TWI397536B - 基因重組之抗體組成物 - Google Patents
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Description
本發明係關於顯示較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體有更高補體依賴性細胞傷害活性之基因重組抗體組成物,係將人類IgG1抗體含Fc區中之CH2功能域(domain)之多胜肽,置換為相當於由Kabat等人於EU Index(以下,為EU Index)之人類IgG3抗體之相同位置的胺基酸序列組成的多胜肽;及關於編碼該基因重組抗體組成物中所含抗體分子或該抗體分子之重鏈恆定區之DNA、將該DNA導入宿主細胞所得之轉形體、使用該轉形體之基因重組抗體組成物之生產方法、及含有該基因重組抗體組成物為有效成分之醫藥。
抗體因具有高的結合活性、結合特異性及血中高安定性而被嘗試用作為人類各種疾病之診斷、預防及治療藥之應用(非專利文獻1)。又,利用基因重組技術,由非人類動物抗體製作人型嵌合抗體或人化抗體(非專利文獻2~5)。人型嵌合抗體之抗體可變區為人類以外之動物抗體、恆定區由人類抗體所構成。人化抗體為人類以外之動物抗體之互補決定區(以下,表記為CDR)被人類抗體之CDR置換的抗體。人型嵌合抗體及人化抗體解決非人類動物抗體之高免疫原性、低效應劑(effector)機能、短的血中半衰期等之鼠抗體等問題,而可作為單株抗體之醫藥品之應用(非專利文獻6~9)。例如美國已販售認可作為癌症治療用抗體之複個人化抗體(非專利文獻10)。
此等人型嵌合抗體及人化抗體,實際上於臨床僅顯示某種程度之效果,但仍冀望有更高效果之高抗體醫藥,例如,對CD20之人型嵌合抗體利妥昔單抗(Rituxan)(非專利文獻11)(IDEC公司/Roche公司/Genentech公司)之單獨投與,對於再發性低惡性度之非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)患者之第III期臨床試驗的奏效率未超過48%(完全寬解6%、部分寬解42%)又,報告其平均之效果持續期間為12個月(非專利文獻12)。以利妥昔單抗與化學療法(CHOP:環磷醯胺,多柔比星(Doxorubicin)、維克思丁(Vincristine))之併用,對於再發性低惡性度及濾泡性之非何杰金氏淋巴瘤患者之第II期臨床試驗中,報告奏效率為95%(完全寬解55%、部分寬解45%),但認為係由於CHOP造成之副作用所致(非專利文獻13)。報告對於HER2之人化抗體赫塞汀(Herceptin)(Genentech公司)為單獨投與,對轉移性乳癌患者之第III期臨床試驗中奏效率僅為15%,平均之效果持續期間為9.1個月(非專利文獻14)。
人類抗體分子亦稱為免疫球蛋白(以下稱為Ig),由其分子構造分類為IgA、IgD、IgE、IgG、IgM各群。作為抗體醫藥主要使用之人類IgG(以下稱為IgG)抗體分子由每2條稱為重鏈(heavy chain,以下稱為H鏈)及輕鏈(light chain,以下稱為L鏈)之多胜肽者所形成。H鏈為由稱為N末端側H鏈可變區(以下記載為VH)、CH1、鉸鏈(hinge)、CH2、CH3之各功能域構造所形成。若合併之CH1、鉸鏈、CH2、CH3各功能域稱重鏈恆定區(以下,記載為CH),則合併CH2、CH3之各功能域亦稱為Fc區。L鏈為由N末端側之L鏈可變區(以下記載為VL)、L鏈恆定區(以下記載為CL)之各功能域構造所形成。
IgG抗體之H鏈中存有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之4個亞群。各IgG亞群之H鏈彼此具有除去富含可變性之鉸鏈外之恆定區中95%左右的胺基酸序列相同性(第1圖)。
各IgG亞群與胺基酸序列之相同性高並無關,有此等之生物活性之強弱為不同(非專利文獻15)。作為生物活性,若有補體依存性細胞傷害活性(以下,略稱為CDC活性)、抗體依存性細胞傷害活性(以下,略稱為ADCC活性)、巨噬活性等效應劑機能,此等會於活體內完成異物或病原體排除等重要的任務。
自然殺手細胞(以下稱為NK細胞)、單核球、巨噬細胞、顆粒球等種種白血球的表面上表現Fcγ受體(以下記載為FcγR)之家族。FcγR分類為FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb之活性型FcγR,與FcγRIIb之抑制型FcγR。IgG抗體,特別是人類之IgG1與IgG3與此等受體之強結合而此結果誘導因白血球之ADCC活性或巨噬活性。
ADCC活性係指,與抗原結合之抗體,主要以Fc部分介於NK細胞表面之FcγRIIIa而結合,由此結果,自NK細胞放出的穿孔素(perforin)或顆粒素(granzyme)等細胞傷害性分子造成之細胞融解反應(非專利文獻16、17)。ADCC活性之強度,一般為IgG1>IgG3>>IgG4≧IgG2的順序(非專利文獻18、19)。
CDC活性係指,與抗原結合之抗體,活化血清中稱為補體系的一群血清蛋白質之反應串級,而最終地融解標的細胞之反應。CDC活性於人類IgG1及IgG3中為高的,此強度一般為IgG3≧IgG1>>IgG2≒IgG4之順序。補體系分類為C1~C9之各成分,其多半為表現遭受部分分解之酵素活性的酵素前驅物。CDC活性開始於最初C1之一成分之Clq向標的細胞上抗體之Fc區的結合,各成分因前階段之成分遭受部分分解而進行活性化的串級,而最終地於標的細胞之細胞膜上形成稱為C5~C9之膜侵襲複合體的孔形成聚合體,造成細胞之溶解反應(非專利文獻16、17)。
於臨床上使用的抗體醫藥之藥效機制,認識到上述效應劑機能之重要性。上述利妥昔單抗,為IgG1亞群之人型嵌合抗體,不僅顯示活體外之ADCC活性及C DC活性(非專利文獻21),於臨床效果上亦顯示於ADCC活性之強基因型的患者上治療效果高(非專利文獻22),投與後快速由血中消耗補體成分(非專利文獻23),投與後再發的患者之癌細胞中有抑制CDC活性的因子之CD59的表現上昇(非專利文獻24)等,暗示利妥昔單抗實際於患者體內發揮效應劑機能。赫塞汀亦為IgG1亞群之人化抗體,報告於活體外有ADCC活性(非專利文獻25)。
由以上內容,人類IgG1抗體與其他亞群比較,具有強的ADCC活性及CDC活性,又於人類血中之半衰期長等原因,最適合作為抗體醫藥。
為機能解析IgG抗體,可進行製作交換不同IgG亞群間功能域單位的抗體之研究。1980年代後半,Morrison等人於IgG1與IgG4之問,或IgG2與IgG3之間替換重鏈恆定區之各功能域(CH1、CH2、CH3、鉸鏈)的抗體分子作為重組蛋白質的表現可能,或IgG3與IgG4之鉸鏈互相交換的抗體,顯示各自原本抗體之補體固定化能及Fc受體結合能無變化(專利文獻1)。之後,調查彼等IgG1與IgG4、及IgG2與IgG3之功能域交換抗體的結果,顯示對於IgG1之CDC活性,CH2之C末端側為重要,對於IgG3之CDC活性,CH2為重要的(非專利文獻26),對於為Fc受體之一種的FcγRI之IgG1及IgG3之結合上CH2功能域或鉸鏈為重要(非專利文獻27)等。
已知Clq結合抗體分子之Fc區,對人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之單量體的Clq之結合常數(Ka)各自為1.2×104
、0.64×104
、2.9×104
、0.44×104
M- 1
(非專利文獻20)。如上所述,Fc區中以CH2功能域為特別重要(非專利文獻26),更詳細地,已知人類IgG1,由Kabat等人之EU Index的定義(非專利文獻28),CH2中之Leu235(非專利文獻29)、Asp270、Lys322、Pro329、Pro331(非專利文獻30),人類IgG3中Gly233、Leu234、Leu235、Gly236(非專利文獻31)、Lys322(非專利文獻32)為重要的。
可嘗試將CDC活性中最高亞群之人類IgG3的重鏈恆定區之胺基酸序列的一部分置換來自其他亞群的胺基酸序列而更增強CDC活性。各IgG亞群之鉸鏈長度,IgG1為15個胺基酸、IgG2為12個胺基酸、IgG3為62個胺基酸、IgG4為12個胺基酸,將人類IG3與其他IgG亞群比較,具有鉸鏈區為較長的構造特徴(非專利文獻1)。Michaelsen等人,將多胜肽人類IgG3之鉸鏈由野生型之62個胺基酸削除N端末側3個外顯子而縮短15個胺基酸的Ig之CDC活性,顯示較IgG3及IgG1更上升(非專利文獻33)。又Norderhaug等人顯示,將短縮的前述鉸鏈胺基酸序列靠近IgG4之鉸鏈胺基酸序列而進一步提升CDC活性(非專利文獻34)。又Brekke等人,將鉸鏈部分置換為IgG1之IgG3,同時將鉸鏈部分,及CH1之N末端部分置換為於IgG1之IgG3,CDC活性較IgG3更高,成為與IgG1同等以上(非專利文獻35)。
又製作人類IgG重鏈恆定區所有胺基酸序列中導入變異的IgG之變異體,檢討此等變異體與Clq結合活性上昇的CDC活性亦增強。Idusogie等人,報告具有人類IgG1恆定區及小鼠由來的可變區之抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗之重鏈恆定區中之CH2功能域中的EU Index 326編號之Lys,或333編號的Glu置換為其他胺基酸,最大增強2倍左右之CDC活性(非專利文獻36、專利文獻2)。Idusogie等人進一步顯示,為IgG1數百分之一左右的CDC活性之IgG2的CDC活性,經由將人類IgG2之EU Index 326編號之Lys、或333編號之Glu以其他胺基酸置換,使其上升至IgG1之CDC活性之1/25左右(專利文獻3~5)。
抗體醫藥之治療效果上ADCC活性或巨噬活性等FcγR依存的活性與CDC活性之兩者為重要的。然而,由於引發CDC活性之初期階段的Clq結合,及引起ADCC活性之初期階段之向FcγR的結合介入共同抗體之Fc,於CDC活性增強時亦有損及ADCC活性之可能性。Idusogie等人報告增強CDC活性的IgG1之Fc胺基酸之點突變導入體,ADCC活性會大幅降低(非專利文獻36)。
又具有人類IgG恆定區之抗體之ADCC活性,添加CH2功能域之297編號之天冬醯胺酸的N-糖苷結合複合型糖鏈之構造(第2圖顯示模式圖)的變化為已知(專利文獻6)。已報告依存於結合抗體之糖鏈之半乳糖及N-乙醯基葡糖胺之含量,而抗體之ADCC活性會變化(非專利文獻37~40),最為影響ADCC活性者,為還原末端之N-乙醯基葡糖胺中α1,6結合的岩藻糖(fucose),具有岩藻糖未結合於還原末端之N-乙醯基葡糖胺的N-糖苷結合複合型糖鏈的IgG抗體,顯示較岩藻糖結合於還原末端之N-乙醯基葡糖胺上的N-糖苷結合複合型糖鏈的IgG抗體有更顯著高的ADCC活性(非專利文獻41、42、專利文獻7)。生產具有岩藻糖未結合於還原末端之N-乙醯基葡糖胺上的N-糖苷結合複合型糖鏈的抗體組成物之細胞,已知有剔除α1,6-岩藻糖基轉移酶(fucosyltransferase)基因之細胞(專利文獻7、8)。
人類IgG3與其他亞群相異,由於不具有蛋白質A結合活性(非專利文獻1),作為醫藥而製造時純化有困難。IgG分子已知會與蛋白質A與CH2功能域與CH3功能域之交界面(interface)會合,具體而言CH2之免疫球蛋白構造(immunoglobulin fold)之EU Index 252編號至254編號、308編號至312編號、CH3之免疫球蛋白構造之433編號至436編號之胺基酸組成的圈套部分為重要者由X射線結晶解析而暗示(非專利文獻43)。進一步由核磁共振法(NMR法)解析,顯示IgG1之CH2中之Ile253、Ser254、His310、Gln311,及CH3中之His433、His435、His436為特別重要的(非專利文獻44)。又Kim等人發現,將表現人類IgG1之重鏈恆定區之His435,替換IgG3由來之Arg而減弱蛋白質A結合活性(非專利文獻45)。
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,(1991)【非專利文獻29】Immunology,86,319(1995)【非專利文獻30】J.Immunol.,164,4178(2000)【非專利文獻31】Mol.Immunol.,34,1019(1997)【非專利文獻32】Mol.Immunol.,37,995(2000)【非專利文獻33】Scand.J.Immunol.,32,517(1990)【非專利文獻34】Eur.J.Immunol.,21,2379(1991)【非專利文獻35】Mol.Immunol.,30,1419(1993)【非專利文獻36】J.Immunol.,166,2571(2001)【非專利文獻37】Human Antib Hybrid,5,143(1994)【非專利文獻38】Human Antib Hybrid,6,82(1995)【非專利文獻39】Nat.Biotechnol.,17,176(1999)【非專利文獻40】Biotechnol.Bioeng.,74,288(2001)【非專利文獻41】J.Biol.Chem.,277,26733(2002)【非專利文獻42】J.Biol.Chem.,278,3466(2003)【非專利文獻43】Biochemistry,20,2361(1981)【非專利文獻44】FEBS Lett.,328,49(1993)【非專利文獻45】Eur.J.Immunol.,29,2819(1999)
【專利文獻1】EP0327378A1【專利文獻2】US2003/0158389A1【專利文獻3】WO00/42072【專利文獻4】US2004/0132101A1【專利文獻5】US2005/0054832A1【專利文獻6】WO00/61739【專利文獻7】WO02/31140【專利文獻8】WO03/85107
希冀不具有抗原性,且CDC活性、ADCC活性等效應劑機能被增強,治療效果高的抗體。又,希冀作醫藥品製造為可能的抗體。
本發明係關於以下(1)~(25)。
(1)一種基因重組抗體組成物,係將於人類IgG1抗體所含Fc區中之CH2功能域的多胜肽,置換為相當於Kabat等人於EU Index(以下、EU Index)中人類IgG3抗體的相同位置的胺基酸序列構成的多胜肽,顯示較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體有更高的補體依存性細胞傷害活性。
(2)如上列(1)所述基因重組抗體組成物,其進一步具有對蛋白質A為與人類IgG1抗體相同的結合活性。
(3)如上列(1)所述基因重組抗體組成物,含經置換人類IgG1抗體之Fc區中之CH2功能域的多胜肽,係選自以下1~10者中任一者之多胜肽:1.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至340編號之胺基酸序列構成的多胜肽2.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至356編號之胺基酸序列構成的多胜肽3.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至358編號之胺基酸序列構成的多胜肽4.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至384編號之胺基酸序列構成的多胜肽5.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至392編號之胺基酸序列構成的多胜肽6.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至397編號之胺基酸序列構成的多胜肽7.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至422編號之胺基酸序列構成的多胜肽8.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至434編號及436編號至447編號之胺基酸序列構成的多胜肽9.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至435編號之胺基酸序列構成的多胜肽10.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至447編號之胺基酸序列構成的多胜肽。
(4)如上列(2)所述基因重組抗體組成物,含經置換人類IgG1抗體之Fc區中之CH2功能域的多胜肽,係選自以下1~8者中任一者之多胜肽:1.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至340編號之胺基酸序列構成的多胜肽2.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至356編號之胺基酸序列構成的多胜肽3.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至358編號之胺基酸序列構成的多胜肽4.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至384編號之胺基酸序列構成的多胜肽5.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至392編號之胺基酸序列構成的多胜肽6.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至397編號之胺基酸序列構成的多胜肽7.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至422編號之胺基酸序列構成的多胜肽8.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至434編號之胺基酸序列構成的多胜肽。
(5)如上列(1)~(4)項中任一項之基因重組抗體組成物,為Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子所構成之基因重組抗體組成物,該組成物中所含結合Fc區之全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上岩藻糖未結合的糖鏈比例為20%以上。
(6)如上列(1)~(4)項中任一項之基因重組抗體組成物,為Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子所構成之基因重組抗體組成物,該抗體之Fc區結合的N-糖苷結合複合型糖鏈為該糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖的糖鏈。
(7)一種DNA,其編碼上列(1)~(4)項中任一項之基因重組抗體組成物。
(8)一種DNA,其編碼上列(1)~(4)項中任一項之基因重組抗體組成物中所含抗體分子之重鏈恆定區。
(9)一種轉形體,係將上述(8)之DNA導入宿主細胞而得。
(10)如上列(9)之轉形體,其中宿主細胞為對辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造之凝集素(lectin)有耐性的細胞。
(11)如上列(9)之轉形體,其中宿主細胞為具有生產下列抗體組成物之能力,於導入編碼抗體分子的基因時,於Fc區上有N-糖苷結合複合型糖鏈的抗體分子構成的組成物,該組成物中所含結合Fc區的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖的糖鏈之比例為20%以上的抗體組成物。
(12)如上列(11)之轉形體,岩藻糖未結合的糖鏈為該岩藻糖之1位於N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上未α結合的糖鏈。
(13)如上列(9)之轉形體,宿主細胞為,與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素,或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性會降低或失活而基因體被改變的細胞。
(14)如上列(9)之轉形體,宿主細胞為,與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素,或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體上的等位基因(allele)全被剔除的細胞。
(15)如上列(13)或(14)之轉形體,與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素為選自GDP-甘露糖4,6-脫水酶(GMD)或GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶(Fx)之酵素。
(16)如上列(15)之轉形體,GDP-甘露糖4,6-脫水酶為選自以下(a)及(b)組成之群的DNA編碼的蛋白質:(a)序列編號18所示核苷酸序列構成的DNA;(b)於嚴格條件下與序列編號18所示核苷酸序列構成的DNA雜交且編碼具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質之DNA。
(17)如上列(15)之轉形體,GDP-甘露糖4,6-脫水酶為選自以下(a)~(c)組成之群的蛋白質:(a)序列編號19所示胺基酸序列構成的蛋白質;(b)序列編號19所示胺基酸序列中,1個以上胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成且具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質;(c)與序列編號19所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列構成且具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質。
(18)如上列(15)之轉形體,GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶為選自以下(a)及(b)組成之群之DNA編碼的蛋白質:(a)序列編號20所示核苷酸序列構成的DNA;(b)於嚴格條件下與序列編號20所示核苷酸序列構成的DNA雜交且編碼具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性的蛋白質的DNA。
(19)如上列(16)之轉形體,GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶為選自以下(a)~(c)組成之群的蛋白質:
(a)序列編號21所示胺基酸序列構成之蛋白質;(b)序列編號21所示胺基酸序列中,1個以上胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所構成,且具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性的蛋白質;(c)與序列編號21所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列所構成,且具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性的蛋白質。
(20)如上列(13)或(14)之轉形體,與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素為α1,6-岩藻糖基轉移酶。
(21)如上列(20)之轉形體,α1,6-岩藻糖基轉移酶為選自以下(a)~(d)組成之群的DNA編碼的蛋白質:(a)序列編號22所示核苷酸序列構成的DNA:(b)序列編號23所示核苷酸序列構成的DNA;(c)於嚴格條件下與序列編號22所示核苷酸序列構成的DNA雜交,且編碼具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA;(d)於嚴格條件下與序列編號23所示核苷酸序列構成的DNA雜交,且編碼具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
(22)如上列(20)之轉形體,α1,6-岩藻糖基轉移酶為選自以下(a)~(f)組成之群的蛋白質:(a)序列編號24所示胺基酸序列構成的蛋白質;(b)序列編號25所示胺基酸序列構成的蛋白質;(c)序列編號24所示胺基酸序列中,1個以上之胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質;(d)序列編號25所示胺基酸序列中,1個以上之胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質;(e)與序列編號24所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質;(f)與序列編號25所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
(23)如上列(9)~(22)中任一項之轉形體,宿主細胞為選自下列(a)~(i)組成之群的細胞:(a)中國倉鼠卵巢組織由來CHO細胞;(b)大鼠骨髓瘤細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;(c)小鼠骨髓瘤細胞株NS0細胞;(d)小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0-Ag14細胞;(e)黃金鼠腎臓組織由來BHK細胞;(f)生產抗體的融合瘤細胞;(g)人類白血病細胞株Namalwa細胞;(h)胚胎幹細胞;(i)受精卵細胞。
(24)一種基因重組抗體組成物之製造方法,其特徵為將上列(9)~(23)中任一項之轉形體於培養基中培養,於培養物中生成蓄積抗體組成物,收取該抗體組成物,並純化。
(25)一種藥物,其以上列(1)~(6)項中任一項之基因重組抗體組成物為有效成分。
依據本發明可提供,人類IgG1抗體中,含Fc區中的CH2功能域的多胜肽置換為來自相當於Kabat等人於EU Index之人類IgG3抗體相同位置的胺基酸序列所構成的多胜肽,而顯示較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體有更高補體依存性細胞傷害活性的基因重組抗體組成物;編碼該基因重組抗體組成物中所含抗體分子或該抗體分子之重鏈恆定區的DNA;將該DNA導入宿主細胞所得的轉形體;使用該轉形體的基因重組抗體組成物之生產方法;及含有以該抗體組成物為有效成分的醫藥。
抗體分子由稱為H鏈及L鏈的多胜肽構成。又,H鏈由N末端側可變區(VH)、CH所構成,L鏈由N末端側可變區(VL)、CL之各區域所構成。CH進一步由N末端側之CH1功能域、鉸鏈功能域、CH2功能域、CH3功能域之各功能域所構成。功能域為構成抗體分子之各多胜肽的機能性構造單位。又,CH2功能域與CH3功能域合併稱為Fc區。
本發明之CH1功能域、鉸鏈功能域、CH2功能域、CH3功能域、Fc區,依來自Kabat等人之EU Index〔Sequence of proteins of Immunological Interest Ed.5t h
,(1991)〕,可特定自N末端的胺基酸殘基編號。具體而言,各自特定CH1為EU Index 118~215號胺基酸序列,鉸鏈為EU Index 216~230號胺基酸序列,CH2為EU Index 231~340號胺基酸序列,CH3為EU Index 341~447號胺基酸序列。
本發明之基因重組抗體組成物,於人類IgG1抗體中,有重鏈恆定區之CH1、鉸鏈、CH2及CH3之各功能域交換對應的IgG3之功能域的基因重組抗體(以下,可稱為功能域交換抗體)組成物中,人類IgG1抗體中,含Fc區中的CH2功能域的多胜肽被置換為相當於來自Kabat等人之EU Index中的人類IgG3抗體的相同位置的胺基酸序列構成的多胜肽之基因重組抗體組成物,亦可為顯示較人類IgG1抗體及IgG3抗體更高的補體依存性細胞傷害活性的基因重組抗體組成物所構成的抗體組成物。
本發明之基因重組抗體組成物,係具有重鏈恆定區且具有向標的分子之結合活性之抗體,或具有重鏈恆定區且具有向標的分子之結合活性之融合蛋白質亦被包含。
具有向標的分子結合活性的抗體可列舉人型嵌合抗體、人化抗體、人類抗體。
作為具有重鏈恆定區且向標的分子結合活性的融合蛋白質,標的分子為配位體時,對該配位體之受體與重鏈恆定區之融合蛋白質,標的分子為受體時,對該受體的配位體與重鏈恆定區之融合蛋白質,為具有向標的分子之結合活性的抗體或抗體片段與重鏈恆定區之融合蛋白質等。
人型嵌合抗體意指人類以外之動物之抗體的VH及VL與人類抗體之CH及CL構成的抗體。人類以外之動物為小鼠、大鼠、倉鼠、兔子等,若可製作融合瘤者,可使用任何一者。
本發明之人型嵌合抗體,由生產單株抗體的融合瘤,取得編碼VH及VL之cDNA,各自插入具有編碼人類抗體CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體而構築人型嵌合抗體表現載體,經導入動物細胞表現而可被製造。
人型嵌合抗體之CH,屬於人類免疫球蛋白(hIg)者皆可,但以hIgG群為最適合,進一步亦可使用屬於hIgG群之γ1、γ2、γ3、γ4亞群任一者。又,作為人型嵌合抗體之CL者,屬於hIg任一者皆可,可使用群或λ群。
人化抗體,係指將人類以外之動物的抗體的VH及VL之CDR的胺基酸序列於適切位置移植人類抗體之VH及VL的抗體。
本發明之人化抗體,由編碼人類以外動物的抗體之VH及VL之CDR的胺基酸序列移植任意人類抗體之VH及VL之FR的區域之cDNA所構築,各自插入具有編碼人類抗體之CH及CL的DNA之動物細胞用表現載體中而構築人化抗體表現載體,導入動物細胞而表現,其可被製造。
人化抗體之CH,可為屬於hIg任一者皆可,但以hIgG群為最宜,進一步可使用屬於hIgG群之γ1、γ2、γ3、γ4亞群任一者。又,人型CDR移植抗體之CL,屬於hIg任一者皆可,可使用群或λ群。
人類抗體,原來係指人類體內天然存在的抗體,但最來由於遺傳工程、細胞工程、發生工程的技術進歩製作出人類抗體唑菌體庫及人類抗體產生轉基因動物所得抗體等亦包含在內。
人體體內存在的抗體,例如為將人類末梢血液淋巴球單離,使其感染EB病毒而不死化,經由選殖,可培養生產抗體之淋巴球,而可由培養物中純化該抗體。
人類抗體唑菌體庫,係將來自人類B細胞調製的抗體基因插入噬菌體基因而於噬菌體表面上表現Fab、scFv等抗體片段庫。由該抗體噬菌體庫,作為對於將抗原固定化的基質的結合活性之指標,可將表現具有所欲之抗原結合活性的抗體片段的唑菌體回收。該抗體片段,經由進一步的遺傳工程技術,亦可對2條完全的H鏈及2條完全的L鏈組成的人類抗體分子做變換。
生產人類抗體之轉基因動物,係指將人類抗體基因編入細胞內的動物。具體而言,可經由將人類抗體基因導入小鼠ES細胞,將該ES細胞移植至其他小鼠的初期胚胎後,而發生產生人類抗體之轉基因動物。由生產人類抗體之轉基因動物之人類抗體的製作方法,依據通常之人類以外的哺乳動物中進行的融合瘤製作方法而得到人類抗體產生融合瘤,以此培養的培養物中可生產蓄積人類抗體。
具有與標的分子之結合活性的抗體片段可列舉如含有Fab、Fab’、F(ab’)2
、scFv、Diabody、dsFv、CDR之胜肽等。
Fab為於將IgG以蛋白質分解酵素木瓜酵素處理所得的片段中(將H鏈之224編號之胺基酸殘基切斷),具有H鏈之N末端側約一半L鏈全體為雙硫鍵結合(S-S結合)之結合分子量約5萬之抗原結合活性的抗體片段。
F(ab’)2
為將IgG以蛋白質分解酵素胃蛋白酶(pepsin)處理所得片段中(將H鏈之234編號之胺基酸殘基切斷),Fab為稍大於介入鉸鏈區之S-S結合的結合物,具有分子量約10萬之抗原結合活性的抗體片段。
Fab’為切斷上記F(ab’)2
之鉸鏈區之S-S結合之具有分子量約5萬之抗原結合活性的抗體片段。
scFv為使用1條VH與1條VL與12個殘基以上的適當胜肽連結物(P)連結,為VH-P-VL或VL-P-VH多胜肽,具有抗原結合活性的抗體片段。
Diabody為,以抗原結合特異性相同或相異的scFv形成2聚物的抗體片段,對相同抗原具有2價抗原結合活性或對不同抗原具有2個特異抗原結合活性的抗體片段。
dsFv為,將VH及VL中任1個胺基酸殘基置換半胱胺酸的多胜肽介入該半胱胺酸殘基間S-S結合的結合物。
含CDR之胜肽,由含VH或VL之CDR之至少一個區域以上所構成,含複數CDR的胜肽,可經由直接或以適當胜肽連結物介入結合而製造。
本發明之基因重組抗體組成物,具體而言,含人類IgG1抗體之Fc區中之CH2功能域的多胜肽,係由以下1~10中任一多胜肽選擇之多胜肽之基因重組抗體組成物。
1.於EU Index中,IgG1抗體231編號至340編號之胺基酸組成的多胜肽2.於EU Index中,IgG1抗體231編號至356編號之胺基酸組成的多胜肽3.於EU Index中,IgG1抗體231編號至358編號之胺基酸組成的多胜肽4.於EU Index中,IgG1抗體231編號至384編號之胺基酸組成的多胜肽5.於EU Index中,IgG1抗體231編號至392編號之胺基酸組成的多胜肽6.於EU Index中,IgG1抗體231編號至397編號之胺基酸組成的多胜肽7.於EU Index中,IgG1抗體231編號至422編號之胺基酸組成的多胜肽8.於EU Index中,IgG1抗體231編號至434編號與436編號至447編號之胺基酸組成的多胜肽9.於EU Index中,IgG1抗體231編號至435編號之胺基酸組成的多胜肽10.於EU Index中,IgG1抗體231編號至447編號之胺基酸組成的多胜肽。
本發明基因重組抗體組成物之CL區胺基酸序列,人類抗體胺基酸序列或非人類動物由來胺基酸序列任一者皆可,較佳為人類抗體胺基酸序列之Cκ或Cλ。
本發明基因重組抗體組成物中可變區為VH及VL,其為人類抗體胺基酸序列、非人類動物抗體胺基酸序列、或此等胺基酸序列之混合胺基酸序列之任一者皆可,具體而言,可為構成融合瘤產生的抗體的可變區、構成人化抗體的可變區、構成人類抗體的可變區等。
融合瘤為將人類以外的動物以抗原免疫取得的B細胞與小鼠等由來的骨髓瘤細胞一起細胞融合而得,而可生產具有所欲抗原特異性的單株抗體的細胞。又,構成融合瘤產生抗體的可變區由非人類動物抗體的胺基酸序列所組成。本發明之基因重組抗體組成物,亦包含具有任何特異性的抗體,較佳為辨識腫瘤相關抗原之抗體、辨識過敏或炎症相關抗原之抗體、辨識與循環器官疾病相關抗原之抗體、與辨識自己免疫疾病相關抗原之抗體,或辨識與病毒或細菌感染相關抗原之抗體。
辨識腫瘤相關抗原之抗體可列舉抗GD2抗體〔Anticancer Res.,13,331(1993)〕、抗GD3抗體〔Cancer Immunol.Immunother.,36,260(1993)〕、抗GM2抗體〔Cancer Res.,54,1511(1994)〕、抗HER2抗體〔Proc,Natl.Acad.Sci.USA,89,4285(1992)〕、抗CD52抗體〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285(1992)〕、抗MAGE抗體〔British J.Cancer,83,493(2000)〕、抗HM1.24抗體〔Molecular Immunol.,36,387(1999)〕、抗副甲狀腺荷爾蒙相關蛋白(PTHrP)抗體〔Cancer,88,2909(2000)〕、抗鹼基性纖維芽細胞增殖因子抗體、抗纖維芽細胞增殖因子8抗體〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,9911(1989)〕、抗鹼基性纖維芽細胞增殖因子受體抗體、抗纖維芽細胞增殖因子8受體抗體〔J.Biol.Chem.,265,16455(1990)〕、抗胰島素樣增殖因子抗體〔J.Neurosci.Res.,40,647(1995)〕、抗胰島素樣增殖因子受體抗體〔J.Neurosci.Res.,40,647(1995)〕、抗PMSA抗體〔J.Urology,160,2396(1998)〕、抗血管內皮細胞增殖因子抗體〔Cancer Res.,57,4593(1997)〕、抗血管內皮細胞增殖因子受體抗體〔Oncogene,19,2138(2000)〕、抗CD20抗體〔Curr.Opin.Oncol.,10,548(1998)〕、抗Her2抗體、抗CD10抗體等。
辨識過敏或炎症相關抗原之抗體可為抗介白素6抗體〔Immunol.Rev.,127,5(1992)〕、抗介白素6受體抗體〔Molecular Immunol.,31,371(1994)〕、抗介白素5抗體〔Immunol.Rev.,127,5(1992)〕、抗介白素5受體抗體、抗介白素4抗體〔Cytokine,3,562(1991)〕、抗介白素4受體抗體〔J.Immunol.Methods,217,41(1998)〕、抗腫瘤壞死因子抗體〔Hybridoma,13,183(1994)〕、抗腫瘤壞死因子受體抗體〔Molecular Pharmacol.,58,237(2000)〕、抗CCR4抗體〔Nature,400,776,(1999)〕、抗趨化素抗體(Peri et al.,J.Immunol.Meth.,174,249-257,1994)或抗趨化素受體抗體〔J.Exp.Med.,186,1373(1997)〕;辨識與循環器疾患相關抗原之抗體為抗GPIIb/IIIa抗體〔J.Immunol.,152,2968(1994)〕、抗血小板由來增殖因子抗體〔Science,253,1129(1991)〕、抗血小板由來增殖因子受體抗體〔J.Biol.Chem.,272,17400(1997)〕、抗血液凝固因子抗體〔Circulation,101,1158(2000)〕等。
辨識與病毒或細菌感染相關抗原之抗體可為抗gp120抗體〔Structure,8,385(2000)〕、抗CD4抗體〔J.Rheumatology,25,2065(1998)〕、抗CCR5抗體、抗vero毒素(verotoxin)抗體〔J.Clin.Microbiol.,37,396(1999)〕等。本發明之基因重組抗體組成物,含Fc區中之CH2功能域之多胜肽,置換為相當於人類IgG3抗體之相同EU Index的多胜肽,較人類IgG1抗體及IgG3抗體顯示具有更高CDC活性。
又,本發明之基因重組抗體組成物,於人類IgG1抗體中,含Fc區中CH2功能域的多胜肽,置換為相當於來自Kabat等人之EU Index之人類IgG3抗體相同位置之胺基酸序列構成的多胜肽,顯示較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體更高的補體依存性細胞傷害活性,且包含對蛋白質A具有人類IgG1抗體相同結合活性之基因重組抗體組成物。
具體而言,基因重組抗體組成物中,含人類IgG1抗體Fc區中CH2功能域之多胜肽為選自以下1至10任一者之多胜肽。1.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至340編號之胺基酸序列構成的多胜肽2.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至356編號之胺基酸序列構成的多胜肽3.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至358編號之胺基酸序列構成的多胜肽4.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至384編號之胺基酸序列構成的多胜肽5.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至392編號之胺基酸序列構成的多胜肽6.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至397編號之胺基酸序列構成的多胜肽7.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至422編號之胺基酸序列構成的多胜肽8.於EU Index中,IgG1抗體之231編號至434編號及436編號至447編號之胺基酸序列構成的多胜肽。
蛋白質A結合活性,可使用ELISA法、表面電漿共振等測定。具體而言,於平板中固相化的蛋白質A上,與抗體組成物反應後,進行各種標識使辨識抗體的抗體進一步反應,可定量於蛋白質A上結合的抗體組成物而被測定。
或可對Sepharose等載體上結合的蛋白質A,以pH5~8前後的高pH條件下與抗體組成物反應,洗淨後,進一步定量以pH2~5前後之低pH條件下溶出的抗體組成物而測定。
抗體分子上之Fc區,此等區域上結合N-糖苷結合糖鏈,因此,抗體每1分子結合2條糖鏈。
N-糖苷結合糖鏈可列舉核構造之非還原末端側上具有並行1或多條半乳糖-N-乙醯基葡糖胺(以下、記載為Gal-GlcNAc)之側鏈,進一步於Gal-GlcNAc之非還原末端側上具有唾液酸(sialic acid)、bisecting之N-乙醯基葡糖胺等複合型(complex型)糖鏈。
本發明中,N-糖苷結合複合型糖鏈如下列化學式所示。
本發明之基因抗體組成物中,於Fc區具有N-糖苷結合型糖鏈之抗體分子組成的基因重組抗體組成物,若具有上述糖鏈構造者,可為由具有單一糖鏈構造的抗體分子所構成者,亦可為具有複數個不同糖鏈構造的抗體分子所構成者。亦即,本發明之基因重組抗體組成物意指具有單一或複數個相異的糖鏈構造之基因重組抗體分子所組成之組成物。
又,本發明之基因重組抗體中,於Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子組成的組成物,係該組成物中所含結合Fc區的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖之糖鏈比例為20%以上的抗體組成物,具有高CDC活性外又有高的ADCC活性。
本發明中,未結合岩藻糖的糖鏈,可為上列所示化學式中,還原末端側之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖者,非還原末端之糖鏈之構造任一者皆可。
本發明中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖者,係指實質上未結合岩藻糖者。實質上未結合岩藻糖的抗體組成物,具體而言,係指於後述4中記載之糖鏈分析中,實質上無法檢測出岩藻糖的程度之抗體組成物的場合。實質上無法檢出的程度,係指超出測定檢出限界者。全部之糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺中未結合岩藻糖的基因重組抗體組成物亦具有最高ADCC活性。
含於Fc區上具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子構成之組成物中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上具有未結合岩藻糖的糖鏈的抗體分子之比例,可使用由抗體分子之肼分解或酵素消化等已知方法〔生物化學實驗法23-糖蛋白質糖鏈研究法(學會出版中心)高橋禮子編(1989)〕,使糖鏈遊離,而遊離的糖鏈以螢光標識或同位素標識,經標識的糖鏈以色層分析法分離而決定。又,經遊離的糖鏈經HPAED-PAD法〔J.Liq.Chromatogr.,6,1577(1983)〕之分析可決定。
生產本發明基因重組抗體組成物之轉形株,可插入編碼來自抗體分子之可變區及恆定區之DNA於動物細胞表現載體,導入動物細胞而取得。
動物細胞表現載體,以下列方式構築。
將編碼前述CH及CL之DNA各自插入於動物細胞中之表現載體,而製作動物細胞用表現載體。
動物細胞用表現載體,可為pAGE107(特開平3-22979號;Miyaji H.et al.,Cytotechnology,3,133-140(1990))、pAGE103(Mizukami T.及Itoh S.,J.Biochem.,101,1307-1310(1987))、pHSG274(Brady G.et al.,Gene,27,223-232(1984))、pKCR(O’Hare K.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,78,1527-1531(1981))、pSGlβd2-4(Miyaji H.et al.,Cytotechnology,4,173-180(1990))等。動物細胞用表現載體中使用的啟動子及增強子,可為SV40之初期啟動子與增強子(Mizukami T.及Itohs.,J.Biochem.,101,1307-1310(1987))、Moloney小鼠白血病病毒之LTR啟動子與增強子(Kuwana Y.et al.,Biochem.Biophys.ResCommun.,149,960-968(1987))、及免疫球蛋白H鏈之啟動子(Mason J.O.et al.,Cell,41,479-487(1985))與增強子(Gillies S.D.et al,Cell,33,717-728(1983))等。
基因重組抗體組成物表現用載體,亦可使用H鏈及L鏈個別存在於載體上的型式或存在於同一載體上的型式(串聯型)中者,基因重組抗體組成物表現載體之構築為容易,導入動物細胞為容易,能夠取得動物細胞內之抗體H鏈及L鏈表現量之平衡等之各點下以串聯型之基因重組抗體組成物表現用載體為宜(Shitara K.et al.,J.Immunol.Methods,167,271-278(1994))。串聯型之基因重組抗體組成物表現用載體可舉pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Bentley K.J.et al.,Hybridoma,17,559-567(1998))等。
編碼經構築的基因重組抗體組成物表現用載體之CH及CL之DNA的上游上,經由選殖對各種抗原之抗體之VH及VL之cDNA,可構築基因重組抗體組成物表現載體。
向宿主細胞之表現載體導入法可舉電穿孔法(特開平2-257891號;Miyaji H.et al.,Cytotechnology,3,133-140(1990))等。
生產本發明之基因重組抗體組成物之宿主細胞為動物細胞、植物細胞、微生物等,包含重組蛋白質生產之一般使用的宿主細胞任一者皆可。
生產本發明之基因重組抗體組成物之宿主細胞可列舉使用中國倉鼠卵巢組織由來CHO細胞、大鼠骨髓瘤細胞株YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20細胞、小鼠骨髓瘤細胞株NS0細胞、小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0-Ag14細胞、黃金鼠腎臓組織由來BHK細胞、人類白血病細胞株Namalwa細胞、骨髓瘤細胞與任意B細胞製造的融合瘤細胞;將使用胚性幹細胞或受精卵細胞所製造之人類以外之轉基因動物以抗原免疫所取得的B細胞與任意骨髓瘤細胞所製造的融合瘤細胞;使用上述骨髓瘤細胞與胚性幹細胞或受精卵細胞所製造之人類以外之轉基因動物以抗原免疫所取得之B細胞而製造的融合瘤細胞等。
表現不僅CDC活性,ADCC活性亦高之基因重組抗體組成物之宿主細胞,為對辨識N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合的糖鏈構造之凝集素有耐性的宿主細胞,例如可列舉為具有生產於Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子所組成之組成物,該組成物中所含於Fc區結合的全N-糖苷結合複合型糖鏈之中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖的糖鏈之比例為20%以上之抗體組成物之能力的宿主細胞,例如以下列舉之至少一種蛋白質活性為降低或失活的細胞等。
(a)與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素蛋白質;(b)與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素蛋白質;(c)與向細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之高基氏體輸送有關的蛋白質。
上述宿主細胞,較佳者為宿主細胞內編碼α1,6-岩藻糖基轉移酶的基因為經剔除的宿主細胞(WO02/31140、WO03/85107)。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素蛋白質,亦可包含與細胞內向糖鏈之岩藻糖供給源之糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素任一者,與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關酵素者可為會影響細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成的酵素等。
細胞內之糖核苷酸GDP-岩藻糖,經由denovo合成路徑或Salvage合成路徑而供給。且,與此等合成路徑有關之酵素包含全部與細胞內GDP-岩藻糖合成有關之酵素。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之denovo合成路徑有關的酵素可列舉為GDP-甘露糖4,6-脫水酶(GDP-mannose4,6-dehydratase;以下,略記為GMD)、GDP-酮基-6-去氧-3,5-表異構酶,4,6-還原酶(GDP-keto-6-deoxymannose3,5-epimerase,4,6-reductase;以下,略記為Fx)等。
與細胞內之糖核苷酸GDP-岩藻糖之Salvage合成路徑有關之酵素可為GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸酶(GDP-β-fucose pyrophosphorylase;以下,略記為GFPP)、弗可酶(Fucokinase)等。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成影響有關之酵素亦可包含影響上述細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成路徑有關酵素之活性者,影響該酵素基質構成物質之構造的酵素。
GDP-甘露糖4,6-脫水酶,可為(a)序列編號18所示核苷酸序列組成的DNA;(b)於嚴格條件下與序列編號18所示核苷酸序列組成的DNA雜交且編碼具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質之DNA等。
GDP-甘露糖4,6-脫水酶可為:(a)序列編號19所示胺基酸序列組成的蛋白質;(b)序列編號19所示胺基酸序列中,1個以上胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質;(c)與序列編號19所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性之蛋白質。
GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶可為:(a)序列編號20所示核苷酸序列組成的DNA;(b)於嚴格條件下與序列編號20所示核苷酸序列組成的DNA雜交且編碼具GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性之蛋白質的DNA。
GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糠-3,5-表異構酶可為:(a)序列編號21所示胺基酸序列組成的蛋白質;(b)序列編號21所示胺基酸序列中,1個以上胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性之蛋白質;(c)與序列編號21所示胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列所組成,且具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性之蛋白質。
與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素蛋白質亦可包含N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合反應有關的酵素任一者。N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合反應有關的酵素可為影響N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合反應之酵素任一者。具體而言,可為α-1,6-岩藻糖基轉移酶或α-L-岩藻糖酶等。
又,影響N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合反應之酵素亦可包含影響上述N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖之1位為α結合反應有關酵素活性者,影響該酵素基質構成物質之構造的酵素。
本發明中,α1,6-岩藻糖基轉移酶,可列舉編碼下述(a)、(b)、(c)或(d)之DNA的蛋白質,(a)序列編號22所示核苷酸序列組成的DNA(b)序列編號23所示核苷酸序列組成的DNA(c)於嚴格條件下與序列編號22所示核苷酸序列組成的DNA雜交且編碼具α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質之DNA(d)於嚴格條件下與序列編號23所示核苷酸序列組成的DNA雜交且編碼具α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質之DNA或、(e)序列編號24所示胺基酸序列組成的蛋白質(f)序列編號25所示胺基酸序列組成的蛋白質(g)序列編號24所示胺基酸序列中,1個以上胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性之蛋白質(h)序列編號25所示胺基酸序列中,1個以上胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性之蛋白質(i)與序列編號24所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性之蛋白質(j)與序列編號25所示胺基酸序列具有80%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有α1,6岩藻糖基轉移酶活性之蛋白質等。
與向細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之高基氏體輸送有關的蛋白質亦可包含與向細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之高基氏體輸送有關之蛋白質、或與影響將細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖輸送至高基氏體內之反應有關的蛋白質之任一蛋白質。
與向細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之高基氏體輸送有關之蛋白質,具體而言可為GDP-岩藻糖轉運子等。
又,影響將細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖向高基氏體內輸送的反應之蛋白質,影響與上述細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖向高基氏體的輸送有關蛋白質之活性,亦包含影響表現之蛋白質。
編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關酵素之胺基酸序列之DNA可為具有序列編號18或20所示核苷酸序列之DNA、於嚴格條件下與具有序列編號18或20所示核苷酸序列之DNA雜交且與編碼具有細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素活性之蛋白質之DNA等。
編碼α1,6-岩藻糖基轉移酶之胺基酸序列的DNA可為具有序列編號22或23所示核苷酸序列之DNA、具有序列編號22或23所示核苷酸序列之DNA與嚴格條件下雜交且編碼具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性之蛋白質之DNA等。
取得上述酵素活性降低或欠缺的細胞之方法,若使用其目的為酵素活性降低下或欠缺之技術,則使用任一技術皆可。具體而言,可列舉為:(a)使酵素基因為標的之基因破壞技術;(b)導入酵素基因之優勢抑制(dominant negative)體的技術;(c)導入酵素之突變技術;(d)抑制酵素基因之轉錄或轉譯的技術;(e)選擇對辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合的糖鏈構造之凝集素有耐受性的細胞株的技術。
辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位與岩藻糖之1位為α結合的糖鏈構造之凝集素可列舉為,若可辨識該糖鏈構造之凝集素,可使用其任一者皆可。此等具體例可列舉扁豆凝集素LCA(Lens Culinaris
由來之Lentil凝集素)、豌豆仔凝集素PSA(Pisum sativum
由來之豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(Vicia faba
由來之凝集素)、橙黃網孢盤菌凝集素AAL(Aleuria aurantia
由來之凝集素)等。
對凝集素有耐受性的,係指給予凝集素有效濃度時,不會抑制生育的細胞。有效濃度為基因體基因被改變前的細胞(以下,亦稱為親株)不能正常生育的濃度以上,較佳為基因體基因被改變前的細胞無法生育的濃度之相同濃度,更佳為2~5倍,再更佳為10倍,最佳為20倍以上。
生育未被抑制的凝集素之有效濃度可視細胞株適宜決定,通常之凝集素有效濃度為10μg/mL~10mg/mL,較佳為0.5mg/mL~2.0mg/mL。
以下具體說明本發明基因重組抗體組成物之製造方法。
1.基因重組抗體組成物之製造方法本發明之基因重組抗體組成物使用Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology、Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988(以下略稱為抗體)、Monoclonal Antibodies:Principles and practice,Third Edition,Acad.Press.1993(以下略稱為單株抗體)、Antibody Engineering,A Practical Approach.IRL Press at Oxford University Press,1996(以下,略稱為抗體工程)等記載之方法,例如,可由以下宿主細胞中表現而取得。
(1)本發明之基因重組抗體組成物表現用載體之構築本發明之基因重組抗體組成物表現用載體為編碼含於本發明基因重組抗體組成物之抗體分子的H鏈及L鏈恆定區的基因重組的動物細胞用表現載體。基因重組抗體組成物表現用載體,可為於動物細胞用表現載體中各自選殖編碼基因重組抗體組成物所含抗體分子的H鏈及L鏈恆定區的基因構築。
編碼本發明之基因重組抗體組成物中所含抗體分子之CH領域的基因,可經由選殖編碼IgG1及IgG3抗體之恆定區的基因後,連結編碼各功能域的基因片段而製作。又,可使用合成DNA合成全部DNA,經由PCR法亦可能合成(Molecular Cloning第2版)。又,經由複數組合此等技術,其可被製作。
動物細胞用表現載體,可使用編碼上述抗體分子之恆定區的基因重組而表現者皆可,例如,pKANTEX93〔Mol.Immunol.,37,1035(2000)〕、pAGE1o7〔Cytotechnology,3,133(1990)〕、pAGE103〔J.Biochem.,101,1307(1987)〕、pHSG274〔Gene,27,223(1984)〕、pKCR〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78,1527(1981)〕、pSGlβd2-4〔Cytotechnology,4,173(1990)〕等。動物細胞用表現載體中使用的啟動子及增強子,可為SV40之初期啟動子與增強子〔J.Biochem.,101,1307(1987)〕、Moloney小鼠白血病病毒之LTR〔Biochem.Biophys.Res.Commun.,41,960(1987)〕、免疫球蛋白H鏈之啟動子〔Cell,41,479(1985)〕與增強子〔Cell,33,717(1983)〕等。
本發明之基因重組抗體組成物表現用載體可使用抗體H鏈及L鏈存在於個別載體上的型式或存於相同載體上之型式(以下,記載為串聯型)中任一者皆可,但以本發明之基因重組抗體組成物表現載體之構築容易性、向動物細胞導入之容易性、於動物細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量平衡為均衡等之點,則以串聯型抗體表現用載體者為宜〔J.Immunol.Methods),167,271(1994)〕。
經構築之本發明基因重組抗體組成物表現用載體可於人型嵌合抗體及人化抗體之動物細胞中表現而使用者。
(2)編碼人類以外動物抗體的V區之cDNA的取得人類以外動物之抗體,例如編碼小鼠抗體之VH及VL之cDNA可依據下列方式取得。
使用由任意生產抗體之融合瘤細胞抽出的mRNA作為模板,合成cDNA。將合成的cDNA插入唑菌體或質體等載體而製作cDNA庫。由該庫,將已存在之編碼小鼠抗體之C區或V區的DNA作為探針使用,具有編碼H鏈V區的cDNA之重組唑菌體或重組質體及具有編碼L鏈V區的cDNA之重組唑菌體或重組質體各自單離。定序重組唑菌體或重組質體上之目的小鼠抗體之VH及VL的全核苷酸,而由核苷酸序列推定VH及VL之全胺基酸序列。
生產任意之人類以外動物之抗體的融合瘤細胞,以結合抗體的抗原於人類以外動物中免疫,藉由周知方法〔Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology,Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988(以下,略稱為抗體)、Monoclonal Antibodies:Principles and practice,Third Edition,Acad.Press.1993(以下,略稱為單株抗體)、Antibody Engineering,APractical Approach,IRL Press at Oxford University Press,1996(以下,略稱為抗體工程)〕,製作經免疫動物之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤,其次選擇單一細胞化的融合瘤,培養,由培養上清液純化,而可取得。
人類以外的動物可使用小鼠、大鼠、倉鼠、兔等,只要能製作融合瘤細胞者,可使用其任一者。
由融合瘤細胞調製全RNA之方法者,可為硫氰酸胍-三氟乙酸銫法〔Methods in Enzymol.,154,3(1987)〕,或由全RNA調製mRNA之方法,可為寡(dT)固定化纖維素柱法〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press New York,1989〕等。又,由融合瘤細胞調製mRNA之套組,可為Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen公司製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司製)等。
cDNA之合成及cDNA庫製作法,可使用習用方法〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press New York,1989;Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-34〕,或使用市販之套組,例如Super ScriptT M
plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL公司製)或ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司製)。
cDNA庫製作時,將由融合瘤細胞抽出的mRNA作為模板而將合成的cDNA重組至載體,可使用能重組該cDNA的載體之任一者皆可,例如,ZAP Express〔Strategies,5,58(1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic acids Research,17,9494(1989)〕、λZAP II〔Stratagene公司製〕、λgt10、λgt11〔DNA Cloning:A Practical Approach,1,49(1985)〕、Lambda BlueMid(Clontech公司製)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia公司製)、pcD2〔Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)〕及pUC18〔Gene,33,103(1985)〕等。
將由唑菌體或質體載體構築的cDNA庫導入的大腸菌,於導入該cDNA庫,可表現及維持者則使用任一者皆可,例如XL1-Blue MRF’〔Strategies,5,81(1992)〕、C600〔Genetics,39,440(1954)〕、Y1088、Y1090〔Science,222,778(1983)〕、NM522〔J.Mol.Biol.,166,1(1983)〕、K802〔J.Mol.Biol.,16,118(1966)〕及JM105〔Gene,38,275(1985)〕等。
選擇編碼來自cDNA庫之人類以外之動物抗體的VH及VL的cDNA選殖株之方法,可選自使用同位素或螢光等標識之探針的選殖.雜交法或斑.雜交法〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cord Spring Harbor Lab.Press New York,1989〕。又,調製引子,而將cDNA或cDNA庫作為模板,由PCR〔Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab,Press New York,1989;Current Protocols in Molecular Biology,Supplmennt 1-34〕調製編碼VH及VL之cDNA。
將由上述方法選擇的cDNA,以適當的制限酶酵素等切斷後,於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製)等之質體中選殖,進行通常使用的核苷酸序列解析方法之方法,例如Sanger等人之二去氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.,74,5463(1977)〕等反應,使用核苷酸序列自動分析裝置,例如ABI PRISM377 DNA定序儀(Applied Biosystems公司製)等核苷酸序列分析裝置分析可定序該cDNA之核苷酸序列。
由定序的核苷酸序列推定VH及VL之全胺基酸序列,與已知抗體之VH及VL之全胺基酸序列〔Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991〕比較,可確認取得的cDNA為編碼完全含有抗體VH及VL的胺基酸序列之分泌訊號序列。
再者,抗體可變區之胺基酸序列或編碼該可變區的DNA之核苷酸序列全為已知時,可使用以下方法製造。
胺基酸序列為已知時,考慮密碼子之使用頻度〔Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991〕設計編碼該可變區之DNA序列,基於設計之DNA序列,合成100個核苷酸前後的長度組成的複數個合成DNA,使用此等進行PCR法可得到DNA。核苷酸序列為已知時,基於此情報而合成100個核苷酸前後長度構成的複數條合成DNA,使用此等進行用PCR法而可得到DNA。
(3)人類以外之動物抗體的V區胺基酸序列之解析關於包含分泌訊號序列的抗體之VH及VL之完全胺基酸序列,與已知抗體之VH及VL胺基酸序列〔Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991〕比較,推定分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列,進一步可知抗體所屬亞群。又,VH及VL之各CDR胺基酸序列,亦可以同樣方法表現。
(4)人型嵌合抗體表現載體之構築編碼本項1之(1)中記載的本發明基因重組抗體組成物表現用載體之人類抗體的CH及CL之基因的上游處,插入編碼人類以外之動物抗體的VH及VL之cDNA,可構築人型嵌合抗體表現載體,例如,將編碼人類以外之動物抗體的VH及VL之cDNA,與人類以外之動物抗體VH及VL之3’末端側的核苷酸序列與人類抗體之CH及CL之5’末端側的核苷酸序列所構成,且兩端上具有適當的制限酶酵素辨識序列之合成DNA各自連結,各自於本項1之(1)中記載之編碼本發明基因重組抗體組成物表現用載體之人類抗體的CH及CL的基因上游處經由適切方式表現之插入,可構築人型嵌合抗體表現載體。
(5)編碼人化抗體之V區的cDNA之構築編碼人化抗體的VH及VL之cDNA,可由以下方式構築。首先,選擇移植為目標之人類以外動物抗體的VH及VL之CDR的人類抗體VH及VL之FR之胺基酸序列,人類抗體之VH及VL之FR胺基酸序列只要是人類抗體中者,則任一者皆可,例如,蛋白質資料庫等資料庫所登錄的人類抗體之VH及VL之FR胺基酸序列、人類抗體之VH及VL之FR各亞群之共通胺基酸序列〔Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991〕等,其中,為了製作具有非常活性的人化抗體,希望選擇作為目的之人類以外動物抗體的VH及VL之FR胺基酸序列具有儘可能高的相同性(至少60%以上)的胺基酸序列。
其次,於選擇的人類抗體之VH及VL之FR胺基酸序列上移植作為目標之人類以外的動物抗體之VH及VL的CDR之胺基酸序列,而設計人化抗體之VH及VL胺基酸序列。考慮經設計的胺基酸序列於抗體基因之核苷酸序列上出現密碼子之使用頻度〔Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services,1991〕變換DNA序列,而設計編碼人化抗體VH及VL之胺基酸序列的DNA序列。基於經設計的DNA序列,合成100個核苷酸前後長度構成的數條合成DNA,使用此等進行PCR法,此時,基於PCR之反應效率及合成可能的DNA長度,設計H鏈、L鏈與4~8條合成DNA為宜。
又,兩端位置上合成DNA之5’末端處導入適當的制限酶酵素之辨識序列,可容易選殖本項1之(1)中構築之本發明基因重組抗體組成物表現用載體。PCR後,將增幅產物於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製)等質體中,依據本項1之(2)中記載的方法,定序核苷酸序列,取得具有所冀望之編碼人化抗體VH及VL胺基酸序列之DNA序列之質體。
(6)人化抗體之V區胺基酸序列之改變人化抗體係僅將人類以外動物抗體之VH及VL之CDR移植人類抗體VH及VL之FR,其抗原結合活性與原始之人類以外動物的抗體相較下為較低係已知〔BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)〕。此原因為原始人類以外動物的抗體之VH及VL,不僅CDR,FR之任何胺基酸殘基係直接或間接地與抗原結合活性有關,此等胺基酸殘基伴隨CDR之移植,向人類抗體之VH及VL之FR相異的胺基酸殘基作變化。為解決此問題,於人化抗體,在人類抗體之VH及VL的FR之胺基酸序列中,與直接抗原結合有關的胺基酸殘基或與CDR之胺基酸殘基相互作用,維持抗體之立體構造,鑑定與間接抗原結合有關的胺基酸殘基,以此等改變來自原來人類以外動物之抗體的胺基酸殘基,進行降低的抗原結合活性之提昇〔BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)〕。
於人化抗體之製作上,如何較有效率鑑定與此等抗原結合活性有關的FR之胺基酸殘基,但最重要之點,為因此進行X射線結晶解析〔J.Mol.Biol.,112,535(1977)〕或電腦模型製作(Computer modelling)〔Protein Engineering,7,1501(1994)〕等抗體之立體構造之構築及解析。此等抗體之立體構造之情報給予人化抗體之製作上許多有益的情報。然而,適應所有抗體之可能的人化抗體之製作法尚未確立,基於現狀下製作各種抗體之數種變異體,檢討與各種抗原結合活性相關等種種嘗試錯誤為必要者。
人類抗體之VH及VL的FR之胺基酸殘基之改變,使用改變用合成DNA而進行本項1之(5)中記載的PCR法可達成。依據PCR後之增幅產物之本項1之(2)中記載的方法,定序核苷酸序列而確認施與目的之改變。
(7)人化抗體表現載體之構築於編碼本項1之(1)中記載之本發明基因重組抗體組成物表現用載體之人類抗體CH及CL的基因之上游處,插入編碼本項1之(5)及(6)中構築的人化抗體之VH及VL的cDNA,可構築人化抗體表現載體,例如,於構築本項1之(5)及(6)之人化抗體的VH及VL時所使用的合成DNA中,可於兩端位置的合成DNA之5’末端上導入適當的制限酶酵素之辨識序列,於編碼本項1之(1)中記載之本發明基因重組抗體組成物表現用載體之人類抗體的CH及CL之基因的上游處插入適切方式的表現,可構築人化抗體表現載體。
(8)人化抗體之安定的生產將本項1之(4)及(7)中記載之人型嵌合抗體或人化抗體表現載體導入適當的動物細胞而得到安定地生產人型嵌合抗體或人化抗體之轉形體。
向動物細胞導入人化抗體表現載體之方法可列舉電穿孔法〔特開平2-257891號;Cytotechnology,3,133(1990)〕等。
導入人型嵌合抗體或人化抗體表現載體之動物細胞,只要可生產人型嵌合抗體或人化抗體之動物細胞,可使用任一種細胞。
具體而言,可列舉為小鼠骨髓瘤細胞之NS0細胞、SP2/0細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO/dhfr-細胞、CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/0細胞、IR983F細胞、黃金鼠腎臓由來的BHK細胞、人類骨髓瘤細胞的Namalwa細胞等,較佳為中國倉鼠卵巢細胞之CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤YB2/0細胞等。
人型嵌合抗體或人化抗體表現載體之導入後,安定生產人型嵌合抗體或人化抗體之轉形體株可依據特開平2-257891號揭示之方法,由含G418硫酸鹽(以下略記為G418;SIGMA公司製)等藥劑之動物細胞培養用培養基而選擇。動物細胞培養用培養基可使用RPMI1640培養基(日水製藥公司製)、GIT培養基(日本製藥公司製)、EX-CELL302培養基(JRH公司製)、IMDM培養基(GIBCO BRL公司製)、Hybridoma-SFM培養基(GIBCO BRL公司製)、或於此等培養基中添加牛胎兒血清(以下,略記為FCS)等之各種添加物的培養基等。於培養基中培養所得轉形體株可於培養上清液中生產蓄積人型嵌合抗體或人化抗體。培養上清液中之人型嵌合抗體或人化抗體之生產量及抗原結合活性以酵素免疫抗體法〔以下,記載為ELISA法;Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.Chapter 14,1998;Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press Limited,1996〕等測定。又,轉形體株依據特開平2-257891號揭示之方法,利用DHFR基因增幅系等可使人型嵌合抗體或人化抗體之生產量上昇。
人型嵌合抗體或人化抗體,可由轉形體株之培養上清液使用蛋白質A管柱而純化〔Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 8,1988;Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press Limited 1996〕。又,其他通常可使用蛋白質純化用之純化方法,例如,可組合凝膠過濾、離子交換層析及限外過濾等進行而純化。經純化人型嵌合抗體或人化抗體之H鏈、L鏈或抗體分子全體之分子量,可以SDS變性聚丙烯醯胺凝膠電泳〔以下,記載為SDS-PAGE;Nature,221,680(1970)〕或西方氏墨漬法〔Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter12,1988;Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press Limited,1996〕等測定。
以上,陳示作為宿主之動物細胞之抗體組成物之製造方法,但於酵母、昆蟲細胞、植物細胞或動物個體或植物個體亦可與動物細胞同樣之方法製造抗體組成物。
因此,宿主細胞為具有表現抗體分子的能力時,於表現以下所示抗體分子之宿主細胞中導入抗體基因後,培養該細胞,由該培養物純化作為目的之抗體組成物,可製造本發明之抗體組成物。
使用酵母作為宿主細胞時,作為表現載體,例如,可例舉YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。
作為啟動子,使用可於酵母菌株中表現之任一者皆可,例如,可列舉己糖激酶(hexose kinase)等解糖系基因之啟動子、PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動子、熱休克蛋白質啟動子、MFα1啟動子、CUPl啟動子等。
宿主細胞為酵母菌(Saccharomyces
)屬、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces
)屬、克魯維酵母菌(Kluyveromyces
)屬、絲孢酵母(Trichosporon
)屬、許旺酵母菌(Schwanniomyces
)屬等微生物,例如可列舉為Saccharomycescerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Kluyveromyceslactis、Trichosporonpullulans、Schwanniomycesalluvius
等。
重組載體之導入方法可使用於酵母導入DNA之任何方法皆可,例如,可列舉電穿孔法〔Methods.Enzymol.,194,182(1990)〕、原生質球法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,84,1929(1978)〕、乙酸鋰法〔J.Bacteriology,153,163(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,1929(1978)〕中記載之方法等。
使用動物細胞作為宿主時,表現載體例如為pcDNAI、pcDM8(由Funakoshi公司販售)、pAGE107〔特開平3-22979號;Cytotechnology,3,133,(1990)〕、pAS3-3〔特開平2-227075號〕、pCDM8〔Nature,329,840,(1987)〕、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司)、pREP4(Invitrogen公司)、pAGE103〔J.Biochemistry,101,1307(1987)〕、pAGE210等。
啟動子為於動物細胞中能表現者則任一者皆可,例如,巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)之IE(immediate eariy)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子等。又,人類CMV之IE基因之增強子與啟動子共同使用亦可。
宿主細胞為人類細胞之Namalwa細胞、猴細胞之COS細胞、中國倉鼠細胞之CHO細胞、HBT5637(特開昭63-299號)、大鼠骨髓瘤細胞、小鼠骨髓瘤細胞、黃金鼠腎臓由來細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等。
昆蟲細胞作為宿主使用時,例如可依據Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)、Bio/Technology,6,47(1988)等記載之方法表現蛋白質。
即,將表現載體及桿狀病毒(baculovirus)共同導入昆蟲細胞而於昆蟲細胞培養上清液中得到重組病毒後,進一步以重組病毒感染昆蟲細胞,可表現蛋白質。
該方法中使用之基因導入載體可列舉例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(皆為Invitorogen公司)等。
桿狀病毒可使用例如感染夜盜蛾科昆蟲之病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。昆蟲細胞可使用斜紋夜蛾(Spodoptera frugiperda
)的卵巣細胞之Sf9、Sf21〔Current Protocols in Molecular Biology-Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)〕、Trichoplusiani之卵巣細胞之High5(Invitrogen公司)等。
為調製重組病毒,向昆蟲細胞將上述表現導入載體與該桿狀病毒之共導入方法可列舉例如磷酸鈣法(特開平2-227075號)、脂轉染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),84,7413(1987)〕等。
植物細胞作為宿主細胞使用時,表現載體可例如為Ti質體、煙草鑲嵌病毒載體等。
啟動子可列舉可於植物細胞中表現者任一者皆可使用,例如花椰菜嵌紋病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)之35S啟動子、RiceAct 1啟動子等。
宿主細胞可列舉煙草、馬鈴薯、番茄、蘿蔔、大豆、油菜、苜蓿、稲、小麥、大麥等植物細胞等。
重組載體之導入方法可使用任一種將DNA導入植物細胞之方法,例如,使用土壤桿菌(Agrobacterium)〔特開昭59-140885號、特開昭60-70080號、WO94/00977〕、電穿孔法〔特開昭60-251887號〕、粒子槍(基因槍)之方法〔日本專利第2606856號、日本專利第2517813號〕等。
重組載體之導入方法可使用於動物細胞中導入DNA之任一種方法,例如可列舉電穿孔法〔Cytotechnology,3,133(1990)〕、磷酸鈣法〔特開平2-227075號〕、脂轉染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987)〕、注射法〔Manipulating the mouse embryo a laboratory manual〕、使用粒子槍(基因槍)之方法〔特許第2606856號、特許第2517813號〕、DEAE-右旋糖酐法〔Biomanual series4-基因導入與表現.解析法(羊土社)横田崇.新井賢一編(1994)〕、病毒載體法〔Manipulating the mouse embryo第2版〕等。
抗體基因之表現方法,直接表現以外,依據Molecular Cloning第2版記載之方法等,可進行分泌生產、Fc區與其他蛋白質之融合蛋白質表現等。
由以上所得轉形體於培養基中培養,於培養物中生成蓄積抗體分子,自該培養物採取,可製造抗體組成物。培養轉形體之方法,可依據通常使用於宿主細胞培養之方法來進行。
培養以酵母等真核生物作為宿主所得轉形體之培養基,該生物為含有資化所得碳素源、氮素源、無機鹽類等,可有效率地進行轉形體之培養的培養基者可使用任一種天然培養基、合成培養基皆可。
碳素源者,該生物資化所得者皆可,可使用含有葡萄糖、果糖、蔗糖、此等之糖蜜、澱粉或澱粉水解物等之碳水化合物、乙酸、丙酸酸等有機酸、乙醇、丙醇等醇類等。
氮素源者,可使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等之無機酸或有機酸之銨塩,其他含氮素化合物,以及腖、肉萃取物、酵母萃取物、穀物廉價烈酒(corn cheap liquor)、酪蛋白水解物、大豆粗及大豆粕水解物、各種發酵菌體及其消化物等。
無機鹽類可使用磷酸第一鉀、磷酸第二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸第一鉄、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養,於通常震盪培養或深部通氣攪拌培養等好氧條件下進行。培養溫度15~40℃為宜,培養時間通常16小時~7日間。培養時保持pH為3.0~9.0。pH之調製,使用無機或有機酸、鹼溶液、尿素、碳酸鈣等進行。
又,視培養需要,可於培養基中添加氨比西林(ampicillin)或四環黴素等抗生物質。
於培養啟動子使用誘導性啟動子之重組載體而轉形的微生物時,視需要可於培養基中添加誘導劑。例如,培養使用lac啟動子之重組載體轉形的微生物時,於培養基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等,於培養使用trp啟動子之重組載體轉形的微生物時可於培養基中添加吲哚丙烯酸等。
培養以動物細胞作為宿主所得轉形體之培養基,一般使用者為RPMI1640培養基〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、Eagle氏MEM培養基〔Science,122,501(1952)〕、Dulbecco's改變MEM培養基〔Virology,8,396(1959)〕、199培養基〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1(1950)〕、Whitten培養基〔發生工學實驗,製作轉基因小鼠的方法(講談社),勝木元也編(1987)〕或此等培養基中添加牛胎兒血清等之培養基等。
培養通常於pH6.0~8.0、30~40℃、5% CO2
存在等條件下進行1~7日。
又,視培養需要,可將卡那黴素(kanamycin)、青黴素等抗生物質添加至培養基。
培養昆蟲細胞作為宿主所得轉形體之培養基,可使用一般使用的TNM-FH培養基(Pharmingen公司)、Sf-900II SFM培養基(Life Technologies公司)、ExCell400、ExCell405(皆為JRH Biosciences公司)、Grace’s Insect Medium〔Nature,195,788(1962)〕等。
培養通常於pH6.0~7.0、25~30℃等條件進行1~5日。
又,視培養需要,可於培養基中添加真大黴素(gentamycin)等抗生物質。
植物細胞作為宿主所得轉形體,可由細胞,或植物之細胞或器官分化而培養。培養該轉形體之培養基,可使用一般使用之Murashige and Skoog(MS)培養基、White氏培養基、或於此等培養基中添加茁長素(auxin)、胞激素(cytokine)等添加植物荷爾蒙之培養基等。
培養通常於pH5.0~9.0、20~40℃之條件下進行3~60日。
又,視培養需要,可於培養基中添加卡那黴素、潮黴素(hygromycin)等抗生物質。
如上記,保有重組編碼抗體分子之DNA的表現載體之動物細胞,或植物細胞由來之轉形體,依據通常之培養方法培養,生成蓄積抗體組成物,由該培養物收取抗體組成物,可製造抗體組成物。
抗體基因之表現方法,直接表現以外,依據Molecular Cloning第2版記載之方法,可進行分泌生產、融合蛋白質表現等。
抗體組成物之生產方法,可由宿主細胞內生產方法、宿主細胞外分泌方法、或宿主細胞外膜上生產方法,依所使用的宿主細胞、生產的抗體分子之構造的不同,而選擇該方法。
抗體組成物於宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產時,可依據Paulson等人之方法〔J.Biol.Chem.,264,17619(1989)〕、Low等人之方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,8227(l989);Genes Develop.,4,1288(1990)〕、或特開平05-336963號、WO94/23021等記載之方法,可於宿主細胞外積極地分泌該抗體組成物。
亦即,使用基因重組之技術,於表現載體上,插入編碼抗體分子之DNA、及編碼抗體分子表現上適切的單股胜肽之DNA,將該表現載體導入宿主細胞後使抗體分子表現,可於宿主細胞外積極地分泌作為目的物之抗體分子。
又,依據特開平2-227075號記載之方法,可利用使用二氫葉酸還原酵素基因等之基因增幅系使生產量上昇。
再者,經由使基因導入的動物或植物細胞再分化,造成基因導入的動物個體(轉基因非人類動物)或植物個體(轉基因植物),使用此等個體可製造抗體組成物。
轉形體為動物個體或植物個體時,依據通常方法,飼育或栽培,生成蓄積抗體組成物,由該動物個體或植物個體採取該抗體組成物,可製造該抗體組成物。
使用動物個體製造抗體組成物之方法,可列舉例如依據公知之方法〔American Journal of Clinical Nutrition),63,639S(1996);American Journal of Clinical Nutrition,63,627S(1996);Bio/Technology,9,830(1991)〕導入基因而造成的動物中生產目的之抗體組成物。
動物個體時,例如,飼育導入編碼抗體分子之DNA的轉基因非人類動物,於該動物中生成抗體組成物,蓄積,由該動物中採取抗體組成物,可製造抗體組成物。該動物中之生成.蓄積場所,例如可列舉該動物之乳汁(特開昭63-309192號)或卵等。此時使用之啟動子,可於動物中表現者任一者皆可,例如,較佳為使用乳腺細胞特異的啟動子之α酪蛋白啟動子、β酪蛋白啟動子、β乳球蛋白啟動子、乳清酸性蛋白質啟動子等。
使用植物個體製造抗體組成物之方法,例如依據導入編碼抗體分子之DNA之轉基因植物之公知方法〔組織培養,20(1994);組織培養,21(1995):Trends in Biotechnology,15,45(1997)〕栽培,抗體組成物於該植物中生成.蓄積,由該植物中採取該抗體組成物,而生產抗體組成物。
由導入編碼抗體分子之基因的轉形體所製造的抗體組成物,例如,抗體組成物於細胞內溶解狀態下表現時,於培養終了後,將細胞遠心分離而回收,懸浮於水系緩衝液後,以超音波破碎機、French Press、Manton-Gaulin均質器、Dinomill等將細胞破碎,得到無細胞的抽出液。經由將該無細胞抽出液遠心分離所得上清液,以通常之酵素單離純化法,即,單獨或組合使用溶劑抽出法、硫安等鹽析法、脫鹽法、自有機溶劑之沈澱法、二乙胺乙基(DEAE)-Sepharose、使用DIAION HPA-75(三菱化學(股)製)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基Sepharose、苯基Sepharose等樹脂之厭水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和性色譜法、等電位色譜法、等電位電泳等電泳法等技術,可得到抗體組成物之純化製品。
又,抗體組成物於細胞內形成不溶體的表現時,同樣地將細胞回收後破碎,經由遠心分離,回收沈澱分隔之抗體組成物不溶體。經回收的抗體組成物之不溶體以蛋白質變性劑可溶化,將該可溶化液稀釋或透析,使該抗體組成物回復正常立體構造後,經由與上記同樣的單離純化法,可得到該抗體組成物之純化製品。
抗體組成物於細胞外分泌時,於培養上清液中可回收該抗體組成物或其衍生物。即,將該培養物以上述相同的遠心分離等技術處理而取得培養上清液,由該培養上清液,使用與上記同樣之單離純化法,可得到抗體組成物之純化製品。
2.製作生產本發明基因重組抗體組成物之細胞本發明基因重組抗體組成物中,生產有高CDC活性加上高ADCC活性之抗體組成物之細胞,如下所述技術,製作為生產本發明基因抗體組成物之細胞,經由於該宿主細胞中導入前述1(4)及(7)中記載之人型嵌合抗體或人化抗體表現載體,其可被生產。
具體而言,與結合抗體分子Fc區之N-糖苷結合糖鏈的修飾有關的酵素,即,選擇與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關之酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素為失活的細胞,或者可依後述所示種種之人為技術所得的細胞作為宿主細胞使用。以下為詳細説明。
(1)酵素之基因作為標的的基因破壞技術為製作具有高的ADCC活性的抗體(以下,稱為高ADCC活性抗體)生產細胞上所使用的宿主細胞,以細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素基因作為標的,使用基因破壞方法可製作。與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素,具體而言,可列舉GDP-甘露糖4,6-脫水酶(以下,記載為GMD)、GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶(以下,略記為Fx)等。
與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素,具體而言,包含α1,6-岩藻糖基轉移酶、α-L-岩藻糖酶等。此處稱為基因者包含DNA或RNA。
基因破壞之方法,亦包含可破壞作為標的之酵素的基因之任一種方法,其例為反義法、核酸酵素(ribozyme)法、相同重組法、RNA-DNA寡核苷酸法(以下,略記為RDO法)、RNA干擾法(以下,記載為RNAi法)、使用反轉錄病毒之方法、使用轉因子(transposon)之方法等。以下具體明此等內容。
(a)由反義法或核酸酵素法製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞之製作為製作高ADCC活性抗體生產細胞所使用之宿主細胞,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素基因作為標的,使用細胞工學,12,239(1993)、BIO/TECHNOLOGY,17,1097(1999)、Hum.Mol.Genet.,5,1083(1995)、細胞工學,13,255(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96,1886(1999)等記載的反義法或核酸酵素法,例如可如以下方式製作。
調製編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA或基因體DNA。
定序調製的cDNA或基因體DNA之核苷酸序列。
基於定序的DNA序列,編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之DNA部分,設計含有非轉譯領域的部分或內含子部分之適當長度的反義基因或核酸酵素。
為使該反義基因、或核酸酵素於細胞內表現,將經調製的DNA片段、或全長插入適當的表現載體的啟動子下游處,而製作重組載體。
將該重組載體,導入該表現載體適合的宿主細胞而得到轉形體。
經由選擇與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關酵素的活性作為指標之轉形體,可得到為製作本發明之於Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈的抗體分子組成的基因重組抗體組成物,該組成物中所含Fc區上結合的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖的糖鏈的比例為20%以上的製作抗體組成物用的宿主細胞可得到。又,選擇細胞膜上的糖蛋白質的糖鏈構造或產生抗體分子的糖鏈構造作為指標之轉形體,可得到為製作高ADCC活性抗體生產細胞所使用的宿主細胞。
作為製作高ADCC活性抗體生產細胞所用的宿主細胞,可為酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等,只要有與作為標的的細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因者任一者皆可。具體而言,可列舉如前述1中記載之宿主細胞。
作為表現載體,於上述宿主細胞中自立複製為可能的,或者向染色體中之重組為可能,而使用轉錄經設計的反義基因、或核酸酵素的位置上含有啟動子者。具體而言,可為前述1中記載之表現載體。
向各種宿主細胞之基因導入方法,可使用前述1中記載的各種宿主細胞中導入適當重組載體的方法。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素活性作為指標之選擇轉形體的方法,例如可為以下方法。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素為失活的細胞之方法,使用文獻〔新生化學實驗講座3-糖質I,糖蛋白質(東京化學同人)日本生化學會編(1988)〕、文獻〔細胞工學,別冊,實驗手冊系列,糖鏈生物學實驗手冊:糖蛋白質.糖脂質.蛋白糖(秀潤公司製)谷口直之.鈴木明美.古川清.菅原一幸監修(1996)〕、Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology等記載的生化學的方法或基因工學的方法等,可為測定與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性之方法。生化學方法,例如為使用酵素特異的基質評價酵素活性之方法。基因工學的方法,例如為測定酵素基因之mRNA量之Northern解析或RT-PCR法等。
細胞膜上之糖蛋白質之糖鏈構造作為指標而選擇轉形體之方法,例如可為後述2之(5)中記載之方法。產生抗體分子之糖鏈構造作為指標而選擇轉形體之方法,例如可為後述4或後述5中記載之方法。
調製編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA的方法,例如為下述中記載之方法。
由各種宿主細胞之組織或細胞調製全RNA或mRNA。由經調製的全RNA或mRNA製作cDNA庫。
基於與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之胺基酸序列,製作退化型引子,將製作的cDNA庫作為模板以PCR法取得編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因片段。
使用取得的基因片段作為探針,篩選cDNA庫,可取得編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之DNA。
可使用人類或非人類動物之組織或細胞之mRNA或市販者(例如Clontech公司),亦可如以下方式由人類或非人類動物之組織或細胞調製。
由人類或非人類動物之組織或細胞調製全RNA之方法,可為硫氰酸胍-三氟乙酸銫法〔Methodsin Enzymology,154,3(1987)〕、酸性硫氰酸胍.苯酚.氯仿(AGPC)法〔Analytical Biochemistry,162,156(1987);實驗醫學,9,1937(1991)〕等。
又,由全RNA調製為poly(A)+
RNA之mRNA的方法可為oligo(dT)固定化纖維素柱法(Molecular Cloning第2版)等。
又,經由使用Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen 公司)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司)等市販之套組可調製mRNA。
自經調製的人類或非人類動物之組織或細胞mRNA製作cDNA庫。cDNA庫製作法為Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology、A Laboratory Manual,2ndEd.(1989)等記載之方法、或市販之套組,例如可為使用SuperScript Plasmid Systerm forc DNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies公司)、ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE公司)之方法等。
為製作cDNA庫用之選殖載體,可使用於大腸菌K12株中可自立複製之唑菌體載體、質體載體等任一者皆可。具體而言,ZAP Express〔STRATAGENE公司、Strategies,5,58(1992)〕、pBlueScript II SK(+)〔Nucleic Acids Research,17,9494(1989)〕、λZAP II(STRATAGENE公司)、λgt10、λgt11〔DNA cloning,A Practical Approach,1,49(1985)〕、λTriplEx(Clontech公司)、λExCell(Pharmacia公司)、pT7T318U(Pharmacia公司)、pcD2〔Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)〕及pUC18〔Gene,33,103(1985)〕等。
為製作cDNA庫用的宿主微生物,為可使用之微生物任一者皆可,較佳為使用大腸菌。具體而言,大腸桿菌(Escherichia coli
)XL1-Blue MRF’〔STRATAGENE公司、Strategies,5,81(1992)〕、大腸桿菌C600〔Genetics,39,440(1954)〕、大腸桿菌Y1088〔Science,222,778(1983)〕、大腸桿菌Y1090〔Science,222,778(1983)〕、大腸桿菌NM522〔J.Mol.Biol.,166,1(1983)〕、大腸桿菌K802〔J.Mol.Biol.,16,118(1966)〕及大腸桿菌JM105〔Gene,38,275(1985)〕等。
cDNA庫為可以此用於之後的解析者,為使不完全長cDNA之比例降低,更有效率取得完全長的cDNA,可使用菅野等人開發的Oligo-capping法〔Gene,138,171(1994);Gene,200,149(1997);蛋白質核酸酵素,41,603(1996);實驗醫學,11,2491(1993);cDNA選殖(羊土社)(1996);基因庫之製作法(羊土社)(1994)〕而調製用於以下解析。
基於與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之胺基酸序列,製作預測編碼該胺基酸序列之核苷酸序列的5’末端及3’末端的核苷酸序列上特異的退化型引子,使用經製作的cDNA庫作為模板之PCR法〔PCR Protocols,Academic Press(1990)〕進行DNA增幅,可取得編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因片段。
取得的基因片段為編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之DNA,以通常使用的核苷酸序列解析方法,例如Sanger等人之二去氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977)〕或ABIPRISM377DNA定序儀(Applied Biosystems公司製)等核苷酸序列分析裝置之分析可確認。
以該基因片段作為探針,使用由人類或非人類動物之組織或細胞中所含mRNA合成的cDNA或cDNA庫之選殖雜交或斑雜交(Molecular Cloning第2版)等,可取得與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之DNA。
又,使用為取得編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關之酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因片段所用之引子,而由人類或非人類動物之組織或細胞所含mRNA合成的cDNA或cDNA庫作為模板,使用PCR法而增幅,可取得與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA。
經取得之編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關酵素的核苷酸序列解析方法,例如為Sanger等人之二去氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977)〕或ABI PRISM377DNA定序儀(Applied Biosystems公司製)等之核苷酸序列分析裝置來分析,可定序該DNA之核苷酸序列。
基於經定序的cDNA之核苷酸序列,使用BLAST等之相同性檢索程式,檢索Genbank、EMBL及DDBJ等核苷酸序列資料庫,確認取得的DNA為資料庫基因中編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因。
以上記方法所得之編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素之基因之核苷酸序列,例如為序列編號18或20中記載之核苷酸序列。
以上記方法所得之編碼N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因之核苷酸序,例如為序列編號22或23中記載之核苷酸序列。
基於經定序DNA之核苷酸序列,利用亞磷醯胺(Phosphoramidite)法之DNA合成機model 392(Perkin Elmer公司製)等之DNA合成機,經由化學合成,可取得與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體DNA的方法,例如為以下記載之方法。
調製基因體DNA之方法,可為使用Molecular Cloning第2版或Current Protocols in Molecular Biology等記載之已知方法。又,使用基因體DNA庫篩選系統(Genome Systems社)或Universal GenomeWalkerT M
Kits(CLONTECH公司)等,可取得與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關的酵素或N一糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體DNA。
編碼所取得之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N一乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之DNA之核苷酸序列,經由使用通常使用的核苷酸序列解析方法,例如Sanger等人之二去氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977)〕或ABI PRISM377DNA定序儀(Applied Biosystems公司製)等之核苷酸序列分析裝置分析,可定序該DNA之核苷酸序列。
於經定序之基因體DNA之核苷酸序列,使用BLAST等之相同性檢索程序,檢索Genbank、EMBL及DDBJ等核苷酸序列資料庫,可確認所取得之DNA為資料庫基因中與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關的酵素或N一糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因。
基於經定序DNA之核苷酸序列,利用Phosphramidite法之DNA合成機model 392(Perkin Elmer公司製)等之DNA合成機,經由化學合成,可取得與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還示末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體DNA。
以上記方法所得之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關的酵素之基因體DNA之核苷酸序列,例如為序列編號26、27、28及29中記載之核苷酸序列。
以上記方法所得之與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體DNA之核苷酸序列,例如為序列編號30中記載之核苷酸序列。
又,不使用表現載體,將基於與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之核苷酸序列設計的反義寡核苷酸或核酸酵素(ribozyme),導入直接宿主細胞,可得到製作本發明抗體組成物用之宿主細胞。
反義寡核苷酸或核酸酵素,可由已知方法或DNA合成機調製,具體而言,編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA及基因體DNA之核苷酸序列中,基於具有相當於連續的5~150個核苷酸、較佳為5~60個核苷酸、更佳為10~40個核苷酸之序列之寡核苷酸序列情報,可合成含相當於該寡核苷酸與互補序列之寡核苷酸(反義寡核苷酸)或含該寡核苷酸序列之核酸酵素而調製。
寡核苷酸可為寡RNA及該寡核苷酸之衍生物(以下,稱為寡核苷酸衍生物)等。
寡核苷酸衍生物可為寡核苷酸中之磷酸二酯結合變換為磷酸酯結合的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中之磷酸二酯結合變成N3’-P5’磷酸醯胺結合的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中之核糖與磷酸二酯結合變化為胜肽核酸結合的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中之尿嘧啶以C-5丙炔基尿嘧啶置換的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中之尿嘧啶以C-5噻唑尿嘧啶置換的衍生物寡核苷酸、寡核苷酸中之胞嘧啶以C-5丙炔基胞嘧啶置換的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中之胞嘧啶以啡修飾胞嘧啶(phenoxazine-modified cytosine)置換的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中之核糖以2’-O-丙基核糖置換的寡核苷酸衍生物、或寡核苷酸中之核糖以2’-甲氧乙氧基核糖置換的寡核苷酸衍生物等〔細胞工學,16,1463(1997)〕。
(b)依相同重組法製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞之製作為製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素的基因為標的,經由改變染色體上之標的基因使用相同重組法之染色體,其可被製作。
染色體上之標的基因之改變,以Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)(以下,略稱為「Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual」)、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、Biomanual series 8 Gene targeting,使用ES細胞的變異小鼠之製作,羊土社(1995)(以下,略記為使用ES細胞的變異小鼠之製作)等記載之方法,例如可如以下方式進行。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素的基因體DNA。
基於基因體DNA之核苷酸序列,製作相同重組改變的標的基因(例如與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之構造基因、或啟動子基因)用之標靶載體。
將經製作的標靶載體導入宿主細胞,經由選擇引起染色體上標的基因與標靶載體之間的相同重組的細胞,可製作高ADCC抗體生產細胞製作用之宿主細胞。
宿主細胞為酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等,只要有作為標的之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因則任一者皆可。具體而言,可為前述1中記載之宿主細胞。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素之基因體DNA的方法或調製與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體DNA的方法,可為上述1之(1)的(a)中記載之基因體DNA之調製方法等。
以上述方法所得之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素之基因體DNA的核苷酸序列,例如可為序列編號26、27、28及29中記載之核苷酸序列。
以上述方法所得之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素的基因體DNA之核苷酸序列,可例如為序列編號30中記載之核苷酸序列。
為相同重組染色體上之標的基因用的標靶載體,可依Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、Biomanual series 8 Gene targeting,使用ES細胞的變異小鼠之製作(羊土社)(1995)等記載之方法製作。標靶載體可使用置換型、插入型任一者皆可。
向各種宿主細胞之標靶載體的導入,可使用適合前述1中記載之各種宿主細胞之重組載體之導入方法。
有效率地選別相同重組體之方法,例如可使用Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、Biomanual series 8 Gene targeting,使用ES細胞的變異小鼠之製作(羊土社)(1995)等記載之陽性選擇、啟動子選擇、陰性選擇、polyA選擇等之方法。由選別的細胞株中選擇作為目的之相同重組體之方法,對基因體DNA南方氏雜交法(Molecular Cloning第2版)或PCR法(PCR Protocols),Academic Press(1990)〕等。
(c)依據RDO方法製作高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞之製作為製作高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞,以細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因為標的,使用RDO法,例如,可依據以下方式製作。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA或基因體DNA,使用上述1之(1)的(a)中記載的而調製。
定序經調製的cDNA或基因體DNA之核苷酸序列。
基於經定序的DNA序列,編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關酵素的部分,設計含非轉譯領域部分或內含子部分的適當長度之RDO之構築體而合成。
將經合成的RDO導入宿主細胞中,選擇作為標的的酵素(即與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素)變異所生成的轉形體,可製作為製作高CDC活性及高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞。
宿主細胞為酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等,具有作為標的之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因者任一者皆可。具體而言,可為前述1中記載之宿主細胞。
向各種宿主細胞之RDO之導入,可使用適於前述1中記載之各種宿主細胞的重組載體之導入方法。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA的方法,例如可為上述2之(1)的(a)中記載之cDNA的調製方法等。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因體DNA的方法,例如可為上述2之(1)的(b)中記載之基因體DNA的調製方法等。
DNA之核苷酸序列,以適當制限酶酵素等切斷後,次選殖於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製)等質體中,使用通常用的核苷酸序列解析方法,例如Sanger等人之二去氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977)〕等反應進行,使用核苷酸序列自動分析裝置,例如ABI PRISM377DNA定序儀(Applied Biosystems公司製)等核苷酸序列分析裝置分析可確認。
RDO可使用常法或DNA合成機調製。
將RDO導入宿主細胞,選擇作為標的的酵素之基因上作變異所生成的細胞之方法,此酵素為與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或與N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素,可以Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology等記載之直接檢出染色體上基因之變異的方法。
又,前述2之(1)的(a)中記載,選擇與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性作為指標的轉形體之方法,後述2之(5)中記載選擇的細胞膜上的糖蛋白質糖鏈構造作為指標之轉形體之方法,或後述4或後述5中記載之選擇產生抗體分子的糖鏈構造作為指標之轉形體的方法亦可被使用。
RDO可依據下列記載設計:Science,273,1386(1996);Nature Medicine,4,285(1198);Hepatology,25,1462(1997);Gene Therapy,5,1960(1999);Gene Therapy,5,1960(1999);J.Mol.Med.,75,829(1997);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,8774(1999);Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96,8768(1999);Nuc.Acids.Res.,27,1323(1999);Invest.Dematol.,111,1172(1998);Nature Biotech.,16,1343(1998);Nature Biotech.,18,43(2000);NatureBiotech.,18,555(2000)等。
(d)由RNAi法製作高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞之製作為製作高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素的基因作為標的,由RNAi法,例如可由以下方式製作。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA以上述2之(1)之(a)中記載的方法,調製cDNA。
決定經調製的cDNA之核苷酸序列。
基於經決定的cDNA之序列,設計適當長度之RNAi基因,此基因含有編碼與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之部分或非轉譯領域之部分。
為於細胞內表現該RNAi基因,經由於適當表現載體之啟動子下游處插入調製的cDNA片段、或其全長,而製作重組載體。
將該重組載體,導入對該表現載體為適合的宿主細胞而得到轉形體。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性、或產生抗體分子或細胞表面上的糖蛋白質之糖鏈構造作為指標而選擇轉形體,可得到為製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞。
宿主細胞為酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等,亦可使用具有作為標的之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因者。具體而言,可有前述1中記載之宿主細胞。
表現載體為於上述宿主細胞中自立複製可能或向染色體之重組為可能,使用可轉錄經設計的RNAi基因的位置上含有啟動子者。具體而言,可為前述1中記載之表現載體。
向各種宿主細胞之基因之導入上,可使用前述1中記載之各種宿主細胞適合的重組載體之導入方法。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素之活性或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性作為指標選擇轉形體之方法,例如可為本項2之(1)的(a)中記載之方法。
以細胞膜上之糖蛋白質的糖鏈構造作為指標選擇轉形體之方法,例如,可為本項2之(5)中記載的方法。產生抗體分子之糖鏈構造作為指標選擇轉形體之方法,例如,可為後述4或後述5中記載之方法。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之cDNA的方法,例如,可為本項2之(1)的(a)中記載的cDNA之調製方法等。
又,不使用表現載體,將基於與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之核苷酸序列所設計的RNAi基因,直接導入宿主細胞,可得到為製作高CDC活性及高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞。
RNAi基因,可經由使用常法或DNA合成機而調製。
RNAi基因之構築體可依據下列文獻中之記載而設計:Nature,391,806(1998);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,15502(1998);Nature,395,854(1998);Proc.NatlAcad.Sci.USA,96,5049(1999);Cell,95,1017(1998);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,1451(1999);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,13959(1998);Nature Cell Biol.,2,70(2000)〕等。
(e)依據使用轉因子的方法,製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞之製作為製作高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞,使用Nature Genet.,25,35(2000)等記載之轉因子系統,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關酵素之活性、或產生抗體分子或細胞膜上之糖蛋白質之糖鏈構造作為指標選擇突變體,可製作為製作高ADCC活性抗體生產細胞用的宿主細胞。
轉因子系統為將外來基因隨機插入染色體上而誘發突變的系統,通常使用於轉因子上插入外來基因而誘發突變的載體,為將此基因隨機插入染色體上時同時將轉因子之表現載體導入細胞中。
轉因子可使用適合所使用的轉因子序列者即可。
外來基因亦可使用誘發宿主細胞之DNA變異者即可。
宿主細胞為酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等,可使用具有作為標的之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因者。具體而言,可為前述1中記載之宿主細胞。向各種宿主細胞之基因之導入上,可使用適合於前述1中記載之各種宿主細胞之重組載體之導入方法。
以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性作為指標而選擇突變體之方法,例如可為本項2之(1)的(a)中記載之方法。
以細胞膜上之糖蛋白質之糖鏈構造作為指標之選擇突變體之方法,例如可為本項2之(5)中記載之方法。以產生抗體分子之糖鏈構造作為指標之選擇突變體之方法,例如可為後述4或後述5中記載之方法。
(2)導入酵素基因之優勢抑制體之技術製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺6位上岩藻糖的1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因為標的,藉由使用導入該酵素之優勢抑制體之技術可製得。與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成有關的酵素,具體而言,可為GMD、Fx等。N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素,具體而言,可為α1,6-岩藻糖基轉移酶、α-L-岩藻糖酶等。
此等酵素為具有基質特異性之催化某種特定反應之酵素,破壞具有如此基質特異性之催化作用的酵素之活性中心,可製作此等酵素之優勢抑制體。作為標的之酵素中,以GMD為例,此優勢抑制體之製作具體而言如以下所述。
解析大腸菌由來之GMD之立體構造的結果,可知4個胺基酸(133編號之蘇胺酸、135編號之麩胺酸、157編號之酪胺酸、161編號之離胺酸)負責酵素活性上之重要機能(Structure,8,2,2000)。亦即,基於立體構造之情報製作與此4個胺基酸不同的其他胺基酸置換的變異體的結果,顯示任一種變異體皆故意降低酵素活性。另一方面,關於GMD之輔酵素NADP或基質之GDP-甘露糖之結合能,任一種變異體幾乎未觀察到有變化。據此,經由作置換負責GMD之酵素活性之此4種胺基酸的可製作優勢抑制體。基於大腸菌由來之GMD之優勢抑制體製作結果,基於胺基酸序列情報進行相同性比較或立體構造預測,例如,以CHO細胞由來之GMD(序列編號19),將155編號之蘇胺酸、157編號之麩胺酸、179編號之酪胺酸、183編號之離胺酸置換為其他胺基酸而可製作優勢抑制體。導入如此胺基酸置換之基因之製作,可使用Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology等記載之部位特異的變異導入法進行。
為製作高ADCC活性抗體生產細胞所使用之宿主細胞,使用如上述製作的編碼標的酵素之優勢抑制體的基因(以下,略記為優勢抑制體基因),依據Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology第2版等記載之基因導入方法,例如,可以以下方式製作。
調製與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之優勢抑制體基因。
基於經調製的優勢抑制體基因之全長DNA,視需要,調製包含編碼該蛋白質部分之適當長度的DNA片段。
經由將該DNA片段、或全長DNA插入適當表現載體之啟動子下游處,製作重組載體。
將該重組載體導入適合該表現載體之宿主細胞,得到轉形體。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素之活性或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素活性、或產生抗體分子或細胞膜上之糖蛋白質之糖鏈構造作為指標而選擇轉形體,可製作用於製作高ADCC活性抗體生產細胞用之宿主細胞。
宿主細胞為酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等,可使用具有作為標的之與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或NP糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素基因者之任一種。具體而言,可為前述記載之宿主細胞。
表現載體,於上記宿主細胞自立複製為可能或向染色體中重組為可能下,使用可轉錄編碼作為目的之優勢抑制體之DNA的位置上含有啟動子者。具體而言,可為前述1中記載之表現載體。
向各種宿主細胞之基因之導入,可使用前述1中記載之適合各種宿主細胞之重組載體之導入方法。
以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素活性作為指標或以N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素活性作為指標選擇轉形體之方法,例如可為後述2(1)之(a)中記載之方法。
以細胞膜上之糖蛋白質之糖鏈構造作為指標選擇轉形體之方法,例如可為後述2之(5)中記載之方法。以產生抗體分子之糖鏈構造作為指標選擇轉形體之方法,例如可為後述4或後述5中記載之方法。
(3)對酵素導入突變之技術為製作高ADCC活性抗體生產細胞所用之宿主細胞,可使用對與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之基因導入突變,而選擇對該酵素突變產生之所欲細胞株的技術而製作。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素,具體而言,可為GMD、Fx等。N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素,具體而言,可為α1,6一岩藻糖基轉移酶、α-L-岩藻糖酶等。
對酵素導入突變之方法可為,1)由突變誘發處理下處理親株的突變體或自然發生產生的突變體,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素之活性或N一糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素活性作為指標而選擇所欲細胞株之方法;2)由突變誘發處理下處理親株的突變體或自然發生產生的突變體,以生產抗體分子之糖鏈構造作為指標而選擇所欲細胞株之方法;3)於突變誘發處理下處理親株之突變體或自然發生產生的突變體,以該細胞之細胞膜上之糖蛋白質的糖鏈構造作為指標而選擇所欲細胞株之方法等。
突變誘發處理亦可使用於親株細胞之DNA上誘發點突變異、欠失或移碼(framesbit)突變任一種的處理。
具體而言,可為以乙基亞硝基尿素、亞硝基胍、苯并芘、吖啶色素處理、放射線之照射等。又,各種烷基化劑或致癌物質亦可作為突變誘發物質使用。以突變誘發物質作用細胞之方法,例如可列舉組織培養技術第三版(朝倉書店)日本組織培養學會編(1996)、Nature Genet,,24,314,(2000)等記載之方法。
自然發生所產生的突變體,可列舉為未施予特別的突變誘發處理,於通常的細胞培養條件下繼續繼代培養而產生的自然發生突變體。
測定與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素活性或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性的方法,例如可為本項1之(1)的(a)中記載之方法。識別產生抗體分子之糖鏈構造的方法,例如可為後述4或後述5中記載之方法。識別細胞膜上之糖蛋白質之糖鏈構造之方法,例如可為本項之2的(5)中記載之方法。
(4)抑制酵素基因之轉錄或轉譯的技術為製作高ADCC活性抗體生產細胞使用之宿主細胞,以與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素基因作為標的,使用反義RNA/DNA技術〔Bioscience and industry,50,322(1992);化學,46,681(1991);Biotechnology,9,358(1992);Trendsin Biotechnology,10,87(1992);Trends in Biotechnology,10,152(1992);細胞工學,16,1463(1997)〕;triple helix技術〔Trends in Biotechnology,10,132(1992)〕等,可製作抑制標的之基因之轉錄或轉譯。
與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素,具體而言,可為GMD、Fx等。N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素,具體而言,可為α1,6-岩藻糖基轉移酶、α-L-岩藻糖酶等。
測定與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素之活性或N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端的N-乙醯基葡糖胺的6位上岩藻糖之1位為α結合的糖鏈修飾有關的酵素之活性的方法,例如可為本項2之(1)的(a)中記載之方法。
識別細胞膜上之糖蛋白質的糖鏈構造之方法,例如可為本項2之(5)中記載之方法。識別產生抗體分子之糖鏈構造之方法,例如可為後述4或後述5中記載之方法。
(5)選擇對於辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造之凝集素有耐性的細胞株之技術為製作高ADCC活性抗體生產細胞使用之宿主細胞,可使用選擇對於辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造之凝集素有耐性的株之技術而製作。
選擇對辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造之凝集素有耐性的株之技術,例如可使用Somatic Cell Mol.Genet.,12,51(1986)等記載之凝集素之方法。
凝集素可為辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造之凝集素之任一種凝集素,具體例可列舉扁豆凝集素LCA(Lens Culinaris
由來之Lentil凝集素)豌豆凝集素PSA(Pisum sativum
由來之豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(Vicia faba
由來之凝集素)、橙黃網孢盤菌凝集素AAL(Aleuria aurantia
由來之凝集素)等。
具體而言,於含上述凝集素1μg/mL~1mg/mL濃度之培養基1日~2週間,較佳為1日~1週間培養,將生存的細胞繼代培養或挑選選殖株而移到別的培養容器,繼續以含凝集素之培養基培養,可選擇辨識對N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造的凝集素有耐性的株。
3.抗體組成物之活性評價測定經純化的抗體組成物之蛋白量、抗原之結合活性或細胞傷害活性之方法,可使用單株抗體、或抗體工程等記載之公知方法。
具體例為抗體組成物係人型嵌合抗體或人化抗體時,與抗原之結合活性、對抗原陽性培養細胞株之結合活性經由以ELISA法及螢光抗體法〔Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)〕等可測定。對抗原陽性培養細胞株之細胞傷害活性,可藉由測定CDC活性、ADCC活性等評價〔Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)〕。
測定ADCC活性之方法,可為以放射性同位素、螢光物質或色素等標識的標的細胞、抗體及效應劑細胞接觸後,由受傷害的標的細胞測定遊離的標識物質之活性之方法;將標的細胞、抗體、及效應劑細胞接觸後,由受傷害的標的細胞測定遊離酵素之生理活性之方法等。
測定CDC活性之方法,可為以放射性同位體、螢光物質或色素等標識的標的細胞、抗體及含補體成分之血清等生體試料接觸後,由受傷害的標的細胞測定遊離的標識物質之活性之;將標的細胞、抗體、及含補體成分之血清等生體試料接觸後,由受傷害的標的細胞測定遊離酵素之生理活性之方法等。
又,抗體組成物對人類之安全性、治療效果,可使用食蟹猴等之與人類比較接近的動物種之適當模式評價。
4.抗體組成物之糖鏈之分析於各種細胞表現的抗體分子之糖鏈構造,可依據通常之糖蛋白質之糖鏈構造之解析進行,例如,對IgG分子結合的糖鏈為由半乳糖、甘露糖、岩藻糖等中性糖、N-乙醯基葡糖胺等胺糖、唾液酸等酸性糖所構成,使用糖組成分析及二次元糖鏈製圖法等之糖鏈構造解析等技術可進行。
(1)中性糖.胺糖組成分析抗體組成物之糖鏈組成分析,以三氟乙酸等,進行糖鏈之酸加水分解,遊離中性糖或胺糖,可分析組成比。
具體方法可使用Dionex公司製糖組成分析裝置用的方法。BioLC為依HPAEC-PAD法(高效率陰離子交換色層分析-加上電流分析偵測法(high performance anion-exchange chromatography-Pulsed amperometric detection))〔J.Liq.Chromatogr.,6,1577(1983)〕分析糖組成之裝置。
又,依2-胺基吡啶之螢光標識化法可分析組成比。具體而言,可以公知方法〔Agric.Bior.Chem.,55(1),283-284(1991)〕將加酸水解的試料以2-胺基吡啶基化之螢光量化,可算出HPLC分析的組成比。
(2)糖鏈構造解析抗體組成物之糖鏈之構造解析,可依2次元糖鏈作圖法〔Anal.Biochem.,171,73(1988)、生物化學實驗法23-糖蛋白質糖鏈研究法(學會出版中心)高橋禮子編(1989年)〕進行。2次元糖鏈作圖法,例如,X軸上依逆相層析的糖鏈保持時間或溶出位置,Y軸為順相層析的糖鏈保持時間或溶出位置,各自作圖,與已知糖鏈之結果比較,推定糖鏈構造之方法。
具體而言,將抗體之肼分解,由抗體游離糖鏈,進行以2-胺基吡啶(以下,略記為PA)之糖鏈螢光標識〔J.Biochem.,95,197(1984)〕後,以凝膠過濾將糖鏈與過剩的PA化試藥等分離,進行逆相層析。其次,分取的糖鏈之各峰值進行順相層析。基於此等結果,與2次元糖鏈作圖上繪圖,糖鏈標準物(TaKaRa公司製)、文獻〔Anal.Biochem.,171,73(1988)〕之點(spot)比較,可推定糖鏈構造。
進一步進行各糖鏈之MALDI-TOF-MS等之質量分析,可由2次元糖鏈作圖法確認推定之構造。
5.抗體分子之糖鏈構造之識別方法抗體組成物,由與結合抗體之Fc區的糖鏈構造相異的抗體分子所構成。本發明之抗體組成物中,於Fc領域具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子構成的基因重組抗體組成物,該組成物所含與Fc區結合的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上岩藻糖未結合的糖鏈之比例為20%以上之抗體組成物,顯示高ADCC活性。如此的抗體組成物,依使用之上記4中記載之抗體分子之糖鏈構造的分析法可識別。又,使用利用凝集素之免疫學的定量方法可識別。
使用凝集素之免疫學的定量方法所用的抗體分子之糖鏈構造之識別,依據文獻〔Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Wiley-Liss,Inc,(1995);酵素免疫測定法,第3版,醫學書院(1987);改訂版,酵素抗體法,學際企畫(1985)〕等記載之西方氏染色、RIA(放射性免疫試驗)、VFA(Viro免疫試驗)、EIA(酵素免疫試驗)、FIA(螢光免疫試驗)、MIA(金屬免疫試驗)等免疫學的定量方法,例如,可以列方式進行。
以辨識構成抗體組成物之抗體分子之糖鏈構造的凝集素作為標識,使經標識的凝集素與試料之抗體組成物反應。其次,測定經標識的凝集素與抗體分子之複合體之量。
識別抗體分子之糖鏈構造用的凝集素,例如,為WGA(小麥(T.vulgaris)由來之小麥胚芽凝集素)、ConA(白鳳豆(C.ensjformis)由來之刀豆素(concanavalin)A)、RIC(蓖麻(R.communis)由來之毒素)、L-PHA(夏枯草(P.vulgaris)由來之白凝集素)、LCA(扁豆(L.culinaris)由來之lentil凝集素)、PSA(豌豆(P.sativum)由來之豌豆凝集素)、AAL(橙黃網胞盤菌凝集素(Aleuria aurantia)凝集素)、ACL(尾穗莧(Amaranthus caudatus)凝集素)、BPL(洋紫荊(Bauhinia purpurea)凝集素)、DSL(曼陀羅(Datura stramonium)凝集素)、DBA(雙花扁豆(Dolichos biflorus)凝集素)、EBL(Elderberry Balk凝集素)、ECL(雞冠刺桐(Erythrina cristagalli)凝集素)、EEL(紅葉衛矛(Euonymus europaeus)凝集素)、GNL(夏雪片蓮(Galanthus nivalis)凝集素)、GSL(加納穀物(Griffonia simplicifolia)凝集素)、HPA(羅曼(Helix pomatia)凝集素)、HHL(朱頂紅(Hippeastrum Hybrid)凝集素)、木菠蘿素凝集素(Jacalin)、LTL(翅莢百脈根(Lotus tetragonolobus)凝集素)、LEL(番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素)、MAL(朝鮮槐(Maackia amurensis)凝集素)、MPL(桑橙(Maclura pomifera)凝集素)、NPL(黃水仙(Narcissus pseudonarcissus)凝集素)、PNA(花生凝集素)、E-PHA(菜豆(Phaseolus vulgaris)紅凝集素)、PTL(Psophocarpus tetragonolobus凝集素)、RCA(蓖麻籽(Ricinus communis)凝集素)、STL(馬鈴薯(Solanum tuberosum)凝集素)、SJA(槐米蘆丁(Sophora japonjca)凝集素)、SBA(大豆凝集素)、UEA(荊豆(Ulex europaeus)凝集素)、VVL(長柔毛野豌豆(Vicia villosa)凝集素)、WFA(多花紫藤(Wisteria floribunda)凝集素)。
使用凝集素特異的辨識結合N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上岩藻糖為結合的糖鏈構造者為宜,其具體例可列舉扁豆凝集素LCA(Lens Culinaris由來之Lentil凝集素)、豌豆凝集素PSA(Pisum sativqm由來之豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA(Vicia faba由來之凝集素)、橙黃網孢盤菌凝集素AAL(Aleuria aurantia由來之凝集素)。
6.本發明基因重組抗體組成物之使用本發明之基因重組抗體組成物,由於具有較IgG1抗體及IgG3抗體更高的CDC活性,亦較向來的抗體組成物有更優異的治療效果。又,本發明之抗體組成物中,於Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈的抗體分子構成的基因重組抗體組成物,於該組成物中含有的Fc區上結合的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上岩藻糖未結合的糖鏈比例為20%以上的抗體組成物,由於較IgG1抗體及IgG3抗體有更高的CDC活性及更高的ADCC活性,更較向來的抗體組成物有更優異的治療效果。又本發明之基因重組抗體組成物中,Fc區上具有N-糖苷結合複合型糖鏈的抗體分子所構成的基因重組抗體組成物,於該組成物中所含的Fc區上結合的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上岩藻糖為未結合的糖鏈比例為100%之抗體組成物為更佳。
含有本發明之基因重組抗體組成物之醫藥,亦可作為治療藥單獨投與,但通常與藥理學上可容許之一種或以上之載劑一起混合,而提供以製劑學之技術領域中已知的任意方法製造的醫藥製劑為所欲的。
投與路徑可使用治療上實際最有效果者為所欲的,可為經口投與、或口腔內、氣道內、直腸內、皮下、肌肉內及靜脈內等非經口投與者,於抗體製劑時,所欲者可為靜脈內投與。
投與形態可為噴霧劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、貼布劑等。
經口投與之適當製劑可為乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑等。
乳劑及糖漿劑類液體調製物可使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等之糖類、聚乙二醇、丙二醇等之二醇類、芝麻油、橄欖油、大豆油等之油類、p-羥基安息香酸酯類等之防腐劑、草莓香料、薄荷等香料類等添加劑而製造。
膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑等可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等賦形劑、澱粉、藻脂酸鈉等崩壞劑、硬脂磷酸鎂、滑石等之潤滑劑、聚乙烯醇、羥基丙基纖維素、明膠等之結合劑、脂肪酸酯等之界面活性劑、甘油等之可塑劑等添加劑製造。
非經口投與之適當製劑可為注射劑、栓劑、噴霧劑等。
注射劑使用鹽溶液、葡萄糖溶液、或兩者之混合物構成的載劑調製。或者,可依常法將抗體組成物凍結乾燥,之後加入氯化鈉而調製粉末注射劑。
栓劑可使用可可油脂、氫化脂肪或羧酸等載劑而調製。
又,噴霧劑為該抗體組成物本身,或者不刺激受容者之口腔及氣管粘膜,且該抗體組成物以使微細粒子分散吸收容易的載劑等使用調製。
載劑具體以乳糖、甘油等例示。依該抗體組成物及使用之載劑性質,可為氣溶膠、乾燥粉末等之製劑。又,此等非經口劑中亦可添加於經口劑中例示成分之添加劑。
投與量或投與次數,依作為目的之治療效果、投與方法、治療期間、年齡、體重等不同,有效成分之量為通常成人每日為10μg/kg~20mg/kg。
又,檢討抗體組成物對各種腫瘤細胞之抗腫瘤效果之方法,活體外實驗可為CDC活性測定法、ADCC活性測定法等,活體內實驗可為使用於小鼠等實驗動物之腫瘤系的抗腫瘤實驗等。
CDC活性、ADCC活性、抗腫瘤實驗可依文獻〔Cancer Immunology Immunotherapy,36,373(1993);Cancer Research,54,1511(1994)〕等記載之方法進行。
以下,以實施例說明本發明,但本發明並未以此限定。
使用動物細胞,人類IgG1抗CD20嵌合抗體、人類IgG3抗CD20嵌合抗體、抗CD20功能域交換抗體之製作1.人類IgG3抗CD20人型嵌合抗體表現載體之製作依淋巴結由來之polyA+RN A(BD Biosciences Clontech公司),使用cDNA合成套組(Amersham Pharmacia Biotech公司),依據附隨的使用説明書合成cDNA。使用100ng之cDNA為模板,KODplus(東洋紡績社)及配列編號1、2所示胺基酸序列所構成、使用人類IgG恆定區特異的合成DNA引子(Fasmac公司製),依據KODplus之附隨説明書進行PCR反應。PCR反應使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems),於94℃、1分鐘熱變性後,於94℃15秒、62℃ 30秒、68℃ 90秒之反應進行30次循環。再於68℃ 7分鐘反應後,以3’末端上腺嘌呤付加為目的加入2.5U之TaqDNA聚合酶(寶酒造社),於68℃反應7分鐘。將反應液供給於使用1%洋菜膠之電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen公司),回收認為是IgG3重鏈恆定區基因之約1.1kbp的增幅片段。添加Ligation High溶液(東洋紡績公司製)進行與質體pCRII-TOPO載體(Invitrogen公司)之連結反應,使用該反應液將大腸菌DH5α株(東洋紡績公司製)轉形。由所得轉形株之選殖株調製各質體DNA,依據Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)添付的説明書反應後,以相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Analyzer解析插入質體中的DNA核苷酸序列,確認與公知之人類IgG3(Genbank新增編號AAH33178)之重鏈恆定區為編碼相同胺基酸序列之核苷酸序列。
由上述人類IgG3重鏈恆定區基因插入質體,制限酶酵素ApaI及NruI(皆獲自寶酒造社)處理,純化1.13kbp之IgG3重鏈恆定區基因片段。具有與人類IgG1抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗之小鼠由來可變區相同的可變區、人類型之輕鏈恆定區及人類IgG1之重鏈恆定區、將人類IgG1抗CD20嵌合抗體之動物細胞安定表現載體pKANTEX2B8P(WO03/055993A1之記載)以ApaI及NruI消化處理。純化切出之IgG1恆定區基因殘餘物約12.6kbp片段,使用上述IgG3恆定區基因片段與Ligation High溶液而連結,構築人類IgG3抗CD20嵌合抗體表現載體pKANTEX2B8γ3(第3圖)。pKANTEX2B8γ3中編碼的人類IgG3抗CD20嵌合抗體之可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列,pKANTEX2B8P中編碼的人類IgG1抗CD20嵌合抗體之可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列為相同。
2.抗CD20功能域交換抗體表現載體之製作可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列,於PKANTEX2B8P編碼的人類IgG1抗CD20嵌合抗體之可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列為相同,重鏈恆定區由人類IgG1抗體或人類IgG3抗體之功能域構成,結合CD20功能域交換抗體以下列順序製作。具有來自人類IgG1抗體之CH1與鉸鏈、Fc區(CH2及CH3)來自人類IgG3抗體之胺基酸序列所構成的重鏈恆定區之抗CD20嵌合抗體稱為1133型抗CD20功能域交換抗體,具有來自IgG3抗體之CH1與鉸鏈、Fc區來自人類IgG1抗體之胺基酸序列所構成的重鏈恆定區之抗CD20嵌合抗體稱為3311型抗CD20功能域交換抗體。此等功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列,進行胺基酸序列資料庫檢索的結果,為新穎的胺基酸序列。
經設計的各種抗CD20功能域交換抗體之各功能域所來自的亞群、及重鏈恆定區之胺基酸序列之對應示於表1。第4圖中顯示各種抗CD20功能域交換抗體之模式圖。
(1)編碼1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體之構築編碼第5圖所示1133型抗CD200功能域交換抗體之表現載體以下列方式構築。
由人類IgG1抗CD20嵌合抗體表現載體pKANTEX2B8P,使用制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)及BmgBI(New England Biolabs公司製),切出編碼人類IgG1抗體之CH1功能域、鉸鏈功能域、及Fc區之5’末端側之一部(與人類IgG1抗體與人類IgG3抗體相同的胺基酸序列之部分)之約430bp的DNA片段而純化。一方面,對本實施例1項中記載之人類IgG3抗CD20嵌合抗體之表現載體pKANTEX2B8γ3進行相同的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA後,進行以Ligation High溶液(東洋紡績公司製)之連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株調製各質體DNA,使用Big Dye Teminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)依據隨附之説明書進行反應後,由相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700DNA Analyzer解析插入各質體之DNA之核苷酸序列,確認得到第5圖所示的質體pKTX93/1133。
(2)編碼3311型抗CD20功能域交換抗體之表現載體之構築編碼第6圖所示3311型抗CD20功能域交換抗體之表現載體如下列方式構築。
由本實施例1項中記載之人類IgG3抗CD20嵌合抗體之表現載體pKANTEX2B8γ3,使用制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)及BmgBI(New England Biolabs公司製),切出編碼人類IgG3抗體之CH1功能域、鉸鏈功能域、及Fc區之5’末端側之一部(與人類IgG1抗體與人類IgG3抗體相同的胺基酸序列之部分)之約570bp的DNA片段而純化。一方面,對IgG1抗CD20抗體之表現載體pKANTEX2B8P進行相同的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA後,進行以Ligation High溶液(東洋紡績公司製)之連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株調製各質體DNA,使用Big Dye Teminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)依據隨附之説明書進行反應後,由相同公司之DNA定序儀ABIPRISM 3700DNA Analyzer解析插入各質體之DNA之核苷酸序列,確認得到第6圖所示的質體pKTX93/3311。
3.各種抗CD20嵌合抗體及各種抗CD20功能域交換抗體之動物細胞中的安定表現將本實施例之第1項及第2項分別製作的人類IgG3抗CD20嵌合抗體表現載體pKANTEX2B8γ3、抗CD20功能域交換抗體表現載體pKTX93/1133及pKTX93/3311,導入CHO/DG44細胞〔Somatic cell Mol.Genet.,12,555(1986)〕及剔除α1,6-岩藻糖基轉移酶基因之CHO/DG44細胞(以下記載為CHO/FUT8- / -
)〔Biotechnol.Bioeng.,87,614(2004)〕之宿主細胞,將人類IgG3抗CD20嵌合抗體或抗CD20功能域交換抗體安定生產的細胞如以下方式製作。CHO/DG44細胞為廣泛用於重組蛋白質生產之宿主細胞。CHO/FUT8- / -
細胞為CHO/DG44細胞之FUT8於基因體上剔除的宿主細胞。又,人類IgG1抗CD20嵌合抗體表現載體pKANTEX2B8P,僅導入CHO/FUT8-/-細胞,同樣地製作安定生產人類IgG1抗CD20嵌合抗體之細胞。
將8μg表現載體質體(vectorplasmid),以電穿孔法〔cytotechnology,3,133(1990)〕,導入1.6×106
個CHO/DG44細胞或CHO/FUT8- / -
細胞後,懸浮於40mL之IMDM-(10)〔含10%透析牛血清(dFBS)之IMDM培養基(GIBCO-BRL公司製)〕培養基,96孔微量盤(住友Bakelite公司製)中平均分注100μl/孔。於37℃下5% CO2
培養箱內培養24小時後,以含500μg/mL濃度G418之IMDM-(10)培養基1~2週間培養。培養後,由各孔回收培養上清液,經由後述之本實施例第4項所示ELISA法,測定培養上清液中之抗CD20功能域交換抗體量。於培養上清液中認為是抗CD20功能域交換抗體之表現的孔之轉形株,利用dhfr基因增幅系增加抗體表現量之目的,含500μg/mL濃度之G418,懸濁於含為dhfr基因產物之二氫葉酸還原酵素之抑制劑的甲氨喋呤(Methotrexate)(以下,記載為MTX:SIGMA公司製)50nM濃度的IMDM-(10)培養基,於37℃之5%CO2
培養箱內約1週間培養,取得對50nM之MTX有耐性之轉形株。其次,依序提升MTX濃度為100nM、200nM,最終為含500μg/mL濃度之G418及200nM之MTX的IMDM-(10)培養基中可增殖,且於各自的表現載體中取得高表現之編碼的抗體之轉形株。
4.培養上清液中之抗體濃度之測定(ELISA法)將山羊抗人類IgG(H & L)抗體(American Qualex公司製)於磷酸鹽緩衝食鹽水(以下,記載為PBS)中稀釋為1μg/mL,於96孔ELISA用平盤(葛拉納公司製),以50μL/孔分注,於室溫下靜置一小時使其吸附。反應後,以PBS洗淨,將含1%牛血清白蛋白(以下,記載為BSA;ProliantInc.公司製)之PBS(以下,記載為1% BSA-PBS)以100μL/孔加入,於室溫下反應1小時阻斷殘存的活性基。除去1% BSA-PBS,於測定對象之培養上清液中以50μL/孔加入,於室溫反應2小時。反應後,各孔以含0.05% Tween20之PBS(以下,記載為Tween-PBS)洗淨後,以於PBS中稀釋500倍的過氧化酶標識的山羊抗人類IgG(Fc)抗體溶液(American Qualex公司製)作為二次抗體溶液,各自以50μL/孔加入,於室溫反應1小時。以Tween-PBS洗淨後,將ABTS基質液〔2,2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)銨0.55g溶解於1L0.1M檸檬酸緩衝液(pH4.2),使用之前以1μL/mL添加過氧化氫之溶液〕以50μL/孔加入使其發色,測定415nm之吸光度(以下,記載為OD415)。
5.各種抗CD20嵌合抗體及各種抗CD20功能域交換抗體之純化各自將表現本實施例之第3項所得各種抗CD20抗體之轉形株懸浮於含200nM MTX之IMDM-FCS(10)中成為1×105
細胞/mL後,於三重燒瓶(triple flask)(Nalgenunc公司製)各分注100mL,37℃設定之5% CO2
培養箱內培養2日。由燒瓶除去培養上清液,燒瓶內部以50mL PBS洗淨後,於燒瓶中加入EXCELL301培養基(JRH Biosciences公司製)100mL,於37℃設定之5% CO2
培養箱中培養5日。回收此培養上清液,於3000rpm、4℃之條件下進行5分鐘之遠心分離後,回收上清液,使用0.22μm孔徑PES膜(Iwaki公司製)濾過滅菌。由經滅菌的培養上清液,使用Prosep-A(Protein-A:Millipore公司製)或Prosep-G(Protein-G:Millipore公司製)的管柱,依據添付的説明書,純化各種抗CD20抗體。IgG1抗CD20抗體可以Protein-A純化,而IgG3抗CD20抗體不可以Protein-A純化故使用Protein-G純化。關於功能域交換抗體,3311型可以Protein-A純化。另一方面,1133型不可以Protein-A純化,但可以Protein-G純化。
各抗體之表現載體、宿主細胞、經純化的抗體樣品名稱、及重鏈恆定區之對應胺基酸序列示於表2。再者,表中,樣品名稱末尾中具有(+F)之樣品表示以CHO/DG44作為宿主細胞所生產的抗體樣品,此以外之樣品表示由CHO/FUT8- / -
生產的抗體樣品。
表中:+F表示Fc區上結合的糖鏈中岩藻糖為結合者。-F表示Fc區上結合的糖鏈中岩藻糖為未結合者。
6.由各種抗CD20嵌合抗體及各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品之SDS-PAGE純化度之評價為評價本實施例之第5項所得之各種抗CD20抗體純化樣品之純化度,使用各種抗CD20抗體純化樣品約1μg,依據公知方法〔Nature,227,680(1970))進行SDS變性聚丙烯醯胺電泳(以下,記載為SDS-PAGE)。泳動度之比較對照,人類IgG1抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗(購自Genentech公司)亦進行同樣的操作。以下,利妥昔單抗記載為CD20-IgG1(+F)。
其結果,1133(+F)及1133(-F),顯示與人類IgG1抗體CD20-IgG1(+F)類似的泳動樣式,3311(+F)及3311(-F)顯示類似人類IgG3抗體CD20-IgG3(+F)之泳動樣式。辨識出CD20-IgG1(+F)、CD20-IgG1(-F)、1133(+F)及1133(-F)中H鏈為約50仟道爾頓(以下,記載為kDa),L鏈為約24kDa左右的帶,CD20-IgG3(+F)、CD20-IgG3(-F)、3311(+F)及3311(-F)為H鏈約54kDa、L鏈為約24kDa左右的帶,確認所製作的抗CD20抗體由目的之H鏈及L鏈所構成。
由以上結果,本實施例之第5項所得各種抗CD20抗體純化樣品中,確認各自由H鏈及L鏈構成的目的之IgG分子含有充分的比例。
各種抗CD20嵌合抗體及各種抗CD20功能域交換抗體之活性評價實施例1第5項所得各種抗CD20抗體純化樣品,以如下方式進行各種活性比較。
1.對各種抗CD20抗體之CD20陽性細胞之結合活性實施例1所得各種抗CD20抗體對CD20陽性細胞之結合活性,與生物素化利妥昔單抗之競合抑制系中,使用流式細胞儀的螢光抗體法測定。使用陰性對照之抗Her2人類IgG1抗體赫塞汀〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,89,4285,(1992)〕(購自Genentech公司)及抗CCR4人類IgG1抗體KM3060〔Cancer Res.64,2127(2004)〕。
以每1孔5×105
個CD20陽性之伯奇氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)由來細胞株Daudi細胞〔ATCC:CCL-213〕分注於96孔U字盤(Falcon公司製)後,以含10μg/mL或1μg/mL濃度之實施例1第5項所得各種抗CD20抗體、或陰性對照之抗Her2抗體赫塞汀〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,89,4285,(1992)〕及抗CCR4抗體KM3060(WO02/31140),使用含生物素標識化抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗〔EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce公司製)之生物素化利妥昔單抗〕0.5μg/mL之FACS用緩衝液〔0.2mg/mL人類-IgG(Sigma公司製)、0.02% EDTA、0.05% NaN3、1% BSA〕以50μL/孔添加。遮光下4℃反應60分鐘,細胞以FACS用緩衝液2次洗淨後,以FACS用緩衝液稀釋200倍之PE標識化鏈抗生物素蛋白以50μL/孔添加。遮光下4℃反應60分鐘,細胞以FACS用緩衝液2次洗淨後,懸浮於1mL之FACS用援衝液,於流式細胞儀EP〔CS-XL(Coulter公司製)測定螢光強度。
結果示於第7圖。陰性對照之抗Her2抗體赫塞汀及抗CCR4抗體KM3060對生物素標識化抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗之CD20陽性細胞Daudi之結合不會抑制,但全部的抗CD20功能域交換抗體、人類IgG1抗CD20嵌合抗體及人類IgG3抗CD20嵌合抗體為濃度依存性抑制結合,此程度為相同程度。由此結果,顯示抗CD20功能域交換抗體之抗原結合為CD20特異的,及抗CD20功能域交換抗體之結合活性與人類IgG1抗CD20嵌合抗體為相同程度。
2.各種抗CD20抗體對Daudi細胞之CDC活性之測定實施例1第5項所得各種抗CD20抗體純化樣品中,使用CD20陽性之Daudi細胞測定活體外CDC活性。
反應於96孔平底盤(住友Bakelite公司製)內進行,各反應孔中平均分注150μL,含5x104
個Daudi細胞、含0.3μg/mL之抗CD20功能域交換抗體、人類IgG1抗CD20嵌合抗體或人類IgG3抗CD20嵌合抗體之人類補體稀釋培養基〔含10% FBS(JRH公司製)之RPMI 1640培養基(GIBCO BRL公司製)的人類補體(SIGMA公司製)以6倍稀釋〕。又,各自準備未引起CDC時之對照的未含抗CD20功能域交換抗體的反應孔(0%反應孔),與引起CDC時之對照的未含Daudi細胞之反應孔(100%反應孔)。於37℃,5% CO2
氛圍下2小時培養後,各反應孔中平均加入151μl之WST-1試藥(ROCHE公司製),於37℃、5% CO、氛圍下反應4小時。反應終了後,測定各孔之OD450,由各孔吸光度使用下式計算CDC活性(%)。
CDC活性(%)=100×〔1-(反應孔吸光度-100%反應孔吸光度)/(0%反應孔吸光度-100%反應孔吸光度)
結果示於第8圖。由第8圖所示,人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3(+F)及CD20-IgG3(-F)之CDC活性,較人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1(+F)及CD20-IgG1(-F)之CDC活性更高,確認CDC活性為IgG3>IgG1。然而,顯示抗CD20功能域交換抗體1133(+F)及1133(-F)較人類IgG3抗CD20嵌合抗體之CDC活性顯著高的CDC活性。一方面,抗CD20功能域交換抗體3311(+F)及3311(-F)之CDC活性降低。又,以任一種抗CD20抗體,CHO/DG44作為宿主細胞所生產的抗體樣品與CHO/FUT8- / -
作為宿主細胞所生產的抗體樣品,顯示相同程度之CDC活性,不管結合抗體的糖鏈之岩藻糖含量,1133之活性會上昇。又,即便抗體濃度上升為1μg/mL,上記各種抗體之CDC活性之強弱的順序不會改變。
3.1133型抗CD20功能域交換抗體之CDC活性測定為進一步詳細評價本實施例第2項具有特高CDC活性之抗CD20功能域交換抗體1133(+F)及1133(-F)之CDC活性,使用任一種CD20陽性、伯奇氏淋巴瘤由來細胞株ST486細胞〔ATCC:CRL1647〕或伯奇氏淋巴瘤由來細胞株Raji細胞〔ATCC:CCL-86〕,進行與本實施例第2項相同次序之CDC活性測定。
結果示於第9圖。如第9圖所示,ST486細胞株(第9A圖)與Raji細胞株(第9B圖)任一者,人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3(+F)及CD20-IgG3(-F)之CDC活性較人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1(+F)及CD20-IgG1(-F)之CDC活性高若干,抗CD20功能域交換抗體1133(+F)及1133(-F)顯示顯著超出的CDC活性。又,任一種抗CD20抗體中,CHO/DG44作為宿主細胞所生產的抗體樣品與CHO/FUT8- / -
作為宿主細胞所生產的抗體樣品,顯示相同程度之CDC活性。
5.各種抗CD20抗體對CD20陽性細胞株之ADCC活性之評價實施例1之第5項所得之各種抗CD20抗體純化樣品中,使用作為標的細胞之CD20陽性之Daudi細胞如下列方式測定活體外ADCC活性。測定中,使用Cytotox96套組(Promega公司製)。
(1)人類效應劑細胞溶液之調製採取健康人末梢血50mL,加入肝素鈉(武田藥品公司製)0.2mL溫和混合。使用Lymphoprep(第一化學藥品公司製)依據使用説明書分離單核球劃份後,以RPMI1640培養基1次、10% FBS-RPMI1640培養基1次遠心分離而洗淨,以此作為效應劑細胞。
(2)ADCC活性之測定反應於96孔平底盤(Falcon公司製)內進行,各反應孔中含2×105
個效應劑細胞及1×104
個Daudi細胞或ST486細胞,於含各種濃度之抗CD20抗體之10% FBS-RPMI1640培養基平均分注200μL。又,各自準備ADCC活性之計算上必要的對象孔;未含效應劑細胞、標的細胞及抗體全部的培養基孔;僅含效應劑細胞之效應劑孔;僅含標的細胞之標的孔;不含具有效應劑細胞及標的細胞之抗體之NK孔;僅含標的細胞;反應開始後3小時15分後添加套組添付之Lysis-buffer 20μL之100%反應孔;不含效應劑細胞、標的細胞及抗體全體、反應開始後3小時間15分後添加套組添付之Lysis-buffer 20μL之100%反應對照孔。各反應孔於37℃,5% CO2
氛圍下反應4小時後,遠心分離反應盤,由各孔回收上清液50μL。各自由96孔U字底盤(住友Bakelite公司製)之孔移出各孔之上清液,於各孔中加入發色基質溶液(將套組添付之基質1份溶解於套組隨附之試驗緩衝液12mL中)50μL,於37℃進行30分鐘發色反應,將套組添付之反應停止液平均於各孔中加入50μL後,測定OD450,由各孔吸光度使用下式算出ADCC活性(%)。
ADCC活性(%)=100×(S-E-T)/(Max-T) S=樣品反應孔吸光度-培養基孔吸光度 E=效應劑孔吸光度-培養基孔吸光度 T=標的孔吸光度-培養基孔吸光度 Max=100%反應孔-100%反應對照孔
結果示於第10圖。如第10圖所示,任一種抗CD20抗體中,由CHO/FUT8- / -
生產的抗體樣品較由CHO/DG44生產的抗體樣品顯示較高的ADCC活性。由此結果,發現本實施例所製作的全部抗CD20功能域交換抗體中,於抗體Fc結合的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在的N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖之抗體組成物之方面,較抗體之Fc上結合的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在的N-乙醯基葡糖胺上結合岩藻糖之抗體組成物亦更提升ADCC活性。又,人類IgG1抗CD20嵌合抗體顯示亦較人類IgG3抗CD20嵌合抗體有更高的ADCC活性,確認為IgG1>IgG3。又,1133型抗CD20功能域交換抗體維持與人類IgG1抗CD20嵌合抗體相同程度之高ADCC活性。再者,發現3311型抗CD20功能域交換抗體之ADCC活性與人類IgG3抗CD20嵌合抗體有相同程度之低活性。
6.各種抗CD20抗體對基因重組Fcγ受體IIIa(以下,略記為FcγRIIIa)之結合活性之測定為解析本實施例第5項所確認的抗CD20功能域交換抗體之ADCC活性的增強機制,人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1(-F)、CD20-IgG1(+F)、人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3(-F)、CD20-IgG3(+F)、1133型抗CD20功能域交換抗體1133(-F)及1133(+F)之NK細胞表面上表現的Fc受體家族FcγRIIIa之結合活性以已知方法測定〔Clin.Cancer Res.,10,6248(2004)〕。
結果示於第11圖。如第11圖所示,由CHO/FUT8- / -
生產的抗體樣品與由CHO/DG44生產的抗體樣品相比下,顯示對FcγRIIIa有高的結合活性。由此結果,經由除去對1133型抗CD20功能域交換抗體之Fc上付加的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在的N-乙醯基葡糖胺結合的岩藻糖使抗體之ADCC活性上昇,由於Fc區與Fc受體之結合活性的提升之原因而確認。
由以上內容,具有與人類IgG1抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗之相同可變區,H鏈之CH1功能域及鉸鏈功能域為人類IgG1抗體、Fc區為人類IgG3抗體之胺基酸序列之1133型抗CD20功能域交換抗體,具有提升人類IgG1抗CD20嵌合抗體及人類IgG3抗CD20嵌合抗體之CDC活性,且具有與人類IgG1抗CD20嵌合抗體相同之ADCC活性。再者,由於降低Fc上付加的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在的N-乙醯基葡糖胺上結合的岩藻糖含量,Fc對Fc受體之結合活性會上昇,顯示與人類IgG1抗CD20嵌合抗體相同的ADCC活性之向上。
基於以上所得結果,製作的各抗體及功能域交換抗體之構造與活性之關係,整理於表3。表中,ADCC活性及CDC活性以活性程度強弱順序記載為++++、+++、++、+。
由以上內容顯示,具有人類IgG1抗體之Fc區置換為人類IgG3抗體之Fc區的重鏈恆定區的抗體分子,較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體有更高的CDC活性,且,維持與人類IgG1同等抗體之高ADCC活性。
使用動物細胞,1131型抗CD20功能域交換抗體及1113型抗CD20功能域交換抗體之製作1. 1131型抗CD20功能域交換抗體表現載體及1113型抗CD20功能域交換抗體表現載體之製作實施例2中,顯示將人類IgG1抗CD20嵌合抗體之Fc區(CH2及CH3)與人類IgG3抗體之Fc區置換的1133型抗CD20功能域交換抗體較人類IgG1抗CD20嵌合抗體有更高CDC活性。其次,為調查構成Fc區之CH2功能域及CH3功能域之CDC活性的關係,製作以下所述2種類之抗CD20功能域交換抗體。
以下之實施例,具有CH1、鉸鏈及CH3為來自人類IgG1抗體,CH2來自人類IgG3抗體之胺基酸序列所構成的重鏈恆定區之抗CD20嵌合抗體稱為1131型抗CD2O功能域交換抗體,具有CH1、鉸鏈及CH2為來自人類IgG1抗體,CH3功能域來自人類IgG3抗體之胺基酸序列所構成的重鏈恆定區之抗CD20嵌合抗體稱為1113型抗CD20功能域交換抗體。其任一者,可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列,與於pKANTEX2B8P中編碼的人類IgG1抗CD20嵌合抗體之可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列相同。
1131型抗CD20功能域交換抗體及1113型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之功能域構造、及胺基酸序列示於表4。此等功能域交換抗體之重鏈恆定區之作成例為尚未已知,任一者皆為新穎的構造。又,第12圖中顯示各功能域交換抗體之模式圖。
(1)編碼1113型抗CD20功能域交換抗體之基因序列的表現載體之構築可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列,與pKANTEX2B8P中編碼的人類IgG1抗CD20嵌合抗體之可變區及輕鏈恆定區之胺基酸序列相同,編碼具有CH1、鉸鏈及CH2來自人類IgG3抗體、CH3功能域來自人類IgG1抗體之胺基酸序列所構成的重鏈恆定區之1113型抗CD20嵌合抗體之表現載體如以下方式構築。
由第13圖所示之人類IgG1抗CD20嵌合抗體之表現載體pKANTEX2B8P,使用制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)及SmaI(寶酒造公司製),切出編碼人類IgG1之CH1功能域、鉸鏈功能域及CH2功能域的約700bp之DNA片段而純化。另一方面,對實施例1之2項(2)記載之第14圖所示1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體pKANTEX93/1133進行相同的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。此等純化DNA經混合後,以Ligation High溶液(東洋紡績公司製)進行連結反應,使用該反應液的大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)轉形。由所得轉形株之選殖株調製各質體DNA,依據使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)添付的説明書反應後,由相同公司之DNA定序儀ABI PRISM3700 DNA分析儀解析插入各質體之DNA核苷酸序列,確認得到第15圖所示質體pKTX93/1113。
(2)編碼抗CD20功能域交換抗體1131之基因序列的表現載體之構築對人類CD20之特異反應,CH之CH2功能域為人類IgG3之胺基酸序列,CH1功能域、鉸鏈功能域及CH3功能域為人類IgG1之胺基酸序列,編碼第16圖所示1113型功能域交換抗體之表現載體如以下方式構築。
由實施例1之2項(2)中記載之第14圖所示1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體pKANTEX93/1133,使用制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)及SmaI(寶酒造公司製),切出編碼人類IgG1之CH1功能域、鉸鏈功能域及人類IgG3之CH2功能域之約700bp的DNA片段而純化。一方面,對第13圖所示人類IgG1抗CD20嵌合抗體之表現載體pKANTEX2B8P進行相同的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA後,進行以Ligation High溶液(東洋紡績公司製)之連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株調製各質體DNA,使用Big Dye Teminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)依據隨附之説明書進行反應後,由相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700DNA Analyzer解析插入各質體之DNA之核苷酸序列,確認得到第16圖所示的質體pKTX93/1131。
2.於抗CD20功能域交換抗體1113型及1131型之動物細胞的安定表現將本實施例之第1項製作的抗CD20嵌合抗體表現載體,導入實施例1之3項中記載作為宿主細胞之CHO/FUT- / -
細胞,與安定生產功能域交換的抗CD20抗體的細胞之實施例1第3項相同的步驟製作。
3.抗CD20功能域交換抗體之純化將表現本實施例第2項所得1113型抗CD20功能域交換抗體或1131型抗CD20功能域交換抗體之轉形株各自以相同於實施例1第5項的步驟,培養而純化。1113型抗CD20功能域交換抗體及1131型抗CD20功能域交換抗體使用Prosep-G管柱進行純化。又,1133型抗CD20功能域交換抗體、1113型抗CD20功能域交換抗體及1131型抗CD20功能域交換抗體使用Prosep-A管柱進行純化,而可僅純化1131型抗CD20功能域交換抗體。
各功能域交換抗體之表現載體、宿主細胞及經純化的抗體名稱之對應示於表5。
4.由純化抗CD20功能域交換抗體之SDS-PAGE之純化度評價為測定本實施例第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品之純化度,進行與實施例1第6項相同步驟之SDS-PAGE。泳動度之比較對照,進行對實施例第5項製作的各種純化樣品CD20-IgG1型、CD20-IgG3型及1133型之同樣操作。
結果示於第17圖。1113型及1131型各自顯示與CD20-IgG1型及1133型類似的泳動樣式。由構成1113型及1131型之H鏈及L鏈之胺基酸序列預測的分子量各自類似,H鏈為約50kDa、L鏈為約24kDa。此等分子量,CD20-IgG1型及1133型之H鏈及L鏈之分子量類似,泳動樣式亦類似,而確認1113型及1131型為目的之H鏈及L鏈所構成。又,由構成CD20-IgG3型之L鏈胺基酸序列預測的分子量為約24kDa而與CD20-IgG1型類似,但H鏈為約54kDa,較CD20-IgG1型之H鏈更大,CD20-IgG3型之L鏈與CD20-IgG1型之L鏈類似的位置出現,H鏈位於較CD20-IgG1型之H鏈更高分子量側的位置上。
由以上結果,於本實施例第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品中,確認各自由H鏈及L鏈構成的目的之IgG分子含有十分的比例。
抗CD20功能域交換抗體1131型及1113型之活性評價於實施例3第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品,如下方式進行各種活性比較。
1.抗CD20功能域交換抗體1113型及1131型之CDC活性實施例1第5項所得人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1型、人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3型、1133型抗CD20功能域交換抗體、實施例3第3項所得1113型抗CD20功能域交換抗體及1131型抗CD20功能域交換抗體中,為評價CD20陽性細胞株之活體外CDC活性,使用任一種為CD20陽性之ST486細胞或Raji細胞,進行與實施例2第2項相同步驟之試驗。
結果示於第18圖,如第18圖所示,ST486細胞株(第18A圖)與Raji細胞株(第18B圖)任一者中,CD20-IgG3(-F)之CDC活性較CD20-IgG1(-F)之CDC活性更高,1133(-F)之CDC活性較CD20-IgG3(-F)之CDC活性更高。更且,1113(-F)及1131(-F)之CDC活性較CD20-IgG3(-F)之CDC活性更高。又,1131(-F)之CDC活性較1113(-F)之CDC活性更高。由此等結果,由於IgG1之Fc置換為IgG3之Fc而使CDC活性上昇,發現係IgG3由來之CH2功能域及CH3功能域兩者之幫助。又由上述結果,亦發現CH2功能域與CH3功能域中,CH2功能域之貢獻較大。
2.對CD20陽性細胞株之ADCC活性評價於實施例1第5項所得人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1、人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3、1133型抗CD20功能域交換抗體、實施例3第3項所得1113型抗CD20功能域交換抗體及1131型抗CD20功能域交換抗體中,使用作為標的細胞之CD20陽性Daudi細胞之活體外ADCC活性,以相同於實施例2第5項之步驟測定。測定上使用Cytotox96套組(Promega公司製)。
結果示於第19圖。如第19圖所示,1113(-F)及1131(-F)亦顯示與CD20-IgG1(-F)及1133(-F)之同等ADCC活性,由此結果,人類IgG1抗CD20嵌合抗體之CH2功能域及/或CH3功能域與人類IgG3功能域交換,ADCC活性亦顯示與IgG1相等。
由以上結果,具有與人類IgG1抗CD20嵌合抗體相同的可變區,且僅重鏈恆定區之CH2功能域或CH3功能域由人類IgG3抗體由來之胺基酸序列所構成,此外之功能域為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列所構成之1113型抗CD20功能域交換抗體及1131型抗CD20功能域交換抗體,提升人類IgG3抗CD20嵌合抗體的CDC活性,且確認與人類IgG1抗CD20嵌合抗體有同等之ADCC活性。
由以上所得結果,製作之各抗體及功能域交換抗體之構造與活性之關係,整理於表6。表中,ADCC活性及CDC活性以活性程度強弱順序記載為++++、+++、++、+。又,於蛋白質A結合,具有向蛋白質A之結合活性者為+、不具有者為-。
由以上內容可知,將人類IgG1抗體之重鏈恆定區中,具有CH2功能域及CH3功能域置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的重鏈恆定區之抗體分子(1133型功能域交換抗體)有高CDC活性,人類IgG1抗體之重鏈恆定區中,具有僅CH2功能域置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的重鏈恆定區之抗體分子(1131型功能域交換抗體)中大部分被維持。又,人類IgG1抗體之重鏈恆定區中,具有僅CH2功能域置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的重鏈恆定區的抗體分子(1131型功能域交換抗體),維持與人類IgG1抗體相同的高ADCC活性,又由於除去Fc上付加的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在的N-乙醯基葡糖胺之結合岩藻糖,顯示ADCC活性增強。
對於抗CD20功能域交換抗體之各種基因重組Fcγ受體之結合活性之測定對實施例1第5項所得之人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20一IgG1及CD20-IgG1(+F)、1133型抗CD20功能域交換抗體1133(-F)及1133(+F)之Fc受體家族FcγRI、及FcγRIIa之結合活性依據公知方法〔Clin.Cancer Res.,10,6248(2004)〕測定。
結果示於第20圖。如第20圖所示,1133型抗CD20功能域交換抗體,無論對FcγRI或對FcrRIIa,顯示與IgG1抗CD20抗體相同的結合活性。由此,IgG1抗體之CH2及CH3置換為IgG3抗體之胺基酸序列,顯示向Fc受體家族FcγRI、及FcγRIIa之結合活性未受到影響。
又,第如20圖所示,無論在1133型抗CD20功能域交換抗體方面,或IgG1抗CD20抗體,皆與Fc上付加的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在之結合N-乙醯基葡糖胺的岩藻糖之有無無關,各抗體皆顯示同樣之結合活性。由以上結果,Fc上付加的N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端上存在之結合N-乙醯基葡糖胺之岩藻糖之有無,不受向Fc受體家族FcγRI及FcγRIIa之結合活性的影響,顯示與IgG1相同。
使用動物細胞,將含人類IgG1抗體之CH2功能域的多胜肽置換為相當於人類IgG3抗體相同的EU Index的多胜肽的各種抗CD20功能域交換抗體之製作1.將CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之表現載體構築如實施例4之1項的發現,發現將CH2功能域及CH3功能域雙方置換人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,極有助於人類IgG1抗體之CDC活性增強。
另一方面,由實施例1之5項之發現,1133型抗CD20功能域交換抗體及1113型抗CD20功能域交換抗體與人類IgG3抗體同樣未結合蛋白質A,但1131型抗CD20功能域交換抗體與人類IgG1抗體同樣會結合蛋白質A,暗示人類IgG1抗體由來之胺基酸序列所構成的CH3功能域有助於向蛋白質A之結合。
將抗體作為醫藥品而製造時,由抗體純化之容易性,抗體具有向蛋白質A之結合活性為重要的。其中,將IgG1之CH2功能域完全置換人類IgG3抗體由來之CH2功能域,而由於IgG1之CH3功能域部分置換人類IgG3抗體由來之CH3功能域,CDC活性與1133型同等,進行亦具有蛋白質A結合活性的功能域交換抗體之製作。
以本實施例設計之種種抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區模式圖示於第21圖。此等功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列為未知,任一者皆為新穎的構造。IgG抗體之CH2功能域為EU Index 231編號至340編號位置上的胺基酸殘基構成,CH3功能域由EU Index 341編號至447編號位置上的胺基酸殘基構成。
113A型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至356編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113B型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至358編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113C型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至384編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113D型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至392編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113E型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至397編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113F型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgGl抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至422編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113G型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至434編號與436編號至447編號的多胜肽之功能域交換抗體。
113H型抗CD20功能域交換抗體為含有人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,但置換為相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至435編號的多胜肽之功能域交換抗體。
此等各種抗CD20功能域交換抗體以下列所示步驟製作。
各種抗CD20功能域交換抗體,可由調製編碼各種功能域交換抗體之CH3功能域胺基酸序列的DNA片段,將其以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體pKTX93/1133之編碼CH3功能域胺基酸序列的基因序列置換而製造。CH3功能域之基因序列之置換,可使用編碼CH3功能域的核苷酸序列中之5’末端側位置上制限酶酵素辨識序列Bsp1407I,與編碼重鏈CH3功能域的核苷酸序列之3’末端側位置上的制限酶酵素辨識序列NruI進行。
(1)編碼113A型抗CD20功能域交換抗體之基因序列的表現載體之構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至356編號的多胜肽之功能域交換抗體113A型之表現載體,如以下所示步驟構築(第22圖)。113A型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號33。
首先,設計序列編號34所示核苷酸序列,該序列為,以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上,由編碼CH3功能域的核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407 I至編碼重鏈CH3功能域的核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列NruI的序列為根本,編碼該核苷酸序列的胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 356編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,EU Index 357編號至447編號之胺基酸序列作為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。其次,各自設計序列編號35及36所示核苷酸序列。序列編號35及36所示核苷酸序列,各自,以序列編號34所示核苷酸序列構成的DNA片段為PCR增幅用之有義引子及反義引子之核苷酸序列。各自製作序列編號35及36所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),以實施例2第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體作為模板進行PCR。2條合成寡DNA為終濃度0.5 μ M,調製PCR反應液〔0.05單元/μl KOD DNA聚合酶(東洋紡績公司製)、0.2mM dNTPs、1mM鹽酸鎂、1/10體積之10倍濃縮PCR Buffer # 2(東洋紡績公司製,加入KOD DNA聚合酶)〕,使用DNA熱循環-GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製),於94℃ 4分鐘加熱後,進行1週期為於94℃ 30秒、55℃ 30秒、74℃ 60秒之3階段構成的反應共計25次循環。PCR反應終了後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),回收約300bp之PCR產物。經回收的PCR產物以制限酶酵素Bsp1407I(寶酒造公司製)及制限酶酵素NruI(寶酒造公司製)消化處理後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),切出約300bp之DNA片段而純化。一方面,對以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體進行同樣的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA片段後,添加Ligation High溶液(東洋紡績公司製)進行連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株各自調製質體DNA,使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kitv3.1(Applied Bioaystems公司製)添付之説明書進行反應後,由相同公司之DNA定序儀-ABI PRISM 3700 DNA Analyzer解析插入各質體的DNA之核苷酸序列,確認得到113A型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113A。
(2)編碼113B型抗CD20功能域交換抗體之基因序列的表現載體之構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,由編碼置換相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至358編號的多胜肽的功能域交換抗體113B型的表現載體以下列步驟構築(第22圖)。抗CD20功能域交換抗體113B型之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號37。
首先,設計序列編號38所示核苷酸序列,該序列以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上編碼重鏈CH3功能域的核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407 I至編碼重鏈CH3功能域的核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列NruI的序列為本,於該核苷酸序列編碼的胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 358編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,由EU Index 359編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。其次,設計序列編號39所示核苷酸序列。為經PCR增幅序列編號39所示核苷酸序列由序列編號38所示核苷酸序列構成的DNA片段,使用相對於有義引子之核苷酸序列、序列編號36所核苷酸序列構成的反義引子。各自製作序列編號39及36所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體作為模板進行PCR。之後,以本項(1)相同的步驟製作113B型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113B。
(3)編碼113C型抗CD20功能域交換抗體之基因序列的表現載體之構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域之多胜肽,置換為編碼相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至384編號之多胜肽的功能域交換抗體113C型之表現載體,以下列步驟構築(第22圖)。113C型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號40。
首先,設計序列編號41所示核苷酸序列,該序列,以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識配列Bsp1407I至編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列NruI之為原本,該核苷酸序列編碼的胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 384編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,EU Index 385編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。其次,各自設計序列編號42及43所示核苷酸序列。序列編號42及43所示核苷酸序列,為經PCR增幅序列編號41所示之核苷酸序列構成的DNA片段之合成寡DNA之核苷酸序列。序列編號42所示核苷酸序列之3’末端側與序列編號43所示核苷酸序列之5’末端側為20bp左右為相互互補序列地重複,造成PCR時退火(annealing)樣的設計。各自製作序列編號42及43所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),進行PCR。2條合成寡DNA各自成為終濃度0.2μM,調製PCR反應液〔0.02單位/μL KOD+DNA聚合酶(東洋紡績公司製)、0.2mMdNTPs、1mM硫酸鎂、1/10體積之10倍濃縮PCR Buffer(東洋紡績公司製,添加KOD+DNA聚合酶)〕,使用DNA溫度循環反應器-GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製),於94℃ 4分鐘加熱後、1次循環為94℃ 30秒、50℃ 30秒、68℃ 60秒之3個步驟構成的反應,進行共計25次循環。之後,以本項之(1)相同的步驟製作113C型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113C。
(4)編碼113D型抗CD20功能域交換抗體之基因序列之表現載體的構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域之多胜肽,以下所示步驟構築置換編碼相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至392編號的多胜肽之功能域交換抗體113D型之表現載體(第22圖)。113D型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號44。
首先,設計序列編號45所示核苷酸序列。該序列為編碼實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407I至重鏈CH3功能域之核苷酸序列之3’末端側位置的制限酵素辨識序列NruI之序列為原本,於該核苷酸序列編碼之胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 392編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,EU Index 393編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。其次,設計序列編號46所示核苷酸序列。PCR增幅序列編號46所示核苷酸序列為序列編號45所示核苷酸序列所構成的DNA片段依PCR增幅用之合成寡DNA之核苷酸序列,使用相對於序列編號43所示核苷酸序列構成的合成寡DNA。序列編號46所示核苷酸序列之3’末端側與序列編號43所示核苷酸序列之5’末端側有20bp左右互相重複,PCR時造成退火樣的設計。各自製作序列編號46及43所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),進行PCR。之後,以相同於本項(3)之步驟製作113D型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113D。
(5)編碼113E型抗CD20功能域交換抗體之基因序列的表現載體之構築含人類IG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域之多胜肽,置換為相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至397編號之多胜肽的功能域交換抗體113E型之表現載體以下列所示步驟構築(第22圖)。113E型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號47。
首先,設計序列編號48所示核苷酸序列,該序列為以實施例2第2項所製作之1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上,以編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407 I至編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列NruI之序列為原本,於該核苷酸序列編碼之胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 397編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,由EU Index 398編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。其次,設計序列編號49所示核苷酸序列。序列編號49所示核苷酸序列,對於由序列編號48所示核苷酸序列構成的DNA片段依PCR增幅用的合成寡DNA之核苷酸序列,與由序列編號43所示核苷酸序列構成的合成寡DNA而使用。序列編號49所示核苷酸序列之3’末端側與序列編號43所示核苷酸序列之5’末端側有20bp左右相互重複,PCR時造成退火之方式設計。各自製作序列編號49及43所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),進行PCR。之後,與本項之(3)相同步驟製作113E型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113E。
(6)編碼113F型抗CD20功能域交換抗體之基因序列之表現載體之構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域之多胜肽,置換為編碼相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至422編號的多胜肽之功能域交換抗體113F型之表現載體,以下列步驟構築(第22圖)。113F型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號50。
首先,設計序列編號51所示核苷酸序列,該序列為,實施例2之第2項所製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上,以由編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407 I至編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列NruI之序列為原本,該核苷酸序列編碼之胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 422編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列、EU Index 423編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。各自製作序列編號39及36所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),以實施例1之第1項製作的人類IgG3抗CD20人型嵌合抗體之表現載體質體pKANTEX2B8γ3作為模板而進行PCR。之後,與本項(1)相同之步驟製作113F型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113F。
(7)編碼113H型抗CD20功能域交換抗體之基因序列之表現載體的構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域的多胜肽,置換為編碼相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至435編號的多胜肽之功能域交換抗體113H型的表現載體,以下列步驟構築(第22圖)。113H型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號52。
首先,設計序列編號53所示核苷酸序列。該序列,以實施例2之第2項所製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上,編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407 I至編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Nrut之序列為原本,於該核苷酸序列所編碼的胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 435編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,EU Index 436編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列。其次,各自設計序列編號54所示核苷酸序列。序列編號54所示核苷酸序列,對於由序列編號53所示核苷酸序列構成的DNA片段依PCR增幅用的反義引子之核苷酸序列,使用由序列編號39所示核苷酸序列構成的有義引子。各自製作序列編號39及54所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),以實施例1之第1項所製作的人類IgG3抗CD20人型嵌合抗體之表現載體質體pKANTEX2B8γ3為模板,進行PCR。之後,與本項之(1)相同步驟製作113H型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113H。
(8)編碼113G型抗CD20功能域交換抗體之基因序列之表現載體的構築含人類IgG1抗CD20嵌合抗體之重鏈恆定區中之CH2功能域之多胜肽,置換為編碼相當於人類IgG3抗體之EU Index 231編號至434編號及436編號至447編號之多胜肽的功能域交換抗體113G型之表現載體,以下列步驟構築(第22圖)。113G型抗CD20功能域交換抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列示於序列編號55。
首先,設計序列編號56所示核苷酸序列。該序列為,實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體上,編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列中之5’末端側位置的制限酶酵素辨識序列Bsp1407I至編碼重鏈CH3功能域之核苷酸序列之3’末端側位置的制限酶酵素辨識序列NruI之序列為原本,於該核苷酸序列編碼之胺基酸序列中,由N末端側至EU Index 434編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列,EU Index 435編號之胺基酸序列為人類IgG1抗體由來之胺基酸序列,EU Index 436編號至447編號之胺基酸序列為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列。其次,各自設計序列編號57所示核苷酸序列。序列編號57所示核苷酸序列為由序列編號56所示核苷酸序列構成的DNA片段依PCR增幅用的反義引子之核苷酸序列,相對於序列編號39所示核苷酸序列構成的有義引子而使用。各自製作序列編號39及56所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),以實施例1之第1項所製作的人類IgG3抗CD20人型嵌合抗體之表現載體質體pKANTEX2B8γ3作為模板進行PCR。之後,與本項(1)之相同步驟製作113G型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/113G。
2.將CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列之各種抗CD20功能域交換抗體之動物細胞中的安定表現本實施例之第1項所製作的CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之表現載體,以實施例1第3項中記載之CHO/FUT8- / -
作為宿主細胞各自導入,安定生產CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列之各種抗CD20功能域交換抗體之細胞,以相同於實施例1之第3項之相同步驟製作。
3. CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之純化各自將表現本實施例之第2項所得CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之轉形株,以實施例1之第5項相同的步驟,培養、純化。使用純化性Prosep-G管柱。各改變抗體中,表現載體、宿主細胞、經純化的抗體之名稱、重鏈恆定區之胺基酸序列之對應示於表7。
4.由經純化各種抗CD20功能域交換抗體之SDS-PAGE之純化度評價為評價本實施例第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品之純化度,以實施例1第6項相同的步驟進行SDS-PAGE。泳動度之比較對照,亦對實施例1第5項所製作的純化樣品CD20-IgG1(-F)及1133(-F)進行同樣的操作。
結果示於第23圖。本實施例第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品,各自顯示CD20-IgG(-F)及1133(-F)為類似的泳動樣式。各自類似構成各種抗CD20功能域交換抗體之H鏈及L鏈之胺基酸序列所預測的分子量,H鏈為約50仟道爾頓(以下,記載為kDa),L鏈為約24kDa。由於此等分子量,CD20-IgG1(-F)及1133(-F)之H鏈及L鏈分子量類似,泳動樣式亦類似,確認各種抗CD20功能域交換抗體為目的之H鏈及L鏈所構成。
由以上結果,以本實施例第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品中,確認含有各由H鏈及L鏈所構成的目的之IgG分子為十分的比例。
將CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之活性評價由實施例6第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品中,如下方式進行各種活性比較。
1.以CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之CDC活性之測定以實施例6第3項所得之各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品、實施例1第5項所得1133型抗CD20功能域交換抗體、及實施例3第3項所得1131型抗CD20功能域交換抗體中,人類CD20基因導入細胞株CD20/EL4-A〔Clinical Cancer Res.,11,2327(2005)〕之活體外CDC活性測定。反應於96孔平底盤(住友Bakelite公司製)內進行,各反應孔中分注含5×104
個標的細胞、各種濃度(0.1μg/mL~30μg/mL)的抗CD20功能域交換抗體的人類補體稀釋培養基分別為150μL。以下,進行與實施例2第2項之相同的步驟試驗。
結果示於第24圖。各種抗CD20功能域交換抗體任一者顯示與1131(-F)同等、或其以上之CDC活性,特別是113E(-F)、113F(-F)、113G(PF)、113H(-F)顯示較1131(-F)更顯著高的CDC活性。
2.以CH2功能域之全部與CH3功能域之一部置換為人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體之蛋白質A結合活性之測定(ELISA法)以實施例6第3項所得各種抗CD20功能域交換抗體純化樣品、以實施例1第5項所得CD20-IgG1(-F)、CD20-IgG3(-F)、1133(-F)、實施例3第3項所得1131(-F)及1113(-F),與蛋白質A之結合活性依以下所述步驟測定。
將山羊抗人類kappa鏈抗體(Sigma-Aldrich公司製)以PBS稀釋為5μg/mL,於96孔ELISA用平盤(葛拉納公司製)中,以50μL/孔分注,於室溫下靜置一小時使其吸附。反應後,以PBS洗淨後,將1% BSA-PBS以100μL/孔加入,室溫下使其反應1小時而阻斷殘存的活性基。除去1% BSA-PBS後,測定對象之抗體以各種濃度(0.01μg/mL~10μg/mL)50μL/孔加入,於室溫下使其反應2小時。反應後,各孔以Tween-PBS洗淨後,以PBS稀釋5000倍的過氧化酶標識蛋白質A溶液(Amersham Bioscience公司製)以50μL/孔加入,於37℃反應2小時。以Tween-PBS洗淨後,ABTS基質液以50μL/孔加入使其發色,測量OD415。
結果示於第25圖。首先,比較CD20-IgG1(-F)、CD20-IgG3(-F)、1133(-F)、1131(-F)及1113(-F)對蛋白質A之結合活性(第25A圖)。如第25A圖所示,基於CD20-IgG1(-F)及1131(-F)顯示濃度依存性蛋白質A結合活性,其活性為相同。一方面,CD20-IgG3(-F)、1133(-F)及1113(-F),所測定的濃度域(10μg/mL以下)則未見蛋白質A結合活性。
其次,將各種抗CD20功能域交換抗體之蛋白質A結合活性與CD20-IgG1(-F)及1133(-F)比較。如第25B圖所示,1l33(-F)及113H(-F)未顯示蛋白質A結合活性,但113A(-F)、113B(-F)、113C(-F)、113D(-F)、113E(-F)、113F(-F)及113G(-F)顯示與IgG1同等的蛋白質A結合活性。
各種抗CD20功能域交換抗體之CDC活性與蛋白質A結合活性之強度示於表8。
將IgG1抗體之CH2及CH3置換為IgG3之胺基酸序列的1133型功能域交換抗體,CDC活性會上昇,但蛋白質A結合活性會喪失。一方面,僅將IgG1抗體之CH2置換為IgG3之胺基酸序列的1131型抗體,保持蛋白質A結合活性,但CDC活性之增強比例會降低。以本實施例作成、CH2功能域之全部與CH3功能域之一部份置換為對應的人類IgG3抗體由來之胺基酸序列的各種抗CD20功能域交換抗體為,較去除113(-F)的全部IgG1有更高CDC活性,且具有蛋白質A結合活性。又,CH3功能域全體占人類IgG3抗體由來之胺基酸序列之比例比較多的113E(-F)、113F(-F)及113G(-F)顯示較1131(-F)有更高CDC活性,且,具有人類IgG1抗體同樣之蛋白質A結合活性。具有人類IgG1抗體同樣之蛋白質A結合活性的抗CD20功能域交換抗體中,特別以113F(-F)之CDC活性為高的。
由以上內容得知,IgG1抗體之CH2功能域全部置換為人類IgG3抗體由來之CH2功能域,進一步,CH3功能域之一部份置換為人類IgG3抗體由來之CH3功能域的抗體,較僅將IgG1抗體之CH2功能域置換為人類IgG3抗體由來之CH2功能域的抗體有最大的CDC活性增強,且維持人類IgG1抗體同樣之蛋白質A結合活性。
各種抗CD20功能域交換抗體對慢性淋巴球性白血病(CLL)細胞之CDC活性評價將實施例1第5項所得的CD20-IgG1(-F)、實施例1第5項所得的1133(-F)、實施例3第3項所得的1131(-F)、實施例6第3項所得之113F(-F),測定任一者對CD20陽性CLL細胞株的MEC-1(DSMZ:ACC497)、MEC-2(DSMZ:ACC500)及EHEB(DSMZ:ACC67)之活體外CDC活性。反應於96孔平底盤(住友Bakelite公司製)內進行,各反應孔中,含5×104
個標的細胞,以各種濃度(0.04μg/mL~100μg/mL)將含抗CD20抗體的人類補體稀釋培養基以每150μl分注。以下,與實施例2第2項相同的步驟進行試驗。
結果示於第26圖。MEC-1(第26A圖)、MEC-2(第26B圖)及EHEB(第26C圖)任一者之CD20陽性CLL細胞株,以1133(-F)、1131(-F)及113F(-F)與CD20-IgG1比較的CDC活性為顯著被增強。以上之結果,含有以此等抗體作為有效成分之醫藥,暗示為CLL之治療上有效者。
使用動物細胞,人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體及1131型抗Campath功能域交換抗體之製作1.人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體及1131型抗Campath功能域交換抗體之表現載體構築以實施例4之1項進行的抗CD20功能域交換抗體1131(-F)與1113(-F)之CDC活性比較上得知,1131(-F)與1113(-F)皆顯示超出IgG1的CDC活性,但特別是1131(-F)超出1113(-F)的CDC活性,CH2功能域為IgG3者給予CDC活性最大增強。對於其他抗原的抗體,為確認所建者為同樣之CDC活性增強,於人化抗Campath抗體Campath-1H,製作人類IgG1、1133型及1131型,而比較CDC活性。
(1)編碼1133型抗Campath功能域交換抗體之基因序列之表現載體的構築人類Campath抗原(CD52)特異地辨識,重鏈恆定區胺基酸序列中,CH1及鉸鏈為人類IgG1之胺基酸序列、CH2及CH3為編碼人類IgG3之胺基酸序列的1133型抗Carnpath功能域交換抗體的表現載體,如以下所示步驟構築(第27圖)。
首先,由National Center of Biotechnology Information(NCBI)之資料庫,得到人化抗Campath抗體Campath-1H之重鏈可變區(登錄號:S79311)及輕鏈可變區(登錄號:S79307)之胺基酸序列及基因序列。人化抗Campath抗體Campath-1H之重鏈可變區之胺基酸序列於序列編號58、基因序列之序列編號59、人化抗Campath抗體Carnpath-1H之輕鏈可變區之胺基酸序列於序列編號60、基因序列之序列編號61。以此等序列情報為根本,各自設計示於序列編號62、人化抗Campath抗體Campath-1H之重鏈可變區與1133型重鏈恆定區序列構成的1133型抗Campath功能域交換抗體重鏈之胺基酸序列、及、示於序列編號63、人化抗Campath抗體Campath-1H之輕鏈可變區與人類抗體輕鏈恆定區序列構成的抗Campath抗體輕鏈之胺基酸序列。
其次,設計序列編號64所示核苷酸序列。該序列為,序列編號59所示人化抗Campat11抗體Campath-1H之重鏈可變區基因序列中,將5’末端側制限酶酵素NotI辨識序列附加3’末端側制限酶酵素ApaI辨識序列的核苷酸序列。又,以序列編號64所示核苷酸序列為基礎,各自設計序列編號65、66、67及68所示核苷酸序列。此等序列,將序列編號64所示核苷酸序列為4分割的核苷酸序列,且,隣接序列彼此有約20bp之重複、有義及反義鏈以交互方式設計。
實際上,各自製作序列編號65、66、67及68所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),使用此等進行PCR。兩端上位置的2條合成寡DNA各成為終濃度0.5μM,內側位置的2條合成寡DNA各成為終濃度0.1μM,調製PCR反應液〔添加0.02單位/μL KOD+DNA聚合酶(東洋紡績公司製)、0.2mM dNTPs、1mM硫酸鎂、1/10體積之10倍濃縮PCR Buffer(東洋紡績公司製、KOD DNA聚合酶)〕,使用DNA溫度循環反應器GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems公司製),於94℃ 4分鐘加熱後,1循環為94℃ 30秒、50℃ 30秒、68℃ 60秒之3階段構成的反應共計25次循環進行。PCR反應終了後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),回收約480bp之PCR產物。經回收的PCR產物以制限酶酵素NotI(寶酒造公司製)及制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)消化處理後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),切出約450bp之DNA片段而純化。一方面,對以實施例2之第2項製作的1133型抗CD20功能域交換抗體之表現載體質體進行相同的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA片段後,添加Ligation High溶液(東洋紡績公司製)而進行連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株調製各別質體DNA,使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(AppliedBiosystems公司製)依添付之説明書反應後,由相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Analyzer解析各質體所插入的DNA核苷酸序列,確認得到以重鏈可變區置換編碼人化抗Campath抗體Campath-1H之重鏈可變區的核苷酸序列的1133型表現載體質體。
其次,設計序列編號69所示核苷酸序列。該序列為,於序列編號61所示人化抗Campath抗體Campath-1H之輕鏈可變區基因序列中,將5’末端側制限酶酵素EcoRI辨識序列附加於3’末端側制限酶酵素BsiWI辨識序列的核苷酸序列。又,以序列編號69所示核苷酸序列為基礎,各別設計序列編號70、71、72及73所示核苷酸序列。此等序列為,將序列編號69所示核苷酸序列為4分割的核苷酸序列,且,隣接序列彼此有約20bp之重複,有義及反義鏈以交互方式設計。使用此等核苷酸序列所示4條合成寡DNA進行PCR,介入各別隣接序列之重複序列而連結,增幅具有序列編號69所示核苷酸序列之DNA片段。
實際上,各別製作序列編號70、71、72及73所示核苷酸序列之合成寡DNA(Fasmac公司製),使用此等進行PCR。兩端位置的2條合成寡DNA各自終濃度成為0.5μM,內側位置的2條合成寡DNA各自終濃度成為0.1μM,調製PCR反應液〔0.02單位/μL KOD+DNA聚合酶(東洋紡績公司製)、0.2mMdNTPs、1mM硫酸鎂、1/10體積之10倍濃縮PCR Buffer(東洋紡績公司製、添加KODDNA聚合酶)〕,使用DNA溫度循環反應器GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems公司製),於94℃ 4分鐘加熱後,1循環為94℃ 30秒、50℃ 30秒、68℃ 60秒之3階段構成的反應共計25次循環進行。PCR反應終了後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),回收約420bp之PCR產物。經回收的PCR產物以制限酶酵素EcoRI(寶酒造公司製)及制限酶酵素BsiWI(東洋紡績公司製)消化處理後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),切出約400bp之DNA片段而純化。一方面,以本項製作之,對以重鏈可變區置換編碼人化抗Campath抗體Campath-1H之重鏈可變區的核苷酸序列的1133型表現載體質體進行相同的制限酶酵素處理,切出約13kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA片段後,添加Ligation High溶液(東洋紡績公司製)進行連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株各自調製質體DNA,使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)依添付之説明書反應後,使用相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Analyzer解析於各質體中插入的DNA之核苷酸序列,確認得到1133型抗Campath抗體之表現載體質體pKTX93/Campath1H-1133。
(2)編碼人類IgG1抗Campath抗體之基因序列的表現載體之構築特異性辨識人類Campath抗原(CD52),編碼重鏈恆定區為人類IgG1之胺基酸序列的人類IgG1抗Campath抗體的表現載體以下列所示步驟構築(第28圖)。
本項製作的1133型抗Campath抗體之表現載體質體pKTX93/Campath1H-1133,以制限酶酵素EcoRI(寶酒造公司製)及制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)消化處理後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),切出約3300bp之DNA片段而純化。一方面,對人類IgG1抗CD20嵌合抗體之表現載體質體pKANTEX2B8P,進行相同之制限酶酵素處理,切出約10kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA片段後,添加Ligation High溶液(東洋紡績公司製)進行連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株調製各別質體DNA,使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)依添付之説明書反應後,使用相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Analyzer解析插入各質體之DNA核苷酸序列,確認得到人類IgG1抗Campath抗體之表現載體質體pKTX93/Campath1H-IgG1。
(3)編碼1131型抗Campath抗體之基因序列的表現載體之構築特異性辨識人類Campath抗原(CD52),編碼重鏈恆定區胺基酸序列中,CH1及鉸鏈為人類IgG1之胺基酸序列,CH2為人類IgG3之胺基酸序列,CH3為人類IgG1之胺基酸序列的人類1131型抗Campath抗體的表現載體,以下列所示步驟構築(第29圖)。
將本項製作的1133型抗Campath抗體之表現載體質體pKTX93/Campath1H-1133,以制限酶酵素EcoRI(寶酒造公司製)及制限酶酵素ApaI(寶酒造公司製)消化處理後,將該反應液供給於洋菜膠電泳,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製),切出約3300bp之DNA片段而純化。一方面,對實施例3之第1項製作的1131型抗CD20抗體之表現載體質體pKTX93/1131進行相同之制限酶酵素處理,切出約10kbp之DNA片段而純化。混合此等純化DNA片段後,添加Ligation High溶液(東洋紡績公司製)進行連結反應,使用該反應液轉形大腸菌XL1-BLUE MRF’株(Stratagene公司製)。由所得轉形株之選殖株調製各別質體DNA,使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems公司製)依添付之説明書反應後,使用相同公司之DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Analyzer解析插入各質體之DNA核苷酸序列,確認得到1131型抗Campath功能域交換抗體之表現載體質體pKTX93/CampathlHP1131。
2.人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體及1131型抗Campath功能域交換抗體之動物細胞的安定表現將本實施例第1項製作的人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體及1131型抗Campath功能域交換抗體之表現載體,各別導入實施例1之第3項記載之作為宿主細胞的CHO/FUT8- / -
,以實施例1之第3項相同的步驟各別製作安定生產人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體或1111型抗Campath功能域交換抗體的細胞。
3.人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體及1131型抗Campath功能域交換抗體之純化各別將表現本實施例第2項所得之人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體或1131型抗Campath功能域交換抗體之轉形株,以與實施例1之第5項相同的步驟,培養、純化。各改變抗體之表現載體、宿主細胞、經純化的抗體的名稱之對應示於表8。
4.經純化的各種抗Campath抗體之SDS-PAGE之純化度評價為評價本實施例第3項所得各種改變抗體純化樣品之純化度,以與實施例1第6項之相同步驟進行SDS-PAGE,於本實施例第3項所得各種改變抗體純化樣品中,確認含有十分比例各別之H鏈及L鏈所構成的目的之IgG分子。
人類IgG1抗Campath抗體、1133型抗Campath功能域交換抗體及1131型抗Campath功能域交換抗體之CDC活性測定以實施例9第3項所得的各種抗Campath抗體純化樣品Carnpath1H-IgG1、Carnpath1H-1133及Campath1H-1131,測定對Campath抗原陽性之CLL細胞株MEC-1、MEC-2及EHEB之活體外CDC活性。
以與實施例8相同的步驟進行試驗,對於MEC-1、MEC-2及EHEB任一細胞株,Campath1H-1133及Campath1H-1131顯示較Campath1H-IgG更高的CDC活性。
依本發明可提供,於人類IgG1抗體,將含Fc區中之CH2功能域的多胜肽,置換為相當於Kabat等人之EU Index中人類IgG3抗體之相同位置的胺基酸序列構成的多胜肽,顯示較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體又更高補體依存性細胞傷害活性之基因重組抗體組成物;編碼含於該基因重組抗體組成物的抗體分子或該抗體分子之重鏈恆定區的DNA;將該DNA導入宿主細胞所得之轉形體;使用該轉形體之基因重組抗體組成物之生產方法;及含有以該基因重組抗體組成物為有效成分之醫藥。
【第1圖】係比較各IgG亞群之重鏈恆定區之胺基酸序列圖。
【第2圖】係結合IgG抗體之H鏈297編號之天冬醯胺酸的N-結合複合型糖鏈之構造模式圖。
【第3圖】係顯示質體pKANTEX2B8γ3之構成步驟圖。
【第4圖】係抗CD20功能域交換抗體之模式圖。
【第5圖】係顯示質體pKTX93/1133之圖。
【第6圖】係顯示質體pKTX93/3311之圖。
【第7圖】係顯示各種抗CD20功能域交換抗體、人類IgG1抗CD20嵌合抗體及人類IgG3抗CD20嵌合抗體對於Daudi細胞,與抗CD20抗體CD20-IgG1(+F)之競爭抑制系統的結合活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度之結合抑制率。圖中之△及▲於圖表A~H中共同表示陰性對照的抗Her2抗體赫塞汀(△)及抗CCR4抗體KM3060(▲);圖中之○及●於各圖表中對應的樣品不同,各於圖表A中為CD20-IgG1(+F)(○)及CD20-IgG1(-F)(●),圖表B中為CD20-IgG3(+F)(○)及CD20-IgG3(-F)(●);圖表C中為1133(+F)(○)及1133(-F)(●);圖表D中為3311(+F)(○)及3311(-F)(●)。
【第8圖】係顯示人類IgG1抗CD20嵌合抗體、人類IgG3抗CD20嵌合抗體、抗CD20功能域交換抗體1133及3311對於Daudi細胞的CDC活性圖;横軸為樣品名稱,縱軸為CDC活性;圖表各自表示樣品濃度0.3μg/mL之CDC活性。
【第9A、B圖】係顯示人類IgG1抗CD20嵌合抗體、人類IgG3抗CD20嵌合抗體及1133型抗CD20功能域交換抗體,對ST486細胞(A)或Raji細胞(B)之CDC活性圖;横軸為樣品濃度;縱軸為各樣品濃度之CDC活性;圖中,□為CD20-IgG1(+F),■為CD20-IgG1(-F),△為CD20-IgG3(+F),▲為CD20-IgG3(-F),○為1133(+F),●為1133(-F)。
【第10A~D圖】係顯示人類IgG1抗CD20嵌合抗體、人類IgG3抗CD20嵌合抗體、抗CD20功能域交換抗體1133及3311,對Daudi細胞之ADCC活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度中的ADCC活性。圖中之○及●於各圖表中對應不同樣品,圖表A中為CD20-IgG1(+F)(○)及CD20-IgG1(-F)(●),圖表B中為CD20-IgG3(+F)(○)及CD20-IgG3(-F)(●),圖表C中為1133(+F)(○)及1133(-F)(●),圖表D中為3311(+F)(○)及3311(-F)(●)。
【第11A~F圖】係顯示抗CD20功能域交換抗體1133、人類IgG1抗CD20嵌合抗體及人類IgG3抗CD20嵌合抗體,對抗原CD20非存在下中可溶性人類FcγRIIIa(纈胺酸型)(A~C)或可溶性人類FcγRIIIa(苯丙胺酸型)(D~F),於ELISA系統之結合活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各種樣品濃度中的吸光度;圖表A及D為CD20-IgG1(-F)(●)及CD20-IgG1(+F)(○),圖表B及E為CD20-IgG3(-F)(●)及CD20-IgG3(+F)(○),圖表C及F為1133(-F)(●)及1133(+F)(○)之結合活性。
【第12圖】係抗CD20功能域交換抗體之模式圖。
【第13圖】係表示質體pKANTEX2B8P之圖。
【第14圖】係表示質體pKANTEX93/1133之制限酶酵素辨識位ApaI及SmaI之位置圖。
【第15圖】係顯示質體pKANTEX93/1113之圖。
【第16圖】係顯示質體pKANTEX93/1131之圖。
【第17圖】係顯示經純化的抗CD20功能域交換抗體1133、1113、1131、人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1及人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3之SDS-PAGE電泳圖之圖;蛋白質染色以柯麥氏燦藍(Coomassie Brilliant Blue)(CBB)進行,各自對應組之第1組為CD20-IgG1,第2組為CD20-IgG3,第3組為1133,第4組為1113,第5組為1131。
【第18A、B圖】係顯示抗CD20功能域交換抗體1133、1113、1131、人類IgG1抗CD20抗體CD20-IgG1及人類IgG3抗CD20抗體CD20-IgG3,對ST486細胞(A)或Raji細胞(B)之CDC活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度中細胞抑制率,圖中,■為CD20-IgG1,▲為CD20-IgG3,●為1133,×為1113,◆為1131。
【第19圖】係顯示抗CD20功能域交換抗體1133、1113、1131、人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1及人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3,對Daudi細胞之ADCC活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度之細胞抑制率,圖中,■為CD20-IgG1,▲為CD20-IgG3,●為1133,×為1113,◆為1131。
【第20A、B圖】係顯示以ELISA系統測定人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1(-F)、CD20-IgG1(+F)、1133型抗CD20功能域交換抗體1133(一F)及1133(+F),對Fc受體家族FcγRI(A)或FcγRIIa(B)之結合活性的結果圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度之吸光度;圖表A為對FcγRI,圖表B為對FcγRIIa,CD20-IgG1(-F)(▲),CD20-IgG1(+F)(△),1133(-F)(●)及1133(+F)(○)之結合活性。
【第21圖】係表示抗CD20功能域交換抗體1133之CH3功能域部分地置換人類IgG1序列的抗體113A、113B、113C、113D、113E、113F、113G及113H之功能域構造的模式圖;圖中,□所示區為IgG1之胺基酸序列,■所示區為IgG3之胺基酸序列,IgG3區之兩端上部所示數字,為對應兩端位置之IgG3胺基酸殘基位置的EU Index。
【第22圖】係顯示抗CD20功能域交換抗體1133之CH3功能域部分地置換人類IgG1序列的各種抗體之表現載體質體之構成步驟圖。
【第23圖】係顯示抗CD20功能域交換抗體1133之CH3功能域部分地置換人類IgG1序列的各種抗體之純化樣品之SDS-PAGE電泳圖;蛋白質之染色以柯麥氏燦藍(CBB)進行;由左道對應分子量記號、CD20-IgG1、1133、113A、113B、I13C、113D、113E、113F、113G、113H。
【第24圖】係顯示抗CD20功能域交換抗體1133之CH3功能域部分地置換人類IgG1序列的各種抗體,抗CD20功能域交換抗體1133及1131對CD20陽性細胞之CDC活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度之CDC活性;圖中,●(粗線)為1133,○(粗線)為1131,●(細線)為113A,○(細線)為113B,▲為113C,△為113D,◆為113E,◇為113F,■為113G,□為113H。
【第25A、B圖】係表示以ELISA系統測定,抗CD20功能域交換抗體1133之CH3功能域部分地置換人類IgG1序列之各種抗體,人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1、人類IgG3抗CD20嵌合抗體CD20-IgG3、抗CD20功能域交換抗體1133、1131及1113對蛋白質A之結合活性的結果圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度之吸光度;第34A圖顯示CD20-IgG1(●)、CD20-IgG3(○)、1133(■)、1131(□)及1113(△)對蛋白質-A的結合活性圖;第34B圖為顯示CD20-IgG1(●)、1133(■)、113A(○)、113B(□)、113C(+)、113D(*)、113E(◇)、113F(◆)、113G(▲)及113H(△)對蛋白質-A的結合活性圖。
【第26A~C圖】係顯示人類IgG1抗CD20嵌合抗體CD20-IgG1,抗CD20功能域交換抗體1133、1131及113F對CD20陽性CLL細胞株MEC-1(A)、MEC-2(B)或EHEB(C)之CDC活性圖;横軸為樣品濃度,縱軸為各樣品濃度中CDC活性;圖中,○為CD20-IgG1,●為1133,△為1131,▲為113F。
【第27圖】係1133型抗Campath功能域交換抗體之表現載體質體之構成步驟圖。
【第28圖】係顯示人類IgG1抗Campath抗體之表現載體質體之構成步驟圖。
【第29圖】係顯示1131型抗Campath功能域交換抗體之表現載體質體之構成步驟圖。
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD. <120> 重組抗體組成物<130> 1749WO0 <150> JP2005-212979 <151> 2005-7-22 <150> JP2006-108216 <151> 2005-4-11 <160> 75 <170> PatentIn Ver.2 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 1<210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 2<210> 3 <211> 1130 <212> DNA <213> 人類<400> 3 <210> 4 <211> 454 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 4<210> 5 <211> 129 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 5<210> 6 <211> 127 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 6<210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 7<210> 8 <211> 129 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 8<210> 9 <211> 595 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 9<210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 10<210> 11 <211> 139 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 11<210> 12 <211> 119 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 12<210> 13 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<213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成胜肽<400> 44 <210> 45 <211> 329 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 45 <210> 46 <211> 174 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 46<210> 47 <211> 330 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成胜肽<400> 47 <210> 48 <211> 329 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 48<210> 49 <211> 174 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 49<210> 50 <211> 330 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成胜肽<400> 50<210> 51 <211> 329 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 51<210> 52 <211> 330 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成胜肽<400> 52 <210> 53 <211> 329 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 53<210> 54 <211> 69 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 54<210> 55 <211> 330 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成胜肽<400> 55 <210> 56 <211> 329 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 56<210> 57 <211> 69 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明:合成DNA <400> 57<210> 58 <211> 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Claims (22)
- 一種基因重組抗體組成物,其含有選自下列(1)至(8)之多胜肽的Fc區中的CH2功能域而成的多胜肽、或CH2功能域和CH3功能域而成的多胜肽;該抗體為將人類IgG1抗體的CH2功能域的全部取代為人類IgG3抗體的相對應功能域,或將人類IgG1抗體的CH2功能域的全部和CH3功能域的一部分取代為人類IgG3抗體的相對應功能域之基因重組抗體;該抗體組成物顯示較人類IgG1抗體及人類IgG3抗體有更高的補體依存性細胞傷害活性,且對蛋白質A,具有與人類IgG1相同的結合活性,(1)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.31所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽;(2)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.33所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽;(3)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.37所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽;(4)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.40所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽;(5)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.44所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽;(6)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.47所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽; (7)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.50所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽;(8)多胜肽為包含序列識別號SEQ ID NO.55所示胺基酸序列之第114至第330號之胺基酸序列的多胜肽。
- 如申請專利範圍第1項之基因重組抗體組成物,為包含Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子的基因重組抗體組成物,該組成物中所含結合Fc區之全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上岩藻糖未結合的糖鏈比例為20%以上。
- 如申請專利範圍第1或2項之基因重組抗體組成物,為包含Fc區具有N-糖苷結合複合型糖鏈之抗體分子的基因重組抗體組成物,該抗體之Fc區結合的N-糖苷結合複合型糖鏈為該糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖的糖鏈。
- 一種DNA,其編碼如申請專利範圍第1至3項中任一項之基因重組抗體組成物所含的抗體分子。
- 一種DNA,其編碼如申請專利範圍第1至3項中任一項之基因重組抗體組成物中所含抗體分子之重鏈恆定區。
- 一種轉形體,係將如申請專利範圍第5項之DNA導入宿主細胞而得。
- 如申請專利範圍第6項之轉形體,其中宿主細胞為對辨識N-糖苷結合糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位與岩藻糖的1位為α結合的糖鏈構造之凝集素(lectin)有耐 受性的細胞。
- 如申請專利範圍第6項之轉形體,其中宿主細胞為導入編碼抗體分子的基因時具有生產下列抗體組成物之能力,該抗體組成物為包含於Fc區上有N-糖苷結合複合型糖鏈的抗體分子的組成物,該組成物中所含結合Fc區的全N-糖苷結合複合型糖鏈中,糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺上未結合岩藻糖的糖鏈之比例為20%以上的抗體組成物。
- 如申請專利範圍第8項之轉形體,其中未結合有岩藻糖的糖鏈為該岩藻糖之1位未α結合於N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上的糖鏈。
- 如申請專利範圍第8項之轉形體,其中宿主細胞為使得與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素,或岩藻糖的1位α結合於N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上的糖鏈修飾有關的酵素之活性降低或去活性而基因體被改變的細胞。
- 如申請專利範圍第8項之轉形體,其中宿主細胞為與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素,或岩藻糖的1位α結合於N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上的糖鏈修飾有關的酵素之基因體上的等位基因(allele)全被剔除的細胞。
- 如申請專利範圍第10或11項之轉形體,其中與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有關的酵素為選自GDP-甘露 糖4,6-脫水酶(GMD)或GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶(Fx)之酵素。
- 如申請專利範圍第12項之轉形體,其中GDP-甘露糖4,6-脫水酶為選自以下(a)及(b)組成之群的DNA編碼的蛋白質:(a)序列識別號18所示核苷酸序列構成的DNA;(b)於嚴格條件下與序列識別號18所示核苷酸序列構成的DNA雜交且編碼具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質之DNA。
- 如申請專利範圍第12項之轉形體,其中GDP-甘露糖4,6-脫水酶為選自以下(a)~(c)組成之群的蛋白質:(a)序列識別號19所示胺基酸序列構成的蛋白質;(b)序列識別號19所示胺基酸序列中,1個至數個胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成且具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質;(c)與序列識別號19所示胺基酸序列具有95%以上相同性的胺基酸序列構成且具有GDP-甘露糖4,6-脫水酶活性的蛋白質。
- 如申請專利範圍第12項之轉形體,其中GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶為選自以下(a)及(b)組成之群之DNA編碼的蛋白質:(a)序列識別號20所示核苷酸序列構成的DNA;(b)於嚴格條件下與序列識別號20所示核苷酸序列 構成的DNA雜交且編碼具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性的蛋白質的DNA。
- 如申請專利範圍第13項之轉形體,其中GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶為選自以下(a)~(c)組成之群的蛋白質:(a)序列識別號21所示胺基酸序列構成之蛋白質;(b)序列識別號21所示胺基酸序列中,1個至數個胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所構成,且具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性的蛋白質;(c)與序列識別號21所示胺基酸序列具有95%以上相同性的胺基酸序列所構成,且具有GDP-4-酮基-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶活性的蛋白質。
- 如申請專利範圍第10或11項之轉形體,其中與岩藻糖的1位α結合於N-糖苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺的6位上的糖鏈修飾有關的酵素為α1,6-岩藻糖基轉移酶。
- 如申請專利範圍第17項之轉形體,其中α1,6-岩藻糖基轉移酶為選自以下(a)~(d)組成之群的DNA編碼的蛋白質:(a)序列識別號22所示核苷酸序列構成的DNA:(b)序列識別號23所示核苷酸序列構成的DNA;(c)於嚴格條件下與序列識別號22所示核苷酸序列 構成的DNA雜交,且編碼具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA;(d)於嚴格條件下與序列識別號23所示核苷酸序列構成的DNA雜交,且編碼具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
- 如申請專利範圍第17項之轉形體,其中α1,6-岩藻糖基轉移酶為選自以下(a)~(f)組成之群的蛋白質:(a)序列識別號24所示胺基酸序列構成的蛋白質;(b)序列識別號25所示胺基酸序列構成的蛋白質;(c)序列識別號24所示胺基酸序列中,1個至數個之胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質;(d)序列識別號25所示胺基酸序列中,1個至數個之胺基酸被刪除、置換、插入及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質;(e)與序列識別號24所示胺基酸序列具有95%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質;(f)與序列識別號25所示胺基酸序列具有95%以上相同性的胺基酸序列所組成,且具有α1,6-岩藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
- 如申請專利範圍第6至11項中任一項之轉形體,宿主細胞為選自下列(a)~(i)組成之群的細胞: (a)中國倉鼠卵巢組織由來CHO細胞;(b)大鼠骨髓瘤細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;(c)小鼠骨髓瘤細胞株NS0細胞;(d)小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0-Ag14細胞;(e)黃金鼠腎臓組織由來BHK細胞;(f)生產抗體的融合瘤細胞:(g)人類白血病細胞株Namalwa細胞;(h)胚胎幹細胞;(i)受精卵細胞。
- 一種基因重組抗體組成物之製造方法,其特徵為將如申請專利範圍第6至20項中任一項之轉形體於培養基中培養,於培養物中生成蓄積抗體組成物,收取該抗體組成物,並純化。
- 一種藥物,其含有如申請專利範圍第1至3項中任一項之基因重組抗體組成物為有效成分。
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