ES2534000T3

ES2534000T3 - Composición de anticuerpo genéticamente modificada

Info

Publication number: ES2534000T3
Application number: ES06781453.3T
Authority: ES
Inventors: Akito Natsume; Rinpei Niwa; Kenya Shitara
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2015-04-16
Anticipated expiration: 2026-07-21
Also published as: CA2616256A1; JP4997108B2; EP1921090A4; TW200745164A; CA2616256C; TWI397536B; JPWO2007011041A1; KR101318611B1; AU2006270718B2; EP1921090A1; WO2007011041A1; KR20080039907A; AU2006270718A1; CN101287765B; EP1921090B1; CN101287765A

Abstract

Composición de anticuerpo IgG1 humano recombinante que tiene una mayor actividad citotóxica dependiente del complemento que un anticuerpo IgG1 humano y un anticuerpo IgG3 humano y que tiene actividad de unión a la proteína A, que es sustancialmente igual a la de un anticuerpo IgG1 humano, en la que un polipéptido que comprende un dominio CH2 en la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano es sustituido por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la misma posición de un anticuerpo IgG3 humano indicada por el índice EU como en Kabat et al., en lo sucesivo denominado índice EU.

Description

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7.: un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 422 de un anticuerpo IgG1 indicadas por el índice EU;

8.: un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos en las posiciones 231 a 434 y en las posiciones 436 a 447 de un anticuerpo IgG1 indicadas por el índice EU.

La actividad de unión a proteína A se puede medir mediante ELISA, resonancia de plasmones superficiales, o similar. Específicamente, la composición de anticuerpo se deja reaccionar con la proteína A inmovilizada en fase sólida sobre una placa y después se deja reaccionar adicionalmente con un anticuerpo que reconoce los anticuerpos diversamente marcados, y la actividad de unión se puede medir determinando la composición de anticuerpo unida a proteína A.

También, la composición de anticuerpo se deja reaccionar con proteína A unida a un soporte, tal como sefarosa, en condiciones de pH elevado tal como un pH de alrededor de 5 a 8, seguido de lavado, y después la actividad de unión se puede medir determinando la composición de anticuerpo eluida en condiciones de pH bajo tal como un pH de alrededor de 2 a 5.

La región Fc en la molécula de anticuerpo comprende regiones a las que se unen cadenas de azúcar enlazadas mediante enlaces N-glucosídicos. En consecuencia, dos cadenas de azúcar están unidas por una molécula de anticuerpo.

La cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos incluye una cadena de azúcar de tipo complejo en la que el lado terminal no reductor de la estructura central comprende una o una pluralidad de cadenas laterales paralelas de galactosa-N-acetilglucosamina (en lo sucesivo denominada “Gal-GlcNAc”), y el lado terminal no reductor de Gal-GlcNAc comprende además una estructura de ácido siálico, que biseca a la N-acetilglucosamina o similar.

En la presente invención, la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico se representa mediante la siguiente fórmula:

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Entre las composiciones de anticuerpo recombinantes de la presente invención, la composición de anticuerpo recombinante que comprende una molécula de anticuerpo en la región Fc de la cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos puede comprender una molécula de anticuerpo que tiene la misma estructura de cadena de azúcar, o una molécula de anticuerpo que tiene diferentes estructuras de cadena de azúcar, en tanto que tenga la estructura de azúcar anterior. Esto es, la composición de anticuerpo recombinante de la presente invención significa una composición que comprende una molécula de anticuerpo recombinante que tiene la misma estructura o estructuras de cadena de azúcar, o diferentes.

Además, entre los anticuerpos recombinantes de la presente invención, la composición que comprende una molécula de anticuerpo que tiene cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico en la región Fc, en la que la relación de cadenas de azúcar en las que fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el terminal reductor de las cadenas de azúcar entre las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace Nglucosídico totales que se unen a la región Fc contenidas en la composición es 20% o más, tiene actividad ADCC elevada además de actividad CDC.

En la presente invención, la cadena de azúcar en la que fucosa no está unida puede tener cualquier estructura de cadena de azúcar en el terminal no reductor, en tanto que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el terminal reductor en la fórmula anterior.

En la presente invención, el caso en el que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el terminal reductor en la cadena de azúcar significa que la fucosa no está sustancialmente unida. Una composición de anticuerpo en la que la fucosa no está sustancialmente unida se refiere específicamente a una composición de anticuerpo en la que la fucosa no se detecta sustancialmente, es decir, el contenido de fucosa está por debajo del límite de detección, cuando se somete al análisis de la cadena de azúcar descrito en el siguiente apartado 4. Una composición de anticuerpo recombinante en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en los terminales reductores de todas las cadenas de azúcar tiene la actividad ADCC más elevada.

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Cuando se conoce la secuencia de aminoácidos, el ADN se puede obtener diseñando una secuencia de ADN que codifica la región variable teniendo en cuenta la frecuencia de uso de codones [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], sintetizando varios AND sintéticos que constituyen aproximadamente 100 nucleótidos en base a la secuencia de ADN diseñada, y llevando a cabo la PCR usando los ADN sintéticos. Cuando se conoce la secuencia nucleotídica, el ADN se puede obtener sintetizando varios ADN sintéticos que constituyen aproximadamente 100 nucleótidos en base a la información de secuencia nucleotídica, y llevando a cabo la PCR usando los ADN sintéticos.

(3): Análisis de la secuencia de aminoácidos de la región V de un anticuerpo de un animal no humano

Comparando la longitud completa de secuencia de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo que incluye secuencias señal secretoras con las secuencias de aminoácidos de VH y VL de un anticuerpo conocido [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], es posible deducir la longitud de las secuencias señal secretoras y las secuencias de aminoácidos N-terminales, y saber además el subgrupo al que pertenece el anticuerpo. Además, las secuencias de aminoácidos de CDRs de VH y VL se pueden deducir de manera similar.

(4): Construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano

Un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano se puede construir insertando los ADNc que codifican VH y VL de un anticuerpo de un animal no humano en sitios aguas arriba de la dirección 5’ de los genes que codifican CH y CL de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de la composición de anticuerpo recombinante descrita en el anterior 1 (1). Por ejemplo, un vector de expresión de anticuerpo humano quimérico se puede construir ligando los ADNc que codifican VH y VL de un anticuerpo de un animal no humano respectivamente a ADN sintéticos que comprenden las secuencias nucleotídicas 3’ terminales de VH y VL de un anticuerpo de animal no humano y las secuencias nucleotídicas 5’ terminales de CH y CL de un anticuerpo humano y que tienen también secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas en ambos extremos, e insertándolos en sitios aguas arriba de la dirección 5’ de los genes que codifican CH y CL de un anticuerpo humano en el vector para la composición de anticuerpo recombinante descrita en el anterior 1 (1) a fin de expresarlos en una forma apropiada.

(5): Construcción de ADNc que codifica la región V de un anticuerpo humanizado

Los ADNc que codifican VH y VL de un anticuerpo humanizado se pueden construir de la siguiente manera. En primer lugar, se seleccionan secuencias de aminoácidos de FRs de VH y VL de un anticuerpo humano para injertar CDRs de VH y VL de un anticuerpo derivado de animal no humano. Las secuencias de aminoácidos de FRs de VH y VL de un anticuerpo humano pueden ser cualquiera de aquellas de anticuerpos humanos. Las secuencias adecuadas incluyen las secuencias de aminoácidos de FRs de VHs y VLs de anticuerpos humanos registrados en bases de datos tales como Protein Data Bank, y las secuencia de aminoácidos comunes a los subgrupos de FRs de VHs y VLs de anticuerpos humanos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. A fin de preparar un anticuerpo humanizado que tenga una actividad suficiente, se prefiere seleccionar secuencias de aminoácidos que tengan una homología tan alta como sea posible (al menos 60% o más) con las secuencias de aminoácidos de FRs de VH y VL del anticuerpo deseado derivado de animal no humano.

A continuación, las secuencias de aminoácidos de CDRs de VH y VL del anticuerpo deseado derivado de animal no humano se injertan en las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre FRs de VH y VL de un anticuerpo humano para diseñar secuencias de aminoácidos de VH y VL de un anticuerpo humanizado. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN teniendo en cuenta la frecuencia de uso de codones en las secuencias nucleotídicas de genes del anticuerpo [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], y se diseñan las secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo humanizado. Se sintetizan varios ADN sintéticos que constituyen aproximadamente 100 nucleótidos en base a las secuencias de ADN diseñadas, y se lleva a cabo la PCR usando los ADN sintéticos. Se prefiere diseñar 4 a 6 ADN sintéticos para cada una de la cadena H y la cadena L, en vista de la eficiencia de reacción de la PCR y las longitudes de los ADN que se pueden sintetizar.

La clonación en el vector para la expresión de la composición de anticuerpo recombinante de la presente invención construido en el anterior 1 (1) se puede llevar a cabo fácilmente introduciendo secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas a los terminales 5’ de los ADN sintéticos presentes en ambos extremos. Tras la PCR, los productos de la amplificación se clonan en un plásmido tal como pBluescript SK(-) (fabricado por STRATAGENE), y las secuencias nucleotídicas se determinan mediante el método descrito en el anterior 1 (2) para obtener un plásmido que porta secuencias de ADN que codifican las secuencia de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo humanizado deseado.

(6) Modificación de la secuencia de aminoácidos de la región V de un anticuerpo humanizado

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Los métodos para preparar ADNc que codifica la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una

5 cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico incluyen los métodos para preparar un ADNc descrito en el anterior 2 (1) (a), y similares.

La célula hospedadora usada para la producción de la célula productora del anticuerpo con actividad CDC elevada y con actividad ADCC elevada de la presente invención también se puede obtener, sin usar un vector de expresión,

10 introduciendo directamente en una célula hospedadora el gen de ARNi diseñado en base a la secuencia nucleotídica que codifica la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico.

15 El gen de ARNi se puede preparar mediante métodos conocidos o usando un sintetizador de ADN.

El constructo del gen de ARNi se puede diseñar según las descripciones en Nature, 391, 806 (1998); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95, 15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96, 5049 (1999); Cell, 95,

20 1017 (1998); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96, 1451 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol., 2, 70 (2000); y similares.

(e) Preparación de la célula hospedadora para la producción de la célula productora del anticuerpo con actividad ADCC elevada mediante el método que usa un transposón

25 La célula hospedadora usada para la producción de la célula productora del anticuerpo con actividad ADCC elevada se puede preparar usando el sistema transposónico descrito en Nature Genet., 25, 35 (2000), y similar, y seleccionando entonces un mutante usando, como índice, la actividad de la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar

30 en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico, o la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida o una glicoproteína en la membrana celular.

El sistema transposónico es un sistema para inducir una mutación mediante inserción al azar de un gen exógeno en

35 el cromosoma, en el que habitualmente se usa como vector para inducir una mutación un gen exógeno insertado en un transposón y al mismo tiempo se introduce en la célula un vector de expresión de transposasa para insertar aleatoriamente el gen en el cromosoma.

Se puede usar cualquier transposasa en tanto que sea adecuada para la secuencia del transposón a usar.

40 Como el gen exógeno, se puede usar cualquier gen en tanto que pueda inducir una mutación en el ADN de una célula hospedadora.

Como la célula hospedadora, se puede usar cualquier levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal, o

45 similar, en tanto que tenga un gen que codifique la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico. Los ejemplos de las células hospedadoras incluyen los descritos en el anterior 1. La introducción del gen en diversas células hospedadoras se puede llevar a

50 cabo mediante los métodos adecuados para introducir un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el anterior 1. La célula hospedadora no es una célula madre embrionaria humana.

Los métodos para seleccionar el mutante usando, como índice, la actividad de la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena de

55 azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico incluyen los métodos descritos en el anterior 2 (1) (a).

Los métodos para seleccionar el mutante usando, como índice, la estructura de la cadena de azúcar de una

60 glicoproteína en la membrana celular incluyen el método descrito en 2 (5). Los métodos para seleccionar el mutante usando, como índice, la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida incluyen los métodos descritos en 4 ó 5 más abajo.

(2) Técnica para introducir un mutante dominante negativo de un gen que codifica una enzima 65

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está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico incluyen los métodos descritos en el anterior 1 (1) (a). Los métodos para determinar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida incluyen los métodos descritos en 4 ó 5 más abajo. Los métodos para determinar la estructura de la cadena de azúcar de una glicoproteína en la membrana celular incluyen el método descrito en el anterior 2 (5).

(4) Técnica para suprimir la transcripción o traducción de un gen que codifica una enzima

La célula hospedadora usada para la producción de la célula productora del anticuerpo con actividad ADCC elevada se puede preparar suprimiendo la transcripción o traducción de un gen diana, es decir, un gen diana que codifica una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico usando técnica de ARN/ADN antisentido [Bioscience and Industry, 50, 322 (1992); Chemistry, 46, 681 (1991); Biotechnology, 9, 358 (1992); Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992); Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992); Cell Technology, 16, 1463 (1997)], la técnica de la triple hélice [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)], y similares.

Los ejemplos de las enzimas relacionadas con la síntesis del nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, incluyen GMD, Fx, y similares. Los ejemplos de las enzimas relacionadas con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico incluyen α1,6fucosiltransferasa, α-L-fucosidasa, y similares.

Los métodos para medir la actividad de la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico incluyen los métodos descritos en el anterior 2 (1) (a).

Los métodos para determinar la estructura de la cadena de azúcar de una glicoproteína en la membrana celular incluyen el método descrito en el anterior 2 (5). Los métodos para determinar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida incluyen los métodos descritos en 4 ó 5 más abajo.

(5) Técnica para seleccionar una línea celular resistente a una lectina que reconoce una estructura en la cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos

La célula hospedadora usada para la producción de la célula productora del anticuerpo con actividad ADCC elevada se puede preparar seleccionando una línea celular resistente a una lectina que reconoce a una estructura de la cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos.

La selección de una línea celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el método que usa una lectina descrito en Somatic Cell Mol. Genet., 12, 51 (1986), y similar.

Como la lectina, se puede usar cualquier lectina en tanto que reconozca una estructura de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos. Los ejemplos específicos incluyen lectina de lenteja LCA (aglutinina de lenteja derivada de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante derivada de Pisum sativum), lectina de haba ancha VFA (aglutinina derivada de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina derivada de Aleuria aurantia).

Específicamente, la línea celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través del enlace α en una cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos se puede seleccionar cultivando células en un medio que contiene la lectina anterior a una concentración de 1 µg/ml a 1 mg/ml durante un día a 2 semanas, preferiblemente un día a una semana, subcultivando las células que sobreviven o recogiendo una colonia y transfiriéndola a una vasija de cultivo, y continuando subsiguientemente el cultivo usando el medio que contiene la lectina.

3. Evaluación de la actividad de la composición de anticuerpo

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separarla de un reactivo en exceso de tratamiento de PA mediante filtración en gel, la cadena de azúcar se somete a cromatografía de fase inversa. Después, cada pico de la cadena de azúcar fraccionada se somete a cromatografía de fase normal. La estructura de la cadena de azúcar se puede deducir representando gráficamente los resultados obtenidos en un mapa de la cadena de azúcar bidimensional y comparándolos con las manchas de un patrón de cadenas de azúcar (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) o aquellas en la bibliografía [Anal. Biochem., 171, 73 (1988)].

La estructura deducida por el cartografiado de la cadena de azúcar bidimensional se puede confirmar llevando a cabo la espectrometría de masas, por ejemplo MALDI-TOF-MS, de cada cadena de azúcar.

5. Método para determinar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo

Una composición de anticuerpo comprende una molécula de anticuerpo que tiene diferentes estructuras de cadena de azúcar que se unen a la región Fc del anticuerpo. Entre las composiciones de anticuerpo de la presente invención, la composición de anticuerpo, en la que la relación de cadenas de azúcar en la que fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el terminal reductor a las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico totales unidas a la región Fc es 20% o más, muestra actividad ADCC elevada. Tal composición de anticuerpo se puede determinar usando el método para analizar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo descrito en el anterior 4. Además, también se puede determinar mediante inmunoinsayos usando lectinas.

La determinación de la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo mediante inmunoensayos usando lectinas se puede hacer según los inmunoensayos tales como tinción Western, RIA (radioinmunoensayo), VIA (viroinmunoensayo), EIA (enzimoinmunoensayo), FIA (fluoroinmunoensayo) y MIA (metaloinmunoensayo) descritos en la bibliografía [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. (1995); Enzyme Immunoassay, 3ª Ed., Igaku Shoin (1987); Enzyme Antibody Technique, Edición Revisada, Gakusai Kikaku (1985); y similares], por ejemplo de la siguiente manera.

Se marca una lectina que reconoce la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo que constituye una composición de anticuerpo, y la lectina marcada se somete a reacción con una composición de anticuerpo de muestra, seguido de la medida de la cantidad de un complejo de la lectina marcada con la molécula de anticuerpo.

Los ejemplos de lectinas útiles para determinar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo incluyen WGA (aglutinina de germen de trigo (derivada de T. vulgaris), ConA (concanavalina A derivada de C. ensiformis), RIC (toxina derivada de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina derivada de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lenteja derivada de L. culinaris), PSA (lectina de guisante derivada de P. sativum), AAL (lectina de Aleuria aurantia), ACL (lectina de Amaranthus caudatus), BPL (lectina de Bauhinia purpurea), DSL (lectina de Datura stramonium), DBA (aglutinina de Dolichos biflorus), EBL (lectina de corteza de saúco negro), ECL (lectina de Erythrina cristagalli), EEL (lectina de Euonymus europaeus), GNL (lectina de Galanthus nivalis), GSL (lectina de Griffonia simplicifolia), HPA (aglutinina de Helix pomatia), HHL (lectina de híbridos Hippeastrum), Jacalina, LTL (lectina de Lotus tetragonolobus), LEL (lectina de Lycopersicon esculentum), MAL (lectina de Maackia amurensis), MPL (lectina de Maclura pomifera), NPL (lectina de Narcissus pseudonarcissus), PNA (aglutinina de cacahuete), E-PHA (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), PTL (lectina de Psophocarpus tetragonolobus), RCA (aglutinina de Ricinus communis), STL (lectina de Solanum tuberosum), SJA (aglutinina de Sophora japonica), SBA (aglutinina de haba de soja), UEA (aglutinina de Ulex europaeus), VVL (lectina de Vicia villosa) y WFA (aglutinina de Wisteria floribunda).

Se prefiere usar lectinas que reconocen específicamente una estructura de la cadena de azúcar en la que la fucosa está unida a la N-acetilglucosamina en el terminal reductor en cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico. Los ejemplos de tales lectinas incluyen lectina de lenteja LCA (aglutinina de lenteja derivada de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante derivada de Pisum sativum), lectina de haba ancha VFA (aglutinina derivada de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina derivada de Aleuria aurantia).

6. Utilización de la composición de anticuerpo recombinante de la presente invención

Puesto que la composición de anticuerpo recombinante de la presente invención tiene actividad CDC mayor que un anticuerpo IgG1 y un anticuerpo IgG3, tiene propiedad en efectos terapéuticos más excelente que las composiciones de anticuerpo convencionales. También, entre las composiciones de anticuerpo de la presente invención, puesto que la composición de anticuerpo recombinante que comprende una molécula de anticuerpo que tiene cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico en la región Fc, en la que la relación de cadenas de azúcar en la que fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el terminal reductor de las cadenas de azúcar entre las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico totales que se unen a la región Fc contenidas en la composición es 20% o más tiene mayor actividad CDC y mayor actividad ADCC que un anticuerpo IgG1 y un anticuerpo IgG3, tiene una propiedad más excelente en efectos terapéuticos que las composiciones de anticuerpo convencionales. Además, entre las composiciones de anticuerpo recombinantes de la presente invención,

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anticuerpo con dominios intercambiados anti-CD20 de tipo 113G, pKTX93/113G se preparó de la misma manera como en (1) de este apartado.

2. Expresión estable de diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 en los que todo el dominio

5 CH2 y una parte del dominio CH3 se sustituyeron por las secuencias de aminoácidos procedentes de un anticuerpo IgG3 humano, en célula de animal

Una célula capaz de producir de forma estable cada uno de los diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 en los que todo el dominio CH2 y una parte del dominio CH3 se sustituyeron por las secuencias de

10 aminoácidos procedentes de un anticuerpo IgG3 humano se preparó de la misma manera como en el apartado 3 del Ejemplo 1, introduciendo cada uno de los vectores de expresión de anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 en los que todo el dominio CH2 y una parte del dominio CH3 se sustituyeron por las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo IgG3 humano, preparados en el apartado 1 de este Ejemplo, en la célula hospedadora CHO/FUT8-/-descrita en el apartado 3 del Ejemplo 1.

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3. Purificación de diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 en los que todo el dominio CH2 y una parte del dominio CH3 se sustituyeron por la secuencia de aminoácidos procedente de un anticuerpo IgG3 humano:

20 Cada uno de los transformantes obtenidos en el apartado 2 de este Ejemplo capaz de expresar diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 en los que todo el dominio CH2 y una parte del dominio CH3 se sustituyeron por las secuencias de aminoácidos procedentes de un anticuerpo IgG3 humano se cultivó y se purificó de la misma manera como en el apartado 5 del Ejemplo 1. En la purificación se usó una columna Prosep-G. El vector de expresión correspondiente, la célula hospedadora, el nombre del anticuerpo purificado y la secuencia de

25 aminoácidos de la región constante de cadena pesada de cada uno de los anticuerpos modificados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7

Célula

Vector de expresión Anticuerpo purificado (nombre) Secuencia de aminoácidos

hospedadora

PKTX93/113A Ms705 113A(-F) SEC ID Nº:33 PKTX93/113B Ms705 113B(-F) SEC ID Nº:37 PKTX93/113C Ms705 113C(-F) ISEC ID Nº:40 PKTX93/113D Ms705 113D(-F) ISEC ID Nº:44 PKTX93/113E Ms705 113E(-F) ISEC ID Nº:47 PKTX93/113F Ms705 113F(-F) ISEC ID Nº:50 PKTX93/113G Ms705 113G(-F) ISEC ID Nº:55 PKTX93/113H Ms705 113H(-F) ISEC ID Nº:52

30

4. Evaluación mediante SDS-PAGE del grado de purificación de diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20

A fin de evaluar el grado de purificación de las muestras purificadas de diversos anticuerpos con dominios

35 intercambiados anti-CD20 obtenidos en el apartado 3 de este Ejemplo, se llevó a cabo una SDS-PAGE de la misma manera como en el apartado 6 del Ejemplo 1. Como controles comparativos de la electroforesis, también se llevó a cabo la misma operación sobre las muestras purificadas CD20-IgG1(-F) y 1133(-F) preparadas en el apartado 5 del Ejemplo 1.

40 Los resultados se muestran en la figura 23. Cada una de las muestras purificadas de los anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 obtenidos en el apartado 3 de este Ejemplo mostró patrones de electroforesis similares de los CD20-IgG1(-F) y 1133(-F). Los pesos moleculares deducidos a partir de las secuencia de aminoácidos de la cadena H y de la cadena L que constituyen cada uno de los diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 fueron similares entre sí, a saber, la cadena H tuvo alrededor de 50 kilodaltons (en lo sucesivo denominado

45 kDa), y la cadena L tuvo alrededor de 24 kDa. Puesto que estos pesos moleculares son similares a los pesos moleculares de la cadena H y de la cadena L de CD20-IgG1(-F) y 1133(-F) y sus patrones de electroforesis son también similares a ellos, se confirmó que cada uno de los diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 está constituido por la cadena H y la cadena L deseadas.

50 En base a los resultados anteriores, se confirmó que las moléculas de IgG deseadas constituidas respectivamente por la cadena H y la cadena L están contenidas en una relación suficiente en las muestras purificadas de diversos anticuerpos con dominios intercambiados anti-CD20 obtenidos en el apartado 3 de este Ejemplo.

Ejemplo 7

55

61

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5

15

25

35

45

55

El plásmido del vector de expresión para anticuerpo anti-Campath de tipo 1133, pKTX93/Campath1H-1133 preparado en este apartado, se digirió con enzimas de restricción EcoRI (fabricada por Takara Shuzo) y ApaI (fabricada por Takara Shuzo), y entonces la disolución de la reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y se escindió y se purificó un fragmento de ADN de alrededor de 3.300 pb usando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN). Por otro lado, se escindió y purificó un fragmento de ADN de alrededor de 10 kpb llevando a cabo el mismo tratamiento con enzimas de restricción sobre el plásmido de vector de expresión para anticuerpo anti-CD20 de tipo 1131, pKTX93/1131 preparado en el apartado 1 del Ejemplo 3. Tras mezclar estos fragmentos de ADN purificados, se llevó a cabo una reacción de ligación añadiendo disolución Ligation High (fabricada por TOYOBO), y se transformó Escherichia coli XL1-BLUE MRF’ (fabricado por Stratagene) usando la disolución de la reacción. Cada ADN plasmídico se preparó a partir de los clones transformantes así obtenidos y se dejó reaccionar usando Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (fabricado por Applied Biosystems) según las instrucciones adjuntas en él, y entonces se analizó la secuencia nucleotídica del ADN insertado en cada plásmido mediante un secuenciador de ADN ABI PRISM 3700 DNA Analyzer de la misma compañía, para confirmar que se obtuvo el plásmido del vector de expresión para anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131, pKTX93/Campath1H-1131.

2. Expresión estable de anticuerpo IgG1 humano anti-Campath, de anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1133, y de anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131, en célula de animal

Cada uno de los vectores de expresión para el anticuerpo IgG1 humano anti-Campath, el anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1133 y el anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131 preparados en el apartado 1 de este Ejemplo se introdujo en la célula hospedadora CHO/FUT8-/-descrita en el apartado 3 del Ejemplo 1, y se preparó una célula capaz de producir de forma estable el anticuerpo IgG1 humano anti-Campath, el anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1133 o el anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131, de la misma manera como en el apartado 3 del Ejemplo 1.

e. Purificación de anticuerpo IgG1 humano anti-Campath, de anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1133 y de anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131

Cada uno de los transformantes capaces de expresar el anticuerpo IgG1 humano anti-Campath, el anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1133 o el anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131, obtenidos en el apartado 2 de este Ejemplo, se cultivó y purificó de la misma manera como en el apartado 5 del Ejemplo 1. En la Tabla 9 se muestran los vectores de expresión correspondientes, las células hospedadoras y los nombres de los anticuerpos purificados de cada uno de los anticuerpos modificados.

Tabla 9

Vector de expresión: Célula hospedadora Anticuerpo purificado (nombre)

pKTX93/Campath1H-IgG1: Ms705 Campath1H-IgG1

pKTX93/Campath1H-1133: Ms705 Campath1H-1133

pKTX93/Campath1H-1131: Ms705 Campath1H-1131

4. Evaluación mediante SDS-PAGE del grado de purificación de diversos anticuerpos anti-Campath

A fin de evaluar el grado de purificación de las muestras purificadas de los diversos anticuerpos modificados obtenidos en el apartado 3 de este Ejemplo, se llevó a cabo la SDS-PAGE de la misma manera como en el apartado 6 del Ejemplo 1 para confirmar de ese modo que la molécula IgG deseada constituida por la cadena H y la cadena L respectivas estaba contenida en una relación suficiente en cada una de las muestras de los anticuerpos modificados purificadas obtenidas en el apartado 3 de este Ejemplo.

Ejemplo 10

Medida de la actividad CDC de anticuerpo IgG1 humano anti-Campath, de anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1133 y de anticuerpo con dominios intercambiados anti-Campath de tipo 1131

Usando las muestras purificadas de los diversos anticuerpos anti-Campath Campath1H-IgG1, Campath1H-1133 y Campath1H-1131 obtenidos en el apartado 3 del Ejemplo 9, se midió su actividad CDC in vitro frente a las estirpes celulares de CLL positivas para el antígeno Campath MEC-1, MEC-2 y EHEB. Cuando el ensayo se llevó a cabo de la misma manera como en el Ejemplo 8, Campath1H-1133 y Campath1H-1131 mostraron mayor actividad CDC que la de Campath1H-IgG para todas las estirpes celulares MEC-1, MEC-2 y EHEB.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona una composición de anticuerpo recombinante que tiene actividad citotóxica dependiente del complemento mayor que un anticuerpo IgG1 humano y un anticuerpo IgG3 humano, en la que un

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Claims

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