TW201605905A - 抗體 - Google Patents

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海春 黃
莎拉 波格
艾利卡 麥道夫
蜜雪兒Ｒ 庫尼
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Abstract

本發明提供結合至酪胺酸-蛋白激酶跨膜受體間質蛋白酶之細胞外域的抗體。亦提供編碼該等抗體之核酸分子、用於表現該等抗體之表現載體、宿主細胞及方法。該等抗體可用於治療癌症，包括胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌症、肺癌(較佳為SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳為非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌。

Description

抗體
間質蛋白酶降解細胞外基質。根據SWISS-PROT，提出其在乳癌侵襲及癌轉移中起一定作用。其展現如藉由以Arg或Lys作為P1位點裂解合成基質定義之胰蛋白酶樣活性。其在與口腔上皮及表皮的終末分化相關之絲聚合蛋白原處理、角質細胞成熟及脂質基質形成中具有必需的生理作用，且亦對於毛囊生長至關重要。其為表現於大部分人類上皮中之II型跨膜絲胺酸蛋白酶且其為絕對的上皮蛋白酶。其表現於上皮來源之癌瘤中且不表現於間葉細胞來源之腫瘤中。間質蛋白酶已先前描述於WO2009/020645中。
本發明提供針對間質蛋白酶(例如針對包含SEQ ID NO：26或功能部分，諸如幹(SEQ ID NO：21-24)之人類間質蛋白酶之抗體及相關組合物，包括編碼該等抗體及治療蛋白質之核酸，及包含該等核酸之宿主細胞。本發明進一步提供製備抗間質蛋白酶抗體之方法及使用該等抗體治療諸如以下疾病之方法：間質蛋白酶介導病症，例如人類癌症，包括胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))及皮膚癌。
在一特定實施例中，本發明之抗間質蛋白酶抗體(或其抗原結合片段)結合至間質蛋白酶之細胞外主幹區(SEQ ID NO：21-24)且藉由表 現間質蛋白酶之細胞內化。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體或其抗原結合部分，其：(a)結合由包括包含SEQ ID NO：1中所出示之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：2中所出示之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體識別之間質蛋白酶上的抗原決定基，或(b)與包括包含SEQ ID NO：1中所出示之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：2中所出示之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至LY75。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分結合至人類LY75且包括包含1、2或3個選自由包含SEQ ID NO：5、6及7之CDR組成之群的CDR之重鏈可變區，及/或包含1、2或3個選自由包含SEQ ID NO：8、9及10之CDR組成之群的CDR之輕鏈可變區。
在另一實施例中，該抗體包含本文所述之特定抗體(例如在本文中稱為「間質蛋白酶_A1」)之重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)或可變區(VR)。因此，在一個實施例中，抗體包含具有展示於SEQ ID NO：1中之序列之間質蛋白酶_A1之重鏈可變(VH)區之CDR1、CDR2及CDR3域，及/或具有展示於SEQ ID NO：2中之序列之A1之輕鏈可變(VL)區之CDR1、CDR2及CDR3域。
在另一實施例中，抗體包含重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR；包含SEQ ID NO：6之第二vhCDR；及包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR；及/或輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR；包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR；及包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR。
在另一實施例中，本發明抗體結合至人類間質蛋白酶且包括包括胺基酸序列SEQ ID NO：1及其保守序列修飾之重鏈可變區。抗體可進一步包括包括胺基酸序列SEQ ID NO：2及其保守序列修飾之輕鏈可變區。
在另一實施例中，本發明之抗體結合至人類間質蛋白酶且包括分別包括SEQ ID NO：1及/或2中所出示之胺基酸序列及其保守序列修飾的重鏈可變區及輕鏈可變區。
應瞭解，保守序列修飾可為胺基酸取代、添加或缺失，但較佳為取代。如本文所用，術語保守序列修飾係指例如胺基酸經具有類似特徵之胺基酸取代。何種此類取代可視為保守為熟習此項技術者的公共常識。可視為保守序列修飾之其他修飾包括例如糖基化。
另外應瞭解，保守序列修飾可存在於SEQ ID NO：1及/或2中所出示之重鏈及/或輕鏈可變區之CDR區域(SEQ ID NO：5-10)中之一或多者及/或構架區(SEQ ID NO：29-36)中之一或多者中。
在較佳實施例中，該等抗體為經分離抗體。
包括與以上序列中之任一者具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或99%以上序列一致性之重鏈及輕鏈可變區的經分離抗體亦包括在本發明中。在上述值中間的範圍，例如與以上序列中之任一者具有至少80%-85%、85%-90%、90%-95%或95%-100%序列一致性之重鏈及輕鏈可變區亦意欲為本發明所包涵。在一個實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：1，或與SEQ ID NO：1具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之序列之重鏈可變區。在另一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：2或與SEQ ID NO：2具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之序列之輕鏈可變區。在另一實施例中，抗體包含重鏈構架區，該重鏈構架區包含與SEQ ID NO：1之重鏈可變區之構架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之胺基酸序列，其如SEQ ID NO 29、30、31及32中所示。在另一實施例中，抗體包含輕鏈構架區，該輕鏈構架區包含與SEQ ID NO：2之輕鏈可變區之構架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之胺基酸序列，其如SEQ ID NO：33、34、35及36中所示。
本發明亦包涵與本發明抗體競爭結合至間質蛋白酶之經分離抗體。在一特定實施例中，抗體與包含分別包含SEQ ID NO：1及2中所出示之胺基酸序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區的抗體競爭結合至間質蛋白酶。在另一實施例中，抗體與包含包含SEQ ID NO：1及2(A1)中所出示之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區的抗體競爭結合至間質蛋白酶。
本發明之其他抗體結合至相同抗原決定基或由本文所述之抗體識別之間質蛋白酶上的抗原決定基。在另一特定實施例中，抗體結合至由包含分別包含SEQ ID NO：1及2中所出示之胺基酸序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區的抗體識別之間質蛋白酶上之抗原決定基。在另一實施例中，抗體結合至由包含包含SEQ ID NO：1及2(A1)中所出示之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區的抗體識別之間質蛋白酶上之抗原決定基。
在另一實施例中，本發明之抗體包含與本文所述之親本抗體相比可變的CDR。因此，本發明提供包含親本抗體之變異可變區的變異抗體，其中該親本抗體包括包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR、包含 SEQ ID NO：6之第二vhCDR、包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR、包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR、包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR及包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR，且其中該變異抗體在第一vhCDR、第二vhCDR、第三vhCDR、第一vlCDR、第二vlCDR及第三vlCDR之組中總共具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，其中1至4個、1至3個或1至2個取代具有特定用途，且其中該抗體保留與間質蛋白酶之特異性結合。
本發明之抗體可為全長，例如以下同型中之任一者：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE。或者，抗體可為諸如抗原結合部分之片段或單鏈抗體(例如Fab、F(ab')2、Fv、單鏈Fv片段、分離之互補決定區(CDR)或兩個或兩個以上分離之CDR之組合)。該等抗體可為任何種類之抗體，包括(但不限於)人類抗體、人類化抗體及嵌合抗體。
在其他實施例中，本發明之抗體呈免疫共軛物形式(亦即另外包括共價連接部分)。在一特定實施例中，該部分為藥物，諸如類美登素、哈米特林(hemiasterlin)、海兔毒素、奧瑞他汀(auristatin)、單端孢黴烯族毒素、卡奇黴素、CC1065或其衍生物。在一較佳實施例中，藥物為奧瑞他汀，更佳MMAE或MMAF。
在其它實施例中，本發明抗體呈雙特異性分子形式，例如在效應細胞存在下引起抗體依賴性細胞毒性(ADCC)反應，因此殺死表現間質蛋白酶之細胞。
在另一方面中，本發明提供編碼前述抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之核酸。在一個實施例中，本發明提供一種結合人類間質蛋白酶之分離之單株抗體，其中該抗體包含藉由分別包含SEQ ID NO：3及4之核酸序列或與上述核酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性 之核酸序列或由於基因密碼之簡併性不同於SEQ ID NO：3及4之序列編碼之重鏈可變區及輕鏈可變區。
在本發明之另一態樣中，提供包含可操作地連接於一或多個調節元件之編碼本發明抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之核酸的表現載體。
在另一態樣中，本發明提供含有編碼上述抗體之重鏈及/或輕鏈可變區或其抗原結合部分之核酸的宿主細胞。較佳地，其中宿主細胞在宿主細胞於表現核酸之條件下生長時表現該等重鏈及/或輕鏈可變區或其抗原結合部分。在其他實施例中，提供恢復一或多種本發明抗體之方法。在一較佳實施例中，宿主細胞包含：(i)根據本發明之表現載體；或
(ii)包含編碼本發明抗體之重鏈或其抗原結合部分之核酸序列的第一表現載體及包含編碼本發明抗體之輕鏈或其抗原結合部分之核酸序列的第二表現載體。
在本發明之另一態樣中，提供製造抗體或其抗原結合部分之方法，包含在表現該抗體或其抗原結合部分之條件下培養本發明之宿主細胞及視情況分離該抗體或其抗原結合部分。
在另一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中向有需要之患者投與本發明之一或多種抗體或其結合部分。在一特定實施例中，向患者投與結合至間質蛋白酶之細胞外主幹區(SEQ ID NO：21-24)之抗體。在另一實施例中，本發明之一或多種抗體經內化。在一個實施例中，抗體或抗原結合部分包含共價連接之藥物部分。在另一實施例中，抗體包含重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR；包含SEQ ID NO：6之第二vhCDR；及包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR，及輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR，包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR及包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR。
在另一態樣中，提供治療癌症之方法，其中向有需要之患者投與本發明之抗體或其抗原結合部分且其中該等本發明之抗體或其抗原結合部分在效應細胞存在下引發ADCC反應。較佳地，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR；包含SEQ ID NO：6之第二vhCDR；及包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR；及輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR，包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR及包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR。
在另一態樣中，提供治療癌症之方法，其中向有需要之患者投與本發明之抗體或其抗原結合部分，且其中該等本發明之抗體或其抗原結合部分在效應細胞存在下引發細胞毒性T細胞反應。較佳地，抗體包含重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR；包含SEQ ID NO：6之第二vhCDR；及包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR；及及輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR；包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR；及包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR。
在本發明之另一態樣中，提供一或多種用於癌症治療之本發明之抗體。
亦提供一或多種本發明之抗體在製造用於癌症治療之藥物中之用途。
在一個實施例中，癌症係選自胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌症、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌之群。
根據本發明之另一態樣，提供在個體中偵測、診斷及/或篩檢表現間質蛋白酶之癌症、或監測該癌症之進展、或監測針對該癌症之癌症藥物或療法之效應的方法，其包含偵測能夠免疫特異性結合至間質蛋白酶之抗體或其一或多種片段之存在或含量。
較佳地，癌症係選自胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵 巢癌症、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌之群。
包含本發明之組合物(例如抗體)及視情況存在之使用說明書的套組亦在本發明之範疇內。該套組可另外含有至少一種額外試劑或一或多種本發明之額外抗體。
本發明之其他特徵及優勢將自以下實施方式及申請專利範圍變得顯而易見。
圖1a及圖1b描繪產生主幹區(SEQ ID NO：21-24)之間質蛋白酶之裂解位點。
圖2a描繪間質蛋白酶_A1重鏈、人類VH 3-23生殖系及人類JH4b生殖系之比對。間質蛋白酶_A1重鏈之CDR區帶下劃線。
圖2b描繪間質蛋白酶_A1輕鏈、人類VK A27生殖系及人類JK2生殖系之比對。間質蛋白酶_A1輕鏈之CDR區帶下劃線。
圖3顯示使用ELISA結合至間質蛋白酶-幹之間質蛋白酶_A1。
圖4a顯示SNU1細胞上之間質蛋白酶_A1之流式細胞學分析之結果。
圖4b描繪HT-29細胞上之間質蛋白酶_A1之流式細胞學分析之結果。
圖4c描繪H69細胞上之間質蛋白酶_A1之流式細胞學分析之結果。
圖5描繪在效應細胞存在下引發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)反應之間質蛋白酶_A1。
圖6描繪使用MabZAP分析，藉由HT-29及H69細胞之間質蛋白酶_A1之內化。
圖7a顯示發現單劑量(以0.3莫耳/公斤：約2毫克/公斤)之毒素共軛 間質蛋白酶_A1為治癒性的。
圖7b顯示表明改善腫瘤誘發之惡病體質的經60天投配間質蛋白酶_A1之體重改變。
圖7c顯示展現對治療之劑量反應的HT-29 ADC異種移植模型中之替代劑量組。
圖7d顯示展現劑量反應惡病體質改善之HT-29 ADC異種移植模型中之替代劑量組。
圖8描繪使用共軛至各種癌細胞株中之MMAE或MMAF之抗間質蛋白酶抗體的ADC細胞毒性分析之EC50值。
圖9描繪共軛至卵巢腺癌SCID小鼠異種移植模型中之MMAE或MMAF之抗間質蛋白酶抗體之功效。
在一個實施例中，本發明係關於以如本文中概述之高親和力特異性地結合至SEQ ID NO：21-24中所述之間質蛋白酶之主幹區之分離抗體。
在特定實施例中，本發明之間質蛋白酶抗體可呈雙特異性分子形式，例如在效應細胞存在下促進抗體依賴性細胞毒性(ADCC)反應，因此殺死表現間質蛋白酶之細胞。
在其他實施例中，本發明之間質蛋白酶抗體在與表現間質蛋白酶受體之細胞接觸時內化。如本文中所論述，間質蛋白酶受體過度表現及/或不同地表現於某些癌細胞上，該等癌細胞包括(但不限於)胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌之腫瘤。
因此，當本發明之該等間質蛋白酶抗體共軛至藥物(有時在本文中稱為「抗體-藥物共軛物」或「ADC」)時，此等ADC分子內化至癌 細胞中導致細胞死亡且因此導致腫瘤治療。
因此，本發明提供抗體，特定言之分離抗體(其如在下文中所概述，包括多種熟知抗體結構、衍生物、模擬物及共軛物)、編碼此等抗體之核酸、用於製造抗體之宿主細胞、製造抗體之方法及包含抗體且視情況包括醫藥載劑之醫藥組合物。
間質蛋白酶蛋白質
已報導間質蛋白酶之細胞外主幹區由包含胺基酸殘基86-201(SEQ ID NO：21)之單一SEA域組成。間質蛋白酶之活化需要連續內蛋白分解裂解及活化位點自裂解。在胺基酸Gly149之後發生裂解，產生包含胺基酸殘基86-149(間質蛋白酶主幹序列B，SEQ ID NO：22)之主幹區。其他蛋白分解裂解可出現在胺基酸K189之後，其產生包含胺基酸序列86-189(間質蛋白酶主幹序列C，SEQ ID NO：23)之主幹區或或胺基酸K204，其產生包含胺基酸序列86-204(間質蛋白酶主幹序列D，SEQ ID NO：24)之主幹區。間質蛋白酶隨後藉由在Arg614之後的蛋白分解裂解轉化成其活性構形。催化C端絲胺酸蛋白酶域由胺基酸殘基615-855(SEQ ID NO：27)組成(圖1)。參見例如Matriptase：Potent Proteolysis on the Cell Surface；List,Bugge及Szabo；Mol Med 12(1-3)1-7,2006年1月-3月及Regulation of the activity of Matriptase on epithelial cell surfaces by a blood derived factor；Benaud,Dickson及Lin；Eur J Biochem 268,1439-1447,2001，其全文併入本文中。
因此，本發明提供特異性結合人類間質蛋白酶之主幹區之分離抗間質蛋白酶抗體。「人類間質蛋白酶」或「人類間質蛋白酶抗原」係指SEQ ID NO：26或功能部分，諸如幹(SEQ ID NO：21-24)(如本文所定義)之蛋白質。一般而言，間質蛋白酶具有短胞質內尾端、跨膜域及細胞外域，其在裂解時產生間質蛋白酶主幹區。在特定實施例中，本發明之抗體結合至間質蛋白酶蛋白質之主幹區。
在某些情況下，本發明抗體可與來自除人類以外之物種之間質蛋白酶交叉反應。舉例而言，為有助於臨床測試，本發明之抗體可與鼠類或靈長類間質蛋白酶分子交叉反應。或者，在某些實施例中，抗體可完全對一或多種人類間質蛋白酶具有特異性且可不展現物種或其他類型之非人類交叉反應性。
抗體
本發明提供抗間質蛋白酶抗體，一般為如本文所述之治療性及/或診斷性抗體。在本發明中可用之抗體可呈如本文所述之許多形式，包括下文所述之傳統抗體以及抗體衍生物、片段及模擬物。基本上，本發明提供含有6個如本文所定義之CDR之組的抗體結構(包括較小數目之胺基酸變化，如下文所述)。
如本文所用之「抗體」包括如熟習此項技術者應瞭解之多種結構，其最少含有6個如本文所定義之CDR之組；包括(但不限於)傳統抗體(包括單株及多株抗體)、人類化及/或嵌合抗體、抗體片段、工程改造抗體(例如具有如在下文中概述之胺基酸修飾)、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)及此項技術中已知及本文中論述之其他類似物。
傳統抗體結構單元通常包含四聚體。各四聚體通常由相同的兩對多肽鏈組成，各對具有一條「輕」鏈(通常具有約25kDa之分子量)及一條「重」鏈(通常具有約50-70kDa之分子量)。將人類輕鏈分類為κ(kappa)及λ(lambda)輕鏈。將重鏈分類為μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干子類，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有包括(但不限於)IgM1及IgM2之子類。因此，如本文所用之「同型」意謂藉由恆定區之化學及抗原特徵定義之免疫球蛋白之子類中之任一者。已知人類免疫球蛋白同型為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD及IgE。應理 解，治療抗體亦可包含同型及/或子類之任何組合之混合物。
在多個實施例中，IgG同型用於本發明中，其中IgG1特定可用於多種應用中。
各鏈之胺基末端部分包括一主要負責抗原識別之約100至110或更多胺基酸之可變區。在可變區中，對於重鏈及輕鏈之V域中之每一者收集三個環以形成抗原結合位點。該等環中之每一者被稱作互補決定區(在下文中稱為「CDR」)，其中胺基酸序列中之變化最顯著。「可變」係指可變區之某些片段在抗體中之序列中廣泛不同之事實。可變區內之可變性並非均勻分佈。換言之，V區由15-30個胺基酸之稱為構架區(FR)之相對恆定伸展區組成，該等相對恆定之伸展區經各9-15個胺基酸長之稱為「高變區」的極端可變較短區分開。
各VH及VL由三個高變區(「互補決定區」、「CDR」)及四個FR組成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高變區一般包涵以下胺基酸殘基：輕鏈可變區中之約胺基酸殘基24-34(LCDR1；「L」表示輕鏈)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)及重鏈可變區中之約31-35B(HCDR1；「H」表示重鏈)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)；Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)及/或形成高變環之彼等殘基(例如輕鏈可變區中之殘基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)及重鏈可變區中之26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)及96-101(HCDR3)；Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917。本發明之特定CDR描述於下文中。
在整個本說明書中，當提及可變域中之殘基(大致輕鏈可變區之殘基1-107及重鏈可變區之殘基1-113)時，一般使用卡貝特編號系統 (Kabat numbering system)(例如Kabat等人，前述(1991))。
CDR促進形成抗體之抗原結合，或更特定言之，抗原決定基結合位點。術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指免疫球蛋白或抗體特異性結合之抗原上位點。抗原決定基可由相連胺基酸或因蛋白質之三級摺疊而毗鄰之非相連胺基酸形成。由相連胺基酸形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑時保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時喪失。抗原決定基通常包括呈獨特空間構形之至少3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸。用於測定何種抗原決定基由給定抗體結合(亦即抗原決定基定位)之方法為此項技術中所熟知的且包括例如免疫墨點法及免疫沈澱分析，其中測試間質蛋白酶之重疊或相連肽與給定抗間質蛋白酶抗體之反應性。測定抗原決定基之空間構形之方法包括此項技術中之技術及本文所述之彼等技術，例如X射線結晶及2維核磁共振(參見例如Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,第66卷，G.E.Morris編(1996))。術語「抗原決定基定位」係指鑑別用於抗體-抗原識別之分子決定子的過程。
「抗原決定基」係指與稱為互補位之抗體分子之可變區中之特異性抗原結合位點相互作用之決定子。抗原決定基為諸如胺基酸或糖側鏈之分子分組且通常具有特定結構特徵以及荷質比特徵。單一抗原可具有一個以上的抗原決定基。在本發明中，精確抗原決定基並非限定的；更確切些，本發明抗體結合至間質蛋白酶受體且經內化或在效應細胞存在下引發ADCC反應之能力為重要的。
各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。Kabat等人收集重鏈及輕鏈之可變區之許多一級序列。基於序列之保守度，其將個別一級序列分類為CDR及構架且製得其清單(參見SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，NIH publication，第91-3242 號，E.A.Kabat等人，以全文引用的方式併入)。
在免疫球蛋白之IgG子類中，重鏈中存在若干免疫球蛋白域。「免疫球蛋白(Ig)結構域」在本文中意謂具有獨特三級結構之免疫球蛋白區。本發明中所關注的為重鏈域，包括恆定重鏈(CH)域及鉸鏈域。在IgG抗體之情形下，IgG同型各具有三個CH區。因此，在IgG之情形下，「CH」結構域如下：「CH1」係指根據如Kabat中之EU指數的位置118-220。「CH2」係指根據如Kabat中之EU指數的位置237-340，且「CH3」係指根據如Kabat中之EU指數的位置341-447。
重鏈之另一類型之Ig域為鉸鏈區。「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」或「免疫球蛋白鉸鏈區」在本文中意謂包含抗體之第一及第二恆定結構域之間的胺基酸之可撓性多肽。在結構上，IgG CH1結構域在EU位置220處結束，且IgG CH2結構域在殘基EU位置237處開始。因此，對於IgG，抗體鉸鏈在本文中界定為包括位置221(IgG1中之D221)至236(IgG1中之G236)，其中編號係根據如Kabat中之EU指數。在一些實施例中，例如在Fc區之情形下，包括下部鉸鏈，其中「下部鉸鏈」一般係指位置226或230。
本發明中尤其受關注的為Fc區。如本文所用，「Fc」或「Fc區」或「Fc結構域」意謂包含抗體恆定區(第一恆定區免疫球蛋白結構域除外)及在一些情況下，鉸鏈之一部分的多肽。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白結構域、IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白結構域、及此等結構域之可撓性鉸鏈N端。對於IgA及IgM，Fc可包括J鏈。對於IgG，Fc結構域包含免疫球蛋白域Cγ2及Cγ3(Cγ2及Cγ3)及Cγ1(Cγ1)與Cγ2(Cγ2)之間的下部鉸鏈區。雖然Fc區之邊界可改變，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為包括殘基C226或P230至其羧基端，其中編號係根據如Kabat中之EU指數。在一些實施例中，如下文更充分地描述，對Fc區進行胺基酸修飾，例如以改變與 一或多種FcγR受體或與FcRn受體之結合。
在一些實施例中，抗體為全長。「全長抗體」在本文中意謂構成抗體之天然生物學形式的結構，包括可變區及恆定區，包括如本文所概述之一或多種修飾。
或者，抗體可為多種結構，包括(但不限於)抗體片段、單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(有時在本文中稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、抗體融合物(有時稱為「抗體共軛物」)及對應地每一者的片段。依賴於使用一組CDR之結構包括在「抗體」之定義內。
在一個實施例中，該抗體為抗體片段。特異性抗體片段包括(但不限於)：(i)由VL、VH、CL及CH1結構域組成之Fab片段，(ii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段，(iii)由單一抗體之VL及VH結構域組成之Fv片段；(iv)由單一可變物組成之dAb片段(Ward等人，1989,Nature 341：544-546，以引用的方式全部併入)，(v)經分離CDR區，(vi)F(ab')2片段，包含兩個連接之Fab片段的二價片段，(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域及VL結構域藉由肽連接子連接，使得兩個結構域締合以形成抗原結合位點(Bird等人，1988,Science 242：423-426，Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883，以引用的方式全部併入)，(viii)雙特異性單鏈Fv(WO 03/11161，以引用的方式併入本文中)及(ix)「雙功能抗體」或「三功能抗體」，藉由基因融合構築之多價或多特異性片段(Tomlinson等人，2000,Methods Enzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448，皆以引用的方式全部併入)。
嵌合及人類化抗體
在一些實施例中，抗體可為來自不同物種之混合物，例如嵌合抗體及/或人類化抗體。亦即，在本發明中，CDR組可與除由本文序 列特定描述之構架區及恆定區以外的構架區及恆定區一起使用。
一般而言，「嵌合抗體」及「人類化抗體」係指組合來自一種以上物種之區的抗體。舉例而言，「嵌合抗體」傳統上包含來自小鼠(或在一些情況下，大鼠)之可變區及來自人類之恆定區。「人類化抗體」一般係指已用人類抗體中發現之序列交換可變結構域構架區的非人類抗體。一般而言，在人類化抗體中，除CDR之外的整個抗體由人類來源之聚核苷酸編碼，或除在其CDR內之外，與此類抗體一致。一些或全部由來源於非人類生物體之核酸編碼的CDR移植至人類抗體可變區之β摺疊構架中以形成抗體，其特異性由移植之CDR決定。此類抗體之形成描述於例如WO 92/11018；Jones,1986,Nature 321：522-525；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536中，其皆以引用的方式全部併入。常常需要使所選受體構架殘基「回復突變」成對應供體殘基以恢復初始移植構築體中損失之親和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，皆以全文引用的方式併入)。人類化抗體最佳亦應包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區，且因此應通常包含人類Fc區。人類化抗體亦可使用具有經基因工程改造之免疫系統的小鼠來產生。Roque等人，2004,Biotechnol.Prog.20：639-654，以全文引用的方式併入。使非人類抗體人類化及重塑之多種技術及方法為此項技術中所熟知(參見Tsurushita及Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)及其中所引用之參考文獻，其皆以全文引用的方式併入)。人類化方法包括(但不限於)以下文獻中所述之方法：Jones等人，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988；Nature 332：323-329；Verhoeyen等人，1988,Science,239：1534-1536；Queen等人，1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86：10029-33；He等人，1998,J.Immunol.160：1029-1035；Carter等人，1992,Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-9；Presta等人，1997,Cancer Res.57(20)：4593-9；Gorman等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4181-4185；O'Connor等人，1998,Protein Eng 11：321-8，其皆以全文引用的方式併入。人類化或降低非人類抗體可變區免疫原性之其他方法可包括表面重修方法，如例如Roguska等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：969-973中所述，其以全文引用的方式併入。在一個實施例中，親本抗體如此項技術中已知已為親和力成熟的。可採用基於結構之方法用於人類化及親和力成熟，如例如USSN 11/004,590中所述。基於選擇之方法可用以使抗體可變區人類化及/或親和力成熟，包括(但不限於)Wu等人，1999,J.Mol.Biol.294：151-162：Baca等人，1997,J.Biol.Chem.272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996,J.Biol.Chem.271(37)：22611-22618；Rader等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8910-8915；Krauss等人，2003,Protein Engineering 16(10)：753-759中所述之方法，其皆以全文引用的方式併入。其他人類化方法可涉及移植僅部分CDR，包括(但不限於)USSN 09/810,510；Tan等人，2002,J.Immunol.169：1119-1125；De Pascalis等人，2002,J.Immunol.169：3076-3084中所述之方法，其皆以全文引用的方式併入。
在一個實施例中，本發明之抗體可為多特異性抗體且尤其雙特異性抗體，亦有時稱為「雙功能抗體」。此等抗體為結合至兩個(或兩個以上)不同抗原或相同抗原上之不同抗原決定基的抗體。雙功能抗體可以此項技術中已知的多種方式來製造(Holliger及Winter,1993,Current Opinion Biotechnol.4：446-449，其以全文引用的方式併入)，例如以化學方式或由雜交融合瘤來製備。
在一個實施例中，抗體為微型抗體。微型抗體為包含接合至CH3 域之scFv的最小化抗體樣蛋白質。Hu等人，1996,Cancer Res.56：3055-3061，以全文引用的方式併入。在一些情況下，scFv可接合至Fc區，且可包括一些或整個鉸鏈區。應注意，不管微型抗體不具有一組完整的CDR的事實，其仍包括在「抗體」之定義內。
本發明之抗體一般為經分離或重組的。「經分離」在用於描述本文所揭示之各種多肽時，意指已自表現細胞或細胞培養物鑑定及分離及/或回收之多肽。因此，經分離抗體意欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合至間質蛋白酶之經分離抗體實質上不含特異性結合除間質蛋白酶以外之抗原的抗體)。因此，「經分離」抗體為發現呈在自然界中正常未發現之形式的抗體(例如非天然存在的)。
在一些實施例中，本發明之抗體為重組蛋白質、經分離蛋白質或實質上純的蛋白質。「經分離」蛋白質無在其天然狀態中與其正常締合之至少一些物質伴隨，例如佔給定樣品總蛋白質之至少約5重量%或至少約50重量%。應瞭解，經分離蛋白質可視情況而定，佔總蛋白質含量之5重量%至99.9重量%。舉例而言，蛋白質可經由使用誘導性啟動子或高表現啟動子而以顯著較高濃度製得，使得蛋白質以增加之濃度水準製得。就重組蛋白質而言，定義包括在此項技術中已知的廣泛多種生物體及/或宿主細胞中產生非天然產生之抗體。通常，經分離多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體。舉例而言，特異性結合至間質蛋白酶之經分離抗體實質上不含特異性結合除間質蛋白酶以外之抗原的抗體。
具有不同特異性之經分離單株抗體可組合在明確定義之組合物中。因此，舉例而言，本發明之抗體可視情況及單獨包括或排除在調配物中，如下文進一步論述。
本發明之抗間質蛋白酶抗體特異性結合間質蛋白酶(例如間質蛋白酶-幹(SEQ ID NO：21-24))。「特異性結合」或「特異性結合至」或「對」特定抗原或抗原決定基「具有特異性」意謂可量測地不同於非特異性相互作用之結合。特異性結合可以例如藉由測定一種分子之結合相較於對照分子(一般為不具結合活性的類似結構分子)之結合來量測。舉例而言，可藉由與類似於標靶之對照分子之競爭測定特異性結合。
針對特定抗原或抗原決定基之特異性結合可例如藉由抗體對抗原或抗原決定基具有至少約10-4M、至少約10-5M、至少約10-6M、至少約10-7M、至少約10-8M、至少約10-9M、或者至少約10-10M、至少約10-11M、至少約10-12M或更大之KD來顯現，其中KD係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。通常，特異性結合抗原之抗體相對於抗原或抗原決定基應具有比對照分子大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或10,000倍以上之KD。然而，在本發明中，當投與本發明之間質蛋白酶抗體之ADC時，重要的是KD足以允許內化且因此使得細胞死亡而無顯著副作用。
另外，針對特定抗原或抗原決定基之特異性結合可例如藉由抗體對抗原或抗原決定基具有相對於對照對抗原決定基大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或10,000倍以上的KA或Ka來顯現，其中KA或Ka係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率。
評估抗體對於間質蛋白酶之結合能力的標準分析可在蛋白質或細胞水準上進行且為此項技術中已知的，包括例如ELISA、西方墨點、RIA、BIAcore®分析及流動式細胞測量術分析。適合之分析在實例中詳細描述。抗體之結合動力學(例如結合親和力)亦可經由此項技術中已知的標準分析，諸如經由Biacore®分析來評定。為評估與Raji或Daudi B細胞腫瘤細胞之結合，可自公開可用之來源(諸如美國菌種 保藏中心(American Type Culture Collection))獲得Raji(ATCC保藏號CCL-86)或Daudi(ATCC保藏號CCL-213)細胞且用於標準分析，諸如流動式細胞測量術分析。
間質蛋白酶抗體
本發明提供特異性結合人類間質蛋白酶(SEQ ID NO：21-24)之幹且在與表現細胞表面上之間質蛋白酶之細胞接觸時內化之間質蛋白酶抗體。此等抗體在本文中稱為「抗間質蛋白酶」抗體，或為易於描述稱為「間質蛋白酶抗體」。
間質蛋白酶抗體可在與細胞，特定言之表現表面上之間質蛋白酶之腫瘤細胞接觸時內化。因此，亦包含藥物共軛物之如本文所定義之間質蛋白酶抗體由腫瘤細胞內化，導致藥物釋放及隨後細胞死亡，允許治療展現間質蛋白酶表現之癌症。內化在此情形中可以若干方式加以量測。在一個實施例中，使用諸如MAbZap及HuZap之標準分析，本發明之間質蛋白酶抗體與諸如本文中概述之細胞株的細胞接觸。技術人員應清楚，MabZap分析表示效應將預期在抗體-藥物共軛物(ADC)之情況下可見。在後一情況中，ADC將經內化，由此將藥物放入細胞中。毒性藥物將具有殺死細胞，亦即殺死靶向癌細胞之能力。熟習此項技術者可容易地接受來自MabZap分析之資料代表ADC分析(Kohls,M及Lappi,D.,[2000]Biotechniques，第28卷，第1號，162-165)。在此等活體外分析實施例中，本發明之間質蛋白酶抗體連同包含毒素之抗間質蛋白酶抗體一起添加；舉例而言間質蛋白酶抗體可為鼠類或人類化的，且抗間質蛋白酶抗體可為抗鼠類或抗人類化的且含有諸如沙泊寧(saporin)之毒素。在形成[本發明之間質蛋白酶抗體]-[抗間質蛋白酶抗體-藥物共軛物]複合物後，該複合物經內化且釋放藥物(例如沙泊寧)，導致細胞死亡。僅在內化後釋放藥物，且因此細胞在不存在內化的情況下保持活力。如下文所概述，在不受理論束縛的 情況下，在治療性應用中，抗間質蛋白酶抗體含有毒素且在內化後，抗體與毒素之間的鍵裂解，釋放毒素且殺死細胞。
另外，間質蛋白酶抗體可在效應細胞，特定言之表現表面上之間質蛋白酶的腫瘤細胞存在下引發ADCC反應。
在一個實施例中，該抗體包含本文所述之特定抗體(例如在本文中稱為「間質蛋白酶_A1」)之重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)或可變區(VR)。因此，在一個實施例中，抗體包含具有展示於SEQ ID NO：1中之序列之抗體A1之重鏈可變(VH)區之CDR1、CDR2及CDR3域，及具有展示於SEQ ID NO：2中之序列之A1之輕鏈可變(VL)區之CDR1、CDR2及CDR3域。
在另一實施例中，抗體包含包括包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR；包含SEQ ID NO：6之第二vhCDR；及包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR的重鏈可變區；及包括包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR；包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR；及包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR的輕鏈可變區。在另一實施例中，本發明抗體結合至人類間質蛋白酶且包括包括選自由SEQ ID NO：1組成之群的胺基酸序列及其保守序列修飾的重鏈可變區。該抗體可進一步包括包括選自由SEQ ID NO：2組成之群的胺基酸序列及其保守序列修飾的輕鏈可變區。
在另一實施例中，本發明之抗體結合至人類間質蛋白酶且包括分別包括SEQ ID NO：1及/或2中所出示之胺基酸序列及其保守序列修飾的重鏈可變區及輕鏈可變區。
包括與以上序列中之任一者具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或99%以上序列一致性之重鏈及輕鏈可變區的經分離抗體亦包括在本發明中。本發明亦意欲包涵在上述值中間之範圍，例如與以上序列中之任一者具 有至少80-85%、85-90%、90-95%或95-100%序列一致性之重鏈及輕鏈可變區。在一個實施例中，該抗體包括包含SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之序列的重鏈可變區。在另一實施例中，該抗體包括包含SEQ ID NO：2或與SEQ ID NO：2具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之序列的輕鏈可變區。在另一實施例中，抗體包含重鏈構架區，該重鏈構架區包含與SEQ ID NO：1之重鏈可變區之構架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之胺基酸序列，其包含SEQ ID NO 29、30、31及32。在另一實施例中，抗體包含輕鏈構架區，該輕鏈構架區包含與SEQ ID NO：2之輕鏈可變區之構架具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之胺基酸序列，其包含SEQ ID NO 33、34、35及36。在一個實施例中，本發明之抗體為包含以下CDR之抗間質蛋白酶抗體(在本文中稱為「A1」抗體)以及含有有限數目之胺基酸變體的變體：
本文亦揭示包含本發明之特定間質蛋白酶抗體(諸如A1)之CDR組的可變重鏈及輕鏈，以及全長重鏈及輕鏈(例如亦包含恆定區)。如熟習此項技術者應瞭解，本發明之CDR組可併入鼠類、人類化或人類恆定區(包括構架區)中。如關於A1及huA1所示，鼠類與人類序列之間的 胺基酸一致性為約90%。因此，本發明提供與本文所揭示之SEQ ID至少約90%-99%一致之可變重鏈及輕鏈，其中90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%皆可用於本發明中。
與本發明之間質蛋白酶抗體結合至相同抗原決定基的抗體
在另一實施例中，本發明提供與本發明之間質蛋白酶單株抗體中之任一者結合至人類間質蛋白酶上之相同抗原決定基的抗體。關於兩個或兩個以上抗體之術語「結合至相同抗原決定基」意指抗體競爭結合至抗原及結合至胺基酸之相同、重疊或涵蓋的連續或非連續區段。熟習此項技術者理解片語「結合至相同抗原決定基」未必意謂抗體結合至完全相同之胺基酸。抗體結合至之確切胺基酸可不同。舉例而言，第一抗體可結合至由第二抗體所結合之胺基酸區段完全涵蓋的胺基酸區段。在另一實例中，第一抗體結合顯著重疊由第二抗體結合之一或多個區段的一或多個胺基酸區段。出於本文之目的，此類抗體視為「結合至相同抗原決定基」。
因此，本發明亦涵蓋結合至間質蛋白酶上之抗原決定基的抗體，該抗原決定基包含由本文所述之特定抗體識別之抗原決定基的全部或一部分(例如相同或重疊區或介於區之間或跨越該區之區)。
本發明亦涵蓋與本文所述之抗體結合相同抗原決定基之抗體及/或與本文所述之抗體競爭結合至人類間質蛋白酶之抗體。可使用常規技術鑑定識別相同抗原決定基或競爭結合之抗體。此類技術包括例如免疫分析，其展示一種抗體阻斷另一抗體結合至目標抗原的能力，亦即競爭性結合分析。競爭性結合在受測試之免疫球蛋白抑制參考抗體與諸如間質蛋白酶之常見抗原之特異性結合的分析中加以測定。已知許多類型之競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物 素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，Mol.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546(1990))；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。此類分析通常涉及使用結合於帶有未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白中任一者的固體表面或細胞之經純化抗原。競爭性抑制係藉由測定在測試免疫球蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測。測試免疫球蛋白通常過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，其將抑制參考抗體與常見抗原之特異性結合至少50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-99%或99%以上。
其他技術包括例如抗原決定基定位方法，諸如抗原：抗體複合物之晶體的x射線分析，其提供抗原決定基之原子解析度。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變變體之結合，其中歸因於抗原序列內胺基酸殘基之修飾的結合損失常常視為抗原決定基組分之指示。此外，亦可使用抗原決定基定位之計算組合方法。此等方法依賴於所關注之抗體親和分離來自組合噬菌體呈現肽庫之特定短肽的能力。肽則視為與用於篩檢肽庫之抗體對應之抗原決定基之定義的榜樣。對於抗原決定基定位，亦已開發已展示定位構形不連續之抗原決定基的計算算法。
在一特定實施例中，抗體與包含分別包含SEQ ID NO：1及2中所出示之胺基酸序列或與其具有至少80%一致性之胺基酸序列的重鏈及/或輕鏈可變區之抗體競爭結合至間質蛋白酶。在另一實施例中，抗體 與包含包含SEQ ID NO：1及2(A1)中所出示之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區的抗體競爭結合至間質蛋白酶。
本發明之其他抗體結合至由本文所述之抗體識別之間質蛋白酶上的抗原決定基。在另一特定實施例中，抗體結合至由包含包含SEQ ID NO：1及2中所出示之胺基酸序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區之抗體識別的間質蛋白酶上之抗原決定基。在另一實施例中，抗體結合至由包含包含SEQ ID NO：1及2(A1)中所出示之胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈可變區的抗體識別之間質蛋白酶上之抗原決定基。
針對間質蛋白酶之單株抗體的表徵
可使用多種已知技術表徵本發明之單株抗體結合至間質蛋白酶。一般而言，抗體最初藉由ELISA表徵。簡言之，微量滴定盤可用含經純化間質蛋白酶之PBS塗佈，且隨後用稀釋於PBS中之諸如牛血清白蛋白(BSA)之不相關蛋白質阻斷。將來自經間質蛋白酶免疫之小鼠之血漿稀釋液添加至各孔且在37℃下培育1-2小時。盤用PBS/Tween 20洗滌且隨後與共軛至鹼性磷酸酶之山羊抗人類IgG Fc特異性多株試劑一起在37℃下培育1小時。在洗滌後，盤用ABTS受質顯影且在OD 405下分析。較佳地，出現最高效價之小鼠將用於融合。
如上所述之ELISA分析可用於篩檢展示與間質蛋白酶免疫原之陽性反應性的抗體，且因此篩檢產生該等抗體之融合瘤。可接著次選殖較佳以高親和力結合至間質蛋白酶之融合瘤且進一步表徵。可接著自保留親本細胞之反應性(藉由ELISA)之各融合瘤選擇一個純系用於製造細胞庫及用於抗體純化。
為純化抗間質蛋白酶抗體，所選融合瘤可在滾瓶、兩公升轉瓶或其他培養系統中生長。可過濾上清液且濃縮，隨後用蛋白質A-瓊脂 糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)親和層析以純化蛋白質。在緩衝液更換為PBS後，可藉由使用1.43消光係數之OD280或較佳藉由濁度分析測定濃度。IgG可藉由凝膠電泳及藉由抗原特異性方法來檢查。
為測定所選抗間質蛋白酶單株抗體是否結合至獨特抗原決定基，可使用市售試劑(Pierce,Rockford,IL)對各抗體進行生物素標記。可使用抗生蛋白鏈菌素標記之探針偵測生物素標記之MAb結合。為測定經純化抗體之同型，可使用此項技術公認之技術進行同型ELISA。舉例而言，微量滴定盤之孔可在4℃下用10μg/ml抗Ig塗佈隔夜。在用5% BSA阻斷後，使盤在環境溫度下與10μg/ml單株抗體或經純化同型對照反應兩小時。可接著使孔與特異性結合探針之IgG1或其他同型反應。顯影滴定盤，且如以上所描述分析。
為測試單株抗體與表現間質蛋白酶之活細胞的結合，可使用流動式細胞測量術。簡言之，使表現膜結合間質蛋白酶之細胞株及/或人類PBMC(在標準生長條件下生長)在4℃下與含有0.1% BSA之含各種濃度之單株抗體之PBS混合1小時。在洗滌後，使該等細胞在與一次抗體染色相同之條件下與經螢光素標記之抗IgG抗體反應。樣品可藉由使用光散射及側向散射特性對單細胞進行閘控之FACScan儀器來分析，且測定經標記抗體之結合。除流式細胞儀分析之外或代替流式細胞儀分析，可使用使用螢光顯微鏡術之替代性分析。細胞可完全如上所述染色且由螢光顯微鏡術進行檢驗。該方法允許目測個別細胞，但可視抗原密度而使敏感性減小。
可藉由西方墨點法進一步測試抗間質蛋白酶IgG與間質蛋白酶抗原之反應性。簡言之，可由表現間質蛋白酶之細胞製備細胞提取物且進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳後，將該等經分離之抗原轉移至硝化纖維素膜，以20%小鼠血清阻斷，且以待測試之單株抗體探查。可使用抗IgG鹼性磷酸酶偵測IgG結合且藉由BCIP/NBT受 質錠劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)顯影。
用於分析各種抗間質蛋白酶抗體之結合親和力、交叉反應性及結合動力學的方法包括此項技術中已知的標準分析，例如使用BiacoreTM 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)之BiacoreTM表面電漿子共振(SPR)分析。
在一個實施例中，抗體特異性地結合至包含SEQ ID NO：26或功能部分，諸如幹(SEQ ID NO：21-24)之人類間質蛋白酶。較佳地，本發明之抗體以高親和力結合至人類間質蛋白酶。
較佳地，本發明抗體結合至具有5×10-8M或5×10-8M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有2×10-8M或2×10-8M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有5×10-9M或5×10-9M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有4×10-9M或4×10-9M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有3×10-9M或3×10-9M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有2×10-9M或2×10-9M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有1×10-9M或1×10-9M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質、結合至具有5×10-10M或5×10-10M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質或結合至具有1×10-10M或1×10-10M以下之KD之間質蛋白酶蛋白質。
在一個實施例中，本發明之抗體與本文所述之特定抗間質蛋白酶抗體(例如_A1)競爭(例如交叉競爭)結合至間質蛋白酶。此類競爭抗體可基於其在標準間質蛋白酶結合分析中競爭性抑制一或多種mAb結合至間質蛋白酶之能力來鑑定。舉例而言，可使用標準ELISA分析，其中將重組人類間質蛋白酶蛋白質固定於滴定盤上，螢光標記一種抗體且評估未標記之抗體競爭斷開經標記抗體之結合的能力。或者或另外，可使用BIAcore分析來評估抗體交叉競爭之能力。測試抗體抑制本發明之抗間質蛋白酶抗體與人類間質蛋白酶結合之能力表明測試抗體可與抗體競爭結合至人類間質蛋白酶。
在一個實施例中，競爭抗體為與本文所述之特定抗間質蛋白酶單株抗體(例如A1)結合至人類間質蛋白酶上之相同抗原決定基之抗體。諸如x射線結晶及2維核磁共振之標準抗原決定基定位技術可用於測定抗體是否與參考抗體結合至相同抗原決定基(參見例如Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編(1996))。
在一個實施例中，競爭結合至間質蛋白酶及/或結合至人類間質蛋白酶上之相同抗原決定基的抗體為人類抗體。該等人類單株抗體可如實例中所述來製備及分離。
一旦已分離具有本文所述之所需特性之單一、原型抗間質蛋白酶mAb，藉由使用此項技術已知之方法產生具有類似特性(例如具有相同抗原決定基)之其他mAb為簡單明瞭的。舉例而言，小鼠可經如本文所述之間質蛋白酶免疫，產生融合瘤，且就與原型mAb競爭結合至間質蛋白酶之能力篩檢所得mAb。小鼠亦可經含有原型mAb所結合之抗原決定基的間質蛋白酶的較小片段免疫。抗原決定基可藉由例如篩檢與跨越間質蛋白酶之一系列重疊肽的結合來定位。或者，可使用Jespers等人，Biotechnology 12：899,1994之方法支配具有與原型mAb相同的抗原決定基且因此具有類似特性之mAb的選擇。使用噬菌體呈現，首先使原型抗體之重鏈與(較佳人類)輕鏈之譜系配對以選擇結合間質蛋白酶之mAb，且隨後使新輕鏈與(較佳人類)重鏈之譜系配對以選擇具有與原型mAb相同的抗原決定基的(較佳人類)結合間質蛋白酶之mAb。或者，可藉由編碼抗體重鏈及輕鏈之cDNA的誘變法獲得原型mAb之變體。
可進行例如如Champe等人(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394中所述之抗原決定基定位以測定抗體是否結合所關注之抗原決定基。人類間質蛋白酶中胺基酸殘基之如Cunningham及Wells(1989)Science 244：1081-1085所述之「丙胺酸掃描誘變法」或一些其他形式的點誘變法亦可用於測定本發明之抗間質蛋白酶抗體的功能性抗原決定基。然而，誘變法研究亦可展示對間質蛋白酶之整體三維結構關鍵單不直接涉及抗體-抗原接觸之胺基酸殘基，且因此可能需要證實使用此方法測定之功能抗原決定基的其他方法。
由特異性抗體結合之抗原決定基亦可藉由評估抗體與包含人類間質蛋白酶片段之肽的結合來測定。可合成一系列涵蓋間質蛋白酶序列之重疊肽且例如在直接ELISA、競爭性ELISA(其中評估肽阻止抗體與結合至微量滴定盤之孔的間質蛋白酶結合的能力)或於晶片上就結合進行篩檢。此類肽篩檢方法可能無法偵測一些不連續的功能性抗原決定基，亦即涉及胺基酸殘基沿著間質蛋白酶多肽鏈之一級序列為不相連的功能性抗原決定基。
亦可藉由結構方法，諸如x射線晶體結構測定(例如WO2005/044853)、分子模擬及核磁共振(NMR)光譜法，包括在游離時及與相關抗體結合於複合物中時的間質蛋白酶中之不穩定醯胺氫之H-D交換速率之NMR測定來測定與本發明之抗體結合之抗原決定基(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31,11335-11347；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32,6884-6891)。
關於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中已知方法中之任一者來實現(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50：339-350；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189：1-23)，包括微批量法(例如Chayen(1997)Structure 5：1269-1274)、懸滴蒸氣擴散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300-6303)、播晶種及透析。需要使用具有至少約1mg/mL及較佳約10mg/mL至約20mg/mL之濃度的蛋白質製劑。結晶可最佳在含有濃度範圍介於約10%至約30%(w/v)之聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量範圍介於約1000至約20,000Da)，較 佳約5000至約7000Da，更佳約6000Da之沈澱劑溶液中實現。亦可能需要包括蛋白質穩定劑，例如甘油，其濃度介於約0.5%至約20%範圍內。沈澱劑溶液中亦可能需要適合之鹽，諸如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉，濃度範圍較佳介於約1mM至約1000mM。沈澱劑較佳緩衝至約3.0至約5.0、較佳約4.0之pH。適用於沈澱劑溶液中之特定緩衝液可變化且為此項技術中熟知的(Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。適用之緩衝劑之實例包括(但不限於)HEPES、Tris、MES及乙酸鹽。晶體可在各種溫度下生長，包括2℃、4℃、8℃及26℃。
抗體：抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術研究且可使用諸如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.發行；參見例如Blundell及Johnson(1985)Meth.Enzymol.114及115，H.W.Wyckoff等人編，Academic Press；美國專利申請公開案第2004/0014194號)及BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49：37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423,Carter及Sweet編.；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56：1313-1323)之電腦軟體改進，該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
如本文所述之抗體競爭分析可用於測定抗體是否與另一抗體「結合至相同抗原決定基」。通常，已知與抗原決定基相互作用之抗體在第二抗體過量且首先使所有位點飽和的條件下，由第二抗體競爭50%或50%以上、60%或60%以上、70%或70%以上，諸如70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上指示該等抗體「結合至相同抗原決定基」。為評估兩種抗體之間的競爭水準，可使用抗體之放射免疫分析或使用其他標記之分析。舉例而言，間質蛋白酶抗原可與飽和量的與標記化合物(例如3H、125I、生物素或銣)共軛之第一抗間質蛋白酶抗 體或其抗原結合片段在相同量之第二未標記抗間質蛋白酶抗體存在下一起培育。接著評估在未標記之阻斷抗體存在下結合至抗原之經標記抗體之量，且與在不存在未標記之阻斷抗體的情況下的結合相比。競爭係藉由在未標記之阻斷抗體存在下，與不存在阻斷抗體相比之結合信號的變化百分比來測定。因此，若在阻斷抗體存在下經標記抗體之結合與無阻斷抗體存在下之結合相比存在50%抑制，則在兩種抗體之間存在50%之競爭。因此，提及第一與第二抗體之間50%或50%以上、60%或60%以上、70%或70%以上，諸如70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之競爭意指第一抗體抑制第二抗體(或反之亦然)與抗原之結合達50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上(與無第一抗體存在下抗原與第二抗體之結合相比)。因此，第一抗體與抗原之結合由第二抗體抑制50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上表明該兩種抗體結合至相同抗原決定基。
抗體修飾
本發明另外亦提供變異抗體，有時稱為「抗體衍生物」或「抗體類似物」。亦即存在多種可對本發明抗體進行之修飾，包括(但不限於)CDR中之胺基酸修飾(親和力成熟)、Fc區中之胺基酸修飾、糖基化變體、其他類型之共價修飾(例如用於連接藥物共軛物等。
「變體」在本文中意指藉助於至少一個胺基酸修飾而與親本多肽不同的多肽序列。在一個實施例中，親本多肽為SEQ ID NO：1及2中所列之全長可變重鏈及/或輕鏈。胺基酸修飾可包括取代、插入及缺失，在多數情況下前者較佳。
一般而言，如本文所述，變體可包括任意數目之修飾，只要抗 體之功能仍存在。因此，舉例而言，本發明之變異抗體應仍特異性結合至人類間質蛋白酶。類似地，若例如產生具有Fc區之胺基酸變體，則變異抗體應維持抗體之特定應用或適應症所需之受體結合功能。
在此情況下，可在列出的抗體CDR序列、構架區或Fc區中製得「變體」。
然而，一般使用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代，因為目標常常為用最小數目之修飾改變功能。在一些情況下，存在1至5個修飾(例如個別胺基酸取代、插入或缺失)，在許多實施例中，亦發現使用1-2、1-3及1-4個。修飾之數目可視所修飾區之尺寸而定；舉例而言，CDR區中一般需要較少修飾。然而，如本文所示，本文中之A1之CDR為類似的，使得可進行多種胺基酸變化及保留結合。
應注意，許多胺基酸修飾可在功能結構域內：例如，可能需要在野生型或經工程改造之蛋白質的Fc區中具有1-5個修飾，以及在例如Fv區中具有1至5個修飾。變異多肽序列將較佳與親本序列(例如可變區、恆定區及/或重鏈及輕鏈序列A1)具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。應注意，視序列之尺寸而定，一致性百分比應視胺基酸之數目而定。
對於在VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之可變區修飾而言，可進行定點誘變法或PCR介導之誘變法以引入突變且可在如本文所述且提供於實例中之活體外或活體內分析中評估對抗體結合或其他相關功能屬性之作用。較佳引入保守修飾(如本文中所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失，但較佳為取代。此外，通常CDR區內不大於1個、2個、3個、4個或5個殘基得以改變。
因此，在另一實施例中，本發明提供分離之抗間質蛋白酶單株 抗體，或其抗原結合部分，其包含：(a)包含選自由SEQ ID NO：5組成之群的胺基酸序列或相比於SEQ ID NO：5具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VH CDR1區；(b)包含選自由SEQ ID NO：6組成之群的胺基酸序列或相比於SEQ ID NO：6具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VH CDR2區；(c)包含選自由SEQ ID NO：7組成之群的胺基酸序列或相比於SEQ ID NO：7具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VH CDR3區；(d)包含選自由SEQ ID NO：8組成之群的胺基酸序列或相比於SEQ ID NO：8具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR1區；(e)包含選自由SEQ ID NO：9組成之群的胺基酸序列或相比於SEQ ID NO：9具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR2區；及(f)包含選自由SEQ ID NO：10組成之群的胺基酸序列或相比於SEQ ID NO：10具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR3區。
本文中之「胺基酸取代」或「取代」意謂親本多肽序列中之特定位置處之胺基酸經另一胺基酸置換。舉例而言，取代S100A係指在位置100處之絲胺酸經丙胺酸置換之變異多肽。如本文所用之「胺基酸插入」或「插入」意指在親本多肽序列之特定位置添加胺基酸。如本文所用之「胺基酸缺失」或「缺失」意指移除在親本多肽序列中之特定位置處之胺基酸。
如本文所用之「親本多肽」、「親本蛋白質」、「前驅多肽」或「前驅蛋白質」意指隨後經修飾以產生變體之未經修飾之多肽。一般而言，本文中之親本多肽為A1)。因此，如本文所用之「親本抗體」意指經修飾以產生變異抗體之抗體。
本文之「野生型」或「WT」或「天然」意指在自然界中發現之胺基酸序列或核苷酸序列，包括對偶基因變異。WT蛋白質、多肽、抗體、免疫球蛋白、IgG等具有未經有意修飾之胺基酸序列或核苷酸序列。
本文之「變異Fc區」意指藉助於至少一個胺基酸修飾而與野生型Fc序列不同的Fc序列。Fc變體可指Fc多肽本身、包含Fc變異多肽之組合物或胺基酸序列。
在一些實施例中，在抗體(A1中之任一者)之一或多個CDR中進行一或多個胺基酸修飾。一般，在任意單個CDR中僅取代1或2或3個胺基酸，且在一組CDR內一般進行不超過4、5、6、7、8、9或10個變化。然而，應瞭解，任意CDR中無取代、1、2或3個取代之任何組合可獨立地及視情況與任何其他取代組合。在一些情況下，CDR中之胺基酸修飾稱為「親和力成熟」。「親和力成熟」抗體為在一或多個CDR中具有一或多個改變，導致與不具有彼等改變之親本抗體相比抗體對抗原之親和力改良的抗體。在一些情況下，雖然稀少，但可能需要降低抗體對其抗原之親和力，但此舉一般並非較佳。
可進行親和力成熟化作用，使抗體對抗原之結合親和力提高至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%或150%以上，或比「親本」抗體提高1、2、3、4至5倍。較佳親和力成熟抗體對標靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳之親和力。親和力成熟抗體係藉由已知程序產生。參見例如，Marks等人，1992,Biotechnology 10：779-783，其描述藉由可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)結構域改組之親和力成熟化。CDR及/或構架殘基之隨機誘變法描述於例如Barbas等人1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Shier等人，1995,Gene 169：147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol. 155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.226：889-896中。
或者，可在「靜默」(例如不顯著改變抗體對抗原之親和力)的本發明抗體之一或多個CDR中進行胺基酸修飾。可出於許多原因進行此等修飾，包括使表現最佳化(如同可對編碼本發明抗體之核酸進行)。
因此，變異CDR及變異抗體包括在本發明之CDR及抗體的定義內；亦即，本發明之抗體可包括A1之一或多個CDR中之胺基酸修飾。此外，如下文所概述，亦可在CDR外之任何區域(包括如本文所述之構架區及恆定區)中獨立地及視情況進行胺基酸修飾。
在一些實施例中，本發明之抗間質蛋白酶抗體由變異Fc結構域組成。如此項技術中已知，抗體之Fc區與許多Fc受體及配位體相互作用，賦予一系列重要的功能性能力，稱為效應功能。此等Fc受體包括(但不限於)(在人類中)FcγRI(CD64)，包括同功異型物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同功異型物FcγRIIa(包括異型H131及R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc；及FcγRIII(CD16)，包括同功異型物FcγRIIIa(包括異型V158及F158，與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)相關)及FcγRIIIb(包括異型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)、FcRn(新生兒受體)、C1q(參與補體依賴性細胞毒性(CDC)之補體蛋白質)及FcRn(參與血清半衰期之新生兒受體)。可在一或多個位置處進行適合之修飾，如例如美國專利申請案11/841,654及其中所引用之參考文獻、US 2004/013210、US 2005/0054832、US 2006/0024298、US 2006/0121032、US 2006/0235208、US 2007/0148170、USSN 12/341,769、美國專利第6,737,056號、美國專利第7,670,600號、美國專利第6,086,875號中所大體概述，其皆以全文引用之方式明確地併入，且特別指提高與Fc受體之結合性的特定胺基酸取代法。
除以上概述之修飾之外，可進行其他修飾。舉例而言，可藉由併入連接VH及VL域之二硫橋鍵使分子穩定(Reiter等人，1996,Nature Biotech.14：1239-1245，以全文引用的方式併入)。
此外，在半胱胺酸處之修飾尤其適用於抗體-藥物共軛物(ADC)應用，其進一步描述如下。在一些實施例中，抗體之恆定區可經工程改造以含有尤其具有「硫醇反應性」之一或多個半胱胺酸，以便允許以更具特異性及控制之方式安置藥物部分體。參見例如美國專利第7,521,541號，其以全文引用的方式併入本文中。
此外，存在多種可如下文所概述進行之抗體的共價修飾。
抗體之共價修飾包括在本發明之範疇內，且一般(但未必總是)在轉譯後進行。舉例而言，抗體之若干類型之共價修飾藉由使抗體之特異性胺基酸殘基與能夠與所選擇的側鏈或N端或C端殘基反應之有機衍生試劑反應引入分子中。
最通常使半胱胺醯基殘基與α-鹵基乙酸酯(及相應胺)(諸如氯乙酸、氯乙醯胺)反應以得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦可藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑及其類似物反應而衍生。
組胺醯基殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍生化，因為此試劑對組胺醯基側鏈具相對特異性。對溴苯醯甲基溴亦為適用的；反應較佳在pH 6.0下於0.1M二甲胂酸鈉中進行。
使離胺醯基及胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用此等試劑進行衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他用於衍生含有α-胺基之殘基之合適試劑包括亞胺基酯類，諸如甲基吡啶醯亞胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氫化氯 (chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮及與乙醛酸酯之轉胺酶催化的反應。
精胺醯基殘基係藉由與一種或若干種習知試劑(其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮)反應而進行修飾。由於胍官能基具有高pKa，因此精胺酸殘基之衍生化需要反應在鹼性條件下進行。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可對酪胺醯基殘基進行特定修飾，其中尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。酪胺醯基殘基使用125I或131I碘化以製備用於放射免疫分析之經標記蛋白質，上述氯胺T方法為適合的。
羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N--R')反應而選擇性地修飾，其中R及R'為不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。
用雙官能劑衍生化適用於使抗體交聯至除下文所述之方法之外的多種方法所用的不溶於水的支撐基質或表面。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮水楊酸之酯)、同雙官能亞胺基酯(包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯)及雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺-1,8-辛烷)。諸如3-[(對疊氮苯基)二硫代]丙醯亞胺甲酯之衍生劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間物。或者，採用不溶於水的反應性基質，諸如美國專利第3,969,287號；第3,691,016號；第4,195,128號；第4,247,642號；第4,229,537號及第4,330,440號中所述之賽諾莫根溴化物(cynomolgusogen bromide)活化 之碳水化合物及反應性受質進行蛋白質固定，該等專利皆以全文引用的方式併入。
常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基脫去醯胺基以分別形成相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，在適度酸性條件下將該等殘基脫醯胺化。此等殘基之任一形式均屬於本發明範疇內。
其他修飾包括：脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco，第79-86頁[1983]，以全文引用的方式併入)、N末端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。
此外，如熟習此項技術者應瞭解，標記(包括螢光、酶促、磁性、放射性等皆可添加至抗體(以及本發明之其他組合物)。
雙特異性分子
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之抗hTSLP抗體或其片段之雙特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合部分可衍生成例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配位體)之另一功能分子或與其連接以產生與至少兩個不同結合位點或靶分子結合之雙特異性分子。本發明之抗體可實際上衍生成或連接至一個以上其他功能分子以產生與兩個以上不同結合位點及/或目標分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」所涵蓋。為了產生本發明之雙特異性分子，可使本發明抗體(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方法)功能性連接至一或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑，從而產生雙特異性分子。
因此，本發明包括包含至少一種對hTSLP之第一結合特異性及對第二靶抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。在本發明之一 個實施例中，第二目標抗原決定基為Fc受體，例如人類FcγRI(CD64)或人類Fcα受體(CD89)。因此，本發明包括能夠結合至表現FcγR或FcαR之效應細胞(例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN)及表現間質蛋白酶之目標細胞的雙特異性分子。此等雙特異性分子靶向表現間質蛋白酶之細胞至效應細胞且觸發Fc受體介導之效應細胞活性，諸如表現間質蛋白酶之細胞的吞噬作用、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、細胞激素釋放或超氧陰離子產生。
在本發明之一實施例中(其中雙特異性分子為多特異性的)，分子可進一步包括除抗Fc結合特異性及抗間質蛋白酶結合特異性以外的第三結合特異性。在一實施例中，該第三結合特異性為一抗-增強因子(EF)部分，舉例而言一結合至參與細胞毒素活性之表面蛋白質且藉此增加抵抗該目標細胞之免疫反應的分子。該“抗強化因子部分”可為與給定分子(例如抗原或受體)結合，且由此使得結合決定子對Fc受體或靶細胞抗原之效應增強的抗體、功能抗體片段或配位體。該「抗強化因子部分」可結合Fc受體或靶細胞抗原。或者，該抗強化因子部分可結合至一不同於第一及第二結合特異性所結合之實體的實體。舉例而言，該抗強化因子部分可結合細胞毒性T-細胞(例如經由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他使得抗靶細胞之免疫反應增加的免疫細胞)。
在一實施例中，本發明之雙特異性分子包含作為結合特異性之至少一個抗體或其抗體片段，包括(例如)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb或單鏈Fv。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或如美國專利第4,946,778號中所述之單鏈構築體，其內容以引用的方式明確併入。
在一實施例中，由單株抗體提供對Fc受體之結合特異性，該單株抗體之結合不受人類免疫球蛋白G(IgG)阻斷。如本文所用，術語 「IgG受體」係指位於染色體1上之八個γ-鏈基因中之任一者。此等基因編碼總共十二個跨膜或可溶受體同功異型物，其分組成三個Fcγ受體類別：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)。在一個較佳實施例中，Fcγ受體為人類高親和力FcγRI。人類FcγRI為72kDa分子，其展示對單體IgG之高親和力(108-109M-1)。
某些較佳抗Fcγ單株抗體之產生及表徵描述於PCT公開案WO 88/00052及美國專利第4,954,617號中，其教示內容以引用的方式全部併入本文中。此等抗體在不同於受體之Fcγ結合位點的位點處結合至FcγRI、FcγRII或FcγRIII之抗原決定基，且因此其結合實質上不受生理含量之IgG阻斷。適用於本發明之特異性抗FcγRI抗體為mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62及mAb 197。產生mAb 32之融合瘤獲自美國菌種保藏中心，ATCC寄存編號HB9469。在其他實施例中，抗Fcγ受體抗體為人源化形式之單株抗體22(H22)。H22抗體之產生及表徵描述於Graziano,R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002及PCT公開案WO 94/10332中。產生H22抗體之細胞株以名稱HA022CL1寄存在美國菌種保藏中心且具有寄存編號CRL 11177。
在其他較佳實施例中，由結合至例如Fc-α受體[FcαRI(CD89)]之人類IgA受體之抗體提供對Fc受體之結合特異性，其結合較佳不受人類免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術語「IgA受體」意欲包括位於染色體19上之一種α-基因的基因產物(FcαRI)。已知此基因編碼若干55至110kDa之替代性剪接的跨膜同功異型物。FcαRI(CD89)組成性表現於單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性及嗜中性粒細胞上，但未表現於非效應細胞群體。FcαRI對於IgA1及IgA2二者具有介質親和力(5×107M-1)，其在暴露於諸如G-CSF或GM-CSF之細胞激素時增加[Morton,H.C.等人(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440]。已描述鑑別為A3、A59、A62及A77之四種FcαRI特異性單株抗體，其結合IgA配位 體結合域外部之FcαRI[Monteiro,R.C.等人(1992)J.Immunol.148：1764]。
FcαRI及FcγRI為用於本發明之雙特異性分子的較佳觸發受體，因為其(1)主要表現於例如單核細胞、PMN、巨噬細胞及樹突狀細胞之免疫效應細胞上；(2)以高含量表現(例如每一細胞5,000-100,000)；(3)細胞毒素活性(例如ADCC、吞噬作用)之介體；及(4)介導靶向其之抗原(包括自體抗原)之增強的抗原呈現。
可用於本發明之雙特異性分子中之抗體為鼠類、人類、嵌合及人類化單株抗體。
本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法共軛組成結合特異物，例如抗FcR及抗間質蛋白酶結合特異物來製備。舉例而言，各雙特異性分子之結合特異物可分別產生，接著彼此共軛。當結合特異物為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、S-乙醯基-硫代乙酸N-丁二醯亞胺酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺酸基-SMCC)[參見例如Karpovsky等人(1984)J.Exp。Med.160：1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648]。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375中所述之彼等方法。較佳共軛劑為SATA及磺酸基-SMCC，二者均購自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)]。
當結合特異性為抗體時，其可經由兩條重鏈之C末端鉸鏈區之氫硫基鍵結共軛。在一尤其較佳實施例中，在共軛前，修飾該鉸鏈區以含有奇數個氫硫基殘基、較佳一個。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法在該雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白時尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利第5,260,203號；第5,455,030號；第4,881,175號；第5,132,405號；第5,091,513號；第5,476,786號；第5,013,653號；第5,258,498號及第5,482,858號中，該等專利皆以引用的方式明確地併入本文中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來證實。此等分析中之每一者一般藉由採用對相關複合物具特異性之經標記試劑(例如抗體)來偵測特定相關蛋白質-抗體複合物的存在。舉例而言，FcR-抗體複合物可使用例如識別抗體-FcR複合物且與其特異性結合之酶聯抗體或抗體片段來偵測。或者，該等複合物可使用多種其他免疫分析中之任一者來偵測。舉例而言，抗體可經放射性標記並用於放射性免疫分析(RIA)(例如，參見Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,1986年3月，其以引用的方式併入本文中)。可藉由諸如使用γ計數器或閃爍計數器之方法或藉由自動射線攝影術來偵測放射性同位素。
糖基化
另一類型之共價修飾為糖基化之改變。在一些實施例中，本文所揭示之抗體可經修飾以包括一或多種經工程改造之糖型。如本文所用之「經工程改造之糖型」意指共價連接至抗體之碳水化合物組分，其中該碳水化合物組分在化學上與親本抗體之碳水化合物組分不同。 經工程改造之糖型可用於多種目的，包括(但不限於)增強或降低效應功能。舉例而言，可製備去糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原之親和力。可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點實現該等碳水化合物修飾。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，其消除一或多個可變區構架糖基化位點以由此消除彼位點處之糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。此類方法更詳細地描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中，且可藉由移除位置297處之天冬醯胺來實現。
經工程改造之糖型的較佳形式為去海藻糖基化，其已展示與ADCC功能增加相關，大概經由與FcγRIIIa受體之更緊密結合。在此情形中，「去海藻糖基化」意指宿主細胞中產生之大部分抗體實質上不含海藻糖，例如90-95-98%所產生之抗體不具有可觀的海藻糖作為抗體之碳水化合物部分的組分(一般連接在Fc區之N297)。功能確定之去海藻糖基化抗體一般對FcγRIIIa受體展現至少50%或50%以上之親和力。
經工程改造之糖型可藉由多種此項技術中已知之方法產生(Umaña等人，1999,Nat Biotechnol 17：176-180；Davies等人，2001,Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人，2002,J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkaw等人，2003,J Biol Chem 278：3466-3473；US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1全部以全文引用的方式併入；(POTELLIGENT®技術[Biowa,Inc.,Princeton,NJ]；GlycoMAb®糖基化工程改造技術[Glycart Biotechnology AG,Zürich,Switzerland])。許多此等技術基於控制共價連接至Fc區之海藻糖基化及/或平分型寡糖的含量，例如藉由在經工程改造或以其他方式改造之各種生物體或細胞株(例如Lec- 13 CHO細胞或大鼠融合瘤YB2/0細胞中表現IgG，藉由調控參與糖基化路徑之酶(例如FUT8[α1,6-海藻糖基轉移酶]及/或β1-4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III[GnTIII])，或藉由在IgG已表現後修飾碳水化合物。舉例而言，Seattle Genetics之「經糖工程改造之抗體」或「SEA技術」藉由在產生期間添加經修飾之醣類抑制海藻糖基化而起作用；參見例如US/2009/0317869，其以全文引用的方式併入本文中。「經工程改造之糖型」通常指與在無糖基化技術的情況下製得之抗體相比不同的碳水化合物或寡醣；因此抗體可包括經工程改造之糖型。
或者，經工程改造之糖型可指包含不同碳水化合物或寡醣之IgG變體。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促結合至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。為此，此等三肽序列中之任一者在抗體中的存在產生潛在性糖基化位點。經O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸連接，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸，但該羥基胺基酸最通常為絲胺酸或蘇胺酸。
在抗體中添加糖基化位點便利地藉由改變胺基酸序列，以使其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(針對N-連接型糖基化位點)。亦可藉由向原始拮抗劑序列加入一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始拮抗劑序列來進行改變(對於O連接糖基化部位)。出於簡易性，抗體胺基酸序列較佳經由在DNA水準之變化來改變，尤其藉由使編碼目標多肽之DNA在預選鹼基處突變以 便產生將轉譯成所需胺基酸之密碼子。
增加抗體上碳水化合物部分之數目的另一方式為藉由醣苷與蛋白質之化學或酶促偶合。此等程序為有利的，因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N-連接型及O-連接型糖基化。視所用偶合模式而定，可將該(等)糖連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基諸如半胱胺酸之彼等巰基、(d)游離羥基諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等羥基、(e)芳族殘基諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基、或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306頁中，其皆以全文引用的方式併入。
移除起始抗體上存在之碳水化合物部分(例如轉譯後)可以化學或酶促方式來實現。化學去糖基化作用需要將該抗體暴露至化合物三氟甲磺酸、或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的絕大多數或所有糖之裂解，而使抗體完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.118：131所述，其皆以全文引用的方式併入。多肽上之碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用多種胞內及胞外醣苷酶來實現，如Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350所述，其以全文引用的方式併入，包括如此項技術中已知使用海藻糖苷酶移除海藻糖殘基。在潛在性糖基化位點處之糖基化可藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)來防止，如Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105所述，其以全文引用的方式併入。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵之形成。
抗體之另一類型之共價修飾包含使抗體連接至各種非蛋白質聚合物，包括(但不限於)各種多元醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧伸烷基，以例如Nektar Therapeutics之2005-2006 PEG目錄(可在Nektar 網站獲得)、美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所出示之方式，其皆以全文引用的方式併入。此外，如此項技術中已知，胺基酸取代可在抗體內之不同位置進行以有助於諸如PEG之聚合物的添加。參見例如美國公開案第2005/0114037A1號，其以全文引用的方式併入。
在其他實施例中，例如在出於診斷性或偵測目的使用本發明之抗體時，抗體可包含標記。「經標記」在本文中意指化合物連接有至少一個元素、同位素或化合物以便能夠偵測該化合物。一般而言，標記分成三個類別：a)同位素標記，其可為放射性同位素或重同位素；b)磁性、電、熱；及c)彩色或發光染料；但標記亦包括酶及諸如磁性粒子之粒子。較佳標記包括(但不限於)螢光鑭系元素複合物(包括銪及鋱之彼等絡合物)，且螢光標記包括(但不限於)量子點、螢光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明、伊紅(eosin)、赤藻紅(erythrosin)、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀綠(Malacite green)、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、級聯藍(Cascade Blue)、德克薩斯紅(Texas Red)、Alexa染料、Cy染料及Richard P.Haugland之Molecular Probes Handbook第6版中所描述之其他標記，藉此以引用的方式明確地併入。
抗體-藥物共軛物
在一些實施例中，本發明之抗間質蛋白酶抗體與藥物結合以形成抗體-藥物共軛物(ADC)。一般而言，ADC用於腫瘤學應用，其中使用抗體-藥物共軛物進行細胞毒性劑或細胞生長抑制劑之局部傳遞允許將藥物部分靶向傳遞至腫瘤，其可使得功效較高、毒性較低等。此技術之概述提供於Ducry等人，Bioconjugate Chem.,21：5-13(2010)，Carter等人，Cancer J.14(3)：154(2008)及Senter,Current Opin.Chem.Biol.13：235-244(2009)中，其皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，本發明提供與藥物共軛之抗間質蛋白酶抗體。一般而言，結合係藉由共價連接至抗體來進行，如下文進一步描述，且一般依賴於連接基團，常常為肽鍵(其如下所述，可經設計以在目標位點處對由蛋白酶裂解敏感或不敏感)。此外，如上所述，連接子-藥物單元(LU-D)之鍵聯可藉由連接至抗體內之半胱胺酸來進行。如熟習此項技術者應瞭解，每一抗體之藥物部分之數目可變化，視反應條件而定，且可在1：1至10：1藥物：抗體之範圍內變化。如熟習此項技術者應瞭解，實際數目為平均值。
因此，本發明提供與藥物共軛之抗間質蛋白酶抗體。如下所述，ADC之藥物可為任意數目之藥劑，提供包括(但不限於)細胞毒性劑，諸如化學治療劑、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性共軛物)。在其他實施例中，本發明另外提供使用ADC之方法。
用於本發明之藥物包括細胞毒性藥物，尤其用於癌症療法之彼等細胞毒性藥物。此類藥物一般包括DNA損傷劑、抗代謝物、天然產物及其類似物。例示性類別之細胞毒性劑包括酶抑制劑，諸如二氫葉酸還原酶抑制劑及胸腺嘧啶核苷合成酶抑制劑、DNA嵌入劑、DNA裂解劑、拓撲異構酶抑制劑、蒽環黴素家族之藥物、長春花藥物、絲裂黴素(mitomycin)、博來黴素(bleomycin)、細胞毒性核苷、喋啶家族之藥物、二炔烯類(diynenes)、足葉草毒素(podophyllotoxin)、海兔毒素(dolastatin)、類美登素(maytansinoid)、分化誘導劑及紫杉醇(taxol)。
此等類別之成員包括例如紫杉醇、甲胺喋呤(methotrexate)、甲胺喋呤(methopterin)、二氯甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、美法侖(melphalan)、環氧長春鹼(leurosine)、洛諾德英(leurosideine)、放線菌素(actinomycin)、道諾黴素 (daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、絲裂黴素C、絲裂黴素A、洋紅黴素(caminomycin)、胺基喋呤、他利黴素(tallysomycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)及鬼臼毒素衍生物，諸如依託泊苷(etoposide)或磷酸依託泊苷、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、包括紫杉醇、多西紫杉醇(taxotere)之紫杉烷(taxane)、視黃酸、丁酸、N8-乙醯基亞精胺、喜樹鹼(camptothecin)、卡奇黴素(calicheamicin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)、烯-二炔、倍癌黴素A(duocarmycin A)、倍癌黴素SA、卡奇黴素(calicheamicin)、喜樹鹼、類美登素(包括DMI)、單甲基阿瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)、單甲基阿瑞他汀F(MMAF)及類美登素(DM4)及其類似物。
毒素可用作抗體-毒素共軛物且包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及卡奇黴素(Lode等人(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制發揮其細胞毒性及細胞生長抑制效應。
涵蓋抗間質蛋白酶抗體及諸如類美登素、海兔毒素、哈米特林、奧瑞他汀、單端孢黴烯族毒素、卡奇黴素及CC1065之一或多種小分子毒素之共軛物及具有毒素活性之此等毒素之衍生物。在一較佳實施例中，毒素為奧瑞他汀，更佳MMAE或MMAF。
共軛物之實例
藉由本發明之抗體Z(SH)m(其中m為1、2、3、4或5)製得之共軛 物之實例顯示如下。共軛物A 1至A 6及A 8至A 15為可裂解基團C包含肽鍵之共軛物。共軛物A 7及A 16為可裂解基團C為腙之共軛物。共軛物A 17及A 18為可裂解基團C為二硫化物之共軛物。在共軛物A 1至A 2、A 5至A 9、A 11至A 14及A 16中，搭配分子D為其中連接有前藥部分之細胞毒素。共軛物A 10、A 11、A 14及A 15為具有自分解部分(在共軛物A10之情況下，具有兩個)之共軛物。共軛物一1至A 8及A 10至A 18說明具有模組化片段之間隔子的用途。
當存在於前述式中時，Hal為Cl或Br且R30為羧酸酯酶可裂解胺基甲酸酯前藥基團，其顯示如下：
製備共軛物
本發明之共軛物較佳藉由首先接合搭配分子D及連接子(XZ)aC(XD)b以形成部分D(XZ)aC(XD)b R31(其中R31為適合於與抗體Z上之官能團反應之官能團)以形成共軛物而製備。適合之基團R21之實例包括： 其中R32為Cl、Br、F、甲磺酸根或甲苯磺酸根且R33為Cl、Br、I、F、OH、ON丁二醯亞胺基、O(4-硝基苯基)、O五氟苯基或-O四氟苯基。製備適合之部分D(XZ)aC(XD)b R31揭示於Ng等人，US 7,087,600 B2(2006)；Ng等人，US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人，US 7,129,261 B2(2006)；Ng等人，WO 02/096910 A1(2002)；Boyd等人，US 2006/0024317 A1(2006)；Chen等人，US 2006/0004081 A1(2006)；Gangwar等人，US 2006/0247295 A1(2006)；Boyd等人，WO 2007/038658 A2(2007)；Gangwar等人，WO 2007/051081 A1(2007)； Gangwar等人，WO 2007/059404 A2(2007)；Sufi等人，WO 2008/083312 A2(2008)；及2008年2月20日申請之Chen等人，PCT申請案第PCT/US2008/054362號中，該等專利之揭示內容以引用的方式併入本文中。
在一較佳實施例(式M)中，R31為順丁烯二醯亞胺基團且抗體Z上之官能基為如下文使用共軛物A-2及抗體Z(SH)m所說明之硫醇基，其中Hal為Cl：
以下為說明性程序，其基於藉由離胺酸ε-胺基與2-亞胺基硫雜環戊烷之反應，接著與藥物-連接子部分D(XZ)aC(XD)b R31(其中R31為順丁烯二醯亞胺)反應將游離硫醇基引入抗體中。起初，抗體經緩衝液更換為含有50mM NaCl及2mM DTPA之0.1M磷酸鹽緩衝液(pH 8.0)且濃縮至5-10mg/mL。藉由添加2-亞胺基硫雜環戊烷至抗體中達成硫醇化。待添加之2-亞胺基硫雜環戊烷之量可藉由初步實驗測定且在抗體與抗體之間變化。在初步實驗中，將滴定增加量之2-亞胺基硫 雜環戊烷添加至抗體中，且在與抗體在室溫下培育1小時後，使用Sephadex G-25管柱將抗體去鹽為50mM pH 6.0 HEPES緩衝液且藉由與二硫聯吡啶(DTDP)反應快速測定引入之硫醇基的數目。硫醇基與DTDP之反應導致釋放硫吡啶，其可在324nm下以光譜方式監測。通常使用在0.5-1.0mg/mL之蛋白質濃度下的樣品。280nm下之吸光度可用於精確測定樣品中之蛋白質之濃度，接著在室溫下用0.1mL DTDP(5mM儲備溶液，於乙醇中)培育各樣品之等分試樣(0.9mL)10分鐘。亦在旁邊培育單獨緩衝液之空白樣品加上DTDP。在10分鐘之後，量測324nm下之吸光度且使用19,800M-1之硫吡啶之消光係數定量硫醇基之數目。
通常，每個抗體三個硫醇基之硫醇化位準為此程序中所需的。舉例而言，在一些抗體中，此可藉由添加15倍莫耳過量之2-亞胺基硫雜環戊烷，接著在室溫下培育1小時實現。隨後將抗體與2-亞胺基硫雜環戊烷以所需莫耳比培育，接著去鹽為共軛緩衝液(50mM pH 6.0 HEPES緩衝液，含有5mM甘胺酸及2mM DTPA)。將硫醇化材料維持於冰上，同時如上文所述定量引入之硫醇的數目。
在校驗引入之硫醇的數目之後，以每硫醇3倍莫耳過量添加藥物-連接子部分D(XZ)aC(XD)b R31。允許在亦含有最終濃度為5%之二甲亞碸(DMSO)或類似替代溶劑之共軛緩衝液中進行共軛反應。通常，藥物-連接子儲備溶液溶解於100% DMSO中。將儲備溶液直接添加至硫醇化抗體，其經添加足夠DMSO以使最終濃度達到10%，或預稀釋於含有最終濃度為10%之DMSO的共軛緩衝液中，接著添加至相同體積之硫醇化抗體中。
在攪拌之情況下在室溫下培育共軛反應混合物2小時。在培育後，將共軛反應混合物離心且經由0.2μm過濾器過濾。可藉由使用多種方法之層析達成共軛物之純化。在一種方法中，在藉由含有5mM 甘胺酸及50mM NaCl之50mM pH 7.2 HEPES緩衝液預平衡之丙烯葡聚糖凝膠S200管柱上使用尺寸排阻層析純化共軛物。在28cm/h之線性流動速率下進行層析。收集含有共軛物之溶離份，將其合併且濃縮。在替代方法中，可藉由離子交換層析達成純化。條件在抗體與抗體之間變化且應在各情況下最佳化。舉例而言，抗體-藥物共軛物反應混合物塗覆至在含有5mM甘胺酸之50mM pH 5.5 HEPES中預平衡之SP-瓊脂糖凝膠管柱。在pH 5.5下之平衡緩衝液中使用0-1M NaCl之梯度溶離抗體共軛物。合併含有共軛物之相關餾份且相對於調配緩衝液(50mM pH 7.2 HEPES緩衝液，含有5mM甘胺酸及100mM NaCl)透析。
熟習此項技術者應理解，上述條件及方法為例示性及非限制性的，且用於共軛抗體之其他方法為此項技術中已知的且可用於本發明中。
類美登素
適於用作類美登素藥物部分之美登素(Maytansine)化合物為此項技術中所熟知，且可根據已知方法自天然來源分離，使用基因工程改造技術產生(參見Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)，或為根據已知方法以合成方式製備之美登醇(maytansinol)及美登醇類似物。如下所述，藥物可藉由併入用於結合至抗體之諸如硫醇或胺基之官能活性基團而經修飾。
例示性類美登素藥物部分包括具有經修飾之芳環的彼等類美登素藥物部分，諸如：C-19-去氯(美國專利第4,256,746號)(藉由氫化鋰鋁還原安絲菌素P2(安莎黴素(ansamytocin)P2)來製備)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4,361,650號及第4,307,016號)(藉由使用鏈黴菌屬(Streptomyces)或放線菌屬(Actinomyces)去甲基化或使用LAH去氯來製備)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(- OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(藉由使用醯基氯醯化來製備)及在其他位置具有修飾之彼等類美登素藥物部分。
例示性類美登素藥物部分亦包括具有以下修飾之彼等類美登素藥物部分，諸如：C-9-SH(美國專利第4,424,219號)(藉由美登醇與H2S或P2S5之反應來製備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美國專利第4,331,598號)；C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4,450,254號)(由諾卡菌屬(Nocardia)製備)；C-15-羥基/醯氧基(美國專利第4,364,866號)(藉由鏈黴菌屬轉化美登醇來製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4,313,946號及第4,315,929號)(自滑桃樹(Trewia nudlflora)分離)；C-18-N-去甲基(美國專利第4,362,663號及第4,322,348號)(藉由鏈黴菌屬使美登醇去甲基化來製備)；及4,5-去氧(美國專利第4,371,533號)(藉由三氯化鈦/LAH還原美登醇來製備)。
尤其使用DM1(揭示於美國專利第5,208,020號中，其以引用的方式併入)及DM4(揭示於美國專利第7,276,497號中，其以引用的方式併入)。亦參見5,416,064、WO/01/24763、7,303,749、7,601,354、USSN 12/631,508、WO02/098883、6,441,163、7,368,565、WO02/16368及WO04/1033272中之許多額外類美登素衍生物及方法，其皆以全文引用的方式明確地併入。
含有類美登素之ADC、其製造方法及其治療性用途揭示於例如美國專利第5,208,020號；第5,416,064號；第6,441,163號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，其揭示內容藉此以引用的方式明確地併入。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之類美登素(命名為DM1)的ADC。已發現該共軛物對所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活體內腫瘤生長分析中展示抗腫瘤活性。
Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述ADC，其中類 美登素經由二硫基連接子與結合人類結腸癌細胞株上之抗原的鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1結合。活體外測試TA.1-類美登素共軛物對每一細胞表現3×105個HER-2表面抗原之人類乳癌細胞系SK-BR-3之細胞毒性。藥物共軛物達成與游離美登素類藥物類似之細胞毒性程度，該細胞毒性程度可藉由增加每個抗體分子美登素類化合物分子之數目而增加。A7-類美登素共軛物在小鼠體內展示出低全身性細胞毒性。
奧瑞他汀及海兔毒素
在一些實施例中，ADC包含與海兔毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物奧瑞他汀共軛之抗間質蛋白酶抗體(美國專利第5,635,483號；第5,780,588號)。已展示海兔毒素及奧瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解及細胞核分裂與細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美國專利第5,663,149號)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)末端或C(羧基)末端連接於抗體(WO 02/088172)。
例示性奧瑞他汀實施例包括2004年3月28日提出之「Senter等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research，第45卷，Abstract Number 623中所揭示且美國專利公開案第2005/0238648號中所描述之N端連接之單甲基阿瑞他汀藥物部分DE及DF，其揭示內容以全文引用的方式明確地併入本文中。
例示性較佳奧瑞他汀實施例為MMAE(參見美國專利第6,884,869號，其以全文引用的方式明確地併入本文中)。
另一例示性奧瑞他汀實施例為MMAF(US 2005/0238649、5,767,237及6,124,431，以全文引用之方式明確地併入)。
包含MMAE或MMAF及各種連接組分之其他例示性實施例(進一 步描述於本文中)具有以下結構及縮寫(其中Ab意謂抗體且p為1至約8，例如1、2、3、4、5、6、7或8)。
肽基藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此等肽鍵可例如根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參見E.Schrder及K.Lubke,「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)製備。奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下之方法製備：美國專利第5,635,483號；美國專利第5,780,588號；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784。
卡奇黴素
在其他實施例中，ADC包含本發明之抗體與一或多個卡奇黴素分子共軛。舉例而言，麥羅塔(Mylotarg)為第一市售ADC藥物且利用卡奇黴素γ1作為有效負載(參見美國專利第4,970,198號，其以全文引用的方式併入本文中)。其他卡奇黴素衍生物描述於美國專利第5,264,586號、第5,384,412號、第5,550,246號、第5,739,116號、第5,773,001號、第5,767,285號及第5,877,296號中，其皆以引用的方式明確地併入。抗生素之卡奇黴素家族能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA碎片。對於製備刺孢黴素家族之共軛物，參見美國專利第5,712,374、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、第5,877,296號(均屬於American Cyanamid Company)。可使用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1I、α2I、α2I、N-乙醯基-γ1I、PSAG及θI1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及屬於American Cyanamid之上述美國專利)。 可與抗體共軛之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。卡奇黴素與QFA均具有細胞內作用位點且不易於跨過質膜。因此，細胞經由抗體介導之內化作用攝取此等藥劑顯著增強其細胞毒性作用。
倍癌黴素
CC-1065(參見4,169,888，以引用的方式併入)及倍癌黴素為ADC中所採用之抗腫瘤抗生素家族的成員。此等抗生素似乎經由使DNA在小溝中之腺嘌呤的N3處序列選擇性烷基化，引發導致細胞凋亡的級聯事件而起作用。
倍癌黴素之重要成員包括倍癌黴素A(美國專利第4,923,990號，以引用的方式併入)及倍癌黴素SA(美國專利第5,101,038號，以引用的方式併入)及如美國專利第7,517,903號、第7,691,962號、第5,101,038號；第5,641,780號；第5,187,186號；第5,070,092號；第5,070,092號；第5,641,780號；第5,101,038號；第5,084,468號、第5,475,092號、第5,585,499號、第5,846,545號、WO2007/089149、WO2009/017394A1、第5,703,080號、第6,989,452號、第7,087,600號、第7,129,261號、第7,498,302號及第7,507,420號中所述之大量類似物，其皆以引用的方式明確地併入。
其他細胞毒性劑
可與本發明之抗體共軛之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲黴素(streptozoicin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶、美國專利第5,053,394號、第5,770,710號中描述的統稱為LL-E33288複合物之藥劑家族以及埃斯波黴素(esperamicin)(美國專利第5,877,296號)。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(獲自綠膿假單胞菌)、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、 巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、重組植物毒素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明進一步涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNA酶)之間所形成的ADC。
為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可使用多種放射性同位素產生放射性共軛抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入共軛物中。舉例而言，肽可生物合成，或可藉由使用涉及例如以氟-19替代氫之適合胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成來合成。諸如tc99m或I123、Re186、Re188及In111之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基附著。釔-90可經由離胺酸殘基連接。可使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
對於包含複數個抗體之組合物，藥物負載量由每一抗體之藥物分子的平均數目p表示。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物(D)之範圍內。在預備共軛反應時每個抗體之藥物平均數目可藉由諸如質譜法、ELISA分析及HPLC之習知手段來表徵。亦可根據p確定抗體-藥物共軛物之定量分佈。
在一些情況下，均質抗體-藥物共軛物可藉由諸如逆相HPLC或電泳之手段來分離、純化及表徵，其中p為具有其他藥物負載之抗體藥物共軛物的某一值。在例示性實施例中，p為2、3、4、5、6、7或8或其分數。
抗體-藥物共軛物化合物可藉由熟習此項技術者已知之任何技術來產生。簡言之，抗體-藥物共軛物化合物可包括抗間質蛋白酶抗體作為抗體單元、藥物及視情況存在之使藥物與結合劑接合之連接子。
多種不同反應可用於使藥物及/或連接子共價連接於結合劑。此可藉由結合劑(例如抗體分子)之胺基酸殘基，包括離胺酸之胺基、麩胺酸及天冬胺酸之游離羧酸基、半胱胺酸之巰基及芳族胺基酸之各個部分之反應來實現。共價連接之常用非特異性方法為碳化二亞胺反應以使化合物之羧基(或胺基)連接至抗體之胺基(或羧基)。此外，已使用雙官能試劑(諸如二醛或醯亞胺酯)使化合物之胺基連接於抗體分子之胺基。
席夫鹼反應(Schiff base reaction)亦可用於使藥物連接於結合劑。此方法涉及含有二醇或羥基之藥物的過碘酸鹽氧化，從而形成醛，接著使其與結合劑反應。經由用結合劑之胺基形成席夫鹼來進行連接。異硫氰酸酯亦可用作使藥物共價連接於結合劑之偶合劑。其他技術為熟習此項技術者所已知且屬於本發明之範疇。
在一些實施例中，中間物，亦即連接子之前驅物，在適當條件下與藥物反應。在其他實施例中，使用藥物及/或中間物上之反應性基團。藥物與中間物之間反應的產物或經衍生藥物隨後在適當條件下與本發明之抗間質蛋白酶抗體反應。
應瞭解，亦可對所需化合物進行化學修飾，以使得該化合物之反應更便於製備本發明之共軛物的目的。舉例而言，例如胺、羥基或巰基之官能基可在對藥物之活性或其他特性具有最小或可接受之影響的位置處隨附於藥物。
連接子單元
通常，抗體-藥物共軛物化合物在藥物單元與抗體單元之間包含連接子單元。在一些實施例中，連接子在細胞內或細胞外條件下可裂 解，使得連接子在適當環境中裂解而自抗體釋放藥物單元。舉例而言，分泌某些蛋白酶之實體腫瘤可充當可裂解連接子之目標；在其他實施例中，其為所用的細胞內蛋白酶。在其他實施例中，連接子單元不可裂解且例如藉由在溶酶體中分解抗體而釋放藥物。
在一些實施例中，連接子為藉由細胞內環境(例如，溶酶體或核內體或胞膜窖內)中存在之裂解劑可裂解的。連接子可為例如由細胞內肽酶或蛋白酶裂解肽基連接子，該蛋白酶包括(但不限於)溶酶體或核內體蛋白酶。在一些實施例中，肽基連接子為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長或更長。
裂解劑可包括(但不限於)組織蛋白酶B及D及纖維蛋白溶酶，已知其均水解二肽藥物衍生物，導致靶細胞內部之活性藥物的釋放(參見例如Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123)。肽基連接子為由表現間質蛋白酶之細胞中存在之酶可裂解的。舉例而言，可使用可藉由在癌組織中高度表現之硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B裂解之肽基連接子(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接子(SEQ ID NO：X))。該等連接子之其他實例描述於例如美國專利第6,214,345號中，該專利以全文引用的方式且出於所有目的併入本文中。
在一些實施例中，由細胞內蛋白酶可裂解之肽基連接子為Val-Cit連接子或Phe-Lys連接子(參見例如，美國專利第6,214,345號，其描述使用val-cit連接子合成小紅莓)。
在其他實施例中，可裂解連接子為pH敏感的，亦即在某些pH值下對水解敏感。通常，pH值敏感性連接子可在酸性條件下水解。舉例而言，可使用在溶酶體中可水解之酸不穩定性連接子(例如，腙、半卡巴腙、硫半卡巴腙、順式-烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或其類似物)。(參見例如美國專利第5,122,368號；第5,824,805號；第5,622,929號；Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67- 123；Neville等人，1989,Biol.Chem.264：14653-14661)。)該等連接子在中性pH條件(諸如血液中之pH條件)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(近似溶酶體之pH)下不穩定。在某些實施例中，可水解連接子為硫醚連接子(諸如經由醯基腙鍵連接於治療劑的硫醚(參見例如美國專利第5,622,929號))。
在其他實施例中，連接子為在還原條件下可裂解的(例如，二硫連接子)。各種二硫連接子為此項技術中已知的，包括例如可使用以下形成之二硫連接子：SATA(N-丁二醯亞胺基-5-乙醯基硫基乙酸酯)、SPDP(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)及SMPT(N-丁二醯亞胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB及SMPT。(參見例如Thorpe等人，1987,Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等人，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel編，Oxford U.Press,1987)。亦參見美國專利第4,880,935號。)
在其他實施例中，連接子為丙二酸酯連接子(Johnson等人，1995,Anticancer Res.15：1387-93)、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基連接子(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在其他實施例中，連接子單元不可裂解，且藥物藉由抗體降解而釋放。(參見美國公開案第2005/0238649號，該案以全文引用的方式且出於所有目的併入本文中)。
在許多實施例中，連接子為自分解型。如本文所用之術語「自分解型間隔子」係指能夠將兩個間隔開之化學部分共價連接在一起形成穩定三聯分子的雙官能化學部分。若其與第一部分之鍵裂解，則其將自發地與第二化學部分分離。參見例如WO 2007059404A2、 WO06110476A2、WO05112919A2、WO2010/062171、WO09/017394、WO07/089149、WO 07/018431、WO04/043493及WO02/083180，其係關於藥物-可裂解受質共軛物，其中該藥物及可裂解受質視情況經由自分解型連接子連接，且其皆以引用的方式明確地併入。
連接子通常實質上對細胞外環境不敏感。如本文所用，在連接子之情形下，「實質上對細胞外環境不敏感」意指當抗體-藥物結合化合物存在於細胞外環境(例如血漿)時，抗體-藥物結合化合物樣品中不超過約20%、15%、10%、5%、3%或不超過約1%之連接子裂解。
連接子是否實質上對細胞外環境不敏感可例如藉由使抗體-藥物結合化合物與血漿一起培育預定時段(例如，2、4、8、16或24小時)，且隨後定量血漿中存在之游離藥物的量來測定。
在其他非互斥實施例中，連接子促進細胞內化。在某些實施例中，當與治療劑結合時(亦即，在如本文所述之抗體-藥物共軛化合物的連接子-治療劑部分的背景中)，連接子促進細胞內化。在其他實施例中，當與奧瑞他汀化合物及本發明之抗間質蛋白酶抗體兩者結合時，連接子促進細胞內化。
可用於本發明組合物及方法之各種例示性連接子描述於WO 2004-010957、美國公開案第2006/0074008號、美國公開案第20050238649號及美國公開案第2006/0024317號(其中每一者均以全文引用的方式且出於所有目的併入本文中)中。
藥物負載
藥物負載由p表示且為分子中每個抗體的藥物部分之平均數目。藥物負載(「p」)可為每個抗體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20個以上部分(D)，儘管平均數目時常為分數或小數。一般而言，1至4之藥物負載為頻繁使用的，且1至2之藥物負載亦適用。本發明之ADC包括與1至20個之一 系列藥物部分共軛之抗體的集合。在由結合反應製備ADC時，每個抗體之藥物部分的平均數目可藉由諸如質譜及ELISA分析之習知方式表徵。
亦可測定ADC中p之定量分佈。在一些情況下，均質ADC可藉由諸如電泳之手段來分離、純化及表徵，其中p為具有其他藥物負載之ADC的某一值。
對於一些抗體-藥物共軛物，p可能受抗體上之連接位點數限制。舉例而言，若連接如以上例示性實施例為半胱胺酸硫醇基，則抗體可能僅具有一個或數個半胱胺酸硫醇基，或可能僅具有一個或數個具有足夠反應性之硫醇基，連接子可經由該等硫醇基連接。在某些實施例中，較高藥物負載(例如p>5)可造成某些抗體-藥物共軛物之凝聚、不可溶性、毒性或細胞滲透性喪失。在某些實施例中，本發明之ADC的藥物負載在以下範圍內：1至約8；約2至約6；約3至約5；約3至約4；約3.1至約3.9；約3.2至約3.8；約3.2至約3.7；約3.2至約3.6；約3.3至約3.8；或約3.3至約3.7。實際上，已顯示對於某些ADC，每個抗體之藥物部分之最佳比可小於8，且可為約2至約5。參見US 2005-0238649 A1(以全文引用的方式併入本文中)。
在某些實施例中，在共軛反應期間，少於理論最大值之藥物部分與抗體共軛。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基，如下文所論述。一般，抗體不含有可連接於藥物部分之許多游離及反應性半胱胺酸硫醇基；實際上，抗體中大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋鍵形式存在。在某些實施例中，抗體可在部分或完全還原條件下用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑還原，產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，使抗體經受變性條件以暴露諸如離胺酸或半胱胺酸之反應性親核基團。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可以不同方式加以控制，例如藉由：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體莫耳過量，(ii)限制結合反應時間或溫度，(iii)用於半胱胺酸硫醇修飾之部分或限制性還原條件，(iv)藉由重組技術工程改造抗體之胺基酸序列，使得半胱胺酸殘基之數目及位置經修飾以控制連接子-藥物連接之數目及/或位置(諸如，如本文及WO2006/034488(以全文引用的方式併入本文中)所揭示製備之thioMab或thioFab)。
應瞭解當一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑、隨後藥物部分試劑反應時，所得產物為具有一或多個藥物部分連接於抗體之分佈的ADC化合物之混合物。每個抗體之藥物平均數目可由該混合物藉由雙ELISA抗體分析計算，該分析對於抗體具有特異性且對於藥物具有特異性。個別ADC分子可藉由質譜法在混合物中鑑別出且藉由HPLC(例如疏水性相互作用層析)分離。
在一些實施例中，具有單一負載值之均質ADC可藉由電泳或層析自共軛物混合物分離。
測定ADC之細胞毒性效應的方法
測定藥物或抗體-藥物共軛物是否對細胞發揮細胞生長抑制及/或細胞毒性作用之方法為已知的。一般而言，抗體藥物共軛物之細胞毒性或細胞生長抑制活性可藉由以下來量測：將表現抗體藥物共軛物之目標蛋白的哺乳細胞暴露於細胞培養基中；培養該等細胞約6小時至約5天之時段；及量測細胞存活率。可使用基於細胞之活體外分析量測抗體藥物共軛物之活力(增殖)、細胞毒性及細胞雕亡之誘導(卡斯蛋白酶(caspase)活化)。
為測定抗體藥物共軛物是否發揮細胞生長抑制作用，可使用胸苷併入分析。舉例而言，可在96孔板中每孔5,000個細胞之密度下培養表現目標抗原之癌細胞72小時，且在72小時時期之最後8小時期間 暴露於0.5μCi 3H-胸苷。在抗體藥物共軛物存在及不存在下量測培養物之細胞中3H-胸苷之併入。
為測定細胞毒性，可量測壞死或細胞凋亡(漸進式細胞死亡)。壞死通常伴隨有質膜之滲透性增加；細胞膨脹及質膜破裂。細胞凋亡通常特徵為膜起泡、細胞質凝聚及內源核酸內切酶活化。測定出對癌細胞之任一此等作用指示抗體藥物共軛物適用於治療癌症。
細胞活力可藉由測定細胞中諸如中性紅、錐蟲藍或ALAMARTM藍之染料的吸收來量測(參見例如Page等人，1993,Intl.J.Oncology 3：473-476)。在該種分析中，在含有染料之培養基中培育細胞，洗滌細胞且以分光光度法量測剩餘染料，其反映細胞對染料之吸收。亦可使用結合蛋白質之染料磺酸基若丹明B(sulforhodamine B，SRB)量測細胞毒性(Skehan等人，1990,J.Natl.Cancer Inst.82：1107-12)。
或者，在藉由偵測活的(但未死)細胞之哺乳動物細胞存活及增殖的定量比色分析中使用諸如MTT之四唑鎓鹽(參見例如Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65：55-63)。
細胞凋亡可藉由量測例如DNA斷裂來定量。可利用用於活體外定量測定DNA斷裂的市售光度法。此類分析之實例，包括TUNEL(其偵測斷裂之DNA中經標記核苷酸的併入)及基於ELISA之分析，描述於Biochemica,1999，第2期，第34-37頁(Roche Molecular Biochemicals)中。
亦可藉由量測細胞中之形態變化來測定細胞凋亡。舉例而言，與壞死相同，可藉由量測某些染料(例如螢光染料，諸如吖啶橙或溴化乙錠)之吸收來確定質膜完整性之喪失。用於量測凋亡細胞數目之方法已由Duke及Cohen,Current Protocols in Immunology(Coligan等人編，1992，第3.17.1-3.17.16頁)描述。亦可用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙錠或碘化丙錠)標記細胞，且觀測細胞的染色質凝聚及沿內部核膜的蝕邊現象。可量測以確定細胞凋亡之其他形態變化包括例如細 胞質凝聚、膜起泡增加及細胞收縮。
可在培養物之附著區及「漂浮」區量測到凋亡細胞之存在。舉例而言，這兩區均可藉由移除上清液、以胰蛋白酶處理附著之細胞、在離心洗滌步驟(例如在2000rpm下10分鐘)後組合製備物及偵測細胞凋亡(例如藉由量測DNA斷裂)來收集。(參見例如，Piazza等人，1995,Cancer Research 55：3110-16)。
可在適合之動物模型中，於活體內評估本發明之抗間質蛋白酶抗體之治療組合物的效應。舉例而言，可使用異種癌症模型，其中將癌症外植體或繼代異種移植組織引入諸如裸小鼠或SCID小鼠之免疫功能不全的動物中(Klein等人，1997,Nature Medicine 3：402-408)。可使用量測腫瘤形成、腫瘤消退或癌轉移之抑制作用的分析及其類似分析量測功效。
用於實施上述方法之治療性組合物可調配成包含適用於所需傳遞方法之載劑的醫藥組合物。適當載劑包括與治療性組合物組合時仍可保持該治療性組合物之抗腫瘤功能且與患者免疫系統通常無反應性的任何物質。實例包括(但不限於)多種標準醫藥載劑中之任一種，諸如無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、抑菌水及其類似物(一般參見Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，A.Osal.編，1980)。
用於產生本發明之抗體的方法
本發明另外提供用於產生所揭示之抗間質蛋白酶抗體的方法。此等方法涵蓋培養含有編碼本發明抗體之經分離核酸的宿主細胞。如熟習此項技術者應瞭解，此舉可依多種方式進行，其視抗體之性質而定。在一些實施例中，以本發明抗體為全長傳統抗體時為例，例如重鏈可變區及輕鏈可變區係處於可以產生抗體產生且可以分離抗體之條件下。
本文揭示抗體A1-A14的可變重鏈及輕鏈(蛋白質及核酸序列二 者)；如在此項技術中應瞭解，此等重鏈及輕鏈可容易地經擴增以產生全長重鏈及輕鏈。亦即，在已提供如本文所概述之編碼VH及VK區段之DNA片段的情況下，此等DNA片段可另外藉由標準重組DNA技術操縱，例如以將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，使編碼VK或VH之DNA片段操作性連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如上下文中所用之術語「可操作地連接」欲意謂接合該等兩個DNA片段以便使由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列在框架中保留。
可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至另一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子而將編碼VH區之經分離DNA轉化為全長重鏈基因。鼠類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中為已知的(參見(例如)Kabat,E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言，可將編碼VH之DNA可操作地連接至另一僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至另一編碼輕鏈恆定區CL之DNA分子而將編碼VL/VK區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。鼠類輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中為已知的(參見(例如)Kabat,E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。在較佳實施例中，輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，編碼VH及VL/VK之DNA片段可操作地連接於編碼可撓性連接子，例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3之另一片段，使得VH及VL/VK序列可表現為相鄰單鏈蛋白質，VL/VK及VH區藉由可撓性連接子接合[參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554]。
一般而言，提供編碼本發明之抗體的核酸。該等聚核苷酸編碼重鏈及輕鏈各自之可變區與恆定區，不過根據本文所述之組合物，本發明亦涵蓋其他組合。本發明亦涵蓋來源於所揭示之聚核苷酸的寡核苷酸片段及與此等聚核苷酸互補之核酸序列。
聚核苷酸可呈RNA或DNA之形式。DNA、cDNA、基因組DNA、核酸類似物及合成DNA形式之聚核苷酸屬於本發明之範疇。DNA可為雙股或單股DNA，且若為單股DNA，則可為編碼(有義)股或非編碼(反義)股。編碼多肽之編碼序列可與本文提供之編碼序列一致，或可為不同編碼序列，該序列由於遺傳密碼之冗餘或簡併，編碼與本文提供之DNA相同的多肽。
在一些實施例中，將編碼本發明抗體之核酸併入表現載體中，該等表現載體可為染色體外的或經設計以整合至所引入之宿主細胞的基因組中。表現載體可含有任意數目之適當調節序列(包括(但不限於)轉錄及轉譯控制序列、啟動子、核糖體結合位點、強化子、複製起點等)或其他組件(選擇基因等)，其皆如此項技術中所熟知般可操作地連接。在一些情況下，使用兩個核酸且將其各自置於不同表現載體中(例如重鏈在第一表現載體中，輕鏈在第二表現載體中)，或者其可置於同一表現載體中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可視諸如宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素而定。
一般，可使用適合於所選宿主細胞之任何方法(例如轉型、轉染、電穿孔、感染)將核酸及/或表現物引入適合之宿主細胞中以形成重組宿主細胞，使得核酸分子可操作地連接於一或多種表現控制元件(例如在載體中、在藉由處理在細胞中形成之構築體中、整合至宿主細胞基因組中)。可將所得重組宿主細胞維持於適於表現之條件下(例如在誘導劑存在下，於適合非人類動物中，在補充有適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑等之適合培養基中)，籍此產生所編碼之多肽。在一些情況下，在一個細胞中產生重鏈且在另一細胞中產生輕鏈。
作為用於表現之宿主可用的哺乳動物細胞株為此項技術中已知且包括購自美國菌種保藏中心(ATCC),Manassas,VA之許多永生化細胞株，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK 293細胞、NSO細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及許多其他細胞株。包括(但不限於)細菌、酵母、昆蟲及植物之非哺乳動物細胞亦可用於表現重組抗體。在一些實施例中，抗體可在諸如母牛或雞之轉殖基因動物中產生。
抗體分子生物學、表現、純化及篩檢之一般方法為所熟知的，例如參見美國專利第4,816,567號、第4,816,397號、第6,331,415號及第7,923,221號以及Antibody Engineering,Kontermann及Dubel編，Springer,Heidelberg,2001及2010 Hayhurst及Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol 5：683-689；Maynard及Georgiou,2000,Annu Rev Biomed Eng 2：339-76；及Morrison,S.(1985)Science 229：1202。
醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供一種含有本發明之一種或一組單株抗體，或其抗原結合部分連同醫藥學上可接受之載劑一起調配的組合物(例如醫藥組合物)。該等組合物可包括一種或一組(例如兩種或兩種 以上不同的)本發明抗體、或免疫共軛物或雙特異性分子。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含一組與靶抗原上之不同抗原決定基結合或具有互補活性的抗體(或免疫共軛物或雙特異性分子)。
本發明之醫藥組合物亦可以組合療法，亦即與其他藥劑組合投與。舉例而言，組合療法可包括本發明之抗抗體與至少一種其他抗腫瘤劑或消炎劑或免疫抑制劑之組合。可用於組合療法中之治療劑的實例以下更詳細描述於關於本發明之抗體之用途的部分中。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。載劑較佳適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體、免疫共軛物或雙特異性分子)可包覆於材料中以保護該化合物免受可使該化合物失活之酸及其他自然條件的作用。
本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保持母體化合物之生物活性且並不賦予任何非所需毒理學作用之鹽[參見例如Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19]。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括由非毒性無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及類似物)以及由非毒性有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、苯基取代之鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及類似物)衍生之鹽。鹼加成鹽包括由以下各鹼衍生之鹽：鹼土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及無毒性有機胺，諸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物。
本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗 壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
可用於本發明之醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用塗層物質(諸如卵磷脂)、在分散液之情況中藉由維持所要粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可經由前述滅菌程序與經由包括多種抗菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物存在。亦可需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包含延遲吸收之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水性溶液或分散液，及用於即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。醫藥學活性物質之該等介質及試劑之用途在此項技術中已知。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其在本發明之醫藥組合物中使用。亦可在組合物中併入輔助性活性化合物。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。該等組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之規則結構。載劑可為含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)之溶劑或分散介質及其適合混合物。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂之塗層，在分散液之狀況下藉由維持所需粒度及藉 由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，較佳組合物中包括等張劑，例如，糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)，可使可注射組合物之吸收延長。
無菌可注射溶液可藉由併入所需量之在適當溶劑中之活性化合物以及一種或一組上文所列舉之成分，若需要隨後進行滅菌微過濾來製備。通常藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其自無菌粉末之前述無菌過濾溶液中得到活性成分加任何其他所要成分的粉末。
可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分的量應視所治療之受檢者及特定投藥模式而定。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分的量將一般為產生治療效應之組合物的量。一般而言，在100%當中，此量應介於約0.01%至約99%活性成分之範圍內，較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合。
調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑；可隨時間投與若干分次劑量；或可按治療情況之緊急需要指示按比例減小或增加劑量。出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文中所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之受檢者的實體上離散之單位；每一單位含有經計算以產生所要治療效應之預定量的與所要藥用載劑締合之活性化合物。本發明之單位劑型之規格係藉由下列情況指定且直接取決於下列情況：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效應，及(b)複配該種用於治療個體敏感性之活性化合物之技 術中的固有限制。
為投與抗體，劑量在每公斤宿主體重約0.0001毫克至100毫克，且更通常0.01毫克至5毫克之範圍內。舉例而言，劑量可為每公斤體重0.3毫克、每公斤體重1毫克、每公斤體重3毫克、每公斤體重5毫克或每公斤體重10毫克，或在每公斤1-10毫克範圍內。例示性治療方案使得必須每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次進行投藥。本發明之抗間質蛋白酶抗體的較佳劑量方案包括經由靜脈內投與每公斤體重1毫克或每公斤體重3毫克，同時使用以下給藥時程中之一者給予抗體：(i)每四週六次劑量，接著每三個月；(ii)每三週；(iii)每公斤體重3毫克一次，接著每三週每公斤體重1毫克。
在一些方法中，同時投與兩種或兩種以上具有不同結合特異性之單株抗體，在該種狀況下，所投與之各抗體之劑量處於指定範圍內。抗體通常多次投與。單一劑量之間的時間間隔可為(例如)一週、一個月、三個月或一年。如藉由量測患者體內靶抗原之抗體的血液含量所指示，時間間隔亦可為不規則的。在一些方法中，調節劑量以達成約1-1000μg/ml之血漿抗體濃度，且在一些方法中，達成約25-300μg/ml。
或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在該種狀況下，需要較不頻繁之投藥。劑量及頻率視抗體在患者體內之半衰期而變化。一般而言，人類抗體展示最長半衰期，隨後為人化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性抑或治療性而變化。在預防性應用中，歷經長時期以相對不頻繁之時間間隔投與相對低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短間隔投與相對較高劑量直至疾病進展降低或終止且較佳直至患者展示病症之部分或完全改善。其後，可向患者施以預 防性療法。
本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量含量可變化以獲得有效達成對特定患者、組合物及投藥模式之所要治療反應，而對患者不具有毒性的活性成分之量。選定劑量含量應視多種藥物動力學因素而定，該等藥物動力學因素包括所用之本發明之特定組合物或其酯、鹽或醯胺的活性；投藥途徑；投藥時間；所用特定化合物之排泄速率；治療持續時間；與所用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前醫療病史；及醫學技術中所熟知的類似因素。
「治療有效劑量」之本發明之抗骨硬化素抗體可使得疾病症狀嚴重性降低，無疾病症狀時期之頻率及持續時間增加，或預防由疾病病痛所致之損傷或殘疾。舉例而言，為治療間質蛋白酶介導之腫瘤，「治療有效劑量」較佳相對於未經治療受檢者抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%、至少約30%、更佳至少約40%、至少約50%、更佳至少約60%、至少約70%且更佳至少約80%或至少約90%。可在預測在人類腫瘤中之功效的動物模型系統中評估化合物抑制腫瘤生長的能力。或者，組合物之此特性可藉由檢查化合物抑制細胞生長之能力來評估，此類抑制可藉由熟練的從業者已知的分析而活體外量測。治療有效量之治療性化合物可減小腫瘤尺寸，或另外改善受檢者症狀。此項技術中一般技術者將能夠基於諸如受檢者尺寸、受檢者症狀嚴重性及所選擇之特別組合物或投藥路徑之因子測定該等量。
本發明之組合物可藉由一或多種投藥途徑使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者投與。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或投藥方式將視所需結果而變化。本發明之抗體的較佳投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文中所用之短語「非經腸投與」意 謂除經腸投藥及局部投藥以外，通常藉由注射之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心臟內、皮內、腹膜內、穿經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及腦幹內注射及輸注。
或者，本發明之抗體可經由非非經腸途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。
活性化合物可與將保護該化合物免於快速釋放之載劑一起製備，該等載劑諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊化之傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法為獲得專利的或熟習此項技術者一般已知的[參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(1978)J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.N.Y]。
治療組合物可用此項技術中已知的醫學裝置投與。舉例而言，在一較佳實施例中，本發明之治療組合物可以無針皮下注射裝置投與，該等無針皮下注射裝置諸如美國專利第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號或第4,596,556號中所示之裝置。美國專利第4,487,603號，其揭示用於以受控速率施配藥物之可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示經由皮膚投與藥物之治療性裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物傳遞之可變流動可植入輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔隔室之滲透藥物傳遞系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物傳遞系統。此等專利以引用的方式併入本文中。多種其他該等植入物、傳遞系統及模組為 熟習此項技術者已知。
在某些實施例中，可調配本發明之人類單株抗體以確保在活體內適當分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除了許多高度親水化合物。為確保本發明之治療化合物與BBB交叉(若需要)，可(例如)在脂質體中調配該等化合物。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂質體可包含選擇性輸送至特定細胞或器官之一或多個部分，因此增強標靶藥物傳遞[參見例如V.V.Ranade(1989),J.Clin.Pharmacol.29：685]。例示性標靶部分包括葉酸或生物素(參見例如美國專利5,416,016)；甘露糖苷[Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038]；抗體[P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180]；界面活性劑蛋白A受體[Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134]；p120[Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090]；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
用途及方法
本發明之抗體、抗體組合物及方法具有許多活體外及活體內診斷性及治療性效用，涉及間質蛋白酶介導之病症的診斷及治療。
在一些實施例中，此等分子可活體外或離體投與培養物中之細胞或例如活體內投與人類個體，以治療、預防及診斷多種病症。如本文所用，術語「受檢者」意欲包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類動物及爬蟲動物。較佳受檢者包括患有由間質蛋白酶活性介導之病症的人類患者。該等方法尤其適用於治療患有與異常間質蛋白酶表現相關聯之病症的人類患者。當 hTSLP之抗體連同另一藥劑投與時，該兩者可以任意次序或同時投與。
考慮到本發明之抗體對間質蛋白酶的特異性結合，本發明之抗體可用於特異性偵測細胞表面上之間質蛋白酶表現，且此外，可用於經由免疫親和力純化來純化間質蛋白酶。
此外，鑒於間質蛋白酶於腫瘤細胞上之表現，本發明之抗體、抗體組合物及方法可用於治療患有致瘤病症之受檢者，例如特徵為存在表現間質蛋白酶之腫瘤細胞的病症，包括例如胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))及皮膚癌。如下文實例5及7所說明，已顯示間質蛋白酶在抗體結合時欲內化，因此使得本發明之抗體能夠用於任何有效負載作用機制，例如ADC方法、放射免疫共軛物或ADEPT方法。
在一個實施例中，本發明之抗體(例如單株抗體、抗體片段、奈米抗體、多特異性及雙特異性分子及組合物等)可用於偵測間質蛋白酶之含量或在膜表面上含有間質蛋白酶之細胞的含量，該等含量可隨後與某些疾病症狀相關聯。或者，抗體一般以ADC形式投與，可用於抑制或阻斷間質蛋白酶功能，繼而可與某些疾病症狀之預防或改善有關，由此暗示間質蛋白酶為該疾病之介體。此可藉由在允許在抗體與間質蛋白酶之間形成複合物之條件下使樣品及對照樣品與抗間質蛋白酶抗體接觸達成。在樣品及對照中偵測且比較在抗體與間質蛋白酶之間形成之任何複合物。
在另一實施例中，可首先測試本發明之抗體(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子及組合物)與活體外治療性或診斷性用途相關聯之結合活性。舉例而言，本發明之組合物可使用下文實例中所述之流動式細胞測量分析來測試。
本發明之抗體(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子、免疫共軛物及組合物)在間質蛋白酶相關疾病之療法及診斷中具有額外效用。舉例而言，單株抗體、多特異性或雙特異性分子及免疫共軛物可用於活體內或活體外引發以下生物活性中之一或多者：抑制表現間質蛋白酶之細胞的生長及/或殺死該細胞；在人類效應細胞存在下介導表現間質蛋白酶之細胞的吞噬作用或ADCC，或阻斷間質蛋白酶配位體與間質蛋白酶之結合。
在一個特定實施例中，活體內使用抗體(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子及組合物)以治療、預防或診斷多種間質蛋白酶相關疾病。間質蛋白酶相關疾病之實例尤其包括表示胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌之人類癌症組織。
活體內及活體外投與本發明之抗體組合物(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫共軛物)的適合途徑為此項技術中所熟知，且可由一般技術者選擇。舉例而言，抗體組合物可藉由注射(例如靜脈內或皮下)投與。所用分子之適合劑量將視受檢者之年齡及體重以及抗體組合物之濃度及/或調配物而定。
如先前所描述，本發明之抗間質蛋白酶抗體可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑)一起同投與。抗體可連接至藥劑(以免疫複合物形式)或可與藥劑分開投與。在後一情況(單獨投與)中，抗體可在藥劑之前、之後或同時投與或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如輻射)共投與。此類治療劑尤其包括抗贅生性劑，諸如小紅莓(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑博萊黴素硫酸鹽(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)及環磷醯胺羥基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其 本身僅在對患者具毒性或亞毒性之含量下有效。順鉑每四週一次以100mg/kg劑量靜脈內投與，且阿德力黴素每21天一次以60-75mg/ml劑量靜脈內投與。適合於與本發明之抗體共投與的其他藥劑包括用於治療癌症，例如胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌或肺癌、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌之其他藥劑，諸如Avastin®、5FU及吉西他濱(gemcitabine)。本發明之抗間質蛋白酶抗體或其抗原結合片段與化學治療劑之共投與提供經由不同機制起作用之兩種抗癌劑，其對人類腫瘤細胞產生細胞毒性效應。該共投與可解決由於形成抗藥性或可能導致對抗體無反應之腫瘤細胞抗原性變化所帶來的問題。
本發明之目標特定性效應細胞，例如連接至組合物(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子)之效應細胞亦可用作治療劑。作為目標之效應細胞可為人類白細胞，諸如巨噬細胞、嗜中性細胞或單核細胞。其他細胞包括嗜伊紅血球、天然殺傷細胞及其他具備IgG-或IgA-受體之細胞。若需要，則可由待治療受檢者取得效應細胞。目標特異性效應細胞係可作為於生理上可接受之溶液內的細胞懸浮液投與。投與細胞數目可為108-109之量級，但將視治療目的而變動。一般而言，該量應足以在目標細胞(例如表現間質蛋白酶之腫瘤細胞)處獲得定位，及藉由例如吞噬作用影響細胞殺死。投藥途徑亦可改變。
可與供除去目標細胞之其他技術聯合執行使用目標特異性效應細胞之療法。例如，可與化學治療聯合使用利用本發明之組合物(舉例而言人類抗體、多特異及雙特異分子)及/或裝備此等組合物之效應細胞的抗-腫瘤療法。另外，可使用組合免疫療法以指引兩個相異細胞毒素效應子群體針對腫瘤細胞排斥。舉例而言，連接至抗Fc-γRI或抗CD3之抗間質蛋白酶抗體可與IgG或IgA受體特異性結合劑結合使用。
亦可使用本發明之雙特異及多特異分子調節效應細胞內FcγR或FcγR水平，諸如藉由封端及消除細胞表面之受體。對於此目的亦可使用抗-Fc受體之混合物。
本發明之組合物(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫共軛物)具有補體結合位點，諸如IgG1、IgG2或IgG3或IgM之結合補體的部分，亦可在補體存在下使用。在一實施例中，用本發明之結合劑及合適效應細胞對包括目標細胞之細胞群體之間接體內治療，係可藉由添加補體或包含補體之血清來補充。藉由補體蛋白質之結合可改善塗佈以本發明之結合劑的目標細胞之噬胞作用。在另一實施例中，包覆有本發明之組合物(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子)之靶細胞亦可由補體溶解。在另一實施例中，本發明之組合物不活化補體。
本發明之組合物(例如單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫共軛物)亦可連同補體一起投與。在某些實施例中，本發明提供包含抗體、多特異性或雙特異性分子及血清或補體之組合物。當補體與抗體、多特異性或雙特異性分子緊密接近時，此等組合物可為有利的。或者，本發明之抗體、多特異性或雙特異性分子及補體或血清可單獨投與。
包含本發明之抗體組合物(例如單株抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫共軛物)及使用說明書的套組亦在本發明之範疇內。該套組可另外含有一或多種額外試劑，諸如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射毒性劑，或一或多種本發明之額外抗體(例如具有不同於第一抗體之結合至間質蛋白酶抗原中之抗原決定基之補充活性的抗體)。
因此，用本發明之抗體組合物治療之患者可(在本發明之抗體投與之前、同時或之後)用另一治療劑(諸如細胞毒性或放射毒性劑)另外投與，其增強或加強抗體之治療效應。
在其他實施例中，可用一調節(舉例而言增強或抑制)Fcγ或Fcγ受體之表現或活性的藥劑另外治療受檢者，例如藉由用一細胞激素治療該受檢者。適於在該多特異分子治療期間投藥之較佳細胞激素包括粒細胞群落-刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞群落-刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子(TNF)。
本發明之組合物(例如抗體、多特異性及雙特異性分子)亦可用於靶向表現FcγR或間質蛋白酶之細胞，例如以便標記此類細胞。對於該用途，可將結合劑連接至一可偵測之分子。因此，本發明提供用於離體或活體外定位表現Fc受體(諸如FcγR)或間質蛋白酶之細胞的方法。該可偵測標記可為(例如)放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子。
在一特定實施例中，本發明提供用於偵測樣品中間質蛋白酶抗原之存在或量測間質蛋白酶抗原之量的方法，其包含在允許在抗體或其部分與間質蛋白酶之間形成複合物之條件下使樣品及對照樣品與單株抗體或其抗原結合部分(其特異性結合至間質蛋白酶)接觸。接著偵測複合物之形成，其中樣品與對照樣品相比的差異複合物形成指示樣品中存在間質蛋白酶抗原。
在其他實施例中，本發明提供用於治療受檢者中間質蛋白酶介導之病症，例如人類癌症，包含胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌的方法。
本說明書中所引用之所有參考文獻，包括(但不限於)所有論文、公開案、專利、專利申請案、演示、文本、報導、手稿、手冊、書、網際網路公告、雜誌文章、期刊、產品說明書及其類似物，吾人據此以全文引用的方式併入本說明書中。本文參考文獻之論述僅意欲概述其作者之聲明且不承認任何參考文獻構成先前技術，且申請人保留攻 擊所引用之參考文獻的準確性及相關性的權利。
儘管已藉由說明及實例較為詳細地描述前述發明以達成理解清楚之目的，但一般熟習此項技術者根據本發明之教示將顯而易知，可在不背離所附之申請專利範圍之精神及範疇下，對其產生某些變化及變更。
以下實例進一步說明本發明，該等實例不應視為進一步限制本發明。
實例1：產生針對間質蛋白酶-抗原之人類單株抗體
已知間質蛋白酶-幹蛋白質充分表現於MCF7細胞中。此等細胞用於以下免疫接種方案中。
轉殖基因HuMAb Mouse ®品系
使用表現人抗體基因之轉殖基因HuMAb Mouse®之HCo12品系製備間質蛋白酶之全人類單株抗體。在此等小鼠品系中，內源性小鼠κ輕鏈基因已如Chen等人(1993)EMBO J. 12：811-820中所述經同型結合破壞且內源性小鼠重鏈基因已如PCT公開案WO 01/09187之實例1中所述經同型結合破壞。
HuMab免疫接種
為產生間質蛋白酶之全人類單株抗體，藉由表現間質蛋白酶之MCF7細胞使HCo12小鼠品系之HuMab小鼠免疫。此等小鼠之一般免疫接種流程描述於Lonberg,N等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及PCT公開案WO 98/24884中。小鼠在第一次輸注表現間質蛋白酶之MCF7細胞時為6-16週大。
藉由以3-21天間隔腹膜內(IP)、皮下(Sc)或經由腳掌(FP)投與之Ribi佐劑中之表現間質蛋白酶之MCF7細胞使轉殖基因小鼠免疫(至多總共9次免疫接種)。藉由眶後出血監測免疫反應。藉由ELISA篩選血 漿(如下所述)，且具有抗間質蛋白酶人類免疫球蛋白之足夠效價的小鼠用於融合。在處死及移除脾臟之前3天及2天用抗原靜脈內增強小鼠。通常，對於各抗原進行10-20次融合。幾十隻小鼠針對各抗原經免疫。
選擇產生抗間質蛋白酶抗體之HuMab Mouse ® 動物
為選擇產生結合間質蛋白酶之抗體的HuMab Mouse®動物，如Fishwild,D.等人(1996)(前述)所述藉由ELISA測試來自經免疫小鼠之血清。簡言之，以PBS中1-2μg/ml之經純化重組間質蛋白酶塗佈微量滴定盤，在4℃下以50微升/孔培育隔夜，隨後用200微升/孔的PBS/Tween中之5%雞血清(0.05%)阻斷。將來自經間質蛋白酶免疫之小鼠之血漿的稀釋液添加至各孔中且在環境溫度下培育1-2小時。用PBS/Tween洗滌盤，且隨後在室溫下，用與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)共軛之山羊抗人類IgG Fc多株抗體培育1小時。在洗滌之後，用ABTS受質(Moss Inc，產品：ABTS-1000)使盤顯影且藉由分光光度計於OD 415-495下進行分析。產生抗間質蛋白酶抗體之最高效價之小鼠用於融合。如下所述進行融合且藉由ELISA及FACS測試融合瘤上清液之抗間質蛋白酶活性。
產生間質蛋白酶之人類單株抗體之融合瘤的產生
使用基於電場之電融合藉由小鼠骨髓瘤細胞株融合自HuMab mouse®分離之小鼠脾細胞，該電融合使用Cyto Pulse大腔室剔除融合電致孔器(Cyto Pulse Sciences,Inc.,Glen Burnie,MD)。簡言之，將來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液融合至與Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)相同之數目。細胞以每孔大致2×104個之密度接種於平底微量滴定盤中，隨後在含有10%胎牛血清、10% P388D1(ATCC，CRL TIB-63)改良性培養基、DMEM(Mediatech，CRL 10013，具有高葡萄糖、L-麩醯胺酸及丙酮酸鈉)中之3-5% origen (IGEN)加上5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50mg/mL健大黴素(gentamycin)及1×HAT(Sigma，CRL P-7185)之選擇性培養基中培育。在1-2週之後，在以HT置換HAT之培養基中培養細胞。在細胞接種之後大致10-14天，首先關於來自個別孔之上清液是否含有人類g,k抗體對其進行篩選。隨後藉由ELISA及FACS(上文所述)自人類g,k評分為陽性之上清液篩選人類抗間質蛋白酶單株IgG抗體。將分泌融合瘤之抗體轉移至24孔盤中，再次篩選且若仍對於人類抗間質蛋白酶IgG單株抗體呈陽性，則藉由限制稀釋法次選殖至少兩次。隨後活體外培養穩定次純系以在組織培養基中產生少量抗體，其用於進一步表徵。
選擇編碼產生自HuMab Mouse®之間質蛋白酶_A1的融合瘤純系用於進一步分析。
實例2：針對間質蛋白酶之單株抗體的結構表徵
使用標準PCR技術獲得編碼間質蛋白酶_A1單株抗體之重鏈及輕鏈可變區之cDNA序列且使用標準DNA定序技術定序。
抗體序列可在一或多個殘基處誘變回復至生殖系殘基。
間質蛋白酶_A1之重鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列分別出示於SEQ ID NO：3及1中。
間質蛋白酶_A1之輕鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列分別出示於SEQ ID NO：4及2中。
間質蛋白酶_A1重鏈免疫球蛋白序列與已知人類生殖系免疫球蛋白重鏈序列的比較表明間質蛋白酶_A1重鏈利用來自鼠類生殖系VH 3-23之VH區段及來自人類生殖系JH JH4b之JH區段。使用CDR區測定之Kabat系統的間質蛋白酶_A1 VH序列之進一步分析產生分別如SEQ ID NO：5、6及7中所示之重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描繪。間質蛋白酶_A1 CDR1、CDR2及CDR3 VH序列與生殖系VH 3-23及生殖系JH JH4b序列之比對展示於圖2a中。
間質蛋白酶_A1輕鏈免疫球蛋白序列與已知鼠類生殖系免疫球蛋白輕鏈序列之比較表明間質蛋白酶_A1輕鏈利用來自人類生殖系VK A27之VK區段及來自人類生殖系JK JK2之JK區段。使用CDR區測定之Kabat系統的間質蛋白酶_A1 VK序列之進一步分析產生分別如SEQ ID NO：8、9及10中所示之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描繪。間質蛋白酶_A1 CDR1、CDR2及CDR3 VK序列與生殖系VK A27及生殖系JK JK2序列之比對展示於圖2b中。
實例3：使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)篩選抗原特異性抗體
藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定間質蛋白酶_A1對間質蛋白酶之細胞外主幹區之特異性。
將310μg/ml間質蛋白酶主幹蛋白質在ELISA塗佈緩衝液(100mm碳酸鈉/碳酸氫鈉)中稀釋至0.1μg/mL、以100μl轉移至孔中且在4℃下培育隔夜。
在培育之後，藉由PBST洗滌孔三次。隨後將200μl SuperBlock(Thermo Scientific)添加至各孔中且在25℃下培育30分鐘，隨後再藉由PBST洗滌孔三次。
以100μl將在PBS及0.1% BSA中自0.01μmol/L連續稀釋至30μmol/L之間質蛋白酶_A1轉移至孔中且在25℃下培育1小時，隨後藉由PBST洗滌孔三次。將山羊抗人類IgG κ特異性HRP(批號NG1876246)及山羊抗人類IgG FC特異性(批號96091)自0.01μmol/L連續稀釋至30μmol/L且以100μl轉移至孔中之每一者中，隨後在25℃下培育1小時，接著再次藉由PBST洗滌三次。隨後將100μl TMB受質添加至各孔中且在25℃下再次培育大致1小時，隨後添加100μl 1N HCL至各孔中。
使用Thermo Varioskan在450nm處讀取結果(參見圖3)。此等結果 顯示間質蛋白酶_A1結合至間質蛋白酶之主幹區。
實例4：使用針對間質蛋白酶之單株抗體的免疫組織化學
使用以下參考方案，間質蛋白酶_A1以20μg/ml用於IHC實驗中。在此等條件下，在關於以FFPE或冷凍形式製備之組織部分的結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌及乳癌中觀測到顯著染色。相同條件用於測試間質蛋白酶_A1在正常人類組織上之結合。
脫蠟及復水
在無緩衝液之水浴中在50ml Falcon中於60℃下加熱載玻片2小時。各Falcon具有一個載玻片或兩個背對背的載玻片，在其之間具有長凝膠加載尖端，用於阻止蓋玻片彼此黏著。在黑色載玻片架中於EZ-DeWax(BioGenex,CA,USA)中將載玻片脫蠟5分鐘，隨後使用1ml滴管以相同DeWax溶液充分沖洗，隨後用水洗滌。將載玻片置放於用水填充之科普林氏缸(coplin jar)中直至壓力釜準備就緒；更換水若干次。
抗原修復
用抗原修復溶液=1×檸檬酸鹽緩衝液，pH 6(DAKO)更換水。藉由壓力釜方法修復抗原。就愛那個抗原修復溶液中之塑膠科普林氏缸中之載玻片置放至壓力釜中，隨後將其加熱至位置6(最高設定)。培育15-20分鐘後，將溫度降低至位置3且在該狀態(當壓力釜內部之溫度為117℃時)下再維持20-25分鐘。隨後關閉擱架且將釜置放於冷擱架上且藉由將柄小心地移動至「打開」與「關閉」之間的位置釋放壓力。使整個系統釋放壓力且再冷卻20分鐘。打開蓋且取出樣品，將其擱置於實驗台上。藉由PBS-3T(0.5L PBS+3滴Tween-20)洗滌載玻片1×5min且將載玻片置放於PBS中。
染色
在抗原修復之後，將載玻片安置於Shandon Coverplate系統中。 藉由將蓋板置放至用PBS填充之科普林氏缸中且將具有組織切片之載玻片溫和地滑動至蓋板中阻止載玻片與塑膠蓋板之間的氣泡截留。將載玻片自科普林氏缸拔出，同時使其與蓋板緊密地保持在一起。將經組裝之載玻片置放至托架中，使漏斗中及載玻片與蓋板之間截留之PBS通過。用2×2ml(或4×1mL)PBS-3T及1×2ml PBS洗滌載玻片，等待直至所有PBS已通過載玻片且漏斗中幾乎無PBS剩餘。
使用過氧化酶阻斷試劑(S2001,DAKO)進行內源性過氧化物阻斷。每個載玻片使用1-4滴過氧化物溶液且培育5分鐘。藉由水沖洗載玻片，接著藉由2ml PBS-3T沖洗一次且藉由2ml PBS沖洗一次；在添加洗滌緩衝液之新部分之前等到漏斗中幾乎無液體生育為重要的。
用抗體稀釋試劑(DAKO)稀釋一級抗體。最佳稀釋度經測定為0.5μg/ml。將50-200μl稀釋一級抗體塗覆至各切片及/或組織微陣列；注意覆蓋整個組織。溫和地輕觸載玻片以經切片均勻地分配抗體或經切片之頂部使用滴管端。在室溫下在保濕室中培育載玻片45分鐘。用2×2ml(或4×1mL)PBS-3T接著用1×2ml PBS洗滌載玻片，等待直至所有PBS已通過載玻片且漏斗中幾乎無PBS剩餘。以1：1000應用對應驢抗山羊IgG：HRP(1500P,1mg/mL,Serotec)且在室溫下培育35分鐘。如上洗滌載玻片。在稀釋緩衝液中製造DAB受質；含有2滴受質之2ml對於10個載玻片足夠。藉由一次塗覆幾滴將DAB試劑塗覆至載玻片。所有DAB分佈在載玻片之間。將載玻片培育10分鐘。用1×2ml(或2×1mL)PBS-3T及1×2ml(或2×1mL)PBS洗滌載玻片，等待直至所有PBS已通過載玻片且漏斗中幾乎無PBS剩餘。塗覆蘇木精(DAKO)；1ml對於10個載玻片足夠且在室溫下培育載玻片1分鐘。用2ml水填充Shandon Coverplate系統之漏斗且使其通過。當對載玻片清除過量蘇木精時，拆卸系統，用來自洗滌瓶之水洗滌組織切片及/或陣列且置放至黑色載玻片架中。藉由在EZ-DeWax中培育5分鐘，接著在95%乙 醇中培育2-5分鐘使組織復水。使載玻片在室溫下於實驗台上乾燥，接著安置於安裝介質中且藉由蓋玻片覆蓋。
結果
發現間質蛋白酶表現於95%-100%結腸直腸癌(表2)臨床測試樣品、97%胃癌(表1)測試樣品、100%前列腺癌測試樣品及75%乳癌測試樣品中。
在觀測到標靶之上皮起源細胞中，偵測之表現量顯著低於類似腫瘤組織。在腎小管以及胃腸道中偶發地觀測到正常表現。
表2.結腸直腸癌中之間質蛋白酶_A1之IHC：下表概述幹蛋白質在一
實例5：單株抗體對間質蛋白酶之特異性.藉由流動式細胞測量術分析測定
藉由流動式細胞測量術測試抗體針對實例1中選擇之間質蛋白酶之特異性。為測試抗體結合至細胞表面間質蛋白酶蛋白質之能力，使抗體與表現間質蛋白酶之細胞一起培育。細胞在FACS緩衝液(DPBS、2% FBS)中洗滌，離心且再懸浮於100μl經稀釋之一級間質蛋白酶抗體(亦稀釋於FACS緩衝液中)中。抗體-細胞株複合物在冰上培 育60分鐘且隨後用如上所述之FACS緩衝液洗滌兩次。將細胞-抗體離心塊再懸浮於100μl經稀釋之二級抗體(亦稀釋於FACS緩衝液中)中，且在冰上培育60分鐘。如前所述洗滌離心塊且再懸浮於200μl FACS緩衝液中。將樣品裝載至BD FACScanto II流式細胞儀上且使用BD FACSdiva軟體分析資料。
流動式細胞測量術分析之結果表明單株抗體間質蛋白酶_A1有效地結合至表現於HT-29及H69細胞中之細胞表面人類間質蛋白酶(圖4b)。除彼等細胞株以外，亦發現間質蛋白酶_A1以高親和力結合至多種其他細胞株，包括SNU-1(圖4a)、A431(表皮樣癌)、SW620(結腸直腸腺癌)、SKOV-3(卵巢腺癌)、MCF-7(乳癌)及A549(人類肺泡腺癌)。
實例6：間質蛋白酶_A1介導之抗體依賴性細胞毒性
遵循標準程序，CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega UK Ltd)用於測定間質蛋白酶_A1抗間質蛋白酶mAb經由抗體依賴性細胞毒性(HT-29及OVCAR8細胞之ADCC)在效應細胞存在下殺死表現間質蛋白酶之細胞的能力。
使用已知經由ADCC引發細胞殺傷之抗體作為陽性對照，且使用人類IgG1同型對照作為陰性對照，結果顯示間質蛋白酶_A1能夠在HT-29細胞上引發ADCC。圖5展示在HT-29細胞上引發ADCC之間質蛋白酶_A1。
實例7：間質蛋白酶_A1單株抗體藉由HT-29及H69細胞之內化。
使用MabZAP分析，顯示間質蛋白酶_A1抗體在結合至HT-29細胞(人類結腸癌細胞株)及H69細胞(人類小細胞肺癌細胞株)時藉由該等細胞內化。MabZAP抗體結合至初級抗體。隨後，MabZAP複合物藉由該等細胞內化。沙泊寧進入細胞中導致蛋白質合成抑制及最終細胞死亡。
如下進行MabZAP分析。將細胞中之每一者以5×103個細胞/孔之密度接種。連續稀釋抗間質蛋白酶單株抗體或同型對照人類IgG，隨後添加至細胞中。隨後以50μg/ml之濃度添加MabZAP且使盤保溫48及72小時。藉由CellTiter-Glo®發光細胞活力分析套組(Promega，G7571)偵測盤中之細胞活力且藉由Luminomitor(Tuner BioSystems,Sunnyvale,CA)在490nM下讀取盤。藉由Prism(Graphpad)分析資料。
圖6展示間質蛋白酶_A1藉由HT-29及H69細胞有效內化，分別具有0.1829及0.07398之EC50。此等結果展示間質蛋白酶_A1之細胞毒性活性之增加與抗體濃度及其他抗間質蛋白酶抗體成正比。
實例8：抗間質蛋白酶抗體-藥物共軛物抑制小鼠異種移植模型中之HT-29細胞生長
檢測根據式M之間質蛋白酶_A1共軛物(在下文中稱為「間質蛋白酶_A1-式M共軛物」)對小鼠異種移植模型中來源於結腸直腸癌之HT-29細胞之生的影響。在此異種移植模型中，SCID小鼠(CB17，來自Charles River Laboratories,Hollister,CA)植入2.5×106個HT-29細胞/小鼠且使HT-29細胞生長約30天。隨後將小鼠隨機分組且藉由間質蛋白酶_A1-式M共軛物(0.03、0.1及0.3微莫耳/公斤)腹膜內(i.p.)處理。DT及抗白喉毒素抗體用作非結合同型對照。
結果顯示藉由間質蛋白酶_A1-式M共軛物處理以劑量依賴方式顯著抑制腫瘤生長率。圖7a顯示發現單劑量(以0.3莫耳/公斤：約2毫克/公斤)之毒素共軛mAb為治癒性的。圖7b顯示表明腫瘤誘發之惡病體質之改善的經60天給藥之體重改變。圖7c顯示展現對處理之劑量依賴性反應的HT-29 ADC異種移植模型中之替代劑量組。圖7d顯示展現劑量依賴性惡病體質改善之HT-29 ADC異種移植模型中之替代劑量組。
實例9：癌細胞株中之MMAE共軛及MMAF共軛抗間質蛋白酶單株抗體之功效 材料
來自Fisher Scientific,PA,USA之細胞剝離液(非酶促細胞解離)(MT-25-056CI)。
來自Fisher Scientific,PA,USA之PBS pH 7.4(1×)(SH30028LS)。
來自Fisher Scientific,PA,USA之RPMI 1640培養基(MT-10-041-CM)。
來自Promega,WI,USA之Cell Titer Glo(G7572)。
方法
使用細胞剝離液解離細胞且計數。將5e3個細胞/孔短暫離心成離心塊(對於懸浮細胞，視細胞倍增時間而定，可使用更多，諸如10e3個細胞/孔)。將離心塊再懸浮於培養基中至1e5個細胞/毫升之濃度。
將50微升/孔細胞懸浮液添加至白邊、透明底的96孔盤之孔中。抗體經稀釋且滴定至8點(3倍滴定)，相當於0-20nM之濃度(兩倍測試濃度)。將經稀釋之抗體或培養基(對於未經處理之樣品)(50微升/孔)添加至適當孔。將過量培養基(200微升/孔)添加至該盤之外部列及行以防止蒸發。該盤在37℃下培育72小時。
該盤自培育箱移出且在室溫下培育30分鐘。同時解凍Cell Titer Glo溶液。輕彈該盤且用100微升/孔PBS洗滌1次(對於懸浮細胞，首先將盤離心以使細胞集結)。將100微升/孔PBS及100微升Cell titer glo添加至各孔且濕磨混合。該盤在暗處在室溫下培育15分鐘且藉由顯微法目測以確保發生有效細胞溶解。接著在Glomax光度計上讀取該盤。
結果
表3顯示使用共軛至MMAE之抗間質蛋白酶抗體之ADC細胞毒性分析中之多種人類腫瘤細胞株之EC50值。檢測之細胞株為Coav-4(人類卵巢腺癌)、COV644(人類卵巢上皮黏液癌)、OVCAR-3(人類卵巢腺癌)、OV90(人類乳頭狀的漿液腺癌)、HCC70(人類乳腺管癌ER陰 性、PR陰性及Her2陰性)、HCC1143(人類乳腺管癌ER陰性、PR陰性及Her2陰性)、BT474(人類乳腺管癌)、PC-3(人類前列腺癌)、N87(人類胃腺癌)、SNU16(人類胃腺癌)、KATOIII(人類胃腺癌)、ST16(人類胃腺癌)、HT-29(人類結腸直腸腺癌)及DMS79(肺小細胞癌)細胞。表3亦顯示共軛至Coav-4、COV644、OVCAR-3、OV90、PC-3、N87、SNU16及KATOIII細胞株中之MMAF的抗間質蛋白酶抗體之EC50值。此等結果展示共軛至MMAE之抗間質蛋白酶抗體及共軛至MMAF之抗間質蛋白酶抗體在>1nM下之細胞毒性活性(參見圖8)。
實例10：卵巢癌異種移植模型中之MMAE共軛及MMAF共軛抗間質蛋白酶單株抗體之功效
在OVACAR-3裸鼠異種移植模型中測試間質蛋白酶_A1_MMAE及間質蛋白酶_A1_MMAF之功效。
藉由OVACAR-3(人類卵巢腺癌)腫瘤細胞對免疫缺陷無胸腺裸小鼠皮下接種。允許建立腫瘤且將小鼠分成七個處理組，每組5-8隻小鼠。當平均腫瘤體積達到每組167mm3之平均尺寸時，用以指定劑量靜脈內投與之以下化合物中之一者處理各組：第1組(媒劑；20mM丁 二酸鈉，pH 5.0，6%海藻糖，0.04%聚山梨醇酯；n=8)；第2組(間質蛋白酶_A1_MMAE；1mg/kg；n=8)，第3組(間質蛋白酶_A1_MMAE；3mg/kg；n=8)，第4組(同型對照-MMAE；3mg/kg；n=5)，第5組(間質蛋白酶_A1_MMAF；1mg/kg；n=8)，第6組(間質蛋白酶_A1_MMAF；3mg/kg；n=8)，第7組(同型對照-MMAF；3mg/kg；n=5)。監測體重(BW)，時常檢查小鼠之健康狀況及不良副作用，且每週量測腫瘤兩次。在腫瘤接種後82天將小鼠安樂死。在ADC處理小鼠對比PBS處理小鼠中，由抗腫瘤活性(處理組之平均腫瘤尺寸/對照組之平均腫瘤尺寸×100)及平均時間端點(TTE)增加測定功效。在接種後第71天，在媒劑處理之對照小鼠中取樣五個最大的腫瘤，藉由福馬林固定及石蠟包埋加工。
結果
圖9顯示間質蛋白酶_A1_MMAE及間質蛋白酶_A1_MMAF各自表明相比於對照組的OVACAR-3裸鼠異種移植模型中之顯著抗腫瘤活性。3mg/kg下之間質蛋白酶_A1_MMAE產生在研究之第61天的8/8位倖存者、八個完全消退、最大可能腫瘤生長延緩(85%)及顯著生存擴展(相比於其同型對照組及媒劑對照組)。間質蛋白酶_A1_MMAF產生3mg/kg下之68% TGD、兩位倖存者、三個部分消退及一個完全消退。所有處理為良好耐受的且未觀察到毒性臨床症狀。此等資料表明針對例如間質蛋白酶_A1_MMAE及間質蛋白酶_A1_MMAF之間質蛋白酶之ADC在人類三陰性乳癌患者之治療中提供臨床效益之潛能。如自此等結果可見，間質蛋白酶_A1_MMAE在此異種移植模型中產生人意料的優良作用。
實例11：食蟹獼猴中之MMAE共軛及MMAF共軛抗間質蛋白酶單株抗體之毒性
分配十隻猴進行研究，每組具有一隻每種性別之猴。如表4中所 呈現，藉由15分鐘靜脈內輸注以0毫克/公斤/劑量(PBS，媒劑)、1毫克/公斤/劑量(間質蛋白酶_A1_MMAE)、3毫克/公斤/劑量(間質蛋白酶_A1_MMAE)、3毫克/公斤/劑量(間質蛋白酶_A1_MMAF)6毫克/公斤/劑量(間質蛋白酶_A1_MMAF)投與媒劑(PBS)、間質蛋白酶_A1_MMAE或間質蛋白酶_A1_MMAF兩次(在第1天及第29天)。在劑量開始(第1天)之前及各劑量後1、2、3、7、14、21及28天採集血液樣品用於毒物動態學評估。在劑量開始(第1天)之前及各劑量後1、3、7、14、21及28天(在第1劑量後28天亦充當第2劑量之劑量前時間點)採集血液樣品用於臨床病理學分析。在第57天最終血液採集後將所有研究動物安樂死且驗屍。將自每次抽取之血液分離之血漿隔離、冷凍且運送至Oxford BioTherapeutics,Inc.以便藉由ELISA分析ADC濃度。
結論
食蟹獼猴經由15分鐘靜脈內輸注分別輸注兩次劑量之PBS、達至3.0毫克/公斤/劑量之間質蛋白酶_A1_MMAE(可裂解)或達至6.0毫克/公斤/劑量之間質蛋白酶_A1_MMAF(不可裂解)為耐受良好的。在研究過程期間未觀測到死亡或瀕死。在用間質蛋白酶_A1_MMAE或間質蛋白酶_A1_MMAF處理之動物中未觀測到臨床症狀、一或多個體重及體重變化或食物消耗的變化。
僅在各輸注之後的一天對於一隻第3組(間質蛋白酶 _A1_MMAE，3毫克/公斤/日)雄性；兩隻第4組(間質蛋白酶_A1_MMAF，3毫克/公斤/日)猴；及兩隻第5組(間質蛋白酶_A1_MMAF，6毫克/公斤/日)猴注意到AST值的增加。第3組雄性在各輸注之後的一天之LDH值亦增加。AST或LDH在任何其他時間點無增加。此等發現與檢測的有限數目之組織中之組織病理學發現不相關。增加為測試物品相關的但並非不良的。第3組(間質蛋白酶_A1_MMAE，3毫克/公斤/日)雄性及雌性之增加的BUN值可與測試物品投與相關，但鑒於缺乏與其他研究參數之相關性及增加之量級，其並非毒理學顯著的。對於血液學、凝血或尿分析參數不存在測試物品相關作用。不存在絕對及相對器官重量之處理相關總體病理學發現或變化。組織病理學上，第2組(間質蛋白酶_A1_MMAE，1毫克/公斤/日)雌性；第4組(間質蛋白酶_A1_MMAF，3毫克/公斤/日)雌性；及第5組(間質蛋白酶_A1_MMAF，6毫克/公斤/日)雄性之脾動脈周圍鞘中顯著數目之淋巴細胞可能為測試物品相關的，但不具有毒理學顯著性。
序列表概述
<110> 英商牛津生物治療公司
<120> 抗體
<130> OB058-PCT
<150> US61/908,371
<151> 2013-11-25
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
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<211> 10
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<400> 36

Claims (28)

  1. 一種經分離抗體或其抗原結合部分，其：(a)會與由包括包含SEQ ID NO：1中所出示之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：2中所出示之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體所識別之間質蛋白酶之主幹區上的抗原決定基結合，或(b)會與包括包含SEQ ID NO：1中所出示之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：2中所出示之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至間質蛋白酶之該主幹區。
  2. 一種經分離抗體或其抗原結合部分，其結合至間質蛋白酶之主幹區，該抗體包含：a)重鏈可變區，其包含：i)包含SEQ ID NO：5之第一vhCDR；ii)包含SEQ ID NO：6之第二vhCDR；及iii)包含SEQ ID NO：7之第三vhCDR；及b)輕鏈可變區，其包含：i)包含SEQ ID NO：8之第一vlCDR；ii)包含SEQ ID NO：9之第二vlCDR；及iii)包含SEQ ID NO：10之第三vlCDR；視情況其中以上SEQ ID NO中之任一者獨立地包含一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、添加或缺失。
  3. 如請求項1或2之經分離抗體或其抗原結合部分，其包含與SEQ ID NO：1具有至少80%、85%、90%、95%或99%胺基酸序列一致性之重鏈及與SEQ ID NO：2具有至少80%、85%、90%、95%或99%胺基酸序列一致性之輕鏈。
  4. 如請求項1或2之經分離抗體或其抗原結合部分，其進一步包含共價連接之部分。
  5. 如請求項4之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該部分為藥物部分或放射性部分。
  6. 如請求項5之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該藥物係選自由以下組成之群：類美登素(maytansinoid)、海兔毒素(dolastatin)、哈米特林(hemiasterlin)、奧瑞他汀(auristatin)、新月毒素(trichothecene)、卡奇黴素(calicheamicin)、CC1065及其衍生物。
  7. 如請求項6之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該藥物為選自由MMAE及MMAF組成之群之類美登素。
  8. 如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
  9. 如請求項8之經分離抗體，其中該抗體為已提高與Fc受體之結合性及/或已提高針對ADCC之效能的經工程改造抗體及/或雙特異性抗體。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合部分，以及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。
  11. 一種核酸，其編碼如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合部分之重鏈。
  12. 一種核酸，其編碼如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合部分之輕鏈。
  13. 一種表現載體，其包含可操作地連接於一或多個調節元件之如請求項11之核酸及/或可操作地連接於一或多個調節元件之如請求項12之核酸。
  14. 一種宿主細胞，其包含：(i)表現載體，其包含可操作地連接於一或多個調節元件之如請求項11之核酸及可操作地連接於一或多個調節元件之如請求項12之核酸；或(ii)第一表現載體，其包含可操作地連接於一或多個調節元件之如請求項11之核酸，及第二表現載體，其包含可操作地連接於一或多個調節元件之如請求項12之核酸。
  15. 一種製造抗體或其抗原結合部分之方法，其包含在表現該抗體或其抗原結合部分之條件下培養如請求項14之宿主細胞，及視情況分離該抗體或其抗原結合部分。
  16. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合部分，其用於治療癌症。
  17. 如請求項16所用之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分被表現該間質蛋白酶之主幹區之細胞內化。
  18. 如請求項16所用之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分包含共價連接之藥物共軛物。
  19. 如請求項18所用之抗體或其抗原結合部分，其中該共價連接之藥物共軛物為奧瑞他汀(auristatin)，較佳為MMAE。
  20. 如請求項16所用之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
  21. 如請求項16所用之抗體或其抗原結合部分，其中該癌症係選自由以下組成之群：胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳為非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))及皮膚癌。
  22. 一種如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其用於製造用於治療癌症之藥物。
  23. 如請求項22之用途，其中該抗體或其抗原結合部分被表現該間質蛋白酶之主幹區之細胞內化。
  24. 如請求項22或23之用途，其中該抗體或抗原結合部分包含共價連接之藥物共軛物。
  25. 如請求項24之用途，其中該共價連接之藥物共軛物為奧瑞他汀，較佳為MMAE。
  26. 如請求項22之用途，其中該抗體誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
  27. 如請求項22或23之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：胃癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌(較佳為SCLC)、食道癌、頭頸癌、胰臟癌、淋巴瘤(較佳為非霍奇金氏淋巴瘤)及皮膚癌。
  28. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合部分，其用於治療或用作藥物。
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