CN105814078A - Nsp4抑制剂及其使用方法 - Google Patents

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S-Y·J·林
D·K·奇士霍夫
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明提供NSP4抑制剂(如抗NSP4抗体)及使用NSP4抑制剂的方法。

Description

NSP4抑制剂及其使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年10月11日提交的美国临时申请系列号61/890,147、2013年10月18日提交的美国临时申请系列号61/893,059和2014年9月19日提交的美国临时申请系列号62/053,052的优先权；这些美国临时申请系列号中的每一个在此以其整体引入作为参考。
ASCII文本文件序列表的提交
以下ASCII文本文件提交的内容在此以其整体引入作为参考：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：146392022740SEQLIST.txt，记录日期：2014年10月8日，大小：63KB)。
技术领域
本发明涉及NSP4抑制剂及使用该NSP4抑制剂的方法。
背景技术
嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶是对保护免受侵入病原体很重要的先天免疫系统的一个效应分子家族。此胰蛋白酶折叠蛋白酶家族的成员嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)和蛋白酶3(PR3)不仅在嗜中性粒细胞介导的侵入微生物的清除(Reeves等,Nature,2002,416:291–297；Weinrauch等,Nature,2002,417:91–94；Belaaouaj等,NatMed,1998,4:615–618)和炎症(Pham等,NatRevImmunol,2006,6:541–550)中发挥重要作用，还可以参与多种疾病的发病机理(Magrone等,CurrPharmDes.,2012,18(12):1609-19和Pham等,IntJBiochemCellBiol.,2008,40(6-7):1317-1333)。最近，将最初通过酵母信号捕获筛选和人cDNA文库的计算机挖掘(Clark等,GenomeRes.,2003,13:2265–2270)发现的丝氨酸蛋白酶PRSS57鉴定为第四个NSP成员，随后称为嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4(NSP4)(Perera等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:6229–6234；Perera等,JImmunol.,2013)。值得注意的是，NSP4从硬骨鱼类到人类高度保守且先于其他NSP出现，表明NSP4可能在嗜中性粒细胞生物学中发挥基础作用(Perera等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:6229–6234；Perera等,ExpertRevClinImmunol,2012,8:501-503)。
根据其活性部位结构的详细了解，NE、CG和PR3相对宽的底物特异性很好理解(Navia等,ProcNatlAcadSciUSA,1989,86:7–11；Hof等,EMBOJ,1996,15:5481–5491；Fujinaga等,JMolBiol,1996,261:267–278)。但是，NSP4产生了一个谜团，因为与胰蛋白酶一样，它在精氨酸残基之后切割底物(Perera等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:6229–6234；Perera等,JImmunol.,2013)，但却矛盾地具有下述一级序列，且似乎与长的P1-精氨酸侧链不相容，该一级序列预测非常不同的弹性蛋白酶样活性部位(小的脂族氨基酸优先)。由于NSP4的长进化谱系及其不同的活性部位，NSP4可能是对中性粒细胞功能重要的蛋白酶，且可以促成中性粒细胞介导的疾病或障碍。但是，相对于中性粒细胞丝氨酸蛋白酶家族的其他成员，NSP4在中性粒细胞介导的疾病(如关节炎)中的作用未知。例如，需要NE和CG的组合缺陷来在小鼠胶原抗体诱发关节炎模型中赋予全面保护(Adkison等,JClinInvest,2002,109:363–371)。NE和CG还各自能够处理和激活IL-33等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:1673–1678)，IL-33是促进炎性关节炎的促炎症细胞因子(Xu等,ProcNatlAcadSciUSA,2008,105:10913–10918)。类似地，需要NE和PR3的组合消除来防止颗粒蛋白前体(progranulin)的失活(Kessenbrock等,JClinInvest,2008,118:2438–2447)，颗粒蛋白前体是减轻炎性关节炎的抗炎症细胞因子(Tang等,Science,2011,332:478–484)。
解决NSP4所显示的预测的弹性蛋白酶样活性部位与实际的胰蛋白酶样活性部位之间的悖论具有提供可便于发展特异性NSP抑制剂的酶活性部位结构特征的潜能。这些NSP4抑制剂可以满足治疗其中潜在病理学完全或部分由NSP4活性引起的嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的需要。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开、科学文献和美国国家生物技术信息中心(NCBI)检索号，在此以其整体引入作为参考，就如同明确和单独地说明引入每一单个参考文献作为参考一样。
发明概述
本发明广泛提供嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4(NSP4)抑制剂及使用该NSP4抑制剂的方法。
在一方面，本文提供用于在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的方法，其包括对该个体施用有效量的NSP4抑制剂。在一些实施方案中，该疾病或障碍是嗜酸性粒细胞介导的疾病或障碍、嗜碱性粒细胞介导的疾病或障碍、或嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍。在本文所述方法的一些实施方案中，可以通过NSP4抑制剂治疗的疾病或障碍是血管病、炎性疾病或自身免疫病。在本文所述方法的一些实施方案中，该疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacularedema)、遗传性血管性水肿(angioedema)、特发性血管性水肿、脉管渗漏(leakageofvasculature)、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、哮喘(例如变应性哮喘、病毒诱发性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病(例如大疱性类天疱疮)、炎性皮肤病(例如特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎)、癌症(例如肺癌)、肾病(例如肾小球性肾炎)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、败血症性休克、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克隆病)。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体患有该疾病或障碍，或已诊断患有该疾病或障碍。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体处于发展该疾病或障碍的风险中。在一些实施方案中，该个体是人。
在一方面，本文提供用于在个体中治疗或预防嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的方法，其包括对该个体施用有效量的NSP4抑制剂。在一些实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。在另一实施方案中，该血管病选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏和脑缺血。在另一实施方案中，该炎性疾病选自急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎和败血症性休克。在本文的任意实施方案中，该个体可以是人。
在另一方面，本文提供可以用于本文所述的任意方法的NSP4抑制剂。在一些实施方案中，该NSP4抑制剂选自抗体、反义分子、siRNA、小分子抑制剂、蛋白酶抑制剂和肽抑制剂。在另一实施方案中，该蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，该蛋白酶抑制剂是α1-抗胰蛋白酶、肝素活化抗凝血酶、C1抑制剂或α2-抗纤溶酶。
在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以是特异性结合NSP4的抗NSP4抗体。在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以是特异性结合成熟形式的NSP4的抗NSP4抗体。在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以是特异性结合成熟形式的NSP4但不结合前体形式的NSP4的抗NSP4抗体。在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以是特异性结合人NSP4的抗NSP4抗体。在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以是特异性结合小鼠NSP4的抗NSP4抗体。在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以是特异性结合人NSP4和小鼠NSP4二者的抗NSP4抗体。在本文的任意实施方案中，该抗NSP4抗体可以是单克隆抗体。在本文的任意实施方案中，该抗NSP4抗体可以是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的抗体片段。在本文的任意实施方案中，该抗NSP4抗体可以是人源化抗体或嵌合抗体。在本文的任意实施方案中，该抗NSP4抗体可以包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(i)含有氨基酸序列SEQIDNO:10的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQIDNO:11的HVR-L2；(iii)含有氨基酸序列SEQIDNO:12的HVR-L3；(iv)含有氨基酸序列SEQIDNO:1、4或7的HVR-H1；(v)含有氨基酸序列SEQIDNO:2、5或8的HVR-H2；(vi)含有氨基酸序列SEQIDNO:3、6或9的HVR-H3。在本文的任意实施方案中，该抗NSP4抗体可以包含含有氨基酸序列SEQIDNO:16的轻链可变区，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:13、14或15的重链可变区。
在本文的一些实施方案中，该NSP4抑制剂可以静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹腔内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在本文的任意实施方案中，该NSP4抑制剂可以配制在包含该NSP4抑制剂和可药用载体的药物组合物中。
还在另一方面，本文提供包含NSP4抑制剂和包装说明书的制品，该包装说明书包含用该NSP4抑制剂来在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的说明。在一些实施方案中，该疾病或障碍是嗜酸性粒细胞介导的疾病或障碍、嗜碱性粒细胞介导的疾病或障碍、或嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍。在一些实施方案中，可以通过NSP4抑制剂治疗的疾病或障碍是血管病、炎性疾病或自身免疫病。在一些实施方案中，该疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、哮喘(例如变应性哮喘、病毒诱发性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病(例如大疱性类天疱疮)、炎性皮肤病(例如特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎)、癌症(例如肺癌)、肾病(例如肾小球性肾炎)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、败血症性休克、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克隆病)。在一些实施方案中，该个体患有该疾病或障碍，或已诊断患有该疾病或障碍。在一些实施方案中，该个体处于发展该疾病或障碍的风险中。在一些实施方案中，该个体是人。
还在另一方面，本文提供包含NSP4抑制剂和包装说明书的制品，该包装说明书包含用该NSP4抑制剂来在个体中治疗或预防嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的说明。在一些实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。在另一实施方案中，该血管病选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏和脑缺血。在另一实施方案中，该炎性疾病选自急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎和败血症性休克。在本文的任意实施方案中，该个体可以是是人。
在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1；(b)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(c)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)的HVR-L3，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。还在另一方面，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)的HVR-L3，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。在某些实施方案中，该HVR-L3包含选自SEQIDNO:12和92-94的序列。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1；(b)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(c)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含含有抗体35.WT的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)的可变结构域。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.WT的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1；(b)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(c)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYGFPLT(SEQIDNO:92)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYGFPLT(SEQIDNO:92)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:102的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.14的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.14的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1；(b)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(c)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYDFPLT(SEQIDNO:93)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYDFPLT(SEQIDNO:93)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:103的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.50的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.50的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1；(b)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(c)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSAGFPLT(SEQIDNO:94)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSAGFPLT(SEQIDNO:94)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:104的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.62的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.62的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
还在另一方面，本文提供抗NSP4抗体，其包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)的HVR-L3，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYGFPLT(SEQIDNO:92)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYDFPLT(SEQIDNO:93)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSAGFPLT(SEQIDNO:94)的HVR-L3。
在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:105的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:106的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.77的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体35.77的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
还在另一方面，本文提供抗NSP4抗体，其包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)的HVR-H3；和(c)含有序列QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)的HVR-L3。
在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2；(c)含有序列X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)的HVR-H3，其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)的HVR-L3，其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含：含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1，含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2，及含有序列X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)的HVR-H3，其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F；和/或(b)该轻链包含：含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1，含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2，及含有序列QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)的HVR-L3，其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S。在某些实施方案中，该HVR-H3包含选自SEQIDNO:67、89和90的序列。在某些实施方案中，该HVR-L3包含选自SEQIDNO:12和97-100的序列。在某些实施方案中，该HVR-H3包含选自SEQIDNO:67、89和90的序列，且该HVR-L3包含选自SEQIDNO:12和97-100的序列。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.WT的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.WT的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2；(c)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2和含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:107的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:108的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.30的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.30的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQANSTPPT(SEQIDNO:98)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQANSTPPT(SEQIDNO:98)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:109的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.50的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.50的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:110的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:108的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.51的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.51的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列RVFFHNVAFDY(SEQIDNO:90)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQNFSSPPT(SEQIDNO:99)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列RVFFHNVAFDY(SEQIDNO:90)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQNFSSPPT(SEQIDNO:99)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:111的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:112的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.59的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.59的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:108的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.72的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.72的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
在某些实施方案中，该抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQTYNAPPT(SEQIDNO:100)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQTYNAPPT(SEQIDNO:100)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:110的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:113的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.82的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表5-7中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体51.82的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表7中所示)。
还在另一方面，本文提供抗NSP4抗体，其包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2；(b)含有序列X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)的HVR-H3，其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F；和(c)含有序列QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)的HVR-L3，其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2；(b)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和(c)含有序列QQANSTPPT(SEQIDNO:98)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列RVFFHNVAFDY(SEQIDNO:90)的HVR-H3；和(c)含有序列QQNFSSPPT(SEQIDNO:99)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)的HVR-H3；和(c)含有序列QQTYNAPPT(SEQIDNO:100)的HVR-L3。
在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGSWIS(SEQIDNO:20)的HVR-H1；(b)含有序列GTISPYNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:21)的HVR-H2；(c)含有序列RVLRPKVYASVMDY(SEQIDNO:22)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GTISPYNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:21)的HVR-H2；(b)含有序列RVLRPKVYASVMDY(SEQIDNO:22)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSWIS(SEQIDNO:20)的HVR-H1、含有序列GTISPYNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:21)的HVR-H2和含有序列RVLRPKVYASVMDY(SEQIDNO:22)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:68的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-1的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-1的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGYSIH(SEQIDNO:23)的HVR-H1；(b)含有序列AGISPTNGYTDYADSVKG(SEQIDNO:24)的HVR-H2；(c)含有序列RLVFYRGVMDY(SEQIDNO:25)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AGISPTNGYTDYADSVKG(SEQIDNO:24)的HVR-H2；(b)含有序列RLVFYRGVMDY(SEQIDNO:25)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGYSIH(SEQIDNO:23)的HVR-H1、含有序列AGISPTNGYTDYADSVKG(SEQIDNO:24)的HVR-H2和含有序列RLVFYRGVMDY(SEQIDNO:25)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:69的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-2的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-2的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSDNWIS(SEQIDNO:26)的HVR-H1；(b)含有序列GYIYPASGYTDYADSVKG(SEQIDNO:27)的HVR-H2；(c)含有序列SDSPHAYWYAMDY(SEQIDNO:28)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GYIYPASGYTDYADSVKG(SEQIDNO:27)的HVR-H2；(b)含有序列SDSPHAYWYAMDY(SEQIDNO:28)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNWIS(SEQIDNO:26)的HVR-H1、含有序列GYIYPASGYTDYADSVKG(SEQIDNO:27)的HVR-H2和含有序列SDSPHAYWYAMDY(SEQIDNO:28)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:70的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTNNSIS(SEQIDNO:29)的HVR-H1；(b)含有序列GAISPNNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:30)的HVR-H2；(c)含有序列RNAWHYSWVGVMDY(SEQIDNO:31)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GAISPNNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:30)的HVR-H2；(b)含有序列RNAWHYSWVGVMDY(SEQIDNO:31)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTNNSIS(SEQIDNO:29)的HVR-H1、含有序列GAISPNNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:30)的HVR-H2和含有序列RNAWHYSWVGVMDY(SEQIDNO:31)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:71的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体1-5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTDYSIH(SEQIDNO:32)的HVR-H1；(b)含有序列AEIYPYSGDTYYADSVKG(SEQIDNO:33)的HVR-H2；(c)含有序列RDGDGWFDWAMDY(SEQIDNO:34)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AEIYPYSGDTYYADSVKG(SEQIDNO:33)的HVR-H2；(b)含有序列RDGDGWFDWAMDY(SEQIDNO:34)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTDYSIH(SEQIDNO:32)的HVR-H1、含有序列AEIYPYSGDTYYADSVKG(SEQIDNO:33)的HVR-H2和含有序列RDGDGWFDWAMDY(SEQIDNO:34)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:72的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-1的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-1的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSSTAIS(SEQIDNO:35)的HVR-H1；(b)含有序列GEIYPSDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:36)的HVR-H2；(c)含有序列RVKWAVSSLGVMDY(SEQIDNO:37)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GEIYPSDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:36)的HVR-H2；(b)含有序列RVKWAVSSLGVMDY(SEQIDNO:37)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSSTAIS(SEQIDNO:35)的HVR-H1、含有序列GEIYPSDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:36)的HVR-H2和含有序列RVKWAVSSLGVMDY(SEQIDNO:37)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:73的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-2的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-2的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTDSDIS(SEQIDNO:38)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPSDGATDYADSVKG(SEQIDNO:39)的HVR-H2；(c)含有序列HEASDDDYAIDY(SEQIDNO:40)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPSDGATDYADSVKG(SEQIDNO:39)的HVR-H2；(b)含有序列HEASDDDYAIDY(SEQIDNO:40)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTDSDIS(SEQIDNO:38)的HVR-H1、含有序列AWISPSDGATDYADSVKG(SEQIDNO:39)的HVR-H2和含有序列HEASDDDYAIDY(SEQIDNO:40)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:74的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSDYWIS(SEQIDNO:41)的HVR-H1；(b)含有序列AGISPNNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:42)的HVR-H2；(c)含有序列REDDDERDYAMDY(SEQIDNO:43)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AGISPNNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:42)的HVR-H2；(b)含有序列REDDDERDYAMDY(SEQIDNO:43)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDYWIS(SEQIDNO:41)的HVR-H1、含有序列AGISPNNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:42)的HVR-H2和含有序列REDDDERDYAMDY(SEQIDNO:43)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:75的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-4的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-4的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTGYGIS(SEQIDNO:44)的HVR-H1；(b)含有序列GWIYPASGATYYADSVKG(SEQIDNO:45)的HVR-H2；(c)含有序列RHRAFDWYPYYIGSSVMDY(SEQIDNO:46)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GWIYPASGATYYADSVKG(SEQIDNO:45)的HVR-H2；(b)含有序列RHRAFDWYPYYIGSSVMDY(SEQIDNO:46)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTGYGIS(SEQIDNO:44)的HVR-H1、含有序列GWIYPASGATYYADSVKG(SEQIDNO:45)的HVR-H2和含有序列RHRAFDWYPYYIGSSVMDY(SEQIDNO:46)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:76的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体2-5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSDYSIS(SEQIDNO:47)的HVR-H1；(b)含有序列GEINPAGGATYYADSVKG(SEQIDNO:48)的HVR-H2；(c)含有序列RGDFPFWSDAYYVMDY(SEQIDNO:49)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GEINPAGGATYYADSVKG(SEQIDNO:48)的HVR-H2；(b)含有序列RGDFPFWSDAYYVMDY(SEQIDNO:49)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDYSIS(SEQIDNO:47)的HVR-H1、含有序列GEINPAGGATYYADSVKG(SEQIDNO:48)的HVR-H2和含有序列RGDFPFWSDAYYVMDY(SEQIDNO:49)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:77的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体3-2的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体3-2的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1；(b)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(c)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。该抗体包含抗体3-5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体3-5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGSDIS(SEQIDNO:53)的HVR-H1；(b)含有序列GEIYPSNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:54)的HVR-H2；(c)含有序列RSVRPSWWAMDY(SEQIDNO:55)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GEIYPSNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:54)的HVR-H2；(b)含有序列RSVRPSWWAMDY(SEQIDNO:55)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSDIS(SEQIDNO:53)的HVR-H1、含有序列GEIYPSNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:54)的HVR-H2和含有序列RSVRPSWWAMDY(SEQIDNO:55)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:79的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-2的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-2的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSSYDIS(SEQIDNO:56)的HVR-H1；(b)含有序列GTISPYDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:57)的HVR-H2；(c)含有序列RYIRRYSVHYGMDY(SEQIDNO:58)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GTISPYDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:57)的HVR-H2；(b)含有序列RYIRRYSVHYGMDY(SEQIDNO:58)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSSYDIS(SEQIDNO:56)的HVR-H1、含有序列GTISPYDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:57)的HVR-H2和含有序列RYIRRYSVHYGMDY(SEQIDNO:58)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:80的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTSTSIH(SEQIDNO:59)的HVR-H1；(b)含有序列AEITPHGGYTNYADSVKG(SEQIDNO:60)的HVR-H2；(c)含有序列RGRTKWGWLYGMDY(SEQIDNO:61)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AEITPHGGYTNYADSVKG(SEQIDNO:60)的HVR-H2；(b)含有序列RGRTKWGWLYGMDY(SEQIDNO:61)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTSTSIH(SEQIDNO:59)的HVR-H1、含有序列AEITPHGGYTNYADSVKG(SEQIDNO:60)的HVR-H2和含有序列RGRTKWGWLYGMDY(SEQIDNO:61)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:81的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-4的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-4的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTNNSIH(SEQIDNO:62)的HVR-H1；(b)含有序列AEIAPDDGYTYYADSVKG(SEQIDNO:63)的HVR-H2；(c)含有序列RGVIRYAYLYAMDY(SEQIDNO:64)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AEIAPDDGYTYYADSVKG(SEQIDNO:63)的HVR-H2；(b)含有序列RGVIRYAYLYAMDY(SEQIDNO:64)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTNNSIH(SEQIDNO:62)的HVR-H1、含有序列AEIAPDDGYTYYADSVKG(SEQIDNO:63)的HVR-H2和含有序列RGVIRYAYLYAMDY(SEQIDNO:64)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:82的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-5的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体4-5的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1；(b)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(c)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-1的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-1的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)的HVR-H1；(b)含有序列GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)的HVR-H2；(c)含有序列RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)的HVR-H2；(b)含有序列RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)的HVR-H1、含有序列GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)的HVR-H2和含有序列RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:84的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-2的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-2的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)的HVR-H1；(b)含有序列AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)的HVR-H2；(c)含有序列RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)的HVR-H2；(b)含有序列RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)的HVR-H1、含有序列AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)的HVR-H2和含有序列RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:85的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-3的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-3的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
还在另一方面，本文提供包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列的抗NSP4抗体：(a)含有序列GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)的HVR-H1；(b)含有序列AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)的HVR-H2；(c)含有序列RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)的HVR-H3；(d)含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1；(e)含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2；和(f)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含：(a)含有序列AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)的HVR-H2；(b)含有序列RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中(a)该重链包含含有序列GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)的HVR-H1、含有序列AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)的HVR-H2和含有序列RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)的HVR-H3；和/或(b)该轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)的HVR-L3。在某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:86的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-4的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列(例如，如表3和4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。在某些实施方案中，该抗体包含抗体5-4的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，如表4及SEQIDNO:19、11和12中所示)。
在可以与任意以上实施方案组合的某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:114的重链恒定区。在可以与任意以上实施方案组合的某些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:115的轻链恒定区。
还在另一方面，本文提供特异性结合NSP4活性部位的抗NSP4抗体。在另一方面，本文提供抑制NSP4催化活性的抗NSP4抗体。在另一方面，本文提供特异性结合NSP4活性部位且抑制NSP4催化活性的抗NSP4抗体。
还在另一方面，本文提供特异性结合NSP4肝素结合部位的抗NSP4抗体。在另一方面，本文提供与肝素竞争结合NSP4的抗NSP4抗体。在另一方面，本文提供特异性结合NSP4肝素结合部位且与肝素竞争结合NSP4的抗NSP4抗体。
在可以与任意以上实施方案组合的某些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的抗体片段。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体特异性结合成熟形式的NSP4。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体特异性结合成熟形式的NSP4但不结合前体形式的NSP4。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体特异性结合人NSP4。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体特异性结合小鼠NSP4。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体特异性结合人NSP4和小鼠NSP4二者。
在另一方面，本文提供分离的编码本文所述任意抗体的核酸。在另一方面，本文提供包含本文所述核酸的载体。在另一方面，本文提供包含本文所述核酸的宿主细胞。在另一方面，本文提供用于产生本文所述抗体的方法，其包括在适于产生该抗体的条件下培养本文所述宿主细胞。在某些实施方案中，用于产生本文所述抗体的方法进一步包括回收由本文所述宿主细胞产生的本文所述抗体。在另一方面，本文提供通过用于产生本文所述抗体的方法产生的抗体。在另一方面，本文提供包含本文所述任意抗体和可药用载体的药物组合物。
还在另一方面，本文提供用于在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述任意抗体。在某些实施方案中，该抗体特异性结合NSP4活性部位和/或抑制NSP4催化活性。在某些实施方案中，该抗体特异性结合NSP4肝素结合部位和/或与肝素竞争结合NSP4。在某些实施方案中，对该个体施用有效量的特异性结合NSP4活性部位和/或抑制NSP4催化活性的抗体，以及特异性结合NSP4肝素结合部位和/或与肝素竞争结合NSP4的抗体。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该疾病或障碍是嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍、嗜酸性粒细胞介导的疾病或障碍、或嗜碱性粒细胞介导的疾病或障碍。在某些实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。在某些实施方案中，该血管病选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏和脑缺血。在某些实施方案中，该炎性疾病选自急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎和败血症性休克。在某些实施方案中，该疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、特发性肺纤维化、哮喘、变应性哮喘、病毒诱发性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、起泡性皮肤病、大疱性类天疱疮、炎性皮肤病、特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎、癌症、肺癌、肾病、肾小球性肾炎、败血症性休克、炎症性肠病、溃疡性结肠炎及克隆病。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该个体是人。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，该抗体静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹腔内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在可以与任意前述实施方案组合的某些实施方案中，将该抗NSP4抗体配制在包含该抗体和可药用载体的药物组合物中。
还在另一方面，本文提供包含本文所述任意抗体的制品。在某些实施方案中，该制品进一步包含含有用该抗体来在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的说明的包装说明书。在一些实施方案中，该疾病或障碍是嗜酸性粒细胞介导的疾病或障碍、嗜碱性粒细胞介导的疾病或障碍、或嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍。在一些实施方案中，可以通过本文所述抗体治疗的疾病或障碍是血管病、炎性疾病或自身免疫病。在一些实施方案中，该疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、哮喘(例如变应性哮喘、病毒诱发性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病(例如大疱性类天疱疮)、炎性皮肤病(例如特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎)、癌症(例如肺癌)、肾病(例如肾小球性肾炎)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、败血症性休克、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克隆病)。在一些实施方案中，该个体患有该疾病或障碍，或已诊断患有该疾病或障碍。在一些实施方案中，该个体处于发展该疾病或障碍的风险中。在一些实施方案中，该个体是人。
应理解，本文所述多种实施方案的一种、一些或全部特性可以组合形成本发明的其他实施方案。本发明的这些及其他方面对本领域技术人员而言显而易见。通过以下发明详述进一步描述本发明的这些及其他实施方案。
附图简述
图1是NSP4直向同源物活性区的序列比对。在顶部用胰凝乳蛋白酶原编号系统编号残基。在底部用线表示二硫键。保守残基用ClustalX方案着色。标记并列出190、192和216位的NSP4主要底物特异性决定簇。与P1精氨酸侧链配位的180-环(190FCS192)和220-环(214SFSGxxC220)区段的长度在NSP4直向同源物中也是保守的，在顶部用黑色条表示。两种或多种NSP4旁系同源物(paralogs)见于袋獾(Tasmaniandevil)、蛙(非洲爪蟾(X.laevis)和热带爪蟾(X.tropicalis))和空棘鱼中；一些旁系同源物在192位具有取代，但所有物种都具有至少一种具有全部必需H键受体的旁系同源物。爬行类和禽类物种具有噬异细胞(heterophils)而不是真正的嗜中性粒细胞，其NSP4直向同源物具有F190V取代。预测禽类NSP4直向同源物由于S192A取代而具有降低的活性，且由于C201F取代而具有长的未配对C136。NSP4直向同源物序列从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和ENSEMBL数据库编译，并用ClustalW(Larkin等,Bioinformatics,2007,23:2947–2948)比对。然后用SeaView(Gouy等,MolBiolEvol,2010,27:221–224)和UniproUGENE(Okonechnikov等,Bioinformatics,2012,28:1166-1167)手工处理和分析初步比对。
图2A-2D显示具有弹性蛋白酶样活性部位的NSP4，该弹性蛋白酶样活性部位具有胰蛋白酶样精氨酸特异性。A)NSP4S1袋的示意图。B)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶S1袋及其与优选的P1残基的相互作用的示意图。胰蛋白酶样蛋白酶具有深S1袋，并在底物P1精氨酸和S1袋底部保守的D189之间形成盐桥相互作用(虚线)。胰凝乳蛋白酶样蛋白酶具有大的疏水袋来容纳大的P1残基。弹性蛋白酶样蛋白酶具有由216和190位残基形成的浅S1袋来容纳小的脂肪族P1残基。C)通过使用具有不同P1残基的荧光肽底物系列来分析NSP4P1底物特异性，用产生自昆虫(杆状病毒表达载体系统；BEVS)或哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢；CHO)的重组野生型(WT)或无活性(S195A)NSP4处理该荧光肽底物系列。P1-Arg肽：WT(BEVS)kcat/KM＝1.1×104±2.1×103M-1s-1，WT(CHO)kcat/KM＝7.5×103±1.1×103M-1s-1。D)NSP4S1袋突变体对荧光肽的切割。活性测量为每秒形成的纳摩尔产物(nM/s)。结果是来自至少三次独立实验的平均值±标准差。
图3A-3B显示NSP4表征为堵塞的S1袋及与P1精氨酸的非典型相互作用。A)NSP4晶体结构的叠加：NSP4-apo形式1、NSP4-apo形式2、NSP4:FFR-cmk和NSP4:VLK-cmk。星号表示催化三联体残基。B)左上，结合于规范胰蛋白酶样蛋白酶因子VIIa(PDB1DAN)的FFR-cmk(棍)。右上，结合于NSP4的FFR-cmk(棍)。左下，规范S1袋的侧视图，叠加结合于胰蛋白酶样蛋白酶(带)的10种不同P1精氨酸配体(棍)。所显示的结构是1DAN、1SHH、1ORF、1AUT、1PFX、2FIR、1LMW、1BUI、2B80、1BDA。右下，结合于NSP4的FFR-cmk(棍)的侧视图。
图4A-4B显示NSP4具有通过离子相互作用结合肝素的碱性斑块。A)从-5至5kT/e绘制的通过Poisson-Boltzmann静电计算轮廓(electrostaticcalculationscontoured)的NSP4表面表示。B)通过不同离子条件下的荧光偏振(左)及通过0.15MNaCl条件下的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(右)测定的NSP4与荧光素缀合肝素的结合。
图5显示NSP4活性部位处的代表性电子密度。NSP4活性部位的按1.5σ绘制的σA加权2mFo-DFc电子密度图。所显示的是220-环残基214SFSGLWC220、180-环残基190FCS192及催化残基H57和S195。堵塞S1袋的S216和F190残基显示为棍。结合的FFR-cmk和VLK-cmk显示为棍。
图6A-6D显示“上”构象中的P1精氨酸通过H键网络得以稳定。A)NSP4中和因子VIIa(PDB1DAN)中P1精氨酸的结构叠加。B)NSP4中P1精氨酸残基(P1-Arg)周围的H键网络。C)NSP4氢键突变体对荧光肽的切割。D)NSP4或因子Xa(FXa)对具有P1精氨酸和P1甲基精氨酸的荧光肽的切割。
图7显示NSP4优选P1精氨酸而不是P1赖氨酸的结构基础。NSP4:FFR-cmk结构中的P1精氨酸通过由H键受体S216和S192侧链及G217主链羰基氧配位的H键网络而得以稳定。相反，NSP4:VLK-cmk结构中的P1赖氨酸未衔接(engage)NSP4上齐全的H键受体。
图8显示通过液相色谱-质谱法(LC-MS)确认修饰的P1精氨酸荧光肽底物的NSP4或Fxa切割。通过使用LC-MS来确认NSP4(50nM)或因子Xa(Fxa，200nM)对P1精氨酸(P1-Arg，左图)或P1甲基精氨酸(P1-Arg(Me)，右图)荧光肽底物的切割。以总离子流测量的峰代表在反相HPLC上分开的全长或水解肽片段。显示肽片段的身份及其推算质量。P1-Arg(Me)耐受(refractory)FXa切割；在用于FXa的P1-Arg(Me)肽中观察到的峰代表发生在1IR2↓3{Arg(Me)}SSYSFKK10处而不是针对NSP4观察到的1IR{Arg(Me)}3↓4SSYSFKK10处的移位P1切割事件。
图9A-9C显示NSP4-/-小鼠的表征。A)之前所述(Tang等,NatBiotechnol,2010,28:749–755)的用于通过同源重组产生NSP4-/-小鼠的靶向策略。B)通过使用三种不同NSP4引物(PRSS57_1、PRSS57_2、PRSS57_3)的来自总骨髓细胞的RT-qPCR确认NSP4-/-小鼠中的NSP4消除(ablation)。还分析了邻近蛋白酶基因嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(Elane)、粒酶M(Gzmm)、蛋白酶3(Prtn3)和补体因子D(Cfd)的表达。所有基因表达水平都通过其相对于哺乳动物18SrRNA的丰度(dCt)来定量。C)活的总骨髓细胞及分选的B细胞(B220+)、髓样细胞(B220-/CD11b+)、单核细胞(B220-/CD11b+/Ly6Chi)和嗜中性粒细胞(B220-/CD11b+/Ly6Ghi)的计数。
图10A-10B显示NSP4为K/BxN血清诱导的脉管渗漏所需。通过尾静脉静脉内注射荧光探针AngioSense680(在-5分钟)，允许平衡5分钟，然后静脉内注射K/BxN关节炎血清(在0分钟)。A)来自野生型和NSP4-/-小鼠的前爪的代表性近红外荧光成像。从第5分钟开始可以在野生型小鼠前爪中观察到脉管渗漏(箭头)。B)野生型小鼠或NSP4-/-小鼠(如所标记)的平均荧光强度的倍数变化的个体定量，n＝每组5只小鼠。
图11A-11C显示NSP4为K/BxN血清诱导的关节炎所需。A)野生型(圆形)和NSP4-/-(方形)小鼠中全身K/BxN血清注射后小鼠爪的临床评分。数据表示为平均值±SEM，n＝每组4只小鼠。B)实验终点时小鼠爪的组织学损伤评分。作为半切片检查了每只小鼠的全部4只爪(n＝每组4只小鼠)，并在0(无损伤)至5(严重损伤)的量表上对炎症、纤维组织形成、软骨损伤和骨重建进行评分。野生型小鼠具有轻度至中度损伤(平均组织学损伤评分为3.4、3.0、2.1、2.2)，而NSP4-/-小鼠基本上受保护(平均组织学损伤评分为0.70、0.80、0.00、0.78)。全部四个组织学损伤评分类别的组间比较都达到统计显著性，p<0.0001。C)用苏木精和伊红染色的野生型(左)和NSP4-/-(右)小鼠前爪的代表性组织切片。上：野生型小鼠具有明显的软组织肿胀，伴随广泛的关节周炎症细胞浸润(箭头)和纤维组织形成。中：包括关节内渗出液(星号)、骨膜骨质溶解(箭头)和炎症细胞浸润(双箭头)的野生型爪损伤。下：野生型小鼠具有密集的关节周炎症细胞浸润。NSP4-/-小鼠未显示组织肿胀(上)，维持正常关节结构(中)，具有最少的细胞浸润(下)。
图12是用于通过噬菌体展示产生构象特异性NSP4抗体的前体形式NSP4(酶原)和成熟形式NSP4(活性)的示意图。hZ表示前体形式的人NSP4；mZ表示前体形式的小鼠NSP4；hA表示成熟形式的人NSP4；mA表示成熟形式的小鼠NSP4。
图13是抗体5-2、5-3和5-4的重链可变区的CDR序列的示意图。图中所示序列在序列表标示如下：噬菌体克隆5-2的CDRH1，SEQIDNO:1；噬菌体克隆5-2的CDRH2，SEQIDNO:2；噬菌体克隆5-2的CDRH3，SEQIDNO:3；噬菌体克隆5-3的CDRH1，SEQIDNO:4；噬菌体克隆5-3的CDRH2，SEQIDNO:5；噬菌体克隆5-3的CDRH3，SEQIDNO:6；噬菌体克隆5-4的CDRH1，SEQIDNO:7；噬菌体克隆5-4的CDRH2，SEQIDNO:8；及噬菌体克隆5-4的CDRH3，SEQIDNO:9。
图14A-14C显示一系列图表，其显示抗体A)5-2、B)5-3和C)5-4在生物层干涉量度法实验中与成熟形式的小鼠NSP4的结合。hZ表示前体形式的人NSP4；mZ表示前体形式的小鼠NSP4；hA表示成熟形式的人NSP4；mA表示成熟形式的小鼠NSP4。
图15是显示抗体5-2、5-3和5-4在荧光底物测定中特异性阻断小鼠NSP4蛋白酶活性的图表。hNSP表示成熟人NSP4。mNSP4表示成熟小鼠NSP4。
图16A-16C显示一系列图表，其显示从四只野生型(WT)和四只NSP4缺陷小鼠(NSP4PRSS57KO)分离的四种不同的分选的骨髓细胞级分的mRNA测量结果。野生型小鼠中的转录物水平表示为圆形，NSP4缺陷小鼠中的转录物水平表示为方形。使用了跨三个不同外显子连接的三个不同NSP4/Prss57引物/探针组：A)跨外显子1-2，B)跨外显子2-3，及C)跨外显子3-4。
图17是为检测NSP4蛋白质在四种不同的小鼠髓系细胞类型(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞)中的存在而实施的一系列Western印迹。上样等量蛋白质裂解物(10ug/泳道)，并用兔抗小鼠NSP4多克隆抗体检测。从三只野生型(WT)和三只NSP4(Prss57)缺陷(KO)小鼠骨髓分离小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞。
图18A-18C显示NSP4为嗜中性粒细胞募集所必需。A)全身K/BxN血清注射后小鼠爪在所示时间点的髓过氧化物酶(MPO)活性的基于鲁米诺的生物发光成像。按所示测试了野生型(WT)或NSP4缺陷(KO)小鼠，并定量为每cm2每分钟的光子计数(cpm)。B)MPO和对照蛋白质β肌动蛋白的Western印迹，使用从野生型(WT)和NSP4缺陷(KO)小鼠分离的总小鼠骨髓来源的嗜中性粒细胞裂解物。每个泳道代表来自每种基因型三只小鼠的合并裂解物。C)K/BxN血清注射后野生型(WT)或NSP4缺陷(NSP4KO)小鼠(n＝3)中小鼠爪的基于鲁米诺(luminol)的生物发光的代表性图表。
图19显示通过噬菌体IC50测定估计NSP4抗体克隆亲和力。噬菌体克隆与可溶性NSP4蛋白质预孵育，然后放入用2ug/mlNSP4包被的孔中，随后用补充0.02％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液洗涤孔。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4。较高亲和力的克隆在较低的可溶性NSP4浓度下结合可溶性NSP4，因此具有左移的曲线。
图20A-20B显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体1-1(A)和1-2(B)(二者都处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图21A-21B显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体1-3(A)和1-5(B)(二者都处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图22A-22D显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体2-1(A)、2-2(B)、2-3(C)和2-4(D)(全都处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图23显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体2-5(处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图24A-24B显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体3-2(A)和3-5(B)(二者都处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图25A-25C显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体4-2(A)、4-3(B)和4-4(C)(全都处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图26A-26D显示通过生物层干涉量度法测定NSP4抗体克隆亲和力。纯化NSP4特异性抗体5-1(A)、5-2(B)、5-3(C)和5-4(D)(全都处于人IgG1型式)与纯化NSP4蛋白质的不同变体结合的生物层干涉量度法测量。hZ，人酶原NSP4；mZ，小鼠酶原NSP4；hA，人活性NSP4；mA，小鼠活性NSP4；全都如所标记。
图27显示通过使用活性NSP4的荧光活性测定筛选针对酶原NSP4淘选的抗体。与缓冲液单独(“无Ab”)或不同的纯化抗NSP4抗体预孵育的纯化人活性NSP4(灰色条)、小鼠活性NSP4(白色条)或缓冲液单独(无酶；黑色条)的荧光肽切割测定。
图28显示通过使用活性NSP4的荧光活性测定筛NSP4阻断抗体。与缓冲液单独(“无Ab”)或不同的纯化NSP4特异性抗体预孵育的纯化人活性NSP4(灰色条)、小鼠活性NSP4(白色条)或缓冲液单独(无酶；黑色条)的荧光肽切割测定。
图29是NSP4抗体表征的总结。提供通过以下(从左至右)测定的纯化NSP4特异性抗体的体外表征的总结：通过生物层干涉量度法测定的与纯化NSP4变体的亲和力，通过生物层干涉量度法测定的特异性分类，及通过荧光酶活性测定测定的阻断抗体筛选。
图30显示用Fab5-1对NSP4抗体进行表位定位。通过生物层干涉量度法测量纯化的NSP4特异性抗体与纯化的小鼠NSP4在Fab5-1存在下的结合，来对小鼠特异性NSP4抗体进行表位定位。
图31显示用肝素对NSP4抗体进行表位定位。通过生物层干涉量度法测量纯化的NSP4特异性抗体与纯化的小鼠NSP4在硫酸肝素存在下的结合，来对小鼠特异性NSP4抗体进行表位定位。
图32显示泛NSP4Ab35抗体克隆的亲和力成熟。通过使用可溶性mNSP4(上)或可溶性hNSP4(下)竞争剂的噬菌体IC50测定测定的基于Ab3-5(“35.WT”)的抗体的亲和力改善。
图33显示构象特异性NSP4Ab51抗体克隆的亲和力成熟。通过使用可溶性mNSP4竞争剂的噬菌体IC50测定测定的基于Ab5-1(“51.WT”)的抗体的亲和力改善。
发明详述
I.定义
除非另有说明，本文所用的术语“嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4”或“NSP4”指来自任意哺乳动物如灵长类(例如人、恒河猴、黑猩猩NSP4)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任意天然NSP4。该术语涵盖“全长”、未加工的NSP4，如前体或酶原形式的NSP4，以及源自蛋白酶剪切的任意形式的NSP4，如成熟或活性形式的NSP4。该术语还涵盖天然存在的NSP4变体，例如剪接变体或等位基因变体。SEQIDNO:17中显示示例性人NSP4的氨基酸序列。SEQIDNO:18中显示另一示例性人NSP4的氨基酸序列。
人NSP4序列
MGLGLFGWGKPLLTVATALMLFVKPPAGSWGAQIIGGHEVTPHSKPYMASVRFGGQHHCGGFLLRARWVVSAAHCFSHRDLRTGLVVLGAHVLSTAEPTQQVFGIDALTTHPDYHPMTHANDICLLRLNGSAVLGPAVGLLRLPGRRARPPTAGTRCRVAGWGFVSDFEELPPGLMEAKVRVLDPDVCNSSWKGHLTLTMLCTRSGDSHRRGFCSADSGGPLVCRNRAHGLVSFSGLWCGDPKTPDVYTQVSAFVAWIWDVVRRSSPQPGPLPGTTRPPGEAA(SEQIDNO：17)
人NSP4序列
MGLGLRGWGRPLLTVATALMLPVKPPAGSWGAQIIGGHEVTPHSRPYMASVRFGGQHHCGGFLLRARWVVSAAHCFSHRDLRTGLVVLGAHVLSTAEPTQQVFGIDALTTHPDYHPMTHANDICLLRLNGSAVLGPAVGLLRPPGRRARPPTAGTRCRVAGWGFVSDFEELPPGLMEAKVRVLDPDVCNSSWKGHLTLTMLCTRSGDSHRRGFCSADSGGPLVCRNRAHGLVSFSGLWCGDPKTPDVYTQVSAFVAWIWDVVRRSSPQPGPLPGTTRPPGEAA(SEQIDNO：18)
本文所用的术语“嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4抑制剂”或“NSP4抑制剂”指在体外、在原位和/或在体内阻断、抑制、降低(包括显著降低)或干扰NSP4(哺乳动物，如人NSP4)生物活性的分子。术语“抑制剂”不暗示任何具体的生物学作用机制，明确包括和涵盖与NSP4的所有可能的药理学、生理学和生物化学相互作用，该相互作用可以是直接或间接的，可以与NSP4、其底物或通过另一机制相互作用，且其结果可以通过多种不同且化学上多样的组合物来达到。示例性NSP4抑制剂包括但不限于特异性结合NSP4或前体形式和成熟形式的NSP4中的一种或两种的抗NSP4抗体、针对编码NSP4的核酸的反义分子、针对编码NSP4的核酸的短干扰RNA(“siRNA”)分子、NSP4抑制化合物、结合NSP4或前体形式和成熟形式的NSP4中的一种或两种的RNA或DNA适配体、及NSP4结构类似物。在一些实施方案中，NSP4抑制剂(例如抗体)结合(与之物理上相互作用)NSP4，结合NSP4底物，和/或抑制(减少)NSP4合成、产生或释放。在其他实施方案中，NSP4抑制剂结合NSP4，并抑制其与其底物的结合。还在其他实施方案中，NSP4抑制剂减少或消除NSP4的表达(例如转录或翻译)或蛋白酶解加工。本文提供NSP4抑制剂的类型的实例。
本文所用的术语“RNA干扰”或“RNAi”泛指这样的过程，其中双链RNA分子或短发夹RNA分子减少或抑制与该双链或短发夹RNA分子具有实质同源性或完全同源性的核酸序列的表达。术语“短干扰RNA”或“siRNA”或“RNAi剂”指引出RNA干扰的RNA序列。参见Kreutzer等,WO00/44895；Zernicka-Goetz等,WO01/36646；Fire,WO99/32619；Mello和Fire,WO01/29058。本文所用的siRNA分子包括含有化学修饰的核苷酸和非核苷酸的RNA分子。术语“ddRNAi剂”指从外源载体转录的DNA指导RNAi剂。术语“短发夹RNA”或“shRNA”指具有双链体区和环区的RNA结构。在某些实施方案中，ddRNAi剂最初表达为shRNA。
本文所用的术语“适配体”指能够紧密地和特异性地结合所希望的分子靶标的异源寡核苷酸，该分子靶标例如常见代谢辅因子(例如辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸等)、蛋白质(例如补体蛋白C5、抗体等)或核酸分子中的保守结构元件(例如对转录因子的结合重要的结构等)。适配体通常包含长度从约10至约100个核苷酸、长度从约10至约75个核苷酸、长度从约10至约50个核苷酸、长度从约10至约35个核苷酸和长度从约10至约25个核苷酸的DNA或RNA核苷酸序列。使用标准固相亚磷酰胺法和设备，如通过使用可从获得AppliedBiosystems(FosterCity,CA)获得的3900HighThroughputDNASynthesizerTM，可以制备合成DNA或RNA寡核苷酸。适配体通常掺入见于DNA和RNA中的常见核苷酸(例如A、G、C和T/U)的衍生物或类似物，包括主链或键修饰(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯(phosphothioate)键)，以提高核酸酶抗性、结合亲和力，或以其他方式改变其药物代谢动力学特性。美国专利号6,455,308、4,469,863、5,536,821、5,541,306、5,637,683、5,637,684、5,700,922、5,717,083、5,719,262、5,739,308、5,773,601、5,886,165、5,929,226、5,977,296、6,140,482中及WIPO公开WO00/56746和WO01/14398中给出了示例性修饰。用于合成含有这类类似物或衍生物的寡核苷酸的方法公开于例如上文引用的专利公开中，及美国专利号6,455,308、5,614,622、5,739,314、5,955,599、5,962,674、6,117,992中和WO00/75372中。
“封闭”抗体是抑制或降低它所结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，封闭抗体实质性或完全抑制抗原的生物活性。在一些实施方案中，该抗原是NSP4。
术语“抗NSP4抗体”和“结合NSP4的抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合NSP4，使得该抗体可以用作靶向NSP4的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测量，抗NSP4抗体与不相关的非NSP4蛋白质结合的程度小于该抗体与NSP4的结合的约10％。在某些实施方案中，结合NSP4的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗NSP4抗体结合在来自不同物种的NSP4间保守的NSP4表位。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望得到的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体以外的包含完整抗体的部分的分子，其结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，相反，参考抗体在竞争测定中将该抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。本文提供示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种。
抗体的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5个主要的抗体种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“效应子功能”指可归因于抗体Fc区且随抗体同种型而变的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞激活。
用于本文目的的“受体人构架”是包含源自下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包括本文中所述的那些。用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这类改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号按照Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号系统，也称为EU指数。
“构架”或“FR”指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表一系列人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，该系列人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列亚组。通常，该序列亚组是如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等,上文中的κI亚组。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是Kabat等,上文中的III亚组。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，而全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。本文所用的HVR区包含定位在24-36(对于L1)、46-56(对于L2)、89-97(对于L3)、26-35B(对于H1)、47-65(对于H2)和93-102(对于H3)位内的任意数目的残基。因此，HVR包含之前所述位置中的残基：
A)24-34(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；
B)L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)；
C)30-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35(H1)、47-58(H2)、93-100a-j(H3)(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996)。
除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩短的CDR或a-CDR的CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有说明，本文按照Kabat等,上文编号可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库，来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
“个体(individual)”或“对象(subject)”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该个体或对象是人。
“分离的”抗体是已从其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的纯度大于95％或99％。用于评估抗体纯度的方法综述参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
“分离的编码抗NSP4抗体的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括单个载体或分开的载体中的这种(类)核酸分子，及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的这种(类)核酸分子。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体方法来产生该抗体。例如，将要按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指天然存在的具有不同结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链组成的，约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体轻链分配至称为κ和λ的两个类型之一。
术语“包装说明书”用来指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或有关这类治疗性产品的用途的警告。
就参考多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为，在比对序列并在必要时引入缺口来达到最大百分比序列同一性，而不将任意保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术之内的多种方式来达到以测定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对，例如，使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列全长内达到最大比对所需的任意算法。但是，为了本文的目的，用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，源代码已随用户文件提交美国版权办公室,WashingtonD.C.,20559，它在美国版权办公室注册在美国版权注册号TXU510087之下。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California公开可得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用在UNIX操作系统上，包括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变动。
在利用ALIGN-2来进行氨基酸序列比较的情况下，按以下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(备选地，其可以叙述为具有或包含与给定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：100乘以分数X/Y，其中X是在该程序的A和B比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基总数。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2计算机程序按前一段落中所述获得。
术语“药物制剂”指这样的制备物，其处于这样的形式，使得包含在其中的活性成分的生物活性有效，且不包含对将要施用该制剂的个体具有不可接受的毒性的附加成分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分外的成分，其对个体无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用的术语“处理”指设计用于改变所处理的个体或细胞在临床病理过程中的自然过程的临床干预。希望得到的处理作用包括减慢疾病进展速率、改善或缓和疾病状态及缓解或改善的预后。例如，如果与该障碍相关的一种或多种症状缓和或消除，则个体得到成功“处理”。例如，如果与炎性疾病相关的一种或多种症状缓和或消除(包括但不限于减少疾病引起的症状、提高患有疾病的个体的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延缓疾病进展和/或延长个体存活)，则个体得到成功“处理”。
本文所用的“与…结合”指施用除另一种治疗方式外的一种治疗方式。因此，“与…结合”指在对个体施用其他治疗方式之前、期间或之后施用一种治疗方式。
本文所用的术语“预防”包括在个体中就疾病的发生或复发提供预防。个体可以易患障碍、对障碍敏感或处于发展障碍的风险，但尚未诊断患有该障碍。在一些实施方案中，用本文所述NSP4抑制剂来延迟该障碍的发展。在一些实施方案中，本文所述NSP4抑制剂预防炎症和/或脉管渗漏。
如本文所使用，在本文所述处理方法之前，“处于发展障碍的风险”的个体可以具有或不具有可检测到的疾病或疾病症状，且可以已显示或未显示可检测到的疾病或疾病症状。“处于…风险”指个体具有本领域已知的一个或多个风险因子，该风险因子是与该障碍的发展相关的可测量参数。具有一个或多个这些风险因子的个体比不具有一个或多个这些风险因子的个体具有更高的概率发展该障碍。
“有效量”指至少对在必要的剂量和时期下达到希望得到的或所示的效应(包括治疗或预防结果)有效的量。有效量可以以一次或多次施用提供。
“治疗有效量”至少是达到具体障碍可测量的改善所需的最小浓度。本文的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别、患者体重和抗体在个体中引出希望得到的反应的能力的因素而变。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益作用超过了抗体的任意毒性作用或有害作用。“预防有效量”指对在必要的剂量和时期下达到希望得到的预防结果有效的量。通常但并非必然，由于在疾病之前或在疾病更早阶段将预防性剂量用于个体，预防有效量可以小于治疗有效量。
本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”指这样的细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合具有抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，且为通过此机制杀死靶细胞所需。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等,PNASUSA95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体途径的激活由补体系统第一成分(C1q)与结合于其关联抗原的(适当亚类的)抗体的结合起始。为了评估补体激活，可以进行例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的CDC测定。
本文所用的术语“约”指本技术领域技术人员容易知道的各值的常见误差范围。本文中提到“约”某个值或参数包括(描述)了指向该值或参数本身的实施方案。
除非文中另有明确说明，本文及所附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。例如，提到“一种抗体”是提到一种至许多种抗体，如摩尔量，且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。
应理解，本文所述发明的方面和实施方案包括“包含该方面和实施方案”、“由该方面和实施方案组成”及“基本由该方面和实施方案组成”。
II.组合物和方法
A.NSP4抑制剂
本文提供在体外、在原位和/或在体内阻断、抑制、降低或干扰NSP4酶活性的NSP4抑制剂。NSP4抑制剂是具有一个或多个以下特征的分子：(1)抑制或降低NSP4酶活性；(2)抑制或减少NSP4与其一种或多种底物的结合的能力；(3)增加NSP4的清除(例如降低所释放的NSP4的胞外水平)的能力；(4)抑制或减少NSP4从嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞释放的能力；(5)减少嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞中的NSP4表达(如在mRNA水平和/或在蛋白质水平)的能力；(6)作用、结合或识别前体和/或成熟形式的NSP4的能力；(7)增强蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)对NSP4的失活的能力；(8)与NSP4而不与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)或蛋白酶3(PR3)活性特异性相互作用或结合的能力；(9)治疗、改善或预防本文所描述或考虑的嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的任意方面的能力；和(10)治疗、改善或预防本文所描述或考虑的粒细胞介导的疾病或障碍的任意方面的能力。
抑制NSP4产生的示例性NSP4抑制剂包括例如但不限于以下的物质：特异性抑制NSP4合成和/或释放的化合物，针对NSP4的反义分子，或针对编码NSP4的核酸的短干扰RNA(siRNA)分子。抑制NSP4蛋白酶活性的其他示例性NSP4抑制剂包括例如但不限于以下的物质：特异性结合NSP4(例如前体NSP4和/或成熟NSP4)的抗NSP4抗体，蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸蛋白酶抑制剂)，特异性抑制NSP4催化活性的化合物如小分子抑制剂和/或肽抑制剂，特异性抑制NSP4与其一种或多种底物结合的化合物，NSP4结构类似物，或结合NSP4的RNA或DNA适配体。在一些实施方案中，NSP4抑制剂是变构抑制剂。在一些实施方案中，NSP4抑制剂是正构抑制剂(orthostericinhibitor)。
在某些实施方案中，NSP4抑制剂是降低NSP4催化活性的蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，本文考虑的蛋白酶抑制剂通过降低活性NSP4蛋白质浓度来降低NSP4蛋白酶活性水平。在一些实施方案中，该NSP4抑制剂是称为serpin的丝氨酸蛋白酶抑制剂，serpin是本领域众所周知能够抑制蛋白酶活性的一组蛋白质。例如，serpin蛋白质包括但不限于α1-抗胰蛋白酶、C1抑制剂、肝素活化抗凝血酶和α2-抗纤溶酶。用于制备或纯化serpin抑制剂的方法为本领域公知，包括但不限于重组蛋白质表达或免疫亲和纯化。
在某些实施方案中，该NSP4抑制剂是小分子抑制剂(例如肽抑制剂)，包括但不限于小肽或肽样分子、可溶性肽及合成的非肽基有机或无机化合物。小分子抑制剂可以具有约100至约20,000道尔顿(Da)、约500至约15,000Da、约1000至约10,000Da的任意分子量。例如，本文考虑的小分子抑制剂包括但不限于氨肽酶抑制剂盐酸盐水合物、抗蛋白酶二盐酸盐、牛胰蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、表抑氨肽酶肽盐酸盐、histatin5、亮抑蛋白酶肽半硫酸盐、亮抑蛋白酶肽三氟醋酸盐、亮抑蛋白酶肽盐酸盐、胃蛋白酶抑制剂或苯甲基磺酰氟。在一些实施方案中，该小分子抑制剂是大环抑制剂如但不限于大环酰基磺酰胺，或已知抑制HCVNS3/4A蛋白酶的小分子抑制剂。用于制备和测试小分子对催化活性所具有的抑制作用的方法为本领域公知，且这类方法可以用于评估小分子抑制剂对NSP4活性的影响。例如，通过在缓冲液中存在荧光肽底物的情况下，将各抑制剂候选物与活性NSP4孵育，可以针对降低的NSP4蛋白酶活性筛选NSP4抑制剂候选物文库。NSP4切割时，该荧光肽底物将发荧光，可以通过本领域公知的技术测量各抑制剂候选物存在下的NSP4活性。可以用于本文所述测定的示例性荧光肽底物包括但不限于具有氨基酸序列1IR{Arg(Me)}SSYSFKK10或1IR{Arg}SSYSFKK10的荧光肽底物。
在某些实施方案中，该NSP4抑制剂是结合NSP4或与NSP4物理上相互作用的抗NSP4抗体。该抗体可以对靶抗原(例如NSP4)具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。在某些实施方案中，该抗体的Kd为约0.05至约100nM。例如，该抗体的Kd可以是约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM中的任一个至约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM中的任一个。本文描述用于制备和选择与NSP4特异性相互作用和/或结合的抗体的方法。
在某些实施方案中，该NSP4抑制剂包含至少一个能够通过靶向编码NSP4的核酸来阻断或减少功能性NSP4的表达的反义分子。NSP4的核酸序列为本领域已知。例如，人NSP4可以具有NCBI检索号NM_214710中所示的核酸序列，小鼠NSP4可以具有NCBI检索号NM_001042710中所示的核酸序列。已知用于制备反义寡核苷酸分子的方法，这类方法可以用于制备将特异性结合一种或多种NSP4mRNA而不与其他多核苷酸交叉反应的反义寡核苷酸。示例性靶向部位包括但不限于起始密码子、5’调节区、编码序列(包括任意保守共有区)和3’非翻译区。在某些实施方案中，该反义寡核苷酸长度为约10至约100个核苷酸、长度为约15至约50个核苷酸、长度为约18至约25个核苷酸、或更长。在某些实施方案中，该寡核苷酸进一步包含化学修饰以提高核酸酶抗性等，例如本领域普通技术人员已知的硫代磷酸酯键和2’-O-糖修饰。
在某些实施方案中，该NSP4抑制剂包含至少一个能够通过靶向编码NSP4的核酸来阻断或减少功能性NSP4的表达的siRNA分子。用于制备siRNA分子的方法为本领域公知，这类方法可以用于制备将特异性靶向NSP4mRNA而不与其他多核苷酸交叉反应的siRNA分子。siRNA分子可以通过诸如典型固相或寡核苷酸合成的方法产生，且通常将掺入化学修饰以增加siRNA物质的半衰期和/或功效，和/或以允许更粗放的递送制剂。备选地，用编码用于胞内转录siRNA的表达盒的载体递送siRNA分子。
在某些实施方案中，该NSP4抑制剂是与NSP4结合或与NSP4物理上相互作用并阻断NSP4与其一种或多种底物之间的相互作用的RNA或DNA适配体。在某些实施方案中，该适配体包含至少一种结合成熟形式的NSP4的RNA或DNA适配体。在某些实施方案中，该适配体包含至少一种结合前体形式的NSP4的RNA或DNA适配体。
在某些实施方案中，该NSP4抑制剂包含至少一种NSP4结构类似物。术语NSP4结构类似物指这样的化合物，其具有与NSP4(例如前体和/或成熟形式的NSP4)的部分三维结构相似的三维结构，且在体外或在体内在生理条件下结合NSP4底物，其中该结合至少部分抑制NSP4生物活性。可以通过NSP4与其底物的结合的分子模拟来设计和合成适宜的NSP4结构类似物。NSP4结构类似物可以是单体、二聚体或相同或不同结构的任意希望的组合的高级多聚体，以获得改善的亲和力和生物效应。在一些实施方案中，NSP4抑制剂与图1中所示的NSP4氨基酸序列结合或相互作用。
测定
可以用本领域公知的方法鉴定和/或表征NSP4抑制剂，例如放射性标记抑制剂测定、光学测定、蛋白质结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定、质量迁移测量测定、荧光测定和/或荧光肽切割测定。
结合测定和其他测定
在某些实施方案中，可以通过本领域公知的用于检测NSP4抑制剂候选物相互作用的存在和/或NSP4抑制剂候选物与NSP4的结合亲和力的技术来鉴定NSP4抑制剂。
在某些实施方案中，可以用放射性标记抑制剂测定来鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。例如，可以将已知量的放射性标记抑制剂候选物与已知量的固定化NSP4和缓冲液孵育。随后，可以用缓冲液洗涤固定化NSP4，并可以用本领域已知的技术(例如γ计数器)针对剩余放射性标记NSP4抑制剂候选物的存在测量固定化NSP4。指示放射性标记物质的存在的测量结果可以指示放射性标记抑制剂候选物能够与NSP4相互作用和/或结合。
在某些实施方案中，可以用光学技术鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。检测NSP4抑制剂的示例性光学技术可以包括，例如，使NSP4附着于比色共振移植表面，从而使反射光波长由于光线必须通过的光程的变化而发生迁移，随后在使抑制剂候选物与NSP4相互作用时测量反射光波长的附加变化。例如，在使抑制剂与NSP4孵育时测量到的反射光波长无变化可以指示该抑制剂候选物不能与NSP4相互作用。在使抑制剂与NSP4孵育时测量到的反射光波长的变化可以指示该抑制剂候选物能够与NSP4结合和/或相互作用。
在某些实施方案中，可以用蛋白质结合测定来鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。检测NSP4抑制剂的示例性蛋白质结合测定可以包括例如抑制剂候选物存在下的NSP4共免疫沉淀。例如，可以使NSP4与抑制剂候选物在缓冲液中孵育，随后可以在本领域已知的洗涤流程期间用专门用于捕获NSP4的固定化分子(例如抗NSP4抗体)来在抑制剂候选物的存在下捕获NSP4，并结合可能带有相互作用的抑制剂候选物的NSP4。随后，可以释放可能带有相互作用的抑制剂候选物的NSP4，并可以根据抑制剂候选物的特征通过例如质谱分析法和/或Western印迹的技术检测抑制剂候选物的存在。
在某些实施方案中，可以用本领域公知的生物化学测定和/或免疫测定来鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。示例性技术可以包括，例如，用诸如Western印迹的技术定量测量NSP4浓度变化和/或蛋白质半衰期的测定。例如，可以使抑制剂候选物与包含NSP4的样品孵育，随后可以在时程研究期间的点测量NSP4蛋白质的量。与对照处理相比，蛋白质的量和/或蛋白质半衰期的变化可以指示该NSP4抑制剂候选物可能能够改变NSP4半衰期和/或活性。
在某些实施方案中，可以用质量迁移测量测定来鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。示例性质量迁移测量测定可以包括，例如，通过使用仪器，如但不限于质谱仪，通过测量抑制剂候选物与NSP4相互作用时NSP4质量的变化来检测强烈和/或共价结合的NSP4抑制剂的存在。例如，取决于抑制剂候选物相互作用的性质，可以在基于全蛋白质和/或肽的分析上进行质量迁移测定。与该抑制剂候选物加至NSP4相关的质量迁移的检测可以指示该抑制剂候选物可能能够抑制NSP4。此外，示例性质量迁移测量测定可以包括，例如，用诸如表面等离振子共振的技术，检测抑制剂候选物与NSP4相互作用时，与各抑制剂候选物质量相关的NSP4质量增加。例如，可以测量光折射率的变化，并使之与附着于传感芯片的NSP4的质量变化相关。
在某些实施方案中，可以用化学交联测定来鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。例如，可以在体内或在体外使抑制剂候选物和NSP4与能够使与NSP4相互作用的抑制剂候选物共价连接至该NSP4分子的分子交联剂孵育。随后，可以用如但不限于质谱分析法和/或Western印迹的技术来鉴定可能能够抑制NSP4的抑制剂候选物。例如，与抑制剂候选物共价交联的NSP4的检测可以指示该抑制剂候选物可能能够抑制NSP4。
在某些实施方案中，可以用荧光抑制剂测定来鉴定与NSP4相互作用的NSP4抑制剂。例如，可以使已知量的荧光抑制剂候选物与已知量的固定化NSP4和缓冲液孵育。随后，可以用缓冲液洗涤固定化NSP4，并可以用如但不限于荧光检测的本领域已知技术针对剩余荧光NSP4抑制剂候选物的存在测量固定化NSP4。指示荧光物质的存在的测量结果可以指示该荧光抑制剂候选物能够与NSP4相互作用和/或结合。
活性测定
可以用本领域已知和本文所述(例如实施例3)的测定来鉴定和测试NSP4抑制剂的生物活性。在一些实施方案中，提供用于测试NSP4抑制剂阻断NSP4活性的能力的测定。示例性生物活性测试可以包括，例如，提供与NSP4抑制剂混合的NSP4(例如人NSP4)，使该混合物与一种或多种内部猝灭的荧光肽底物孵育，并用仪器如分光光度计测量荧光强度。NSP4抑制剂存在下的荧光增加可以指示该NSP4抑制剂不能阻断NSP4活性，而NSP4抑制剂存在下荧光无增加可以指示该NSP4抑制剂阻断NSP4活性。可以用于本文所述测定的示例性荧光肽底物包括但不限于具有氨基酸序列1IR{Arg(Me)}SSYSFKK10或1IR{Arg}SSYSFKK10的荧光肽底物。
在一些实施方案中，该NSP4抑制剂可以在任意这些测定中阻断NSP4活性的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％中任一个。
抗NSP4抗体
在一方面，本发明提供分离的结合NSP4的抗体。在某些实施方案中，抗NSP4抗体具有一个或多个以下特征：(1)结合NSP4(例如人NSP4)并抑制或降低NSP4蛋白酶活性；(2)阻断NSP4与其一种或多种肽底物的结合；(3)结合小鼠和/或人的NSP4；(4)结合失活和/或前体形式的NSP4；(5)结合NSP4和蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)之间形成的复合物；(6)增强蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)对NSP4的失活；和(7)特异性与NSP4而不与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)或蛋白酶3(PR3)反应。
在另一方面，本发明提供可以分入以下亚类之一的分离的抗NSP4抗体：1)结合成熟和前体形式的小鼠NSP4但不结合成熟和前体形式的人NSP4；2)结合成熟和前体形式的人NSP4但不结合成熟和前体形式的小鼠NSP4；3)结合成熟形式的小鼠NSP4但不结合前体形式的小鼠NSP4；4)结合成熟形式的人NSP4但不结合前体形式的人NSP4；5)结合成熟形式的小鼠NSP4和人NSP4但不结合前体形式的小鼠NSP4人NSP4；和6)结合成熟和前体形式的小鼠NSP4和人NSP4。
本文描述NSP4包含活性部位和肝素结合部位(参见例如图4A)的发现。本文进一步描述特异性结合这些部位之一的抗体(参见例如图30-31)。在另一方面，本发明提供可以分入以下亚类之一的分离的抗NSP4抗体：(1)特异性结合NSP4活性部位或NSP4活性部位附近；(2)抑制NSP4催化活性；(3)特异性结合NSP4活性部位或NSP4活性部位附近并抑制NSP4催化活性；(4)特异性结合NSP4肝素结合部位；(5)与肝素竞争结合NSP4；和(6)特异性结合NSP4肝素结合部位并与肝素竞争结合NSP4。
在一方面，本发明提供分离的抗NSP4抗体，其包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(i)含有氨基酸序列SEQIDNO:10的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQIDNO:11的HVR-L2；(iii)含有氨基酸序列SEQIDNO:12的HVR-L3；(iv)含有氨基酸序列SEQIDNO:1、4或7的HVR-H1；(v)含有氨基酸序列SEQIDNO:2、5或8的HVR-H2；和(vi)含有氨基酸序列SEQIDNO:3、6或9的HVR-H3。
在一个实施方案中，该分离的抗NSP4抗体包含含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区，其中：
(a)该HVR-H1序列是GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)；
(b)该HVR-H2序列是GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)；和
(c)该HVR-H3序列是RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)。
在一个实施方案中，该分离的抗NSP4抗体包含含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区，其中：
(a)该HVR-H1序列是GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)；
(b)该HVR-H2序列是AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)；和
(c)该HVR-H3序列是RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)。
在一个实施方案中，该分离的抗NSP4抗体包含含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区，其中：
(a)该HVR-H1序列是GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)；
(b)该HVR-H2序列是AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)；和
(c)该HVR-H3序列是RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)。
在一些实施方案中，本文提供的重链多肽进一步与包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合，其中：
(a)该HVR-L1序列是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)；
(b)该HVR-L2序列是SASFLYS(SEQIDNO:11)；和
(c)该HVR-L3序列是QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)。
在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中：
(i)该HVR-H1序列是GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)；
(ii)该HVR-H2序列是GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)；
(iii)该HVR-H3序列是RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)；和/或
(b)该轻链包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中：
(i)该HVR-L1序列是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)；
(ii)该HVR-L2序列是SASFLYS(SEQIDNO:11)；和
(iii)该HVR-L3序列是QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)。
在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中：
(i)该HVR-H1序列是GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)；
(ii)该HVR-H2序列是AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)；
(iii)该HVR-H3序列是RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)；和/或
(b)该轻链包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中：
(i)该HVR-L1序列是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)；
(ii)该HVR-L2序列是SASFLYS(SEQIDNO:11)；和
(iii)该HVR-L3序列是QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)。
在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中：
(i)该HVR-H1序列是GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)；
(ii)该HVR-H2序列是AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)；
(iii)该HVR-H3序列是RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)；和/或
(b)该轻链包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中：
(i)该HVR-L1序列是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)；
(ii)该HVR-L2序列是SASFLYS(SEQIDNO:11)；和
(iii)该HVR-L3序列是QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)。
还在另一具体方面，该抗体进一步包含人或鼠恒定区。还在另一方面，该人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。还在另一具体方面，该人恒定区是IgG1。还在另一方面，该鼠恒定区选自IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3。还在另一方面，该鼠恒定区是IgG2A。还在另一具体方面，该抗体具有减少的或最小的效应子功能。
还在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链进一步包含分别与GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)、GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)和RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
还在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链进一步包含分别与GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)、AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)和RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
还在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链进一步包含分别与GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)、AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)和RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
还在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链序列与重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTYISWVRQAPGKGLEWVGFIYPANGATYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRRYRLSFDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:13)具有至少85％序列同一性；和/或
(b)该轻链序列与轻链序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:16)具有至少85％序列同一性。
还在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链序列与重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGNDISWVRQAPGKGLEWVAGISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRRVSFYSRHAGMDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:14)具有至少85％序列同一性；和/或
(b)该轻链序列与轻链序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:16)具有至少85％序列同一性。
还在另一实施方案中，提供分离的抗NSP4抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)该重链序列与重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAISWVRQAPGKGLEWVAGISPSNGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRAGRWTHSDIDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:15)具有至少85％序列同一性；和/或
(b)该轻链序列与轻链序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:16)具有至少85％序列同一性。
在任意以上实施方案中，抗NSP4抗体是分离的抗体。在任意以上实施方案中，抗NSP4抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗NSP4抗体包含如任意以上实施方案中的HVR和图13中所示的HVR(包括含有KabatCDR、ChothiaCDR或ContactCDR序列的HVR)，并进一步包含受体人构建，例如人免疫球蛋白构建或人共有构架。
在某些实施方案中，本文所述抗NSP4抗体包含如Kabat所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗NSP4抗体，其中通过本文进一步描述的Kabat定义每个CDR。在某些实施方案中，本文所述抗NSP4抗体包含如Chothia所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗NSP4抗体，其中通过本文进一步描述的Chothia定义每个CDR。在某些实施方案中，本文所述抗NSP4抗体包含如ContactCDR序列所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗NSP4抗体，其中通过本文进一步描述的ContactCDR序列定义每个CDR。
在另一方面，提供抗NSP4抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗NSP4抗体保留结合NSP4的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO:16中取代、插入和/或缺失了总计1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即FR中)。可选地，该抗NSP4抗体包含VL序列SEQIDNO:16，包括该序列的翻译后修饰。
在另一方面，抗NSP4抗体包含与选自SEQIDNO:13-15的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗NSP4抗体保留结合NSP4的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO:13-15的任一个中取代、插入和/或缺失了总计1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即FR中)。可选地，该抗NSP4抗体包含SEQIDNO:13-15的任一个中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，本文提供抗NSP4抗体，其包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)、GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)和RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。
在一些实施方案中，前一段落的抗NSP4抗体包含含有与选自SEQIDNO:12和92-94的序列具有至少85％序列同一性的HVR-L3序列的轻链。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)、GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)和(SEQIDNO:52)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)、QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:78具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)、GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)和RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYGFPLT(SEQIDNO:92)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:78具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:102具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)、GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)和RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYDFPLT(SEQIDNO:93)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:78具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:103具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)、GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)和RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSAGFPLT(SEQIDNO:94)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区，和/或含有序列SEQIDNO:104的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供抗NSP4抗体，其包含分别与GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)、RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)和QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。
在一些实施方案中，该抗体包含分别与GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)、RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)、RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)和QQSYGFPLT(SEQIDNO:92)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)、RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)和QQSYDFPLT(SEQIDNO:93)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)、RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)和QQSAGFPLT(SEQIDNO:94)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)和KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:105具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:106具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供抗NSP4抗体，其包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)和QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)和X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S。
在一些实施方案中，前一段落的抗NSP4抗体包含含有HVR-H3序列的重链，该HVR-H3序列与选自SEQIDNO:67、89和90的序列具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，前一段落的抗NSP4抗体包含含有HVR-L3序列的轻链，该HVR-L3序列与选自SEQIDNO:12和97-100的序列具有至少85％序列同一性。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:83具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)和KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:107具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:108具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)和KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQANSTPPT(SEQIDNO:98)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:83具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:109具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)和RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:110具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:108具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)和RVFFHNVAFDY(SEQIDNO:90)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQNFSSPPT(SEQIDNO:99)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:111具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:112具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)和KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:83具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:108具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包含重链和轻链，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQTYNAPPT(SEQIDNO:100)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:110具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:113具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供抗NSP4抗体，其包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)、X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)(其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F)和QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)(其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)、KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)和QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)和QQANSTPPT(SEQIDNO:98)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)和QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、RVFFHNVAFDY(SEQIDNO:90)和QQNFSSPPT(SEQIDNO:99)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)和QQSYTAPPT(SEQIDNO:97)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗体包含分别与AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)、RGLFHNVAFDY(SEQIDNO:89)和QQTYNAPPT(SEQIDNO:100)具有至少85％序列同一性的HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSWIS(SEQIDNO:20)、GTISPYNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:21)和RVLRPKVYASVMDY(SEQIDNO:22)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:68具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGYSIH(SEQIDNO:23)、AGISPTNGYTDYADSVKG(SEQIDNO:24)和RLVFYRGVMDY(SEQIDNO:25)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:69具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNWIS(SEQIDNO:26)、GYIYPASGYTDYADSVKG(SEQIDNO:27)和SDSPHAYWYAMDY(SEQIDNO:28)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:70具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTNNSIS(SEQIDNO:29)、GAISPNNGSTYYADSVKG(SEQIDNO:30)和RNAWHYSWVGVMDY(SEQIDNO:31)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:71具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTDYSIH(SEQIDNO:32)、AEIYPYSGDTYYADSVKG(SEQIDNO:33)和RDGDGWFDWAMDY(SEQIDNO:34)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:72具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSSTAIS(SEQIDNO:35)、GEIYPSDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:36)和RVKWAVSSLGVMDY(SEQIDNO:37)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:73具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTDSDIS(SEQIDNO:38)、AWISPSDGATDYADSVKG(SEQIDNO:39)和HEASDDDYAIDY(SEQIDNO:40)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:74具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDYWIS(SEQIDNO:41)、AGISPNNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:42)和REDDDERDYAMDY(SEQIDNO:43)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:75具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTGYGIS(SEQIDNO:44)、GWIYPASGATYYADSVKG(SEQIDNO:45)和RHRAFDWYPYYIGSSVMDY(SEQIDNO:46)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:76具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDYSIS(SEQIDNO:47)、GEINPAGGATYYADSVKG(SEQIDNO:48)和RGDFPFWSDAYYVMDY(SEQIDNO:49)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:77具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)、GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)和RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:78具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSDIS(SEQIDNO:53)、GEIYPSNGDTYYADSVKG(SEQIDNO:54)和RSVRPSWWAMDY(SEQIDNO:55)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:79具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSSYDIS(SEQIDNO:56)、GTISPYDGYTDYADSVKG(SEQIDNO:57)和RYIRRYSVHYGMDY(SEQIDNO:58)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:80具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTSTSIH(SEQIDNO:59)、AEITPHGGYTNYADSVKG(SEQIDNO:60)和RGRTKWGWLYGMDY(SEQIDNO:61)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:81具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTNNSIH(SEQIDNO:62)、AEIAPDDGYTYYADSVKG(SEQIDNO:63)和RGVIRYAYLYAMDY(SEQIDNO:64)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:82具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)、AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)和KSLFHNVAFDY(SEQIDNO:67)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:83具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)、GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)和RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:84具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)、AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)和RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:85具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文提供包含重链和轻链的抗NSP4抗体，其中：
(a)该重链包含分别与GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)、AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)和RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列；和/或
(b)该轻链包含分别与RASQDVS(SEQIDNO:19)、SASFLYS(SEQIDNO:11)和QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含含有与SEQIDNO:86具有至少85％序列同一性的序列的重链可变区，和/或含有与SEQIDNO:16具有至少85％序列同一性的序列的轻链可变区。
在可以与任意上述实施方案组合的一些实施方案中，该序列同一性可以是至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在以上实施方案的一些中，抗NSP4抗体是分离的抗体。在以上实施方案的一些中，抗NSP4抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗NSP4抗体包含如任意以上实施方案中的HVR和本文所述抗体的HVR(包括含有KabatCDR、ChothiaCDR或ContactCDR序列的HVR)。
在某些实施方案中，本文所述抗NSP4抗体包含如Kabat所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗NSP4抗体，其中通过本文进一步描述的Kabat定义每个CDR。在某些实施方案中，本文所述抗NSP4抗体包含如Chothia所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗NSP4抗体，其中通过本文进一步描述的Chothia定义每个CDR。在某些实施方案中，本文所述抗NSP4抗体包含如ContactCDR序列所定义的HVR，例如包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗NSP4抗体，其中通过本文进一步描述的ContactCDR序列定义每个CDR。
在另一方面，提供抗NSP4抗体，其中该抗体包含轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域与选自SEQIDNO:16、102、103、104、106、108、109、112或113的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗NSP4抗体保留结合NSP4的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO:16、102、103、104、106、108、109、112或113的任一个中取代、插入和/或缺失了总计1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即FR中)。可选地，该抗NSP4抗体包含SEQIDNO:16、102、103、104、106、108、109、112或113中任一个的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。可选地，该轻链包含具有序列SEQIDNO:115的恒定区。
在另一方面，抗NSP4抗体包含重链可变结构域(VH)序列，该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO:13-15、68-86、105、107、110和111的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，相对于参考序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗NSP4抗体保留结合NSP4的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO:13-15、68-86、105、107、110和111的任一个中取代、插入和/或缺失了总计1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即FR中)。可选地，该抗NSP4抗体包含SEQIDNO:13-15、68-86、105、107、110和111的任一个中的VH序列，包括那些序列的翻译后修饰。可选地，该重链包含具有序列SEQIDNO:114的恒定区。
在本发明的另一方面，以上实施方案中任一个的抗NSP4抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗NSP4抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，该抗体是全长抗体，例如本文定义的完整IgG1抗体或其他抗体种类或同种型(例如IgG2、IgG3或IgG4)。
本领域已知NSP4的氨基酸序列。例如，人NSP4可以具有NCBI检索号NP_999875.1中所示的氨基酸序列，非人灵长类NSP4可以具有NCBI检索号XP_001146596.1(黑猩猩NSP4)、XP_002828403.1(猩猩NSP4)、EHH29398.1(恒河猴NSP4)、XP_003914595.1(狒狒NSP4)、XP_002761565.1(狨猴NSP4)或XP_003788878.1(丛猴NSP4)中所示的氨基酸序列，非灵长类哺乳动物可以具有NCBI检索号NP_001036175.1(小鼠NSP4)、Q6IE59.2(大鼠NSP4)、XP_004717061.1(刺猬NSP4)、XP_001375784.7(负鼠NSP4)、XP_542217.3(犬NSP4)、XP_593377.3(牛NSP4)或XP_004009516.1(绵羊NSP4)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗NSP4抗体结合人NSP4。在一些实施方案中，该抗NSP4抗体结合小鼠NSP4。在一些实施方案中，该抗NSP4抗体结合人NSP4和小鼠NSP4二者。在一些实施方案中，该抗NSP4抗体结合图1中所示的NSP4的氨基酸序列。
在另一方面，以上实施方案中任一个的抗NSP4抗体可以单独掺入或组合掺入以下章节中所述的任意特征：
抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过用以下测定所述的Fab形式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量Kd。通过在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(125I)-标记抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定用于测定的条件，用含5μg/ml捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)的50mM碳酸钠(pH9.6)过夜包被多孔板(ThermoScientific)，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后过夜孵育目的Fab；但是，孵育可以持续更长时期(例如约65小时)，以确保达到平衡。然后，将混合物转移至捕获平板进行室温孵育(例如孵育1小时)。然后去除溶液，用含0.1％聚山梨酸酯20的PBS洗涤平板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数平板10分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每种Fab的浓度用于竞争结合测定。
根据另一实施方案，用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，在25℃下使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用表面等离振子共振测定来测量Kd。简言之，按照厂家说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM醋酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后按5μl/分钟的流速注入，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺，以封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃下注入两倍系列稀释于含0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab(0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图，用简单的1:1Langmuir结合模型EvaluationSoftwareversion3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，如在分光计，如装配停流的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，该技术在浓度逐渐提高的抗原存在下测量含20nM抗-抗原的抗体(Fab形式)的PBSpH7.2在25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低。
抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，及下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。scFv片段的综述参见例如Pluckthün,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,NewYork),269-315页(1994)；还参见WO93/16185；及美国专利号5,571,894和5,587,458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论参见美国专利号US5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生的多种技术来制备抗体片段。
嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体还将可选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，用来自非人抗体(例如从其衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并进一步描述于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；Osbourn等,Methods36:61-68(2005)；及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：用“最适”法选择的构架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源自具体亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般地描述于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外，或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和US6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述技术的美国专利号7,041,870；描述技术的美国专利申请公开号2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自这类动物所产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(参见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
还可以通过分离选自人衍生噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这类可变结构域序列与希望的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
文库衍生的抗体
可以针对具有一种或多种希望得到的活性的抗体筛选组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并针对具有希望得到的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法，如实施例3中所述的方法。其他方法综述于例如Hoogenboom等inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2001)中，并进一步描述于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,inMethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机组合，然后按Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述针对抗原结合噬菌体筛选该文库。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)所述克隆(例如从人)首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，通过以下来合成制备首次用于实验的文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，用包含随机序列的PCR引物来编码高变的CDR3区，并实现体外重排。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如美国专利号5,750,373及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
本文将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性之一针对NSP4，另一种针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与NSP4的两个不同表位结合。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)；WO93/08829；及Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))和“杵入臼”改造(参见例如美国专利号5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电引导作用(WO2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；按例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还可以包括含有与NSP4以及另一不同抗原结合的抗原结合部位的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US2008/0069820)。
抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或在抗体的氨基酸序列内插入残基和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终构建体，只要最终构建体具有希望得到的特征，例如抗原结合。
取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。进行取代诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“保守取代”的表头下显示保守取代。表1中在“示例性取代”的表头下显示更实质性的改变，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望得到的活性(例如保留/改善抗原结合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC)筛选产物。
表1.示例性取代
氨基酸可以按照共同的侧链性质分组：
a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链取向的残基：Gly、Pro；
f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)，和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行这类改变，针对结合亲和力测试所得到的变体VH或VL。通过构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)中的任一种来在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选该文库来鉴定具有希望得到的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定点途径，其中随机化几个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可以例如用丙氨酸扫描诱变或模拟来明确地鉴定出涉及抗原结合的HVR残基。尤其是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在证明对最初取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选残基来靶向或消除。可以筛选变体来确定它们是否包含希望得到的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低该抗体的糖基化程度。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现抗体糖基化位点的加入或缺失。
在抗体包含Fc区时，可以改变附着于其上的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供包含Fc区的抗体变体，其中附着于Fc区的糖类结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善ADCC功能。特别是，本文考虑相对于在野生型CHO细胞中产生的同一抗体上岩藻糖的量具有减少的岩藻糖的抗体。这就是说，它们的特征在于，具有比通过天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化模式的CHO细胞，如包含天然FUT8基因的CHO细胞)产生时它们本该具有的岩藻糖量低的岩藻糖量。在某些实施方案中，该抗体是这样的抗体，其中其上N连接聚糖中的不到约50％、40％、30％、20％、10％或5％包含岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。在某些实施方案中，该抗体是这样的抗体，其中其上N连接聚糖中没有一种包含岩藻糖，即其中该抗体完全不含岩藻糖、或无岩藻糖或是无岩藻糖基化的。相对于通过例如WO2008/077546中所述的MALDI-TOF质谱法测量的附着于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，通过计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其是在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
还提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等.)；US2005/0123546(Umana等)；及Ferrara等,BiotechnologyandBioengineering,93(5):851-861(2006)中。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施方案中，包含本文所述Fc区的抗体变体能够结合FcγRIII。在某些实施方案中，与包含人野生型IgG1Fc区的同一抗体相比，包含本文所述Fc区的抗体变体在人效应细胞存在下具有ADCC活性，或在人效应细胞存在下具有提高的ADCC活性。
Fc区变体
在某些实施方案中，可以向本文提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得它成为其中抗体的体内半衰期很重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用所希望的候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来确认CDC和/或ADCC活性的降低/减损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定来确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。备选地，可以利用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定来确认抗体不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。还可以用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了某些具有改善或减少的FcR结合的抗体变体(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312；及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如Fc区298、333和/或334位(残基的EU编号)的取代)的Fc区。在示例性实施方案中，抗NSP4抗体在其Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。
在一些实施方案中，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述，在Fc区中进行改变，该改变导致改变(即改善或减少)的C1q结合和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。
具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)中，新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代的那些，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及WO94/29351。
半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基取代抗体的一个或多个残基。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近部位。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性巯基放置在抗体的可接近部位，并可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代以下残基中的任意一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以按例如美国专利号7,521,541中所述产生。
抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以包含本领域已知且易于得到的附加非蛋白质部分。适合用于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropyleneglycol同聚物、prolypropyleneoxide/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在制备中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，且可以分枝或不分枝。附着于抗体的聚合物的数目可以不同，且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据包括但不限于抗体要改善的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在确定的条件下用于治疗等的考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。
在另一实施方案中，提供抗体和可通过暴露于照射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，该非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。照射可以具有任意波长，且包括但不限于这样的波长，该波长不损害普通细胞，但加热非蛋白质部分至杀死靠近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
重组方法和组合物
抗体可以用例如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述的抗NSP4抗体的核酸。这种核酸可以编码含有抗体VL的氨基酸序列和/或含有抗体VH的氨基酸序列(例如抗体轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗NSP4抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。本文还提供通过这类方法产生的抗NSP4抗体。
为了重组产生抗NSP4抗体，分离例如上文所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,MethodsinMolecularBiology,248卷(B.K.C.Lo,编辑,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；描述于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中的TRI细胞；MRC5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,248卷(B.K.C.Lo,编辑,HumanaPress,Totowa,NJ),255-268页(2003)。
测定
可以通过本领域已知的多种测定针对其物理/化学性质和/或生物学活性鉴定、筛选或表征本文提供的抗NSP4抗体。
结合测定和其他测定
在一方面，例如通过已知的方法(如ELISA、Western印迹等)针对其抗原结合活性测试本发明的抗体。
在另一方面，可以用竞争测定来鉴定与选自1-1、1-2、1-3、1-5、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、3-2、3-5、4-2、4-3、4-4、4-5、5-1、5-2、5-3、5-4、35.WT、35.14、35.50、35.62、35.77、51.WT、51.30、51.50、51.51、51.59、51.72和51.82的一种或多种抗体竞争结合NSP4的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合与选自1-1、1-2、1-3、1-5、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、3-2、3-5、4-2、4-3、4-4、4-5、5-1、5-2、5-3、5-4、35.WT、35.14、35.50、35.62、35.77、51.WT、51.30、51.50、51.51、51.59、51.72和51.82的一种或多种抗体所结合的表位相同的表位(例如线性表位或构象表位)。用于定位抗体所结合的表位的详细的示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”inMethodsinMolecularBiology66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定中，在溶液中孵育固定化NSP4，该溶液包含结合NSP4(例如人NSP4或小鼠NSP4)的第一标记抗体，及针对其与该第一抗体竞争结合NSP4的能力进行测试的第二未标记抗体。该第二抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照，在溶液中孵育固定化NSP4，该溶液包含该第一标记抗体但不包含该第二未标记抗体。在允许该第一抗体与NSP4结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定化NSP4结合的标记的量。如果测试样品中与固定化NSP4结合的标记的量相对于对照样品实质性减少，则指示该第二抗体与该第一抗体竞争结合NSP4。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
在另一方面，可以用生物层干涉量度法来测定抗NSP4抗体对NSP4的亲和力。在示例性测定中，将抗NSP4抗体固定在抗人Fc传感器上，并用浓度递增的NSP4孵育，以用诸如OctetSystem(ForteBio)的仪器获得亲和力测量结果。
在另一方面，可以用ELISA来鉴定结合NSP4和蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)的复合物的抗体。在示例性测定中，将重组NSP4与蛋白酶抑制剂如丝氨酸蛋白酶抑制剂混合，以允许复合物形成。通过重组NSP4上存在的His标记将NSP4复合物包被在镍(Ni)平板中，用抗NSP4抗体按之前所述(参见Kuhl等,2010,J.Immunol.,185,387-399)进行捕获ELISA。与同种型抗体对照相比，抗NSP4抗体与NSP4复合物的结合将该抗体鉴定为与NSP4和蛋白酶抑制剂的复合物结合。参见例如Hinkofer等,J.Biol.Chem.,2013,288:26635-26648。
在本文的任意实施方案中，用于该测定的NSP4可以是成熟形式或前体形式的NSP4。
活性测定
可以用本领域已知和本文所述(例如实施例3)的测定来鉴定和测试抗NSP4抗体的生物活性。在一些实施方案中，提供用于测试阻断NSP4活性的抗NSP4抗体的测定。示例性生物活性测试可以包括，例如，提供与抗NSP4抗体混合的NSP4(例如人NSP4)，使该混合物与一种或多种内部猝灭的荧光肽底物孵育，并用仪器如分光光度计测量荧光强度。抗NSP4抗体存在下的荧光增加可以指示该抗NSP4抗体不能阻断NSP4活性，而抗NSP4抗体存在下荧光无增加可以指示该抗NSP4抗体阻断NSP4活性。可以用于本文所述测定的示例性荧光肽底物包括但不限于具有氨基酸序列1IR{Arg(Me)}SSYSFKK10或1IR{Arg}SSYSFKK10的荧光肽底物。
在一些实施方案中，该抗NSP4抗体可以在任意这些测定中阻断至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％中任一个的NSP4活性。
还提供用于测试阻断NSP4活性的抗NSP4抗体的测定。用于评估NSP4活性的示例性方法可以包括，提供底材(substrate)上的粒细胞，用NSP4抑制剂如抗NSP4抗体孵育粒细胞，然后用趋化因子(如补体C5a或白介素-8)刺激，并测量抗NSP4抗体存在下粒细胞的趋化性或移动性的变化，与同种型对照相比，其中趋化性或移动性的降低指示该抗NSP4抗体阻断NSP4活性。
在另一示例性测定中，可以使用嗜中性粒细胞介导的疾病的体内动物模型。例如，可以通过在施用静脉内K/BxN血清之前、与之同时或之后施用抗NSP4抗体来使用嗜中性粒细胞依赖性K/BxN血清转移关节炎模型。可以按实施例2中所述用体内近红外荧光成像监测处理的小鼠爪中的脉管渗漏、红斑和水肿，其中脉管渗漏、红斑或水肿中任一种的减少指示该抗NSP4抗体阻断NSP4活性。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任意抗NSP4抗体都可用于检测NSP4蛋白质在生物样品中的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如嗜中性粒细胞。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测的方法的抗NSP4抗体。在另一方面，提供检测NSP4在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使该生物样品与本文所述抗NSP4抗体在允许该抗NSP4抗体与NSP4结合的条件下接触，并检测该抗NSP4抗体和NSP4之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，用抗NSP4抗体来选择适于用抗NSP4抗体治疗的个体，例如，其中NSP4是用于选择患者的生物标志。
可以用本发明的抗体诊断的示例性障碍包括中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、脑缺血、急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎(例如幼年型类风湿性关节炎)、败血症性休克、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏、囊性纤维化、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病、癌症(例如肺癌)、由天然蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸蛋白酶抑制剂)缺乏引起的疾病、及本文描述和考虑的任意其他粒细胞介导的疾病或障碍(嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍)。
在某些实施方案中，提供标记的抗NSP4抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光标记、生色标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
B.药物组合物和制剂
本文还提供包含本文所述NSP4抑制剂和可药用载体的药物组合物和制剂。在一些实施方案中，该NSP4抑制剂可以是本文所述抗体。
可以通过将具有希望的纯度的NSP4抑制剂(如抗体或多肽)与一种或多种可选的可药用载体(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所述的药物组合物和制剂。可药用载体一般在所利用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20BaxterInternational,Inc.)。包括rhuPH20的某些示例性sHASEGP和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将sHASEGP与诸如软骨素酶的一种或多种附加的糖胺聚糖酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括描述于美国专利号6,171,586和WO2006/044908中的那些，后一种制剂包含组氨酸-乙酸缓冲液。
本文的组合物和制剂还可以根据所治疗的具体适应症的需要包含一种以上活性成分，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。这类活性成分以对预期目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地例如通过滤过无菌滤膜来达到。
C.治疗方法
本文提供的任意NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)都可以用于治疗方法。
在一方面，提供用作药物的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在另一方面，提供用于治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在某些实施方案中，提供用于治疗或预防的方法的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗或预防患有粒细胞介导的疾病或障碍的个体的方法的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)，该方法包括对该个体施用有效量的NSP4抑制剂。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在一些实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。以上实施方案中任一个的“个体”优选是人。在本文的任意实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍可以是本文所述疾病。
在某些实施方案中，本发明提供用于治疗或预防患有粒细胞介导的疾病或障碍的个体的方法的抗NSP4抗体，该方法包括对该个体施用有效量的抗NSP4抗体。在某些实施方案中，该抗体特异性结合NSP4活性部位。在某些实施方案中，该抗体抑制NSP4催化活性。在某些实施方案中，该抗体特异性结合NSP4活性部位且抑制NSP4催化活性。在某些实施方案中，该抗体特异性结合NSP4肝素结合部位。在某些实施方案中，该抗体与肝素竞争结合NSP4。在某些实施方案中，该抗体特异性结合NSP4肝素结合部位且与肝素竞争结合NSP4。在某些实施方案中，对该个体施用有效量的异性结合NSP4活性部位和/或抑制NSP4催化活性的抗体，以及特异性结合NSP4肝素结合部位和/或与肝素竞争结合NSP4的抗体。
在另一方面，本发明提供NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍。在另一实施方案中，该药物用于治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的方法，该方法包括对患有该疾病或障碍的个体施用有效量的该药物。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在一些实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。在本文的任意实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍可以是本文所述疾病。
在另一方面，本发明提供用于治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的方法。在一个实施方案中，该方法包括对患有这种疾病或障碍的个体施用有效量的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在一些实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。在本文的任意实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍可以是本文所述疾病。
在一方面，提供用作药物的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在另一方面，提供用于治疗嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在某些实施方案中，本方提供用于治疗患有嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的个体的方法的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)，该方法包括对该个体施用有效量的NSP4抑制剂。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在一些实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。以上实施方案中任一个的“个体”优选是人。在本文的任意实施方案中，该粒细胞介导的疾病或障碍可以是本文所述疾病。
在另一方面，本发明提供NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍。在另一实施方案中，该药物用于治疗嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的方法，该方法包括对患有该疾病或障碍的个体施用有效量的该药物。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在一些实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。在本文的任意实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍可以是本文所述疾病。
在另一方面，本发明提供用于治疗嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的方法。在一个实施方案中，该方法包括对患有这种疾病或障碍的个体施用有效量的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在一些实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。在本文的任意实施方案中，该嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍可以是本文所述疾病。
中性粒细胞(也称为多形核白细胞(PMN))是先天免疫系统的细胞，其涉及急性炎症及侵入病原体(例如细菌)的吞噬。嗜中性粒细胞的抗微生物活性部分由嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3)介导，嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶在胞内发挥作用来破坏所吞噬的微生物，或者可以由嗜中性粒细胞释放以在胞外发挥作用来遏制和减少感染部位的病原体增殖。虽然嗜中性粒细胞释放的嗜中性粒细胞蛋白酶可以在先天免疫系统中发挥有益作用，但这些蛋白酶也可以通过引起例如异常组织损伤和炎症而促成嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍的形成。研究显示嗜中性粒细胞在几种疾病的病理学中发挥促进作用，如但不限于败血症性休克、急性呼吸窘迫综合征、缺血后再灌注、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎和癌症。参见例如Adams等,JTrauma-InjuryInfectCritCare.,2001,51:452-456；Lindsey等,Circulation,2001,103:2181-2187；Wright等,Rheumatology,2010,49(9):1618-1631；Magrone等,PharmDes.,2012,18(12):1609-19；和Vaguliene等,BMCImmunology.,2013,6:14-36。
嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍包括表征为炎症(例如急性炎症和/或慢性炎症)、血管通透性提高、组织损伤和/或已知嗜中性粒细胞在其中发挥作用的其他炎症过程的疾病。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍是选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏和脑缺血的血管病。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍是选自急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎(例如幼年型类风湿性关节炎)和败血症性休克的炎性疾病。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍是选自COPD、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏、囊性纤维化、特发性肺纤维化和ARDS的肺病。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍是自身免疫病，如但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎和起泡性皮肤病。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍是癌症，如但不限于肺癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、胰腺癌和脑癌。在一些实施方案中，该癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍是由天然(即宿主)蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸蛋白酶抑制剂)缺乏引起的疾病，该天然蛋白酶抑制剂如但不限于α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶、C1抑制剂、分泌型白细胞蛋白酶抑制剂、单核细胞-嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂和α1-抗胰凝乳蛋白酶。
粒细胞包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，本文所述方法或药物用于治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍。例如，可以治疗或预防的疾病或障碍包括血管病、炎性疾病和自身免疫病。在一些实施方案中，该疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、哮喘(例如变应性哮喘、病毒诱发性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病(例如大疱性类天疱疮)、炎性皮肤病(例如特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎)、癌症(例如肺癌)、肾病(例如肾小球性肾炎)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、败血症性休克、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克隆病)。
在另一方面，本发明提供例如用于任意以上治疗方法的包含本文提供的任意NSP4抑制剂的药物组合物或制剂。在一个实施方案中，药物组合物或制剂包含本文提供的任意NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)和可药用载体。在另一实施方案中，药物组合物或制剂包含本文提供的任意NSP4抑制剂和例如下文所述的至少一种附加治疗剂。
本文所述NSP4抑制剂可以在治疗中单独使用或与其他活性剂组合使用。例如，本文所述NSP4抑制剂可以与至少一种附加治疗剂共同施用。这类联合治疗涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前发生、与施用附加治疗剂和/或佐剂同时发生和/或在施用附加治疗剂和/或佐剂之后发生。
本文所述NSP4抑制剂(和任意附加治疗剂)可以通过任意适宜的手段施用，其包括胃肠外、肺内和鼻内，如果希望进行局部处理，则可以病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的，可以通过任意适宜的途径给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射。本文考虑多种给药方案，包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。
将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用本文所述NSP4抑制剂(例如抗体)。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的病因、递送活性剂的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。无需但可选地用目前用于预防或治疗所讨论的障碍的一种或多种活性剂配制NSP4抑制剂。这类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的NSP4抑制剂的量、障碍或处理的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量并用本文所述给药途径施用，或者本文所述剂量的约1％至99％，或以任意剂量，并通过经验/临床上确定为适当的任意途径施用。
对于疾病的预防或治疗，NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)(在单独使用时或与一种或多种其他附加治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、NSP4抑制剂的类型、疾病的严重度和病程、为了预防性还是治疗性目的而施用NSP4抑制剂、之前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应及主治医师的判断。在一次或一系列治疗中适宜地对患者施用NSP4抑制剂。
例如，取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)可以是例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来对患者施用的起始候选剂量。取决于上述因素，一个典型日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗通常将持续至出现希望的疾病症状抑制。NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)的一个示例性剂量将在从约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。这类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受约2至约20、或例如约6个剂量的抗体)。可以施用较高的起始负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定容易地监测此治疗的进展。
III.制品和试剂盒
在本发明的另一方面，提供包含一种或多种用于治疗、预防和/或诊断上述障碍的NSP4抑制剂(例如抗NSP4抗体)的制品或试剂盒。制品或试剂盒可以进一步包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器、IV溶液袋等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳本身或与另一组合物组合对治疗、预防和/或诊断病症有效的组合物，且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述NSP4抑制剂。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症。在一些实施方案中，所选择的病症是粒细胞介导的疾病或障碍。在一些实施方案中，待治疗的疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、哮喘(例如变应性哮喘、病毒诱发性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病(例如大疱性类天疱疮)、炎性皮肤病(例如特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎)、癌症(例如肺癌)、肾病(例如肾小球性肾炎)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、败血症性休克、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克隆病)。在一些实施方案中，所选择的病症是嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍，如但不限于中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、脑缺血、急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎(例如幼年型类风湿性关节炎)、败血症性休克、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏、囊性纤维化、特发性肺纤维化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、起泡性皮肤病、癌症(例如肺癌)、由天然蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸蛋白酶抑制剂)缺乏引起的疾病、或本文描述和考虑的任意其他嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍。此外，制品或试剂盒可以包含：(a)组合物包含在其中的第一容器，其中该组合物包含本文所述NSP4抑制剂；和(b)组合物包含在其中的第二容器，其中该组合物包含第二治疗剂。本发明的此实施方案中的制品或试剂盒可以进一步包含指示该组合物可以用来治疗特定病症的包装说明书。备选地或此外，制品或试剂盒可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包含商业和用户角度希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式，较为详细地描述了前述发明，但该描述和实例不应理解为限制本发明的范围。
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例
实施例1：嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4(NSP4)的底物识别的表征
NSP4(表征为胰蛋白酶折叠蛋白酶的嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶家族的成员)储存在嗜中性粒细胞嗜天青颗粒中(Perera等,JImmunol.,2013)，它还是所有NSP中丰度最低的(Perera等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:6229–6234)，且其功能仍未知。NSP4从硬骨鱼至人高度保守(图1)，先于其他NSP进化出现(Perera等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:6229–6234；Perera等,ExpertRevClinImmunol,2012,8:501–503)。因此NSP4可能在嗜中性粒细胞生物学中发挥基础作用。虽然根据对其活性部位结构的认识很好理解嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)和蛋白酶3(PR3)相对宽的底物特异性(Navia等,ProcNatlAcadSciUSA,1989,86:7-11；Hof等,EMBOJ,1996,15:5481–5491；Fujinaga等,JMolBiol,1996,261:267-278)，但NSP4提出了挑战，因为它在精氨酸残基后切割底物(Perera等,ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:6229–6234；Perera等,JImmunol.,2013)，但其一级序列预测不同的弹性蛋白酶样活性部位(图2A)。在胰蛋白酶折叠蛋白酶中，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的活性部位帮助确定P1位的三类主要底物特异性(Hedstrom等,ChemRev,2002,102:4501–4524)(图2B)。胰蛋白酶样蛋白酶(如凝血因子和补体因子)具有深S1袋来容纳长精氨酸侧链，该长精氨酸侧链通过与高度保守的D189(胰凝乳蛋白酶原编号)的盐桥相互作用而得以稳定。相反，弹性蛋白酶样蛋白酶由于其浅S1袋而不能容纳大的精氨酸侧链。
为了研究NSP4如何能够用表观上的弹性蛋白酶样S1袋(图2A和B)达到其精氨酸特异性，表征了该非典型S1袋。
方法
重组蛋白质表达和纯化
为了产生用于结构表征的人野生型NSP4，将编码从Ile34(胰凝乳蛋白酶原编号中的Ile16)至Ala283的人NSP4的DNA与N端His6标记和肠肽酶切割位点融合，克隆入pAcGP67载体(BDBiosciences)。通过DNA测序确认所得到的杆状病毒转移载体，并与BaculoGold线性化DNA(BDBiosciences)共转染入Sf9昆虫细胞，扩增三次，以产生高效价病毒原液。对于蛋白质产生，感染后用ESF921培养基(ExpressionSystems)在27℃在摇瓶或wave袋(GEHealthcare)中培养细胞72小时，并通过离心去除。得到的上清补充含1mMNiCl2、5mMCaCl2的50mMTris-HCl，pH7.5。通过重力流在Ni-NTA柱(Qiagen)上捕获上清中的蛋白质，用200ml洗涤缓冲液(50mMTrispH7.5、300mMNaCl、10mM咪唑)洗涤，并用洗脱缓冲液(50mMTrispH7.5、300mMNaCl、300mM咪唑)洗脱。浓缩蛋白质，在用20mMTrispH7.5、150mMNaCl平衡的大小排阻柱(Superdex200HiLoad16/60,GEBiosciences)上进一步纯化。
为了产生用于生物化学表征的NSP4突变体，将编码从Ile34至Ala283的人NSP4片段的DNA与N端FLAG标记和C端His6标记一起克隆在经修饰的适合用于哺乳动物细胞表达的pRK5载体中。用QuikChange诱变试剂盒(Agilent)来产生掺入希望得到的单点和双点突变体的衍生表达构建体(按胰凝乳蛋白酶编号)：F190A、S192A、S195A、S216G、F190A:S216G和S192A:S216G。通过瞬时表达在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达该构建体，孵育后通过离心收集上清。通过重力流在抗FLAG亲和树脂上捕获上清中的蛋白质，用200ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸钠pH3.0、150mMNaCl)洗脱，并立即用1MTrispH8中和至pH7。
生物化学测定
昆虫细胞来源和CHO细胞来源的NSP4都按15EU/ml蛋白质使用肠肽酶(Invitrogen)并在20℃过夜孵育来激活。通过SDS-PAGE和液相层析-质谱分析法(LC-MS)监测切割反应的完成。进行阳离子交换的第二纯化来去除肠肽酶，并使用从0.05M至1.0MNaCl的20mMTrispH7.5的梯度洗脱，用MonoS柱(GEHealthcare)纯化NSP4至同质。
结晶和结构测定
对于apo-NSP4和FFR:NSP4晶体，在100mM柠檬酸钠pH5.5、300mMNaCl中按1:100EndoF3:NSP4质量比用EndoF3部分去糖基化昆虫来源的NSP4，37℃3小时，然后4℃过夜。用SDS-PAGE和LC-MS验证去糖基化反应。对于VLK:NSP4晶体，完全去糖基化昆虫来源的NSP4。为了制备FFR:NSP4和VLK:NSP4复合物，将NSP4分别与20倍摩尔过量的D-Phe-L-Phe-L-Arg-cmk(Bachem)或与D-Val-L-Leu-L-Lys-cmk(Bachem)在20℃混合过夜。用LC-MS验证所得到的FFR:NSP4和VLK:NSP4共价复合物。Apo-NSP4、FFR:NSP4和VLK:NSP4均用20mMTrispH7.5、150mMNaCl平衡的SuperdexS200HiLoad16/60大小排阻层析柱脱盐。将蛋白质浓缩至约10mg/ml，并与沉淀剂/缓冲液(母液)1:1混合进行结晶试验。
所有晶体均在19℃通过坐滴蒸汽扩散法获得，晶体在2至7天之间出现。FFR:NSP4在20％PEGMME2000、0.1MTrispH8.5、0.2M三甲胺N-氧化物中结晶。Apo-NSP4(形式1)在15-17％PEG-10,000、0.1M醋酸钠pH4.4、0.1M醋酸铵中结晶。Apo-NSP4(形式2)在22-25％PEG-3350、0.1MBis-TrispH5.5、0.2MNaCl中结晶。VLK:NSP4在20％PEG-33500.2M醋酸钾中结晶，无其他缓冲剂。晶体在补充20％甘油的母液中冷冻保存，且在液氮中速冻。
用同步加速器光源进行数据收集实验。具体而言，在波长的ALS光束5.0.1和95K温度下收集Apo(形式1和2)和VLK-cmk数据集(AdvancedLightSource)。在波长的SSRL光束7-1和100K温度下收集FFR-cmk数据集(StanfordSynchrotonRadiationLightSource)。用HKL2000(Otwinowski等,MethodsinEnzymology,1997,276:307–326)索引和整合数据。用MrBUMP(Keegan等,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr,2007,63:447–457)解析NSP4的初始结构，以获得初始相，并重建入通过用PHENIX包(Adams等,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr,2010,66:213–221)模拟退火创建的图谱中。用PHENIX提炼结构，97.0％(apo形式1)、95.4％(apo形式2)、96.5％(FFR-cmk)和95.4％(VLK-cmk)的残基在Ramachandran图的有利区中，其余残基在允许区中。数据收集和提炼统计量总结在表2中。所有结构图均用PyMolLLC)产生。
荧光肽切割测定
用Fmoc固相肽合成(GenScript)合成内部猝灭荧光肽，该内部猝灭荧光肽N端具有7-methoxycourmain-4-acetate(Mca)和mini-PEG1(8-氨基-3,6-二氧杂辛酸)，二硝基苯酚(Dnp)附着于C端附近的次末端赖氨酸侧链。将肽加至37℃的含50nMNSP4或100nM因子Xa(EnzymeResearchLaboratories)的50mMTrispH8.0、150mMNaCl、2mMCaCl2中。用SpectraMaxM5(MolecularDevices)以328nm激发和393nm发射进行酶动力学测量。用Prism5(GraphPadSoftware)用标准Michaelis-Menten动力学模型拟合动力学数据，并产生标准曲线，以将来自荧光测量的催化速率(RFU/s)转化为每秒形成的纳摩尔产物(nM/s)。使用与含50nMNSP4或200nM因子Xa的50mMTrispH8.0、150mMNaCl、2mMCaCl2在37℃孵育1小时的荧光肽，用LC-MS来确认肽切割位点。在5-60％乙腈:水反相梯度上分开肽片段，然后在飞行时间质谱仪(Agilent)上分析。
肝素结合测定
用荧光偏振评估肝素结合，其中将荧光素缀合的肝素(Invitrogen)与纯化的重组NSP4混合。在三次独立测量中进行荧光偏振测定，并在配有485±30nm激发和535±40nm发射滤片的Victor3(PerkinElmer)上读数。为了通过电泳迁移率变动测定评估反应，将等体积的50％甘油加至NSP4:肝素混合物，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分开混合物，并用Typhoonimager(GEHealthcare)以蓝色(488nm)激光和526±20nm发射滤片检测荧光信号。
NSP4-/-小鼠的表征
按之前所述(Tang等,NatBiotechnol,2010,28:749–755)产生NSP4-/-小鼠，并与C57/BL6回交10代以上。用RT-PCR进行NSP4-/-小鼠中NSP4消除的确认和邻近蛋白酶基因表达的测定。用RNeasyMinikit(Qiagen)分离来自NSP4-/-小鼠或野生型同窝仔的总骨髓细胞的RNA，并用iScript反转录酶(Bio-Rad)合成相应的cDNA，均按厂家说明书进行。使用获自AppliedBiosystems的以下TaqMan引物/探针组(圆括号内为目录号)，用TaqMan2XPCR反应混合液(AppliedBiosystems)从cDNA样品进行qPCR：Prss57_1(ABIMm01144794_m1，跨外显子1-2)、Prss57_2(ABIMm01144795_m1，跨外显子2-3)、Prss57_3(ABIMm01144796_m1，跨外显子3-4)、Cfd(ABIMm01143935_g1，跨外显子4-5)、Elane(ABIMm01168928_g1，跨外显子1-2)、Gzmm(ABIMm00493150_m1，跨外显子2-3)、Prtn3(ABIMm00478323_m1，跨外显子1-2)、18srRNA(ABI4333760F)。
为了定量免疫细胞群体，用标准流式细胞术流程和以下抗体克隆鉴定来自NSP4-/-小鼠或野生型同窝仔的股骨骨髓的细胞：抗-CD11b(M1/70)、抗-CD11c(N418)、抗-B220(RA3-6B2)、抗-Ly6C(HK1.4)、抗-Ly6G(1A8)。所有抗体均获自eBioscience。用SytoxBlue(Invitrogen)评价活率。用FACSAria细胞分选仪(BDBiosciences)分选染色的细胞。分选并计数以下群体：B细胞、B220+、总髓样细胞、B220-/CD11b+、单核细胞、B220-/CD11b+/Ly6Chi、嗜中性粒细胞、B220-/CD11b+/Ly6Ghi。
K/BxN血清转移小鼠模型
通过小鼠全爪的非侵入性近红外荧光成像(NIRF)体内监测K/BxN血清诱导的血管通透性。通过2％异氟烷(ButlerSchein，1L/分钟流速)麻醉小鼠，植入尾静脉导管，通过医用胶带将爪固定在KodakIn-VivoFXPro400全动物NIRF成像系统(CarestreamHealth)的成像面玻璃上来固定。小鼠通过尾静脉导管注射100μl血库探针AngioSense680(PerkinElmer)，按1分钟间隔成像(650nm激发/700nm发射，21.4mmFOV，10秒暴露，2xbinning)5分钟，以建立基线荧光，然后尾静脉导管注射75ulK/BxN血清，并再成像25分钟。用于此模型的K/BxN血清源自显示严重关节炎的KRNxNODF1小鼠。用MatLab(MathWorks)中的自定义程序定量爪内的平均荧光强度和荧光强度从初始成像时间点的倍数变化。
血管通透性分析之后，每天评估关节炎，评估8天。如通过组合0(正常关节外观)至4(最大红斑和水肿)的单爪评分所赋值，每只动物的临床评分在从0至16的范围内。针对红斑和水肿分析了以下关节：跗关节或腕关节、跖关节或掌关节、跖趾关节或掌指关节、或趾(指)节。
小鼠关节炎爪的组织学检查
爪在中性缓冲福尔马林中固定，脱钙，并常规处理至苏木精和伊红染色的矢状半切片。检查每只动物的全部四只爪。在从0(正常)至5(严重)的任意量表上针对以下特征评分组织学损伤：炎性细胞浸润、纤维组织形成包括血管翳形成、软骨损伤和骨重建。
结果
NSP4S1结合袋的动力学表征
考察了NSP4识别P1精氨酸残基的能力，尤其是根据NSP4S1结合袋中似乎准备阻碍精氨酸结合的F190和S216残基(图2A)。位于S1袋开口对侧的NSP4残基F190和S216可能作为活动门发挥作用，以允许接近S1袋。如果是这样，则作为D189(NSP4中的G189)替代的D226可稳定P1精氨酸侧链(图2A)(13，14)。为了测试此假说，改造了具有部分开放(F190A或S216G)或完全开放(F190A:S216G)“门”的NSP4突变体，如果该假说是正确的，则它们应全都提高酶活性。为了测量对NSP4活性的影响，合成了通过NSP4在作为P1残基的精氨酸之后特异性切割的荧光肽1IRR3↓4SSYSFKK10(图2C)。结果显示，与野生型相比，单突变体(F190A或S216G)和双突变体F190A:S216G具有降低约10倍和4倍的活性(kcat/KM)(图2D)。这些结果不支持活动门假说，但表明F190和S216都对放置底物以使得能够催化至关重要。
NSP4的晶体结构
为了阐明P1精氨酸识别机制的结构基础，在分辨率测定了具有模拟D-Phe-L-Phe-L-Arg氯甲基酮的共价结合底物(FFR-cmk)的NSP4的X射线晶体结构。此外，测定了和分辨率的NSP4在其apo形式中的两个非同晶结构(表2)。所有结构均显示胰蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶的双β-桶和催化三联体排列特征(图3A)。NSP4还具有可发挥作用来将NSP4定位至蛋白聚糖的延长的碱性表面斑块(图4A)。与此观点一致，NSP4在荧光偏振和电泳迁移率变动测定中显示强肝素结合(图4B)。NSP4结构的叠加还显示形成S2/S4底物相互作用部位的99-环(图3A)不稳定，可能涉及如针对其他丝氨酸蛋白酶所证明的NSP4别构调节(Ganesan等,Structure,2009,17:1614–1624；Debela等,JMolBiol,2007,373:1017–1031)。
表2.数据和提炼特征。
*圆括号中的值用于最高分辨率壳。
NSP4精氨酸特异性的结构基础
活性部位的结构细节揭示了前所未有的机制，通过该机制识别底物P1精氨酸，且目前通过该机制解释了NSP4谜团。结构显示典型S1袋不存在，因为它完全被F190和S216堵塞(图3B和图5)。F190和S216侧链高度有序，与缺乏“门”机制一致；相反，残基F190和S216形成堵塞的S1袋上方浅沟的底部，以容纳重定向的精氨酸侧链(图3B)。通过Cβ-Cγ键(Chi2角)旋转160度来实现NSP4中从典型的“下”位至新的“上”位的精氨酸侧链移动(图6A)。另外，催化三联体、氧阴离子穴和FFR肽的经典Cα痕迹，包括蛋白酶214-216残基和底物P1-P3残基之间的反向平行主链相互作用，全都得以保留。F190支持P1精氨酸的“上”构象，F190提供优选与P1精氨酸侧链的脂肪族部分相互作用的疏水平台。此外，对P1精氨酸的特异性由涉及通过三个H键受体(S216和S192侧链及G217主链羰基氧)配位的胍基的H键网络赋予(图6B)。因此，NSP4用位于堵塞的S1袋上方的新的H键网络取代典型胰蛋白酶样S1袋内占主导地位的P1精氨酸稳定静电相互作用。通过突变两个H键受体S192和S216来检查了此H键网络对催化的重要性。单H键受体突变体显示降低10倍的活性，而去除两个H键受体(S192A:S216G)导致降低20倍(图6C)。
虽然NSP4对P1赖氨酸(P1-Lys)底物活性弱，但可能制备NSP4与模拟D-Val-L-Leu-L-Lys(VLK)-cmk的共价结合赖氨酸底物的复合物，并获得分辨率的晶体结构。显示P1赖氨酸侧链采用类似P1精氨酸构象的构象(图7)。但是，与较长的P1精氨酸测量不一样，较短的P1赖氨酸侧链不能像P1精氨酸一样衔接齐全的H键，从而解释了P1赖氨酸残基之后极其弱的切割(图2C)。
NSP4处理具有修饰精氨酸的底物
在评价独特的NSP4活性部位的正交方法中，检查了NSP4对具有修饰P1精氨酸的肽底物的活性。天然存在的精氨酸衍生物甲基精氨酸对胰蛋白酶样蛋白酶切割具有抗性，因为甲基精氨酸侧链在空间上不能容纳在窄的S1袋内(Baldwin等,Science,1971,171:579–581；Asami等,BioorgMedChemLett,2012,22:6328–6332)。此结构限制不适用于NSP4。由于P1精氨酸胍基溶剂暴露于NSP4，合理的是，NSP4可适应对精氨酸胍基的修饰，如额外的甲基。肽底物酶促测定证明，NSP4确实可以在甲基精氨酸之后切割，而具有典型S1袋的胰蛋白酶样蛋白酶因子Xa仅可切割未修饰的P1-Arg底物(图6D和图8)。
实施例2：用NSP4缺陷小鼠确定NSP4的生物学作用
作为探究NSP4体内功能的第一步，用嗜中性粒细胞依赖性K/BxN血清转移关节炎模型考察了NSP4在炎症中可能的作用(Monach等,CurrProtocImmunol,2008,Chapter15:Unit15.22)。之前已将NSP与炎性关节炎相关联，但需要NE和CG二者的组合缺陷来在实验性关节炎模型中达到完全保护，表明NSP中的功能冗余。但是，鉴于NSP4独特的精氨酸特异性及其进化地位，推测NSP4可能在嗜中性粒细胞介导的炎症过程中具有必需功能。为了考察NSP4在炎症中的作用，按之前所述(Tang等,NatBiotechnol,2010,28:749–755)产生NSP4缺陷小鼠(图9A)，并与C57BL/6品系回交。使用跨三个不同NSP4外显子边界的不同PCR引物/探针组，通过RT-qPCR验证NSP4-/-小鼠中NSP4的成功消除(图9B)。以类似方式，还针对此蛋白酶富集基因座中NSP4侧翼蛋白酶基因的表达分析了NSP4-/-小鼠。没有一个邻近蛋白酶基因(包括NSP成员NE和PR3)受影响(图9B)。NSP4缺陷小鼠存活且可育，在全面表型筛查中未显示明显异常(Henrich等,NatStructBiol,2003,10:520–526)，且具有正常的骨髓细胞、B细胞、单核细胞、髓样细胞和嗜中性粒细胞计数(图9C)。
K/BxN模型的一个主要标志是静脉内施用K/BxN血清后小鼠爪中局部血管性水肿快速发病(Binstadt等,NatImmunol,2006,7:284–292)。为了监测脉管渗漏，在K/BxN血清注射前5分钟对NSP4缺陷和野生型小鼠施用近红外荧光血管探针，然后通过体内近红外荧光成像显示和定量随后的血管通透性变化(图10A和B)。静脉内施用K/BxN血清后，如预期，野生型小鼠以可重现的严重度和动力学显示爪中血管探针的快速溢出。形成鲜明对比的是，NSP4-/-小鼠的荧光水平在整个研究过程中保持在基线(图10A和B)，表明NSP4在介导此免疫复合物引发的血管通透性反应中发挥不可或缺的作用。
野生型小鼠中K/BxN血清转移后脉管渗漏的初始诱导之后，发生红斑和水肿，而NSP4-/-小鼠在8天的诱导后时期内保持显著受保护(图11A)。实验终点爪的病理学检查显示野生型对照组中轻度至中度多发性关节炎，而NSP4-/-小鼠基本无损伤(图11B和11C)。在野生型小鼠中，所观察到的多发性关节炎与K/BxN模型一致，表征为伴随轻度纤维组织形成的炎症细胞(主要为嗜中性粒细胞)浸润、软骨损伤和骨重建(图11C)。相反，NSP4-/-小鼠具有最小的病理学损伤(图11C，中右)，基本无炎症细胞浸润(图11C，下右)。概括起来，这些结果显示，NSP4在此嗜中性粒细胞介导的疾病模型中发挥不可或缺的促炎症作用。
实施例3：构象特异性和物种特异性NSP4抗体的产生
产生一系列抗体，并针对对NSP4的特异性进行表征。残基用Kabat系统(Kabat等,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))编号。
方法
重组人和小鼠NSP4的产生
产生重组人NSP4和小鼠NSP4作为抗原用于文库分选。通过在蛋白质N端改造可切割附加表位以防止过早激活来作为无活性的酶原产生NSP4，从而降低细胞毒性，提高异源表达系统中的蛋白质表达。产生了总计四种NSP4抗原：人酶原(hZ)、人活性(hA)、小鼠酶原(mZ)和小鼠活性(mA)。在昆虫细胞中表达hZNSP4，并用固定化金属亲和层析通过N端6His标记纯化。在CHO细胞中表达mZNSP4，并用抗FLAG亲和层析通过N端FLAG标记纯化。hZ和mZNSP都用Superdex200大小排阻层析(GEHealthcare)和MonoS阳离子交换层析(GEHealthcare)进一步纯化。通过用Ekmax肠肽酶(Invitrogen)处理纯化的酶原形式(hZ和mZ)去除N端附加表位来产生这些NSP4的催化活性形式(hA和mA)，随后在另一MonoS阳离子交换层析(GEHealthcare)上纯化至同质。切割发生在氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys后的赖氨酸的C端一侧。这四种NSP4抗原(hZ、hA、mZ和mA)平行用于噬菌体文库分选，并用于筛选构象特异性和物种特异性抗NSP4抗体(图12)。
用于文库构建的噬菌粒载体
用修饰的编码h4D5的噬菌粒pV0350-4(作为模板)上的三个重链互补决定区(CDR)中的寡核苷酸定向诱变产生噬菌体展示的合成抗体文库，并描述为Lib-3(参见Lee等,2004.JMolBiol340:1073-1093)。对于首次用于实验的文库的初始筛选，将hZ-、hA-、mZ和mA-NSP4各自分别固定在Maxisorp免疫平板(Nunc)上，使噬菌体文库在磷酸缓冲盐溶液中的高盐条件下循环通过4轮结合选择(参见Lee等,JMolBiol,2004,340:1073-1093)，该磷酸缓冲盐溶液补充了1％BSA或酪蛋白(BSA在第1和3轮，酪蛋白在第2和4轮)、0.1％Tween-20和附加的0.5MNaCl，以减少带正电荷的NSP4蛋白质与带负电荷的噬菌体颗粒之间的非特异性相互作用。挑取从第3和4轮选择的随机克隆并测定，以用噬菌体酶联免疫吸附测定(ELISA)鉴定特异性结合剂。通过聚合酶链反应(PCR)扩增所选择的结合于NSP4的克隆的VH区进行测序。
竞争噬菌体ELISA
通过在30ml补充羧苄青霉素和KO7辅助噬菌体的2YT培养基中30℃过夜培养来从单菌落繁殖噬菌体克隆，纯化，并按所述(参见Lee等,JMolBiol,2004,340:1073-1093)测定。亚饱和浓度的噬菌体先与递增浓度的靶NSP4抗原(hZ、hA、mZ或mA)孵育1至2小时，然后转移至用相同NSP4抗原包被的孔，以捕获未结合的噬菌体。按之前所述(参见Lee等,JMolBiol,2004,340:1073-1093)，用抗M13抗体-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(GEHealthcare)测量结合噬菌体的量，用底物四甲基联苯胺(TMB)(KirkegaardandPerryLaboratories)显色约5分钟，用1.0MH3PO4猝灭，用分光光度计在450nm波长读数。将抑制浓度(IC50)值计算为抑制噬菌体与固定化抗原结合的50％的可溶性抗原浓度。
抗NSP4抗体产生和亲和力测量
为了产生IgG蛋白质用于表征，将所选择的噬菌体克隆的可变结构域克隆入具有人轻链或重链(人IgG1)恒定区的基于pRK5的质粒，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行瞬时IgG表达，并用蛋白A亲和层析纯化。
用生物层干涉量度法测量(ForteBio)来测定抗NSP4抗体对全部四种NSP4抗原(hZ、hA、mZ和mA)的亲和力。将5μg/ml的各抗NSP4候选物固定在抗人Fc传感器上，并与递增浓度的各NSP4抗原孵育，以获得亲和力测量结果。然后将这些抗体候选物分入以下种类之一：1)构想和物种特异性：结合hZ、hA或mA(未鉴定出mZ特异性结合剂)；2)构象特异性：结合活性(hA/mA)或酶原(hZ/mZ)形式的NSP4；3)物种特异性：结合人(hZ/hA)或小鼠(mZ/mA)形式的NSP4；和4)泛NSP4：结合全部四种形式的NSP4(hZ/hA/mZ/mA)。
筛选NSP4阻断抗体
通过用NSP4筛选一系列内部猝灭荧光肽底物(参见Eigenbrot等,Structure,2012,20:1040-1050)来设计NSP4荧光活性测定。将50nMNSP4与含2.5uM各荧光猝灭肽底物的50mMTrispH8.0、200mMNaCl和0.25％w/wCHAPS孵育，并用SpectraMaxM5分光光度计(MolecularDevices)以328nm激发和393nm发射测定荧光强度。NSP4最有效切割的肽底物是Mca-Ile-Arg-Arg-Ser-Tyr-Ser-Phe-Lys[Dnp]-Lys，其中Mca是7-methoxycoumarin-4-acetate，Dnp是二硝基苯酚。与NSP4孵育导致特异性切割，产生两个不同片段：Mca-Ile-Arg-Arg和Ser-Tyr-Ser-Phe-Lys[Dnp]-Lys。
为了鉴定阻断性抗NSP4抗体候选物，将10nM重组人或小鼠NSP4与500nM各抗体候选物在37℃孵育30分钟。然后将此NSP4:抗体混合物与6.7uM荧光肽底物混合，在37℃孵育5分钟，然后用上述参数在SpectraMaxM5分光光度计上读数。
结果
分离了在重链可变结构域(VH)文库淘选期间强烈结合于NSP4的三个抗体候选物，并用来产生IgG1抗体进行进一步表征(图13)。抗体候选物5-2、5-3和5-4证明对活性小鼠(mA)NSP4抗原的高度结合特异性(分别为图14A、14B和14C)。抗体候选物5-2、5-3和5-4的评价证明其阻断小鼠NSP4肽切割活性的能力(图15)。此外，这些抗体不阻断人NSP4的肽切割活性，表明5-2、5-3和5-4为对小鼠NSP4物种特异(图15)。
抗人NSP4的抗体可以用本文所述方法产生。
抗体序列
抗体5-2’的重链CDR1
GFTFSNTYIS(SEQIDNO:1)
抗体5-2’的重链CDR2
GFIYPANGATYYADSVKG(SEQIDNO:2)
抗体5-2’的重链CDR3
RRYRLSFDY(SEQIDNO:3)
抗体5-3’的重链CDR1
GFTFSGNDIS(SEQIDNO:4)
抗体5-3’的重链CDR2
AGISPYGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:5)
抗体5-3’的重链CDR3
RRVSFYSRHAGMDY(SEQIDNO:6)
抗体5-4’的重链CDR1
GFTFTSYAIS(SEQIDNO:7)
抗体5-4’的重链CDR2
AGISPSNGYTNYADSVKG(SEQIDNO:8)
抗体5-4’的重链CDR3
RAGRWTHSDIDY(SEQIDNO:9)
抗体5-2’、5-3’和5-4’的轻链CDR1
RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)
抗体5-2’、5-3’和5-4’的轻链CDR2
SASFLYS(SEQIDNO:11)
抗体5-2’、5-3’和5-4’的轻链CDR3
QQSYTTPPT(SEQIDNO:12)
抗体5-2’的重链可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNTYISWVRQAPGKGLEWVGFIYPANGATYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRRYRLSFDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:13)
抗体5-3’的重链可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGNDISWVRQAPGKGLEWVAGISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRRVSFYSRHAGMDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:14)
抗体5-4’的重链可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAISWVRQAPGKGLEWVAGISPSNGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRAGRWTHSDIDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:15)
抗体5-2’、5-3’和5-4’的轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:16)
实施例4：NSP4mRNA和蛋白质表达水平的表征
测量了多种小鼠细胞类型中NSP4的mRNA和蛋白质表达水平二者，以分析该细胞类型中NSP4的存在。
方法
NSP4mRNA水平的RT-qPCR测量。为了定量来自小鼠股骨骨髓的免疫细胞群体中NSP4的mRNA表达水平，进行了RT-qPCR分析。用标准流式细胞术流程和以下抗体克隆鉴定来自小鼠股骨骨髓的免疫细胞群体：抗-CD11b(M1/70)、抗-CD11c(N418)、抗-B220(RA3-6B2)、(BM8)、抗-Ly6C(HK1.4)、抗-Ly6G(1A8)和抗涎免凝集素F(E50-2440)。所有抗体均获自eBioscience。用SytoxBlue(Invitrogen)评价活率。用BDBiosciencesFACSAria细胞分选仪分选染色的细胞。分选以下群体用于下游分析：B细胞、B220+CD11b-、单核细胞、Ly6C+CD11b+、嗜中性粒细胞、Ly6G+CD11b+、嗜酸性粒细胞、涎免凝集素F+CD11b+。用RNeasyMinikit(Qiagen)从各细胞类型分离总RNA内含物，并用iScript反转录酶(Bio-Rad)合成相应的cDNA，均按厂家说明书进行。使用以下三个NSP4/Prss57引物/探针组(AppliedBiosystems)，用TaqMan2XPCR反应混合液(AppliedBiosystems)从cDNA样品进行qPCR：Prss57_1(ABIMm01144794_m1)、Prss57_2(ABIMm01144795_m1)和Prss57_3(ABIMm01144796_m1)。基因表达水平表示为相对于小鼠18SrRNA对照的2^(-dCt)。
NSP4蛋白质的Western印迹检测。为了测量NSP4蛋白质在来自小鼠股骨骨髓的免疫细胞群体中的存在，用兔抗小鼠NSP4多克隆抗体进行了Western印迹分析。按厂家说明书进行，用小鼠嗜中性粒细胞阴性选择试剂盒(MiltenyiBiotec)从总骨髓细胞分离骨髓来源的嗜中性粒细胞。按Dyer等,2008.JImmunol181(6):4004-4009中所述从骨髓细胞分离并培养骨髓来源的嗜酸性粒细胞。按Lukacs等,1996,Blood87(6):2262-2268中所述从骨髓细胞分离并培养骨髓来源的肥大细胞。按Zhang等,2008.CurrProtocImmunol,Unit14.1所述从骨髓细胞分离骨髓来源的巨噬细胞。用SDS-Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)产生细胞裂解物，并用BCA蛋白质测定(Pierce)测定浓度。
结果
NSP4mRNA水平的RT-qPCR测量。进行RT-qPCR分析来测量NSP4在从小鼠股骨骨髓分离的免疫细胞群体中的mRNA表达水平。使用跨三个不同外显子连接的三个不同NSP4/Prss57引物/探针组的RT-qPCR测量结果证实B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞中的NSP4mRNA表达水平(图16)。如图16A-C所示，NSP4mRNA在嗜酸性粒细胞中非常高地表达，测量结果显示单核细胞中存在NSP4mRNA表达。NSP4转录物在完全分化的嗜中性粒细胞中非常低，因为NSP4基因的转录主要发生在成髓细胞阶段，在完全分化的嗜中性粒细胞中停止。参见Theilgaard-Monch等,Blood105:1785-1796,2005。
NSP4蛋白质的Western印迹检测。用兔抗小鼠NSP4多克隆抗体进行Western印迹分析来测量NSP4在从小鼠股骨骨髓分离并培养的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的蛋白质表达水平(图17)。如所示，在从野生型小鼠分离的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中检测到了NSP4蛋白质(约30kD)，但在来自野生型小鼠的肥大细胞或巨噬细胞中未检测到NSP4。在来自NSP4缺陷小鼠的细胞中未检测到NSP4。
实施例5：嗜中性粒细胞募集需要NSP4
为了确认NSP4-/-小鼠中缺乏嗜中性粒细胞关节浸润，在野生型和NSP4-/-小鼠中通过基于鲁米诺的生物发光成像监测了嗜中性粒细胞募集。
方法
小鼠爪中嗜中性粒细胞髓过氧化物酶活性的鲁米诺-生物发光成像。通过小鼠爪的非侵入性生物发光成像(BLI)体内监测髓过氧化物酶(MPO)活性。通过2％异氟烷(ButlerSchein,1L/分钟流速)麻醉小鼠，植入尾静脉导管，并放置在Photon成像仪(BiospaceLab,巴黎,法国)内的加热台上。小鼠通过尾静脉导管注射75ulK/BxN血清和150ulMPO敏感鲁米诺(Sigma-Aldrich)的混合物。对于每只小鼠，注射混合物后按5分钟、6小时和24小时间隔记录光发射8分钟。将生物发光伪彩色图像叠加显示在小鼠的灰度明场图像上，最强信号为红色，最弱信号为蓝色。对于鲁米诺信号的定量分析，在生物发光图像上的全部四只爪上画出目的椭圆区域(ROI)。使ROI的面积保持恒定，用M3Vision软件(BiospaceLab)将结果表示为每分钟每cm2的光子计数。
为了验证髓过氧化物酶在NSP4缺陷小鼠中的表达，用小鼠嗜中性粒细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)从股骨骨髓分离嗜中性粒细胞，用2XLaemmli缓冲液(Bio-Rad)制备总细胞裂解物。分别用抗髓过氧化物酶小鼠单克隆抗体(克隆392105；R&DBiosystems)和抗-β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体(克隆8H10D10；CellSignalingTechnology)检测髓过氧化物酶和肌动蛋白。
结果
进行了嗜中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)活性的基于鲁米诺的生物发光成像，以对小鼠爪中的嗜中性粒细胞进行成像(图18A)。NSP4缺陷嗜中性粒细胞表达正常水平的MPO(图18B)，因此可以用鲁米诺-生物发光水平作为替代标记用于监测嗜中性粒细胞募集。参见Gross等,2009,Nat.Med.15::455-461。NSP4-/-小鼠在K/BxN血清转移后24小时显示显著降低的嗜中性粒细胞髓过氧化物酶活性(图18C)，表明NSP4在介导体内嗜中性粒细胞变移和关节浸润中的重要作用。这些光学成像结果与在上文所述组织学检查中观察到的嗜中性粒细胞浸润的缺乏一致，从而确认NSP4-/-小鼠中缺乏嗜中性粒细胞关节浸润。
实施例6：抗体3-5和5-1的亲和力改善
通过优化其抗体轻链序列来以更高亲和力结合NSP4，对抗体克隆3-5和5-1进行了亲和力成熟。
方法
用于源自VH文库的克隆3-5和5-1的亲和力改善的文库构建。选择抗体克隆Ab3-5(缩写为Ab35)和Ab5-1(缩写为Ab51)进行进一步的亲和力改善。用在所有CDR-L3位置包含终止密码子(TAA)并在M13噬菌体表面展示单价Fab的噬菌粒pW0703(源自噬菌粒pV0350-2b(Lee等,J.Mol.Biol340,1073-1093(2004))作为文库模板，用于移植来自VH文库的目的克隆的重链可变结构域(VH)进行亲和力成熟。硬性和软性随机化策略都用于亲和力成熟。对于硬性随机化，用设计用于模拟天然人抗体的氨基酸随机化具有三个轻链CDR的所选位置的一个轻链文库，且所设计的DNA简并性如Lee等(J.Mol.Biol340,1073-1093(2004))中所述。对于软性随机化，靶向CDR-L3的91-96位，CDR-H1的30-33、35位，CDR-H2的50、52、53-54、56和58位，CDR-H3的95-100、100A和100C位的残基；选择CDR环的三个不同组合H1/L3、H2/L3和H3/L3进行随机化。为了达到软性随机化条件(其在所选择的位置引入约50％的突变率)，用偏向野生型核苷酸的70-10-10-10碱基混合物合成诱变DNA(Gallop等,JournalofMedicinalChemistry37:1233-1251(1994))。
产生亲和力改善的噬菌体分选策略。对于亲和力改善选择，对噬菌体文库进行一轮平板分选，然后进行严格性递增的三轮附加溶液分选。对于第一轮，使用平板分选策略，其中将1％BSA和0.05％Tween20中3OD/ml的噬菌体输入与5ug/ml小鼠NSP4按100ul/孔含1％BSA和0.05％Tween-20的缓冲液在室温下轻轻摇动孵育1.5小时。用PBS-0.05％Tween-20洗涤孔10次。用150μl/孔50mMHCl、500mMKCl洗脱结合的噬菌体30分钟，随后通过50μl/孔1MTrispH8中和，滴定，并繁殖用于下一轮。对于第二至四轮，使用溶液分选策略，选择严格性递增。具体而言，将20nM(第2轮)、5nM(第3轮)和0.5nM(第4轮)的生物素化小鼠NSP与500nM未标记mNSP4竞争剂一起使用，以选择结合速率和解离速率改善的结合剂。为了测定背景结合，在neutravidin包被平板上捕获含噬菌体的对照孔。用150μl/孔50mMHCl、500mMKCl洗脱捕获在neutravidin包被孔上的结合噬菌体30分钟，随后通过50μl/孔1MTrispH8中和，滴定，并繁殖用于下一轮。
表位定位。将重组小鼠NSP4与缓冲液单独、NSP4抗体5-1(Fab型式)或与10ug/ml硫酸肝素(SigmaAldrich)在室温下在磷酸缓冲盐溶液中预孵育15分钟。然后将50nM的此小鼠NSP4混合物与用按1XKineticBuffer(PallCorporation)中40ug/ml固定的NSP4抗体包被的光学传感器孵育。用Octet生物层干涉量度法(PallCorporation)测量结合。
结果
在噬菌体IC50实验中测试多个抗体克隆以估计其对NSP4的结合亲和力。简言之，将2ug/mlNSP4(hZ、hA、mZ或mA变体)在补充0.5％BSA的PBS中4℃过夜包被在孔上。纯化每一单个噬菌体克隆(按0.01OD/ml)，并与浓度递增的可溶性NSP4蛋白质室温孵育2小时，然后放入固定化NSP4蛋白质包被的孔中，室温15分钟。然后用补充0.05％Tween-20的PBS洗涤孔10次，并用与HRP缀合的抗M13噬菌体抗体(NewEnglandBiolabs)显色。如图19中所示，较高亲和力的噬菌体克隆将比较低亲和力的噬菌体克隆更有可能在较低抗原浓度下保持与可溶性抗原结合，导致在15分钟孵育期间与包被在孔上的固定化抗原的结合更少。具有更高可能性是高亲和力噬菌体克隆的可溶性噬菌体:抗原复合物因此将通过连续的洗涤步骤去除，导致任意给定的可溶性抗原浓度下更低的A450信号。因此，较高亲和力噬菌体克隆将具有较低噬菌体IC50值，与较低亲和力噬菌体克隆相比，伴随结合曲线的左移。下文表3和4中提供这些克隆的HVR序列。表3和4中的每种抗体使用相同的轻链，该轻链包含对应于SEQIDNO:16的轻链可变区，及分别对应于SEQIDNO:19、11和12的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
表3.抗NSP4抗体的HCHVR序列。
表4.抗NSP4抗体的重链可变区序列，CDR序列下划线。
图19显示用可溶性hZ-、hA-、mZ-或mA-NSP4作为竞争剂(如所标记)的噬菌体IC50实验的结果。在这些实验中，较高亲和力克隆在较低可溶性NSP4浓度下结合于可溶性NSP4，因此具有左移的曲线。根据这些结果，纯化了单个克隆，并表达用于进一步表征。这些结果总结在下表中。
表8.NSP4特异性抗体噬菌体克隆的噬菌体IC50值的总结。
用生物层干涉量度法测量进一步表征这些抗体，以估计对不同NSP4蛋白质(即hZ、hA、mZ和mA，如所标记)的亲和力(kD)。图20A和B分别显示抗体1-1和1-2的结果。图21A和B分别显示抗体1-3和1-5的结果。图22A-D分别显示抗体2-1、2-2、2-3和2-4的结果。图23显示抗体2-5的结果。图24A和B分别显示抗体3-2和3-5的结果。图25A-C分别显示抗体4-2、4-3和4-4的结果。图26A-D分别显示抗体5-1、5-2、5-3和5-4的结果。这些结合数据表明一系列具有不同NSP4结合特征的抗体，从高度构象特异和物种特异的抗体(例如对hZ-NSP4、hA-NSP4或mA-NSP4之一特异，如抗体1-2、4-3和5-3)，到构象特异但不是物种特异的抗体(例如对酶原-NSP4或活性-NSP4特异，如抗体2-2、2-5和5-1)，到物种特异但不是构象特异的抗体(例如对人-NSP4或小鼠NSP4特异，如抗体3-2、4-2和4-4)，最后到是泛NSP结合剂的抗体(例如结合处于其酶原和活性构象状态的人和小鼠NSP4，如抗体2-1、2-3、2-4和3-5)。
针对阻断NSP4酶活性的能力进一步测试抗体。测试了阻断人和小鼠NSP4的能力。图27显示抗体对酶原NSP4的影响。图28显示抗体对活性NSP4的影响。如图28中所示，抗体4-3和4-4阻断人NSP4活性，而5-系列抗体中的每一种都阻断小鼠NSP4活性。抗体的体外特性总结在图29中。
不希望受限于理论，由于其阻断NSP4酶活性的能力及其优先与活性形式而不是酶原形式的NSP4结合，推测5-系列抗体在靠近酶活性部位处结合NSP4，酶活性部位是在蛋白酶激活过程中经历显著构象变化的区域。相反，由于其不能阻断NSP4酶活性及其构想不敏感性，推测3-系列抗体在远离酶活性部位处结合NSP4。在图30和31中所示的一些列实验中确认了关于抗体表位的此假设。
如图30中所示，Fab5-1干扰Ab5-1、5-2和5-4与小鼠NSP4结合，但不干扰Ab3-2或3-5与小鼠NSP4结合。类似地，如图31中所示，肝素对Ab5-1、5-2和5-4与NSP4的结合具有非常小的影响，但能够显著减少Ab3-2和3-5与NSP4的结合。这些结果表明，Ab5-1、5-2、5-4在酶活性部位附近结合；相反，Ab3-2和3-5在远离酶活性部位的肝素结合部位附近结合。
选择抗体克隆3-5(下文称为Ab35)和5-1(下文称为Ab51)进行进一步的亲和力改善(按上文所述进行)。由于其结合人和小鼠NSP4二者及酶原和活性构象二者的能力而选择Ab35。由于其以5-系列抗体中最高的效力抑制小鼠NSP4催化活性的能力而选择Ab51。
表5和6列出了抗体3-5(在以下表格中称为35.WT)的亲和力成熟变体(标记为35.XX)和抗体5-1(在以下表格中称为51.WT)的亲和力成熟变体(标记为51.XX)。表5中列出重链HVR序列；表6中列出轻链HVR序列。
表5.亲和力成熟的抗NSP4抗体的HCHVR序列。
表6.亲和力成熟的抗NSP4抗体的LCHVR序列。
克隆 HVR-L1 SEQ ID HVR-L2 SEQ ID HVR-L3 SEQ ID
35.WT RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYTTPPT 12
35.14 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYGFPLT 92
35.50 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYDFPLT 93
35.62 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSAGFPLT 9480 -->
共有序列 QQSX1X2X3PX4T 95
35.77 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQAYSAPPT 96
51.WT RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYTTPPT 12
51.30 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYTAPPT 97
51.50 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQANSTPPT 98
51.51 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYTAPPT 97
51.59 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQNFSSPPT 99
51.72 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQSYTAPPT 97
51.82 RASQDVS 19 SASFLYS 11 QQTYNAPPT 100
共有序列 QQX1X2X3X4PPT 101
表7列出抗体3-5(在下表中称为35.WT)的亲和力成熟变体(标记为35.XX)和抗体5-1(在下表中称为51.WT)的亲和力成熟变体(标记为51.XX)的重链和轻链可变区序列。恒定区序列在表格下提供。
表7.亲和力成熟的抗NSP4抗体的HC和LC可变区序列。
CDR序列下划线。
HC恒定区序列(SEQIDNO:114)
ASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYASTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
LC恒定区序列(SEQIDNO:115)
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
在一系列噬菌体IC50实验中估计亲和力成熟的抗体克隆的改善。图32显示来自Ab35的亲和力成熟抗体克隆对人和小鼠NSP4的亲和力。图33显示来自Ab51的亲和力成熟抗体克隆对人NSP4的亲和力。如所示，Ab35克隆的亲和力改善得没有Ab51克隆多。不希望受限于理论，这可以是由于Ab35以更高的亲和力起始。相反，Ab51的亲和力显著改善(超过500x)。
表9总结通过其在噬菌体竞争结合测定中的IC50值测定的亲和力成熟的抗体克隆的改善。
表9.亲和力成熟的抗体。
Ab克隆 mNSP4IC50(nM) hNSP4IC50(nM) 对mNSP4的亲和力改善
35.WT 0.131 32.79 --
35.14 0.048 23.41 2.783 -->
35.50 0.075 22.75 1.7
35.62 0.206 25.69 0.6
35.77 0.064 -- 2.0
51.WT 18.670 -- --
51.30 0.116 -- 160.9
51.50 0.105 -- 178.0
51.51 0.296 -- 63.0
51.59 0.095 -- 196.0
51.72 0.375 -- 49.8
51.82 0.037 -- 504.6
通过探究和优化抗体轻链上用于结合NSP4的CDR序列，Ab35和Ab51相对于其亲本克隆亲和力分别改善至多2.7倍和504.6倍。亲和力成熟的Ab35和Ab51克隆都达到了对NSP4的目标皮摩尔亲和力，并以不同表位结合NSP4。不希望受限于理论，认为Ab35来源的克隆在肝素结合部位处结合NSP4，而Ab51来源的克隆在靠近其酶活性部位处结合NSP4。
实施例7：NSP4体内催化活性
为了确认NSP4的酶活性与在K/BxN血清转移小鼠模型中观察到的疾病表型相关，在具有野生型NSP4、NSP4敲除和无催化活性的NSP4敲入(例如，在其NSP4蛋白质序列中具有S224A突变的小鼠)的小鼠中比较了K/BxN模型。在这三种小鼠品系的每一个中，用NIRF、鲁米诺-生物发光成像和组织学检查体内监测血清诱发的血管通透性。如果表达无催化活性的NSP4蛋白质的小鼠在K/BxN模型中显示类似于NSP4敲除小鼠的保护，则此结果可以指示NSP4的催化活性与疾病表型相关，NSP4催化活性的抑制剂(例如抗体NSP4抗体，如抗体51.WT、51.30、51.50、51.51、51.59、51.72、51.82)将可作为治疗剂用于与NSP4活性相关的多种血管障碍和炎性障碍。
实施例8：小鼠模型中的NSP4活性抑制
在小鼠K/BxN模型中测试抗NSP4抗体，以确认抗体抑制NSP4活性保护在野生型NSP4K/BxN模型中观察到的疾病表型。在存在或缺乏抗NSP4抗体的情况下按上文所述攻击K/BxN小鼠。在K/BxN模型中测试了结合NSP4的肝素结合部位(例如35系列抗体35.WT、35.14、35.50、35.62和/或35.77)或抑制NSP4的催化活性(51系列抗体51.WT、51.30、51.50、51.51、51.59、51.72和/或51.82)的NSP4抗体。结果与对照抗体(例如不结合NSP4的抗体)相比较。如果用抗NSP4抗体处理的小鼠在K/BxN模型中显示类似于NSP4敲除小鼠的保护，则此结果可以指示用抗NSP4抗体抑制NSP4将可作为治疗剂用于与NSP4活性相关的多种血管障碍和炎性障碍。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但该描述和实例不应理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地以其整体引入作为参考。

Claims (77)

1.抗NSP4抗体，其包含重链和轻链，其中：
(a)所述重链包含含有序列GFTFSDNDIS(SEQIDNO:50)的HVR-H1、含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2和含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和/或
(b)所述轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)的HVR-L3，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。
2.权利要求1的抗体，其中HVR-L3包含选自SEQIDNO:12和92-94的序列。
3.权利要求1的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。
4.权利要求1的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:102的轻链可变区。
5.权利要求1的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:103的轻链可变区。
6.权利要求1的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:78的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:104的轻链可变区。
7.抗NSP4抗体，其包含：(a)含有序列GSISPDNGDTNYADSVKG(SEQIDNO:51)的HVR-H2；(b)含有序列RDDVPAVFTSAMDY(SEQIDNO:52)的HVR-H3；和(c)含有序列QQSX1X2X3PX4T(SEQIDNO:95)的HVR-L3，其中X1是Y或A，X2是T、G或D，X3是T或F，X4是P或L。
8.抗NSP4抗体，其包含重链和轻链，其中：
(a)所述重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2和含有序列KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)的HVR-H3；和/或
(b)所述轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)的HVR-L3。
9.权利要求8的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:105的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:106的轻链可变区。
10.抗NSP4抗体，其包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)的HVR-H2；(b)含有序列KRHLHNVAFDY(SEQIDNO:87)的HVR-H3；和(c)含有序列QQAYSAPPT(SEQIDNO:96)的HVR-L3。
11.抗NSP4抗体，其包含重链和轻链，其中：
(a)所述重链包含含有序列GFTFSGSGIH(SEQIDNO:65)的HVR-H1、含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2和含有序列X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)的HVR-H3，其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F；和/或
(b)所述轻链包含含有序列RASQDVS(SEQIDNO:19)的HVR-L1、含有序列SASFLYS(SEQIDNO:11)的HVR-L2和含有序列QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)的HVR-L3，其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S。
12.权利要求11的抗体，其中HVRH3包含选自SEQIDNO:67、89和90的序列。
13.权利要求11或12的抗体，其中HVR-L3包含选自SEQIDNO:12和97-100的序列。
14.权利要求11的抗体，其中抗体包含：
(a)包含序列(a)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:66的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:67的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:12的HVR-L3；
(b)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:88的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:67的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:97的HVR-L3；
(c)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:66的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:67的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:98的HVR-L3；
(d)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:66的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:89的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:97的HVR-L3；
(e)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:66的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:90的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:99的HVR-L3；
(f)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:66的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:67的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:97的HVR-L3；
(g)含有序列SEQIDNO:65的HVR-H1、含有序列SEQIDNO:66的HVR-H2、含有序列SEQIDNO:89的HVR-H3、含有序列SEQIDNO:19的HVR-L1、含有序列SEQIDNO:11的HVR-L2和含有序列SEQIDNO:100的HVR-L3；
15.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:16的轻链可变区。
16.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:107的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:108的轻链可变区。
17.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:109的轻链可变区。
18.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:110的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:108的轻链可变区。
19.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:111的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:112的轻链可变区。
20.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:83的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:108的轻链可变区。
21.权利要求11的抗体，其中抗体包含含有序列SEQIDNO:110的重链可变区和/或含有序列SEQIDNO:113的轻链可变区。
22.抗NSP4抗体，其包含：(a)含有序列AWISPTGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:66)或序列AWIPTAGGNTYYADSVKG(SEQIDNO:88)的HVR-H2；(b)含有序列X1X2X3FHNVAFDY(SEQIDNO:91)的HVR-H3，其中X1是K或R，X2是S、G或V，X3是L或F；和(c)含有序列QQX1X2X3X4PPT(SEQIDNO:101)的HVR-L3，其中X1是S、A、N或T，X2是Y、N或F，X3是T、S或N，X4是T、A或S。
23.抗NSP4抗体，其特异性结合NSP4活性部位和/或抑制NSP4催化活性。
24.抗NSP4抗体，其特异性结合NSP4肝素结合部位和/或与肝素竞争结合NSP4。
25.权利要求1-24中任一项的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
26.权利要求1-24中任一项的抗体，其中抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的抗体片段。
27.权利要求1-26中任一项的抗体，其中抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
28.权利要求1-27中任一项的抗体，其中抗体特异性结合成熟形式的NSP4。
29.权利要求1-27中任一项的抗体，其中抗体特异性结合成熟形式的NSP4但不结合前体形式的NSP4。
30.权利要求1-29中任一项的抗体，其中抗体特异性结合人NSP4。
31.权利要求1-29中任一项的抗体，其中抗体特异性结合小鼠NSP4。
32.权利要求1-29中任一项的抗体，其中抗体特异性结合人NSP4和小鼠NSP4二者。
33.分离的核酸，其编码权利要求1-32中任一项的抗体。
34.载体，其包含权利要求33的核酸。
35.宿主细胞，其包含权利要求33的核酸。
36.用于产生抗体的方法，其包括在适于产生所述抗体的条件下培养权利要求35的宿主细胞。
37.权利要求36的方法，其进一步包括回收由所述宿主细胞产生的抗体。
38.抗NSP4抗体，其通过权利要求36或权利要求37的方法产生。
39.药物组合物，其包含权利要求1-32和38中任一项的抗NSP4抗体和可药用载体。
40.用于在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的方法，其包括对所述个体施用有效量的权利要求1-32和38中任一项的抗体。
41.权利要求40的方法，其中抗体特异性结合NSP4活性部位和/或抑制NSP4催化活性。
42.权利要求40的方法，其中抗体特异性结合NSP4肝素结合部位和/或与肝素竞争结合NSP4。
43.权利要求40的方法，其中对所述个体施用有效量的特异性结合NSP4活性部位和/或抑制NSP4催化活性的抗体，以及特异性结合NSP4肝素结合部位和/或与肝素竞争结合NSP4的抗体。
44.权利要求40-43中任一项的方法，其中疾病或障碍是嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍、嗜酸性粒细胞介导的疾病或障碍，或嗜碱性粒细胞介导的疾病或障碍。
45.权利要求44的方法，其中嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。
46.权利要求45的方法，其中血管病选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏和脑缺血。
47.权利要求45的方法，其中炎性疾病选自急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎和败血症性休克。
48.权利要求40-43中任一项的方法，其中疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、特发性肺纤维化、哮喘、变应性哮喘、病毒诱发性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、起泡性皮肤病、大疱性类天疱疮、炎性皮肤病、特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎、癌症、肺癌、肾病、肾小球性肾炎、败血症性休克、炎症性肠病、溃疡性结肠炎和克隆病。
49.权利要求40-48中任一项的方法，其中个体是人。
50.权利要求40-49中任一项的方法，其中抗体静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹腔内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。
51.权利要求40-50中任一项的方法，其中将所述抗NSP4抗体配制在包含所述抗体和可药用载体的药物组合物中。
52.用于在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的方法，其包括对所述个体施用有效量的NSP4抑制剂。
53.权利要求52的方法，其中疾病或障碍是嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍、嗜酸性粒细胞介导的疾病或障碍，或嗜碱性粒细胞介导的疾病或障碍。
54.权利要求53的方法，其中嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍选自血管病和炎性疾病。
55.权利要求54的方法，其中血管病选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏和脑缺血。
56.权利要求54的方法，其中炎性疾病选自急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎和败血症性休克。
57.权利要求52的方法，其中疾病或障碍选自中风、糖尿病性视网膜病变、水肿、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管性水肿、特发性血管性水肿、脉管渗漏、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性血管炎、脑缺血、急性肺损伤、过敏症、全身性过敏症、变应性肺炎、特发性肺纤维化、哮喘、变应性哮喘、病毒诱发性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、起泡性皮肤病、大疱性类天疱疮、炎性皮肤病、特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性蜂窝织炎、癌症、肺癌、肾病、肾小球性肾炎、败血症性休克、炎症性肠病、溃疡性结肠炎和克隆病。
58.权利要求52-57中任一项的方法，其中个体是人。
59.权利要求52-58中任一项的方法，其中NSP4抑制剂选自抗体、反义分子、siRNA、小分子抑制剂、蛋白酶抑制剂和肽抑制剂。
60.权利要求59的方法，其中蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂。
61.权利要求59的方法，其中蛋白酶抑制剂是α1-抗胰蛋白酶、肝素活化抗凝血酶、C1抑制剂或α2-抗纤溶酶。
62.权利要求52-59中任一项的方法，其中NSP4抑制剂是特异性结合NSP4的抗NSP4抗体。
63.权利要求52-59中任一项的方法，其中NSP4抑制剂是特异性结合成熟形式的NSP4的抗NSP4抗体。
64.权利要求52-59中任一项的方法，其中NSP4抑制剂是特异性结合成熟形式的NSP4但不结合前体形式的NSP4的抗NSP4抗体。
65.权利要求52-59中任一项的方法，其中NSP4抑制剂是特异性结合人NSP4的抗NSP4抗体。
66.权利要求52-59中任一项的方法，其中NSP4抑制剂是特异性结合小鼠NSP4的抗NSP4抗体。
67.权利要求52-59中任一项的方法，其中NSP4抑制剂是特异性结合人NSP4和小鼠NSP4二者的抗NSP4抗体。
68.权利要求62-67中任一项的方法，其中抗NSP4抗体是单克隆抗体。
69.权利要求62-67中任一项的方法，其中抗NSP4抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的抗体片段。
70.权利要求62-67中任一项的方法，其中抗NSP4抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
71.权利要求62的方法，其中抗NSP4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(i)含有氨基酸序列SEQIDNO:10的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQIDNO:11的HVR-L2；(iii)含有氨基酸序列SEQIDNO:12的HVR-L3；(iv)含有氨基酸序列SEQIDNO:1、4或7的HVR-H1；(v)含有氨基酸序列SEQIDNO:2、5或8的HVR-H2；(vi)含有氨基酸序列SEQIDNO:3、6或9的HVR-H3。
72.权利要求71的方法，其中抗NSP4抗体包含含有氨基酸序列SEQIDNO:16的轻链可变区，以及含有氨基酸序列SEQIDNO:13、14或15的重链可变区。
73.权利要求52-72中任一项的方法，其中抗NSP4抗体或NSP4抑制剂静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹腔内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。
74.权利要求52-73中任一项的方法，其中将所述抗NSP4抗体或NSP4抑制剂配制在包含(a)所述抗NSP4抗体或NSP4抑制剂和(b)可药用载体的药物组合物中。
75.制品，其包含权利要求1-32和38中任一项的抗体。
76.权利要求75的制品，其进一步包含含有用所述抗体来在个体中治疗或预防粒细胞介导的疾病或障碍的说明的包装说明书。
77.权利要求76的制品，其中疾病或障碍是嗜酸性粒细胞介导、嗜碱性粒细胞介导或嗜中性粒细胞介导的疾病或障碍。
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