ES2639222T3

ES2639222T3 - Células que producen unas composiciones de anticuerpo

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Publication number: ES2639222T3
Application number: ES10180018.3T
Authority: ES
Inventors: Yutaka Kanda; Mitsuo Satoh; Kazuyasu Nakamura; Kazuhisa Uchida; Toyohide Shinkawa; Naoko Yamane; Emi Hosaka; Kazuya Yamano; Motoo Yamasaki; Nobuo Hanai
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2021-10-05
Also published as: AU2001294198C1; CN102311986B; JP2015131807A; JP5301525B2; EP2314686B1; EP1331266A1; HUP0402066A2; EP2314686A1; JP2012085655A; JP4290423B2; HUS2000035I1; KR100877676B1; ES2639222T5; CN102311986A; EP3263702A1; JP2012087131A; JP6270930B2; EP3690043A1; JP5384677B2; EA200600469A1

Abstract

Utilización de una estirpe celular resistente a la lectina para la producción de una composición de anticuerpo, comprendiendo la composición unas moléculas de anticuerpo que presentan unas cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas unidas a la región Fc, en la que de entre las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas totales unidas a la región Fc en la composición, la proporción para una cadena de azúcar en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar es 20% o superior, en la que la estirpe celular resistente a la lectina puede obtenerse por selección utilizando un medio que comprende la lectina a una concentración de 1 mg/ml a 1 mg/ml, y en la que los anticuerpos son expresados utilizando la estirpe celular de CHO resistente a la lectina, en la que la lectina es una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en la cadena de azúcar unida a N-glucósido.

Description

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(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 72 y que presenta actividad de Fx.

(10): La célula CHO según (5), en la que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51,

(b): un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP.

(11): La célula CHO según (5), en la que GFPP es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73,

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y que presenta actividad de GFPP,

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y presenta actividad de GFPP.

(12): La célula CHO según (4), en la que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una α-1,6-fucosiltransferasa.

(13): La célula CHO según (12), en la que la α-1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1,

(b): un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa.

(14): La célula CHO según (12), en la que la α-1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23,

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa.

(15): La célula CHO según cualquiera de entre (4) y (14), en la que la actividad enzimática se reduce o se anula mediante una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d) y (e), a continuación:

(a): una técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante del enzima,

(b): una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima,

(c): una técnica para introducir una mutación en el enzima,

(d): una técnica para inhibir la transcripción o la traducción de un gen codificante del enzima,

(e): una técnica para seleccionar una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N

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(60): Un ADN genómico seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:

(a): un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 3,

(b): un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 67,

(c): un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 70.

(61): Un vector diana para la recombinación homóloga, que comprende una longitud completa del ADN según cualquiera de entre (58) y (60), o una parte del mismo.

La célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo introducida según la presente invención puede ser cualquier célula CHO con la condición de que sea una célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, que produce una composición de anticuerpo que comprende cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc de una molécula de anticuerpo, en la que el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc en la composición, la proporción, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es de 20% o superior.

En la presente invención, la molécula de anticuerpo incluye cualquier molécula con la condición de que comprende la región Fc de un anticuerpo. Entre los ejemplos se incluyen un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión que comprende una región Fc y similares.

El anticuerpo es una proteína que es producida en el cuerpo vivo mediante reacción inmunológica como resultado de la estimulación por antígenos exógenos y que presenta una actividad de unión específica al antígeno. Entre los ejemplos del anticuerpo se incluyen un anticuerpo secretado por una célula de hibridoma preparada a partir de una célula de bazo de un animal inmunizado con un antígeno, un anticuerpo preparado mediante una técnica de recombinación genética, es decir un anticuerpo obtenido mediante la introducción de un vector de expresión de anticuerpo en el que se ha insertado un gen de anticuerpo en una célula hospedadora, y similares. Entre los ejemplos específicos se incluyen un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y similares.

Un hibridoma es una célula que se obtiene mediante fusión celular entre una célula B obtenida mediante la inmunización de un mamífero diferente de un ser humano con un antígeno y una célula de mieloma obtenida del ratón o similar y que puede producir un anticuerpo monoclonal que presenta la especificidad de antígeno deseada.

Entre los ejemplos del anticuerpo humanizado se incluye un anticuerpo híbrido humano, un anticuerpo injertado con RDC humano y similares.

Un anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (en adelante denominado "VH", siendo la cadena pesada "cadena H") y una región variable de cadena ligera de anticuerpo (en adelante denominada "VL", siendo la cadena ligera "cadena L"), ambas de un animal diferente del ser humano, una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano (en adelante también denominada "CH") y una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano (en adelante también denominado "CL"). Como animal diferente del ser humano, puede utilizarse cualquier animal, tal como el ratón, la rata, el hámster, el conejo o similar, con la condición de que pueda prepararse un hibridoma a partir del mismo.

El anticuerpo híbrido humano puede producirse mediante la obtención del ADNc codificante de VH y VL a partir de un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales, insertándolos en un vector de expresión para una célula hospedadora que presenta genes codificantes de CH de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano, para construir de esta manera un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano y después introducir el vector en una célula hospedadora para expresar el anticuerpo.

Como CH del anticuerpo híbrido humano, puede utilizarse cualquier CH, con la condición de que pertenezca a una inmunoglobulina humana (en adelante denominada "lg_h"). Aunque las pertenecientes a la clase lgG_h resultan preferentes, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase IgG_h, tales como IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h e IgG4_h. Además, como CL del anticuerpo híbrido humano, puede utilizarse cualquier CL, con la condición de que pertenezca a la clase Ig_h, y también pueden utilizarse cualquiera perteneciente a la clase κ o λ.

Un anticuerpo injertado con RDC humana es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de las RDC de VH y VL de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano se injertan en posiciones apropiadas de VH y VL de un anticuerpo humano.

El anticuerpo con injertación de RDC humano puede producirse mediante la construcción de los ADNc codificantes de regiones V en las que las RDC de VH y VL de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del

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terminales de una secuencia de nucleótidos que se considera que codifica la secuencia de aminoácidos, basándose en la secuencia de aminoácidos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido y el ADN se amplificó mediante PCR [PCR Protocols, Academic Press, 1990] utilizando la biblioteca de ADNc preparada como molde para obtener un fragmento génico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Puede confirmarse que el fragmento génico obtenido es un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, mediante un método utilizado habitualmente para analizar un nucleótido, tal como el método dideoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], un analizador de secuencias de nucleótidos ABIPRISM 377 DNA Sequencer (fabricado por PE Biosystems) o similar.

Se preparó un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDPfucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede obtenerse llevando a cabo la hibridación de colonias o la hibridación de placas (Molecular Cloning, segunda edición) para el ADNc o la biblioteca de ADNc sintetizada a partir del ARNm contenido en el tejido o célula humano o animal no humano, utilizando el fragmento génico a modo de sonda de ADN.

Además, un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDPfucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, también puede obtenerse realizando un cribado mediante PCR utilizando el ADNc o biblioteca de ADNc sintetizado a partir de ARNm contenido en un tejido o célula humano o animal no humano como molde y utilizando los cebadores utilizados para obtener el fragmento génico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

La secuencia de nucleótidos del ADN obtenido codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se analizó desde su extremo y se determinó mediante un método utilizado habitualmente para analizar un nucleótido, tal como el método dideoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], un analizador de secuencias de nucleótidos ABIPRISM 377 DNA Sequencer (fabricado por PE Biosystems) o similar.

Un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido también puede determinarse a partir de genes en bases de datos mediante la búsqueda en bases de datos de secuencias de nucleótidos tales como GenBank, EMBL, DDBJ y similares utilizando un programa de recuperación de homologías tal como BLAST basado en la secuencia de nucleótidos determinada del ADNc.

Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del gen obtenido mediante el método, codificantes del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 48, nº 51 o nº 65. Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del gen codificante del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la secuencia de nucleótidos representada porlaSECID nº1o nº2.

El ADNc codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido también puede obtenerse mediante síntesis química de

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puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite que el gen de ARNi pueda transferirse. Entre los ejemplos se incluyen vectores de expresión que se describirán a continuación, en el ítem 3.

Con método para introducir un gen en diversas células hospedadoras, pueden utilizarse métodos para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.

Entre los ejemplos del método de selección de un transformante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a).

Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 5 o 6.

Entre los ejemplos del método de preparación de ADNc codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a) y similares.

Además, la célula hospedadora de la presente invención también puede obtenerse sin utilizar un vector de expresión, mediante la introducción directa de un gen de ARNi diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa,

o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

El gen de ARNi puede prepararse mediante el método habitual o utilizando un sintetizador de ADN.

El constructo de gen de ARNi puede diseñarse de acuerdo con los métodos descritos en Nature 391:806, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502, 1998; Nature 395:854, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5049, 1999; Cell 95:1017, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1451, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959, 1998; Nature Cell Biol. 2:70, 2000, y similares.

(e) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante un método que utiliza un trasposón

La célula hospedadora de la presente invención puede obtenerse mediante la inducción de una mutación utilizando un sistema de trasposón descrito en Nature Genet. 25:35, 2000, o similar, seleccionando seguidamente un mutante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína de una molécula de anticuerpo producida o sobre la membrana celular.

El sistema de trasposones es un sistema en el que se induce una mutación mediante la inserción aleatoria de un gen exógeno en el cromosoma, en el que un gen exógeno interpuesto entre trasposones se utiliza generalmente como vector para inducir una mutación, y se introduce simultáneamente en la célula un vector de expresión de trasposasa para la inserción aleatoria del gen en el cromosoma.

Puede utilizarse cualquier trasposasa, con la condición de que resulte adecuada para la secuencia del trasposón que debe utilizarse.

Como gen exógeno, puede utilizarse cualquier gen, con la condición de que pueda inducir una mutación en el ADN de una célula hospedadora.

Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima diana relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima diana relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante

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similar al del ítem 1 a un callo o célula de la planta de interés.

Una planta transgénica en la que se encuentra reducida la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede prepararse mediante el cultivo del callo preparado utilizando un medio que comprende auxina y citoquinina para rediferenciarlo de acuerdo con un método conocido [Tissue Culture 20, 1994; Tissue Culture 21, 1995; Trends in Biotechnology 15:45, 1997].

3. Procedimiento para producir una composición de anticuerpo

La composición de anticuerpo puede obtenerse expresándola en una célula hospedadora utilizando los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (en adelante denominado "Antibodies"); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Acad. Press, 1993 (en adelante también denominada "Monoclonal Antibodies"), y Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (en adelante también denominada "Antibody Engineering"), por ejemplo, tal como se indica a continuación.

Se preparó un ADNc de longitud completa codificante de una molécula de anticuerpo y se preparó una longitud apropiada de un fragmento de ADN que comprendía una fracción codificante de la molécula de anticuerpo.

Se preparó un vector recombinante mediante la inserción del fragmento de ADN o el ADN de longitud completa cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.

Puede obtenerse un transformante que produce la molécula de anticuerpo mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.

Como célula hospedadora, puede utilizarse cualquiera de entre una célula de levadura, una célula animal, una célula vegetal o similar, con la condición de que pueda expresar el gen de interés.

Como célula hospedadora también puede utilizarse una célula tal como una célula de levadura, una célula animal, una célula de insecto, una célula vegetal o similar en la que se ha introducido mediante una técnica de ingeniería genética un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar unida mediante Nglucósido que se une a la región Fc de la molécula de anticuerpo.

Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite que el ADN codificante de la molécula de anticuerpo pueda transferirse.

El ADNc puede prepararse a partir de un tejido o célula humano o no humano utilizando, por ejemplo, un cebador sonda específico para la molécula de anticuerpo de interés, de acuerdo con los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a).

En el caso de que se utilice una levadura como célula hospedadora, entre los ejemplos de vector de expresión se incluyen YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) y similares.

Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en las levaduras. Entre los ejemplos se incluyen un promotor de un gen de la ruta glucolítica, tal como un gen de hexosa quinasa, etc., el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, el promotor gal 1, el promotor gal 10, el promotor de la proteína de choque térmico, el promotor MF α1, el promotor CUP 1 y similares.

Entre los ejemplos de célula hospedadora se incluyen los microorganismos pertenecientes al género Saccharomyces, al género Schizosaccharomyces, al género Kluyveromyces, al género Trichosporon, al género Schwanniomyces y similares, tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans and Schwanniomyces alluvius, etc.

Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en levaduras. Entre los ejemplos se incluyen la electroporación [Methods in Enzymology 194:182, 1990], el método de esferoplastos [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1929, 1978], el método de acetato de litio [J. Bacteriol. 153:163, 1983], un método descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978, y similares.

En el caso de que se utilice una célula animal como huésped, entre los ejemplos del vector de expresión se incluyen pcDNAI, pcDM8 (disponible de Funakoshi), pAGE107 [solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 22979/91; Cytotechnology 3:133, 1990], pAS3-3 (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 227075/90), pCDM8 [Nature 329:840, 1987], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pREP4

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1307 (1987)], promotor RTL de la leucemia de Moloney de ratón [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:960, 1987], el promotor [Cell 41:479, 1985] e intensificador [Cell, 33, 717 (1983)] de cadena H de inmunoglobulina y similares.

El vector de expresión de anticuerpos humanizados puede ser de un tipo en el que los genes codificantes de las cadenas H y L de un anticuerpo se encuentran en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes se encuentran presentes en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpos humanizados, facilidad de introducción en células animales y equilibrio entre las cantidades expresadas de las cadenas H y L de un anticuerpo en células animales, resulta más preferente un tipo tándem del vector de expresión de anticuerpos humanizados [J. Immunol. Methods 167:271, 1994].

El vector de expresión construido de anticuerpos humanizados puede utilizarse para la expresión de un anticuerpo híbrido humano y un anticuerpo injertado con RDC humano en células animales.

(2) Preparación de ADNc codificante de la región V de anticuerpos obtenidos de animales diferentes del ser humano

Los ADNc codificantes de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano, tal como un anticuerpo de ratón, pueden obtenerse de la manera siguiente.

Se sintetizó un ADNc mediante la extracción del ARNm de una célula de hibridoma que produce el anticuerpo de ratón de interés. El ADNc sintetizado se clonó en un vector, tal como un fago o un plásmido, con el fin de obtener una biblioteca de ADNc. Se aisló cada uno de un fago recombinante o un plásmido recombinante que comprende un ADNc codificante de la región V de cadena H y un fago recombinante o plásmido recombinante que comprende un ADNc codificante de la región V de la cadena L a partir de la biblioteca utilizando una parte de región C o una parte de región V de un anticuerpo de ratón presente como sonda. Se determinan las secuencia de nucleótidos completas de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o el plásmido recombinante y las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de cadenas H y L se deducen de las secuencias de nucleótidos.

Como animal diferente del ser humano, puede utilizarse cualquier animal, tal como el ratón, la rata, el hámster, el conejo o similar, con la condición de que pueda prepararse una célula de hibridoma a partir del mismo.

Entre los ejemplos de método para preparar ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluyen el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymology 154:3, 1987] y similares, y como ejemplo del método de preparación de ARNm a partir del ARN total, el método de columna de celulosa con oligo(dT) inmovilizado (Molecular Cloning, segunda edición), y similares. Además, entre los ejemplos de un kit para preparar ARN a partir de una célula de hibridoma se incluyen el kit de aislamiento de ARN Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARN Quick Prep (fabricado por Pharmacia) y similares.

Entre los ejemplos del método para sintetizar ADNc y la preparación de una biblioteca de ADNc se incluyen los métodos habituales (Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 134) y métodos utilizando un kit disponible comercialmente, tal como SuperScriptTM, el sistema de plásmidos para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por Gibco Brl)) o el kit de síntesis de ADNc-ZAP (fabricado por Stratagene) y similares.

Durante la preparación de la biblioteca de ADNc, el vector en el que se inserta un ADN sintetizado utilizando el ARNm extraído de una célula de hibridoma como molde puede ser cualquier vector con la condición de que pueda insertarse el ADNc. Entre los ejemplos se incluyen ZAP Express [Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], λzapII (fabricado por Stratagene), λgt10 y λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach I:49, 1985], Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), λExCell, pT7T3 18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983], pUC18 [Gene 33:103, 1985] y similares.

Como Escherichia coli en la que se introduce la biblioteca de ADNc construida a partir de un vector fago o plásmido, puede utilizarse cualquier Escherichia coli, con la condición de que pueda introducirse, expresarse y mantenerse la biblioteca de ADNc. Entre los ejemplos se incluyen XL1-Blue MRF' [Strategies 5:81, 1992], C600 [Genetics 39, 440, 1954], Y1088 y Y1090 [Science 222:778, 1983], NM522 [J. Mol. Biol. 166, 1, 1983], K802 [J. Mol. Biol. 16, 118, 1966], JM105 [Gene, 38, 275, 1985] y similares.

Como método para seleccionar un clon de ADN codificante de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano a partir de la biblioteca de ADNc, puede utilizarse una hibridación de colonias o una hibridación de placas utilizando una sonda marcada con isótopos o con fluorescencia (Molecular Cloning, segunda edición). El ADNc codificante de las regiones V de las cadenas H y L también puede prepararse mediante la preparación de cebadores y llevando a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (en adelante denominada "PCR"; Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34) utilizando un ADNc sintetizado a partir de ARNm o de una biblioteca de ADN a modo

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culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia).

7. Aplicación de una molécula de anticuerpo de la presente divulgación

La composición de anticuerpo de la presente divulgación presenta una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos. Un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos resulta útil para prevenir y tratar diversas enfermedades, incluyendo cánceres, enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunológicas tales como enfermedades autoinmunológicas, alergias y similares, enfermedades de órganos circulatorios e infecciones víricas o bacterianas.

En el caso de los cánceres, concretamente los tumores malignos, las células de cáncer crecen. Los agentes antitumorales generales inhiben el crecimiento de las células de cáncer. En contraste, un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos puede tratar cánceres al dañar las células de cáncer mediante su efecto de eliminación celular y, por lo tanto, resulta más eficaz como agente terapéutico que los agentes antitumorales generales. Actualmente, en el agente terapéutico para cánceres, un efecto antitumoral de un medicamento de anticuerpo por sí solo resulta insuficiente, de manera que se ha llevado a cabo una terapia de combinación con quimioterapia [Science 280:1197, 1998]. En el caso de que se encontrase un efecto antitumoral más potente con la composición de anticuerpo de la presente divulgación por sí sola, se reduciría la dependencia de la quimioterapia y se reducirían los efectos secundarios.

En enfermedades inmunológicas tales como las enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunológicas,

alergias y similares, se inducen reacciones in vivo de las enfermedades debido a la liberación de una molécula mediadora por los inmunocitos, de manera que puede inhibirse la reacción alérgica mediante la eliminación de los inmunocitos utilizando un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.

Entre los ejemplos de enfermedades de órganos circulatorios se incluyen la arterioesclerosis y similares. Actualmente, la arterioesclerosis se trata utilizando catéteres con balón, aunque las enfermedades de órganos circulatorios pueden prevenirse y tratarse mediante la inhibición del crecimiento de las células arteriales en restricción tras el tratamiento con un anticuerpo con potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.

Pueden prevenirse y tratarse diversas enfermedades, incluyendo infecciones víricas y bacterianas, mediante la inhibición de la proliferación de las células infectadas por un virus o bacteria utilizando un anticuerpo con potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.

Posteriormente se describen ejemplos de un anticuerpo que reconozca un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación, un anticuerpo que reconozca antígenos relacionados con enfermedades de los órganos circulatorios y un anticuerpo que reconozca antígenos relacionados con infecciones víricas o bacterianas.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral se incluyen el anticuerpo anti-GD2 (Ohta et al., Anticancer Res. 13:331-336, 1993), el anticuerpo anti-GD3 (Ohta et al., Cancer Immunol. Immunother. 36:260-266, 1993), el anticuerpo anti-GM2 (Nakamura et al., Cancer Res. 54:1511-1516, 1994), el anticuerpo anti-HER2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992), el anticuerpo anti-CD52 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992), el anticuerpo anti-MAGE (Jungbluth et al., British

J. Cancer 83:493-497, 2000), el anticuerpo anti-HM1.24 (Ono et al., Molecular Immunol. 36:387-395, 1999), el anticuerpo anti-proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) antibody (Ogata et al., Cancer 88:2909-2911, 2000), el anticuerpo anti-factor básico de crecimiento fibroblástico y el anticuerpo anti-FGF8 (Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9911-9915, 1989), el anticuerpo anti-receptor del factor básico de crecimiento fibroblástico y el anticuerpo anti-receptor de FGF8 (Kuo et al., J. Biol. Chem. 265:16455-16463, 1990), el anticuerpo anti-factor de crecimiento similar a la insulina (Yao et al., J. Neurosci. Res. 40:647-659, 1995), el anticuerpo anti-PMSA (Murphy et al., J. Urology, 160, 2396-2401, 1998), el anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular (Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599, 1997), el anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (Kanno et al., Oncogene 19:2138-2146, 2000) y similares.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación se incluyen el anticuerpo anti-interleuquina 6 (Abrams et al., Immunol. Rev. 127:5-24, 1992), el anticuerpo anti-receptor de interleuquina 6 (Sato et al., Molecular Immunol. 31:371-381, 1994), el anticuerpo anti-interleuquina 5 (Abrams et al., Immunol. Rev. 127:5-24, 1992), el anticuerpo anti-receptor de interleuquina 5 y el anticuerpo antiinterleuquina 4 (Biord et al., Cytokine 3:562-567, 1991), el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral (Tempest et al., Hybridoma 13:183-190, 1994), el anticuerpo anti-receptor del factor de necrosis tumoral (Amrani et al., Molecular Pharmacol. 58:237-245, 2000), el anticuerpo anti-CCR4 (Campbell et al., Nature 400:776-780, 1999),

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