의 제조 방법
본 발명은 개시된 항-매트립타제 항체의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 이 방법은 항체의 성질에 따라 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체가 통상적인 전장 항체인 경우, 예를 들어, 중쇄 가변성 영역과 경쇄 가변성 영역은 항체가 생성되는 조건 하에 단리할 수 있다.
항체 A1-A14의 가변 중쇄 및 경쇄가 본원에 개시되며 (단백질 서열 및 핵산 서열 둘다); 당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 이는 전장 중쇄와 경쇄를 제조하기 위해 용이하게 증폭시킬 수 있다. 즉, 본원에 개략적으로 기술된 바와 같이 VH 및 VK 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 제공하며, 이들 DNA 단편은, 예를 들어, 가변성 영역 유전자를 전장 항체 체인 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 통해, 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작에서, VK- 또는 VH를 코딩하는 DNA 단편은 항체 불변성 영역 또는 가요성 링커와 같은 다른 단백질을 코딩하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 결합된다. 본 맥락에서 사용되는 "작동가능하게 결합된”이라는 용어는, 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결된다는 것을 의미하는 것이다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH를 코딩하는 DNA를 중쇄 불변성 영역(CH1 , CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 변환할 수 있다. 뮤라인 중쇄 불변성 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 [예를 들어, Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 수득할 수 있다. 중쇄 불변성 영역은 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변성 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 lgG1 또는 lgG4 불변성 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH를 코딩하는 DNA는 중쇄 CH1 불변성 영역만 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합될 수 있다.
VL/VK 영역을 코딩하는 단리된 DNA는, VL을 코딩하는 DNA를 경쇄 불변성 영역인 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합시킴으로써, 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 변환할 수 있다. 뮤라인 경쇄 불변성 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 [예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조], 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변성 영역은 카파 또는 람다 불변성 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 구축하기 위해, VH- 및 VL/VK-코딩 DNA 단편들을 가요성 링커, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 결합시켜, VH 및 VL/VK 서열이 가요성 링커에 의해 연결된 VL/VK 및 VH 영역과 더불어, 인접한 단쇄 단백질로 발현시킬 수 있다 [예를 들어, Bird et al.(1988) Science 242:423-426; Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,(1990) Nature 348:552-554].
일반적으로, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 비록 본원에 기술된 조성물에 따른 다른 조합도 본 발명에 포함되지만, 상기한 폴리뉴클레오티드는 각각의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역과 불변성 영역을 모두 코딩한다. 본 발명은 또한 개시된 폴리뉴클레오티드와 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열로부터 유래되는 올리고뉴클레오티드 단편을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA, cDNA, 게놈 DNA, 핵산 유사체 및 합성 DNA 형태인 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위에 포함된다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 만일 단일 가닥이라면 코딩(센스) 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열은, 본원에 제시된 코딩 서열과 동일할 수 있거나, 또는 유전자 코드의 가외성 (redundancy) 또는 축중의 결과로서 본원에 제공된 DNA와 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는, 다른 코딩 서열일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산(들)을, 염색체 외부이거나 또는 도입되는 숙주 세포의 게놈으로 삽입되도록 설계될 수 있는, 발현 벡터로 병합한다. 발현 벡터는 임의의 수의 적절한 조절 서열 (비제한적으로, 전사 및 번역 조절 서열, 프로모터, 리보솜 결합부, 인핸서, 복제 오리진 등을 포함함) 또는 다른 구성요소 (선택 유전자 등)를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 작동가능하게 결합시킨다. 일부 경우에, 2종의 핵산을 사용하여, 각각을 서로 다른 발현 벡터 (예, 제1 발현 벡터에는 중쇄, 제2 발현 벡터에는 경쇄)에 넣거나, 또는 다른 예로 이를 동일한 발현 벡터에 넣을 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 조절 서열의 선택 등의, 발현 벡터(들)의 설계는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 좌우될 수 있음을, 알 것이다.
일반적으로, 핵산 및/또는 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입하여, 핵산 분자(들)가 (예를 들어, 벡터에서, 세포내 가공을 통해 구축되는 구조체에서, 숙주 세포의 게놈에 삽입된) 하나 이상의 발현 조절 인자에 작동가능하게 연결되도록, 선택한 숙주 세포에 적절한 임의의 방법 (예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)을 이용해 재조합 숙주 세포를 구축할 수 있다. 제조되는 재조합 숙주 세포는 발현에 적합한 조건 (예를 들어, 유도인자의 존재 하에, 인간을 제외한 적합한 동물에서, 적정 염, 성장인자, 항생제, 영양 보충제 등이 첨가된 적정 배양 배지에서) 하에 유지될 수 있는데, 이로써 코딩된 폴리펩타이드(들)가 만들어진다. 일부 경우, 하나의 세포에서 중쇄를 만들고, 다른 세포에서 경쇄를 만든다.
발현용 숙주로 이용가능한 포유류 세포주들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 비제한적으로 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포, HEK 293 세포, NSO 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원승이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예, Hep G2) 및 그외 다수 세포주를 비롯하여, 미국 미생물 보존 센터 (ATCC, Manassas, VA)로부터 입수가능한 다수의 불멸 세포주를 포함한다. 비제한적인 예로, 박테리아, 효모, 곤충 및 식물 등의 포유류를 제외한 세포를 사용해 재조합 항체를 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 소 또는 닭과 같은 형질전환 동물에서 생산할 수 있다.
일반적인 항체 분자 생물학, 발현, 정제 및 스크리닝 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567, 4,816,397, 6,331,415 및 7,923,221 뿐 아니라 Antibody Engineering, edited by Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 and 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; 및 Morrison, S.(1985) Science 229:1202)을 참조한다.
약학 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 조성물, 예를 들어, 본 발명의 매트립타제 항체 하나나 또는 이들의 조합물 또는 이의 항원 결합 영역(들)을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 발명의 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이성 분자를 하나 또는 조합물 (예, 2종 이상의 항체)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 타겟 항원 상의 서로 다른 에피토프에 결합하거나 또는 상보적인 활성을 가진, 항체의 조합물 (또는 면역접합체 또는 이중 특이성 항체)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 조합 요법으로, 즉 다른 물질과 조합하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 본 발명의 항-항체를 하나 이상의 다른 항-종양제, 항염증제 또는 면역억제제와 조합하여 포함할 수 있다. 조합 요법으로 사용할 수 있는 치료제의 예들은 아래 본 발명의 항체의 용도 섹션에서 보다 자세히 기술된다.
본원에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제와 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체 또는 이중특이성 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅할 수 있다.
본 발명의 약학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 지원하지만 임의의 원치 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다 [예를 들어, Berge, S.M., et al.(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19를 참조함]. 이러한 염의 예로는 산 부가 염과 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염으로는 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 무독성 무기 산으로부터 유래되는 염뿐 아니라 지방족 모노- 및 다이-카르복시산, 페닐-치환 알카논산, 하이드록시 알카논산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등과 같은 무독성 유기 산으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기 부가 염으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속으로부터 유래된 염뿐 아니라, Ν,Ν'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등과 같은 무독성 유기 아민으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예로는, (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라 아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예로는, 물, 에탄올, 폴리올류 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적정 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산화제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 전술한 멸균 공정에 의해, 그리고 다양한 항세균제와 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 확보할 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 흡수 연장 (prolonged absorption)은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 물질을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 무균성 수용액 또는 분산액과, 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 산제를 포함한다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질과 제제의 사용은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 혼용가능하지 않은 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물에 이의 사용이 고려된다. 보충가능한 활성 화합물 역시 본 조성물에 첨가할 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 무균성이어야 하며, 제조 조건과 저장 조건에서 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜 또는 약물 고 농도에 적합한 다른 고차 구조로 제형화할 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 포함하는 용매 또는 분산 매질, 및 이의 적정 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅재를 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써, 유지시킬 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어, 당, 만니톨과 같은 다가알코올, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 흡수 연장은 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
주사가능한 무균성 용액은, 필요에 따라, 위에 열거된 성분들 중 하나 또는 그 조합과 함께 적절한 용매 중에 활성 화합물을 필수 함량으로 투입한 다음 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질과 전술한 성분들 중 필요한 다른 성분을 포함하는 무균성 비히클에 투입함으로써, 제조한다. 주사가능한 무균성 용액을 제조하기 위한 무균성 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균 여과한 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 바람직한 성분으로 된 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
단일한 투약 형태 (single dosage form)를 제조하기 위해 담체 물질과 조합시킬 수 있는 활성 성분의 양은 치료 대상과 구체적인 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일한 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 발생시키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되는 활성 성분의 양은 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 범위, 바람직하게는 활성 성분의 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.
최상의 원하는 반응 (예, 치료적 반응)을 제공하도록 투약 용법은 조정된다. 예를 들어, 하나의 볼루스를 투여하거나, 몇회로 분할된 용량들을 경시적으로 투여하거나, 또는 용량을 치료학적 상황의 긴박성에 따라 비례적으로 줄이거나 높일 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해, 단위 용량 형태 (dosage unit form)로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 단위 용량 형태는 치료할 대상에 대해 단일한 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 약제학적 필수 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 발생시키도록 계산된 사전-결정된 양으로 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 단위 투약 형태에 대한 사양은, (a) 활성 화합물의 고유한 특성과 달성될 구체적인 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성을 치료하기 위한 이러한 활성 화합물의 배합 분야에 내재된 제한으로 기술되며, 이에 직접 좌우된다.
항체 투여시, 투여량은 숙주의 체중에 대해 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 - 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은, 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중이거나, 또는 1-10 mg/kg의 범위일 수 있다. 치료 용법의 예는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 매월 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 항-매트립타제 항체에 대한 바람직한 투약 용법은 정맥 내 투여으로 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하며, 항체는 다음과 같은 투약 계획 중 한가지 계획을 이용해 제공된다: (i) 4주 간격으로 6회 투여한 후 3달마다 투여; (ii) 3주 간격; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회 투여한 후 3주 간격으로 1 mg/kg 체중으로 투여.
일부 방법에서, 서로 다른 결합 특이성을 가진 2종 이상의 단일클론 항체를 동시에 투여하며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 지정된 범위 내이다. 항체는 통상적으로 다양한 경우로 투여된다. 1회 투여 간격은, 예를 들어, 매주, 매월, 3달마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 타겟 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 처방되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎍/ml 및 일부 방법의 경우 약 25-300 ㎍/ml의 혈장내 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
다른 예로, 항체는 투여 횟수 감소가 필요한 경우에는 서방형 제형 (sustained release formulation)으로서 투여할 수 있다. 투여량과 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 반감기가 가장 길며, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비-인간 항체이다. 투여량과 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 용도인 경우, 상대적으로 적은 투여량을 장기간 상대적으로 적은 횟수로 투여한다. 일부 환자는 그들의 남은 삶 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 용도인 경우, 질환의 진행이 감소되거나 중단될 때까지, 그리고 바람직하게는 환자에서 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 개선이 나타날 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 고 투여량이 때때로 요구된다. 이 후, 환자는 예방적 용법을 투여받을 수 있다.
특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 바람직한 치료학적 반응을 환자에게 독성이지 않으면서도 달성하기에 효과적인 양의 활성 성분으로 달성하기 위해, 본발명의 약학 조성물내 활성 성분의 실제 투여량 농도를 변경할 수 있다. 선정되는 투여량 수준은 채택된 본 발명의 구체적인 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출률, 치료 기간, 기타 약물, 사용된 구체적인 조성물과 조합 사용되는 화합물 및/또는 물질, 치료 중인 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 기존 병력과, 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자들을 비롯한, 다양한 약동학적 인자에 따라 결정될 것이다.
본 발명의 항-매트립타제 항체의 "치료학적 유효량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 저하, 질환의 증상이 없는 기간의 빈도와 기간의 증가, 또는 질환 원인으로 인한 결함 또는 불능의 방지에 의해 구해진다. 예를 들어, 매트립타제 매개 종양을 치료하는 경우, "치료학적 유효량"은, 바람직하게는, 세포 생장 또는 종양 생장을, 비-치료 대상 대비 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 그리고 보다 더 더 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%로 저해한다. 화합물의 종양 생장 저해력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템으로 평가할 수 있다. 다른 예로, 조성물의 이러한 특성은 세포 생장을 저해하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가할 수 있으며, 이러한 저해는 숙련된 실무자에게 공지된 분석을 통해 시험관내에서 측정할 수 있다. 치료적 화합물의 치료학적 유효량은 종양 크기를 축소시키거나, 또는 그렇지 않으면 개체에서 증상을 개선시킬 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 개체의 신체 크기, 개체의 증상 중증도와 선택된 구체적인 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자들에 기반하여 상기한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법들 중 한가지 이상의 방법을 이용해 한가지 이상의 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체의 바람직한 투여 경로는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한, 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내, 피하, 척추 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 "비경구 투여"라는 표현은, 대개 주사에 의한, 장내 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 비제한적인 예로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내 (intrathecal), 관절낭내 (intracapsular), 안내 (intraorbital), 심장내 (intracardiac), 진피내 (intradermal), 복막내, 경기관내 (transtracheal), 피하, 각피하 (subcuticular), 관절내 (subcapsular), 피막하, 지주막하 (subarachnoid), 척수내 (intraspinal), 경막외 (epidural) 및 흉골내 (intrasternal) 주사 및 주입을 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 경로, 예를 들어, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여할 수 있다.
활성 화합물은, 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐형의 전달 시스템 등의, 제어 방출형 제형과 같이, 화합물이 빨리 방출되지 않게 방지하는 담체를 가미하여 준비할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성의 생체적합한 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법들이 다수 특허 출원되어 있거나 또는 당해 기술 분야의 당업자들에게 일반적으로 공지되어 있다 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y 참조].
치료 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 의료 디바이스를 이용해 투여할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조성물은 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 디바이스 등의, 무-바늘성 피하 주사 디바이스를 사용해 투여할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 잘 알려진 임플란트와 모듈의 예로는 다음을 포함한다: 조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 약제를 투여하기 위한 치료 디바이스를 개시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약제를 전달하기 위한 약제 주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,447,233; 지속적인 약물 전달을 위한 이식가능한 변류 (variable flow) 이식성 주입 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 구비한 삼투성 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,475,196. 이들 특허는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈에 대한 다른 다수의 예들이 다수 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 단일클론 항체는 적절한 생체내 분포를 보장하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 혈-뇌 장벽 (BBB)은 다수의 고 친수성 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 통과하도록 하기 위해, 화합물을, 예를 들어, 리포솜 내로 제형화할 수 있다. 리포솜 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 장기로 선택적으로 이동되어, 타겟화된 약물 전달을 강화하는, 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 [예, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]. 타겟팅 모이어티의 예로는 폴레이트와 바이오틴 (예, 미국 특허 5,416,016.); 만노시드 [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]; 항체 [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; 계면활성제 단백질 A 수용체 [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134]; p120 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090]를 포함하며, 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273을 참조한다.
용도 및 방법
본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 매트립타제 매개 장애의 진단 및 치료와 관련된 다수의 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도를 가진다.
일부 구현예에서, 이들 분자는, 다양한 장애들을 치료, 예방 및 진단하기 위해, 배양 세포에 시험관내 또는 생체외로 또는 인간 개체에게, 예컨대 생체내로 투여할 수 있다. 본원에서, 용어 "개체"는 인간과 인간을 제외한 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 인간을 제외한 동물은, 모든 척추 동물, 예를 들어, 포유류와 비-포유류, 예를 들어, 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 개체로는 매트립타제 활성에 의해 매개되는 장애를 가진 인간 환자를 포함한다. 본 방법은 비정상적인 매트립타제 발현과 연관된 장애를 가진 인간 환자를 치료하기에 특히 적합하다. 매트립타제에 대한 항체를 다른 제제와 함께 투여하는 경우, 이들 2종은 어떠한 순서로도 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 특이적인 매트립타제 결합을 감안하면, 본 발명의 항체를 사용해 세포의 표면 상에서의 매트립타제 발현을 특이적으로 검출할 수 있으며, 또한 이를 사용해 면역친화성 정제를 통해 매트립타제를 정제할 수 있다.
아울러, 종양 세포 상에 매트립타제가 발현되는 것을 감안하여, 본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 종양유발 장애 (tumorigenic disorder), 예를 들어, 매트립타제를 발현하는 종양 세포의 존재로 특정되는 장애, 예를 들어, 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암을 가진 개체를 치료하는데 사용할 수 있다. 매트립타제는 아래 실시에 5와 실시예 7에 나타낸 바와 같이 항체 결합시 내재화되는 것으로 입증되었으므로, 본 발명의 항체는 예를 들어 ADC 방식, 방사성면역접합체 또는 ADEPT 방식과 같은 임의의 페이로드 작용 기전에 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 단일클론 항체, 항체 단편, 나노바디, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 조성물 등)를 사용해, 매트립타제의 수준, 또는 막 표면에 매트립타제를 함유한 세포의 수준을 검출하기 위해 사용할 수 있으며, 이후 이들 수준을 특정 질환 증상과 연계시킬 수 있다. 다른 예로, 일반적으로 ADC로서 투여되는 항체를 사용해, 매트립타제 기능을 저해 또는 차단하여, 특정 질환의 증상의 예방 또는 완화로 연관시킬 수 있으며, 즉, 질환의 매개인자로서의 매트립타제의 사용을 암시할 수 있다. 이는 샘플과 대조군 샘플을 항-매트립타제 항체와, 항체와 매트립타제 간에 복합체 형성을 가능하게 하는 조건 하에, 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 항체와 매트립타제 간에 형성된 임의의 복합체를 검출하여, 샘플과 대조군에서 비교한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 조성물)는 먼저 시험관내에서 치료학적 또는 진단학적 용도와 관련된 결합 활성을 테스트할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 조성물은 후술한 실시예에 기술된 유세포 측정 분석을 이용해 테스트할 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자, 면역접합체 및 조성물)는 매트립타제 관련 질환의 치료법과 진단에 있어 추가적인 유용성을 가진다. 예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 면역접합체를 사용해, 다음과 같은 한가지 이상의 생물학적 활성을 생체내 또는 시험관내에서 유발할 수 있다: 매트립타제를 발현하는 세포의 생장을 저해하거나 및/또는 사멸시킴; 인간 작동자 세포의 존재 하에 매트립타제를 발현하는 세포의 식세포 작용 또는 ADCC의 매개, 또는 매트립타제에 대한 매트립타제 리간드의 결합 차단.
특정 구현예에서, 항체 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 조성물)를 생체내에서 사용해, 다양한 매트립타제 관련 질환을 치료하거나, 예방하거나 또는 진단한다. 매트립타제 관련 질환의 예로는 특히 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암을 나타내는, 인간 암 조직을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 면역접합체)을 생체내 및 시험관내 투여하기 적합한 경로들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 당업자들이 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 (예를 들어, 정맥내 또는 피하) 주사에 의해 투여할 수 있다. 사용되는 분자의 적정 투여량은 개체의 연령과 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라 결정될 것이다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 항-매트립타제 항체는, 하나 이상의 다른 치료 제제, 예를 들어, 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 공동-투여할 수 있다. 항체는 (면역복합체로서) 제제에 결합되거나 또는 제제와는 별개로 투여할 수 있다. 후자 (별개 투여)의 경우, 항체는 제제의 투여 전, 투여 후 또는 투여와 동시에 투여할 수 있거나, 또는 그외 공지된 요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어, 방사선 치료와 함께 투여할 수 있다. 이러한 치료 제제로는, 특히 항-신생물제, 예를 들어, 독소루비신 (아드리아마이신 (adriamycin)), 시스플라스틴, 블레오마이신 설페이트, 카무스틴 (carmustine), 클로람부실 (chlorambucil) 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아를 포함하며, 이들 자체는 환자에게 독성 또는 준-독성 수준에서만 효과적이다. 시스플라스틴은 100 mg/kg 용량으로 4주마다 1회 정맥내로 투여되며, 아드리아마이신은 60-75 mg/ml 용량으로 21일마다 1회로 정맥내로 투여된다. 본 발명의 항체와 공동 투여하기에 적합한 다른 제제로는, 암, 예를 들어, 위암, 직장결장암, 전립선암, 유방암, 난소암 또는 폐암, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암을 치료하기 위해 사용되는 그외 제제, 예를 들어 아바스틴 (Avastin®), 5FU 및 겜시타빈 (gemcitabine)을 포함한다. 본 발명의 항-매트립타제 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법제의 공동 투여는, 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 발휘하는 여러가지 기전을 통해 작동하는, 2종의 항암제를 제공한다. 이러한 공동-투여는, 항체에 무-반응성이 되게 하는, 약물에 대한 내성 발현 또는 종양 세포의 항원성 변동으로 인한 문제들을 해결할 수 있다.
타겟-특이적인 작동자 세포, 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자 및 이중특이성 분자)과 결합하는 작동자 세포는 또한 치료 제제로서 사용할 수 있다. 타겟 작동자는 세포 인간 백혈구, 예를 들어, 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 그외 세포로는 호산구, 자연 살상 세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체를 가진 세포를 포함한다. 필요에 따라서는, 작동자 세포를 치료할 개체로서 입수할 수 있다. 타겟-특이적인 작동자 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액 중의 세포 현탁액으로 투여할 수 있다. 투여되는 세포의 수는 대략 108-109일 수 있지만 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 그 양은 타겟 세포, 예를 들어, 매트립타제를 발현하는 종양 세포로의 국지화를 달성하여, 예를 들어, 식세포 작용에 의해 세포를 살상하는 효과를 얻기에 충분할 것이다. 투여 경로 역시 다양할 수 있다.
타겟-특이적인 작동자 세포를 이용한 치료법은 타겟화된 세포를 제거하는 다른 기법과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자 및 이중특이성 분자) 및/또는 이들 조성물로 무장화된 작동자 세포를 이용한 항-종양 치료법을 화학요법과 함께 사용할 수 있다. 추가적으로, 조합 면역요법을 사용해 2종의 구분되는 세포독성 작동자 개체군을 종양 세포 거부가 되게 할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3와 연결된 항-매트립타제 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적인 결합제와 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이성 분자와 다중특이성 분자를 사용해, 세포 표면 상의 수용체를 캡핑 및 제거함으로써와 같이, 작동자 세포 상의 FcγR 또는 FcγR의 수준을 조절할 수 있다. 항-Fc 수용체들의 혼합물 역시 이런 목적으로 사용할 수 있다.
보체에 결합하는 lgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM으로부터 유래되는 영역과 같이, 보체 결합 자리를 가지는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 면역접합체) 역시 보체의 존재 하에 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 타겟 세포를 포함하는 세포 집단에 대한 본 발명의 결합성 물질과와 적절한 작동자 세포의 생체외 처리에는 보체 또는 보체를 함유하는 혈청의 첨가가 보충될 수 있다. 본 발명의 결합성 물질로 코팅된 타겟 세포의 식세포 작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자 및 이중특이성 분자)로 코팅된 타겟 세포는 또한 보체에 의해 용해 (lysis)될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 다중특이성 분자, 이중특이성 분자 및 면역접합체)은 또한 보체와 함께 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원은 항체, 다중특이성 분자 또는 이중특이성 분자와, 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은, 보체가 항체, 다중특이성 분자 또는 이중특이성 분자에 근접하게 위치할 때, 유익할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 항체, 다중특이성 분자 또는 이중특이성 분자 및 보체 또는 혈청은 분리하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위에는 본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 단일클론 항체, 이중특이성 분자, 다중특이성 분자 또는 면역접합체)과 사용 설명서를 포함하는 키트도 포함된다. 키트는 면역억제제, 세포독성제 또는 방사독성제, 또는 하나 이상의 추가적인 본 발명의 항체 (예를 들어, 제1 항체와 구분되는 매트립타제 항원 내 에피토프에 결합하는 상보적인 활성을 가지는 항체)와 같은, 하나 이상의 추가적인 시약을 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료받는 환자에게, 항체의 치료 효과를 강화 또는 증가시키는, 세포독성제 또는 방사성독성제와 같은 다른 치료제를 (본 발명의 항체의 투여 전, 동시에, 또는 투여 이후에) 추가로 투여할 수 있다.
다른 구현예에서, 개체를, 예를 들어, 개체에 사이토카인을 처리함으로써, Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어, 강화 또는 저해하는 물질로 추가적으로 치료할 수 있다. 다중특이성 분자를 이용한 치료 중에 투여하기에 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 다중특이성 분자 및 이중특이성 분자)은 또한 FcγR 또는 매트립타제를 발현하는 세포를 타겟화, 예를 들어, 이러한 세포를 표지하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 용도에서, 결합제를 검출가능한 분자에 연결될 수 있다. 이에, 본 발명은 Fc 수용체, 예를 들어 FcγR, 또는 매트립타제를 발현하는 세포의 생체외 또는 시험관내 국지화 방법을 제공한다. 검출가능한 표지 물질은, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 조인자일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 샘플 및 대조군 샘플을, 매트립타제에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 영역과, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역과 매트립타제 간에 복합체 형성을 가능하게 하는 조건 하에, 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 매트립타제 항원의 존재를 검출하는 방법 또는 매트립타제 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 복합체의 형성은, 이후 검출하여, 대조군 샘플과 비교하여 샘플에서의 차별적인 복합체 형성은 샘플내 매트립타제 항원의 존재를 나타내는 지표이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 개체에서 매트립타제 매개 장애, 예를 들어, 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암 등의 인간 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌들은, 비제한적인 예로, 모든 논문, 간행물, 특허, 특허 출원, 프리젠테이션, 문헌, 보고서, 원고, 브로셔, 책, 인터넷 포스팅, 저널 기사, 정기 간행물, 제품 자료 표 등을 비롯하여, 그 전체 내용이 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 본원에서 참조 문헌에 대한 논의는 저자의 논고를 단지 요약하기 위한 것이며, 임의의 참조문헌이 선행 기술을 구성하고, 출원인이 인용된 참조문헌의 정확성 및 적절성에 대해 이의를 제기할 권리가 있음을 용인하는 것은 아니다.
전술한 본 발명이 이해를 명확하게 하기 위한 목적으로 예시와 예를 들어 일부 상세히 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 내용에 비추어 청구범위의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 일부 변경 및 수정을 가할 수 있음을 쉽게 알 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 하기 실시예는 추가적인 제한으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 매트립타제-항원에 대한 인간 단일클론 항체의 제조
매트립타제-스템 단백질은 MCF 세포에서 많이 발현되는 것으로 알려져 있다. 이들 세포는 하기 면역화 프로토콜에 사용하였다.
형질전환 HuMAb Mouse ® 세포주
매트립타제에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를, 인간 항체 유전자를 발현하는 형질전환 HuMAb Mouse ® 의 HCo12 세포주를 이용해 제작하였다. 이 마우스 세포주에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820에 기술된 바와 같이 동형접합에 의해 파괴되었으며, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 PCT 공개공보 WO 01/09187의 실시예 1에 언급된 바와 같이 동형접합에 의해 파괴되었다.
HuMab 면역화
매트립타제에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를 제조하기 위해, HCo12 마우스 세포주의 HuMab 마우스를 매트립타제-발현성 MCF7 세포로 면역화하였다. 이들 마우스에 대한 일반적인 면역화 과정은 Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 PCT 공개공보 WO 98/24884에 기술되어 있다. 마우스는 매트립타제-발현성 MCF7 세포의 1차 융합시 6-16주령이었다.
형질전환 마우스에, 매트립타제-발현성 MCF7 세포를 Ribi 보강제 중에 복막내 (IP), 피하 (Sc) 또는 발바닥 (FP)을 통해 3-21일 간격으로 (최대 총 9회) 면역화하였다. 면역 반응은 후안와 조직의 출혈 (retroorbital bleed)을 통해 모니터링하였다. 혈장을 (후술한) ELISA로 스크리닝하고, 항-매트립타제 인간 면역글로불린에 대해 충분한 역가를 가진 마우스를 융합에 사용하였다. 마우스에 항원을 정맥내로 부스트 주사한 후 2 및 2일에 희생시켜 비장을 적출하였다. 전형적으로, 각 항원에 대해 10-20개의 융합을 수행하였다. 각 항원에 대해 십여 마리의 마우스를 면역화하였다.
항-매트립타제 항체를 생산하는 HuMab Mouse ® 동물 선택
매트립타제에 결합하는 항체를 생산하는 HuMab Mouse® 동물을 선택하기 위해, 면역화된 마우스의 혈청을 fishwild, D. et al. (1996)(상기에 언급됨)에 언급된 바와 같이 ELISA로 테스트하였다. 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 1-2 ㎍/ml인 정제된 재조합 매트립타제를 50 ㎕/웰로 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 코팅한 다음, PBS/Tween (0.05%) 중의 5% 닭 혈청 200 ㎕/웰로 블록킹하였다. 매트립타제-면역화된 마우스로부터 유래된 혈장의 희석물을 각 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 1-2시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음, HRP (horseradish peroxidase)가 접합된 염소-항-인간 IgG Fc 다클론 항체와 함께 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, ABTS 기질 (Moss Inc, product: ABTS-1000)로 현상하고, OD 415-495에서 분확광도계로 분석하였다. 항-매트립타제 항체 역가가 가장 높게 나타난 마우스를 융합에 사용하였다. 융합은 후술한 바와 같이 수행하였으며, 하이브리도마 상층액에 대해 ELISA와 FACS로 항-매트립타제 활성에 대해 테스트하였다.
매트립타제에 대한 인간 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마의 제조
HuMab mouse®로부터 분리된 마우스 비장세포를, Cyto Pulse 라지 챔버 세포 융합 전기천공기 (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)를 사용해 전기장 기반의 전기융합 (electric field based electrofusion)으로 마우스 골수종 세포주와 융합하였다. 간략하게는, 면역화된 마우스로부터 수득한 비장 림프구의 단일 세포 현탁물을 동수의 Sp2/0 비-분비형 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581)와 융합시켰다. 세포를 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이트에 약 2x104/웰의 밀도로 접종한 다음, 10% 소태아 혈청, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) 컨디셔닝된 배지, DMEM 중의 3-5% origen (IGEN) (Mediatech, CRL 10013, + 고 농도의 글루코스, L-글루타민 및 소듐 피루베이트) + 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1x HAT (Sigma, CRL　 P-7185)이 함유된 선택 배지에서 배양하였다. 1-2주 후, 세포를, HAT를 HT로 교체한 배지에서 배양하였다. 세포 접종 후 약 10-14일 후에, 각 웰의 상층액에 대해, 먼저 인간 g, k 항체가 함유되었는지를 스크리닝하였다. 인간 g,k에 양성을 나타낸 상층액은, 이후, 인간 항-매트립타제 단일클론 IgG 항체에 대해 (전술한) ELISA와 FACS로 스크리닝하였다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 24웰 플레이트에 이동시켜, 다시 스크리닝하고, 인간 항-매트립타제 IgG 단일클론 항체에 여전히 양성인 경우 제한 희석으로 2회 이상 서브클로닝하였다. 이후, 안정적인 서브클론들을 시험관내에서 배양하여 추가적인 특징 분석을 위한 항체 소량을 조직 배양 배지 중에 입수하였다.
HuMab Mouse ® 으로부터 제조된 매트립타제_A1을 코딩한 하이브리도마 클론을 추가적으로 분석하기 위해 선택하였다.
실시예 2: 매트립타제에 대한 단일클론 항체의 구조 특정화
매트립타제_A1 단일클론 항체의 중쇄 가변성 영역과 경쇄 가변성 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 표준 PCR 기법을 이용해 수득한 다음, 표준적인 DNA 서열분석 기법을 이용해 서열분석하였다.
항체 서열은 돌연변이되어 하나 이상의 잔기에서 생식계열 (germline) 잔기로 돌아갈 수 있다.
매트립타제_A1의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 3과 1로 나타낸다.
매트립타제_A1의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 4와 2로 나타낸다.
공지된 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 대한 매트립타제_A1 중쇄 면역글로불린 서열을 비교한 바, 매트립타제_A1 중쇄가 뮤라인 생식계열 VH 3-23로부터 유래된 VH 세그먼트와 인간 생식계열 JH JH4b로부터 유래된 JH 세그먼트를 이용하는 것으로 확인되었다. CDR 영역 결정에 카바트 시스템을 이용한 매트립타제_A1 VH 서열을 추가로 분석한 바, 각각 서열번호 5, 6 및 7로 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들의 설계가 확인되었다. 매트립타제_A1 CDR1, CDR2 및 CDR3 VH 서열들을 생식계열 VH 3-23 및 생식계열 JH JH4b 서열과 정렬하여 도 2a에 나타낸다.
매트립타제_A1 경쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 바, 매트립타제_A1 경쇄는 인간 생식계열 VK A27로부터 유래된 VK 세그먼트와 인간 생식계열 JK JK2로부터 유래된 JK 세그먼트를 이용하는 것으로 확인되었다. CDR 영역 결정에 카바트 시스템을 이용한 매트립타제_A1 VK 서열을 추가로 분석한 바, 각각 서열번호 8, 9 및 10으로 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들의 설계가 확인되었다. 매트립타제_A1 CDR1, CDR2 및 CDR3 VK 서열들을 생식계열 VK A27 및 생식계열 JK JK2 서열과 정렬하여 도 2b에 나타낸다.
실시예 3: ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 이용한 항원 특이 항체의 스크리닝
매트립타제의 세포외 스템 영역에 대한 매트립타제_A1의 특이성을 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 확인하였다.
매트립타제 스템 단백질 310 ㎍/ml을 ELISA 코팅 완충액 (100 mm 소듐 카보네이트/바이카보네이트)으로 0.1 ㎍/ml로 희석한 다음, 웰에 100 ㎕씩 넣어, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
인큐베이션한 후, 웰을 PBST로 3번 헹구었다. 그런 후, 각 웰에 SuperBlock (Thermo Scientific) 200 ㎕를 첨가하여 25℃에서 30분간 인큐베이션한 다음, PBST로 3회 이상 헹구었다.
PBS + 0.1% BSA에 0.01 - 30 μmol/L로 연속 희석한 매트립타제_A1을 웰에 100 ㎕씩 넣어 1시간 25℃에서 인큐베이션한 다음, 웰을 PBST로 3회 세척하였다. 염소-항-인간 IgG 카파 특이 항체-HRP (Lot# NG1876246) 및 염소-항-인간 IgG FC 특이 항체 (Lot# 96091)를 0.01 - 30 μmol/L로 연속 희석한 다음, 각 웰에 100 ㎕씩 넣은 후 25℃에서 1시간 인큐베이션하고, PBST로 3번 다시 헹구었다. 그런 후, 각 웰에 TMB 기질 100 ㎕를 첨가하여 25℃에서 약 1시간 인큐베이션한 다음 1N HCl 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다.
결과는 Thermo Varioskan을 이용해 450nm에서 판독하였다 (도 3). 이는, 매트립타제_A1이 매트립타제의 스템에 결합함을 보여준다.
실시예 4: 매트립타제에 대한 단일클론 항체를 이용한 면역조직화학
아래 참조 프로토콜을 이용해, 매트립타제_A1을 IHC 실험에 20 ㎍/ml로 사용하였다. 이러한 조건에서, FFPE 또는 냉동 형태로서 준비된 결장직장암, 위암, 전립선암 및 유방암 조직 절편들에서 강한 염색이 관찰되었다. 동일한 조건으로 정상 인간 조직에 대한 매트립타제_A1의 결합을 조사하였다.
탈파라핀화 및 재수화
슬라이드를 완충제를 사용하지 않고 수조에서 50 ml 팔콘 안에 넣어 60℃에서 2시간 열처리하였다. 각 팔콘에는 슬라이드 하나를 넣거나, 또는 슬라이드 2개를 서로 붙지 않도록 하기 위해 그 사이에 긴 겔 로딩 팁을 넣어 맞대어 넣었다. 슬라이드는 블랙 슬라이드 랫에서 5분간 EZ-DeWax (BioGenex, CA, USA) 중에서 탈파라핀화하고, 1 ml 파이펫을 이용해 동일 DeWax 용액으로 잘 헹군 후 물로 세척하였다. 슬라이드는 압력 쿠커가 준비될 때까지 물이 담긴 커플린-자 (coplin jar)에 넣어 두었으며, 물을 2번 교체해주었다.
항원 회수
물을 항원 회수 용액 (retrieval solution) = 1 x 사이트레이트 완충제, pH 6 (DAKO)으로 교체하였다. 항원은 압력 쿠커 방법 (pressure cooker method)으로 회수하였다. 플라스틱 커플린 자에 항원 회수 용액 중에 있는 슬라이드를 압력 쿠커에 넣은 다음 최대 6번 (최고 세팅)으로 가열하였다. 15-20분 인큐베이션 후, 온도를 3번으로 낮추고, 그 상태로 (압력 쿠커의 내부 온도는 117℃임) 다시 20-25분간 두었다. 그런 다음, 호브 (hob)의 스위치를 끄고, 쿠커를 차가운 호브 위에 두었으며, "열림"과 "닫힘" 사이의 위치로 핸들을 조심스럽게 이동시켜 압력을 떨어뜨렸다. 전체 시스템을 그대로 두어 압력을 해지시키고, 다시 20분간 냉각시켰다. 뚜껑을 열어 샘플을 꺼내 실험대에 위에서 휴지시켰다. 슬라이드를 PBS-3T (0.5 L PBS + Tween-20 3방울)로 1 x 5분 헹군 다음, 슬라이드를 PBS 중에 두었다.
염색
항원을 회수한 후, 슬라이드를 Shandon Coverplate 시스템 위에 두었다. PBS가 든 커플린 자에 커버플레이트를 넣고, 조직 절편이 있는 슬라이드를 커버플레이트 쪽으로 조심스럽게 이동시켜, 슬라이드와 플라스틱 커버플레이트 사이에 기포가 들어가지 않도록 하였다. 슬라이드를 커버플레이트와 견고하게 합체된 상태로 커플린 자에서 꺼냈다. 조립된 슬라이드를 랙에 넣고, 퍼넬 (funnel) 및 슬라이드와 커버플레이트 사이에 있는 PBS가 빠지게 두었다. 슬라이드를 PBS-3T로 2x2 ml (또는 4x1 ml), 그리고 PBS로 1x2 ml로 헹군 다음, PBS가 전부 슬라이드에서 빠져 실제 PBS가 퍼넬에 남아있을 않을 때까지 기다렸다.
내인성 퍼옥사이드 차단은 퍼옥시다제 차단 시약 (S2001, DAKO)을 사용해 수행하였다. 슬라이드 당 퍼옥사이드 용액 1-4 방울을 사용하였고, 5분간 인큐베이션하였다. 슬라이드를 물로 헹군 다음, 2 ml PBS-3T로 한번, 그리고 2 ml PBS로 한번 헹구었으며; 이때 새로운 세척 완충제를 넣기 전 실제 액체가 퍼넬에 남아있지 않을 때까지 기다리는 것이 중요하다.
일차 항체를 항체 희석 시약 (DAKO)으로 희석하였다. 최적 희석율은 0.5 ㎍/ml으로 결정하였다. 희석한 일차 항체 50-200 ㎕를 각 섹션 및/또는 조직 마이크로어레이에 넣고; 주의를 기울여 전체 조직을 덮었다. 슬라이드를 부드럽게 두들겨, 항체가 섹션 전체에 균등하게 퍼지게 하거나, 또는 파이펫 팁을 섹션 상부에서 사용하였다. 슬라이드를 습식 챔버에서 45분간 실온으로 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS-3T 2x2 ml (또는 4x1 ml)로 헹군 후, PBS 1x2 ml로 헹구고, PBS가 슬라이드에서 모두 제거될 때까지, 사실상 PBS가 퍼넬에 남아있지 않을 때까지 기다렸다. 대응되는 당나귀 항-염소 IgG:HRP (1500P, 1 mg/ml, Serotec)을 1:1000 비율로 첨가하여, 실온에서 35분간 인큐베이션하였다. 슬라이드를 상기와 같이 세척하였다. DAB 기질을 희석 완충제 중에 준비하고; 기질 2 방울이 첨가된 2 ml이 슬라이드 10개에 충분하였다. DAB 시약을 한번에 수 방울 떨어뜨려 슬라이드에 적용하였다. DAB 모두 슬라이드들에 공급하였다. 슬라이드를 10분간 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS-3T 1 x 2 ml (또는 2 x 1 ml)로 헹군 후, PBS 1 x 2 ml (또는 2 x 1 ml)로 헹구고, PBS가 슬라이드에서 모두 제거될 때까지, 사실상 PBS가 퍼넬에 남아있지 않을 때까지 기다렸다. 헤마톡실린 (DAKO)을 적용하였으며, 슬라이드 10개에 1 ml이 충분하였으며, 슬라이드를 실온에서 1분간 인큐베이션하였다. Shandon Coverplate 시스템의 퍼넬에 물 2 ml을 채우고, 흘러 내리게 두었다. 슬라이드에 과잉의 헤마토실린이 없어지면, 시스템을 분리하여 조직 섹션 및/또는 어레이를 세척 바틀에서 나온 물로 세척한 다음, 블랙 슬라이드 랙에 두었다. 조직은, EZ-De왁스 중에서 5분간 인큐베이션한 다음 95% 에탄올 중에서 2-5분간 인큐베이션하여, 재수화하였다. 이후, 슬라이드는 실험대에서 실온에 두어 건조시킨 후, 마운팅 매질을 첨가하고 커버슬립을 덮었다.
결과
매트립타제 발현율은 결장직장암 임상 샘플의 경우 95%-100% (표 2), 위암 샘플의 경우 97% (표 1), 전립선암 샘플의 경우 100%, 그리고 유방암 테스트 샘플의 경우 75%인 것으로 확인되었다.
타겟이 관찰된 상피계 세포에서, 검출된 발현 수준은 비교가능한 종양 조직 보다 현저하게 낮았다. 정상적인 발현은 신장 관 (kidney tubule)과 또한 위장관에서 산발적으로 관찰되었다.
표 1. 위암에서 매트립타제_A1를 나타낸 IHC: 아래 표는 위암 샘플 41종과 정상 위 샘플 8종으로 구성된 어레이의 세포 표면에서의 스템 단백질의 발현을 요약 개시한다.
병리 등급 TMN 타입 결과 병리 등급 TMN 타입 결과
선암종 1 T2N0M0 악성 ++ 선암종 2 T2N0M0 악성 ++
선암종 1 T2N1M0 악성 0 선암종 2 T3N1M0 악성 +++
선암종 1 T3N2M0 악성 +++ 선암종 2 - 3 T3N1M0 악성 +
선암종 1 T3N1M0 악성 +++ 선암종 2 T2N3M0 악성 0
선암종 1 T3N4M1 악성 +++ 선암종 2 T3N1M0 악성 ++
선암종 1 T3N0M0 악성 +++ 선암종 3 T3N0M0 악성 +++
선암종 1 T3N0M0 악성 ++ 선암종 2 - 3 T2N1M0 악성 +++
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N2M0 악성 ++
선암종 1 T3N0M0 악성 +++ 선암종 3 T3N1M0 악성 -
유두상 선암종 1 - 2 T3N1M0 악성 ++ 선암종 3 T3N0M0 악성 +
선암종 1 -- 2 T3N3M0 악성 ++ 선암종 3 T3N0M0 악성 +++
선암종 1 T3N1M0 악성 ++ 선암종 3 T2N0M0 악성 ++
선암종 1 T3N1M0 악성 +++ 선암종 3 T3N2M0 악성 +
유두상 선암종 2 T3N1M0 악성 +++ 선암종 3 T3N0M0 악성 +++
선암종 1 T3N1M0 악성 ++ 선암종 3 T3N2M0 악성 +
선암종 2 T3N1M0 악성 ++ 선암종 3 T3N1M0 악성 ++
선암종 2 T3N1M0 악성 ++ 정상 위 조직 (평활근 조직) - - 정상 -
선암종 1 - 2 T3N1M0 악성 ++ 정상 위 조직 - - 정상 -
선암종 2 T2N1M0 악성 ++ 정상 위 조직 - - 정상 +
유두상 선암종 2 T3N1M0 악성 ++ 정상 위 조직 - - 정상 +
선암종 2 - 악성 +++ 정상 위 조직 - - 정상 +
선암종 2 T3N1M0 악성 +++ 정상 위 조직 - - 정상 -
유두상 선암종 2 T3N2M0 악성 +++ 정상 위 조직 - - 정상 -
선암종 2 T3N3M0 악성 +++ 정상 위 조직 - - 정상 -
표 2. 결장직장암에서 매트립타제_A1를 나타낸 IHC: 아래 표는 대장암 샘플 54종으로 구성된 어레이의 세포 표면에서의 스템 단백질의 발현을 요약 개시한다.
병리 등급 타입 TMN 결과 병리 등급 타입 TMN 결과
유두상 선암종 1 T3N0M0 악성 ++ 선암종 2 T1N0M0 악성 ++
유두상 선암종 1 T3N0M0 악성 ++ 선암종 2 T1N0M0 악성 ++
관상 유두상 선암종 1 T3N0M0 악성 ++ 선암종 2 T1N0M0 악성 ++
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 2 T3N0M0 악성 +++
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 2 T3N0M0 악성 +++
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 2 T3N0M0 악성 +++
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 +
선암종 1-2 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 ++
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 ++
선암종 2 T2N0M0 악성 ++ 선암종 2-3 T3N1M0 악성 +
선암종 2 T2N0M0 악성 ++ 선암종 2-3 T3N1M0 악성 +
선암종 2 T2N0M0 악성 +++ 선암종 2-3 T3N1M0 악성 +
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 +
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 +
선암종 1 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 +++
선암종 1 T3 N0 악성 +++ 선암종 2 T3N1M0 악성 ++
선암종 1 T3 N0 악성 ++ 선암종 2 T3N1M0 악성 0
선암종 1 T3 N0 악성 ++ 선암종 2-3 T3N1M0 악성 +++
선암종 2 T2N1M0 악성 ++ 선암종 (저밀도) 2 T3N0M0 악성 ++
선암종 2 T2N1M0 악성 ++ 선암종 (저밀도) - T3N0M0 악성 0
선암종 2 T2N1M0 악성 ++ 선암종 2 T3N0M0 악성 ++
점액성 선암종 2 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 +
점액성 선암종 2 T3N1M0 악성 + 선암종 3 T3N1M0 악성 +
점액성 선암종 2 T3N1M0 악성 ++ 선암종 3 T3N1M0 악성 +
선암종 2 T3N0M0 악성 ++ 선암종 3 T2N0M0 악성 +
선암종 2 T3N0M0 악성 ++ 괴사를 동반한 선암종 3 T2N0M0 악성 +
선암종 2 T3N0M0 악성 ++ 선암종 3 T2N0M0 악성 +
실시예 5: 유세포 측정 분석에 의해 결정된 매트립타제에 대한 단일클론 항체의 특이성
실시예에서 선택된 매트립타제에 대한 항체 특이성을 유세포 측정법으로 조사하였다. 세포 표면의 매트립타제 단백질에 대한 항체 결합력을 조사하기 위해, 항체를 매트립타제-발현 세포와 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제 (DPBS, 2% FBS) 중에서 헹구고, 원심분리한 다음 희석한 일차 매트립타제 항체 (FACS 완충제에 희석됨) 100 ㎕에 희석하였다. 항체-세포주 복합체를 얼음 위에서 60분 인큐베이션한 다음, 전술한 바와 같이 FACS 완충제로 2번 헹구었다. 세포-항체 펠렛을 희석한 이차 항체 (FACS 완충제에 희석됨) 100 ㎕에 재현탁하고, 얼음 위에서 60분간 인큐베이션하였다. 펠렛을 앞에서와 같이 세척하고, 200 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 샘플을 BD FACScanto II 유세포 측정기에 주입하고, BD FACSdiva 소프트웨어로 데이타를 분석하였다.
유세포 측정 분석 결과, 단일클론 항체 매트립타제_A1은 HT-29 및 H69 세포에서 발현된 세포-표면 인간 매트립타제에 효과적으로 결합하는 것으로 확인되었다 (도 4b). 이 세포 외에도, SNU-1 (도 4a), A431 (상피세포암), SW620 (결장직장 선암종), SKOV-3 (난소 선암종), MCF-7 (유방암) 및 A549 (인간 폐포 선암종) 등의 다수의 다른 세포주에 대해서도 고 친화성으로 결합하는 것으로 확인되었다.
실시예 6: 매트립테이트_A1에 의해 매개되는 항체-의존적인 세포성 세포독성
표준 절차에 따라, CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 분석 (Promega UK Ltd)을 이용하여, 작동자 세포의 존재 하에 항체 의존적인 세포성 세포독성 (HT-29 및 OVCAR8를 이용한 ADCC)을 통해 매트립타제-발현 세포를 사멸시키는 매트립타제_A1 항-매트립타제 mAb의 사멸력을 확인하였다.
양성 대조군으로서 ADCC를 통한 세포-사멸을 일으키는 것으로 공지된 항체와 음성 대조군으로서 인간 IgG1 이소형 대조군을 이용한 바, 매트립타제_A1은 HT-29 세포에 ADCC를 유발할 수 있었던 것으로 확인된다. 도 5는 매트립타제_A1이 HT-29 세포에 ADCC를 유발함을 보여준다.
실시예 7: HT-29 세포와 H69 세포에 의한 매트립타제_A1 단일클론 항체의 내재화
매트립타제_A1 항체는, MabZAP 분석을 이용해, 세포로의 결합시, HT-29 세포 (인간 대장암 세포주)와 H69 세포 (인간 소 세포성 폐암 세포주)에 의해 내재화되는 것으로 확인되었다. MabZAP 항체는 일차 항체에 결합하였다. 그런 후, MabZAP 복합체가 세포에 의해 내재화되었다. 세포로 사포린이 도입되어, 단백질 합성이 저해되고, 궁극적으로 세포 사멸이 발생하였다.
MabZAP 분석을 다음과 같이 수행하였다. 각 세포를 웰 당 5 x 103개의 밀도로 접종하였다. 항-매트립타제 단일클론 항체 또는 이소형 대조군 인간 IgG를 연속 희석하여 세포에 첨가하였다. 그런 후, MabZAP를 50 ㎍/ml 농도로 첨가하여, 플레이트를 48 및 72시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트의 세포 생존성을 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega, G7571)를 이용해 검출하고, 플레이트를 Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA)를 사용해 490 nm에서 판독하였다. 데이타는 Prism (Graphpad)으로 분석하였다.
도 6은, 매트립타제_A1이 HT-29 세포와 H69 세포에 효과적으로 내재화되며, EC50이 각각 0.1829 및 0.07398임을 보여준다. 이들 결과는, 항체 농도 및 다른 항-매트립타제 항체에 비례하여 매트립타제_A1의 세포독성 활성이 증가됨을 입증해준다.
실시예 8: 마우스 이종이식 모델에서 항-매트립타제 항체-약물 접합체는 HT-29 세포의 증식을 저해한다
식 M (이하, " 매트립타제_A1-Formula M 접합체"로 지칭됨)에 따른 매트립타제_A1 접합체가 마우스 이종이식 모델에서 결장직장암 유래 HT-29 세포의 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 이 이종이식 모델에서, SCID 마우스 (CB17, Charles River Laboratories, Hollister, CA)에 HT-29 세포를 2.5 x 106개/마우스로 이식한 다음, HT-29 세포를 약 30일간 증식시켰다. 그런 후, 마우스를 무작위 분류하고, 매트립타제_A1-Formula M 접합체 (0.03, 0.1 및 0.3 μmole/kg)를 복막내 (i.p.) 처리하였다. DT와 항-디프테리아 독소 항체를 비-결합성 이소형 대조군으로서 사용하였다.
그 결과, 매트립타제_A1-Formula M 접합체의 처리가 용량 의존적인 방식으로 종양 증식율을 현저하게 저해하는 것으로 확인된다. 도 7a는, 독소 접합된 mAb의 1회 용량 (0.3 μmole/kg: c.2mg/kg)이 치유 효과가 있음을 보여준다. 도 7b는, 60일간의 투여 동안의 체중 변화를 나타낸 것으로, 종양-유발성 악액질이 개선되는 것으로 나타났다. 도 7c는 HT-29 ADC 이종이식 모델에서 다른 투약 그룹을 나타낸 것으로, 치료에 용량 의존적인 반응이 확인되었다. 도 7d는 HT-29 ADC 이종이식 모델에서 다른 투약 그룹을 나타낸 것으로, 용량 의존적인 악액질 완화가 확인되었다.
실시예 9: 암 세포주에서 MMAE-접합형 및 MMAF-접합형 항-매트립타제 단일클론 항체의 효능
재료
세포 스트립퍼 (비-효소적 세포 분리) (MT-25-056CI), 미국 PA에 소재한 fisher Scientific 사로부터 구입.
PBS pH 7.4 (1X) (SH30028LS), 미국 PA에 소재한 fisher Scientific 사로부터 구입.
RPMI 1640 배지 (MT-10-041-CM), 미국 PA에 소재한 fisher Scientific 사로부터 구입.
세포 타이터 Glo (G7572), 미국 WI에 소재한 Promega 사로부터 구입.
방법
세포를 세포 스트립퍼를 이용해 분리하여 카운팅하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀 다운하였다 (현탁 세포의 경우, 세포의 더블링 시간에 따라 더 많이 사용함, 예를 들어 10e3 세포/웰). 펠렛을 배양 배지에 1e5 세포/mL로 재현탁하였다.
50 ㎕/웰의 세포 현탁물을 96웰 백색 벽을 구비한 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하고, 0-20 nM 범위의 농도에 맞게 8 포인트로 (3배수) 타이트레이션하였다 (테스트 농도 당 2배). 희석 항체 또는 배지 (무처리 샘플의 경우) (50 ㎕/웰)를 적정 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해, 바깥쪽 열과 행에는 과잉의 배지 (200 ㎕/웰)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내, 실온에서 30분 인큐베이션하였다. 세포 타이터 Glo 용액을 해동시켰다. 플레이트를 털고, 100 ㎕/웰 PBS로 1회 세척하였다 (현탁 세포의 경우, 플레이트를 먼저 원심분리하여 세포를 펠렛화하였음). 100 ㎕/웰 PBS 및 100 ㎕ 세포 타이터 glo를 각 웰에 첨가하고, 트리투레이션하여 혼합하였다. 플레이트를 어두운 실온 조건에서 15분간 인큐베이션하고, 현미경으로 가시화하여 효과적인 세포 용혈 발생을 확보하였다. 그런 후, 플레이트를 Glomax 루미노미터에서 판독하였다.
결과
표 3은 MMAE가 접합된 항-매트립타제 항체를 이용한 ADC 세포독성 분석에서 다수의 인간 종양 세포주들의 EC50 값을 나타낸 것이다. 조사한 세포주는 Coav-4 (인간 난소 선암종), COV644 (인간 난소 상피-점액성 암종 (점액성 암종)), OVCAR-3 (인간 난소 선암종), OV90 (인간 유두상 장액성 선암종), HCC70 (인간 유방암 (breast ductal carcinoma) ER 음성, PR 양성 및 Her2 음성), HCC1143 (인간 유방암 ER 음성, PR 음성 및 Her2 음성), BT474 (인간 유방암), PC-3 (인간 전립선 선암종), N87 (인간 위 선암종), SNU16 (인간 위 선암종), KATOIII (인간 위 선암종), ST16 (인간 위 선암종), HT-29 (인간 결장직장 선암종) 및 DMS79 (폐 소세포암) 세포였다. 표 3은 또한 Coav-4, COV644, OVCAR-3, OV90, PC-3, N87, SNU16 및 KATOIII 세포주들에서 MMAF가 접합된 항-매트립타제 항체의 EC50 값을 도시한다. 이들 결과는, MMAE가 접합된 항-매트립타제 항체와 MMAF가 접합된 항-매트립타제 항체의 세포 독성이 > 1 nM임을 보여준다 (도 8).
표 3. 암 세포주에서 ADC 세포독성 분석의 EC50 값
세포주 매트립타제_A1-vc-MMAE
(EC50 nM) 		매트립타제_A1-mc-MMAF
(EC50 nM)
Coav-4 0.196 0.151
COV644 0.166 0.102
OVCAR-3 0.039 0.035
OV90 0.094 0.185
HCC70 0.248 계산 안됨
HCC1143 0.061 계산 안됨
BT474 0.118 계산 안됨
PC-3 0.579 0.389
N87 0.196 0.194
SNU16 0.082 0.073
KATOIII 0.068 0.261
ST16 0.086 계산 안됨
HT-29 0.139 계산 안됨
DMS79 0.444 계산 안됨
실시예 10: 난소암 이종이식 모델에서 MMAE-접합형 및 MMAF-접합형 항-매트립타제 단일클론 항체의 효능
매트립타제_A1_MMAE 및 매트립타제_A1_MMAF의 효능을 OVACAR-3 누드 마우스 이종이식 모델에서 테스트하였다.
면역결핍성 무-흉선 누드 마우스에 OVACAR-3 (인간 난소 선암종) 종양 세포를 피하 접종하였다. 종양을 확립시키고, 마우스를 마우스 5-8 마리/그룹으로 총 7개의 그룹으로 분류하였다. 평균 종양 체적이 평균 167 mm3/그룹에 도달하면, 각 그룹에 하기 화합물들 중 한가지를 처리하였으며, 지정된 투여량으로 정맥내로 투여하였다: 그룹 1 (비히클; 20 mM 소듐 숙시네이트, pH 5.0, 6% 트레할로스, 0.04% 폴리소르베이트; n=8); 그룹 2 (매트립타제_A1_MMAE; 1 mg/kg; n=8), 그룹 3 (매트립타제_A1_MMAE; 3 mg/kg; n=8), 그룹 4 (이소형 대조군-MMAE; 3 mg/kg; n=5), 그룹 5 (매트립타제_A1_MMAF; 1 mg/kg; n=8), 그룹 6 (매트립타제_A1_MMAF; 3 mg/kg; n=8), 그룹 7 (이소형 대조군-MMAF; 3 mg/kg; n=5). 체중 (BW)을 모니터링하였으며, 건강과 부작용에 대해 마우스를 자주 조사하였고, 종양은 주당 2회 측정하였다. 마우스는 종양 접종 후 82일 후에 안락사시켰다. 항-종양 활성 (치료 그룹의 평균 종양 크기/정상군의 평균 종양 크기 x 100) 및 ADC-처리 대 PBS-처리 마우스에서 평균 TTE (time-to-endpoint) 증가로부터 효능을 구하였다. 비히클-처리 대조군 마우스에서 가장 큰 종양 5개를 접종 후 71일째에 포르말린 고정 및 파라핀 포매하여 샘플 가공하였다.
결과
도 9는 매트립타제_A1_MMAE와 매트립타제_A1_MMAF가 각각 OVACAR-3 누드 마우스 이종이식 모델에서 대조군에 비해 놀라운 항-종양 활성을 나타냄을 보여준다. 매트립타제_A1_MMAE는 3 mg/kg에서 실험 61일째에 8마리 중 8마리가 생존하였는데, 8마리가 완전 퇴화되었고, 종양 증식이 가능한 최대한 지연되었으며 (85%), 이소형 대조군과 비히클 대조군에 비해 현저한 생존 연장을 나타내었다. 매트립타제_A1_MMAF는 3 mg/kg에서 68% TGD를 나타내었으며, 2마리는 생존하고, 3마리는 부분 퇴화, 1마리는 완전 퇴화되었다. 모든 처리는 허용성이 우수하였으며, 임상적인 독성 신호는 관찰되지 않았다. 이들 데이타는, 인간 트리플 네거티브 유방암 환자를 치료하는데 있어, ADC, 예를 들어 매트립타제_A1_MMAE 및 매트립타제_A1_MMAF에 의한 매트립타제 겨냥이 임상적인 이점을 제공할 가능성을 시사해준다. 이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 매트립타제_A1_MMAE은 본 이종이식 모델에서 놀랍게도 우수한 효과를 나타내었다.
실시예 11: 시노몰구스 원숭이에서 MMAE-접합형 및 MMAF-접합형 항-매트립타제 단일클론 항체의 독성
원숭이 10마리를 1마리/성별/그룹으로 실험에 배정하였다. 비히클 (PBS), 매트립타제_A1_MMAE 또는 매트립타제_A1_MMAF를, 표 4에 나타낸 바와 같이, 0 mg/kg/dose (PBS, 비히클), 1 mg/kg/dose (매트립타제_A1_MMAE), 3 mg/kg/dose (매트립타제_A1_MMAE), 3 mg/kg/dose (매트립타제_A1_MMAF), 6 mg/kg/dose (매트립타제_A1_MMAF)로 15분 정맥내 주입을 통해 2회 (1일과 29일)투여하였다. 투약 개시 전 (1일)과 각 투약 후 1, 2, 3, 7, 14, 21 및 28일 (1차 투약 후 28일째는 또한 2차 투약을 위한 pre-dose 시간대로도 이용함)에 독성 평가를 위해 채혈하였다. 57일에 모든 실험 동물을 안락사시키고, 마지막으로 채혈한 후 부검하였다. 각 혈액으로부터 혈장을 분리, 냉동하여 옥스포드 바이오테라퓨틱스 사로 보내 ELISA에 의한 ADC 농도 분석을 수행하였다.
표 4.
그룹 처리 투여량
(mg/kg/dose)		 농도
(mg/mL)		 투약 부피
(mL/kg)		 주입 속도
(mL/kg/min)		 동물 수
1 PBS 0 0 2.0 0.1333 1M/1F
2 매트립타제_A1_MMAE 1.0 0.50 2.0 0.1333 1M/1F
3 매트립타제_A1_MMAE 3.0 1.50 2.0 0.1333 1M/1F
4 매트립타제_A1_MMAF 3.0 1.50 2.0 0.1333 1M/1F
5 매트립타제_A1_MMAF 6.0 3.00 2.0 0.1333 1M/1F
결론
PBS, 매트립타제_A1_MMAE (절단가능형) 최대 3.0 mg/kg/dose 또는 매트립타제_A1_MMAF (절단불가형) 최대 6.0 mg/kg/dose를 각각 15분 정맥내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에 2회 투여하는 것은, 잘 허용되었다. 실험 기간 동안 사망 또는 빈사는 관찰되지 않았다. 매트립타제_A1_MMAE 또는 매트립타제_A1_MMAF를 처리한 동물에서는 임상 신호, 체중 및 체중 변화 또는 식이에 변화가 관찰되지 않았다.
AST 값 증가는 각 주입한 당일에만 나타났는데, 그룹 3 (매트립타제_A1_MMAE 3 mg/kg/day)은 수컷 1마리; 그룹 4 (매트립타제_A1_MMAF 3 mg/kg/day)는 원숭이 2마리 모두; 그리고 그룹 5 (매트립타제_A1_MMAF 6 mg/kg/day)는 원숭이 2마리 모두에서 그러하였다. 그룹 3의 수컷 원숭이의 경우 각 주입한 당일 LDH 값도 증가하였다. 다른 시간대에는 AST 또는 LDH의 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 조사한 제한된 수의 조직에서 확인되는 조직병리학적 결과와 관련없었다. 이러한 증가는 테스트 물품과 관련있었지만, 부작용은 아니었다. 그룹 3 (매트립타제_A1_MMAE 3 mg/kg/day)의 경우 암컷과 수컷에서 나타난 BUN 값 증가는 테스트 물품 투여와 관련있을 수 있지만, 다른 실험 파라미터와 증가 정도의 상호연관성이 없다는 것을 감안하면 독성 측면에서 유의한 것은 아니다. 혈액, 응고 또는 소변 검사와 관련된 파라미터에서는 테스트 물품-관련 효과가 없었다. 치료와 관련된, 전반적인 병리학적 결과나 또는 장기의 절대 무게 및 상대적인 무게 측면에서의 변화는 없었다. 그룹 2 (매트립타제_A1_MMAE 1 mg/kg/day)의 암컷; 그룹 4 (매트립타제_A1_MMAF 3 mg/kg/day)의 암컷; 그룹 5 (매트립타제_A1_MMAF 6 mg/kg/day)의 수컷의 경우, 조직병리학적으로, 비장 동맥주위 시트 (periarteriolar sheath)내 다수 림프구가 있는 것은 테스트 물품과 관련있을 수 있지만, 독성학적으로 유의한 것은 아니다.
서열목록의 요약
서열번호 설명 서열
1 VH_A1 aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAKRGATPFDYWGQGSLVTVSS
2 VK_A1 aa EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKLEIK
3 VH_A1 nt GAGGTGCAACTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGGAACTATGACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAAAAGGGGGGCTACCCCATTTGACTACTGGGGCCAGGGATCCCTGGTCACCGTCTCCTCA
4 VK_A1 nt GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGTTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
5 VH_A1_CDR1 aa NYDMS
6 VH_A1_CDR2 aa SISYSGGSTYYADSVKG
7 VH_A1_CDR3 aa RGATPFDY
8 VK_A1_CDR1 aa RASQSVSSSYLA
9 VK_A1_CDR2 aa GASSRAT
10 VK_A1_CDR3 aa QQYGSSPYT
11 VH_A1_CDR1 nt AACTATGACATGAGC
12 VH_A1_CDR2 nt AGTATTAGTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC
13 VH_A1_CDR3 nt AGGGGGGCTACCCCATTTGACTAC
14 VK_A1_CDR1 nt AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGTTACTTAGCC
15 VK_A1_CDR2 nt GGTGCATCCAGCAGGGCCACT
16 VK_A1_CDR3 nt CAGCAGTATGGTAGCTCACCGTACACT
17 3-23 생식계열 (V) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
18 JH4b 생식계열 (J) RGATPFDYWGQGTLVTVSS
19 A27 생식계열 (V) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
20 JK2 생식계열 (J) YTFGQGTKLEIK
21 매트립타제 스템 A VQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEGSVIAYYWSEFSIPQHLVEEAERVMAEERVVMLPPRARSLKSFVVTSVVAFPT
22 매트립타제 스템 B VQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEG
23 매트립타제 스템 C VQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEGSVIAYYWSEFSIPQHLVEEAERVMAEERVVMLPPRARSLK
24 매트립타제 스템 D VQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEGSVIAYYWSEFSIPQHLVEEAERVMAEERVVMLPPRARSLKSFVVTSVVAFPTDSK
25 매트립타제 ECD VVGGTDADEGEWPWQVSLHALGQGHICGASLISPNWLVSAAHCYIDDRGFRYSDPTQWTAFLGLHDQSQRSAPGVQERRLKRIISHPFFNDFTFDYDIALLELEKPAEYSSMVRPICLPDASHVFPAGKAIWVTGWGHTQYGGTGALILQKGEIRVINQTTCENLLPQQITPRMMCVGFLSGGVDSCQGDSGGPLSSVEADGRIFQAGVVSWGDGCAQRNKPGVYTRLPLFRDWIKENTGV
26 매트립타제 전장 단백질 MGSDRARKGGGGPKDFGAGLKYNSRHEKVNGLEEGVEFLPVNNVKKVEKHGPGRWVVLAAVLIGLLLVLLGIGFLVWHLQYRDVRVQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEGSVIAYYWSEFSIPQHLVEEAERVMAEERVVMLPPRARSLKSFVVTSVVAFPTDSKTVQRTQDNSCSFGLHARGVELMRFTTPGFPDSPYPAHARCQWALRGDADSVLSLTFRSFDLASCDERGSDLVTVYNTLSPMEPHALVQLCGTYPPSYNLTFHSSQNVLLITLITNTERRHPGFEATFFQLPRMSSCGGRLRKAQGTFNSPYYPGHYPPNIDCTWNIEVPNNQHVKVRFKFFYLLEPGVPAGTCPKDYVEINGEKYCGERSQFVVTSNSNKITVRFHSDQSYTDTGFLAEYLSYDSSDPCPGQFTCRTGRCIRKELRCDGWADCTDHSDELNCSCDAGHQFTCKNKFCKPLFWVCDSVNDCGDNSDEQGCSCPAQTFRCSNGKCLSKSQQCNGKDDCGDGSDEASCPKVNVVTCTKHTYRCLNGLCLSKGNPECDGKEDCSDGSDEKDCDCGLRSFTRQARVVGGTDADEGEWPWQVSLHAQGHICGASLISPNWLVSAAHCYIDDRGFRYSDPTQWTAFLGLHDQSQRSAPGVQERRLKRIISHPFFNDFTFDYDIALLELEKPAEYSSMVRPICLPDASHVFPAGKAIWVTGWGHTQYGGTGALILQKGEIRVINQTTCENLLPQQITPRMMCVGFLSGGVDSCQGDSGGPLSSVEADGRIFQAGVVSWGDGCAQRNKPGVYTRLPLFRDWIKENTGV
27 매트립타제 촉매성 C-말단 세린 프로테아제 도메인 VVGGTDADEGEWPWQVSLHALGQGHICGASLISPNWLVSAAHCYIDDRGFRYSDPTQWTAFLGLHDQSQRSAPGVQERRLKRIISHPFFNDFTFDYDIALLELEKPAEYSSMVRPICLPDASHVFPAGKAIWVTGWGHTQYGGTGALILQKGEIRVINQTTCENLLPQQITPRMMCVGFLSGGVDSCQGDSGGPLSSVEADGRIFQAGVVSWGDGCAQRNKPGVYTRLPLFRDWIKENTGV
28 매트립타제 스템 Fc-융합 단백질 VQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEGSVIAYYWSEFSIPQHLVEEAERVMAEERVVMLPPRARSLKSFVVTSVVAFPTASGSGIEGRGLEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
29 VH FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
30 VH FR2 WVRQAPGKGLEWVS
31 VH FR3 RFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAK
32 VH FR4 WGQGSLVTVSS
33 VK FR1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC
34 VK FR2 WYQQKPGQAPRLLIY
35 VK FR3 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC
36 VK FR4 FGQGTKLEIK
SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioTherapeutics Ltd <120> Antibodies <130> OB058-PCT <150> US61/908,371 <151> 2013-11-25 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Human <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Gly Ala Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Human <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 351 <212> DNA <213> Human <400> 3 gaggtgcaac tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagg aactatgaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt attagttata gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa tacgctgtct 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gaaaaggggg 300 gctaccccat ttgactactg gggccaggga tccctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Human <400> 4 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagttact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaa 324 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 5 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 6 Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 7 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 8 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Human <400> 9 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 10 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Human <400> 11 aactatgaca tgagc 15 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Human <400> 12 agtattagtt atagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Human <400> 13 aggggggcta ccccatttga 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Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 20 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 116 <212> PRT <213> Human <400> 21 Val Gln Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg Ile Thr Asn Glu Asn Phe 1 5 10 15 Val Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu Phe Val Ser Leu Ala 20 25 30 Ser Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Tyr Ser Gly Val Pro Phe 35 40 45 Leu Gly Pro Tyr His Lys Glu Ser Ala Val Thr Ala Phe Ser Glu Gly 50 55 60 Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser Ile Pro Gln His Leu 65 70 75 80 Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Met Ala Glu Glu Arg Val Val Met Leu 85 90 95 Pro Pro Arg Ala Arg 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Gln Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg Ile Thr Asn Glu Asn Phe 1 5 10 15 Val Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu Phe Val Ser Leu Ala 20 25 30 Ser Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Tyr Ser Gly Val Pro Phe 35 40 45 Leu Gly Pro Tyr His Lys Glu Ser Ala Val Thr Ala Phe Ser Glu Gly 50 55 60 Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser Ile Pro Gln His Leu 65 70 75 80 Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Met Ala Glu Glu Arg Val Val Met Leu 85 90 95 Pro Pro Arg Ala Arg Ser Leu Lys Ser Phe Val Val Thr Ser Val Val 100 105 110 Ala Phe Pro Thr Asp Ser Lys 115 <210> 25 <211> 241 <212> PRT <213> Human <400> 25 Val Val Gly Gly Thr Asp Ala Asp Glu Gly Glu Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu His Ala Leu Gly Gln Gly His Ile Cys Gly Ala Ser Leu Ile 20 25 30 Ser Pro Asn Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Ile Asp Asp Arg 35 40 45 Gly Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp Thr Ala Phe Leu Gly Leu 50 55 60 His Asp Gln Ser Gln Arg Ser Ala Pro Gly Val Gln Glu Arg Arg Leu 65 70 75 80 Lys Arg Ile Ile Ser His Pro Phe Phe Asn Asp Phe Thr Phe Asp Tyr 85 90 95 Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Pro Ala Glu Tyr Ser Ser Met 100 105 110 Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ala Ser His Val Phe Pro Ala Gly 115 120 125 Lys Ala Ile Trp Val Thr Gly Trp Gly His Thr Gln Tyr Gly Gly Thr 130 135 140 Gly Ala Leu Ile Leu Gln Lys Gly Glu Ile Arg Val Ile Asn Gln Thr 145 150 155 160 Thr Cys Glu Asn Leu Leu Pro Gln Gln Ile Thr Pro Arg Met Met Cys 165 170 175 Val Gly Phe Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly 180 185 190 Gly Pro Leu Ser Ser Val Glu Ala Asp Gly Arg Ile Phe Gln Ala Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Arg Asn Lys Pro Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Leu Pro Leu Phe Arg Asp Trp Ile Lys Glu Asn Thr Gly 225 230 235 240 Val <210> 26 <211> 853 <212> PRT <213> Human <400> 26 Met Gly Ser Asp Arg Ala Arg Lys Gly Gly Gly Gly Pro Lys Asp Phe 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Lys Tyr Asn Ser Arg His Glu Lys Val Asn Gly Leu 20 25 30 Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu Pro Val Asn Asn Val Lys Lys Val Glu 35 40 45 Lys His Gly Pro Gly Arg Trp Val Val Leu Ala Ala Val Leu Ile Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Ile Gly Phe Leu Val Trp His Leu Gln 65 70 75 80 Tyr Arg Asp Val Arg Val Gln Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg Ile 85 90 95 Thr Asn Glu Asn Phe Val Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu 100 105 110 Phe Val Ser Leu Ala Ser Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Tyr 115 120 125 Ser Gly Val Pro Phe Leu Gly Pro Tyr His Lys Glu Ser Ala Val Thr 130 135 140 Ala Phe Ser Glu Gly Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser 145 150 155 160 Ile Pro Gln His Leu Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Met Ala Glu Glu 165 170 175 Arg Val Val Met Leu Pro Pro Arg Ala Arg Ser Leu Lys Ser Phe Val 180 185 190 Val Thr Ser Val Val Ala Phe Pro Thr Asp Ser Lys Thr Val Gln Arg 195 200 205 Thr Gln Asp Asn Ser Cys Ser Phe Gly Leu His Ala Arg Gly Val Glu 210 215 220 Leu Met Arg Phe Thr Thr Pro Gly Phe Pro Asp Ser Pro Tyr Pro Ala 225 230 235 240 His Ala Arg Cys Gln Trp Ala Leu Arg Gly Asp Ala Asp Ser Val Leu 245 250 255 Ser Leu Thr Phe Arg Ser Phe Asp Leu Ala Ser Cys Asp Glu Arg Gly 260 265 270 Ser Asp Leu Val Thr Val Tyr Asn Thr Leu Ser Pro Met Glu Pro His 275 280 285 Ala Leu Val Gln Leu Cys Gly Thr Tyr Pro Pro Ser Tyr Asn Leu Thr 290 295 300 Phe His Ser Ser Gln Asn Val Leu Leu Ile Thr Leu Ile Thr Asn Thr 305 310 315 320 Glu Arg Arg His Pro Gly Phe Glu Ala Thr Phe Phe Gln Leu Pro Arg 325 330 335 Met Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Arg Lys Ala Gln Gly Thr Phe Asn 340 345 350 Ser Pro Tyr Tyr Pro Gly His Tyr Pro Pro Asn Ile Asp Cys Thr Trp 355 360 365 Asn Ile Glu Val Pro Asn Asn Gln His Val Lys Val Arg Phe Lys Phe 370 375 380 Phe Tyr Leu Leu Glu Pro Gly Val Pro Ala Gly Thr Cys Pro Lys Asp 385 390 395 400 Tyr Val Glu Ile Asn Gly Glu Lys Tyr Cys Gly Glu Arg Ser Gln Phe 405 410 415 Val Val Thr Ser Asn Ser Asn Lys Ile Thr Val Arg Phe His Ser Asp 420 425 430 Gln Ser Tyr Thr Asp Thr Gly Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp 435 440 445 Ser Ser Asp Pro Cys Pro Gly Gln Phe Thr Cys Arg Thr Gly Arg Cys 450 455 460 Ile Arg Lys Glu Leu Arg Cys Asp Gly Trp Ala Asp Cys Thr Asp His 465 470 475 480 Ser Asp Glu Leu Asn Cys Ser Cys Asp Ala Gly His Gln Phe Thr Cys 485 490 495 Lys Asn Lys Phe Cys Lys Pro Leu Phe Trp Val Cys Asp Ser Val Asn 500 505 510 Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Gly Cys Ser Cys Pro Ala Gln 515 520 525 Thr Phe Arg Cys Ser Asn Gly Lys Cys Leu Ser Lys Ser Gln Gln Cys 530 535 540 Asn Gly Lys Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro 545 550 555 560 Lys Val Asn Val Val Thr Cys Thr Lys His Thr Tyr Arg Cys Leu Asn 565 570 575 Gly Leu Cys Leu Ser Lys Gly Asn Pro Glu Cys Asp Gly Lys Glu Asp 580 585 590 Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Lys Asp Cys Asp Cys Gly Leu Arg Ser 595 600 605 Phe Thr Arg Gln Ala Arg Val Val Gly Gly Thr Asp Ala Asp Glu Gly 610 615 620 Glu Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu His Ala Gln Gly His Ile Cys Gly 625 630 635 640 Ala Ser Leu Ile Ser Pro Asn Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Tyr 645 650 655 Ile Asp Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp Thr Ala 660 665 670 Phe Leu Gly Leu His Asp Gln Ser Gln Arg Ser Ala Pro Gly Val Gln 675 680 685 Glu Arg Arg Leu Lys Arg Ile Ile Ser His Pro Phe Phe Asn Asp Phe 690 695 700 Thr Phe Asp Tyr Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Pro Ala Glu 705 710 715 720 Tyr Ser Ser Met Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ala Ser His Val 725 730 735 Phe Pro Ala Gly Lys Ala Ile Trp Val Thr Gly Trp Gly His Thr Gln 740 745 750 Tyr Gly Gly Thr Gly Ala Leu Ile Leu Gln Lys Gly Glu Ile Arg Val 755 760 765 Ile Asn Gln Thr Thr Cys Glu Asn Leu Leu Pro Gln Gln Ile Thr Pro 770 775 780 Arg Met Met Cys Val Gly Phe Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln 785 790 795 800 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Ser Val Glu Ala Asp Gly Arg Ile 805 810 815 Phe Gln Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Arg Asn 820 825 830 Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Leu Pro Leu Phe Arg Asp Trp Ile Lys 835 840 845 Glu Asn Thr Gly Val 850 <210> 27 <211> 241 <212> PRT <213> Human <400> 27 Val Val Gly Gly Thr Asp Ala Asp Glu Gly Glu Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu His Ala Leu Gly Gln Gly His Ile Cys Gly Ala Ser Leu Ile 20 25 30 Ser Pro Asn Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Ile Asp Asp Arg 35 40 45 Gly Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp Thr Ala Phe Leu Gly Leu 50 55 60 His Asp Gln Ser Gln Arg Ser Ala Pro Gly Val Gln Glu Arg Arg Leu 65 70 75 80 Lys Arg Ile Ile Ser His Pro Phe Phe Asn Asp Phe Thr Phe Asp Tyr 85 90 95 Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Pro Ala Glu Tyr Ser Ser Met 100 105 110 Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ala Ser His Val Phe Pro Ala Gly 115 120 125 Lys Ala Ile Trp Val Thr Gly Trp Gly His Thr Gln Tyr Gly Gly Thr 130 135 140 Gly Ala Leu Ile Leu Gln Lys Gly Glu Ile Arg Val Ile Asn Gln Thr 145 150 155 160 Thr Cys Glu Asn Leu Leu Pro Gln Gln Ile Thr Pro Arg Met Met Cys 165 170 175 Val Gly Phe Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly 180 185 190 Gly Pro Leu Ser Ser Val Glu Ala Asp Gly Arg Ile Phe Gln Ala Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Arg Asn Lys Pro Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Leu Pro Leu Phe Arg Asp Trp Ile Lys Glu Asn Thr Gly 225 230 235 240 Val <210> 28 <211> 359 <212> PRT <213> Human <400> 28 Val Gln Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg Ile Thr Asn Glu Asn Phe 1 5 10 15 Val Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu Phe Val Ser Leu Ala 20 25 30 Ser Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Tyr Ser Gly Val Pro Phe 35 40 45 Leu Gly Pro Tyr His Lys Glu Ser Ala Val Thr Ala Phe Ser Glu Gly 50 55 60 Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser Ile Pro Gln His Leu 65 70 75 80 Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Met Ala Glu Glu Arg Val Val Met Leu 85 90 95 Pro Pro Arg Ala Arg Ser Leu Lys Ser Phe Val Val Thr Ser Val Val 100 105 110 Ala Phe Pro Thr Ala Ser Gly Ser Gly Ile Glu Gly Arg Gly Leu Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Human <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Human <400> 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 32 <212> PRT <213> Human <400> 31 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 32 Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Human <400> 33 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Human <400> 34 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Human <400> 35 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (34)

  1. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 영역으로서,
    (a) 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역과 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는, 매트립타제 (Matriptase)의 스템 영역 (stem region) 상의 에피토프에 결합하거나, 또는
    (b) 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 영역과 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하는 항체와, 매트립타제의 스템 영역과의 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  2. 매트립타제의 스템 영역에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 영역으로서,
    상기 항체는,
    a) i) 서열번호 5를 포함하는 제1 vhCDR;
    ii) 서열번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및
    iii) 서열번호 7을 포함하는 제3 vhCDR
    을 포함하는 중쇄 가변성 영역과,
    b) i) 서열번호 8을 포함하는 제1 vlCDR;
    ii) 서열번호 9를 포함하는 제2 vlCDR; 및
    iii) 서열번호 10을 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 경쇄 가변성 영역을 포함하며,
    선택적으로, 상기 서열번호들은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결손을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 1에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 중쇄와, 서열번호 2에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    공유 결합된 모이어티를 더 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 모이어티가 약물 모이어티 또는 방사성 모이어티인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약물이 메이탄시노이드 (maytansinoid), 돌라스타틴 (dolastatin), 헤미아스테를린, 아우리스타틴 (auristatin), 트리코테센 (trichothecene), 칼리케아미신 (calicheamicin), CC1065 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 약물이 MMAE 및 MMAF로 이루어진 군으로부터 선택되는 메이탄시노이드인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 항체가 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)을 유도하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항체가 Fc 수용체에 대해 증가된 결합성 및/또는 ADCC에 대한 증가된 효능을 가진 엔지니어드 항체 (engineered antibody) 및/또는 이중특이성 항체 (bispecific antibody)인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역을, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 포함하는, 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역의 중쇄를 코딩하는 핵산.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역의 경쇄를 코딩하는 핵산.
  13. 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결된 제11항의 핵산 및/또는 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결된 제12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  14. 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 숙주 세포:
    (i) 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결된 제11항의 핵산 및/또는 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결된 제12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터; 또는
    (ii) 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결된 제11항의 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터 및/또는 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결된 제12항의 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터.
  15. 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제조하는 방법으로서,
    제14항에 따른 숙주 세포를 상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역이 발현되는 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역이 매트립타제의 스템 영역을 발현하는 세포에 의해 내재화 (internalizion)되는, 암 치료 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 영역이 공유 결합된 약물 접합체를 포함하는, 암 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 공유 결합된 약물 접합체가 아우리스타틴 (auristatin), 바람직하게는 MMAE인, 암 치료 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 항체가 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)을 유도하는, 암 치료 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 치료 방법.
  22. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역이 매트립타제의 스템 영역을 발현하는 세포에 의해 내재화되는, 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역이 공유 결합된 약물 접합체를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  25. 제25항에 있어서,
    상기 공유 결합된 약물 접합체가 아우리스타틴, 바람직하게는 MMAE인, 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 항체가 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)을 유도하는, 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
  28. 암 치료용 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역의 용도.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 매트립타제의 스템 영역을 발현하는 세포에 의해 내재화되는, 용도.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 영역이 공유 결합된 약물 접합체를 포함하는, 용도.
  31. 제30에 있어서,
    상기 공유 결합된 약물 접합체가 아우리스타틴, 바람직하게는 MMAE인, 용도.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 항체가 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)을 유도하는, 용도.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 위암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 바람직하게는 SCLC, 식도암, 두경부암, 췌장암, 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  34. 치료법 (therapy)에 사용하거나 또는 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 영역.
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